Способ определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в генах протеазы и обратной транскриптазы Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 G01N33/573 C12N15/00 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии, и предназначено для определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) методом секвенирования генов протеазы и обратной транскриптазы (ревертазы). Полученные последовательности анализируются при помощи общедоступного web-сервиса HIVdb Program: Mutations Analysis (версия программы 3.4.3; версия алгоритма 9.4) [Liu, Shafer, 2006] c целью определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ. Результатом анализа является заключение о наличии или отсутствии резистентности к препаратам, используемым для антиретровирусной терапии: к ингибиторам протеазы (ИП), ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ), нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ).

Уровень техники

В настоящее время известно множество мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам из классов ИП, НИОТ и ННИОТ. Данные мутации лекарственной устойчивости сосредоточена в фрагменте гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу и ревертазу [Ожмегова, Бобкова, 2022]. Определение лекарственной устойчивости ВИЧ необходимо для назначения эффективной антиретровирусной терапии. Для определения мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость ВИЧ, применяются коммерческие, а также «in house» тест-системы на основе метода секвенирования по Сенгеру, позволяющие определить нуклеотидную последовательность фрагмента генома ВИЧ [Лободанов, 2015].

Известны следующие способы определения лекарственной устойчивости ВИЧ методом секвенирования фрагментов его генома:

1. Зарегистрированная тест-система «АмплиСенс® HIV-Resist-Seq» ©ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия) [Богословская и др., 2008].

В данной тест-системе используется вложенная двухраундовая полимеразно-цепная реакция (ПЦР) с применением стандартной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, что повышает количество ошибок в секвенируемом продукте. Обратная транскрипция (ОТ) осуществляется термолабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразой с максимальной температурой ОТ 45°C, что понижает выход кДНК и чувствительность метода в связи со сложной вторичной структурой РНК ВИЧ. На этапе секвенирующей реакции используется 6 праймеров, что приводит к уменьшению количества покрытия генома прочтениями и повышает риск ошибки при анализе и интерпретации результатов.

2. Зарегистрированная тест-система «ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System» (Thermo Fisher Scientific, США) [Cunningham и др., 2001]

В данной тест-системе используется двухраундовая ПЦР с применением стандартной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, что повышает количество ошибок в секвенируемом продукте. Обратная транскрипция осуществляется низкотермолабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразой с максимальной температурой ОТ 42°C, что понижает выход кДНК и чувствительность метода в связи со сложной вторичной структурой РНК ВИЧ. На этапе секвенирующей реакции используется 7 праймеров, что приводит к уменьшению количества перекрытий прочтений и повышает риск ошибки при анализе и интерпретации результатов. Праймеры используемые в данной тест-системе разрабатывались и тестировались преимущественно для работы с субтипами B и C ВИЧ-1, распространенными в Европе, США и Африке. В Российской Федерации (и на территории стран бывшего СССР) преимущественно циркулирует субсубтип A6 субтипа A ВИЧ-1, чувствительность данной тест-системы снижена.

3. Способ выявления мутации в ВИЧ-1 c использованием секвенирования pol [Larder и др., 2004].

В данной тест-системе используется вложенная двухраундовая ПЦР с применением стандартной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, что повышает количество ошибок в секвенируемом продукте. Обратная транскрипция осуществляется низкотермолабильной РНК-зависимой ДНК-полимеразой с максимальной температурой обратной транскрипции +37°C, что понижает выход кДНК и чувствительность метода в связи со сложной вторичной структурой РНК ВИЧ. На этапе секвенирующей реакции используется 6 праймеров, что приводит к уменьшению количества перекрытий прочтений и повышает риск ошибки при анализе и интерпретации результатов. Праймеры используемые в данной тест-системе разрабатывались и тестировались преимущественно для работы с субтипами ВИЧ B и C ВИЧ-1, распространенными в Европе, США и Африке. В Российской Федерации (и на территории стран бывшего СССР) преимущественно циркулирует субсубтип A6 субтипа A ВИЧ-1, чувствительность данной тест-системы снижена.

