Микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты и способ получения микоспорин-подобной аминокислоты с его использованием Российский патент 2020 года по МПК C12N15/70 C12N1/21 C12N1/19 C12P13/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Описание настоящего изобретения относится к микроорганизму для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты и к способу получения микоспорин-подобной аминокислоты с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

Излучаемый солнцем ультрафиолетовый свет состоит из УФ-А (ультрафиолета А, диапазон которого составляет от приблизительно 320 нм до 400 нм), УФ-В (ультрафиолета В, диапазон которого составляет от приблизительно 290 нм до 320 нм) и УФ-С (ультрафиолета С, диапазон которого составляет от приблизительно 100 нм до 280 нм). Среди солнечных лучей приблизительно 6% УФ-А и УФ-В достигает поверхности Земли, с другой стороны, УФ-С не достигает поверхности Земли, поскольку поглощается и рассеивается в озоновом слое и в атмосфере Земли.

Хотя эти УФ лучи могут обеспечивать полезные аспекты, такие как синтез витамина D в организме, лечение кожных заболеваний, эффекты стерилизации и т.д., они также несут в себе вредные аспекты, такие как солнечные ожоги, рак кожи, старение, заболевания, обусловленные светочувствительностью кожи, и мутагенез. Известно, что УФ-А проникает даже в слой дермы, что, в основном, вызывает пигментацию и старение кожи, и вовлечен в развитие заболеваний, обусловленных светочувствительностью кожи, а УФ-В связывают с солнечными ожогами, пигментацией и злокачественными новообразованиями кожи вследствие проникновения лучей высокой энергии в верхний слой эпидермиса и дерму.

Чтобы предотвратить эти побочные эффекты, вызываемые солнечными лучами, сделаны попытки блокирования солнечного света. Типы предназначенных для этой цели солнцезащитных агентов можно разделить на химические солнцезащитные агенты и физические солнцезащитные агенты. Химические солнцезащитные агенты прежде всего блокируют проникновение солнечного света посредством поглощения, при этом физические солнцезащитные агенты блокируют проникновение солнечного света посредством отражения и рассеивания солнечного света.

Химические солнцезащитные агенты содержат один или более компонентов, поглощающих УФ-свет, таких как пара-аминобензойная кислота (ПАБК), сложные эфиры ПАБК (амилдиметил-ПАБК, октилдиметил-ПАБК), циннаматы (циноксат), салицилаты (гомометилсалицилат), камфора и т.д., которые поглощают в основном УФ-В, и бензофенон (оксибензон, диоксибензон, сулизобензон), дибензоилметан, антранилат и т.д., поглощающие в основном УФ-А. Хотя эти химические солнцезащитные агенты могут обеспечить защитный эффект от УФ света за счет поглощения УФ лучей, некоторые из них могут вызывать раздражение кожи или глаз. В частности, известно, что ПАБК, сложные эфиры ПАБК, бензофеноны, циннаматы и т.д. вызывают контактный дерматит. Дополнительно сообщалось о проблемах, связанных с тем, что некоторые другие агенты обуславливают развитие реакций гиперчувствительности кожи, и поэтому применение химических солнцезащитных агентов и их используемое количество в некоторых странах ограничено.

Физические солнцезащитные агенты, которые содержат существующие в природе компоненты, защищают кожу за счет отражения и рассеивания проникающих в кожу УФ лучей. Например, такие физические солнцезащитные агенты, как диоксид титана, тальк (силикат магния), оксид магния, оксид цинка, каолин и т.д., могут обеспечить УФ-защитный эффект как от УФ-А, так и от УФ-В. Кроме того, их преимущество состоит в том, что они не обладают побочными эффектами, такими как контактный дерматит, и не смываются легко водой. Но они, наоборот, также имеют недостатки, связанные с тем, что при применении желаемой композиции физических солнцезащитных агентов поддержание их эффективного количества может быть затруднительным, и они оставляют белый оттенок при нанесении на кожу.

Микоспорин-подобные аминокислоты (МАК) представляют собой вещества, обнаруживаемые в природных организмах, и известные как эффективные поглотители УФ-А (320 нм - 400 нм) и УФ-В (290 нм - 320 нм). В природе существует 35 или более видов МАК в зависимости от типа аминокислот, циклогексенонового или циклогексениминового кольца, служащих в качестве предшественников. (Mar. Biol., 1991, 108: 157-166; Planta Med., 2015, 81: 813-820). Недавно в микроводорослях были обнаружены различные гликозилированные МАК, о которых сообщалось, что они играют роль превосходных антиоксидантов (Journal of Photochemistry and Photobiology, 2015, 142: 154-168). Дополнительно известно, что МАК не только обеспечивают защиту от УФ света, но также проявляют устойчивость к окислению, осмосу и тепловому стрессу (Comp. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol., 2007, 146: 60-78; J. Photochem. Photobiol. В., 2007, 89: 29-35).

Тем не менее количество продуцируемой микроводорослями МАК слишком мало, на уровне нескольких мкг, а условия выделения, экстракции и очистки МАК путем культивирования микроводорослей сложны, и поэтому получить МАК на уровне крупномасштабного производства могло бы быть затруднительным.

Документация предшествующего уровня техники

Непатентная документация

Непатентный документ 1 Comp. Biochem. Physiol. В., 1995, 112: 105-114.

Непатентный документ 2 FEMS Microbiol Lett. 2007, 269: 1-10.

Непатентный документ 3 Ann. Rev. Physiol. 2002, 64: 223-262.

Непатентный документ 4 Mar. Biol. 1991, 108: 157 166.

Непатентный документ 5 Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2015, 142: 154-168

Непатентный документ 6 Biol. Rev. 1999, 74: 311-345.

Непатентный документ 7 Mol. Biol. Evol. 2006, 23: 1437-1443.

Непатентный документ 8 Science, 2010, 329: 1653 1656.

Непатентный документ 9 Genomics 2010, 95: 120-128.

Непатентный документ 10 Geomicrobiol. J. 1997, 14: 231-241.

Непатентный документ 11 Comp. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2007. 146: 60-78.

Непатентный документ 12 Can. J. Bot. 2003. 81: 131-138.

Непатентный документ 13 J. Photochem. Photobiol. В., 2007, 89: 29-35.

Непатентный документ 14 J. Bacteriol. 2011. 193(21): 5923-5928.

Непатентный документ 15 PlantaMed. 2015. 81: 813-820

Непатентный документ 16 ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. 7: 16558-16564

Непатентный документ 17 Appl Environ Microbiol. 2016, 82(20): 6167-6173

Непатентный документ 18 ChemBioChem. 2015, 16: 320-327

Непатентный документ 19 Methods Mol Biol. 2013, 1073: 437

Непатентный документ 20 Enzyme Microb Technol., 2016, Jan, 82: 96-104

Непатентный документ 21 Nature Review, 2011, 9: 791-802

Описание

Техническая задача изобретения

Авторы настоящего изобретения приложили интенсивные усилия к повышению продукции МАК в микроорганизмах. В результате было подтверждено, что продукция МАК была повышена посредством различных исследований по инактивации активности 3-дегидрохиннатдегидратазы в микроорганизме, продуцирующем МАК, в результате чего было выполнено настоящее изобретение.

Техническое решение

Одним объектом настоящего изобретения является предоставление микроорганизма для продуцирования микроспорин-подобной аминокислоты, в котором активность 3-дегидрохиннатдегидратазы инактивирована по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

Другим объектом настоящего изобретения является предоставление способа продуцирования микроспорин-подобной аминокислоты, включающего:

культивирование микроорганизма; и

извлечение микроспорин-подобной аминокислоты из культивируемого микроорганизма или из среды.

Преимущественные эффекты изобретения

Микроорганизм по настоящему изобретению проявляет улучшенную способность к продуцированию микоспорин-подобной аминокислоты и, таким образом, может быть эффективно использован в получении микоспорин-подобной аминокислоты.

Подробное описание предпочтительных воплощений изобретения

Конкретные особенности настоящего изобретения могут быть пояснены ниже.

Тем не менее раскрытые в описании настоящего изобретения пояснения и воплощения могут быть применены к другим пояснениям и воплощениям соответственно. Таким образом, все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем документе, относятся к объему настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не подлежит ограничению конкретными описаниями, приведенными в настоящем документе ниже. Кроме того, специалист среднего уровня в данной области техники с помощью лишь традиционных экспериментов сможет распознать или подтвердить множество эквивалентов конкретных аспектов изобретения, описанных в данной заявке. Более того, также подразумевают, что эти эквиваленты должны быть включены в настоящее изобретение.

Для достижения описанных выше целей в одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм для продуцирования микроспорин-подобной аминокислоты, в котором активность 3-дегидрохиннатдегидратазы инактивирована по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

При использовании в настоящем документе термин «3-дегидрохиннатдегидратаза» относится к ферменту, катализирующему обратимую реакцию, представленную на приведенной ниже схеме реакции, и может специфично преобразовывать 3-дегидрохиннат в 3-дегидрошикимат, но не ограничен этим.

Схема реакции

Используемый в настоящем документе термин «инактивация» относится к случаю, где активность белка-фермента, которой исходно обладает микроорганизм, ослаблена по сравнению с его эндогенной активностью или активностью до модификации; к случаю, где отсутствует какая-либо экспрессия белка; или к случаю, где белок экспрессируется, но не проявляет активности. Понятие инактивации включает в себя случай, где активность самого фермента ослаблена или отсутствует по сравнению с активностью фермента, которой исходно обладает микроорганизм, вследствие модификации в кодирующем этот фермент полинуклеотиде и т.д.; случай, где общий уровень активности фермента внутри клетки снижен или фермент удален по сравнению с микроорганизмом дикого типа вследствие ингибирования экспрессии кодирующего фермент гена или ингибирования его трансляции и т.д.; случай, где кодирующий фермент ген или его участок делетирован; и их комбинацию, но не ограничено этим. Термин «немодифицированный микроорганизм» относится к микроорганизму, обладающему активностью конкретного белка, которой исходно обладает родительский штамм до его модификации, при этом признаки микроорганизма модифицируют посредством генетической модификации в конкретном белке, которым обладает микроорганизм по сравнению с модификацией вследствие естественных или искусственных факторов. При использовании в настоящем документе термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с термином «микроорганизм, обладающий эндогенной активностью».

Инактивация ферментативной активности может быть достигнута различными способами, хорошо известными в данной области техники. Примеры этих способов включают 1) способ делетирования всего гена, кодирующего фермент на хромосоме, или его участка; 2) способ модифицирования регуляторной последовательности экспрессии таким образом, чтобы экспрессия гена, кодирующего фермент на хромосоме, была снижена; 3) способ модифицирования последовательности кодирующего белок гена на хромосоме таким образом, чтобы активность этого белка была устранена или ослаблена; 4) способ введения антисмыслового олигонуклеотида, который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего белок на хромосоме (например, антисмысловая РНК); 5) способ искусственного присоединения последовательности, комплементарной последовательности Шайна - Дальгарно гена, кодирующего белок на хромосоме, выше этой последовательности Шайна - Дальгарно с образованием вторичной структуры, в результате чего адгезия рибосомы становится невозможной; и 6) способ обратно-транскрипционного (ОТ) конструирования, при котором к 3'-концу открытой рамки считывания (ОРС) кодирующей белок полинуклеотидной последовательности присоединяют промотор, с которого должна идти обратная транскрипция, или комбинацию этих способов, но без конкретного ограничения этими ими.

Способ делетирования всего гена, кодирующего фермент на хромосоме, или его участка можно осуществлять путем замещения кодирующего эндогенный целевой белок полинуклеотида внутри хромосомы полинуклеотидом, имеющим частично делетированную нуклеиново-кислотную последовательность, или геном-маркером с помощью вектора для встраивания в хромосому микроорганизма. В качестве примера способа делетирования всего полинуклеотида или его участка можно, не ограничиваясь этим, использовать способ делетирования полинуклеотида посредством гомологичной рекомбинации.

Способ модифицирования регуляторной последовательности экспрессии можно осуществлять путем индукции модификации в регуляторной последовательности экспрессии посредством делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены, или их комбинации с целью дополнительного ослабления активности регуляторной последовательности экспрессии; или путем замены этой последовательности нуклеиново-кислотной последовательностью, обладающей ослабленной активностью. Регуляторная последовательность экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую домен связывания рибосомы, и последовательность регуляции терминации транскрипции и трансляции, но не ограничена ими.

Способ модифицирования последовательности гена на хромосоме можно осуществлять путем индукции модификации в последовательности гена посредством делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены, или их комбинации таким образом, чтобы дополнительно ослабить активность фермента; или путем замещения последовательности модифицированной последовательностью этого гена, обладающего более слабой активностью или модифицированной последовательностью этого гена, активность которого полностью отсутствует, но не ограничен этим.

Полинуклеотид может быть описан как ген в тех случаях, где он относится к комплексу полинуклеотидов, способному к выполнению функций. В описании настоящего изобретения термины «полинуклеотиды» и «гены» можно использовать взаимозаменяемо, и термины «полинуклеотидные последовательности» и «нуклеотидные последовательности» можно использовать взаимозаменяемо.

Используемый в настоящем документе термин «участок», хотя он может изменяться в зависимости от видов полинуклеотида, может конкретно относиться к участку длиной от 1 до 300 нуклеотидов, более конкретно от 1 до 100 нуклеотидов и еще более конкретно от 1 до 50 нуклеотидов, но в частности не ограничен ими.

В микроорганизме по настоящему изобретению активность по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы I/II и 3-дегидрохиннатсинтазы, в частности, активность одного или более, двух или более, трех или более, или всех этих ферментов, может быть усилена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

2-Дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза относится к ферменту, катализирующему обратимую реакцию, представленную на приведенной ниже схеме реакции, и может специфично синтезировать 3-дезокси-арабино-гептулозонат-7-фосфат, но не ограниченному этим.

Схема реакции

Фосфоенолпируватсинтетаза относится к ферменту, катализирующему обратимую реакцию, представленную на приведенной ниже схеме реакции, и может специфично синтезировать фосфоенолпируват, но не ограниченному этим.

Схема реакции

Транскетолаза I/II относится к ферменту, катализирующему обратимую реакцию, представленную на приведенной ниже схеме реакции.

Схема реакции

Седогептулозо-7-фосфат + D-глицеральдегид-3-фосфат = D-рибозо-5-фосфат + В-ксилулозо-5-фосфат

3-Дегидрохиннатсинтаза относится к ферменту, катализирующему обратимую реакцию, представленную на приведенной ниже схеме реакции, и может специфично синтезировать 3-дегидрохиннат (3-DHQ), но не ограничена этим.

Схема реакции

При использовании в настоящем документе термин «усиление активности» означает, что активность белка-фермента либо введена, либо усилена по сравнению с эндогенной активностью, которой обладает микроорганизм, или с активностью до модификации. «Введение» активности означает, что активность конкретного полипептида, которой микроорганизм исходно не обладал, экспрессируется естественным или искусственным путем. Например, усиление активности может включать в себя либо усиление за счет введения 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы VII и/или 3-дегидрохиннатсинтазы; либо усиление эндогенной активности 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы I/II и/или 3-дегидрохиннатсинтазы. В частности, усиление активности в настоящем изобретении можно осуществлять следующими способами:

1) способом увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего ферменты;

2) способом модифицирования регуляторной последовательности экспрессии таким образом, чтобы экспрессия полинуклеотида была повышена;

3) способом модифицирования полинуклеотидной последовательности на хромосоме таким образом, чтобы активность ферментов была усилена; и

4) способом модификации, усиливающей активность за счет комбинирования описанных выше способов, но не ограничиваясь ими.

Увеличение числа копий полинуклеотида в описанном выше способе 1) можно осуществить в такой форме, чтобы полинуклеотид был функционально связан с вектором, или путем встраивания полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина, но конкретно не ограничиваясь этим. Дополнительно в аспекте увеличения числа копий его можно осуществлять путем введения в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность фермента, или модифицированного полинуклеотида, в котором кодоны чужеродного полинуклеотида оптимизированы. Чужеродный полинуклеотид можно использовать без ограничения его происхождением или последовательностью при условии, что он проявляет активность, идентичную или подобную активности фермента. Специалисты в данной области техники могут осуществить это введение, выбрав подходящий способ трансформации, известный в данной области техники, и в случае экспрессии введенных в клетку-хозяина полинуклеотидов может продуцироваться фермент, таким образом, повышая активность.

Кроме того, модификацию регуляторной последовательности экспрессии в способе 2) таким образом, чтобы экспрессия полинуклеотида была повышена, можно осуществить путем индукции модификации последовательности посредством делеции, вставки или неконсервативной или консервативной замены нуклеиново-кислотной последовательности, либо их комбинации таким образом, чтобы дополнительно усилить активность регуляторной последовательности экспрессии, либо путем замещения нуклеотидной последовательностью, обладающей более сильной активностью, но конкретно не ограничиваясь этим. Дополнительно регуляторная последовательность экспрессии может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую домен связывания рибосомы, последовательность регуляции терминации транскрипции и трансляции и т.д., но без особых ограничений.

В частности, с областью, расположенной выше единицы экспрессии полинуклеотида, может быть связан сильный гетер о логичный промотор вместо исходного промотора. Примеры сильного промотора включают промотор CJ7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА или асеВ и т.д. Более конкретно уровень экспрессии кодирующего фермент полинуклеотида можно повысить путем функционального связывания полинуклеотида с промотором lysCP1 (WO 2009/0966S9) или с промотором CJ7 (WO 2006/065095), но не ограничиваясь ими.

Кроме того, модификацию полинуклеотидной последовательности на хромосоме в способе 3) можно осуществить путем индукции модификации в регуляторной последовательности экспрессии посредством делеции, вставки или неконсервативной или консервативной замены нуклеиново-кислотной последовательности, либо их комбинации таким образом, чтобы дополнительно усилить активность полинуклеотидной последовательности, либо путем замещения этой полинуклеотидной последовательности модифицированной полинуклеотидной последовательностью, обладающей более сильной активностью, но конкретно не ограничиваясь этим.

Наконец, способ модификации с усилением активности посредством комбинирования способов 1) - 3) в способе 4) можно осуществить путем комбинированного применения по меньшей мере одного из следующих способов: увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок; модифицирования регуляторной последовательности экспрессии таким образом, чтобы экспрессия полинуклеотида была повышена; модифицирования полинуклеотидной последовательности на хромосоме и модифицирования чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность фермента, или оптимизированного по кодонам полинуклеотида.

Используемый в настоящем документе термин «вектор» относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность кодирующего целевой белок полинуклеотида, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью так, чтобы целевой белок мог экспрессироваться в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает в себя промотор, способный к инициации транскрипции, любую последовательность оператора для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую домен связывания рибосомы соответствующей мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После того, как вектор трансформирован в подходящую клетку-хозяина, он может реплицироваться или функционировать независимо от генома клетки-хозяина, а может быть интегрирован в сам геном клетки-хозяина.

Используемый в настоящем изобретении вектор конкретно не ограничен при условии, что он может реплицироваться в клетке-хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры традиционно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.д., а в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и т.д. В частности, можно использовать векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.д., но вектор конкретно не ограничен ими.

Вектор, который можно использовать в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, и можно использовать известный экспрессионный вектор. Дополнительно, кодирующий целевой белок полинуклеотид может быть вставлен в хромосому с помощью вектора для вставки в хромосому. Вставку полинуклеотида в хромосому можно осуществить любым способом, известным в данной области техники, например, посредством гомологической рекомбинации, но не ограничиваясь этим. Для подтверждения вставки в хромосому можно дополнительно включать селективный маркер. Селективный маркер используют для отбора трансформированной вектором клетки, т.е. для подтверждения вставки целевых молекул нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, способные обеспечивать селективные фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, потребность в питательных веществах, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных белков. В окружающей среде, обработанной этими селективными агентами, могут выживать или экспрессировать другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективные маркеры, и таким образом можно легко отобрать трансформированные клетки.

Используемый в настоящем документе термин «трансформация» относится к процессу введения в клетку-хозяина вектора, включающего в себя полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, и, следовательно, обеспечивающего экспрессию кодируемого полинуклеотидом белка в клетке-хозяине. До тех пор, пока трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, встроен ли он в хромосому клетки-хозяина и расположен внутри нее, или расположен все хромосомы, и могут быть включены оба случая. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которая кодирует целевой полипептид. Полинуклеотид может быть введен в любой форме при условии возможности его введения в клетку-хозяина и экспрессии в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой генную конструкцию, включающую в себя все необходимые элементы для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета традиционно может включать в себя промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, терминатор, домен связывания рибосомы и стоп-кодон. Экспрессионная кассета может иметь форму экспрессионного вектора, способного к самостоятельной репликации. Кроме того, полинуклеотид можно вводить в клетку-хозяина как он есть и функционально связывать с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничений. Способ трансформации вектора включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку, и его можно осуществлять, выбирая подходящую стандартную методику, известную в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, трансформацию можно осуществлять с помощью методики электропорации, кальций-фосфатной (CaPO₄) преципитации, кальций-хлоридной (CaCl₂) преципитации, микроинъекции, методики, основанной на использовании полиэтиленгликоля (ПЭГ), методики, основанной на использовании ДЭАЭ-декстрана, катионно-липосомной методики, методики, основанной на использовании ацетата лития-ДМСО, и т.д., но способ не ограничен этими методиками.

Кроме того, используемый выше термин «функционально связанный» относится к функциональному соединению между описанной выше полинуклеотидной последовательностью и последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению. Функциональное связывание может быть получено с использованием известной в данной области методики рекомбинантных ДНК, а сайт-специфическое расщепление и лигирование ДНК можно осуществить с помощью известных в данной области техники ферментов, таких как лиазы, лигазы и т.д., но не ограничиваясь ими.

Генетическая информация о 3-дегидрохиннатдегидратазе, 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазе, фосфоенолпируватсинтетазе, транскетолазе и 3-дегидрохиннатсинтазе может быть получена из известной базы данных, и ее примеры включают GenBank Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information; NCBI) и т.д., но известная база данных не ограничена ею.

