АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ ВИЧ-1 ДЛЯ ВЫСУШЕННЫХ МАЗКОВ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/50 G01N35/00 C12Q1/686 

Предпосылки создания изобретения

[0001] Вирус человеческого иммунодефицита (ВИЧ - HIV) является возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД - AIDS). (Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)). Science 1983, 220:868-71; Popovic M, Sarngadharan MG, Read E, et al. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 1984, 224:497-500; Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, 224:500-3). Он может передаваться половым путем, через зараженную кровь или препараты крови, либо от зараженной матери плоду. (Curran JW, Jaffe HW, Hardy AM, et al. Epidemiology of HIV infection and AIDS in the United States. Science, 1988, 239:610-16). Острый ВИЧ-синдром, характеризующийся симптомами острого респираторного заболевания, развивается в течение 3-5 недель после начального заражения и ассоциирован с высокими уровнями виремии. (Daar ES, Moudgil T, Meyer RD, Ho DD. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New Engl J Med 1991, 324:961-4; Clark SJ, Saag MS, Decker WD. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New Engl J Med 1991, 324:954-60). ВИЧ-специфическую иммунную реакцию можно обнаружить в пределах 4-6 недель после появления симптомов. (Albert J, Abrahamsson B, Nagy K, et al. Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera AIDS 1990, 4:107-12; Horsburgh CR Jr, Ou CY, Jason J, et al. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 1989, 334:637-40). После сероконверсии вирусная нагрузка в периферической крови снижается, и большинство пациентов входят в бессимптомную фазу, которая может длиться годами. (Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection. New Engl J Med 1993, 328:327-55). Количественное измерение уровней ВИЧ в периферической крови в значительной мере способствует пониманию патогенеза ВИЧ-инфекции (Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 1995, 373:123-6; Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 1995, 373:117-22), также было показано, что оно является важным параметром для прогноза и лечения ВИЧ-инфицированных людей. (Mellors JW, Rinaldo CR JR, Gupta P, et al. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science 1996, 272:1167-70; Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV, et al. Plasma viral load and CD4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997, 126(12):946-54; Chene G, Sterne JA, May M, et al. Prognostic importance of initial response in HIV-1 infected patients starting potent antiretroviral therapy: analysis of prospective studies. Lancet 2003, 362:679-86; Egger M, May M, Chene G, et al. Prognosis of HIV-1 infected drug patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies. Lancet 2002, 360:119-29; Wood E, Hogg RS, Yip B, at al. Higher baseline levels of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA are associated with increased mortality after initiation of triple-drug antiretroviral therapy. J Infect Dis 2003, 188:1421-5; US Department of Health and Human Services. 2004 guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and adolescents. Доступно онлайн на AIDSinfo.nih.gov/guidelines). Решения, касающиеся начала антиретровирусной терапии или внесения в нее изменений, принимаются с учетом результатов мониторинга уровней РНК ВИЧ (вирусной нагрузки) в плазме, количества CD4+ Т-лимфоцитов и клинического состояния пациента. (US Department of Health and Human Services. 2004 guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and adolescents. Доступно онлайн на AIDSinfo.nih.gov/guidelines; Yeni PG, Hammer SM, Hirsch MS, et al. Treatment for Adult HIV infection. 2004 Recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA 2004, 292:251-65). Целью антиретровирусной терапии является уменьшение содержания вируса ВИЧ в плазме до уровней, ниже обнаруживаемых имеющимися на сегодняшний момент тестами вирусной нагрузки. (US Department of Health and Human Services. 2004 guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1 infected adults and adolescents. Доступно онлайн на AIDSinfo.nih.gov/guidelines; AS, Essunger P, Cao Y, et al. Decay characteristics of HIV-1 infected compartments during combination therapy. Nature 1997, 387(6629):188-91). Количественное определение уровня РНК ВИЧ в плазме можно выполнять с помощью процедур уровня техники методами амплификации нуклеиновых кислот или усиления сигнала. (Mulder J, McKinney N, Christopher C, et al. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 1994, 32:292-300; Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD, et al. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. J Inf Diseases 1994, 170:1172-9; Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, et al. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA™ during HIV-1 primary infection. J Virol Methods 1993, 43:177-87).

Сущность изобретения

[0002] Количественное измерение уровней ВИЧ-1 в периферической крови является важным параметром для получения прогноза относительно заболевания и для определения курса антиретровирусной терапии инфицированных пациентов. Из-за ограниченной стабильности вирусной РНК обычные способы тестирования вирусной нагрузки (VL) ВИЧ-1 в плазме предъявляют жесткие требования к сбору образцов, работе с ними и их пересылке, что может препятствовать дальнейшему расширению использования методов тестирования VL в местах с ограниченными ресурсами. Высушенные мазки (DS), включая высушенные мазки крови (DBS), позволяют обойти эти логистические и технические ограничения. Другими DS-мазками, помимо DBS, могут быть, например, плазма, слюна, сыворотка и т.д. В настоящем изобретении предлагаются новые и неочевидные способы и процедуры нового анализа вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DS/DBS.

[0003] Разработка анализа на основе DBS для количественного определения РНК ВИЧ-1 и провирусной ДНК (вирусного генома или его части, встроенных в ДНК клетки-хозяина) находится на ранней стадии. Таким образом, разрабатываемые методы анализа в данной области техники имеют несколько недостатков, относящихся к стоимости и эффективности. Например, многие из имеющихся сегодня процедур требуют ручного переноса элюатов DS или DBS, используемых в дальнейших процедурах экстракции нуклеиновых кислот, что допускает возможность ошибки и загрязнения в ходе анализа. Если в методах анализа уровня техники желательна или требуется обработка ДНКазой, процедуры часто включают использование дополнительных реагентов (специфичных буферов для реакции с участием ДНКазы и буферов для деактивации), оборудования (нагревательных устройств), времени (для завершения этапов процедуры, связанных с ДНКазой) и дополнительную ручную обработку.

[0004] Процедура по настоящему изобретению уменьшает или устраняет эти недостатки уровня техники. В анализе вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DS/DBS по настоящему изобретению применяется новый технологический процесс и инновационная система буферов для элюирования/рабочих буферов. Эти усовершенствования по сравнению с уровнем техники позволяют практически полностью автоматизировать анализ с увеличением точности и эффективности по сравнению с уровнем техники. Кроме того, эти усовершенствования по сравнению с уровнем техники позволяют использовать ДНКазу без дополнительных затрат времени и неудобств, присущих процедурам уровня техники, в которых применяется ДНКаза.

[0005] Настоящее изобретение предоставляет автоматизированный способ обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1 в образце крови, содержащий следующие этапы: a) предоставления: i) образца крови с подозрением на инфицирование ВИЧ, высушенного на твердом носителе; ii) буфер для элюирования; iii) автоматизированный, программируемый прибор для подготовки образцов; iv) автоматизированный, программируемый прибор для ПЦР; v) ДНКазу; и vi) реагенты ПЦР, подходящие для обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1; b) элюирование образца крови с твердого носителя буфером для элюирования для получения элюированного образца; c) загрузку элюированного образца в автоматизированный, программируемый прибор для подготовки образцов для последующих экстракции и очистки нуклеиновых кислот с получением обработанного образца; d) загрузку реагентов ПЦР в автоматизированный, программируемый прибор для ПЦР; e) запуск выполнения автоматизированной программы для ввода аликвоты реагентов ПЦР в обработанный образец; f) выполнение ПЦР для экстрагированных нуклеиновых кислот в обработанном образце с использованием автоматизированного, программируемого прибора для ПЦР; g) анализ результатов ПЦР, полученных автоматизированным, программируемым прибором для ПЦР, для определения наличия нуклеиновых кислот ВИЧ-1 в образцах; причем буфер для элюирования содержит приблизительно 3,5 М GITC, приблизительно 5% Tween® 20 (торговое наименование полисорбата 20, также называемого полиоксиэтилен(20)-сорбитан монолауратом), приблизительно 50 мМ КОАс (ацетат калия) при рН приблизительно 6.0, и i) необязательно, добавления ДНКазы в одно или более из следующего: обработанный образец, реагенты ПЦР или окончательную реакционную смесь ПЦР, или завершение реакции ПЦР после добавления реагентов ПЦР к обработанному образцу.

[0006] Согласно изобретению, способ также дополнительно включает использование негативных и позитивных контрольных образцов.

[0007] Согласно изобретению, этап b) выполняют в течение примерно 20 минут при комнатной температуре со слабым периодическим перемешиванием или в течение 30 минут при 55°С со слабым периодическим перемешиванием.

[0008] Согласно изобретению, автоматизированную процедуру программируют, используя команды программного обеспечения.

[0009] Согласно изобретению, выполняют этап i), и ДНКаза не требует специфических для ДНКазы буферов, эффективна при температуре окружающей среды или температурах, используемых во время стадий циклирования ПЦР, эффективно расщепляет ДНК в пределах 30 минут, не нуждается в инактивации после эффективного расщепления ДНК и не оказывает негативного влияния на обнаружение последовательностей РНК.

[0010] Согласно изобретению, твердый носитель представляет собой фильтровальную бумагу.

[0011] Согласно изобретению, нуклеиновая кислота представляет собой РНК.

[0012] Также согласно изобретению, нуклеиновая кислота представляет собой провирусную ДНК.

[0013] Краткое описание чертежей

[0014] На Фиг.1 показана ДНКаза (ДНКаза 1 компании Ambion (свободная от РНКазы) (Cat #AM2222) или эквивалент), которая эффективно удалила ДНК и не повлияла негативно на сигналы РНК. ДНКазу использовали для непосредственной обработки экстрагированных нуклеиновых кислот перед проведением реакции ПЦР.