Принцип действия тест-систем для определения лекарственной устойчивости ВИЧ заключается в секвенировании генов, содержащих мутации ответственные за лекарственную устойчивость. При этом существующие тест-системы включают в себя этапы: выделения, обратную транскрипцию, 1-2 раунда ПЦР, электрофореза продуктов амплификации, очистки продуктов амплификации, секвенирующей реакции, очистки продуктов секвенирующей реакции, капиллярного электрофореза высокого разрешения на генетическом анализаторе, сборки из полученных прочтений консенсусной последовательностей. Известные методы отличаются размером и локализацией исследуемых участков генома, используемыми праймерами, температурными режимами амплификации. Недостатками известных методов являются: многораундовость ПЦР, использование стандартных ДНК-зависимых ДНК-полимераз и РНК-зависимых ДНК- полимераз, ограниченная чувствительность, обусловленная высокой вариабельностью генома ВИЧ и требующая особого подхода к разработке праймеров для отдельных регионов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод определения лекарственной устойчивости с помощью двухраундовой амплификации и прямого секвенирования участка генома pol-rev, кодирующего протеазу и обратную транскриптазу. Указанный метод использует низкотермолабильную ревертазу для обратной транскрипции, двухраундовую вложенную ПЦР для амплификации целевого участка генома, 6 праймеров в секвенирующей реакции. (Зарегистрированная тест-система «АмплиСенс® HIV-Resist-Seq» ©ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка способа определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в фрагменте гена pol, кодирующего протеазу и обратную транскриптазу, с повышенной чувствительностью по отношению к штаммам ВИЧ, циркулирующим на территории Российской Федерации, со сниженным числом технологических операций, сокращением времени всего анализа, снижения риска контаминации ампликонами, с полным покрытием не менее чем двумя непрерывными прочтениями исследуемого фрагмента, с использованием реагентов, производимых на территории Союзного государства (надгосударственное образование России и Белоруссии).

Технический результат.

Указанный технический результат достигается за счет использования:

набора уникальных праймеров (праймер для обратной транскрипции фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу: 5` CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC 3`; праймер для обратной транскрипции фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу: 5` TCCCACTCAGGAATCCAGGT 3`; комбинация праймеров для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу: 5` TAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGG 3` и 5` CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC 3`, комбинация праймеров для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу: 5` TAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCA 3` и 5` TCCCACTCAGGAATCCAGGT 3`; праймеры для секвенирующей реакции 5` TAGGGAAAATYTGGCCTT 3`, 5` CCATCCATTCCTGGCTT 3`, 5` ATGATAGGGGGAATTGGAGG 3`, 5` GGAATATTGCTGGTGATCC 3`, 5` GGGDGATGCATATTTTTCAGT 3`, 5` TCATAHCCCATCCAAAG 3`, 5` CCTCCATTYCTTTGGATGGG 3`, 5` CCAYTCAGGAATCCAGGT 3`), разработанных на основе анализа геномов штаммов ВИЧ, циркулирующих на территории стран бывшего СССР (обеспечивают высокую чувствительность особенно к штаммам ВИЧ, циркулирующим в Российской Федерации, позволяют использовать однораундовую ПЦР, что в свою очередь обеспечивает снижение числа технологических операций, сокращение времени всего анализа, снижение риска контаминации ампликонами, обеспечивают покрытие не менее чем двумя непрерывными прочтениями исследуемого фрагмента),

термостабильной обратной транскриптазы (оптимальная активность при 55°С обеспечивает повышение чувствительности способа),

реагентов для ПЦР, содержащих смесь термостабильных ДНК-полимераз для высокоточной и специфичной амплификации,

оптимизацией параметров технологических операций под реагенты, производимые на территории Союзного государства.

Заявляется способ определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в генах протеазы и обратной транскриптазы, отличающийся тем, что:

1) После выделения вирусной РНК сразу отбирают две аликвоты по 10 мкл: одна для исследования фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, вторая для исследования фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу.