Происхождение или последовательности 3-дегидрохиннатдегидратазы, 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы и 3-дегидрохиннатсинтазы могут быть не ограничены, поскольку в зависимости от видов бактерий или микроорганизмов могут существовать различия по аминокислотной последовательности белка, проявляющего эту активность.

В частности, 3-дегидрохиннатдегидратаза может представлять собой белок, включающий в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72 или 80, а 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза, фосфоенолпируватсинтетаза, транскетолаза и 3-дегидрохиннатсинтаза могут представлять собой белки, включающие в себя аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 74, 76, 78 и 84 соответственно, но не ограниченные ими. В описании настоящего изобретения «белок, включающий в себя аминокислотную последовательность», можно использовать взаимозаменяемо с выражением «белок, имеющий аминокислотную последовательность» или «белок, состоящий из аминокислотной последовательности».

Дополнительно в описании настоящего изобретения ферменты могут включать не только белок, имеющий описанную выше аминокислотную последовательность SEQ ID, но также белок, имеющий гомологию 80% или более, в частности, 90% или более, более конкретно 95% или более, еще более конкретно 99% или более с описанными выше аминокислотными последовательностями при условии, что белок обладает биологической активностью, идентичной или соответствующей активности каждого из этих ферментов.

Кроме того, очевидно, что если аминокислотная последовательность имеет гомологию с описанными выше последовательностями, аминокислотная последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением участка последовательности также включена в объем настоящего изобретения при условии, что эта аминокислотная последовательность обладает биологической активностью, по существу идентичной или соответствующей активности белка-фермента, имеющего описанную выше аминокислотную последовательность SEQ ID NO.

Полинуклеотид, кодирующий 3-дегидрохиннатдегидратазу, 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазу, фосфоенолпируватсинтетазу, транскетолазу и 3-дегидрохиннатсинтазу по настоящему изобретению, может включать полинуклеотид, кодирующий описанную выше аминокислотную последовательность SEQ ID NO, или полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий гомологию 80% или более, в частности, 90% или более, более конкретно 95% или более, еще более конкретно 99% или более с описанными выше аминокислотными последовательностями при условии, что белок обладает биологической активностью, идентичной или соответствующей активности каждого из этих ферментов.

Дополнительно, в кодирующей области полинуклеотида, кодирующего 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазу, фосфоенолпируватсинтетазу, транскетолазу и 3-дегидрохиннатсинтазу, с учетом кодонов, предпочитаемых организмами для экспрессии белка вследствие вырожденности кодонов, могут быть выполнены различные модификации в пределах объема без изменения аминокислотной последовательности полипептида. Соответственно, полинуклеотид может включать любую полинуклеотидную последовательность, кодирующую каждый белок-фермент, без ограничений.

Кроме того, может быть без ограничений включен зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, из любой последовательности, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной всей нуклеотидной последовательности или ее участку в жестких условиях гибридизации, кодирующей белок, обладающий активностью 3-дегидрохиннатдегидратазы, 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы и 3-дегидрохиннатсинтазы.

Используемый в настоящем документе термин «гомология» относится к степени соответствия данной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности и может быть выражен в процентах. В настоящем описании гомологичная последовательность, обладающая активностью, идентичной или подобной активности данной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, может быть указана в виде «% гомологии». Например, гомология может быть подтверждена с помощью стандартного программного обеспечения для расчета таких показателей, как оценка в баллах, идентичность и подобие, в частности BLAST 2.0, или путем сравнения последовательностей с помощью экспериментов по гибридизации в определенных жестких условиях, и определенные подходящие жесткие условия гибридизации находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники и могут быть определены способом, известным специалистам в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Термин «жесткие условия» относятся к условиям, дающим возможность для специфичной гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия конкретно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al.).

Используемый в настоящем документе термин «микоспорин-подобные аминокислоты (МАК)» относится к циклическим соединениям, поглощающим ультрафиолетовые лучи. В описание настоящего изобретения может быть включена любая микоспорин-подобная аминокислота без ограничений при условии, что она может поглощать УФ лучи, но более конкретно она может представлять собой соединение, содержащее центральное кольцо циклогексенона или циклогексенимина; или соединение, в котором различные вещества, такие как аминокислота и т.д., связаны с центральным кольцом. Более конкретно, она может представлять собой микоспорин-2-глицин, палитинол, палитеновую кислоту, дезоксигадузол, микоспорин-метиламин-треонин, микоспорин-глицин-валин, палитин, астерина-330 (asterina-330), шинорин (shinorine), порфиру-334, эугалотек-362 (euhalothece-362), микоспорин-глицин, микоспорин-орнитин, микоспорин-лизин, микоспорин-глутаминовая кислота-глицин, микоспорин-метиламин-серин, микоспорин-таурин, палитен, палитин-серин, палитин-серин-сульфат, палитинол, усуджирен (usujirene) или их комбинацию.

В описании настоящего изобретения микоспорин-подобные аминокислоты могут использоваться взаимозаменяемо с МАК и МАА (англ.).

Используемый в настоящем документе термин «микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты» относится к микроорганизму, включающему в себя ген фермента, вовлеченного в биосинтез микоспорин-подобных аминокислот, или кластер этих генов. Кроме того, используемый в настоящем документе термин «ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты» относится к гену, кодирующему фермент, вовлеченный в биосинтез микоспорин-подобных аминокислот, а также включает в себя кластер этих генов. Ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты включает чужеродные и/или эндогенные гены микроорганизма при условии, что микроорганизм, включающий в себя этот ген, может продуцировать микоспорин-подобные аминокислоты. Чужеродные гены могут быть гомологичными и/или гетерологичными.

Ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может быть не ограничен видом микроорганизма, из которого получен этот ген, при условии, что включающий его микроорганизм продуцирует фермент, вовлеченный в биосинтез микоспорин-подобных аминокислот и, следовательно, продуцирует микоспорин-подобные аминокислоты. В частности, он может представлять собой Anabaena variabilis, Nostoc punctiforme, Nodularia spumigena, Cyanothece sp. PCC 7424, Lyngbya sp. PCC 8106, Microcystis aeruginosa, Microcoleus chthonoplastes, Cyanothece sp. АТСС 51142, Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp. CCY 0110, Cylindrospermum stagnate sp. PCC 7417, Aphanothece halophytica или Trichodesmium erythraeum, которые являются видами цианобактерий, или Magnaporthe oryzae, Pyrenophora tritici-repentis, Aspergillus clavatus, Nectria haematococca, Aspergillus nidulans, Gibberella zeae, Verticillium albo-atrum, Botryotinia fuckeliana или Phaeosphaeria nodorum, являющиеся видами грибов, или Nematostella vectensis, Heterocapsa triquetra, Oxyrrhis marina, Karlodinium micrum, Actinosynnema mirum, etc., но не ограничен этими видами.

В соответствии с одним воплощением изобретения микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты по настоящему изобретению может включать в себя ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты.

В частности, ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может быть не ограничен названием фермента или микроорганизмов, из которых они получены, при условии, что микроорганизм может продуцировать микоспорин-подобные аминокислоты, и может, в частности, включать по меньшей мере один, в частности, один или более, два или более, либо три или более, либо все белки-ферменты, выбранные из группы, состоящей из 2-деметил-4-дезоксигадузол-синтазы, О-метилтрансферазы и C-N лигазы; или ген, кодирующий белок-фермент, обладающий активностью, идентичной и/или подобной активности этих ферментов.

Например, 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтаза представляет собой фермент, который преобразует седогептулозо-7-фосфат в 2-деметил-4-дезоксигадузол. О-метилтрансфераза представляет собой фермент, который преобразует 2-деметил-4-дезоксигадузол в 4-дезоксигадузол, а глицирование 4-дезоксигадузола катализирует C-N лигаза.

Дополнительно микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя ген фермента, обладающего активностью присоединения к микоспорин-подобным аминокислотам дополнительных аминокислотных остатков, или кластер таких генов. Этот ген или кластер генов может быть не ограничен названием ферментов или микроорганизмов, из которых они получены, при условии, что микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты может продуцировать микоспорин-подобные аминокислоты, к которым присоединены два или более аминокислотных остатков, и может, в частности, включать ген по меньшей мере одного, в частности, одного или более, двух или более, трех или более, либо всех белков-ферментов, выбранных из группы, состоящей из синтетазы нерибосомных пептидов (NRPS), фермента, подобного синтетазе нерибосомных пептидов (NRPS-подобный фермент), и D-Ala-D-Ala лигазы (DDL); или ген, кодирующий белок-фермент, обладающий активностью, идентичной и/или подобной активности этих ферментов. Некоторые микоспорин-подобные аминокислоты могут включать второй аминокислотный остаток в микоспорин-глицине. По меньшей мере один фермент, выбранный из группы, состоящей из синтетазы нерибосомных пептидов, фермента, подобного синтетазе нерибосомных пептидов, и D-Ala-D-Ala лигазы, может присоединять второй аминокислотный остаток к микоспорин-глицину.

В соответствии с одним воплощением изобретения микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя любой фермент без ограничения названием ферментов или видов микроорганизмов, из которых они получены, при условии, что он обладает такой же активностью присоединения второй аминокислоты к микоспорин-глицину, как синтетаза нерибосомных пептидов, фермент, подобный синтетазе нерибосомных пептидов, и D-Ala-D-Ala лигаза.

В одном воплощении изобретения фермент, подобный синтетазе нерибосомных пептидов (Ava_3855), обнаруженный в Anabaena variabilis, или D-Ala-D-Ala лигаза (NpF5597), обнаруженная в Nostoc punctiforme, могут продуцировать шинорин (shinorine) путем присоединения остатка серина к микоспорин-глицину. В другом воплощении изобретения микоспорин-2-глицин может быть образован путем присоединения второго остатка глицина посредством гомолога D-Ala-D-Ala лигазы (Ар_3855), обнаруженного в Aphanothece halophytica. Аналогично, в Actinosynnema mirum серин или аланин может быть присоединен посредством D-Ala-D-Ala лигазы с образованием шинорина или микоспорин-глицин-аланина. Микроорганизм в соответствии с одним воплощением настоящего описания может включать в себя фермент, подходящий для продуцирования желаемых микоспорин-подобных аминокислот путем выбора из описанных выше ферментов или ферментов, обладающих активностью, идентичной и/иди подобной активности этих ферментов.

2-Деметил-4-дезоксигадузолсинтаза, О-метилтрансфераза, C-N лигаза, синтетаза нерибосомных пептидов, фермент, подобный синтетазе нерибосомных пептидов, и/или D-Ala-D-Ala лигаза, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть не ограничены видами микроорганизмов, из которых они получены, и может быть включен любой фермент без ограничений, если известно, что он выполняет идентичные и/или подобные функции и обладает соответствующими активностями. Дополнительно диапазон числовых значений гомологии между этими ферментами может быть не ограничен. Например, My1A, My1B, My1D, My1E и My1C Cylindrospermum stagnate PCC 7417 гомологичны 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазе, О-метилтрансферазе, C-N лигазе и D-Ala-D-Ala лигазе, полученным из Anabaena variabilis и Nostoc punctiforme, и подобие между этими гомологами составляет от примерно 61 до 88% (Appl Environ Microbiol, 2016, 82(20), 6167-6173; J Bacteriol, 2011, 193(21), 5923-5928). Таким образом, фермент, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть конкретно не ограничен видами микроорганизмов, из которых он получен, или гомологией последовательности, если известно, что он проявляет идентичные и/или подобные функции и эффекты. Далее, непатентная документация, раскрытая в предшествующем уровне техники, включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Дополнительно ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может представлять собой полинуклеотид, кодирующий белок, включающий в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 или 104, но не ограниченный ими.

Дополнительно ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, имеющую гомологию 50%, 60% или 70% или более, в частности 80% или более, более конкретно 90% или более, еще более конкретно 95% и еще более конкретно 99%, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, 4, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 или 104, и может без ограничений включать в себя любую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий гомологию, отклоняющуюся от описанной выше, при условии, что микроорганизм продуцирует микоспорин-подобные аминокислоты. В частности, ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя без ограничений нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 85, 84, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 или 103.

Кроме того, если аминокислотная последовательность имеет гомологию с описанной выше аминокислотной последовательностью, очевидно, что в объем настоящего изобретения также включена аминокислотная последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением участка последовательности при условии, что эта аминокислотная последовательность обладает биологической активностью, идентичной или соответствующей активности белка, имеющего описанную выше аминокислотную последовательность SEQ ID NO.

Дополнительно, принимая во внимание кодоны, предпочитаемые организмами для экспрессии белка, вследствие вырожденности кодонов, могут быть выполнены различные модификации в кодирующей области в объеме, не измененяющем аминокислотную последовательность полипептида. Соответственно, ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя без ограничений любую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, вовлеченный в синтез микоспорин-подобных аминокислот.

Кроме того, может быть без ограничений включен зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, из любой последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью, комплементарной всей нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, вовлеченный в биосинтез микоспорин-подобных аминокислот.

В соответствии с одним воплощением изобретения микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты может включать в себя гены биосинтеза микоспорин-подобных аминокислот, полученных из источников различного происхождения.

В описании настоящего изобретения инактивацию белка, усиление активности белка и/или введение гена в настоящем документе можно осуществлять одновременно, последовательно или в обратном порядке.

Используемый в настоящем документе термин «микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты» обладает эндогенными и/или экзогенно введенными генами биосинтеза микоспорин-подобных аминокислот и, таким образом, может продуцировать микоспорин-подобные аминокислоты, и дополнительно он может представлять собой микроорганизм, у которого способность к продуцированию микоспорин-подобных аминокислот повышена за счет инактивации эндогенной активности 3-дегидрохиннатдегидратазы. Введение гена биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты и инактивацию 3-дегидрохиннатдегидратазы можно осуществлять одновременно, последовательно или в обратном порядке.

Дополнительно микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой природный микроорганизм, исходно имеющий ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты; и микроорганизм, в который введен гомологичный и/или гетерологичный ген биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты, но не ограничен ими.

Дополнительно микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, обладающий усиленной активностью фермента, кодируемого эндогенным и/или введенным геном, связанным с биосинтезом микоспорин-подобной аминокислоты, но не ограничен ими.

Дополнительно микроорганизм по настоящему изобретению может не иметь ограничений при условии, что он обладает активностью 3-дегидрохиннатдегидратазы до модификации, и, в частности, он может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, микроорганизм рода Escherichia или дрожжи.

Микроорганизм рода Corynebacterium может, в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens и т.д. и более конкретно он может представлять собой Corynebacterium glutamicum, но не ограничен ими.

Микроорганизм рода Escherichia может, в частности, представлять собой Escherichia albertii, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris, и т.д., и более конкретно он может представлять собой Escherichia coli, но не ограничен ими.

Дрожжи, в частности, могут представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Saccharomycotina, Taphrinomycotina класса Ascomycota или Agaricomycotina, Pucciniomycotina класса Basidiomycota и т.д., и более конкретно он может представлять собой микроорганизм рода Saccharomyces, микроорганизм рода Schizosaccharomyces, микроорганизм рода Phaffia, микроорганизм рода Kluyveromyces, микроорганизм рода Pichia или микроорганизм рода Candida, и еще более конкретно он может представлять собой Saccharomyces cerevisiae, но не ограничен ими.

В настоящем изобретении в дрожжи для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты может быть введен ген, кодирующий 3-дегидрохиннатсинтазу, или может обладать усиленной активностью 3-дегидрохиннатсинтазы. Например, если в дрожжах весь ген ARO1 или его участок делетирован в целях инактивации активности 3-дегидрохиннатдегидратазы, функция 3-дегидрохиннатдегидратазы утрачивается, и, следовательно, синтез 3-DHQ может быть затруднительным. Таким образом, если в дрожжах делетирован весь ген ARO1 или его участок, в них может быть введен ген 3-дегидрохиннатсинтазы (например, ген aroB), но без ограничений.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования микроспорин-подобной аминокислоты, включающий:

культивирование микроорганизма по настоящему изобретению; и

извлечение микроспорин-подобной аминокислоты из культивируемого микроорганизма или из среды.

«Микроорганизм» и «микоспорин-подобные аминокислоты» являются такими, как определено выше.

Используемый в настоящем документе термин «культивирование» относится к культивированию микроорганизма в подобранной соответствующим образом окружающей среде. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть выполнен в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области техники. Процесс культивирования может быть легко скорректирован специалистами в данной области техники для применения в соответствии с выбранным микроорганизмом. Стадию культивирования микроорганизма можно осуществлять известным способом периодического культивирования, непрерывного культивирования, способа периодического культивирования с подпиткой и т.д., но в частности не ограничиваясь ими. Среда, используемая для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, и другие условия культивирования конкретно не ограничены, но можно использовать любую среду, применяемую для традиционного культивирования микроорганизма. В частности, микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в традиционной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины и т.д., в аэробных условиях при регулировании температуры, рН и т.д. В частности, рН культуры можно регулировать до подходящего рН (например, рН от 5 до 9, в частности, рН от 6 до 8 и наиболее конкретно рН 6,8), используя основное соединение (например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак) или кислое соединение (например, фосфорную кислоту или серную кислоту), но не ограничиваясь ими. Дополнительно для поддержания аэробного состояния культуры в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ; или для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния можно вводить газообразный азот, газообразный водород или газообразный диоксид углерода или не вводить никакого газа, но без ограничений. Дополнительно температуру культуры можно поддерживать от 20 до 45°С, в частности, от 25 до 40°С, и культивирование можно осуществлять в течение от примерно 10 до 160 часов, но культивирование не ограничено этим. Дополнительно образование пены во время культивирования можно предотвращать, используя пеногаситель, такой как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты и т.д., но не ограничиваясь им.

Дополнительно в качестве источника углерода для используемой культуральной среды сахара и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассы, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например, глицерин и этанол), органические кислоты (например, уксусную кислоту), и т.д., можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь ими. В качестве источника азота можно использовать азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и т.д., по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь ими. В качестве источника фосфора можно использовать дигидрофосфат калия, вторичный кислый фосфат калия, соответствующие им натрийсодержащие соли и т.д., по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь ими. Кроме того, в среде могут содержаться незаменимые материалы, стимулирующие рост, такие как другие соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты, витамины и т.д.

МАК, продуцируемые в культуре, могут секретироваться в среду или могут оставаться в клетках.

Используемый в настоящем документе термин «среда» относится к продукту, полученному в результате культивирования микроорганизма по настоящему изобретению. Понятие среды включает в себя как форму, содержащую микроорганизм, так и форму, где микроорганизм был удален из культурального раствора, содержащего микроорганизм, посредством центрифугирования, фильтрации и т.д.

На стадии извлечения МАК, продуцируемых на стадии культивирования по настоящему изобретению, желаемые МАК могут быть собраны из культурального раствора подходящим способом, известным в данной области техники. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и т.д., и желаемые МАК могут быть выделены из культивируемого микроорганизма или из среды с использованием подходящего способа, известного в данной области техники. Кроме того, стадия выделения МАК может дополнительно включать процесс разделения и/или стадию очистки.

Способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Тем не менее эти примеры предназначены только для иллюстративных целей, и объем настоящего изобретения не предназначен для ограничения этими примерами.

Конструирование продуцирующих МАК рекомбинантных микроорганизмов, полученных из Е. coli., и получение МАК с их использованием

Пример 1 Конструирование векторов для гиперэкспрессии гена биосинтеза шинорина, полученного из микроводорослей

Генный кластер биосинтеза шинорина на основе A. variabilis состоит из четырех генов 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазы, О-метилтрансферазы, C-N лигазы и синтетазы нерибосомных пептидов, и один из видов цианобактерий Nostoc punctiforme также может продуцировать шинорин, используя эти гены. В геномной ДНК А. variabilis АТСС29413 и N. punctiforme АТСС29133 были идентифицированы генные кластеры биосинтеза шинорина. С использованием двух типов векторов pECCG 117_Ptrc_GFP_терминатор и pECCG 117_Pcj1_GFP_терминатор были сконструированы четыре вектора, каждый из которых содержал гены биосинтеза шинорина (Ava_ABCD и Npr_ABCD), полученные из A. variabilis АТСС29413 и N. punctiforme АТСС29133 соответственно. Названия четырех экспрессионных векторов гена биосинтеза шинорина и используемые для конструирования этих векторов матрицы и праймеры обобщены в таблице 1 ниже.

После получения фрагментов генов с использованием этих матриц и праймеров каждый фрагмент гена лигировали в векторы pECCG 117_Ptrc_GFP_терминатор и pECCG 117_Pcj1_GFP_терминатор, обработанные ферментами рестрикции EcoRV/XbaI, с помощью набора реактивов для клонирования In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). Экспрессионные векторы были названы pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD, pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, pECCG117_Ptrc_Npr_ABCD и pECCG117_Pcj1_Npr_ABCD соответственно, и каждый из этих экспрессионных векторов был подтвержден секвенированием. Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности Ava_ABCD и Npr_ABCD были описаны как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно.

Пример 2: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, в которые введены экспрессионные векторы генов биосинтеза шинорина

Чтобы подтвердить способность к продуцированию МАК в Е. coli, четыре плазмиды, полученные в примере 1, были введены в штамм Е. coli W3110 дикого типа с получением штаммов с усиленным биосинтезом шинорина. Полученные таким образом штаммы высевали на плотную питательную среду Лурия-Бертани (LB), содержащую канамицин, а затем культивировали в течение ночи в термостате при 37°С. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи на плотной питательной среде LB засевали в 25 мл среды для титрования (состав среды: 40 г/л глюкозы, 0,3 г/л KH₂PO₄, 0,6 г/л K₂HPO₄, 15 г/л (NH₄)₂SO₄, 1 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 2,5 г/л NaCl, 1,2 г/л цитрата натрия, 2,5 г/л дрожжевого экстракта, 40 г/л карбоната кальция: рН 7,0), а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью вращения 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 2 ниже.

Как показано в таблице 2 выше, было подтверждено, что при введении в штамм W3110 генов биосинтеза шинорина продуцирование шинорина было возможно. Кроме того, было подтверждено, что продуцирование шинорина увеличивалось за счет повышения интенсивности промоторов (введен промотор PCJ1) посредством усиления пути биосинтеза.