[0015] На Фиг.2 показана ДНКаза (ДНКаза I компании New England Biolabs (свободная от РНКазы) (Cat #MO303S) или эквивалент), которая не удалила ДНК эффективным образом и не повлияла негативно на сигналы РНК. ДНКазу использовали для непосредственной обработки экстрагированных нуклеиновых кислот перед проведением реакции ПЦР.

[0016] На Фиг.3 показана ДНКаза (ДНКаза 1 компании Sigma-Aldrich (степень чистоты для амплификации) (Cat #AMPD1) или эквивалент), которая эффективно удалила ДНК и негативно повлияла на сигналы РНК. ДНКазу использовали для непосредственной обработки экстрагированных нуклеиновых кислот перед проведением реакции ПЦР.

[0017] На Фиг.4 показана ДНКаза (ДНКаза RQ1 компании Promega, свободная от РНКазы (Cat #M6101) или эквивалент), которая эффективно удалила ДНК и не повлияла негативно на сигналы РНК. ДНКазу использовалась для непосредственной обработки экстрагированных нуклеиновых кислот перед проведением реакции ПЦР.

[0018] На Фиг.5 приведено сравнение элюирования DBS в режиме при температуре 55°С в течение 30 минут и в режиме при комнатной температуре (КТ) в течение 20 минут для 1000 копий ВИЧ-1 на 1 мл. В каждом из режимов использовали семьдесят один реплик. Пороговый цикл (Ct) при 50°С в течение 30 минут наступал раньше, чем Ct при комнатной температуре в течение 20 минут. Максимальное отношение (MR, измерение уровня сигнала) при 55°С в течение 30 минут было больше, чем MR при комнатной температуре в течение 20 минут.

[0019] На Фиг.6 показано элюирование DBS при температуре в диапазоне от 52°С до 65°С в течение 25-45 минут. Хотя значения Ct были сравнимы для разных режимов, наибольшее значение MR было получено при 55°С в течение 30 минут.

[0020] На Фиг.7 показано элюирование DBS при 55°С в течение 10, 20 и 30 минут. Увеличение времени элюирования приводило к улучшению Ct и увеличению MR, хотя разница между временными точками была незначительной. После инкубации при 55°С в течение 30 минут дальнейшая инкубация при комнатной температуре длительностью до 24 часов не повлияла на результаты ПЦР.

Подробное описание изобретения

[0021] На сегодняшний день тестирование образцов плазмы представляет собой золотой стандарт для оценки вирусной нагрузки (VL) у ВИЧ-инфицированных людей при антиретровирусной терапии (ART). В местах с ограниченными ресурсами высушенные мазки крови (DBS) являются многообещающим альтернативным видом образца как для тестирования вирусной нагрузки, так и для генотипирования. DBS в комбинации с системами на основе ПЦР в реальном времени и автоматизированной обработки образцов позволят проводить измерение вирусной нагрузки или тесты для генотипирования в центральных лабораториях.

[0022] При адаптации анализа ВИЧ вирусной нагрузки для DBS наиболее важными техническими проблемами являются чувствительность и специфичность анализа. Клиническая чувствительность и специфичность анализа вирусной нагрузки на основе DBS определена в Методических рекомендациях 2013 года Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по антиретровирусному лечению в виде использования порога 1000 копий/мл. Доля пациентов с VL в плазме < 1000 копий/мл спустя 12 месяцев или более после начала ART является ключевым результатом, измеренным в качестве одного из параметров изучения приобретенной устойчивости к лекарственному средству. Пациенты с вирусной нагрузкой ниже этого уровня попадают в категорию "успешно прошедших лекарственную терапию" (Parkin, 2014 AIDS Rev.).

[0023] Анализ специфичности связан с выделением/амплификацией внеклеточной РНК по сравнению с клеточно-ассоциированной ДНК или РНК. Если анализ определяет как внеклеточную РНК, так и клеточно-ассоциированную ДНК или РНК, то при низких концентрациях VL в плазме количество будет значительно завышено, поскольку в высушенных мазках крови клеточная ДНК является доминирующим источником не содержащейся в плазме нуклеиновой кислоты, получаемой из вируса. (Parkin, 2014 AIDS Rev.). Система Abbott RealTime HIV-1 m2000 включает реагенты и способы, которые специфичны или, по меньшей мере, избирательны для РНК (Parkin, 2014 AIDS Rev.). В отчетах также сообщается о приемлемой корреляции между вирусными нагрузками в плазме и образцах DBS, анализ которых проводили в системе Abbott RealTime HIV-1 (Marconi, A., et al., 2009 Clin. Microbiol. Infect.; Arredondo et al., 2012 J. Clin. Micro.).

[0024] Чувствительность анализа обычно представлена пределом обнаружения (LOD) для данного анализа. Основной проблемой, связанной с чувствительностью в случае DBS, является то, что ограничения по объему ограничивают число входных копий (обзор, сделанный Nell T. Parkin, 2014). Была разработана модифицированная версия анализа с DBS в Abbott RealTime HIV-1 (открытый режим анализа DBS в Abbott RealTime HIV-1), которая предполагает использование одного ʺперфорированного мазкаʺ 70 мкл DBS, который не нужно вырезать. В дополнение к этому, не требуется перенос образца между пробирками. DBS элюируют в 1300 мкл буфера, из которых 1000 мкл используется как вводимое количество для обработки. Таким образом, реальное количество цельной крови, которая переносится для экстракции, составляет приблизительно 53,8 мкл. Экспериментально определенная степень извлечения при элюировании DBS (по сравнению с плазмой) в режиме при комнатной температуре (определенном в первоначальном протоколе для открытого режима с DBS) находилась в диапазоне от 24% до 43% (по сравнению с плазмой), со средним значением 35%, что дает вычисленный диапазон LOD от 1080 копий/мл до 1934 копий/мл. (В этих экспериментах как в цельную кровь, так и в плазму вносили ВИЧ с одной и той же концентрацией; гематокритный эффект не учитывался). Так как предложенный ВОЗ порог определения успешности терапии ART представляет собой VL≤1000 копий/мл (WHO Technical and Operational Considerations for Implementing HIV Viral Load Testing, July 2014), анализ вирусной нагрузки ВИЧ на основе DBS должно иметь предел обнаружения (LOD) ≤1000 копий/мл. Чтобы обеспечить такую чувствительность при использовании одного 70 мкл образца DBS, эффективность элюирования DBS должна быть повышена на 10% или более, чтобы снизить LOD до менее 1000 копий/мл.

[0025] Анализ VL ВИЧ-1 на основе DBS по настоящему изобретению разработан таким образом, чтобы его можно было выполнять на автоматизированном устройстве, которое может быть запрограммировано на параметры экстракции и амплификации нуклеиновой кислоты, соответствующие настоящему изобретению. Примерами подходящих автоматизированных и программируемых устройств для анализа VL ВИЧ-1 на основе DBS по настоящему изобретению являются приборы Abbott RealTime m2000sp и m2000rt (устройство; Abbott Molecular, Abbott Park, IL). Рабочие инструкции/параметры для приборов Abbott RealTime m2000sp и m2000rt (и подходящих приборов, доступных из других источников) известны специалисту с обычной квалификацией в данной области техники и включены в настоящее изобретение в виде ссылки. Настоящее изобретение не ограничивается использованием этого устройства, и специалистам с обычной квалификацией в данной области техники на момент создания этого изобретения были известны и другие похожие устройства. В анализе ВИЧ-1 по настоящему изобретению предпочтительно используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детектированием флуоресцентных сигналов в гомогенных объемах в режиме реального времени. Структура флуоресцентного частично двухнитевого зонда позволяет обнаруживать различные варианты ВИЧ-1, включая группы M, O и N. Анализ может быть стандартизован относительно вирусного стандарта от Virology Quality Assurance (VQA) Laboratory организации AIDS Clinical Trial Group или другого стандарта (Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B, et al. Evaluation of quality assurance program for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma by the AIDS clinical trials group virology laboratories, J Clin Microbiol, 1996, 34:2695-701), Международных стандартов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для РНК ВИЧ-1 (NIBSC; Holmes H, Davis C, Heath A, et al. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acid-based techniques, J Virol Methods, 2001, 92:141-50; Davis C, Heath A, Best S, et al. Calibration of HIV-1 working reagents for nucleic acid amplification techniques against the 1st international standard for HIV-1 RNA, J Virol Meth, 2003, 107:37-44). Результаты исследования могут быть указаны в копиях/мл, в log(копии/мл), международных единицах/мл (МЕ/мл) или в log(МЕ/мл).

[0026] Как указано в мировом web-исследовании по ВИЧ Всемирной организации здравоохранения Early Infant Diagnosis of HIV (depts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/ discussion.html), тестирование высушенных мазков крови является приемлемым средством при сборе образцов для анализа и создает меньшую биологическую опасность, чем жидкие образцы. Кроме того, согласно опубликованным оценкам экспертов, использование образцов DBS целесообразно в плане чувствительности и надежности по сравнению с образцами плазмы (J. Clin. Microbiol., 2011, 50(3):569-572).

[0027] Действенность, эффективность и точность автоматизированных систем подготовки и анализа образцов, таких как Abbott Sample Preparation System (m2000sp) (Система подготовки образцов) и Abbott Real-Time PCR analyzer (m2000rt) (Анализатор с ПЦР в реальном времени) подтверждена статьями в научных журналах (Marconi, et al. Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried blood spot specimens, Clin. Microbiol. Infect, 2009, 15:93-97). Помимо этого, опубликованы сравнения различных документов, относящихся к сбору DBS (Rottinghaus, et al., J. Clin. Microbiol., 2012, 51(1):55-60).