2) Перед постановкой реакции обратной транскрипции производят предварительный отжиг генспецифических обратных праймеров при 70 °C в течение 3 минут: в аликвоте №1 (объем 10 мкл) праймер CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC для протеазы (объем 2 мкл, концентрация 5 мкмоль) и в аликвоте №2 (объем 10 мкл, концентрация 5 мкмоль) праймер TCCCACTCAGGAATCCAGGT для ревертазы (объем 2 мкл). К аликвотам добавляют смесь для обратной транскрипции, содержащую генетически модифицированную обратную транскриптазу (ревертазу) вируса лейкемии мышей (M-MuLV) RNAscribe RT («Обратная транскриптаза RNAscribe RT» ©ООО «Биолабмикс», Россия) в объеме 8 мкл. Проводят обратную транскрипцию, инкубируя реакционные смеси при 55°С в течение 50 минут, после чего выполняют денатурацию реакционной смеси при 85°С в течение 5 минут.

3) Для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, используют комбинацию праймеров 5` TAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGG 3` (праймер F) и 5` CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC 3` (праймер R), для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, используют комбинацию праймеров 5` TAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCA 3` (праймер F) и 5` TCCCACTCAGGAATCCAGGT 3` (праймер R). Реакционную смесь для ПЦР готовят на основе набора реагентов, содержащих смесь термостабильных ДНК-полимераз для высокоточной и специфичной амплификации фрагментов ДНК Tersus® (набор «Tersus Plus PCR kit» ©ЗАО «Евроген», Россия). Для приготовления 25 мкл реакционной смеси смешивают 5 мкл Tersus Red буфер, 0,5 мкл смеси dNTP, 0,5 мкл Tersus полимеразы, 2 мкл 5 мкмоль праймера F, 2 мкл 5 мкмоль праймера R, 5 мкл раствора кДНК, 10 мкл деионизированной воды, свободной от ДНК-аз. Схема амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов - денатурация 95°C 20 секунд, отжиг 61°C 30 секунд, элонгация 72°C 120 секунд, 1 цикл - финальная элонгация при 72°C 10 минут. Схема амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов, включающих денатурацию 95°C 20 секунд, отжиг 59°C 30 секунд, элонгацию 72°C 120 секунд, 1 цикл финальная элонгация при 72°C 10 минут.

4) Очистка продуктов амплификации производится при помощи колонок «Cleanup mini» ©ЗАО «Евроген» (Россия).

5) Оценка концентрации продуктов амплификации производится путем гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле в TBE-буфере ©ЗАО «Евроген» (Россия), с использованием маркеров длин ДНК ©ЗАО «Евроген» (Россия) и/или с помощью флуориметрии. Количество продукта амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, должно находиться в диапазоне 10-20 нг. Количество продукта амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, должно находиться в диапазоне 30-40 нг. Достижение необходимой концентрации обеспечивается за счет разбавления продуктов амплификации раствором формамида («Формамид для молекулярной биологии «Формамид-СЕ», ©Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси», Белоруссия).

6) Проведение секвенирующей реакции производится при помощи «Набора реагентов для секвенирования ДНК по методу Сенгера «GenSeq» ©ООО «НПФ Синтол», Россия. Для проведения секвенирующей реакции формируют 8 реакционных смесей, по одной на каждый праймер для секвенирующей реакции. Для приготовления 10 мкл реакционной смеси смешивают 4 мкл готовой реакционной смеси GenSeq, от 1 до 3 мкл продукта амплификации (в зависимости от концентрации продукта), 1 мкл праймера 4 пкмоль/мкл, деионизированную воду до объема 10 мкл. Продукт амплификации, полученный из аликвоты №1 (фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу) используют в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5` TAGGGAAAATYTGGCCTT 3`, 5` CCATCCATTCCTGGCTT 3`. Продукт амплификации, полученный из аликвоты №2 (фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий ревертазу) используют в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5` ATGATAGGGGGAATTGGAGG 3`, 5` GGAATATTGCTGGTGATCC 3`, 5` GGGDGATGCATATTTTTCAGT 3`, 5` TCATAHCCCATCCAAAG 3`, 5` CCTCCATTYCTTTGGATGGG 3`, 5` CCAYTCAGGAATCCAGGT 3`.