Пример 3: Конструирование штаммов, в которых инактивирована 3 - дети дрохиннатдегидр атаза

Первый ген биосинтеза МАК Ava-A в микроводорослях имеет и использует общие субстраты DHQ (3-дегидрохиннат) в шикиматном пути и SH-7P (седогептулозо-7-фосфат) в пентозофосфатном пути. Чтобы получить штаммы, в которых 3-дегидрохиннатдегидратаза инактивирована в результате делеции гена aroD, применяли метод гомологической рекомбинации с использованием рекомбиназы Red фага лямбда. В качестве маркера вставки гена использовали ген резистентности к хлорамфениколу pKD3 и сконструировали кассету с делетированным геном aroD, включающую участок гена aroD и ген резистентности к хлорамфениколу плазмиды pKD3, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 (прямой) и 10 (обратный). После подготовки штаммов (Е. coli W3110 дикого типа), в которых должен быть делетирован ген aroD (SEQ ID NO: 71 и 72), эти штаммы трансформировали плазмидой pKD46, содержащей ген рекомбиназы Red фага лямбда, и впоследствии индуцировали экспрессию этого гена, используя арабинозу для подготовки компетентных клеток. Кассету с делетированным геном aroD вводили в компетентные клетки методом электропорации, а затем клетки высевали на плотную питательную среду LB, содержащую 30 мг/л хлорамфеникола. Полученные таким образом штаммы подвергали ПЦР, используя праймеры SEQ ID NO: 11 (прямой) и 12 (обратный), и делецию гена aroD подтверждали на основании выявления амплифицированных фрагментов 1300 п. о. (пар оснований).

Пример 4: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, в которых инактивирована 3-дегидрохиннатдегидратаза

Две из четырех плазмид, полученных в примере 1, в которых экспрессия находится под контролем промотора PCJ1, вводили в штаммы, в которых был делетирован ген aroD, полученные в примере 3(W3110 ΔaraD/pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD и W3110 ΔaroD/pECCG117 PCJ1_Npr_ABCD), а затем эти штаммы высевали на плотную питательную среду LB, содержащую канамицин. Впоследствии штаммы с делетированным aroD и штаммы без делеции aroD соответственно культивировали в течение ночи в термостате при 37°С, и одну платиновую петлю каждого штамма засевали в 25 мл среды для титрования (состав среды: 40 г/л глюкозы, 0,3 г/л KH₂PO₄, 0,6 г/л K₂HPO₄, 15 г/л (NH₄)₂SO₄, 1 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 2,5 г/л NaCl, 1,2 г/л цитрата натрия, 2,5 г/л дрожжевого экстракта, 40 г/л карбоната кальция: рН 7,0), а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью вращения 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 3 ниже.

Как показано в таблице 3, концентрация шинорина, продуцируемого в штаммах с делетированным геном aroD, была повышена на 194% и 182% по сравнению с концентрацией шинорина, продуцируемого в штаммах без делеции aroD соответственно. Соответственно, штамм W3110 ΔaraD/pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD и штамм W3110 ΔaraD/pECCG117_PCJ1_Npr_ABCD, представляющие собой штаммы с делетированным геном aroD, были названы СВ06-0017 и СВ06-0018 и депонированы в Корейском центре культур микроорганизмов (KССМ) в соответствии с Будапештским договором 26 июня 2017 г. под номерами доступа KCCM1204P и KCCM12045P соответственно.

Пример 5: Конструирование штаммов, обладающих повышенной активностью

2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы I/II

Чтобы повысить способность продуцирующих МАК микроорганизмов к продуцированию МАК, была усилена активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы I/II. В частности, были дополнительно введены три гена, полученные из Е. coli W3110, а именно aroG (2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза; SEQ ID NO: 73 и 74), ppsA (фосфоенолпируватсинтетаза; SEQ ID NO: 75 и 76) и tktA (транскетолаза I/II; SEQ ID NO: 77 и 78). Для усиления генов aroG, ppsA и tktA сконструировали плазмиды pSKH130-ΔfluA-Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA. Матрицы и праймеры, используемые при конструировании плазмид pSKH130-ΔfhuA-Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA, представлены в таблице 4 ниже.

Фрагменты генов aroG, ppsA и tktA амплифицировали с помощью ПЦР с использованием описанных выше матрицы и праймеров, а затем соответственно вводили в вектор pSKH130- ΔfhuA, расщепленный ферментом рестрикции BamH1-Pst1. Для подтверждения клонирования и последовательностей генов векторов применяли секвенирование, а затем этими векторами трансформировали штамм Е. coli W3110 дикого типа и штамм Е. coli W3110 Δ aroD с делецией aroD методом электропорации. Трансформированные гены вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссинговера) с последующим исключением участка плазмиды из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссинговера). Введение генов aroG, ppsA и tktA в трансформированные штаммы Е. coli, в которых была завершена вторая рекомбинация, подтверждали с использованием праймеров SEQ ID NO: 19 (прямой) и 20 (обратный).

Пример 6: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, обладающими_повышенной_активностью 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы I/II

Две из четырех плазмид, полученных в примере 5, в которых экспрессия находится под контролем промотора PCJ1, соответственно вводили в штаммы, в которые были введены гены aroG, ppsA и tktA, полученные в примере 5, а затем эти штаммы высевали на плотную питательную среду LB. Впоследствии штаммы культивировали в течение ночи в термостате при 37°С, и одну платиновую петлю каждого штамма засевали в 25 мл среды для титрования, указанной в примере 4, а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью перемешивания 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 5 ниже.

Как показано в таблице 5, концентрация шинорина, продуцируемого в штаммах, в которых была усилена экспрессия трех генов (aroG, ppsA и tktA), была повышена приблизительно на 300% по сравнению с контрольной группой.

Пример 7: Конструирование векторов и штаммов с хромосомной вставкой ava ABCD

Для введения генов биосинтеза шинорина в Е. coli были получены плазмиды pSKH130 ΔpinR::Ava-ABCD. Ava_ABCD подвергали ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 21 (прямой) и 22 (обратный) на основе pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD в качестве матрицы. Чтобы получить pSKH130 ΔpirR::Ava_ABCD, фрагменты ПЦР около 7 кб (килобаз) лигировали в вектор pSKH130 ΔpinR, обработанный ферментами рестрикции BamHI и PstI, используя набор реактивов для клонирования In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). Для контроля экспрессии Ava-ABCD фрагменты промотора Ptrc и PCJ1 впоследствии подвергали ПЦР, используя пары прямых и обратных праймеров SEQ ID NO: 23 24, SEQ ID NO: 25 и 26, и SEQ ID NO: 25 и 27, соответственно. Затем эти фрагменты лигировали в вектор pSKH130ΔpinR::Ava_ABCD, обработанный ферментом рестрикции ScaI, с получением pSKH130 ΔpinR::Ptrc-Ava-ABCD и pSKH130ΔpinR::PCJ1-Ava-ABCD, используя набор реактивов для клонирования In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). Штаммы W3110 ΔaroΔfhuA::Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA, полученные в примере 5, трансформировали рекомбинантными плазмидами методом электропорации и вводили их в хромосому штаммов посредством первичной рекомбинации (кроссинговера) с последующим исключением векторного участка из хромосомы за исключением целевого гена посредством вторичной рекомбинации (кроссинговера).

Введение гена Ava_ABCD в трансформированные штаммы Е. coli, в которых была завершена вторая рекомбинация, подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 28 (прямой) и 29 (обратный).

Пример 8: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами с хромосомной вставкой ava_ABCD

Штаммы, полученные в примере 7, высевали на плотную среду LB, а затем культивировали в течение ночи в термостате при 37°С. Впоследствии одну платиновую петлю каждого штамма засевали в 25 мл среды для титрования, указанной в примере 4, а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью перемешивания 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 6 ниже.

Как показано в таблице 6, было подтверждено, что шинорин продуцируется при введении в хромосому Ava-ABCD, и его концентрация была увеличена в соответствии с силой промоторов. Однако было также подтверждено, что продукция шинорина снижена по сравнению со штаммами, в которых биосинтез шинорина был усилен посредством плазмид. При дополнительном введении плазмиды pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD в штаммы с введенной в хромосому вставкой Ava-ABCD продукция шинорина увеличивалась на 353% и 152% по сравнению со штаммом, в котором в хромосому была введена только вставка Ava-ABCD (на основе промотора СJ1), и со штаммом, в который была введена только плазмида, соответственно.

Пример 9: Конструирование векторов с гиперэкспрессией гена МАК и оценка их способности к продуцированию МАК

4-Дезоксигадузол и микоспорин-глицин являются промежуточными соединениями, образующимися в процессе биосинтеза шинорина, и представляют собой микоспорин-подобные аминокислоты, одновременно обладающие эффектом предотвращения воздействия УФ лучей. Чтобы подтвердить, могут ли эти вещества продуцироваться в штаммах Е. coli с делецией AroD, были сконструированы векторы. Результаты представлены в таблице 7 ниже.

Ptrc_Ava_АВ и Ptrc_Ava_ABC подвергали ПЦР, используя праймеры SEQ ID NO: 30 и 31 и SEQ ID NO: 30 и 32 на основе pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD в качестве матрицы. pECCG117_Ptrc_Ava_AB и pECCG117_Ptrc_Ava_ABC были получены путем лигирования фрагментов ПЦР в вектор pECCG117 Pre GFP, обработанный ферментами рестрикции BamHI и SpeI. Таким же образом получили pECCG117_PCJ1_Ava_АВ и pECCG117_PCJ1_Ava_ABC путем лигирования фрагментов ПЦР, полученных с использованием пар праймеров SEQ ID NO: 30 и 31 и SEQ ID NO: 30 и 32 на основе pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD в качестве матрицы, в вектор pECCG117 Pcj1 GFP, обработанный ферментами рестрикции BamHI и SpeI. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность Ava_АВ и Ava_ABC были описаны как SEQ ID NO: 85-88.

Полученными таким образом векторами трансформировали штаммы W3110ΔaroDΔfhuA::Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA, используемые в примере 8, с помощью общепринятого электроимпульсного метода, и каждый штамм высевали на плотную среду LB и культивировали в течение ночи в термостате при 37°С. Штаммы, культивированные в течение ночи на плотной среде LB, засевали в 25 мл среды для титрования, указанной в примере 4, а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью перемешивания 200 об/мин в течение 48 часов. После окончания культивирования культуры измеряли продукцию МАК методом жидкостной высокоскоростной хроматографии, и в таблице 8 ниже представлена концентрация МАК в культуре каждого штамма.

Как показано в таблице 8, было подтверждено, что при введении генов Ava_АВ и Ava_ABC продуцируются 4-дезоксигадузол и микоспорин-глицин, а их количество увеличивается по мере увеличения силы промотора.

Конструирование продуцирующих МАК рекомбинантных микроорганизмов, полученных из Corynebacterium glutamicum, и получение МАК с их использованием

Пример 10: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, в которые введены векторы с гиперэкспрессией генов биосинтеза шинорина

Чтобы подтвердить способность Corynebacterium glutamicum к продуцированию МАК, четыре плазмиды, полученные в примере 1, вводили в штамм 13032 Corynebacterium glutamicum с получением штаммов, характеризующихся усиленным биосинтезом шинорина, и высевали эти штаммы на плотную питательную среду с добавлением сердечно-мозговой вытяжки (BHIS; Beef Heart Infusion Supplemented), содержащую канамицин, и культивировали в течение ночи в термостате при 30°С. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи на плотной питательной среде BHIS, засевали в 25 мл среды для титрования (состав среды: 40 г/л глюкозы, 1 г/л KH₂PO₄, 10 г/л (NH₄)₂SO₄, 5 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л карбоната кальция: рН 7,0), а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью вращения 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 9 ниже.

Как показано в таблице 9, было подтверждено, что продуцирование шинорина возможно при введении генов биосинтеза шинорина в Corynebacterium glutamicum 13032, и его продукция может быть повышена до 375% в зависимости от силы промоторов.

Пример 11: Конструирование векторов для введения гена биосинтеза шинорина в хромосому, и штаммов

Для введения генов биосинтеза шинорина в Corynebacterium glutamicum были получены плазмиды pDC AN1021_Ava_ABCD. Ava_ABCD подвергали ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 33 (прямой) и 34 (обратный) на основе pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD в качестве матрицы. Чтобы получить pDC ΔN1021_Ava_ABCD, фрагменты ПЦР около 7 кб лигировали в вектор pDC ΔN1021, обработанный ферментом рестрикции NdeI, используя набор реактивов для клонирования In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). Для контроля экспрессии Ava-ABCD фрагменты промотора CJ7, Lysc8 и O2 впоследствии подвергали ПЦР, используя пары прямых и обратных праймеров SEQ ID NO: 35 и 36, SEQ ID NO: 37 и 38 и SEQ ID NO: 39 и 40 соответственно. Затем эти фрагменты ПЦР лигировали в вектор pDC ΔN1021_Ava_ABCD, обработанный ферментом рестрикции NdeI, используя набор реактивов для клонирования In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.), для получения pDC ΔN1021_Pcj7_Ava_ABCD, pDC ΔN1021_Plysc8_Ava_ABCD и pDC ΔN1021_PO2_Ava_ABCD.

Этими рекомбинантными плазмидами трансформировали штамм 13032 Corynebacterium glutamicum методом электропорации (van der Rest et al. 1999) и вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссинговера) с последующим исключением плазмиды из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссинговера).

Введение гена Ava_ABCD в трансформированные штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторая рекомбинация, подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 33 (прямой) и 34 (обратный).

Пример 12: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, в хромосому которых введен ген биосинтеза шинорина

Все штаммы высевали на плотную среду BHIS, а затем культивировали в течение ночи в термостате при 30°С для подтверждения способности к продуцированию шинорина. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи на плотной среде BHIS, засевали в 25 мл среды для титрования примера 11, а затем культивировали в термостате при 37°С со скоростью перемешивания 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 10 ниже.

Как показано в таблице 10, было подтверждено, что при введении одной копии генов биосинтеза шинорина в штамм дикого типа Corynebacterium glutamicum шинорин может продуцироваться в количестве от 36 мг до 173 мг.

Пример 13: Конструирование векторов и штаммов Corynebacterium с делецией aroD (3-дегидрохиннатдегидратазы)

Как упоминалось в примере 3, были получены штаммы с делецией, чтобы подтвердить, что можно увеличить продукцию шинорина посредством делеции aroD (3-дегидрохиннатдегидратазы). Чтобы получить штаммы с сайт-специфической делецией гена aroD (SEQ ID NO: 79 и 80) Corynebacterium glutamicum, были сконструированы плазмиды pDC-ΔaroD, в которых была эндогенно делетирована открытая рамка считывания aroD. Эндогенная делеция гена pDC-ΔaroD была образована путем введения в вектор pDC фрагментов гена, образовавшихся в результате кроссоверной ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров SEQ ID NO: 41 и 42 и SEQ ID ΔN1021_РО2_Ava_ABCD методом электропорации (van der Rest et al. 1999) и вводили плазмиды в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссинговера) с последующим исключением плазмиды из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссинговера).

Делецию гена aroD в трансформированных штаммах Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторая рекомбинация, подтверждали с помощью ПЦР с использованием пары геноспецифичных праймеров SEQ ID NO: 41 и 44. Пример 14: Оценка делеции aroD (3-дегидрохиннатдегидратазы) Штамм Corynebacterium glutamicum 13032 ΔN1021_PO2_Ava_ABCD, в котором ожидалось накопление DHQ за счет делеции гена 3-дегидрохиннатдегидратазы, высевали на плотную среду BHIS и культивировали в течение ночи в термостате при 30°С. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи на плотной среде BHIS, засевали в 25 мл среды для титрования (состав среды: 40 г/л глюкозы, 1 г/л KH₂PO₄, 10 г/л (NH₄)₂SO₄, 5 г/л MgSO₄-7H₂O, 5 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л карбоната кальция: рН 7,0), а затем кульивировали в термостате при 37°С со скоростью вращения 200 об/мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 11 ниже.

Как показано в таблице 11, было подтверждено, что при делетировании гена aroD концентрация шинорина повышалась на 239% по сравнению с контрольной группой, и за счет дополнительного усиления биосинтеза шинорина посредством pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD концентрация шинорина повышалась. Соответственно, штамм с делецией aroD c.g1 13032 N1021_PO2_Ava_ABCD_ΔaroD был назван CB06-0019 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM) в соответствии с Будапештским договором от 26 июня 2017 г. с номером доступа KCCM12046P.

Конструирование продуцирующих МАК рекомбинантных микроорганизмов, полученных из дрожжей, и получение МАК с их использованием

Пример 15: Конструирование дрожжевых векторов с гиперэкспрессией гена биосинтеза шинорина, полученного из микроводорослей

Были сконструированы векторы S. cerevisiae, в которые были введены гены биосинтеза шинорина, основанные на геномной ДНК A. variabilis АТСС29413 и N. punctiforme АТСС29133. Для получения векторов использовали промоторы ADH, TEF и GPD S. cerevisiae, и в таблице 12 ниже представлены матрицы и праймеры, использованные для получения в общей сложности двадцати четырех экспрессионных векторов гена биосинтеза шинорина. Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности Ava_A, Ava_B, Ava_C, Ava_D, Npr_A, Npr_B, Npr_C и Npr_D обозначены номерами SEQ ID NO: 89-104 в порядке ферментов.

Фрагменты генов, полученные с помощью ПЦР с использованием описанных выше комбинаций матриц и праймеров, лигировали в вектор р413/414/415/416-pADH/pTEF/pGPD-CYC1_терминатор, обработанный ферментами рестрикции BamH1/XhoI, с использованием фермента лигазы Т4 (NEB) и, таким образом, получили двадцать четыре вектора p413/414/415/416-pADH/pTEF/pGPD-A, В, С, D. Конструирование каждого экспрессионного вектора и их последовательности генов подтверждали методом секвенирования. Полученные такие образом экспрессионные векторы вводили в штамм дикого типа S. cerevisiae CEN.PK-1D и, таким образом, получили штаммы, способные продуцировать шинорин.

Пример 16: Оценка способности к продуцированию шинорина штаммами, в которые введены векторы с гиперэкспрессией генов биосинтеза шинорина

Чтобы подтвердить способность дрожжей к продуцированию МАК, двадцать четыре плазмиды, полученные в примере 15, вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D (S. cerevisiae CEN.PK-1D) для получения штаммов, характеризующихся усиленным биосинтезом шинорина, и высевали эти штаммы на плотную питательную среду SC (полная синтетическая среда) с исключением Leu, Trp, Ura и His и культивировали в течение ночи в термостате при 30°С. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи, засевали в 25 мл среды для титрования, показанной в таблице 13, а затем культивировали в термостате при 30°С со скоростью перемешивания 150 об/мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 14 ниже.

На основании приведенных выше результатов было подтверждено, что S. cerevisiae CEN.PK-1D (т.е. штамм дрожжей) показал высокую активность генов Npr А, В, С, D по сравнению с генами Ava А, В, С, D. Дополнительно было подтверждено, что уровень экспрессии генов регулируется в соответствии с силой промоторов, и в соответствии с этим продукция шинорина была изменена. В частности, было подтверждено, что самая высокая продукция шинорина (521 мг/л) была получена при введении вектора, несущего Npr А, В, С, D под контролем промотора GPD (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы).

Пример 17: Повышение продукции шинорина в результате делеции гена ARO1 в S. cerevisiae и введения гена aroB Е. coli

Чтобы определить, приводит ли инактивация дегидрохиннатдегидратазы к улучшению продукции шинорина в дрожжах, в S. cerevisiae CEN.PK-1D был делетирован tquARO1. TquARO1 S. cerevisiae представляет собой ген, выполняющий пять функций, и в результате делеции гена ARO1 функция 3-дегидрохиннатсинтазы, соответствующая гену aroB Е. coli, утрачивается, в результате чего синтез 3-DHQ становится невозможным. Поэтому после делеции гена ARO1 S. cerevisiae (SEQ ID NO: 81 и 82), который является гомологом гена aroB Е. coli на хромосоме, ген aroB Е. coli (SEQ ID NO: 83 и 84) был введен в том же положении под контролем промотора GPD. Использованные матрицы и праймеры показаны в таблице 15. Двадцать четыре плазмиды, полученные в примере 15, вводили в штамм S. cerevisiae CEN.PK-1D, в котором делетирован ген ARO1 и введен ген aroB Е. coli, и штаммы высевали на плотную среду SC (полную синтетическую) с исключением Leu, Trp, Ura и His и культивировали в течение ночи в термостате при 30°С. Одну платиновую петлю каждого штамма, культивированного в течение ночи, засевали в 25 мл среды для титрования, показанной в таблице 13, а затем культивировали в термостате при 30°С со скоростью перемешивания 150 об/мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 16 ниже.

На основании результатов, представленных в таблице 16, было подтверждено что продукция шинорина повышалась в 3 раза в штаммах, в которых способность к продуцированию DHQ была повышена в результате делеции ARO1 и введения aroB Е. coli по сравнению со штаммами ДТ (дикого типа). Дополнительно было подтверждено, что эти штаммы проявляли более высокую активность генов Npr А, В, С, D по сравнению с генами Ava А, В, С, D, и продукция шинорина повышалась по мере увеличения силы промоторов. В частности, было подтверждено, что самая высокая продукция шинорина (1,6 г/л) была получена при введении вектора, несущего Npr А, В, С, D под контролем промотора GPD.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или неотъемлемых характеристик. Описанные воплощения изобретения должны быть рассмотрены во всех аспектах только как иллюстративные, а не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения в большей степени указан в прилагаемой формуле изобретения, чем в приведенном выше описании. Все изменения, которые следуют из значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, должны быть включены в объем настоящего изобретения.