[0028] Хотя использование DBS в автоматизированных системах подготовки и исследования образцов изучено в большом количестве работ, по-прежнему требуются усовершенствования в плане технологического процесса и химии реагентов, чтобы улучшить практичность и чувствительность. Настоящее изобретение обеспечивает повышение эффективности, а также улучшение технологического процесса и эксплуатационных характеристик по сравнению с известными процедурами анализа вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DBS при использовании автоматизированных систем.

[0029] Преимущества сбора образцов DBS

[0030] Имеется множество преимуществ сбора DBS по сравнению с образцами жидкой крови. DBS легко собирать: необходимо только взять кров из пальца или пятки, при этом устраняется необходимость венепункции. Не требуются навыки флеботомии. Оборудование для сбора образцов является минимальным. Карты для образцов обычно имеют указание размера мазка (диаметра), чтобы гарантировать адекватный размер образца. Объем образца, равный примерно 70 мкл, обычно является адекватным. Образцы сушат на воздухе в условиях окружающей среды. Для хранения DBS е требуется заморозка. DBS можно хранить или транспортировать в закрытом контейнере (например, Tupper Wear® или герметичном конверте). Образцы легко транспортировать, и они являются стабильными в течение длительного периода времени в условиях окружающей среды (от нескольких недель до нескольких месяцев). Таким образом, образцы можно собирать в полевых условиях и транспортировать в пункт централизованного тестирования. Из-за более низкого риска биологического повреждения образцов DS/DBS, их можно пересылать по почте в пункт тестирования в упакованном должным образом виде (Shipping Guidelines for Dried-Blood Spot Specimens, CDC (Center for Disease Control), www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap/Bloodspot_Transportation_ Guidelines.pdf и ссылки, которые там содержатся; Clinical and Laboratory Standards Institute. Blood collection on filter paper for newborn screening programs; Approved Standard - Fifth Edition CLSI document LA4-A6. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012). После поступления в пункт тестирования образцы можно экстрагировать с использованием автоматизированных систем или с помощью ручных процедур, при необходимости.

[0031] Определения

[0032] Приведенные далее определения относятся к настоящему изобретению.

[0033] Термин "примерно" или "приблизительно", если не указано иное, относится к разбросу данных±10% от указанного значения. Необходимо понимать, что такой разброс данных всегда включен в любое приведенное здесь конкретное значение, вне зависимости от того, сделана или нет на него специальная ссылка. Кроме того, все приведенные диапазоны включают все значения, находящиеся в этом диапазоне, вне зависимости от того, приведено или нет на самом деле конкретное значение. Таким образом, диапазон 1-10 включает, например, значения 2; 3,6; 9,015 и т.д.

[0034] Термин "полимеразная цепная реакция (ПЦР)" относится к методу создания копий последовательности ДНК. В этом методе используется термоциклирование (т.е., циклы нагревания и охлаждения для денатурации (или плавления) и репликации ДНК, соответственно). Для выбора последовательности ДНК и ее копирования обычно выбирают праймеры, представляющие собой короткие фрагменты ДНК, содержащие последовательности, комплементарные копируемой последовательности ДНК, и устойчивую к нагреванию ДНК-полимераза, например, одну из Thermus aquaticus, которая называется Taq-полимеразой (см., например, патенты США №№ 4,683,195; 4,800,195 и 4,965,188, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки в части, относящейся к информации по данному вопросу). При повторном циклировании полученные копии используются в качестве матриц для создания последующих копий (т.е., цепная реакция). Методы ПЦР включают, без ограничения, стандартную ПЦР, аллель-специфическую ПЦР, ПЦР-сборку (assembly PCR), асимметричную ПЦР, цифровую ПЦР (digital PCR), ПЦР с "горячего старта" (Hot-start PCR), ПЦР промежуточных последовательностей (intersequence-specific PCR), инвертированную ПЦР (inverse PCR), опосредованную лигированием ПЦР (ligation-mediated PCR), специфическую к метилированию ПЦР (methylation-specific PCR), ПЦР с минипраймерами (mini-primer PCR), вложенную ПЦР (nested PCR), ПЦР с перекрыванием (overlap-extension PCR), ПЦР в реальном времени (real-time PCR), ПЦР с обратной транскрипцией (reverse transcription PCR), твердофазную ПЦР (solid-phase PCR), термическую асимметричную чередующуюся ПЦР (thermal asymmetric interlaced PCR) и ступенчатую ПЦР (touchdown PCR).

[0035] Термин "полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией" (ОТ-ПЦР) относится к методу количественного определения экспрессии генов путем создания из РНК комплементарных ДНК (кДНК) транскриптов.

[0036] Термины "полимеразная цепная реакция в реальном времени", ʺПЦР в реальном времениʺ и "количественная ПЦР (кПЦР)" относятся к методу количественного измерения амплификации ДНК с использованием флуоресцентных зондов.

[0037] Термин "праймер", в том виде как используется в настоящем описании, относится к олигонуклеотиду, который инициирует синтез нуклеиновых кислот, зависящих от матрицы. При наличии матрицы нуклеиновой кислоты, предшественников нуклеозид-трифосфатов, полимеразы и кофакторов, в подходящих условиях по температуре и рН праймер может удлиняться с 3'-конца путем добавления нуклеотидов с участием полимеразы с получением продукта удлинения праймера. Праймер может меняться по длине в зависимости от конкретных применяемых режимов и цели амплификации. Например, праймер для амплификации с целью диагностики, как правило, имеет длину от примерно 15 до примерно 35 нуклеотидов. Праймер должен иметь достаточную комплементарность к требуемой матрице, чтобы инициировать синтез требуемого продукта удлинения. Другими словами, праймер должен иметь способность к гибридизации с требуемой нитью матрицы настолько, чтобы 3'-гидроксильная группа праймера оказалась в соответствующем контактном положении для инициации синтеза с участием полимеразы. Праймер не должен быть точным комплементом требуемой матрицы. Например, на 5'-конце другого комплементарного праймера может иметься некомплементарная нуклеотидная последовательность. В качестве альтернативы, некомплементарные основания могут быть рассеяны внутри олигонуклеотидного праймера при условии, что последовательность праймера имеет достаточную комплементарность с последовательностью требуемой нити матрицы, чтобы обеспечить образование комплекса матрица-праймер для синтеза продукта удлинения.

[0038] ПЦР

[0039] Целевые последовательности амплифицируют методами, известными в данной области техники. Методом выбора является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-амплификацию можно выполнять стандартными методами ПЦР, следуя инструкциям изготовителя. Система Abbott m2000 содержит устройства, которые автоматизируют подготовку образцов и реакции ПЦР на основе информации, введенной пользователем.

[0040] Реакция амплификации может и предпочтительно содержит внутренний контрольный (IC) образец нуклеиновой кислоты и пару праймеров для амплификации IC нуклеиновой кислоты. Когда реакция амплификации содержит IC нуклеиновую кислоту, условия, которые способствуют амплификации, также способствуют амплификации IC нуклеиновой кислоты. В качестве IC может быть использована любая подходящая последовательность. Примеры целевых IC последовательностей включают последовательности, которые используются в приведенном ниже разделе "Примеры".

[0041] Хотя в качестве источника образца нуклеиновой кислоты можно использовать любой подходящий образец ткани или жидкости тела, т.е., ДНК или РНК, в настоящем изобретении образец элюируют из DBS. К образцу может быть добавлена протеиназа, например, протеиназа К для расщепления нежелательных белков, если это необходимо или желательно.

[0042] Образец может быть подготовлен для анализа с помощью любого подходящего способа, который известен в данной области техники. Желательно, чтобы способ позволял экстрагировать и концентрировать нуклеиновые кислоты. Также желательно, чтобы способ обеспечивал доступность целевой последовательности для амплификации и позволял удалять потенциальные ингибиторы амплификации из экстракта. В настоящем изобретении нуклеиновые кислоты элюируют из DBS с использованием буфера для элюирования, соответствующего настоящему изобретению.

[0043] После элюирования образца можно выделить РНК и выполнить обратную транскрипцию, и амплифицировать полученную кДНК (например, методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), описанным, для примера, в патентах США №№ 5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864 и 5,693,517). Кроме того, можно амплифицировать ДНК непосредственно, без использования обратной транскриптазы. Таким способом можно амплифицировать провирусную ДНК.

[0044] Можно привести целевую нуклеиновую кислоту в контакт с праймерами, что приведет к специфической амплификации целевой последовательности, если целевая последовательность имеется в образце. "Специфическая амплификация" означает, что праймеры амплифицируют конкретную целевую последовательность и не амплифицируют другие последовательности. См., например, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Elrich, Editor, Freeman Press, NY (1992)); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Editors, Academic Press, San Diego, CA (1990)); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1994-1999, включая дополнительные обновления до апреля 2004); и Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed., 2001), а также способы, описанные в опубликованной международной заявке на патент WO 93/22456 и патентах США №№ 4,851,331; 5,137,806; 5,595,890 и 5,639,611, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки в части, относящейся к информации по данному вопросу.

[0045] Праймер может быть детектируемо меченным меткой, которую можно обнаружить, например, при помощи средств спектроскопического, фотохимического, биохимического, иммунохимического или химического анализа (например, см. Sambrook, et al.). Используемые метки включают краситель, например, флуоресцентный краситель, радиоактивную метку, например, ³²Р, электроноплотный реагент, фермент, например, пероксидазу или щелочную фосфатазу, биотин, или гаптены и белки, для которых имеются антисыворотки или моноклональные антитела. В настоящем изобретении предпочтительными являются флуоресцентные красители. В этой связи, детектируемый олигонуклеотид можно метить, например, флуоресцеином. Если праймер метят красителем, а обнаруживаемый олигонуклеотид, который предназначен для связи с образующейся нитью с противоположной стороны относительно красителя, метят флуоресцеином, может возникнуть Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) по спирали ДНК. Другие детектируемые олигонуклеотиды включают молекулярный зонд, зонд TAQMAN®, однонитевой ДНК-зонд, двухнитевой ДНК-зонд и т.п.