7) После очистки продуктов секвенирующей реакции проводится с помощью спиртового осаждения. проводят секвенирование по Сенгеру проводится с помощью капиллярного электрофореза высокого разрешения. На одну пробу задействуется 8 капилляров. В качестве реагентов используются: «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Анодный», «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Катодный» ©Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» (Белоруссия), полимер ПДМА-6 ©ООО «НПФ Синтол» (Россия). В результате получается 8 прочтений, перекрывающих фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу и ревертазу.

9) Сборка последовательностей производится при помощи общедоступного программного обеспечения Unipro UGENE ©ООО НЦИТ «УНИПРО» (Россия).

Осуществление изобретения

В качестве материала использовали плазму крови. Перед выделением нуклеиновых кислот для повышения концентрации РНК ВИЧ в образце проводили ультрацентрифугирование 1 мл плазмы крови в течение 1 часа при скорости центрифуги 24000 g и температуре 4°С. Затем удалили 900 мкл надосадочной жидкости и далее работали с осадком 100 мкл. Выделение вирусной РНК из исследуемой пробы проводили с помощью коммерческих наборов реагентов, предназначенных для этих целей в соответствии с инструкцией производителя. Использовали выделение нуклеиновых кислот методом сорбции на силикагелевом носителе с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» ©ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия), в качестве сравнения проводили выделение нуклеиновых кислот методом твердофазной экстракции с помощью набора реагентов «МАГНО-сорб» ©ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия). Различные способы выделения не оказали существенного влияния на результат. Пробу аликвотировали в 2 пробирки по 20 мкл полученного раствора нуклеиновых кислот.

Перед постановкой реакции обратной транскрипции производили предварительный отжиг генспецифических обратных праймеров при 70 °C в течение 3 минут: в аликвоте №1 (объем 10 мкл) праймер CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC для протеазы (объем 2 мкл, концентрация 5 мкмоль) и в аликвоте №2 (объем 10 мкл, концентрация 5 мкмоль) праймером TCCCACTCAGGAATCCAGGT для ревертазы (объем 2 мкл). К аликвотам добавляли смесь для обратной транскрипции, содержащую генетически модифицированную обратную транскриптазу (ревертазу) вируса лейкемии мышей (M-MuLV) RNAscribe RT («Обратная транскриптаза RNAscribe RT» ©ООО «Биолабмикс», Россия) в объеме 8 мкл. Проводили обратную транскрипцию, инкубируя реакционные смеси при 55°С в течение 50 минут, после чего выполняли денатурацию реакционной смеси при 85°С в течение 5 минут.

Приготовили следующую ПЦР смесь: 5 мкл Tersus Red буфер, 0,5 мкл смеси dNTP, 0,5 мкл Tersus полимеразы (реагенты из набора «Tersus Plus PCR kit» ©ЗАО «Евроген», Россия), по 2 мкл 5 мкмоль прямого (F) и обратного (R) праймера, 10 мкл деионизированной воды, свободной от ДНК-аз. Для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу использовали комбинацию праймеров 5` TAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGG 3` (прямой праймер F) и 5` CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC 3` (обратный праймер R). Для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, использовали комбинацию праймеров 5` TAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCA 3` (прямой праймер F) и 5` TCCCACTCAGGAATCCAGGT 3` (обратный праймер R). Для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу использовали следующую схему: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов - денатурация 95°C 20 секунд, отжиг 61°C 30 секунд, элонгация 72°C 120 секунд, 1 цикл - финальная элонгация при 72°C 10 минут. Для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу использовали следующую схему: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов, включающих денатурацию 95°C 20 секунд, отжиг 59°C 30 секунд, элонгацию 72°C 120 секунд, 1 цикл финальная элонгация при 72°C 10 минут.

Очистку продуктов амплификации проводили при помощи колонок, использовали "Cleanup Mini" (Евроген, Москва) в соответствии с инструкцией производителя.

Для анализа длины и концентрации продуктов амплификации использовали электрофорез в 1,5% агарозном геле с использованием бромистого этидия и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе, оценку длины продукта производили с использованием маркеров длин ДНК, оценку концентрации производили по интенсивности окрашивания бендов.