--->

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION

<120> МИКРООРГАНИЗМ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ МИКРОСПОРИН-ПОДОБНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОСПОРИН-ПОДОБНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> OPA18235-PCT

<150> KR10-2017-0103795

<151> 2017-08-16

<160> 104

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 6461

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 1

atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60

gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120

ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180

cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240

tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300

gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360

attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420

attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480

catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540

ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600

aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660

ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720

cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780

ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840

cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900

atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960

agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020

actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080

ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140

cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200

tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260

tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320

gaaagagaag gctacgcaaa taatcggaca ctaattgtct ttaattttga attttgaatt 1380

ttgaattttg aattggagcg aagcgacttg acaaatgtga ttgtccaacc aacagctaga 1440

cctgttacac cattgggaat tttaaccaag cagttagaag ccatagtcca agaggttaag 1500

caacatccag atttacctgg ggaattgata gcaaacatcc atcaggcttg gcgtttagcc 1560

gcaggtatag acccttattt ggaagaatgc accactccag aatctcctga actcgctgca 1620

ttggcaaaaa ccacagccac cgaagcctgg ggagaacact tccacggagg tacaaccgtc 1680

cgtcctctag aacaagagat gctttctggt catatcgaag gacaaacctt aaagatgttt 1740

gttcacatga ccaaagctaa aaaagtctta gaaattggga tgtttaccgg ttattcggcg 1800

ctggcgatgg cggaagcatt accagaggat ggactgcttg tggcttgtga agttgaccct 1860

tacgcggcgg aaattggaca gaaagccttt caacaatctc cccacggtgg aaagattcgt 1920

gtggaattgg atgcagcctt agcaactctt gataagttag cagaagctgg ggagtctttt 1980

gacttggtat ttatcgacgc agataaaaaa gagtatgtag cctattttca caagttgcta 2040

ggtagcagtt tgttagcacc agatggcttt atttgtgtag ataacacctt attacaaggg 2100

gaagtttatc taccagcaga ggaacgtagc gtcaatggtg aagcgatcgc gcaatttaat 2160

catacagtag ctatagaccc ccgtgtagaa caggttttgt tgccgttgcg agatggttta 2220

acaattatcc gcagaataca accttaattg tccaatcgac tatggcacaa tcccttcccc 2280

tttcttccgc acctgctaca ccgtctcttc cttcccagac gaaaatagcc gcaattatcc 2340

aaaatatctg cactttggct ttgttattac tagcattgcc cattaatgcc accattgttt 2400

ttatatcctt gttagtcttc cgaccgcaaa aggtcaaagc agcaaacccc caaaccattc 2460

ttatcagtgg cggtaagatg accaaagctt tacaactagc aaggtcattc cacgcggctg 2520

gacatagagt tgtcttggtg gaaacccata aatactggtt gactggtcat cgtttttccc 2580

aagcagtgga taagttttac acagtccccg caccccagga caatccccaa gcttacattc 2640

aggctttggt agatatcgtc aaacaagaaa acatcgatgt ttatattccc gtcaccagtc 2700

cagtgggtag ctactacgac tcattagcca aaccagagtt atcccattat tgcgaagtgt 2760

ttcactttga cgcagatatt acccaaatgt tggatgataa atttgcgttg acacaaaaag 2820

cgcgatcgct tggtttatca gtacccaaat cctttaaaat tacctcacca gaacaagtca 2880

tcaacttcga tttttctgga gagacacgta aatacatcct caaaagcatt ccctacgact 2940

cagtgcggcg gttggactta accaaactcc cctgtgctac tccagaggaa acagcagcat 3000

tcgtcagaag tttgccaatt actcccgaaa aaccgtggat tatgcaggaa tttatccccg 3060

gtaaggaatt ctgcacccat agcaccgttc ggaatgggga actcagactg cattgctgtt 3120

gcgaatcttc agccttccaa gttaattatg agaatgtaaa taacccgcaa attaccgaat 3180

gggtacagca ttttgtcaag gaactgaaac tgacaggaca gatttccttt gactttatcc 3240

aagccgaaga cggaacagtt tacgccatcg agtgtaaccc ccgcacacat tcagcaatta 3300

ccacatttta cgaccacccc caggtagcag aagcgtactt gagtcaagca ccgacgactg 3360

aaaccataca accactaacg acaagcaagc ctacctattg gacttatcac gaagtttggc 3420

gtttaactgg tatccgttct ttcacccagt tgcaaagatg gctggggaat atttggcgcg 3480

ggactgatgc gatttatcag ccagatgacc ccttaccgtt tttgatggta catcattggc 3540

aaattcccct actgttattg aataatttgc gtcgtcttaa aggttggacg cggatagatt 3600

tcaatattgg gaagttggtg gaattggggg gagattagtt tttaaacgca gagggacgct 3660

gaggttagcg cagcgaaaag ttctggagga gggtttccct ccgtaggaaa cttttcaaga 3720

gagagggacg cggagtgtgt tttctctgcg tctctgcgtg agaaattttt tattattgag 3780

caaagttaga agatatgcag actatagatt ttaatattcg taagttactt gtagagtgga 3840

acgcgaccca cagagattat gatctttccc agagtttaca tgaactaatt gtagctcaag 3900

tagaacgaac acctgaggcg atcgctgtca cctttgacaa gcaacaacta acttatcaag 3960

aactaaatca taaagcaaac cagctaggac attatttaca aacattagga gtccagccag 4020

aaaccctggt aggcgtttgt ttagaacgtt ccttagaaat ggttatctgt cttttaggaa 4080

tcctcaaagc tgggggtgct tatgttccta ttgaccctga atatcctcaa gaacgcatag 4140

cttatatgct agaagattct caggtgaagg tactactaac tcaagaaaaa ttactcaatc 4200

aaattcccca ccatcaagca caaactatct gtgtagatag ggaatgggag aaaatttcca 4260

cacaagctaa taccaatccc aaaagtaata taaaaacgga taatcttgct tatgtaattt 4320

acacctctgg ttccactggt aaaccaaaag gtgcaatgaa cacccacaaa ggtatctgta 4380

atcgcttatt gtggatgcag gaagcttatc aaatcgattc cacagatagc attttacaaa 4440

aaaccccctt tagttttgat gtttccgttt gggagttctt ttggacttta ttaactggcg 4500

cacgtttggt aatagccaaa ccaggcggac ataaagatag tgcttacctc atcgatttaa 4560

ttactcaaga acaaatcact acgttgcatt ttgtcccctc aatgctgcaa gtgtttttac 4620

aaaatcgcca tgtaagcaaa tgcagctctc taaaaagagt tatttgtagc ggtgaagctt 4680

tatctataga tttacaaaat agatttttcc agcatttgca atgtgaatta cataacctct 4740

atggcccgac agaagcagca attgatgtca cattttggca atgtagaaaa gatagtaatt 4800

taaagagtgt acctattggt cgtcccattg ctaatactca aatttatatt cttgatgccg 4860

atttacaacc agtaaatatt ggtgtcactg gtgaaattta tattggtggt gtaggggttg 4920

ctcgtggtta tttgaataaa gaagaattga ccaaagaaaa atttattatt aatccctttc 4980

ccaattctga gtttaagcga ctttataaaa caggtgattt agctcgttat ttacccgatg 5040

gaaatattga atatcttggt agaacagatt atcaagtaaa aattcggggt tatagaattg 5100

aaattggcga gattgaaaat gttttatctt cacacccaca agtcagagaa gctgtagtca 5160

tagcgcggga tgataacgct caagaaaaac aaatcatcgc ttatattacc tataactcca 5220

tcaaacctca gcttgataat ctgcgtgatt tcctaaaagc aaggctacct gattttatga 5280

ttccagccgc ttttgtgatg ctggagcatc ttcctttaac tcccagtggt aaagtagacc 5340

gtaaggcatt acctaagcct gatttattta attatagtga acataattcc tatgtagcgc 5400

ctcggaatga agttgaagaa aaattagtac aaatctggtc gaatattctg catttaccta 5460

aagtaggtgt gacagaaaac tttttcgcta ttggtggtaa ttccctcaaa gctctacatt 5520

taatttctca aattgaagag ttatttgcta aagagatatc cttagcaaca cttttaacaa 5580

atccagtaat tgcagattta gccaaggtta ttcaagcaaa caaccaaatc cataattcac 5640

ccctagttcc aattcaacca caaggtaagc agcagccttt cttttgtata catcctgctg 5700

gtggtcatgt tttatgctat tttaaactcg cacaatatat aggaactgac caaccatttt 5760

atggcttaca agctcaagga ttttatggag atgaagcacc cttgacgcga gttgaagata 5820

tggctagtct ctacgtcaaa actattagag aatttcaacc ccaagggcct tatcgtgtcg 5880

gggggtggtc atttggtgga gtcgtagctt atgaagtagc acagcagtta catagacaag 5940

gacaagaagt atctttacta gcaatattag attcttacgt accgattctg ctggataaac 6000

aaaaacccat tgatgacgtt tatttagttg gtgttctctc cagagttttt ggcggtatgt 6060

ttggtcaaga taatctagtc acacctgaag aaatagaaaa tttaactgta gaagaaaaaa 6120

ttaattacat cattgataaa gcacggagcg ctagaatatt cccgcctggt gtagaacgtc 6180

aaaataatcg ccgtattctt gatgttttgg tgggaacttt aaaagcaact tattcctata 6240

taagacaacc atatccagga aaagtcactg tatttcgagc cagggaaaaa catattatgg 6300

ctcctgaccc gaccttagtt tgggtagaat tattttctgt aatggcggct caagaaatta 6360

agattattga tgtccctgga aaccattatt cgtttgttct agaaccccat gtacaggttt 6420

tagcacagcg tttacaagat tgtctggaaa ataattcata a 6461

<210> 2

<211> 2035

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 2

Met Ser Ile Val Gln Ala Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly

20 25 30

Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu

85 90 95

Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys

165 170 175

Val Phe Leu Asp Phe Ser Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr

210 215 220

His Phe Gly Asn Ile Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His

225 230 235 240

Arg Leu Thr Tyr Lys Ala Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Val Asp Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ile Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Val Gly Leu Ser Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile

325 330 335

Leu Trp Arg Gly Thr Glu Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp

355 360 365

Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu

370 375 380

Cys Thr Ser Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val

385 390 395 400

Tyr Gln Lys Glu Leu Ile Gly Ser Val Lys Leu Thr Asn Val Ile Val

405 410 415

Gln Pro Thr Ala Arg Pro Val Thr Pro Leu Gly Ile Leu Thr Lys Gln

420 425 430

Leu Glu Ala Ile Val Gln Glu Val Lys Gln His Pro Asp Leu Pro Gly

435 440 445

Glu Leu Ile Ala Asn Ile His Gln Ala Trp Arg Leu Ala Ala Gly Ile

450 455 460

Asp Pro Tyr Leu Glu Glu Cys Thr Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ala

465 470 475 480

Ala Leu Ala Lys Thr Thr Ala Thr Glu Ala Trp Gly Glu His Phe His

485 490 495

Gly Gly Thr Thr Val Arg Pro Leu Glu Gln Glu Met Leu Ser Gly His

500 505 510

Ile Glu Gly Gln Thr Leu Lys Met Phe Val His Met Thr Lys Ala Lys

515 520 525

Lys Val Leu Glu Ile Gly Met Phe Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Ala Met

530 535 540

Ala Glu Ala Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Val Ala Cys Glu Val Asp

545 550 555 560

Pro Tyr Ala Ala Glu Ile Gly Gln Lys Ala Phe Gln Gln Ser Pro His

565 570 575

Gly Gly Lys Ile Arg Val Glu Leu Asp Ala Ala Leu Ala Thr Leu Asp

580 585 590

Lys Leu Ala Glu Ala Gly Glu Ser Phe Asp Leu Val Phe Ile Asp Ala

595 600 605

Asp Lys Lys Glu Tyr Val Ala Tyr Phe His Lys Leu Leu Gly Ser Ser

610 615 620

Leu Leu Ala Pro Asp Gly Phe Ile Cys Val Asp Asn Thr Leu Leu Gln

625 630 635 640

Gly Glu Val Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Arg Ser Val Asn Gly Glu Ala

645 650 655

Ile Ala Gln Phe Asn His Thr Val Ala Ile Asp Pro Arg Val Glu Gln

660 665 670

Val Leu Leu Pro Leu Arg Asp Gly Leu Thr Ile Ile Arg Arg Ile Gln

675 680 685

Pro Met Ala Gln Ser Leu Pro Leu Ser Ser Ala Pro Ala Thr Pro Ser

690 695 700

Leu Pro Ser Gln Thr Lys Ile Ala Ala Ile Ile Gln Asn Ile Cys Thr

705 710 715 720

Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Ile Asn Ala Thr Ile Val Phe

725 730 735

Ile Ser Leu Leu Val Phe Arg Pro Gln Lys Val Lys Ala Ala Asn Pro

740 745 750

Gln Thr Ile Leu Ile Ser Gly Gly Lys Met Thr Lys Ala Leu Gln Leu

755 760 765

Ala Arg Ser Phe His Ala Ala Gly His Arg Val Val Leu Val Glu Thr

770 775 780

His Lys Tyr Trp Leu Thr Gly His Arg Phe Ser Gln Ala Val Asp Lys

785 790 795 800

Phe Tyr Thr Val Pro Ala Pro Gln Asp Asn Pro Gln Ala Tyr Ile Gln

805 810 815

Ala Leu Val Asp Ile Val Lys Gln Glu Asn Ile Asp Val Tyr Ile Pro

820 825 830

Val Thr Ser Pro Val Gly Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Lys Pro Glu

835 840 845

Leu Ser His Tyr Cys Glu Val Phe His Phe Asp Ala Asp Ile Thr Gln

850 855 860

Met Leu Asp Asp Lys Phe Ala Leu Thr Gln Lys Ala Arg Ser Leu Gly

865 870 875 880

Leu Ser Val Pro Lys Ser Phe Lys Ile Thr Ser Pro Glu Gln Val Ile

885 890 895

Asn Phe Asp Phe Ser Gly Glu Thr Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ser Ile

900 905 910

Pro Tyr Asp Ser Val Arg Arg Leu Asp Leu Thr Lys Leu Pro Cys Ala

915 920 925

Thr Pro Glu Glu Thr Ala Ala Phe Val Arg Ser Leu Pro Ile Thr Pro

930 935 940

Glu Lys Pro Trp Ile Met Gln Glu Phe Ile Pro Gly Lys Glu Phe Cys

945 950 955 960

Thr His Ser Thr Val Arg Asn Gly Glu Leu Arg Leu His Cys Cys Cys

965 970 975

Glu Ser Ser Ala Phe Gln Val Asn Tyr Glu Asn Val Asn Asn Pro Gln

980 985 990

Ile Thr Glu Trp Val Gln His Phe Val Lys Glu Leu Lys Leu Thr Gly

995 1000 1005

Gln Ile Ser Phe Asp Phe Ile Gln Ala Glu Asp Gly Thr Val Tyr Ala

1010 1015 1020

Ile Glu Cys Asn Pro Arg Thr His Ser Ala Ile Thr Thr Phe Tyr Asp

1025 1030 1035 1040

His Pro Gln Val Ala Glu Ala Tyr Leu Ser Gln Ala Pro Thr Thr Glu

1045 1050 1055

Thr Ile Gln Pro Leu Thr Thr Ser Lys Pro Thr Tyr Trp Thr Tyr His

1060 1065 1070

Glu Val Trp Arg Leu Thr Gly Ile Arg Ser Phe Thr Gln Leu Gln Arg

1075 1080 1085

Trp Leu Gly Asn Ile Trp Arg Gly Thr Asp Ala Ile Tyr Gln Pro Asp

1090 1095 1100

Asp Pro Leu Pro Phe Leu Met Val His His Trp Gln Ile Pro Leu Leu

1105 1110 1115 1120

Leu Leu Asn Asn Leu Arg Arg Leu Lys Gly Trp Thr Arg Ile Asp Phe

1125 1130 1135

Asn Ile Gly Lys Leu Val Glu Leu Gly Gly Asp Met Gln Thr Ile Asp

1140 1145 1150

Phe Asn Ile Arg Lys Leu Leu Val Glu Trp Asn Ala Thr His Arg Asp

1155 1160 1165

Tyr Asp Leu Ser Gln Ser Leu His Glu Leu Ile Val Ala Gln Val Glu

1170 1175 1180

Arg Thr Pro Glu Ala Ile Ala Val Thr Phe Asp Lys Gln Gln Leu Thr

1185 1190 1195 1200

Tyr Gln Glu Leu Asn His Lys Ala Asn Gln Leu Gly His Tyr Leu Gln

1205 1210 1215

Thr Leu Gly Val Gln Pro Glu Thr Leu Val Gly Val Cys Leu Glu Arg

1220 1225 1230

Ser Leu Glu Met Val Ile Cys Leu Leu Gly Ile Leu Lys Ala Gly Gly

1235 1240 1245

Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu Tyr Pro Gln Glu Arg Ile Ala Tyr

1250 1255 1260

Met Leu Glu Asp Ser Gln Val Lys Val Leu Leu Thr Gln Glu Lys Leu

1265 1270 1275 1280

Leu Asn Gln Ile Pro His His Gln Ala Gln Thr Ile Cys Val Asp Arg

1285 1290 1295

Glu Trp Glu Lys Ile Ser Thr Gln Ala Asn Thr Asn Pro Lys Ser Asn

1300 1305 1310

Ile Lys Thr Asp Asn Leu Ala Tyr Val Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr

1315 1320 1325

Gly Lys Pro Lys Gly Ala Met Asn Thr His Lys Gly Ile Cys Asn Arg

1330 1335 1340

Leu Leu Trp Met Gln Glu Ala Tyr Gln Ile Asp Ser Thr Asp Ser Ile

1345 1350 1355 1360

Leu Gln Lys Thr Pro Phe Ser Phe Asp Val Ser Val Trp Glu Phe Phe

1365 1370 1375

Trp Thr Leu Leu Thr Gly Ala Arg Leu Val Ile Ala Lys Pro Gly Gly

1380 1385 1390

His Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Ile Asp Leu Ile Thr Gln Glu Gln Ile

1395 1400 1405

Thr Thr Leu His Phe Val Pro Ser Met Leu Gln Val Phe Leu Gln Asn

1410 1415 1420

Arg His Val Ser Lys Cys Ser Ser Leu Lys Arg Val Ile Cys Ser Gly

1425 1430 1435 1440

Glu Ala Leu Ser Ile Asp Leu Gln Asn Arg Phe Phe Gln His Leu Gln

1445 1450 1455

Cys Glu Leu His Asn Leu Tyr Gly Pro Thr Glu Ala Ala Ile Asp Val

1460 1465 1470

Thr Phe Trp Gln Cys Arg Lys Asp Ser Asn Leu Lys Ser Val Pro Ile

1475 1480 1485

Gly Arg Pro Ile Ala Asn Thr Gln Ile Tyr Ile Leu Asp Ala Asp Leu

1490 1495 1500

Gln Pro Val Asn Ile Gly Val Thr Gly Glu Ile Tyr Ile Gly Gly Val

1505 1510 1515 1520

Gly Val Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Lys Glu Glu Leu Thr Lys Glu Lys

1525 1530 1535

Phe Ile Ile Asn Pro Phe Pro Asn Ser Glu Phe Lys Arg Leu Tyr Lys

1540 1545 1550

Thr Gly Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Pro Asp Gly Asn Ile Glu Tyr Leu

1555 1560 1565

Gly Arg Thr Asp Tyr Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Ile

1570 1575 1580

Gly Glu Ile Glu Asn Val Leu Ser Ser His Pro Gln Val Arg Glu Ala

1585 1590 1595 1600

Val Val Ile Ala Arg Asp Asp Asn Ala Gln Glu Lys Gln Ile Ile Ala

1605 1610 1615

Tyr Ile Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Pro Gln Leu Asp Asn Leu Arg Asp

1620 1625 1630

Phe Leu Lys Ala Arg Leu Pro Asp Phe Met Ile Pro Ala Ala Phe Val

1635 1640 1645

Met Leu Glu His Leu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Lys Val Asp Arg Lys

1650 1655 1660

Ala Leu Pro Lys Pro Asp Leu Phe Asn Tyr Ser Glu His Asn Ser Tyr

1665 1670 1675 1680

Val Ala Pro Arg Asn Glu Val Glu Glu Lys Leu Val Gln Ile Trp Ser

1685 1690 1695

Asn Ile Leu His Leu Pro Lys Val Gly Val Thr Glu Asn Phe Phe Ala

1700 1705 1710

Ile Gly Gly Asn Ser Leu Lys Ala Leu His Leu Ile Ser Gln Ile Glu

1715 1720 1725

Glu Leu Phe Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ala Thr Leu Leu Thr Asn Pro

1730 1735 1740

Val Ile Ala Asp Leu Ala Lys Val Ile Gln Ala Asn Asn Gln Ile His

1745 1750 1755 1760

Asn Ser Pro Leu Val Pro Ile Gln Pro Gln Gly Lys Gln Gln Pro Phe

1765 1770 1775

Phe Cys Ile His Pro Ala Gly Gly His Val Leu Cys Tyr Phe Lys Leu

1780 1785 1790

Ala Gln Tyr Ile Gly Thr Asp Gln Pro Phe Tyr Gly Leu Gln Ala Gln

1795 1800 1805

Gly Phe Tyr Gly Asp Glu Ala Pro Leu Thr Arg Val Glu Asp Met Ala

1810 1815 1820

Ser Leu Tyr Val Lys Thr Ile Arg Glu Phe Gln Pro Gln Gly Pro Tyr

1825 1830 1835 1840

Arg Val Gly Gly Trp Ser Phe Gly Gly Val Val Ala Tyr Glu Val Ala

1845 1850 1855

Gln Gln Leu His Arg Gln Gly Gln Glu Val Ser Leu Leu Ala Ile Leu

1860 1865 1870

Asp Ser Tyr Val Pro Ile Leu Leu Asp Lys Gln Lys Pro Ile Asp Asp

1875 1880 1885

Val Tyr Leu Val Gly Val Leu Ser Arg Val Phe Gly Gly Met Phe Gly

1890 1895 1900

Gln Asp Asn Leu Val Thr Pro Glu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Val Glu