[0046] Реагенты для амплификации нуклеиновых кислот (реагенты ПЦР) включают фермент, имеющий полимеразную активность (например, AmpliTaq Gold®), один или более кофакторов ферментов (например, MgCl₂) и дезоксинуклеотид-трифосфаты (dNTPS; например, dATP, dGTP, dCTP и dUTP или dTTP).

[0047] Условия, которые способствуют амплификации, представляют собой условия, которые способствуют отжигу праймеров и удлинению последовательностей нуклеиновых кислот. Отжиг зависит от различных параметров, таких как температура, ионная сила, длина амплифицируемых последовательностей, комплементарность и содержание G:C в амплифицируемых последовательностях. Например, снижение температуры способствует отжигу комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот. Высокое содержание G:C и бóльшая длина стабилизируют образование дуплекса. Как правило, хорошо работают праймеры и детектируемые олигонуклеотиды длиной примерно 30 п.о. или менее с высоким содержанием G:С. В качестве примера в настоящем описании приведены предпочтительные условия амплификации, праймеры и детектируемые олигонуклеотиды.

[0048] Амплификацию можно повторять любое подходящее количество раз путем термоциклирования реакционной смеси в диапазоне от примерно 10 раз до примерно 100 раз, например, в диапазоне от примерно 20 раз до примерно 75 раз, для примера, в диапазоне от примерно 25 до примерно 50 раз.

[0049] После завершения реакции амплификации наличие амплифицированного продукта можно обнаружить любым подходящим способом. Такие способы включают, без ограничений, способы, известные в данной области техники, например, гель-электрофорез с флуоресцентным красителем или без него (в зависимости от того, был ли продукт амплифицирован с праймером, меченным красителем), кривую плавления с интеркалирующим красителем (см., например, PCR Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., W. H. Freeman and Co., New York, 1992, Chapter 7) и гибридизацию с внутренним детектируемым олигонуклеотидом. Другие примеры способов включают ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), электрохемилюминесценцию, обратный дот-блоттинг, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) (см., например, Lazar, Genome Res.4: S1-S14 (1994)), также может быть использован анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК для однонитевых продуктов ПЦР (см., например, Orita, et al., PNAS USA 86: 2766-2770 (1989)). В настоящем изобретении флуоресцентные метки детектируют автоматически с использованием автоматизированного устройства для проведения реакции ПЦР.

[0050] Амплифицированная нуклеиновая кислота может быть обнаружена путем отслеживания увеличения общего количества двухнитевых молекул ДНК (днДНК) в реакционной смеси (см., например, патент США № 5,994,056 и опубликованные европейские патенты №№ 487,218 и 512,334). Используется краситель, связывающийся с ДНК, например, SYBR Green. Краситель флуоресцирует, если связан с днДНК, и увеличение флуоресценции используется для определения увеличения количества днДНК.

[0051] В качестве альтернативы и в предпочтительном случае амплификацию и обнаружение можно объединить в одном ПЦР-анализе в реальном времени. Когда используется ПЦР в реальном времени, смесь может дополнительно содержать реагенты для обнаружения нуклеиновых кислот. Примеры включают неспецифичные флуоресцентные красители, которые интеркалируют с любой двухнитевой ДНК, или специфичные для последовательности детектируемые ДНК-олигонуклеотиды, которые можно обнаружить только после гибридизации детектируемого олигонуклеотида с комплементарной целевой ДНК, обеспечивая возможность для одновременного выполнения амплификации и обнаружения. Если детектируемый олигонуклеотид во время амплификации находится в смеси, он должен быть стабилен в условиях, которые способствуют амплификации, не должен мешать амплификации, должен связываться с целевой последовательностью в условиях амплификации и испускать сигнал только при связывании с целевой последовательностью. Примеры детектируемого олигонуклеотида, которые особенно хорошо подходят в этой связи, включают детектируемые олигонуклеотиды-молекулярные маяки, TAQMAN® детектируемые олигонуклеотиды и линейные детектируемые олигонуклеотиды, например, такие, которые описаны Abravaya и др. (опубликованная заявка на патент США № 2005/0227257). Детектируемые олигонуклеотиды могут образовывать конструкцию "петля на стержне" в комбинации с молекулярным маяком. Детектируемые олигонуклеотиды также можно использовать в виде линейных детектируемых олигонуклеотидов с флуорофором (например, FAM) на одном конце и высокоэффективным гасителем флуоресценции, например, Black Hole Quencher (BHQ®; BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA) на другом конце.

[0052] Термины и выражения, которые применены, используются в качестве терминов для описания, и не накладывают никаких ограничений. В этой связи, там, где некоторые из терминов определяются, описываются или обсуждаются, предполагается, что все эти определения, описания и обсуждения относятся к таким терминам. Также отсутствует намерение при использовании таких терминов и выражений исключать любые эквиваленты показанных и описанных элементов или их частей.

[0053] Понятно, что без выхода за пределы объема заявляемого изобретения возможны различные модификации. Таким образом, необходимо понимать, что, хотя настоящее изобретение конкретным образом рассмотрено в контексте предпочтительных вариантов его реализации и возможных особенностей, специалисты в данной области техники могут вносить модификации и изменять рассмотренные здесь концепции. Считается, что такие модификации и изменения не выходят за пределы объема изобретения, который определен пунктами приложенной Формулы изобретения.

[0054] Все патенты, опубликованные заявки на патент, журнальные статьи, пособия и другие публикации, упомянутые в описании, определяют уровень квалификации тех специалистов в данной области техники, на которых рассчитано это описание. Все такие публикации включены в настоящее описание в виде ссылки так как, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и отдельно указана как включенная в настоящее описание в виде ссылки.

[0055] Изобретение, раскрытое в настоящем описании путем иллюстрации, может быть подходящим образом реализовано на практике при отсутствии любого элемента (элементов) или ограничения (ограничений), которые конкретным образом здесь не описаны. Таким образом, например, каждый раз, когда в настоящем описании используется любой из терминов "содержащий", "по существу, состоящий из" или "состоящий из", он может быть заменен любым из двух других упомянутых терминов. Аналогичным образом, указание в единственном числе не исключает наличия множества, если контекстом явным образом не определено иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" подразумевают один или более способов и/или этапов данного типа, которые здесь описаны и/или которые станут очевидными специалистам с обычной квалификацией в данной области техники после прочтения описания.

Примеры

[0056] Пример 1

[0057] Настоящее изобретение предпочтительно реализуют на автоматизированных, программируемых устройствах для ПЦР, несколько из которых известны специалисту с обычной квалификацией в данной области техники и подходят для использования вместе с настоящим изобретением с любыми изменениями процедуры, которые могут оказаться необходимыми для использования с конкретной системой, не отходя от новаторских концепций настоящего изобретения. В других случаях настоящее изобретение может быть реализовано вручную. Однако реализация настоящего изобретения вручную приводит к увеличению временных затрат и возможному уменьшению точности из-за ошибки оператора.

[0058] В этих примерах применяется система Abbott m2000, содержащая приборы m2000sp (подготовка образцов) и m2000rt (амплификация нуклеиновых кислот в реальном времени) и реагенты Abbott RealTime HIV-1.

[0059] Тестирование вирусной нагрузки ВИЧ-1 для проб в виде высушенных мазков крови с использованием приборов Abbott m2000 (или аналогичных) и реагентов Abbott RealTime HIV-1 (или аналогичных)

[0060] Описанная ниже процедура применяется для тестирования вирусной нагрузки ВИЧ-1 для проб в виде высушенных мазков крови (DBS). Описанная ниже процедура используется вместе с приборами Abbott m2000sp и m2000rt и реагентами Abbot RealTime HIV-1. В данной области техники доступны и другие системы и устройства, и специалист с обычной квалификацией в данной области техники может модифицировать описанную ниже процедуру для использования в других доступных системах и устройствах на основе материалов настоящей спецификации и без отхода от новаторских концепций этой спецификации.

[0061] Процедура работы с прибором

[0062] Перед выполнением анализа в системы Abbott m2000sp и Abbott m2000rt должен быть инсталлирован файл приложения (т.е., программное обеспечение) для тестирования вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DBS.

[0062] Инструкции по сбору проб и работе с ними

[0064] DBS может быть получен на бумажной карте Munktell TFN (Швеция) (или эквивалентных бумажных картах, которые известны специалистам с обычной квалификацией в данной области техники) путем выполнения следующих этапов:

- Нанести цельную кровь в виде мазков на кружки размером полдюйма (12 миллиметров) на бумажной карте Munktell TFN (или эквиваленте), убедившись, что заполнен весь кружок. Для гарантированного полного покрытия рекомендуется использовать на каждый кружок, по меньшей мере, 70 мкл крови (~3-5 капель; не сдавливать и не "доить" палец). Если цельная кровь отобрана в пробирку для сбора крови, полученную свежую кровь можно хранить при температуре от 2°С-8°С (температура в холодильнике) до 15°С-30°С (температура окружающей среды) до 24 часов перед нанесением мазков. В дополнение к этому, перед нанесением мазков с помощью дозатора кровь необходимо перемешать.

- Высушить карту на воздухе при температуре окружающей среды.