Проведение секвенирующей реакции производили при помощи «Набора реагентов для секвенирования ДНК по методу Сенгера «GenSeq» ©ООО «НПФ Синтол», Россия. Для проведения секвенирующей реакции сформировали 8 реакционных смесей, по одной на каждый праймер для секвенирующей реакции. Для приготовления 10 мкл реакционной смеси смешивали 4 мкл готовой реакционной смеси GenSeq, от 1 до 3 мкл продукта амплификации (в зависимости от концентрации продукта), 1 мкл праймера 4 пкмоль/мкл, деионизированную воду до объема 10 мкл. Продукт амплификации, полученный из аликвоты №1 (фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу) использовали в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5` TAGGGAAAATYTGGCCTT 3`, 5` CCATCCATTCCTGGCTT 3`. Продукт амплификации, полученный из аликвоты №2 (фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий ревертазу) использовали в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5` ATGATAGGGGGAATTGGAGG 3`, 5` GGAATATTGCTGGTGATCC 3`, 5` GGGDGATGCATATTTTTCAGT 3`, 5` TCATAHCCCATCCAAAG 3`, 5` CCTCCATTYCTTTGGATGGG 3`, 5` CCAYTCAGGAATCCAGGT 3`.

Очистка продуктов секвенирующей реакции проводилась с помощью спиртового осаждения. Использовались следующие реагенты: 100% этиловый спирт, 70% этиловый спирт, раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 125 ммоль, pH 8,0. К 10 мкл продукта, полученного после секвенирующей реакции добавляют 2,5 мкл раствора ЭДТА (125 ммоль, pH 8,0) и 30 мкл 100% этилового спирта, перемешивали вортексированием, после чего инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли после центрифугирования при 4°С и 2000g 45 минут. Далее производилась промывка осадка 70% этанолом: добавляли 30 мкл этанола, центрифугировали 15 минут при 4°С и 2000g, удаляли надосадочную жидкость, после чего ДНК растворяли раствором формамида.

Секвенирование по Сенгеру проводили на генетическом анализаторе 3500 Genetic Analyzer ©Thermo Fisher Scientific (США). На одну пробу задействовали 8 капилляров. В качестве реагентов использовали: «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Анодный», «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Катодный» ©Государственное научное учреждение «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси» (Белоруссия), полимер ПДМА-6 ©ООО «НПФ Синтол» (Россия).

В результате получили 8 прочтений, перекрывающих фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу и ревертазу.

Сборку консенсусной последовательностей производили при помощи общедоступного программного обеспечения Unipro UGENE ©ООО НЦИТ «УНИПРО» (Россия) путем выравнивания электрофореграмм на референсный (по версии «Los Alamos HIV databases» [Apetrei и др., 2021]) геном ВИЧ субсубтипа A6 (GeneBank accession number KU749403).

Определение мутаций лекарственной устойчивости и резистентности к ИП, НИОТ и ННИОТ. производили при помощи общедоступного онлайн сервиса Стэнфордского университета HIVdb Program: Mutations Analysis (версия программы 3.4.3; версия алгоритма 9.4) [Liu, Shafer, 2006].

Пример применения способа способ определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в генах протеазы и обратной транскриптазы

Исследовали пробу плазмы крови от пациента с ВИЧ-инфекцией и неэффективной антиретровирусной терапией: вирусная нагрузка на фоне приема Ламивудина (3TC, НИОТ), Эмтрицитабина (FTC, НИОТ), Атазанавира (ATV, ИП) составляла 3900 копий РНК ВИЧ-1 на 1 мл. Взятие крови проводилось утром натощак в пробирку с 3 % раствором ЭДТА из расчета 1:20. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивали. В течение 4 часов с момента взятия крови отобрали образец плазмы крови в новую пробирку. Для этого пробирку с кровью центрифугировали 20 мин при 1600 g. Транспортировали и хранили образец в течении 2-х суток при температуре 4°С.