1905 1910 1915 1920

Glu Lys Ile Asn Tyr Ile Ile Asp Lys Ala Arg Ser Ala Arg Ile Phe

1925 1930 1935

Pro Pro Gly Val Glu Arg Gln Asn Asn Arg Arg Ile Leu Asp Val Leu

1940 1945 1950

Val Gly Thr Leu Lys Ala Thr Tyr Ser Tyr Ile Arg Gln Pro Tyr Pro

1955 1960 1965

Gly Lys Val Thr Val Phe Arg Ala Arg Glu Lys His Ile Met Ala Pro

1970 1975 1980

Asp Pro Thr Leu Val Trp Val Glu Leu Phe Ser Val Met Ala Ala Gln

1985 1990 1995 2000

Glu Ile Lys Ile Ile Asp Val Pro Gly Asn His Tyr Ser Phe Val Leu

2005 2010 2015

Glu Pro His Val Gln Val Leu Ala Gln Arg Leu Gln Asp Cys Leu Glu

2020 2025 2030

Asn Asn Ser

2035

<210> 3

<211> 4528

<212> ДНК

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 3

atgagtaatg ttcaagcatc gtttgaagca acggaagctg aattccgcgt ggaaggttac 60

gaaaaaattg agtttagtct tgtctatgta aatggtgcat ttgatatcag taacagagaa 120

attgcagaca gctatgagaa gtttggccgt tgtctgactg tgattgatgc taatgtcaac 180

agattatatg gcaagcaaat caagtcatat tttagacact atggtattga tctgaccgta 240

gttcccattg tgattactga gcctactaaa acccttgcaa cctttgagaa aattgttgat 300

gctttttctg actttggttt aatccgcaag gaaccagtat tagtagtggg tggtggttta 360

accactgatg tagctgggtt tgcgtgtgct gcttaccgtc gtaagagtaa ctatattcgg 420

gttccgacaa cgctgattgg tctgattgat gcaggtgtag cgattaaggt tgcagtcaac 480

catcgcaagt taaaaaatcg cttgggtgca tatcatgctc ctttgaaagt catcctcgat 540

ttctccttct tgcaaacatt accaacggct caagttcgta atgggatggc agagttggtc 600

aaaattgctg ttgtggcgaa ctctgaagtc tttgaattgt tgtatgaata tggcgaagag 660

ttgctttcca ctcactttgg atatgtgaat ggtacaaagg aactgaaagc gatcgcacat 720

aaactcaatt acgaggcaat aaaaactatg ctggagttgg aaactccaaa cttgcatgag 780

ttagacctcg atcgcgtcat tgcctacggt cacacttgga gtccgacctt agaattagct 840

ccgatgatac cgttgtttca cggtcatgcc gtcaatatag acatggcttt gtctgcaact 900

attgcggcaa gacgtggcta cattacatca ggagaacgcg atcgcatttt gagcttgatg 960

agtcgtatag gtttatcaat cgatcatcct ctactagatg gcgatttgct ctggtatgct 1020

acccaatcta ttagcttgac gcgagacggg aaacaacgcg cagctatgcc taaacccatt 1080

ggtgagtgct tctttgtcaa cgatttcacc cgtgaagaac tagatgcagc tttagctgaa 1140

cacaaacgtc tgtgtgctac ataccctcgt ggtggagatg gcattgacgc ttacatagaa 1200

actcaagaag aatccaaact attgggagtg tgaaaacatg accagtattt taggacgaga 1260

taccgcaaga ccaataacgc cacatagcat tctggtagca cagctacaaa aaaccctcag 1320

aatggcagag gaaagtaata ttccttcaga gatactgact tctctgcgcc aagggttgca 1380

attagcagca ggtttagatc cctatctgga tgattgcact acccctgaat cgaccgcatt 1440

gacagcacta gcgcagaaga caagcattga agactggagt aaacgcttca gtgatggtga 1500

aacagtgcgt caattagagc aagaaatgct ctcaggacat cttgaaggac aaacactaaa 1560

gatgtttgtg catatcacta aggctaaaag catcctagaa gtgggaatgt tcacaggata 1620

ttcagctttg gcaatggcag aggcgttacc agatgatggg cgactgattg cttgtgaagt 1680

agactcctat gtggccgagt ttgctcaaac ttgctttcaa gagtctcccc acggccgcaa 1740

gattgttgta gaagtggcac ctgcactaga gacgctgcac aagctggtgg ctaaaaaaga 1800

atcctttgat ctgatcttca ttgatgcgga taaaaaggag tatatagaat acttccaaat 1860

tatcttggat agccatttac tagctcccga cggattaatc tgtgtagata atactttgtt 1920

gcaaggacaa gtttacctgc catcagaaca gcgtacagcc aatggtgaag cgatcgctca 1980

attcaaccgc attgtcgccg cagatcctcg tgtagagcaa gttctgttac ccatacgaga 2040

tggtataacc ctgattagac gcttggtata agcggccgcg agctcctcga gatggcacaa 2100

tcaatctctt tatctcttcc tcaatccaca acgccatcaa agggtgtgag gctaaaaata 2160

gcagctctac tgaagactat cgggactcta atactactgc tgatagcctt gccgcttaat 2220

gctttgatag tattgatatc tctgatgtgt aggccgttta caaaaaaacc tgccgtagcc 2280

actcatcccc agaatatctt ggtcagtggc ggcaaaatga ccaaagcatt gcaacttgcc 2340

cgctccttcc atgcagccgg acacagagtt attctgattg aaggtcataa atactggtta 2400

tcagggcata gattctcaaa ttctgtgagt cgtttttata cagttcctgc accacaagac 2460

gacccagaag gctataccca agcgctattg gaaattgtca aacgagagaa gattgacgtt 2520

tatgtacccg tatgcagccc tgtagctagt tattacgact ctttggcaaa gtctgcacta 2580

tcagaatatt gtgaggtttt tcactttgat gctgatataa ccaagatgct ggatgataaa 2640

tttgccttta ccgatcgggc gcgatcgctt ggtttatcag ccccgaaatc ttttaaaatt 2700

accgatcctg aacaagttat caacttcgat tttagtaaag agacgcgcaa atatattctt 2760

aagagtattt cttacgactc agttcgccgc ttaaatttaa ccaaacttcc ttgtgatacc 2820

ccagaagaga cagcagcgtt tgtcaagagt ttacccatca gcccagaaaa accttggatt 2880

atgcaagaat ttattcctgg gaaagaatta tgcacccata gcacagtccg agacggcgaa 2940

ttaaggttgc attgctgttc aaattcttca gcgtttcaga ttaactatga aaatgtcgaa 3000

aatccccaaa ttcaagaatg ggtacaacat ttcgtcaaaa gtttacggct gactggacaa 3060

atatctcttg actttatcca agctgaagat ggtacagctt atgccattga atgtaatcct 3120

cgcacccatt cggcgatcac aatgttctac aatcacccag gtgttgcaga agcctatctt 3180

ggtaaaactc ctctagctgc acctttggaa cctcttgcag atagcaagcc cacttactgg 3240

atatatcacg aaatctggcg attgactggg attcgctctg gacaacaatt acaaacttgg 3300

tttgggagat tagtcagagg tacagatgcc atttatcgcc tggacgatcc gataccattt 3360

ttaactttgc accattggca gattacttta cttttgctac aaaatttgca acgactcaaa 3420

ggttgggtaa agatcgattt taatatcggt aaactcgtgg aattaggggg cgactaaaaa 3480

catgccagta cttaatatcc ttcatttagt tgggtctgca cacgataagt tttactgtga 3540

tttatcacgt ctttatgccc aagactgttt agctgcaaca gcagatccat cgctttataa 3600

ctttcaaatt gcatatatca cacccgatcg gcagtggcga tttcctgact ctctcagtcg 3660

agaagatatt gctcttacca aaccgattcc tgtgtttgat gccatacaat ttctaacagg 3720

ccaaaacatt gacatgatgt taccacaaat gttttgtatt cctggaatga ctcagtaccg 3780

tgccctattc gatctgctca agatccctta tataggaaat accccagata ttatggcgat 3840

cgcggcccac aaagccagag ccaaagcaat tgtcgaagca gcaggggtaa aagtgcctcg 3900

tggagaattg cttcgccaag gagatattcc aacaattaca cctccagcag tcgtcaaacc 3960

tgtaagttct gacaactctt taggagtagt cttagttaaa gatgtgactg aatatgatgc 4020

tgccttaaag aaagcatttg aatatgcttc ggaggtcatc gtagaagcat tcatcgaact 4080

tggtcgagaa gtcagatgcg gcatcattgt aaaagacggt gagctaatag gtttacccct 4140

tgaagagtat ctggtagacc cacacgataa acctatccgt aactatgctg ataaactcca 4200

acaaactgac gatggcgact tgcatttgac tgctaaagat aatatcaagg cttggatttt 4260

agaccctaac gacccaatca cccaaaaggt tcagcaagtg gctaaaaggt gtcatcaggc 4320

tttgggttgt cgccactaca gtttatttga cttccgaatc gatccaaagg gacaaccttg 4380

gttcttagaa gctggattat attgttcttt tgcccccaaa agtgtgattt cttctatggc 4440

gaaagcagcc ggaatccctc taaatgattt attaataacc gctattaatg aaacattggg 4500

tagtaataaa aaggtgttac aaaattga 4528

<210> 4

<211> 1496

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 4

Met Ser Asn Val Gln Ala Ser Phe Glu Ala Thr Glu Ala Glu Phe Arg

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Phe Ser Leu Val Tyr Val Asn Gly

20 25 30

Ala Phe Asp Ile Ser Asn Arg Glu Ile Ala Asp Ser Tyr Glu Lys Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Thr Val Ile Asp Ala Asn Val Asn Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Lys Gln Ile Lys Ser Tyr Phe Arg His Tyr Gly Ile Asp Leu Thr Val

65 70 75 80

Val Pro Ile Val Ile Thr Glu Pro Thr Lys Thr Leu Ala Thr Phe Glu

85 90 95

Lys Ile Val Asp Ala Phe Ser Asp Phe Gly Leu Ile Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Thr Thr Asp Val Ala Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Lys Ser Asn Tyr Ile Arg Val Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Gly Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Pro Leu Lys

165 170 175

Val Ile Leu Asp Phe Ser Phe Leu Gln Thr Leu Pro Thr Ala Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala Asn Ser

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Tyr Glu Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Ser Thr

210 215 220

His Phe Gly Tyr Val Asn Gly Thr Lys Glu Leu Lys Ala Ile Ala His

225 230 235 240

Lys Leu Asn Tyr Glu Ala Ile Lys Thr Met Leu Glu Leu Glu Thr Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Met Ile Pro Leu Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Ile Asp Met Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ser Gly Glu Arg Asp Arg Ile Leu Ser Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Ile Gly Leu Ser Ile Asp His Pro Leu Leu Asp Gly Asp Leu

325 330 335

Leu Trp Tyr Ala Thr Gln Ser Ile Ser Leu Thr Arg Asp Gly Lys Gln

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Glu Cys Phe Phe Val Asn Asp

355 360 365

Phe Thr Arg Glu Glu Leu Asp Ala Ala Leu Ala Glu His Lys Arg Leu

370 375 380

Cys Ala Thr Tyr Pro Arg Gly Gly Asp Gly Ile Asp Ala Tyr Ile Glu

385 390 395 400

Thr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Leu Gly Val Met Thr Ser Ile Leu Gly

405 410 415

Arg Asp Thr Ala Arg Pro Ile Thr Pro His Ser Ile Leu Val Ala Gln

420 425 430

Leu Gln Lys Thr Leu Arg Met Ala Glu Glu Ser Asn Ile Pro Ser Glu

435 440 445

Ile Leu Thr Ser Leu Arg Gln Gly Leu Gln Leu Ala Ala Gly Leu Asp

450 455 460

Pro Tyr Leu Asp Asp Cys Thr Thr Pro Glu Ser Thr Ala Leu Thr Ala

465 470 475 480

Leu Ala Gln Lys Thr Ser Ile Glu Asp Trp Ser Lys Arg Phe Ser Asp

485 490 495

Gly Glu Thr Val Arg Gln Leu Glu Gln Glu Met Leu Ser Gly His Leu

500 505 510

Glu Gly Gln Thr Leu Lys Met Phe Val His Ile Thr Lys Ala Lys Ser

515 520 525

Ile Leu Glu Val Gly Met Phe Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Ala Met Ala

530 535 540

Glu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Arg Leu Ile Ala Cys Glu Val Asp Ser

545 550 555 560

Tyr Val Ala Glu Phe Ala Gln Thr Cys Phe Gln Glu Ser Pro His Gly

565 570 575

Arg Lys Ile Val Val Glu Val Ala Pro Ala Leu Glu Thr Leu His Lys

580 585 590

Leu Val Ala Lys Lys Glu Ser Phe Asp Leu Ile Phe Ile Asp Ala Asp

595 600 605

Lys Lys Glu Tyr Ile Glu Tyr Phe Gln Ile Ile Leu Asp Ser His Leu

610 615 620

Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Cys Val Asp Asn Thr Leu Leu Gln Gly

625 630 635 640

Gln Val Tyr Leu Pro Ser Glu Gln Arg Thr Ala Asn Gly Glu Ala Ile

645 650 655

Ala Gln Phe Asn Arg Ile Val Ala Ala Asp Pro Arg Val Glu Gln Val

660 665 670

Leu Leu Pro Ile Arg Asp Gly Ile Thr Leu Ile Arg Arg Leu Val Met

675 680 685

Ala Gln Ser Ile Ser Leu Ser Leu Pro Gln Ser Thr Thr Pro Ser Lys

690 695 700

Gly Val Arg Leu Lys Ile Ala Ala Leu Leu Lys Thr Ile Gly Thr Leu

705 710 715 720

Ile Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Leu Asn Ala Leu Ile Val Leu Ile

725 730 735

Ser Leu Met Cys Arg Pro Phe Thr Lys Lys Pro Ala Val Ala Thr His

740 745 750

Pro Gln Asn Ile Leu Val Ser Gly Gly Lys Met Thr Lys Ala Leu Gln

755 760 765

Leu Ala Arg Ser Phe His Ala Ala Gly His Arg Val Ile Leu Ile Glu

770 775 780

Gly His Lys Tyr Trp Leu Ser Gly His Arg Phe Ser Asn Ser Val Ser

785 790 795 800

Arg Phe Tyr Thr Val Pro Ala Pro Gln Asp Asp Pro Glu Gly Tyr Thr

805 810 815

Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Lys Arg Glu Lys Ile Asp Val Tyr Val

820 825 830

Pro Val Cys Ser Pro Val Ala Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Lys Ser

835 840 845

Ala Leu Ser Glu Tyr Cys Glu Val Phe His Phe Asp Ala Asp Ile Thr

850 855 860

Lys Met Leu Asp Asp Lys Phe Ala Phe Thr Asp Arg Ala Arg Ser Leu

865 870 875 880

Gly Leu Ser Ala Pro Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Pro Glu Gln Val

885 890 895

Ile Asn Phe Asp Phe Ser Lys Glu Thr Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ser

900 905 910

Ile Ser Tyr Asp Ser Val Arg Arg Leu Asn Leu Thr Lys Leu Pro Cys

915 920 925

Asp Thr Pro Glu Glu Thr Ala Ala Phe Val Lys Ser Leu Pro Ile Ser

930 935 940

Pro Glu Lys Pro Trp Ile Met Gln Glu Phe Ile Pro Gly Lys Glu Leu

945 950 955 960

Cys Thr His Ser Thr Val Arg Asp Gly Glu Leu Arg Leu His Cys Cys

965 970 975

Ser Asn Ser Ser Ala Phe Gln Ile Asn Tyr Glu Asn Val Glu Asn Pro

980 985 990

Gln Ile Gln Glu Trp Val Gln His Phe Val Lys Ser Leu Arg Leu Thr

995 1000 1005

Gly Gln Ile Ser Leu Asp Phe Ile Gln Ala Glu Asp Gly Thr Ala Tyr

1010 1015 1020

Ala Ile Glu Cys Asn Pro Arg Thr His Ser Ala Ile Thr Met Phe Tyr

1025 1030 1035 1040

Asn His Pro Gly Val Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Pro Leu Ala

1045 1050 1055

Ala Pro Leu Glu Pro Leu Ala Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Trp Ile Tyr

1060 1065 1070

His Glu Ile Trp Arg Leu Thr Gly Ile Arg Ser Gly Gln Gln Leu Gln

1075 1080 1085

Thr Trp Phe Gly Arg Leu Val Arg Gly Thr Asp Ala Ile Tyr Arg Leu

1090 1095 1100

Asp Asp Pro Ile Pro Phe Leu Thr Leu His His Trp Gln Ile Thr Leu

1105 1110 1115 1120

Leu Leu Leu Gln Asn Leu Gln Arg Leu Lys Gly Trp Val Lys Ile Asp

1125 1130 1135

Phe Asn Ile Gly Lys Leu Val Glu Leu Gly Gly Asp Met Pro Val Leu

1140 1145 1150

Asn Ile Leu His Leu Val Gly Ser Ala His Asp Lys Phe Tyr Cys Asp

1155 1160 1165

Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gln Asp Cys Leu Ala Ala Thr Ala Asp Pro

1170 1175 1180

Ser Leu Tyr Asn Phe Gln Ile Ala Tyr Ile Thr Pro Asp Arg Gln Trp

1185 1190 1195 1200

Arg Phe Pro Asp Ser Leu Ser Arg Glu Asp Ile Ala Leu Thr Lys Pro

1205 1210 1215

Ile Pro Val Phe Asp Ala Ile Gln Phe Leu Thr Gly Gln Asn Ile Asp

1220 1225 1230

Met Met Leu Pro Gln Met Phe Cys Ile Pro Gly Met Thr Gln Tyr Arg

1235 1240 1245

Ala Leu Phe Asp Leu Leu Lys Ile Pro Tyr Ile Gly Asn Thr Pro Asp

1250 1255 1260

Ile Met Ala Ile Ala Ala His Lys Ala Arg Ala Lys Ala Ile Val Glu

1265 1270 1275 1280

Ala Ala Gly Val Lys Val Pro Arg Gly Glu Leu Leu Arg Gln Gly Asp

1285 1290 1295

Ile Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala Val Val Lys Pro Val Ser Ser Asp

1300 1305 1310

Asn Ser Leu Gly Val Val Leu Val Lys Asp Val Thr Glu Tyr Asp Ala

1315 1320 1325

Ala Leu Lys Lys Ala Phe Glu Tyr Ala Ser Glu Val Ile Val Glu Ala

1330 1335 1340

Phe Ile Glu Leu Gly Arg Glu Val Arg Cys Gly Ile Ile Val Lys Asp

1345 1350 1355 1360

Gly Glu Leu Ile Gly Leu Pro Leu Glu Glu Tyr Leu Val Asp Pro His

1365 1370 1375

Asp Lys Pro Ile Arg Asn Tyr Ala Asp Lys Leu Gln Gln Thr Asp Asp

1380 1385 1390

Gly Asp Leu His Leu Thr Ala Lys Asp Asn Ile Lys Ala Trp Ile Leu

1395 1400 1405

Asp Pro Asn Asp Pro Ile Thr Gln Lys Val Gln Gln Val Ala Lys Arg

1410 1415 1420

Cys His Gln Ala Leu Gly Cys Arg His Tyr Ser Leu Phe Asp Phe Arg

1425 1430 1435 1440

Ile Asp Pro Lys Gly Gln Pro Trp Phe Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Cys

1445 1450 1455

Ser Phe Ala Pro Lys Ser Val Ile Ser Ser Met Ala Lys Ala Ala Gly

1460 1465 1470

Ile Pro Leu Asn Asp Leu Leu Ile Thr Ala Ile Asn Glu Thr Leu Gly

1475 1480 1485

Ser Asn Lys Lys Val Leu Gln Asn

1490 1495

<210> 5

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_ABCD

<400> 5

acaatttcac acaggaaaga tatcatgagt atcgtccaag caaag 45

<210> 6

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_ABCD

<400> 6

ctcatccgcc aaaacagctc tagattatga attattttcc agaca 45

<210> 7

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Npr_ABCD

<400> 7

gatcgatatc atgagtaatg ttcaagcatc g 31

<210> 8

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Npr_ABCD

<400> 8

gatctctaga tcaattttgt aacacctttt tattac 36

<210> 9

<211> 71

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для кассеты с делецией aroD

<400> 9

tcatggggtt cggtgcctga caggctgacc gcgtgcagaa agggtaaaaa gctggagctg 60

cttcgaagtt c 71

<210> 10

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для кассеты с делецией aroD

<400> 10

atatattttt tagttcggcg gggagggtgt tcccgccgaa atattattgc gccatggtcc 60

atatgaatat cctccttag 79

<210> 11

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для делеции aroD

<400> 11

caaagatttc cctctggaat atg 23

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для делеции aroD

<400> 12

cagatgtgat tttccctacg c 21

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для aroG

<400> 13

aaggagctca ctagtggtac ggatgctcct gttatggtcg 40

<210> 14

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для aroG

<400> 14

ctctcttcga caatttccac ttacccgcga cgcgctttta c 41

<210> 15

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для ppsA

<400> 15

gtaaaagcgc gtcgcgggta agtggaaatt gtcgaagaga g 41

<210> 16

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для ppsA

<400> 16

gccctagtgg atctgatggg ttatttcttc agttcagcca gg 42

<210> 17

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для tktA

<400> 17

cctggctgaa ctgaagaaat aacccatcag atccactagg gc 42

<210> 18

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для tktA

<400> 18

cgacaccggt cagcagggtg ttacagcagt tcttttgctt tc 42

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для подтверждения плазмиды

pSKH130-deltafhuA-Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA

<400> 19

gaaaatgccg atgggtaccg 20

<210> 20

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для подтверждения поазмиды

pSKH130-deltafhuA-Pn-aroG-Pn-ppsA-Pn-tktA

<400> 20

cgttagaacg cggctacaat taatac 26

<210> 21

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_ABCD

<400> 21

catctcacac cgagattatt ttagtactat gagtatcgtc caagcaaag 49

<210> 22

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_ABCD

<400> 22

caatttcgta tagagtctca ctagtaccgc aaaaaggcca tccgtc 46

<210> 23

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента промотора Ptrc

<400> 23

tctcacaccg agattatttt agtcgactgc acggtgcacc aat 43

<210> 24

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора Ptrc

<400> 24

tttgcttgga cgatactcat agtctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 50

<210> 25

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента промотора PCJ1 или PCJ2.2