- Для транспортировки или хранения упаковать каждую карту в мешок или другой герметичный контейнер с пакетами влагопоглотителя. Карты можно хранить в условиях окружающей среды до 12 недель. В качестве альтернативы, карты можно хранить при 2°С-8°С или при -10°С или более низкой температуре до 24 недель.

- Пересылать образцы, если это необходимо или желательно, в соответствии с перечисленными выше рекомендованными значениями температуры и времени хранения. Для внутренней или международной пересылки пробы должны быть упакованы и помечены в соответствии с применимыми законодательными нормами для штата, федеральными и международными законодательными нормами, касающимися транспортировки клинических, диагностических или биологических проб.

[0065] Протокол анализа

[0066] 1. При выполнении этого примерного протокола использовалась система Abbott RealTime. Специалист с обычной квалификацией в данной области техники сможет адаптировать этот протокол для других аналогичных устройств и систем без излишнего экспериментирования. В каждом прогоне может быть обработано в сумме 96 образцов. В каждый прогон включены негативный контрольный образец, низкоположительный контрольный образец и высокоположительный контрольный образец, что позволяет проводить обработку максимум 93 пробы DBS в одном прогоне, когда не включены калибраторы. Эти этапы не применяются для контрольных образцов и калибраторов Abbott, которые должны обрабатываться как непосредственно жидкие образцы. Обработка проб DBS включает следующие этапы:

- Подготовить пробирки Abbott Transport Tube с 1,3 мл буфера для элюирования DS/DBS (буфер для элюирования содержит приблизительно 3,5М GITC (гуанидин тиоцианат), приблизительно 5% Tween® 20, приблизительно 50 мМ КОАс (ацетат калия) при рН приблизительно 6.0). Tween® 20 - зарегистрированный товарный знак компании ICI Americas, Inc., Bridgewater, New Jersey. Tween® 20 - торговое наименование полисорбата 20. Полисорбат 20 под другими марками также будет работать в способах по настоящему изобретению. [GITC может быть использован в количестве 1,0-5,5М, 2,0-4,5М, 3,0-4,0М и примерно 3,5М; Tween® 20 может быть использован при концентрации 0-20%, 2%-8%, 4%-6% и примерно 5%; ацетат калия может быть использован в количестве 10-500 мМ, 20 мМ - 300 мМ, 30 мМ - 200 мМ, 40 мМ - 100 мМ и примерно 50 мМ; и рН может составлять 5-10, 5.2-8, 5.6-7, 5.8-6.5 и примерно 6.5.]

- Отделить один (1) полный мазок DBS для каждой пробы с бумажной карты Munktell TFN (или эквивалента). Каждый мазок DBS должен иметь в диаметре приблизительно полдюйма (12 миллиметров). ПРИМЕЧАНИЕ: Если применимо, избегать непосредственного контакта режущей поверхности с пробами DBS. Если необходимо, между пробами следует очищать инструмент, используемый для разрезания DBS, согласно правилам лабораторной практики. Поместить DBS в пробирку Abbott Transport Tube, содержащую буфер для элюирования DS/DBS. Убедиться, что DBS полностью погружен в буфер для элюирования DS/DBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого этапа переноса DBS перфорированную бумажную карту Munktell TFN можно расположить над пробиркой Abbott Transport Tube, в которую DBS переносят с карты непосредственно в пробирку с использованием чистого наконечника дозатора.

- Инкубировать при комнатной температуре в течение примерно 20 минут или инкубировать в течение 30 минут при 55°С с периодическим слабым перемешиванием до помещения образца в прибор Abbott m2000sp или другую роботизированную систему (Этап 7).

[0067] 2. Разморозить соответствующие контрольные образцы для анализа и внутренний контрольный образец (IC) при 15°С - 30°С или при 2°С - 8°С (и между этими диапазонами). Разморозить калибраторы при 15°С - 30°С или при 2°С - 8°С (и между этими диапазонами), только если выполняется прогон калибровки.

- После разморозки контрольные образцы для анализа, IC и калибраторы можно хранить перед использованием при 2°С - 8°С до 24 часов.

- Перед использованием перемешать вихревым способом (т.е., перемешать очень сильно, например, с использованием смесителя Vortex или эквивалента) каждый калибратор для анализа и каждый контрольный образец 3 раза в течение 2-3 секунд. Убедиться, что содержимое каждого сосуда находится на дне после вихревого перемешивания, путем встряхивания сосудов на стенде таким образом, чтобы переместить жидкость на дно сосуда. Убедиться в отсутствии образования пузырьков или пены, и, если они имеются, удалить пузырьки при помощи стерильного наконечника дозатора, используя для каждого сосуда новый наконечник.

- Подготовить внутренние контрольные образцы (IC) согласно инструкциям изготовителя, как известно в данной области техники.

[0068] 3. Разморозить реагенты амплификации при 15°С - 30°С или при 2°С - 8°С (и между этими диапазонами) и хранить при 2°С - 8°С, пока они не потребуются для мастер-микс процедуры амплификации.

- После разморозки реагенты амплификации можно хранить при 2°С - 8°С до 24 часов, если не используются сразу.

- Подготовить реагенты амплификации (реагенты ПЦР) согласно инструкциям изготовителя, как известно в данной области техники.

- Поместить низкоположительные и высокоположительные контрольные образцы, негативный контрольный образец, калибраторы, если используются, и пробы DBS в пробирках Abbott Transport Tube на штативы для образцов Abbott m2000sp. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедиться, что штативы для образцов Abbott m2000sp откалиброваны именно для этой процедуры определения вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DBS.

- Аккуратно загрузить штативы образцами, избегая разбрызгивания. Если используются, штрих-коды на этикетках пробирок должны быть обращены вправо для сканирования. Убедитесь, что каждая пробирка установлена в штативе для образцов безопасным образом так, чтобы дно пробирки упиралось в дно штатива.

- Загрузить заполненные штативы в Abbott m2000sp с соблюдением последовательности их расположения, при которой первый штатив является крайним справа на рабочем столе, и следующие штативы располагаются по порядку слева от первого штатива.

[0069] 5. Поместить 5 мл реакционные емкости в держатель 1 ml Subsystem Abbott m2000sp.

[0070] 6. Установить реагенты системы подготовки образцов Abbott mSample Preparation System и планшет с глубокими лунками Abbott 96 Deep-Well Plate на рабочий стол Abbott m2000sp.

[0071] 7. На экране Protocol выбрать файл приложения для определения вирусной нагрузки ВИЧ-1 в мазках DBS. Инициировать протокол экстракции образцов.

- Ввести калибратор (необходимый, если в Abbott m2000rt не сохранена кривая калибровки) и конкретные значения для набора контрольных образцов в поля Sample Extraction: Worktable Setup, Calibrator and Control (Экстракция образцов: Настройка рабочего стола, Калибратор и Контрольный образец). Конкретные значения для набора указаны в каждой карте Abbott RealTime HIV-1 Calibrator and Control Kit Card (Карта комплекта из калибратора и контрольных образцов Abbott RealTime HIV-1).

- Протокол Master Mix Addition (этап 9) прибора Abbott m2000sp должен быть инициирован в пределах 1 часа после завершения процедуры Sample Preparation (Подготовка образцов).

[0072] ПРИМЕЧАНИЕ: Сменить перчатки перед работой с реагентами амплификации.

[0073] 8. Установить реагенты амплификации и сосуд с мастер-миксом на рабочий стол Abbott m2000sp после завершения подготовки образцов.

[0074] 9. Выбрать надлежащий планшет с глубокими лунками, который подходит для соответствующей экстракции для подготовки образцов. Инициировать протокол Master Mix Addition прибора Abbott m2000sp.

- После завершения экстракции образцов Abbott m2000sp автоматически заполняет любые пустые лунки на планшете Abbott 96-Well Optical Reaction Plate (оптический реакционный планшет с 96 лунками), если имеется больше 48 образцов, обрабатываемых за один прогон. Заполнение планшета не выполняется для прогонов, содержащих 48 образцов или меньше.

[0075] 10. Включить и инициализировать прибор Abbott m2000rt в области Amplification Area.

[0076] 11. Герметизировать планшет Abbott 96-Well Optical Reaction Plate после того, как прибор Abbott m2000sp завершил добавление образцов и мастер-микса, в соответствии с руководством Abbott m2000sp Operations Manual, раздел Operating Instructions (Рабочие инструкции).

[0077] 12. Поместить герметично закрытый планшет Optical Reaction Plate на основание Abbott Splash-Free Support Base (опорное основание, исключающее разбрызгивание) для переноса в прибор Abbott m2000rt.

[0078] 13. Поместить планшет Abbott 96-Well Optical Reaction Plate в прибор Abbott m2000rt. На экране Protocol выбрать файл приложения для определения вирусной нагрузки ВИЧ-1 на основе DBS. Инициировать протокол, как описано в руководстве Abbott m2000sp Operations Manual, раздел Operating Instructions.

[0079] 14. Можно добавить ДНКазу в одно или более из следующего: элюированный образец, реагенты ПЦР и окончательную реакционную смесь ПЦР после добавления реагентов ПЦР в элюированный образец, если оператор считает это необходимым. Реагенты/буферы для реакции с участием ДНКазы и реагенты/буферы для деактивации не являются необходимыми.

[0080] Результаты

[0081] Концентрацию вирусной РНК ВИЧ-1 в пробе или контрольном образце вычисляют на основе хранящейся кривой калибровки. Прибор Abbott m2000rt автоматически выводит результаты на свою рабочую станцию. Результаты исследования могут быть выведены в копиях/мл, log(копии/мл), международных единицах (МЕ)/мл или log(МЕ/мл). Для интерпретации результатов смотри приведенную ниже Таблицу 1.