В результате реализации заявляемого способа получили следующие результаты:

1. получена консенсусная последовательность фрагмента гена pol ВИЧ-1 от позиции 2085 до 3856 (нумерация по референсному геному KU749403), длиной 1772 нуклеотида:

GGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGCCATCAAATGAAAGACTGCACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAGAATTTGGCCTTCCAGCAAAGGGAGGCCAGGAAATTTTCCTCAGAGCAGACCAGAGCCATCAGCCCCACCAGCAGAACTCTTTGGGATGGGGGAAGAGATGACCCCCTCCCTGAAACAGGAACAGAAAGACAGGGAACAGAGGCCTCCTTCAGTTTCCCTCAAATCACTCTTTGGCAGCGACCCATTGTCACAGTAAGAATAGAAGGACAGCTAAAAGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGACATAAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATAGTTATAGAAATTTATGGAAAAAAGGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGGCCTACCCCTGTCAACATAATTGGAAGAAATATGTTGACTCAGATTGGCTGTACTTTAAATTTCCCAATAAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAACWTTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAGGTTAAACAATGGCCATTRACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAATGGACATTTGTAATGARATGGAAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAATATTTGCTATAAAGAAGAAAGATAGCACTAAGTGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGGGAGCTCAATAAAAGAACTCAGGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGCATACCTCATCCAGCTGGTTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTACTAGATGTGGGGGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAAATGAAAACTTCAGAAATTATACTGCATTCACTGTACCAAGTATAAACAATGAGACACCAGGGATCAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAGAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCATTTAGATTACAAAATCCAGAAGTAGTTATCTATCAATACGTGGATGACTTATATGTAGGCTCTGATTTAGAAATAGGGCAACATAGAGCAAAAATAGAGGAGTTGAGAGCTCATCTATTGAGCTGGGGATTTACTACACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTTCTTTGGATGGGGTATGAACTCCATCCTGACAAGTGGACAGTCCAGCCTATAACGCTGCCAGATAAAGACAGCTGGACTGTCAATGATATACAGAAATTAGTGGGAAAACTAAATTGGGCAAGTCAGATTTATGCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTGTGTAAACTCCTTAGAGGAGCCAAAGCACTGACAGATATAGTGACACTGACTGAGGAAGCAGAATTAGAATTGGCAGAGAACAGAGAGATTCTAAAAGAACCTGTGCATGGGGTATATTATGACCCATCAAAAGAATTAATAGCAGAAATACAGAAACAAGGACAGGAACAATGGACATATCAAATTTATCAGGAGCCATTTAAAAATCTAAAAACAGGAAAATATGCAAAAAGGGGGTCTGCTCACACTAATGATGTAAAACAATTAACAGCAGTGGTGCAAAAAGTGGCCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGACTCCTAAATTTAGACTACCCATACAAAAAGAAACATGGGAAGCATGGTGGATGGAGTACTGGCAGGCTACCTGGATTCCTGAGTGGGA

Фрагмент протеазы начинается с позиции 2316, фрагмент ревертазы - 2613.

Выявлены следующие мутации лекарственной устойчивости (МЛУ) и прочие аминокислотные замены:

1. в фрагменте гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу:

МЛУ: нет

Прочие: L10I, I13V, K14R, G16E, E35D, M36I, R41K, L63V, C67Y, H69K, L89M

2. в фрагменте гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу:

МЛУ: M184V

Прочие: K11T, V35M, E36D, T39N, V60I, D121N, K122E, D123N, K126N, I132V, K173L, D177E, I178V, T200A, Q207A, R211S, V245T, E248D, K277R, T286A, E291D, V292I, I293V, P294T, D324E, G335E, R356K, M357R, R358G, G359S, E370A, A371V, I375V, K390R, T403M, E415X

Установлена генотипическая резистентность/чувствительность к следующим антиретровирусным препаратам:

из класса ИП:

Атазанавир (ATV/r) Чувствителен

Дарунавир (DRV/r) Чувствителен

Фосампренавир (FPV/r) Чувствителен

Индинавир (IDV/r) Чувствителен

Лопинавир (LPV/r) Чувствителен

Нелфинавир (NFV/r) Чувствителен

Саквинавир (SQV/r) Чувствителен

Типранавир (TPV/r) Чувствителен

из класса НИОТ:

Тенофовир (TDF) Чувствителен

Эмтрицитабин (FTC) Высокий уровень устойчивости

Зидовудин (AZT) Чувствителен

Ставудин (D4T) Чувствителен

Диданозин (DDI) Возможно низкий уровень устойчивости

Ламивудин (3TC) Высокий уровень устойчивости

Абакавир (ABC) Низкий уровень устойчивости

из класса ННИОТ:

Рилпивирин (RPV) Чувствителен

Эфавиренц (EFV) Чувствителен

Этравирин (ETR) Чувствителен

Невирапин (NVP) Чувствителен

Результат полностью подтвержден с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс® HIV-Resist-Seq» ©ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия)

Способ разработан и апробирован в Уральском окружном центре профилактике и борьбы со СПИД ФБУН Федеральный научно-исследовательский институт вирусных инфекций «Виром» Роспотребнадзора.

Источники научно-технической и патентной информации.

1. Богословская Е. и др. Результаты государственных испытаний тест-системы, предназначенной для выявления мутаций устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008. № 3. С. 51-53.

2. Лободанов С. А. Тесты для выявления лекарственной устойчивости ВИЧ: настоящее и будущее // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2015. Т. 7. № 2. С. 55-60.

3. Ожмегова Е., Бобкова М. Лекарственная устойчивость ВИЧ: прежние и современные тенденции // Вопросы вирусологии. 2022. Т. 67. № 3. С. 193-205.

4. Apetrei C. и др. HIV Sequence Compendium 2021. Los Alamos,New Mexico: Theoretical Biology and Biophysics Group, 2021.

5. Cunningham S. и др. Performance of the applied biosystems ViroSeq human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genotyping system for sequence-based analysis of HIV-1 in pediatric plasma samples // J Clin Microbiol. 2001. Т. 39. № 4. С. 1254-1257.

6. Larder B. и др. Method for mutation detection in HIV-1 using pol sequencing // 2004.

7. Liu T. F., Shafer R. W. Web resources for HIV type 1 genotypic-resistance test interpretation // Clin Infect Dis. 2006. Т. 42. № 11. С. 1608-1618.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Способ определения МЛУ ВИЧ.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-09-18">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>W23045416</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2023120817</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>W23045416</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ФНИИВИ «ВИРОМ»

РОСПОТРЕБНАДЗОРА</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBIS FSRIVI &quot;Virome&quot;

Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Питерский Михаил

Валерьевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Piterskiy Michael Valerievich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ определения мутаций

лекарственной устойчивости ВИЧ в генах протеазы и обратной

транскриптазы</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taggaaaaagggctgttggaaatgtgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggttgtgcytgaatgattcctaatgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagggggaattggaggttttatca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcccactcaggaatccaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagggaaaatytggcctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatccattcctggctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgatagggggaattggagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaatattgctggtgatcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggdgatgcatatttttcagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcatahcccatccaaag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctccattyctttggatggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Human immunodeficiency virus

1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccaytcaggaatccaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии. Предложен способ определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ методом секвенирования генов протеазы и обратной транскриптазы. Выделяют вирусную РНК, получают кДНК, которую используют в качестве матрицы при постановке реакции ПЦР. Продукты ПЦР реакции очищают и секвенируют. Мутации лекарственной устойчивости анализируют при помощи общедоступных сервисов. Изобретение позволяет выявлять мутации лекарственной устойчивости ВИЧ с полным покрытием не менее чем двумя непрерывными прочтениями исследуемого фрагмента. 1 пр.