<400> 25

tctcacaccg agattatttt agtcaccgcg ggcttattcc att 43

<210> 26

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора PCJ1 или PCJ2.2

<400> 26

ttgcttggac gatactcata gtatcttaat ctcctagatt gggtttcac 49

<210> 27

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора PCJ2.2

<400> 27

tttgcttgga cgatactcat agtatcttaa tctcctagat ttggtttcac 50

<210> 28

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для подтверждения интеграции Ava-ABCD

<400> 28

cagaatgagt gaacaaccac gg 22

<210> 29

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для подтверждения интеграции Ava-ABCD

<400> 29

catatccaat aacccagaca aaacc 25

<210> 30

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ptrc/PCJ1-Ava_AB или Ptrc/PCJ1-Ava_ABC

<400> 30

gatcggatcc atgagtatcg tccaagcaaa g 31

<210> 31

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ptrc/PCJ1-Ava_AB

<400> 31

gatcactagt ttaaggttgt attctgcgg 29

<210> 32

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ptrc/PCJ1-Ava_ABC

<400> 32

gatcactagt ctaatctccc cccaattcc 29

<210> 33

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_ABCD

<400> 33

ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gatgagtatc gtccaagcaa agtttgaagc 60

60

<210> 34

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_ABCD

<400> 34

agagggtgac gctagtcaga actagtttat gaattatttt ccagacaatc ttgtaaacgc 60

60

<210> 35

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента промотора CJ7

<400> 35

ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gagaaacatc ccagcgctac taataggg 58

<210> 36

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора CJ7

<400> 36

caaactttgc ttggacgata ctcatagtgt ttcctttcgt tgggtacg 48

<210> 37

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента промотора lysc8

<400> 37

caccaacaaa aggctctacc catatgaaca ctcctctggc taggtag 47

<210> 38

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора lysc8

<400> 38

caaactttgc ttggacgata ctcatctttg tgcacctttc gatctacg 48

<210> 39

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента промотора O2

<400> 39

ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gcaataatcg tgaattttgg cagc 54

<210> 40

<211> 53

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента промотора O2

<400> 40

caaactttgc ttggacgata ctcattgttt tgatctcctc caataatcta tgc 53

<210> 41

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для генов aroD для конструирования pDC-дельта-aroD

<400> 41

gatcggatcc cactggacgt ttgggtgaga cc 32

<210> 42

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для генов aroD для конструирования pDC-дельта-aroD

<400> 42

gatcggatcc actagtttta ggttccattt ctaattg 37

<210> 43

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для генов aroD для конструирования pDC-дельта-aroD

<400> 43

gatcactagt atgaacgaca gtattctcc 29

<210> 44

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для генов aroD для конструирования pDC-дельта-aroD

<400> 44

gatcaagctt gttacatcct gacgttgtgg 30

<210> 45

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_A

<400> 45

cgcggatcca tgagtatcgt ccaagcaaag 30

<210> 46

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_A

<400> 46

cgcctcgagt tatttaacac tcccgattaa ttc 33

<210> 47

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_B

<400> 47

cgcggatcca tgacaaatgt gattgtccaa c 31

<210> 48

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_B

<400> 48

cgcctcgagt taaggttgta ttctgcggat aattg 35

<210> 49

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_C

<400> 49

cgcggatcca tggcacaatc ccttcccctt tc 32

<210> 50

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_C

<400> 50

cgcctcgagc taatctcccc ccaattccac c 31

<210> 51

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Ava_D

<400> 51

cgcggatcca tgcagactat agattttaat attc 34

<210> 52

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Ava_D

<400> 52

cgcctcgagt tatgaattat tttccagaca atc 33

<210> 53

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Npr_A

<400> 53

cgcggatcca tgagtaatgt tcaagcatcg 30

<210> 54

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Npr_A

<400> 54

cgcctcgagt cacactccca atagtttgg 29

<210> 55

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Npr_B

<400> 55

cgcggatcca tgaccagtat tttaggacga g 31

<210> 56

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Npr_B

<400> 56

cgcctcgagt tataccaagc gtctaatc 28

<210> 57

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Npr_C

<400> 57

cgcggatcca tggcacaatc aatctcttta tc 32

<210> 58

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Npr_C

<400> 58

cgcctcgagt tagtcgcccc ctaattccac g 31

<210> 59

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для Npr_D

<400> 59

cgcggatcca tgccagtact taatatcctt c 31

<210> 60

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для Npr_D

<400> 60

cgcctcgagt caattttgta acaccttttt attac 35

<210> 61

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для pGPD

<400> 61

acgtaagata attgtatatt acgcagttta tcattatcaa tactcgcc 48

<210> 62

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для pGPD

<400> 62

gtaacgacaa tcctctccat gtggtcttga atcaaagctg 40

<210> 63

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для LoxP(Ura)

<400> 63

ccgattgtca atcagcgtaa cagctgaagc ttcgtacgc 39

<210> 64

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для LoxP(Ura)

<400> 64

ttgttttggc cagtcggcaa gggcataggc cactagtgga tctg 44

<210> 65

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для aroB

<400> 65

cagctttgat tcaagaccac atggagagga ttgtcgttac 40

<210> 66

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для aroB

<400> 66

gcgtacgaag cttcagctgt tacgctgatt gacaatcgg 39

<210> 67

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента 1 ARO1

<400> 67

accattcaag agtatatgag agaaggaaaa ct 32

<210> 68

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента 1 ARO1

<400> 68

ggcgagtatt gataatgata aactgcgtaa tatacaatta tcttacg 47

<210> 69

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для фрагмента 2 ARO1

<400> 69

cagatccact agtggcctat gcccttgccg actggccaaa acaa 44

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для фрагмента 2 ARO1

<400> 70

caaatatcaa tggcacgttg 20

<210> 71

<211> 759

<212> ДНК

<213> Escherichia coli W3110

<400> 71

atgaaaaccg taactgtaaa agatctcgtc attggtacgg gcgcacctaa aatcatcgtc 60

tcgctgatgg cgaaagatat cgccagcgtg aaatccgaag ctctcgccta tcgtgaagcg 120

gactttgata ttctggaatg gcgtgtggac cactatgccg acctctccaa tgtggagtct 180

gtcatggcgg cagcaaaaat tctccgtgag accatgccag aaaaaccgct gctgtttacc 240

ttccgcagtg ccaaagaagg cggcgagcag gcgatttcca ccgaggctta tattgcactc 300

aatcgtgcag ccatcgacag cggcctggtt gatatgatcg atctggagtt atttaccggt 360

gatgatcagg ttaaagaaac cgtcgcctac gcccacgcgc atgatgtgaa agtagtcatg 420

tccaaccatg acttccataa aacgccggaa gccgaagaaa tcattgcccg tctgcgcaaa 480

atgcaatcct tcgacgccga tattcctaag attgcgctga tgccgcaaag taccagcgat 540

gtgctgacgt tgcttgccgc gaccctggag atgcaggagc agtatgccga tcgtccaatt 600

atcacgatgt cgatggcaaa aactggcgta atttctcgtc tggctggtga agtatttggc 660

tcggcggcaa cttttggtgc ggtaaaaaaa gcgtctgcgc cagggcaaat ctcggtaaat 720

gatttgcgca cggtattaac tattttacac caggcataa 759

<210> 72

<211> 252

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 72

Met Lys Thr Val Thr Val Lys Asp Leu Val Ile Gly Thr Gly Ala Pro

1 5 10 15

Lys Ile Ile Val Ser Leu Met Ala Lys Asp Ile Ala Ser Val Lys Ser

20 25 30

Glu Ala Leu Ala Tyr Arg Glu Ala Asp Phe Asp Ile Leu Glu Trp Arg

35 40 45

Val Asp His Tyr Ala Asp Leu Ser Asn Val Glu Ser Val Met Ala Ala

50 55 60

Ala Lys Ile Leu Arg Glu Thr Met Pro Glu Lys Pro Leu Leu Phe Thr

65 70 75 80

Phe Arg Ser Ala Lys Glu Gly Gly Glu Gln Ala Ile Ser Thr Glu Ala

85 90 95

Tyr Ile Ala Leu Asn Arg Ala Ala Ile Asp Ser Gly Leu Val Asp Met

100 105 110

Ile Asp Leu Glu Leu Phe Thr Gly Asp Asp Gln Val Lys Glu Thr Val

115 120 125

Ala Tyr Ala His Ala His Asp Val Lys Val Val Met Ser Asn His Asp

130 135 140

Phe His Lys Thr Pro Glu Ala Glu Glu Ile Ile Ala Arg Leu Arg Lys

145 150 155 160

Met Gln Ser Phe Asp Ala Asp Ile Pro Lys Ile Ala Leu Met Pro Gln

165 170 175

Ser Thr Ser Asp Val Leu Thr Leu Leu Ala Ala Thr Leu Glu Met Gln

180 185 190

Glu Gln Tyr Ala Asp Arg Pro Ile Ile Thr Met Ser Met Ala Lys Thr

195 200 205

Gly Val Ile Ser Arg Leu Ala Gly Glu Val Phe Gly Ser Ala Ala Thr

210 215 220

Phe Gly Ala Val Lys Lys Ala Ser Ala Pro Gly Gln Ile Ser Val Asn

225 230 235 240

Asp Leu Arg Thr Val Leu Thr Ile Leu His Gln Ala

245 250

<210> 73

<211> 1053

<212> ДНК

<213> Escherichia coli W3110

<400> 73

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 74

<211> 350

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 74

Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala

20 25 30

Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys

35 40 45

Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His

50 55 60

Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu

85 90 95

Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His

100 105 110

Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys

115 120 125

Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly

145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala

165 170 175

Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys

195 200 205

Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser

210 215 220

Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala

245 250 255

Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser

260 265 270

Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln

275 280 285

Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His

290 295 300

Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr

305 310 315 320

Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly

340 345 350

<210> 75

<211> 2379

<212> ДНК

<213> Escherichia coli W3110

<400> 75

atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg ctttggtata accaactcgg catgaatgat 60

gtagacaggg ttgggggcaa aaatgcctcc ctgggtgaaa tgattactaa tctttccgga 120

atgggtgttt ccgttccgaa tggtttcgcc acaaccgccg acgcgtttaa ccagtttctg 180

gaccaaagcg gcgtaaacca gcgcatttat gaactgctgg ataaaacgga tattgacgat 240

gttactcagc ttgcgaaagc gggcgcgcaa atccgccagt ggattatcga cactcccttc 300

cagcctgagc tggaaaacgc catccgcgaa gcctatgcac agctttccgc cgatgacgaa 360

aacgcctctt ttgcggtgcg ctcctccgcc accgcagaag atatgccgga cgcttctttt 420

gccggtcagc aggaaacctt cctcaacgtt cagggttttg acgccgttct cgtggcagtg 480

aaacatgtat ttgcttctct gtttaacgat cgcgccatct cttatcgtgt gcaccagggt 540

tacgatcacc gtggtgtggc gctctccgcc ggtgttcaac ggatggtgcg ctctgacctc 600

gcatcatctg gcgtgatgtt ctccattgat accgaatccg gctttgacca ggtggtgttt 660

atcacttccg catggggcct tggtgagatg gtcgtgcagg gtgcggttaa cccggatgag 720

ttttacgtgc ataaaccgac actggcggcg aatcgcccgg ctatcgtgcg ccgcaccatg 780

gggtcgaaaa aaatccgcat ggtttacgcg ccgacccagg agcacggcaa gcaggttaaa 840

atcgaagacg taccgcagga acagcgtgac atcttctcgc tgaccaacga agaagtgcag 900

gaactggcaa aacaggccgt acaaattgag aaacactacg gtcgcccgat ggatattgag 960

tgggcgaaag atggccacac cggtaaactg ttcattgtgc aggcgcgtcc ggaaaccgtg 1020

cgctcacgcg gtcaggtcat ggagcgttat acgctgcatt cacagggtaa gattatcgcc 1080

gaaggccgtg ctatcggtca tcgcatcggt gcgggtccgg tgaaagtcat ccatgacatc 1140

agcgaaatga accgcatcga acctggcgac gtgctggtta ctgacatgac cgacccggac 1200

tgggaaccga tcatgaagaa agcatctgcc atcgtcacca accgtggcgg tcgtacctgt 1260

cacgcggcga tcatcgctcg tgaactgggc attccggcgg tagtgggctg tggagatgca 1320

acagaacgga tgaaagacgg tgagaacgtc actgtttctt gtgccgaagg tgataccggt 1380

tacgtctatg cggagttgct ggaatttagc gtgaaaagct ccagcgtaga aacgatgccg 1440

gatctgccgt tgaaagtgat gatgaacgtc ggtaacccgg accgtgcttt cgacttcgcc 1500

tgcctaccga acgaaggcgt gggccttgcg cgtctggaat ttatcatcaa ccgtatgatt 1560

ggcgtccacc cacgcgcact gcttgagttt gacgatcagg aaccgcagtt gcaaaacgaa 1620

atccgcgaga tgatgaaagg ttttgattct ccgcgtgaat tttacgttgg tcgtctgact 1680

gaagggatcg cgacgctggg tgccgcgttt tatccgaagc gcgtcattgt ccgtctctct 1740

gattttaaat cgaacgaata tgccaacctg gtcggtggtg agcgttacga gccagatgaa 1800

gagaacccga tgctcggctt ccgtggcgcg ggccgctatg tttccgacag cttccgcgac 1860

tgtttcgcgc tggagtgtga agcagtgaaa cgtgtgcgca acgacatggg actgaccaac 1920

gttgagatca tgatcccgtt cgtgcgtacc gtagatcagg cgaaagcggt ggttgaagaa 1980

ctggcgcgtc aggggctgaa acgtggcgag aacgggctga aaatcatcat gatgtgtgaa 2040

atcccgtcca acgccttgct ggccgagcag ttcctcgaat atttcgacgg cttctcaatt 2100

ggctcaaacg atatgacgca gctggcgctc ggtctggacc gtgactccgg cgtggtgtct 2160

gaattgttcg atgagcgcaa cgatgcggtg aaagcactgc tgtcgatggc tatccgtgcc 2220

gcgaagaaac agggcaaata tgtcgggatt tgcggtcagg gtccgtccga ccacgaagac 2280

tttgccgcat ggttgatgga agaggggatc gatagcctgt ctctgaaccc ggacaccgtg 2340

gtgcaaacct ggttaagcct ggctgaactg aagaaataa 2379

<210> 76

<211> 792

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 76

Met Ser Asn Asn Gly Ser Ser Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly

35 40 45

Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly

50 55 60

Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile

85 90 95

Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr

100 105 110

Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln

130 135 140

Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val

145 150 155 160

Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg

165 170 175

Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val

180 185 190

Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser

195 200 205

Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala

210 215 220

Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val

245 250 255

Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr

260 265 270

Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln

275 280 285

Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys

290 295 300

Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu

305 310 315 320

Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg

325 330 335

Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu

340 345 350

His Ser Gln Gly Lys Ile Ile Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg

355 360 365

Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn

370 375 380

Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp

385 390 395 400

Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly

405 410 415

Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Leu Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu

435 440 445

Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Phe Ser Val Lys Ser Ser Ser Val Glu Thr Met Pro

465 470 475 480

Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu

500 505 510

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu

515 520 525

Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met

530 535 540

Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile

565 570 575

Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly

580 585 590

Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Asp Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg

595 600 605

Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Asp Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu

610 615 620

Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Asp Met Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala

645 650 655

Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly

660 665 670

Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala

675 680 685

Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp

690 695 700

Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser

705 710 715 720

Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met

725 730 735

Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly

740 745 750

Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu

755 760 765

Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp

770 775 780

Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys

785 790

<210> 77

<211> 1992

<212> ДНК

<213> Escherichia coli W3110

<400> 77

atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60

aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120

tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180

gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240

gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300

ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360

gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420

ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480

ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540

ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600

accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660

gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720

ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780

cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840

tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900

caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960

gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020

gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080

tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140

gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200

gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260

atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320

gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380

cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440

tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500

gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560

cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620

tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680

gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740

gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800

ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860

aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920

gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980

gaactgctgt aa 1992

<210> 78

<211> 663

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 78

Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met

1 5 10 15

Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly

20 25 30

Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn

35 40 45

Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn

50 55 60

Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys

85 90 95

Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr

100 105 110

Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile

115 120 125

Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile

130 135 140

Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu

145 150 155 160

Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His

180 185 190

Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr

195 200 205

Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly

245 250 255

Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu

260 265 270

Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser

275 280 285

Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu

290 295 300

Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln

305 310 315 320

Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp

325 330 335

Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro

340 345 350

Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe

355 360 365

Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro

370 375 380

Ser Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala

385 390 395 400

Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala

405 410 415

Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser

420 425 430

Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala

435 440 445

Ala Leu Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile

450 455 460

Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala

465 470 475 480

Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln

485 490 495

Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly

500 505 510

Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg

515 520 525

Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly Tyr Val Leu Lys

530 535 540

Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu

545 550 555 560

Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val

565 570 575

Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln

580 585 590

Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg

595 600 605

Val Ala Val Glu Ala Gly Ile Ala Asp Tyr Trp Tyr Lys Tyr Val Gly

610 615 620

Leu Asn Gly Ala Ile Val Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro

625 630 635 640

Ala Glu Leu Leu Phe Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val

645 650 655

Ala Lys Ala Lys Glu Leu Leu

660

<210> 79

<211> 438

<212> ДНК

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 79

atgcctggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60

cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120

gcgaagcacg gccttgaggt tgaggcgctg cagagcaatc acgaaggtga gctaatcgat 180

gcgctgcaca acgctcgcgg cacccacatc ggttgcgtga ttaaccccgg cggcctgact 240

cacacttcgg tggcgctttt ggatgctgtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300

cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360

gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420

gcaaatctca aaaagtag 438

<210> 80

<211> 145

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 80

Met Pro Gly Lys Ile Leu Leu Leu Asn Gly Pro Asn Leu Asn Met Leu

1 5 10 15

Gly Lys Arg Glu Pro Asp Ile Tyr Gly His Asp Thr Leu Glu Asp Val

20 25 30

Val Ala Leu Ala Thr Ala Glu Ala Ala Lys His Gly Leu Glu Val Glu

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Asn His Glu Gly Glu Leu Ile Asp Ala Leu His Asn

50 55 60

Ala Arg Gly Thr His Ile Gly Cys Val Ile Asn Pro Gly Gly Leu Thr

65 70 75 80

His Thr Ser Val Ala Leu Leu Asp Ala Val Lys Ala Ser Glu Leu Pro

85 90 95

Thr Val Glu Val His Ile Ser Asn Pro His Ala Arg Glu Glu Phe Arg

100 105 110

His His Ser Tyr Ile Ser Leu Ala Ala Val Ser Val Ile Ala Gly Ala

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Tyr Arg Phe Ala Val Asp Ile Leu Ala Asn Leu Lys