Таблица 1

Интерпретация результатов

Результат Интерпретация Не обнаружено Цель не обнаружена <7,00 log(копии/мл) Обнаружена^* >7,00 log(копии/мл) > ULQ^а

^а ULQ=верхний предел количественного измерения

^* Для файла изучения AppSpec File (v4 или выше) все пробы, где произошло обнаружение, будут выводиться с результатом вирусной нагрузки. Реальное значение LOD будет предоставлено после верификации. После получения верифицированного значения LOD результаты для "Обнаружена" будут разделены на две категории: 1) "Обнаружена" и 2) "Обнаружена, < значения LOD"

[0082] Пример 2

[0082] Пояснение на основе примеров иллюстрирует особенности структуры, которые позволяют автоматизированной процедуре исследования DBS по настоящему изобретению работать с повышенной эффективностью и чувствительностью по сравнению с известными способами.

[0084] Процедура включает следующие этапы:

1. DBS отделяют от карты для DBS.

2. Инкубируют DBS в буфере для обработки.

3. Устанавливают реакционную емкость, содержащую DBS в буфере, в автоматизированную и роботизированную систему (например, Abbott m2000sp).

4. Запускают роботизированную систему под управлением сценария для обработки образца DBS в ходе процесса экстракции нуклеиновых кислот путем непосредственной работы с пробиркой, в которой был инкубирован DBS, без ручного вмешательства.

5. После экстракции нуклеиновых кислот роботизированная система создает мастер-микс ПЦР (т.е., окончательную реакционную смесь ПЦР без целевых нуклеиновых кислот). В качестве альтернативы, без этого этапа можно обойтись, если мастер-микс ПЦР создан априори и установлен в систему.

6. Роботизированная система создает окончательную реакционную смесь ПЦР путем объединения экстрагированных нуклеиновых кислот, полученных в конце Этапа 4, с мастер-миксом ПЦР, полученным в конце Этапа 5.

7. Выполняют циклирование ПЦР и обработку данных/вывод результатов в аналитическом приборе (например, приборе для ПЦР в реальном времени, таком как Abbott m2000rt).

8. Если требуется для конкретного варианта применения, в экстрагированные нуклеиновые кислоты, полученные при выполнении Этапа 4, добавляют ДНКазу, которую инкубируют вместе с ними, чтобы исключить/уменьшить содержание ДНК. В таком случае нуклеиновые кислоты, обработанные ДНКазой, подлежат дальнейшей обработке, начиная с Этапа 6. В качестве альтернативы, ДНКазу можно добавлять в реагенты ПЦР перед созданием мастер-микса ПЦР или во время него. В качестве еще одной альтернативы, ДНКазу можно вводить в состав реагента (реагентов) ПЦР. В таком случае мастер-микс ПЦР, содержащий ДНКазу, подлежит дальнейшей обработке, начиная с Этапа 6. На Этапе 6 ДНКазу распределяют по всем образцам роботизированной системой, с исключением ее ручного распределения. В дополнение к этому, после Этапа 6 и перед Этапом 7 может потребоваться инкубация для обработки ДНКазой.

Примечание: Конкретный вариант применения, в котором желательно использовать ДНКазу, представляет собой ПЦР, специфическую для РНК ВИЧ, где можно устранить/уменьшить помехи со стороны провирусной ДНК.

[0085] Методы, которые позволяют реализовать указанные выше процедуры исследования и выполнить анализ, включают следующее:

1. Буфер для обработки, при помощи которого элюируют нуклеиновую кислоту из DS/DBS с высокой эффективностью. Это изобретение включает использование буфера mWash 1 компании Abbott (3,5 М GITC; 5% Tween 20; 50 мМ KOAc, рН 6.0) в качестве буфера для обработки/элюирования DBS. Примечание: Abbott ранее выпустила на рынок протокол исследования вирусной нагрузки ВИЧ на основе DBS и анализ CE-IVD HIV Qualitative DBS (количественный анализ на ВИЧ на основе DBS при диагностике в лабораторных условиях (IVD, In Vitro Diagnostic) по стандарту CE), в которых в качестве буфера для обработки используется буфер Abbott mLysis (4,66 М GITC; 10% Tween 20; 100 мМ Trizma, рН 7.8). Ниже приведено сравнение этих двух процедур и продемонстрировано неожиданно обнаруженное превосходство процедуры по настоящему изобретению.

2. Параметры сценария, которые позволяют роботизированной системе дозаторов переносить жидкость непосредственно из пробирки, содержащей твердый материал DBS, для дальнейшей обработки надежным и точным образом, одновременно оставляя в пробирке "мертвый" объем, составляющий≤300 мкл, после переноса жидкости.

3. Использование ДНКазы, которая эффективным образом расщепляет ДНК в экстрагированных нуклеиновых кислотах без включения специфических буферов для реакции с участием ДНКазы.

4. Использование ДНКазы со свойством, указанным в пункте 3, которая эффективным образом расщепляет ДНК при температуре окружающей среды.

5. Использование ДНКазы со свойствами, указанными в пунктах 3 и 4, которая эффективным образом расщепляет ДНК в период времени, составляющий 30 минут.

6. Использование ДНКазы со свойствами, указанными в пунктах 3-5, которую не нужно инактивировать либо введением реагентов, либо при повышенных температурах.

7. Использование ДНКазы, которая эффективным образом расщепляет ДНК в ходе ПЦР, если ДНКаза введена в реагенты ПЦР перед воздействием экстрагированных нуклеиновых кислот или вводится во время образования реакционной смеси ПЦР.

8. Использование ДНКазы со свойством, указанным в пункте 7, без включения специфического буфера для реакции с участием ДНКазы.

9. Использование ДНКазы со свойствами, указанными в пунктах 7 и 8, которая эффективным образом расщепляет ДНК при температуре окружающей среды или температурах, используемых во время различных стадий циклирования ПЦР.

10. Использование ДНКазы со свойствами, указанными в пунктах 7-9, которая эффективным образом расщепляет ДНК в период времени, составляющий 10 минут. В предпочтительном случае, если температуры, используемые во время различных стадий циклирования ПЦР, могут оказывать положительное влияние на работу ДНКазы, обработка ДНКазой не требует дополнительного времени или стадии (стадий) циклирования сверх тех, что включены в циклирование ПЦР.

11. Использование ДНКазы со свойствами, указанными в пунктах 7-10, которую не нужно деактивировать либо введением реагентов, либо воздействием повышенных температур перед и во время ПЦР.

12. Использование ДНКазы и соответствующих условий ее обработки, указанных в пунктах 3-11, которые не оказывают негативного влияния на обнаружение последовательностей РНК.

13. Использование задаваемого параметра "объем ПЦР" (как параметра термоциклирования), который ниже реального объема ПЦР. Такое задание устраняет "краевой" эффект, наблюдаемый в заполненном планшете ПЦР, который негативно влияет на чувствительность, если сравнивать с прогоном при частично заполненном планшете ПЦР. "Краевой" эффект, наблюдаемый в некоторых современных устройствах для циклирования ПЦР в реальном времени, вызван температурным выбросом блока управления температурой. Задание более низкого объема ПЦР дает более медленное и более точное управление температурой, что позволяет практически устранить температурный выброс.

14. Завершение реакции ПЦР определяется специалистом в данной области техники соответствующим образом для конкретного целевого образца DS/DBS.

[0086] Более подробное описание метода по настоящему изобретению с использованием примеров:

1. Роботизированный перенос жидкости из пробирок, содержащих DBS, состоит из следующих этапов:

- DBS пропихивается в сторону дна пробирки для ввода образца при помощи одноразового наконечника с использованием алгоритма "Detect Tube Bottom" ("Обнаружить дно пробирки").

- Одноразовый наконечник медленно отводится на небольшое расстояние (например, 3 мм) от дна пробирки для ввода образца и выполняется отбор небольшого объема (например, 50 мкл), чтобы удостовериться, что DBS и одноразовый наконечник разделены. После завершения отбора небольшого объема, одноразовый наконечник отводится в положение над поверхностью жидкости.

- С использованием того же одноразового наконечника детектируется поверхность жидкости, и из этого места выполняется частичный отбор с отслеживанием объема (например, 450 мкл, до получения 1 мл). После завершения первого частичного отбора жидкости, жидкость, содержащаяся в одноразовом наконечнике, переносится в реакционную пробирку для выполнения дальнейших этапов экстракции нуклеиновых кислот.

- Эти этапы повторяют, чтобы получить итоговый объем при переносе образца.

2. Приведенные в качестве примера ДНКазы, которые эффективно расщепляют ДНК при использовании вместе со способами и составами по настоящему изобретению при добавлении к экстрагированным нуклеиновым кислотам (без негативного влияния на обнаружение РНК) в условиях отсутствия специфических буферов для реакции с участием ДНКазы, и которые не нужно инактивировать либо путем введения реагентов, либо воздействием повышенных температур, являются следующими:

- RQ1 не содержащая РНКазы ДНКаза (Cat #M6101) от компании Promega (Madison, WI); 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

- ДНКаза I (не содержащая РНКазы) (Cat #AM2222) от компании Ambion (Grand Island, NY); 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

- ДНКаза I (рекомбинантная, не содержащая РНКазы) (Cat #047167280001) от компании Roche (Basel, Switzerland); 20U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

- Другие подходящие ДНКазы могут быть известны специалисту с обычной квалификацией в данной области техники и могут быть им определены с использованием описанных здесь способов без излишнего экспериментирования. Настоящее изобретение не ограничивается любой специфической ДНКазой, если она соответствует стандартам, перечисленным в этой спецификации. Исследования, которые описаны ниже с использованием чертежей, являются только иллюстративными и не предполагают ограничение изобретения какой-либо конкретной ДНКазой или каким-либо конкретным способом выбора.