Способ определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в генах протеазы и обратной транскриптазы, заключающийся в том, что после выделения вирусной РНК сразу отбирают две аликвоты по 10 мкл: одна для исследования фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, вторая для исследования фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, перед постановкой реакции обратной транскрипции производят предварительный отжиг генспецифических обратных праймеров при 70°C в течение 3 минут: в аликвоте №1 объем 10 мкл праймер CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC для протеазы объем 2 мкл, концентрация 5 мкмоль и в аликвоте №2 объем 10 мкл, концентрация 5 мкмоль, праймер TCCCACTCAGGAATCCAGGT для ревертазы объем 2 мкл, к аликвотам добавляют смесь для обратной транскрипции, содержащую генетически модифицированную обратную транскриптазу - ревертазу вируса лейкемии мышей M-MuLV RNAscribe RT в объеме 8 мкл, проводят обратную транскрипцию, инкубируя реакционные смеси при 55°С в течение 50 минут, после чего выполняют денатурацию реакционной смеси при 85°С в течение 5 минут, для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, используют комбинацию праймеров: 5' TAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGG 3' праймер F и 5' CTGGTTGTGCYTGAATGATTCCTAATGC 3' праймер R, для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, используют комбинацию праймеров: 5' TAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCA 3' праймер F и 5' TCCCACTCAGGAATCCAGGT 3' праймер R, реакционную смесь для ПЦР готовят на основе набора реагентов, содержащих смесь термостабильных ДНК-полимераз для высокоточной и специфичной амплификации фрагментов ДНК Tersus®, для приготовления 25 мкл реакционной смеси смешивают 5 мкл Tersus Red буфер, 0,5 мкл смеси dNTP, 0,5 мкл Tersus полимеразы, 2 мкл 5 мкмоль праймера F, 2 мкл 5 мкмоль праймера R, 5 мкл раствора кДНК, 10 мкл деионизированной воды, свободной от ДНКаз; схема амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов - денатурация 95°C 20 секунд, отжиг 61°C 30 секунд, элонгация 72°C 120 секунд, 1 цикл - финальная элонгация при 72°C 10 минут; схема амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу: 1 цикл - денатурация 95°C 60 секунд, 40 циклов, включающих денатурацию 95°C 20 секунд, отжиг 59°C 30 секунд, элонгацию 72°C 120 секунд, 1 цикл - финальная элонгация при 72°C 10 минут, очистку продуктов амплификации производят при помощи колонок «Cleanup mini», оценку концентрации продуктов амплификации производят путем гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле в TBE-буфере с использованием маркеров длин ДНК и/или с помощью флуориметрии, количество продукта амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего протеазу, должно находиться в диапазоне 10-20 нг, количество продукта амплификации фрагмента гена pol ВИЧ-1, кодирующего ревертазу, должно находиться в диапазоне 30-40 нг, достижение необходимой концентрации обеспечивают за счет разбавления продуктов амплификации раствором формамида, для проведения секвенирующей реакции формируют 8 реакционных смесей, по одной на каждый праймер для секвенирующей реакции, для приготовления 10 мкл реакционной смеси смешивают 4 мкл готовой реакционной смеси GenSeq, от 1 до 3 мкл продукта амплификации в зависимости от концентрации продукта, 1 мкл праймера 4 пкмоль/мкл, деионизированную воду до объема 10 мкл, продукт амплификации, полученный из аликвоты №1 фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу, используют в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5' TAGGGAAAATYTGGCCTT 3', 5' CCATCCATTCCTGGCTT 3', продукт амплификации, полученный из аликвоты №2 фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий ревертазу, используют в секвенирующих реакциях со следующими праймерами: 5' ATGATAGGGGGAATTGGAGG 3', 5' GGAATATTGCTGGTGATCC 3', 5' GGGDGATGCATATTTTTCAGT 3', 5' TCATAHCCCATCCAAAG 3', 5' CCTCCATTYCTTTGGATGGG 3', 5' CCAYTCAGGAATCCAGGT 3', после очистки продуктов секвенирующей реакции с помощью спиртового осаждения проводят секвенирование по Сенгеру с помощью капиллярного электрофореза высокого разрешения, на одну пробу задействуют 8 капилляров, в качестве реагентов используют: «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Анодный», «Буфер для генетических анализаторов серии 3500 «БУФЕР-СЕ Катодный», полимер ПДМА-6, в результате получают 8 прочтений, перекрывающих фрагмент гена pol ВИЧ-1, кодирующий протеазу и ревертазу, сборку последовательностей производят при помощи общедоступного программного обеспечения Unipro UGENE.