130 135 140

Lys

145

<210> 81

<211> 4767

<212> ДНК

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 81

atggtgcagt tagccaaagt cccaattcta ggaaatgata ttatccacgt tgggtataac 60

attcatgacc atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt 120

tgcaatgata cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag 180

gcttctttgc cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt 240

aaaagtagag aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt 300

gatacggtta tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca 360

tctacattta tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc 420

gattcctcca ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt 480

gcattttggc aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag 540

agagagttta tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac 600

gaatttacta gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa 660

aatgtcaagg ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt 720

gaagctatgt tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa 780

gttgtctctt cggatgaacg tgaatccagt ctaagaaacc ttttgaactt cggacattct 840

attggtcatg cttatgaagc tatactaacc ccacaagcat tacatggtga atgtgtgtcc 900

attggtatgg ttaaagaggc ggaattatcc cgttatttcg gtattctctc ccctacccaa 960

gttgcacgtc tatccaagat tttggttgcc tacgggttgc ctgtttcgcc tgatgagaaa 1020

tggtttaaag agctaacctt acataagaaa acaccattgg atatcttatt gaagaaaatg 1080

agtattgaca agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt 1140

aagtgctatg gtgactccgc tcaatttgtt agcgatgaag acctgagatt tattctaaca 1200

gatgaaaccc tcgtttaccc cttcaaggac atccctgctg atcaacagaa agttgttatc 1260

ccccctggtt ctaagtccat ctccaatcgt gctttaattc ttgctgccct cggtgaaggt 1320

caatgtaaaa tcaagaactt attacattct gatgatacta aacatatgtt aaccgctgtt 1380

catgaattga aaggtgctac gatatcatgg gaagataatg gtgagacggt agtggtggaa 1440

ggacatggtg gttccacatt gtcagcttgt gctgacccct tatatctagg taatgcaggt 1500

actgcatcta gatttttgac ttccttggct gccttggtca attctacttc aagccaaaag 1560

tatatcgttt taactggtaa cgcaagaatg caacaaagac caattgctcc tttggtcgat 1620

tctttgcgtg ctaatggtac taaaattgag tacttgaata atgaaggttc cctgccaatc 1680

aaagtttata ctgattcggt attcaaaggt ggtagaattg aattagctgc tacagtttct 1740

tctcagtacg tatcctctat cttgatgtgt gccccatacg ctgaagaacc tgtaactttg 1800

gctcttgttg gtggtaagcc aatctctaaa ttgtacgtcg atatgacaat aaaaatgatg 1860

gaaaaattcg gtatcaatgt tgaaacttct actacagaac cttacactta ttatattcca 1920

aagggacatt atattaaccc atcagaatac gtcattgaaa gtgatgcctc aagtgctaca 1980

tacccattgg ccttcgccgc aatgactggt actaccgtaa cggttccaaa cattggtttt 2040

gagtcgttac aaggtgatgc cagatttgca agagatgtct tgaaacctat gggttgtaaa 2100

ataactcaaa cggcaacttc aactactgtt tcgggtcctc ctgtaggtac tttaaagcca 2160

ttaaaacatg ttgatatgga gccaatgact gatgcgttct taactgcatg tgttgttgcc 2220

gctatttcgc acgacagtga tccaaattct gcaaatacaa ccaccattga aggtattgca 2280

aaccagcgtg tcaaagagtg taacagaatt ttggccatgg ctacagagct cgccaaattt 2340

ggcgtcaaaa ctacagaatt accagatggt attcaagtcc atggtttaaa ctcgataaaa 2400

gatttgaagg ttccttccga ctcttctgga cctgtcggtg tatgcacata tgatgatcat 2460

cgtgtggcca tgagtttctc gcttcttgca ggaatggtaa attctcaaaa tgaacgtgac 2520

gaagttgcta atcctgtaag aatacttgaa agacattgta ctggtaaaac ctggcctggc 2580

tggtgggatg tgttacattc cgaactaggt gccaaattag atggtgcaga acctttagag 2640

tgcacatcca aaaagaactc aaagaaaagc gttgtcatta ttggcatgag agcagctggc 2700

aaaactacta taagtaaatg gtgcgcatcc gctctgggtt acaaattagt tgacctagac 2760

gagctgtttg agcaacagca taacaatcaa agtgttaaac aatttgttgt ggagaacggt 2820

tgggagaagt tccgtgagga agaaacaaga attttcaagg aagttattca aaattacggc 2880

gatgatggat atgttttctc aacaggtggc ggtattgttg aaagcgctga gtctagaaaa 2940

gccttaaaag attttgcctc atcaggtgga tacgttttac acttacatag ggatattgag 3000

gagacaattg tctttttaca aagtgatcct tcaagacctg cctatgtgga agaaattcgt 3060

gaagtttgga acagaaggga ggggtggtat aaagaatgct caaatttctc tttctttgct 3120

cctcattgct ccgcagaagc tgagttccaa gctctaagaa gatcgtttag taagtacatt 3180

gcaaccatta caggtgtcag agaaatagaa attccaagcg gaagatctgc ctttgtgtgt 3240

ttaacctttg atgacttaac tgaacaaact gagaatttga ctccaatctg ttatggttgt 3300

gaggctgtag aggtcagagt agaccatttg gctaattact ctgctgattt cgtgagtaaa 3360

cagttatcta tattgcgtaa agccactgac agtattccta tcatttttac tgtgcgaacc 3420

atgaagcaag gtggcaactt tcctgatgaa gagttcaaaa ccttgagaga gctatacgat 3480

attgccttga agaatggtgt tgaattcctt gacttagaac taactttacc tactgatatc 3540

caatatgagg ttattaacaa aaggggcaac accaagatca ttggttccca tcatgacttc 3600

caaggattat actcctggga cgacgctgaa tgggaaaaca gattcaatca agcgttaact 3660

cttgatgtgg atgttgtaaa atttgtgggt acggctgtta atttcgaaga taatttgaga 3720

ctggaacact ttagggatac acacaagaat aagcctttaa ttgcagttaa tatgacttct 3780

aaaggtagca tttctcgtgt tttgaataat gttttaacac ctgtgacatc agatttattg 3840

cctaactccg ctgcccctgg ccaattgaca gtagcacaaa ttaacaagat gtatacatct 3900

atgggaggta tcgagcctaa ggaactgttt gttgttggaa agccaattgg ccactctaga 3960

tcgccaattt tacataacac tggctatgaa attttaggtt tacctcacaa gttcgataaa 4020

tttgaaactg aatccgcaca attggtgaaa gaaaaacttt tggacggaaa caagaacttt 4080

ggcggtgctg cagtcacaat tcctctgaaa ttagatataa tgcagtacat ggatgaattg 4140

actgatgctg ctaaagttat tggtgctgta aacacagtta taccattggg taacaagaag 4200

tttaagggtg ataataccga ctggttaggt atccgtaatg ccttaattaa caatggcgtt 4260

cccgaatatg ttggtcatac cgctggtttg gttatcggtg caggtggcac ttctagagcc 4320

gccctttacg ccttgcacag tttaggttgc aaaaagatct tcataatcaa caggacaact 4380

tcgaaattga agccattaat agagtcactt ccatctgaat tcaacattat tggaatagag 4440

tccactaaat ctatagaaga gattaaggaa cacgttggcg ttgctgtcag ctgtgtacca 4500

gccgacaaac cattagatga cgaactttta agtaagctgg agagattcct tgtgaaaggt 4560

gcccatgctg cttttgtacc aaccttattg gaagccgcat acaaaccaag cgttactccc 4620

gttatgacaa tttcacaaga caaatatcaa tggcacgttg tccctggatc acaaatgtta 4680

gtacaccaag gtgtagctca gtttgaaaag tggacaggat tcaagggccc tttcaaggcc 4740

atttttgatg ccgttacgaa agagtag 4767

<210> 82

<211> 1588

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 82

Met Val Gln Leu Ala Lys Val Pro Ile Leu Gly Asn Asp Ile Ile His

1 5 10 15

Val Gly Tyr Asn Ile His Asp His Leu Val Glu Thr Ile Ile Lys His

20 25 30

Cys Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ile Cys Asn Asp Thr Asn Leu Ser Lys

35 40 45

Val Pro Tyr Tyr Gln Gln Leu Val Leu Glu Phe Lys Ala Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Gly Ser Arg Leu Leu Thr Tyr Val Val Lys Pro Gly Glu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Ser Arg Glu Thr Lys Ala Gln Leu Glu Asp Tyr Leu Leu Val Glu

85 90 95

Gly Cys Thr Arg Asp Thr Val Met Val Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile

100 105 110

Gly Asp Met Ile Gly Phe Val Ala Ser Thr Phe Met Arg Gly Val Arg

115 120 125

Val Val Gln Val Pro Thr Ser Leu Leu Ala Met Val Asp Ser Ser Ile

130 135 140

Gly Gly Lys Thr Ala Ile Asp Thr Pro Leu Gly Lys Asn Phe Ile Gly

145 150 155 160

Ala Phe Trp Gln Pro Lys Phe Val Leu Val Asp Ile Lys Trp Leu Glu

165 170 175

Thr Leu Ala Lys Arg Glu Phe Ile Asn Gly Met Ala Glu Val Ile Lys

180 185 190

Thr Ala Cys Ile Trp Asn Ala Asp Glu Phe Thr Arg Leu Glu Ser Asn

195 200 205

Ala Ser Leu Phe Leu Asn Val Val Asn Gly Ala Lys Asn Val Lys Val

210 215 220

Thr Asn Gln Leu Thr Asn Glu Ile Asp Glu Ile Ser Asn Thr Asp Ile

225 230 235 240

Glu Ala Met Leu Asp His Thr Tyr Lys Leu Val Leu Glu Ser Ile Lys

245 250 255

Val Lys Ala Glu Val Val Ser Ser Asp Glu Arg Glu Ser Ser Leu Arg

260 265 270

Asn Leu Leu Asn Phe Gly His Ser Ile Gly His Ala Tyr Glu Ala Ile

275 280 285

Leu Thr Pro Gln Ala Leu His Gly Glu Cys Val Ser Ile Gly Met Val

290 295 300

Lys Glu Ala Glu Leu Ser Arg Tyr Phe Gly Ile Leu Ser Pro Thr Gln

305 310 315 320

Val Ala Arg Leu Ser Lys Ile Leu Val Ala Tyr Gly Leu Pro Val Ser

325 330 335

Pro Asp Glu Lys Trp Phe Lys Glu Leu Thr Leu His Lys Lys Thr Pro

340 345 350

Leu Asp Ile Leu Leu Lys Lys Met Ser Ile Asp Lys Lys Asn Glu Gly

355 360 365

Ser Lys Lys Lys Val Val Ile Leu Glu Ser Ile Gly Lys Cys Tyr Gly

370 375 380

Asp Ser Ala Gln Phe Val Ser Asp Glu Asp Leu Arg Phe Ile Leu Thr

385 390 395 400

Asp Glu Thr Leu Val Tyr Pro Phe Lys Asp Ile Pro Ala Asp Gln Gln

405 410 415

Lys Val Val Ile Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Ser Asn Arg Ala Leu

420 425 430

Ile Leu Ala Ala Leu Gly Glu Gly Gln Cys Lys Ile Lys Asn Leu Leu

435 440 445

His Ser Asp Asp Thr Lys His Met Leu Thr Ala Val His Glu Leu Lys

450 455 460

Gly Ala Thr Ile Ser Trp Glu Asp Asn Gly Glu Thr Val Val Val Glu

465 470 475 480

Gly His Gly Gly Ser Thr Leu Ser Ala Cys Ala Asp Pro Leu Tyr Leu

485 490 495

Gly Asn Ala Gly Thr Ala Ser Arg Phe Leu Thr Ser Leu Ala Ala Leu

500 505 510

Val Asn Ser Thr Ser Ser Gln Lys Tyr Ile Val Leu Thr Gly Asn Ala

515 520 525

Arg Met Gln Gln Arg Pro Ile Ala Pro Leu Val Asp Ser Leu Arg Ala

530 535 540

Asn Gly Thr Lys Ile Glu Tyr Leu Asn Asn Glu Gly Ser Leu Pro Ile

545 550 555 560

Lys Val Tyr Thr Asp Ser Val Phe Lys Gly Gly Arg Ile Glu Leu Ala

565 570 575

Ala Thr Val Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ser Ile Leu Met Cys Ala Pro

580 585 590

Tyr Ala Glu Glu Pro Val Thr Leu Ala Leu Val Gly Gly Lys Pro Ile

595 600 605

Ser Lys Leu Tyr Val Asp Met Thr Ile Lys Met Met Glu Lys Phe Gly

610 615 620

Ile Asn Val Glu Thr Ser Thr Thr Glu Pro Tyr Thr Tyr Tyr Ile Pro

625 630 635 640

Lys Gly His Tyr Ile Asn Pro Ser Glu Tyr Val Ile Glu Ser Asp Ala

645 650 655

Ser Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Ala Phe Ala Ala Met Thr Gly Thr Thr

660 665 670

Val Thr Val Pro Asn Ile Gly Phe Glu Ser Leu Gln Gly Asp Ala Arg

675 680 685

Phe Ala Arg Asp Val Leu Lys Pro Met Gly Cys Lys Ile Thr Gln Thr

690 695 700

Ala Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Pro Pro Val Gly Thr Leu Lys Pro

705 710 715 720

Leu Lys His Val Asp Met Glu Pro Met Thr Asp Ala Phe Leu Thr Ala

725 730 735

Cys Val Val Ala Ala Ile Ser His Asp Ser Asp Pro Asn Ser Ala Asn

740 745 750

Thr Thr Thr Ile Glu Gly Ile Ala Asn Gln Arg Val Lys Glu Cys Asn

755 760 765

Arg Ile Leu Ala Met Ala Thr Glu Leu Ala Lys Phe Gly Val Lys Thr

770 775 780

Thr Glu Leu Pro Asp Gly Ile Gln Val His Gly Leu Asn Ser Ile Lys

785 790 795 800

Asp Leu Lys Val Pro Ser Asp Ser Ser Gly Pro Val Gly Val Cys Thr

805 810 815

Tyr Asp Asp His Arg Val Ala Met Ser Phe Ser Leu Leu Ala Gly Met

820 825 830

Val Asn Ser Gln Asn Glu Arg Asp Glu Val Ala Asn Pro Val Arg Ile

835 840 845

Leu Glu Arg His Cys Thr Gly Lys Thr Trp Pro Gly Trp Trp Asp Val

850 855 860

Leu His Ser Glu Leu Gly Ala Lys Leu Asp Gly Ala Glu Pro Leu Glu

865 870 875 880

Cys Thr Ser Lys Lys Asn Ser Lys Lys Ser Val Val Ile Ile Gly Met

885 890 895

Arg Ala Ala Gly Lys Thr Thr Ile Ser Lys Trp Cys Ala Ser Ala Leu

900 905 910

Gly Tyr Lys Leu Val Asp Leu Asp Glu Leu Phe Glu Gln Gln His Asn

915 920 925

Asn Gln Ser Val Lys Gln Phe Val Val Glu Asn Gly Trp Glu Lys Phe

930 935 940

Arg Glu Glu Glu Thr Arg Ile Phe Lys Glu Val Ile Gln Asn Tyr Gly

945 950 955 960

Asp Asp Gly Tyr Val Phe Ser Thr Gly Gly Gly Ile Val Glu Ser Ala

965 970 975

Glu Ser Arg Lys Ala Leu Lys Asp Phe Ala Ser Ser Gly Gly Tyr Val

980 985 990

Leu His Leu His Arg Asp Ile Glu Glu Thr Ile Val Phe Leu Gln Ser

995 1000 1005

Asp Pro Ser Arg Pro Ala Tyr Val Glu Glu Ile Arg Glu Val Trp Asn

1010 1015 1020

Arg Arg Glu Gly Trp Tyr Lys Glu Cys Ser Asn Phe Ser Phe Phe Ala

1025 1030 1035 1040

Pro His Cys Ser Ala Glu Ala Glu Phe Gln Ala Leu Arg Arg Ser Phe

1045 1050 1055

Ser Lys Tyr Ile Ala Thr Ile Thr Gly Val Arg Glu Ile Glu Ile Pro

1060 1065 1070

Ser Gly Arg Ser Ala Phe Val Cys Leu Thr Phe Asp Asp Leu Thr Glu

1075 1080 1085

Gln Thr Glu Asn Leu Thr Pro Ile Cys Tyr Gly Cys Glu Ala Val Glu

1090 1095 1100

Val Arg Val Asp His Leu Ala Asn Tyr Ser Ala Asp Phe Val Ser Lys

1105 1110 1115 1120

Gln Leu Ser Ile Leu Arg Lys Ala Thr Asp Ser Ile Pro Ile Ile Phe

1125 1130 1135

Thr Val Arg Thr Met Lys Gln Gly Gly Asn Phe Pro Asp Glu Glu Phe

1140 1145 1150

Lys Thr Leu Arg Glu Leu Tyr Asp Ile Ala Leu Lys Asn Gly Val Glu

1155 1160 1165

Phe Leu Asp Leu Glu Leu Thr Leu Pro Thr Asp Ile Gln Tyr Glu Val

1170 1175 1180

Ile Asn Lys Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gly Ser His His Asp Phe

1185 1190 1195 1200

Gln Gly Leu Tyr Ser Trp Asp Asp Ala Glu Trp Glu Asn Arg Phe Asn

1205 1210 1215

Gln Ala Leu Thr Leu Asp Val Asp Val Val Lys Phe Val Gly Thr Ala

1220 1225 1230

Val Asn Phe Glu Asp Asn Leu Arg Leu Glu His Phe Arg Asp Thr His

1235 1240 1245

Lys Asn Lys Pro Leu Ile Ala Val Asn Met Thr Ser Lys Gly Ser Ile

1250 1255 1260

Ser Arg Val Leu Asn Asn Val Leu Thr Pro Val Thr Ser Asp Leu Leu

1265 1270 1275 1280

Pro Asn Ser Ala Ala Pro Gly Gln Leu Thr Val Ala Gln Ile Asn Lys

1285 1290 1295

Met Tyr Thr Ser Met Gly Gly Ile Glu Pro Lys Glu Leu Phe Val Val

1300 1305 1310

Gly Lys Pro Ile Gly His Ser Arg Ser Pro Ile Leu His Asn Thr Gly

1315 1320 1325

Tyr Glu Ile Leu Gly Leu Pro His Lys Phe Asp Lys Phe Glu Thr Glu

1330 1335 1340

Ser Ala Gln Leu Val Lys Glu Lys Leu Leu Asp Gly Asn Lys Asn Phe

1345 1350 1355 1360

Gly Gly Ala Ala Val Thr Ile Pro Leu Lys Leu Asp Ile Met Gln Tyr

1365 1370 1375

Met Asp Glu Leu Thr Asp Ala Ala Lys Val Ile Gly Ala Val Asn Thr

1380 1385 1390

Val Ile Pro Leu Gly Asn Lys Lys Phe Lys Gly Asp Asn Thr Asp Trp

1395 1400 1405

Leu Gly Ile Arg Asn Ala Leu Ile Asn Asn Gly Val Pro Glu Tyr Val

1410 1415 1420

Gly His Thr Ala Gly Leu Val Ile Gly Ala Gly Gly Thr Ser Arg Ala

1425 1430 1435 1440

Ala Leu Tyr Ala Leu His Ser Leu Gly Cys Lys Lys Ile Phe Ile Ile

1445 1450 1455

Asn Arg Thr Thr Ser Lys Leu Lys Pro Leu Ile Glu Ser Leu Pro Ser

1460 1465 1470

Glu Phe Asn Ile Ile Gly Ile Glu Ser Thr Lys Ser Ile Glu Glu Ile

1475 1480 1485

Lys Glu His Val Gly Val Ala Val Ser Cys Val Pro Ala Asp Lys Pro

1490 1495 1500

Leu Asp Asp Glu Leu Leu Ser Lys Leu Glu Arg Phe Leu Val Lys Gly

1505 1510 1515 1520

Ala His Ala Ala Phe Val Pro Thr Leu Leu Glu Ala Ala Tyr Lys Pro

1525 1530 1535

Ser Val Thr Pro Val Met Thr Ile Ser Gln Asp Lys Tyr Gln Trp His

1540 1545 1550

Val Val Pro Gly Ser Gln Met Leu Val His Gln Gly Val Ala Gln Phe

1555 1560 1565

Glu Lys Trp Thr Gly Phe Lys Gly Pro Phe Lys Ala Ile Phe Asp Ala

1570 1575 1580

Val Thr Lys Glu

1585

<210> 83

<211> 1089

<212> ДНК

<213> Escherichia coli W3110

<400> 83

atggagagga ttgtcgttac tctcggggaa cgtagttacc caattaccat cgcatctggt 60

ttgtttaatg aaccagcttc attcttaccg ctgaaatcgg gcgagcaggt catgttggtc 120

accaacgaaa ccctggctcc tctgtatctc gataaggtcc gcggcgtact tgaacaggcg 180

ggtgttaacg tcgatagcgt tatcctccct gacggcgagc agtataaaag cctggctgta 240

ctcgataccg tctttacggc gttgttacaa aaaccgcatg gtcgcgatac tacgctggtg 300

gcgcttggcg gcggcgtagt gggcgatctg accggcttcg cggcggcgag ttatcagcgc 360

ggtgtccgtt tcattcaagt cccgacgacg ttactgtcgc aggtcgattc ctccgttggc 420

ggcaaaactg cggtcaacca tcccctcggt aaaaacatga ttggcgcgtt ctaccaacct 480

gcttcagtgg tggtggatct cgactgtctg aaaacgcttc ccccgcgtga gttagcgtcg 540

gggctggcag aagtcatcaa atacggcatt attcttgacg gtgcgttttt taactggctg 600

gaagagaatc tggatgcgtt gttgcgtctg gacggtccgg caatggcgta ctgtattcgc 660

cgttgttgtg aactgaaggc agaagttgtc gccgccgacg agcgcgaaac cgggttacgt 720

gctttactga atctgggaca cacctttggt catgccattg aagctgaaat ggggtatggc 780

aattggttac atggtgaagc ggtcgctgcg ggtatggtga tggcggcgcg gacgtcggaa 840

cgtctcgggc agtttagttc tgccgaaacg cagcgtatta taaccctgct caagcgggct 900

gggttaccgg tcaatgggcc gcgcgaaatg tccgcgcagg cgtatttacc gcatatgctg 960

cgtgacaaga aagtccttgc gggagagatg cgcttaattc ttccgttggc aattggtaag 1020

agtgaagttc gcagcggcgt ttcgcacgag cttgttctta acgccattgc cgattgtcaa 1080

tcagcgtaa 1089

<210> 84

<211> 362

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 84

Met Glu Arg Ile Val Val Thr Leu Gly Glu Arg Ser Tyr Pro Ile Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gly Leu Phe Asn Glu Pro Ala Ser Phe Leu Pro Leu Lys

20 25 30

Ser Gly Glu Gln Val Met Leu Val Thr Asn Glu Thr Leu Ala Pro Leu

35 40 45

Tyr Leu Asp Lys Val Arg Gly Val Leu Glu Gln Ala Gly Val Asn Val

50 55 60

Asp Ser Val Ile Leu Pro Asp Gly Glu Gln Tyr Lys Ser Leu Ala Val

65 70 75 80

Leu Asp Thr Val Phe Thr Ala Leu Leu Gln Lys Pro His Gly Arg Asp

85 90 95

Thr Thr Leu Val Ala Leu Gly Gly Gly Val Val Gly Asp Leu Thr Gly

100 105 110

Phe Ala Ala Ala Ser Tyr Gln Arg Gly Val Arg Phe Ile Gln Val Pro

115 120 125

Thr Thr Leu Leu Ser Gln Val Asp Ser Ser Val Gly Gly Lys Thr Ala

130 135 140

Val Asn His Pro Leu Gly Lys Asn Met Ile Gly Ala Phe Tyr Gln Pro

145 150 155 160

Ala Ser Val Val Val Asp Leu Asp Cys Leu Lys Thr Leu Pro Pro Arg

165 170 175

Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ala Glu Val Ile Lys Tyr Gly Ile Ile Leu