[0087] На Фиг.1 показана ДНКаза, которая эффективным образом удалила ДНК и не оказала негативного влияния на сигналы РНК. На Фиг.1 показаны элюаты нуклеиновых кислот, экстрагированные из высушенных мазков ВИЧ-положительной крови, которые обработаны с использованием ДНКазы перед объединением с реагентами ПЦР (пунктирные линии), по сравнению с контрольным образцом (без обработки ДНКазой, сплошные линии). Затем нуклеиновые кислоты анализировали методом ПЦР в реальном времени с бета-глобином для получения сигнала ДНК бета-глобина и ОТ-ПЦР в реальном времени с ВИЧ-1 для получения сигналов РНК ВИЧ и IC. а) Сигнал ДНК бета-глобина для демонстрации эффективности обработки ДНКазой, b) сигнал РНК ВИЧ для демонстрации влияния обработки ДНКазой и с) сигнал РНК IC для демонстрации влияния обработки ДНКазой. Условия, использованные для обработки ДНКазой: ДНКаза I (не содержащая РНКазы) (Cat #AM2222) от компании Ambion; 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

[0088] На Фиг.2 показана ДНКаза, которая не удалила эффективным образом ДНК и не оказала негативного влияния на сигналы РНК. На Фиг.2 показаны элюаты нуклеиновых кислот, экстрагированные из высушенных мазков ВИЧ-положительной крови, которые обработаны с использованием ДНКазы перед объединением с реагентами ПЦР (пунктирные линии), по сравнению с контрольным образцом (без обработки ДНКазой, сплошные линии). Затем нуклеиновые кислоты анализировали методом ПЦР в реальном времени с бета-глобином для получения сигнала ДНК бета-глобина и ОТ-ПЦР в реальном времени с ВИЧ-1 для получения сигналов РНК ВИЧ и IC. а) Сигнал ДНК бета-глобина для демонстрации эффективности обработки ДНКазой, b) сигнал РНК ВИЧ для демонстрации влияния обработки ДНКазой и с) сигнал РНК IC для демонстрации влияния обработки ДНКазой. Условия, использованные для обработки ДНКазой: ДНКаза I (не содержащая РНКазы) (Cat #MO303S) от компании New England Biolabs; 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

[0089] На Фиг.3 показана ДНКаза, которая эффективным образом удалила ДНК и негативно повлияла на сигналы РНК. На Фиг.3 показаны элюаты нуклеиновых кислот, экстрагированные из высушенных мазков ВИЧ-положительной крови, которые обработаны с использованием ДНКазы перед объединением с реагентами ПЦР (пунктирные линии), по сравнению с контрольным образцом (без обработки ДНКазы, сплошные линии). Затем нуклеиновые кислоты анализировали методом ПЦР в реальном времени с бета-глобином для получения сигнала ДНК бета-глобина и ОТ-ПЦР в реальном времени с ВИЧ-1 для получения сигналов РНК ВИЧ и IC. а) Сигнал ДНК бета-глобина для демонстрации эффективности обработки ДНКазой, b) сигнал РНК ВИЧ для демонстрации влияния обработки ДНКазой и с) сигнал РНК IC для демонстрации влияния обработки ДНКазой. Условия, использованные для обработки ДНКазой: ДНКаза 1 (степень чистоты для амплификации) (Cat #AMPD1) от компании Sigma-Aldrich; 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

3. Приведенные в качестве примера ДНКазы, которые эффективно расщепляют ДНК в ПЦР (без негативного влияния на обнаружение РНК), когда ДНКаза введена в реагенты ПЦР перед воздействием экстрагированных нуклеиновых кислот или вводится во время образования реакционной смеси ПЦР, являются следующими:

- RQ1 не содержащая РНКазы ДНКаза (Cat #M6101) от компании Promega; 2U на реакцию; комнатная температура; 10 минут.

- ДНКаза I (не содержащая РНКазы) (Cat #AM2222) от компании Ambion; 2U на реакцию; комнатная температура; 30 минут.

- Другие ДНКазы могут быть известны специалисту с обычной квалификацией в данной области техники и могут быть им определены с использованием описанных здесь способов без излишнего экспериментирования. Настоящее изобретение не ограничивается любой специфической ДНКазой, если она соответствует стандартам, перечисленным в этой спецификации. Исследования, которые описаны ниже с использованием чертежей, являются только иллюстративными и не предполагают ограничение изобретения какой-либо конкретной ДНКазой.

[0090] На Фиг.4 показана ДНКаза, которая эффективным образом удалила ДНК и не повлияла негативно на сигналы РНК. Как показано на Фиг.4, ДНКаза, была добавлена к реагентам ПЦР, которые были затем объединены в мастер-микс ПЦР (пунктирная линия). Что касается контрольного образца, в реагенты ПЦР ДНКаза не добавлялась (сплошная линия). Затем экстрагированные нуклеиновые кислоты анализировали методом мастер-микс ПЦР, при этом были измерены сигналы ДНК бета-глобина, а также сигналы РНК ВИЧ и IC. а) Сигнал ДНК бета-глобина для демонстрации эффективности обработки ДНКазой, b) сигнал РНК ВИЧ для демонстрации влияния обработки ДНКазой и с) сигнал РНК IC для демонстрации влияния обработки ДНКазой. Условия, использованные для обработки ДНКазой: RQ1 не содержащая РНКазы ДНКаза (Cat #M6101) от компании Promega; 2U на реакцию; комнатная температура; 10 минут.

[0091] Компания Abbott ранее предложила известный протокол. Этот протокол был оптимизирован до первоначального открытого режима определения вирусной нагрузки ВИЧ-1 с помощью DBS (см. приведенную ниже таблицу). Протокол первоначального открытого режима был дополнительно оптимизирован до текущего открытого режима и для получения CE-продукта. В приведенной ниже Таблице 2 показаны различия между известным протоколом, протоколом первоначального открытого режима и дополнительно улучшенным протоколом. Буквы "СЕ" являются сокращением от французской фразы "Conformité Européene", что дословно означает "Европейское соответствие".

Таблица 2

Различия между известным протоколом, протоколом первоначального открытого режима и дополнительно улучшенным протоколом

Известный протокол Оптимизация до первоначального открытого режима для DBS Дополнительная оптимизация для СЕ-продукта Число DBS на один образец 2 1 1 Объем крови на один DBS 50 мкл 70 мкл 70 мкл Буфер для обработки DBS 1,7 мл буфера mLysis
(4,66 М GITC; 10% Tween 20; 100 мМ Trizma, рН 7.8) 1,3 мл буфера mWash 1
(3,5 М GITC; 5% Tween 20; 50 мМ KOAc, рН 6.0) 1,3 мл буфера mWash 1
(3,5 М GITC; 5% Tween 20; 50 мМ KOAc, рН 6.0) Число пробирок для образцов на один DBS 2
(включает пробирку для обработки DBS и пробирку ввода образца для m2000sp 1
(пробирка для ввода образца для m2000sp 1
(пробирка для ввода образца для m2000sp Число образцов на один прогон m2000 48 96 96 Режим элюирования DBS Комнатная температура, 20 минут с периодическим перемешиванием Комнатная температура, 20 минут с периодическим перемешиванием 55°С в течение 30 минут Автоматизиро-ванный перенос элюата DBS Нет Да Да Обработка ДНКазой Нет Да Нет Объем добавленного буфера для лизиса на Этапе лизиса клеток 0,8 мл х 3 0,8 мл х 3 0,8 мл х 2
(чтобы уменьшить перенос GITC, вызывающий ошибки 4450/4442) Добавление IC 750 мл IC на бутыль для буфера для лизиса 500 мл IC на бутыль для буфера для лизиса 750 мл IC на бутыль для буфера для лизиса Параметр ПЦР Задаваемое значение объема ПЦР (как параметра термоциклиро-вания) то же, что реальный объем ПЦР (100 мл) Задаваемое значение объема ПЦР (как параметра термоциклиро-вания) ниже реального объема ПЦР (25 мл против 100 мл) Задаваемое значение объема ПЦР (как параметра термоциклиро-вания) ниже реального объема ПЦР (25 мл против 100 мл) Обработка данных Более высокая отсечка активности ПЦР (MR 0,07) Более низкая отсечка активности ПЦР (MR 0,03) Более низкая отсечка активности ПЦР (MR 0,03) Чувствитель-ность (целевой уровень, связанный с 95% вероятностью обнаружения) ~ 2500 копий/мл ~ 1000
копий/мл ~ 800
копий/мл

[0092] Изменения в анализе, как подробно показано в Таблице 2, дали в результате огромное, неожиданное и удивительное улучшение по сравнению с известным способом. В Таблице 3 приведена увеличенная чувствительность, достигнутая при помощи способа по настоящему изобретению. Целевой уровень, соответствующий 100% обнаружению, снизился с 10.000 копий на мл в известном исследовании до 2.000 копий на мл при использовании способов по настоящему изобретению.

Таблица 3. См. приведенную ниже таблицу для сравнения протокола открытого режима (режим элюирования DBS при КТ в течение 20 минут) по настоящему изобретению с известным протоколом в плане чувствительности обнаружения.

Известный уровень техники Открытый режим Целевой уровень (копий/мл) Число протестированных Число обнаруженных Процент обнаруженных Число обнаруженных Процент обнаруженных 1000000 12 12 100 12 100 100000 12 12 100 12 100 10000 12 12 100 12 100 3000 12 11 92 12 100 2000 12 11 92 12 100 1000 12 7 58 11 92 500 12 4 33 8 67 250 12 3 25 8 67

[0093] Пример 3

[0094] Изучение чувствительности и повышение надежности анализа

[0095] Что касается анализа в первоначальном открытом режиме, приблизительно 2-3% образцов внутреннего изучения и > 5% образцов внешнего изучения в m2000rt имели ошибки 4450 или 4442 и, таким образом, были недостоверными. Было определено, что остаточный гуанидин привел к увеличенной частоте ингибирования и ошибкам 4450 и 4442. Файл HIV-1 DBS Application Specification File был модифицирован для уменьшения количества и частоты переноса гуанидина. Уменьшение скорости отведения во время удаления отходов уменьшило падение капель, свисающих с наконечников дозаторов. Так как образец DBS присутствует в буфере Wash 1 (буфер для элюирования DBS) в количестве 1 мл в качестве введенного образца, объем буфера для лизиса в реакции можно было уменьшить с 2400 до 1600 мл, уменьшая также количество GITC, присутствующего в каждой реакции. Эффективность промывки была увеличена путем увеличения объема Wash 2 c 700 до 750 мл. Внесение этих изменений уменьшило частоту появления ошибок 4450 и 4442 до приблизительно 0,2% (данные не показаны). Эта оптимизация значительно повысила надежность анализа.

[0096] Чувствительность анализа может быть повышена за счет увеличения вводимого объема образца путем использования для тестирования двух DBS (высушенных мазков крови) объемом 70 мкл на одного пациента. Оценка данных (не показаны) позволила предположить, что в случае элюирования при комнатной температуре два DBS по сравнению с одним DBS повысят степень обнаружения ВИЧ на нижней границе. При режиме элюирования "55°С в течение 30 минут" увеличение степени обнаружения низкой концентрации ВИЧ для двух DBS по сравнению с одним DBS не было столь заметным.

[0097] Чувствительность исследования также можно повысить путем увеличения эффективности элюирования. Было выполнено непосредственное сравнение элюирования при комнатной температуре в течение 20 минут и элюирования при 55°С в течение 30 минут. Результаты (Фиг.5) говорят о том, что значительно улучшились как Ct (значение порогового цикла), так и MR (максимальное отношение) при увеличении температуры с переходом на режим "55°С в течение 30 минут". Температуру 55°С и длительность сравнивали с другими температурами и длительностями (Фиг.6 и 7, соответственно). Результаты (Фиг.6) показали, что температуры выше 60°С приводят к более низким значениям MR. Если говорить в общем, наибольшее значение MR наблюдали при 55°С. На Фиг.7 показано, что для более эффективного элюирования DBS потребовалось тридцать минут при 55°С. После инкубации при 55°С в течение 30 минут дальнейшая инкубация при комнатной температуре длительностью до 24 часов не повлияла на результаты ПЦР. Помимо этого, было проведено сравнение количества материала РНК, извлеченного из DBS, относительно цельной крови, отбираемой непосредственно в буфер для образцов, для режима "комнатная температура в течение 30 минут" и режима "55°С в течение 30 минут". Результаты показали, что режим элюирования при 55°С позволил увеличить извлечение на приблизительно 10% по сравнению с режимом элюирования при комнатной температуре (Таблица 4). C режимом элюирования при 55°С было объединено непрерывное интенсивное перемешивание образца DBS в буфере. Результаты показали небольшое улучшение при извлечении из DBS ВИЧ с низкой концентрацией; это улучшение не было статистически значимым (данные не показаны).

Таблица 4

Вычисление % извлечения относительно цельной крови

Режим 1000 копий/мл Средний Ct Среднее MR Средний процент извлечения относительно цельной крови (диапазон) КТ, 20 мин 27,79 0,160 44,9 (34,1-62,8) 55°С, 30 мин 27,43 0,180 57,4 (43,3-70,4) Режим 250 копий/мл Средний Ct Среднее MR Средний процент извлечения относительно цельной крови (диапазон) КТ, 20 мин 28,78 0,097 57,1 (40,6-68,9) 55°С, 30 мин 28,59 0,103 66,1 (37,2-82,7)

Наблюдаемое улучшение процентного извлечения относительно цельной крови, когда элюирование DBS выполнялось при 55°С в течение 30 минут, по сравнению с элюированием при комнатной температуре в течение 20 минут составляет приблизительно 10%.

[0098] Для определения чувствительности была выполнена предварительная оценка аналитической чувствительности с использованием панели разведения VQA HIV-1 (программа Virology Quality Assurance) (набор #2 панелей) при 55°С в течение 30 минут. Она также была протестирована с использованием инактивированного ВИЧ-1 от компании SeraCare, количественно определенного с использованием трех наборов калибраторов. Калибраторы, использованные для количественного определения, были количественно охарактеризованы с помощью панелей разведения VQA HIV-1 (набор #1 панелей). Результаты приведены в Таблице 5. Определено, что LOD составляет приблизительно 800 копий/мл.

Таблица 5

Определение чувствительности

Источник ВИЧ ВИЧ, копий/мл Число протестированных Число обнаруженнных Процент обнаруженных Логит LOD, копий/мл Пробит LOD, копий/мл VQA 2 250 30 18 60 741 766 500 30 24 80 1000 30 30 100 ВИЧ LAV^* 250 16 11 68,8 884 865 500 16 15 93,8 1000 16 15 93,8

^* Инактивированный ВИЧ-1 от компании SeraCare, который был количественно определен с использованием 3 наборов калибраторов, которые были количественно охарактеризованы при помощи VQA 1.

[0099] В настоящее время на рынке предлагается множество бумажных карт для DBS. Важно показать, сравнимы ли их эксплуатационные качества. Было проведено изучение на предмет одновременного сравнения карт от 3 поставщиков. По возможности использовалось множество серий бумажных карт. Результаты сведены в Таблицу 6. Что касается Ct и MR для низкой концентрации ВИЧ и степени обнаружения, эксплуатационные качества были похожими. Различия не были статистически значимыми.

Таблица 6

Сравнение бумаги для DBS от разных поставщиков

ВИЧ,
копий/мл Тип бумаги/номер серии поставщика ВИЧ в среднем Степень обнаружения Ct MR 1000 Munktell TFN/LabMate серия 13-108-36 27,50 0,175 12/12 1000 Munktell TFN/Lasec серия 13-108-24 27,14 0,202 12/12 1000 Munktell TFN/ Lasec серия 13-108-25 27,62 0,174 12/12 1000 Ahlström 226/Perkin Elmer серия 103649 27,11 0,189 11/11 1000 Whatman 903/GE Healthcare серия 6933912 27,81 0,167 11/12 1000 Whatman 903/GE Healthcare серия 6990814 27,41 0,174 12/12

Изобретение относится к области медицины. Предложен автоматизированный способ обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1 в образце крови. Способ включает предоставление образца крови с подозрением на ВИЧ-инфекцию, высушенного на фильтровальной бумаге, элюирование указанного образца с использованием буфера для элюирования, проведение ПЦР и анализ результатов для определения, содержат ли образцы ВИЧ-1. Изобретение обеспечивает эффективное тестирование высушенных пятен крови на предмет их вирусной нагрузки ВИЧ-1. 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 3 пр.

1. Автоматизированный способ обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1 в образце крови, включающий:

a) предоставление:

i) образца крови с подозрением на ВИЧ-инфекцию, высушенного на фильтровальной бумаге;

ii) буфера для элюирования;

iii) автоматизированного, программируемого прибора для подготовки образцов;

iv) автоматизированного, программируемого прибора для ПЦР;

и

v) реагентов для ПЦР, подходящих для обнаружения нуклеиновых кислот ВИЧ-1;

b) элюирование образца крови с фильтровальной бумаги с использованием буфера для элюирования с получением элюированного образца;

c) загрузку элюированного образца в автоматизированный, программируемый прибор для подготовки образца для последующей экстракции нуклеиновых кислот и очистки с получением обработанного образца;

d) загрузку реагентов ПЦР в автоматизированный, программируемый прибор для ПЦР;

e) запуск автоматизированной программы для ввода аликвоты реагентов ПЦР в обработанный образец;

f) выполнение ПЦР для экстрагированных нуклеиновых кислот в обработанном образце с использованием автоматизированного, программируемого прибора для ПЦР;

g) анализ результатов ПЦР, полученных автоматизированным, программируемым прибором для ПЦР, для определения, содержат ли какие-либо образцы нуклеиновые кислоты ВИЧ-1;

h) причем указанный буфер для элюирования содержит 3,5 М GITC, 5% полисорбата 20, 50 мМ КОАс при рН 6.0.

2. Способ по п.1, который дополнительно включает добавление ДНКазы в одно или более из следующего: обработанный образец, реагенты ПЦР или окончательную реакционную смесь ПЦР после добавления реагентов ПЦР к обработанному образцу.

3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий использование негативных и позитивных контрольных образцов.

4. Способ по п.1 или 2, в котором этап b) выполняют в течение примерно 20 минут при комнатной температуре.

5. Способ по п.4, в котором этап b) выполняют со слабым периодическим перемешиванием.

6. Способ по п.1 или 2, в котором этап b) выполняют в течение примерно 30 минут при примерно 55°С.

7. Способ по п.6, в котором этап b) выполняют со слабым периодическим перемешиванием.

8. Способ по п.1 или 2, в котором упомянутую автоматизированную процедуру программируют с помощью команд программного обеспечения.

9. Способ по п.1 или 2, в котором нуклеиновая кислота представляет собой РНК.

10. Способ по п.1 или 2, в котором нуклеиновая кислота представляет собой провирусную ДНК.