180 185 190

Asp Gly Ala Phe Phe Asn Trp Leu Glu Glu Asn Leu Asp Ala Leu Leu

195 200 205

Arg Leu Asp Gly Pro Ala Met Ala Tyr Cys Ile Arg Arg Cys Cys Glu

210 215 220

Leu Lys Ala Glu Val Val Ala Ala Asp Glu Arg Glu Thr Gly Leu Arg

225 230 235 240

Ala Leu Leu Asn Leu Gly His Thr Phe Gly His Ala Ile Glu Ala Glu

245 250 255

Met Gly Tyr Gly Asn Trp Leu His Gly Glu Ala Val Ala Ala Gly Met

260 265 270

Val Met Ala Ala Arg Thr Ser Glu Arg Leu Gly Gln Phe Ser Ser Ala

275 280 285

Glu Thr Gln Arg Ile Ile Thr Leu Leu Lys Arg Ala Gly Leu Pro Val

290 295 300

Asn Gly Pro Arg Glu Met Ser Ala Gln Ala Tyr Leu Pro His Met Leu

305 310 315 320

Arg Asp Lys Lys Val Leu Ala Gly Glu Met Arg Leu Ile Leu Pro Leu

325 330 335

Ala Ile Gly Lys Ser Glu Val Arg Ser Gly Val Ser His Glu Leu Val

340 345 350

Leu Asn Ala Ile Ala Asp Cys Gln Ser Ala

355 360

<210> 85

<211> 2247

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 85

atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60

gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120

ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180

cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240

tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300

gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360

attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420

attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480

catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540

ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600

aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660

ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720

cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780

ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840

cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900

atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960

agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020

actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080

ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140

cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200

tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260

tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320

gaaagagaag gctacgcaaa taatcggaca ctaattgtct ttaattttga attttgaatt 1380

ttgaattttg aattggagcg aagcgacttg acaaatgtga ttgtccaacc aacagctaga 1440

cctgttacac cattgggaat tttaaccaag cagttagaag ccatagtcca agaggttaag 1500

caacatccag atttacctgg ggaattgata gcaaacatcc atcaggcttg gcgtttagcc 1560

gcaggtatag acccttattt ggaagaatgc accactccag aatctcctga actcgctgca 1620

ttggcaaaaa ccacagccac cgaagcctgg ggagaacact tccacggagg tacaaccgtc 1680

cgtcctctag aacaagagat gctttctggt catatcgaag gacaaacctt aaagatgttt 1740

gttcacatga ccaaagctaa aaaagtctta gaaattggga tgtttaccgg ttattcggcg 1800

ctggcgatgg cggaagcatt accagaggat ggactgcttg tggcttgtga agttgaccct 1860

tacgcggcgg aaattggaca gaaagccttt caacaatctc cccacggtgg aaagattcgt 1920

gtggaattgg atgcagcctt agcaactctt gataagttag cagaagctgg ggagtctttt 1980

gacttggtat ttatcgacgc agataaaaaa gagtatgtag cctattttca caagttgcta 2040

ggtagcagtt tgttagcacc agatggcttt atttgtgtag ataacacctt attacaaggg 2100

gaagtttatc taccagcaga ggaacgtagc gtcaatggtg aagcgatcgc gcaatttaat 2160

catacagtag ctatagaccc ccgtgtagaa caggttttgt tgccgttgcg agatggttta 2220

acaattatcc gcagaataca accttaa 2247

<210> 86

<211> 820

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 86

Met Ser Ile Val Gln Ala Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly

20 25 30

Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu

85 90 95

Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys

165 170 175

Val Phe Leu Asp Phe Ser Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr

210 215 220

His Phe Gly Asn Ile Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His

225 230 235 240

Arg Leu Thr Tyr Lys Ala Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Val Asp Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ile Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Val Gly Leu Ser Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile

325 330 335

Leu Trp Arg Gly Thr Glu Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp

355 360 365

Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu

370 375 380

Cys Thr Ser Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val

385 390 395 400

Tyr Gln Lys Glu Leu Ile Gly Ser Val Lys Met Ser Ile Val Gln Ala

405 410 415

Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His Val Glu Gly Tyr Glu Lys

420 425 430

Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly Ile Phe Glu Ile Gln Asn

435 440 445

Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Cys Leu Ala Ile

450 455 460

Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly Asn Gln Ile Gln Ala Tyr

465 470 475 480

Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu Phe Pro Ile Thr Ile Thr

485 490 495

Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu Arg Val Ile Asp Val Phe

500 505 510

Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro Val Leu Val Val Gly Gly

515 520 525

Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Arg

530 535 540

Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr Leu Ile Gly Leu Ile Asp

545 550 555 560

Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn His Arg Lys Leu Lys Asn

565 570 575

Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys Val Phe Leu Asp Phe Ser

580 585 590

Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val Arg Asn Gly Met Ala Glu

595 600 605

Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln Glu Val Phe Glu Leu Leu

610 615 620

Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr His Phe Gly Asn Ile Asp

625 630 635 640

Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His Arg Leu Thr Tyr Lys Ala

645 650 655

Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro Asn Leu His Glu Leu Asp

660 665 670

Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr Trp Ser Pro Thr Leu Glu

675 680 685

Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly His Ala Val Asn Val Asp

690 695 700

Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Ile Thr Ile

705 710 715 720

Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met Ser Arg Val Gly Leu Ser

725 730 735

Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gly Thr Glu

740 745 750

Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu Arg Ala Ala Met Pro Lys

755 760 765

Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Leu

770 775 780

Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu Cys Thr Ser Tyr Pro Arg

785 790 795 800

Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val Tyr Gln Lys Glu Leu Ile

805 810 815

Gly Ser Val Lys

820

<210> 87

<211> 3638

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 87

atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60

gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120

ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180

cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240

tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300

gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360

attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420

attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480

catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540

ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600

aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660

ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720

cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780

ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840

cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900

atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960

agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020

actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080

ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140

cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200

tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260

tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320

gaaagagaag gctacgcaaa taatcggaca ctaattgtct ttaattttga attttgaatt 1380

ttgaattttg aattggagcg aagcgacttg acaaatgtga ttgtccaacc aacagctaga 1440

cctgttacac cattgggaat tttaaccaag cagttagaag ccatagtcca agaggttaag 1500

caacatccag atttacctgg ggaattgata gcaaacatcc atcaggcttg gcgtttagcc 1560

gcaggtatag acccttattt ggaagaatgc accactccag aatctcctga actcgctgca 1620

ttggcaaaaa ccacagccac cgaagcctgg ggagaacact tccacggagg tacaaccgtc 1680

cgtcctctag aacaagagat gctttctggt catatcgaag gacaaacctt aaagatgttt 1740

gttcacatga ccaaagctaa aaaagtctta gaaattggga tgtttaccgg ttattcggcg 1800

ctggcgatgg cggaagcatt accagaggat ggactgcttg tggcttgtga agttgaccct 1860

tacgcggcgg aaattggaca gaaagccttt caacaatctc cccacggtgg aaagattcgt 1920

gtggaattgg atgcagcctt agcaactctt gataagttag cagaagctgg ggagtctttt 1980

gacttggtat ttatcgacgc agataaaaaa gagtatgtag cctattttca caagttgcta 2040

ggtagcagtt tgttagcacc agatggcttt atttgtgtag ataacacctt attacaaggg 2100

gaagtttatc taccagcaga ggaacgtagc gtcaatggtg aagcgatcgc gcaatttaat 2160

catacagtag ctatagaccc ccgtgtagaa caggttttgt tgccgttgcg agatggttta 2220

acaattatcc gcagaataca accttaattg tccaatcgac tatggcacaa tcccttcccc 2280

tttcttccgc acctgctaca ccgtctcttc cttcccagac gaaaatagcc gcaattatcc 2340

aaaatatctg cactttggct ttgttattac tagcattgcc cattaatgcc accattgttt 2400

ttatatcctt gttagtcttc cgaccgcaaa aggtcaaagc agcaaacccc caaaccattc 2460

ttatcagtgg cggtaagatg accaaagctt tacaactagc aaggtcattc cacgcggctg 2520

gacatagagt tgtcttggtg gaaacccata aatactggtt gactggtcat cgtttttccc 2580

aagcagtgga taagttttac acagtccccg caccccagga caatccccaa gcttacattc 2640

aggctttggt agatatcgtc aaacaagaaa acatcgatgt ttatattccc gtcaccagtc 2700

cagtgggtag ctactacgac tcattagcca aaccagagtt atcccattat tgcgaagtgt 2760

ttcactttga cgcagatatt acccaaatgt tggatgataa atttgcgttg acacaaaaag 2820

cgcgatcgct tggtttatca gtacccaaat cctttaaaat tacctcacca gaacaagtca 2880

tcaacttcga tttttctgga gagacacgta aatacatcct caaaagcatt ccctacgact 2940

cagtgcggcg gttggactta accaaactcc cctgtgctac tccagaggaa acagcagcat 3000

tcgtcagaag tttgccaatt actcccgaaa aaccgtggat tatgcaggaa tttatccccg 3060

gtaaggaatt ctgcacccat agcaccgttc ggaatgggga actcagactg cattgctgtt 3120

gcgaatcttc agccttccaa gttaattatg agaatgtaaa taacccgcaa attaccgaat 3180

gggtacagca ttttgtcaag gaactgaaac tgacaggaca gatttccttt gactttatcc 3240

aagccgaaga cggaacagtt tacgccatcg agtgtaaccc ccgcacacat tcagcaatta 3300

ccacatttta cgaccacccc caggtagcag aagcgtactt gagtcaagca ccgacgactg 3360

aaaccataca accactaacg acaagcaagc ctacctattg gacttatcac gaagtttggc 3420

gtttaactgg tatccgttct ttcacccagt tgcaaagatg gctggggaat atttggcgcg 3480

ggactgatgc gatttatcag ccagatgacc ccttaccgtt tttgatggta catcattggc 3540

aaattcccct actgttattg aataatttgc gtcgtcttaa aggttggacg cggatagatt 3600

tcaatattgg gaagttggtg gaattggggg gagattag 3638

<210> 88

<211> 1099

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 88

Met Ser Ile Val Gln Ala Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly

20 25 30

Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu

85 90 95

Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys

165 170 175

Val Phe Leu Asp Phe Ser Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr

210 215 220

His Phe Gly Asn Ile Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His

225 230 235 240

Arg Leu Thr Tyr Lys Ala Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Val Asp Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ile Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Val Gly Leu Ser Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile

325 330 335

Leu Trp Arg Gly Thr Glu Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp

355 360 365

Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu

370 375 380

Cys Thr Ser Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val

385 390 395 400

Tyr Gln Lys Glu Leu Ile Gly Ser Val Lys Met Ser Ile Val Gln Ala

405 410 415

Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His Val Glu Gly Tyr Glu Lys

420 425 430

Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly Ile Phe Glu Ile Gln Asn

435 440 445

Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Cys Leu Ala Ile

450 455 460

Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly Asn Gln Ile Gln Ala Tyr

465 470 475 480

Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu Phe Pro Ile Thr Ile Thr

485 490 495

Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu Arg Val Ile Asp Val Phe

500 505 510

Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro Val Leu Val Val Gly Gly

515 520 525

Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Arg

530 535 540

Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr Leu Ile Gly Leu Ile Asp

545 550 555 560

Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn His Arg Lys Leu Lys Asn

565 570 575

Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys Val Phe Leu Asp Phe Ser

580 585 590

Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val Arg Asn Gly Met Ala Glu

595 600 605

Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln Glu Val Phe Glu Leu Leu

610 615 620

Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr His Phe Gly Asn Ile Asp

625 630 635 640

Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His Arg Leu Thr Tyr Lys Ala

645 650 655

Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro Asn Leu His Glu Leu Asp

660 665 670

Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr Trp Ser Pro Thr Leu Glu

675 680 685

Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly His Ala Val Asn Val Asp

690 695 700

Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Ile Thr Ile

705 710 715 720

Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met Ser Arg Val Gly Leu Ser

725 730 735

Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gly Thr Glu

740 745 750

Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu Arg Ala Ala Met Pro Lys

755 760 765

Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Leu

770 775 780

Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu Cys Thr Ser Tyr Pro Arg

785 790 795 800

Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val Tyr Gln Lys Glu Leu Ile

805 810 815

Gly Ser Val Lys Met Thr Asn Val Ile Val Gln Pro Thr Ala Arg Pro

820 825 830

Val Thr Pro Leu Gly Ile Leu Thr Lys Gln Leu Glu Ala Ile Val Gln

835 840 845

Glu Val Lys Gln His Pro Asp Leu Pro Gly Glu Leu Ile Ala Asn Ile

850 855 860

His Gln Ala Trp Arg Leu Ala Ala Gly Ile Asp Pro Tyr Leu Glu Glu

865 870 875 880

Cys Thr Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ala Ala Leu Ala Lys Thr Thr

885 890 895

Ala Thr Glu Ala Trp Gly Glu His Phe His Gly Gly Thr Thr Val Arg

900 905 910

Pro Leu Glu Gln Glu Met Leu Ser Gly His Ile Glu Gly Gln Thr Leu

915 920 925

Lys Met Phe Val His Met Thr Lys Ala Lys Lys Val Leu Glu Ile Gly

930 935 940

Met Phe Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Ala Met Ala Glu Ala Leu Pro Glu

945 950 955 960

Asp Gly Leu Leu Val Ala Cys Glu Val Asp Pro Tyr Ala Ala Glu Ile

965 970 975

Gly Gln Lys Ala Phe Gln Gln Ser Pro His Gly Gly Lys Ile Arg Val

980 985 990

Glu Leu Asp Ala Ala Leu Ala Thr Leu Asp Lys Leu Ala Glu Ala Gly

995 1000 1005

Glu Ser Phe Asp Leu Val Phe Ile Asp Ala Asp Lys Lys Glu Tyr Val

1010 1015 1020

Ala Tyr Phe His Lys Leu Leu Gly Ser Ser Leu Leu Ala Pro Asp Gly

1025 1030 1035 1040

Phe Ile Cys Val Asp Asn Thr Leu Leu Gln Gly Glu Val Tyr Leu Pro

1045 1050 1055

Ala Glu Glu Arg Ser Val Asn Gly Glu Ala Ile Ala Gln Phe Asn His

1060 1065 1070

Thr Val Ala Ile Asp Pro Arg Val Glu Gln Val Leu Leu Pro Leu Arg

1075 1080 1085

Asp Gly Leu Thr Ile Ile Arg Arg Ile Gln Pro

1090 1095

<210> 89

<211> 1233

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 89

atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60

gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120

ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180

cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240

tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300

gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360

attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420

attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480

catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540

ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600

aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660

ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720

cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780

ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840

cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900

atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960

agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020

actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080

ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140

cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200

tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taa 1233

<210> 90

<211> 410

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 90

Met Ser Ile Val Gln Ala Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly

20 25 30

Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu

85 90 95

Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys

165 170 175

Val Phe Leu Asp Phe Ser Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr

210 215 220

His Phe Gly Asn Ile Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His

225 230 235 240

Arg Leu Thr Tyr Lys Ala Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Val Asp Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ile Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Val Gly Leu Ser Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile

325 330 335

Leu Trp Arg Gly Thr Glu Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp

355 360 365

Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu

370 375 380

Cys Thr Ser Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val

385 390 395 400

Tyr Gln Lys Glu Leu Ile Gly Ser Val Lys

405 410

<210> 91

<211> 840

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 91

ttgacaaatg tgattgtcca accaacagct agacctgtta caccattggg aattttaacc 60

aagcagttag aagccatagt ccaagaggtt aagcaacatc cagatttacc tggggaattg 120

atagcaaaca tccatcaggc ttggcgttta gccgcaggta tagaccctta tttggaagaa 180

tgcaccactc cagaatctcc tgaactcgct gcattggcaa aaaccacagc caccgaagcc 240

tggggagaac acttccacgg aggtacaacc gtccgtcctc tagaacaaga gatgctttct 300

ggtcatatcg aaggacaaac cttaaagatg tttgttcaca tgaccaaagc taaaaaagtc 360

ttagaaattg ggatgtttac cggttattcg gcgctggcga tggcggaagc attaccagag 420

gatggactgc ttgtggcttg tgaagttgac ccttacgcgg cggaaattgg acagaaagcc 480

tttcaacaat ctccccacgg tggaaagatt cgtgtggaat tggatgcagc cttagcaact 540

cttgataagt tagcagaagc tggggagtct tttgacttgg tatttatcga cgcagataaa 600

aaagagtatg tagcctattt tcacaagttg ctaggtagca gtttgttagc accagatggc 660

tttatttgtg tagataacac cttattacaa ggggaagttt atctaccagc agaggaacgt 720

agcgtcaatg gtgaagcgat cgcgcaattt aatcatacag tagctataga cccccgtgta 780

gaacaggttt tgttgccgtt gcgagatggt ttaacaatta tccgcagaat acaaccttaa 840

840

<210> 92

<211> 410

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 92

Met Ser Ile Val Gln Ala Lys Phe Glu Ala Lys Glu Thr Ser Phe His

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly

20 25 30

Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu

65 70 75 80

Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu

85 90 95

Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys

165 170 175

Val Phe Leu Asp Phe Ser Leu Leu Arg Thr Leu Pro Thr Asp Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala His Gln

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Thr

210 215 220

His Phe Gly Asn Ile Asp Ala Thr Pro Glu Ile Lys Glu Ile Ala His

225 230 235 240

Arg Leu Thr Tyr Lys Ala Ile His Lys Met Leu Glu Leu Glu Val Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Arg Leu Pro Met Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Val Asp Met Ala Phe Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ile Ala Glu Arg Asp Arg Ile Leu Gly Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Val Gly Leu Ser Leu Asp His Pro Met Leu Asp Ile Asp Ile

325 330 335

Leu Trp Arg Gly Thr Glu Ser Ile Thr Leu Thr Arg Asp Gly Leu Leu

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp

355 360 365

Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu

370 375 380

Cys Thr Ser Tyr Pro Arg Gly Gly Glu Gly Val Asp Val Tyr Pro Val

385 390 395 400

Tyr Gln Lys Glu Leu Ile Gly Ser Val Lys

405 410

<210> 93

<211> 840

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 93

ttgacaaatg tgattgtcca accaacagct agacctgtta caccattggg aattttaacc 60

aagcagttag aagccatagt ccaagaggtt aagcaacatc cagatttacc tggggaattg 120

atagcaaaca tccatcaggc ttggcgttta gccgcaggta tagaccctta tttggaagaa 180

tgcaccactc cagaatctcc tgaactcgct gcattggcaa aaaccacagc caccgaagcc 240

tggggagaac acttccacgg aggtacaacc gtccgtcctc tagaacaaga gatgctttct 300

ggtcatatcg aaggacaaac cttaaagatg tttgttcaca tgaccaaagc taaaaaagtc 360

ttagaaattg ggatgtttac cggttattcg gcgctggcga tggcggaagc attaccagag 420

gatggactgc ttgtggcttg tgaagttgac ccttacgcgg cggaaattgg acagaaagcc 480

tttcaacaat ctccccacgg tggaaagatt cgtgtggaat tggatgcagc cttagcaact 540

cttgataagt tagcagaagc tggggagtct tttgacttgg tatttatcga cgcagataaa 600

aaagagtatg tagcctattt tcacaagttg ctaggtagca gtttgttagc accagatggc 660

tttatttgtg tagataacac cttattacaa ggggaagttt atctaccagc agaggaacgt 720

agcgtcaatg gtgaagcgat cgcgcaattt aatcatacag tagctataga cccccgtgta 780

gaacaggttt tgttgccgtt gcgagatggt ttaacaatta tccgcagaat acaaccttaa 840

840

<210> 94

<211> 279

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 94

Met Thr Asn Val Ile Val Gln Pro Thr Ala Arg Pro Val Thr Pro Leu

1 5 10 15

Gly Ile Leu Thr Lys Gln Leu Glu Ala Ile Val Gln Glu Val Lys Gln

20 25 30

His Pro Asp Leu Pro Gly Glu Leu Ile Ala Asn Ile His Gln Ala Trp

35 40 45

Arg Leu Ala Ala Gly Ile Asp Pro Tyr Leu Glu Glu Cys Thr Thr Pro

50 55 60

Glu Ser Pro Glu Leu Ala Ala Leu Ala Lys Thr Thr Ala Thr Glu Ala

65 70 75 80

Trp Gly Glu His Phe His Gly Gly Thr Thr Val Arg Pro Leu Glu Gln

85 90 95

Glu Met Leu Ser Gly His Ile Glu Gly Gln Thr Leu Lys Met Phe Val

100 105 110

His Met Thr Lys Ala Lys Lys Val Leu Glu Ile Gly Met Phe Thr Gly

115 120 125

Tyr Ser Ala Leu Ala Met Ala Glu Ala Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu

130 135 140

Val Ala Cys Glu Val Asp Pro Tyr Ala Ala Glu Ile Gly Gln Lys Ala

145 150 155 160

Phe Gln Gln Ser Pro His Gly Gly Lys Ile Arg Val Glu Leu Asp Ala

165 170 175

Ala Leu Ala Thr Leu Asp Lys Leu Ala Glu Ala Gly Glu Ser Phe Asp

180 185 190

Leu Val Phe Ile Asp Ala Asp Lys Lys Glu Tyr Val Ala Tyr Phe His

195 200 205

Lys Leu Leu Gly Ser Ser Leu Leu Ala Pro Asp Gly Phe Ile Cys Val

210 215 220

Asp Asn Thr Leu Leu Gln Gly Glu Val Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Arg

225 230 235 240

Ser Val Asn Gly Glu Ala Ile Ala Gln Phe Asn His Thr Val Ala Ile

245 250 255

Asp Pro Arg Val Glu Gln Val Leu Leu Pro Leu Arg Asp Gly Leu Thr

260 265 270

Ile Ile Arg Arg Ile Gln Pro

275

<210> 95

<211> 2667

<212> ДНК

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 95

atgcagacta tagattttaa tattcgtaag ttacttgtag agtggaacgc gacccacaga 60

gattatgatc tttcccagag tttacatgaa ctaattgtag ctcaagtaga acgaacacct 120

gaggcgatcg ctgtcacctt tgacaagcaa caactaactt atcaagaact aaatcataaa 180

gcaaaccagc taggacatta tttacaaaca ttaggagtcc agccagaaac cctggtaggc 240

gtttgtttag aacgttcctt agaaatggtt atctgtcttt taggaatcct caaagctggg 300

ggtgcttatg ttcctattga ccctgaatat cctcaagaac gcatagctta tatgctagaa 360

gattctcagg tgaaggtact actaactcaa gaaaaattac tcaatcaaat tccccaccat 420

caagcacaaa ctatctgtgt agatagggaa tgggagaaaa tttccacaca agctaatacc 480

aatcccaaaa gtaatataaa aacggataat cttgcttatg taatttacac ctctggttcc 540

actggtaaac caaaaggtgc aatgaacacc cacaaaggta tctgtaatcg cttattgtgg 600

atgcaggaag cttatcaaat cgattccaca gatagcattt tacaaaaaac cccctttagt 660

tttgatgttt ccgtttggga gttcttttgg actttattaa ctggcgcacg tttggtaata 720

gccaaaccag gcggacataa agatagtgct tacctcatcg atttaattac tcaagaacaa 780

atcactacgt tgcattttgt cccctcaatg ctgcaagtgt ttttacaaaa tcgccatgta 840

agcaaatgca gctctctaaa aagagttatt tgtagcggtg aagctttatc tatagattta 900

caaaatagat ttttccagca tttgcaatgt gaattacata acctctatgg cccgacagaa 960

gcagcaattg atgtcacatt ttggcaatgt agaaaagata gtaatttaaa gagtgtacct 1020

attggtcgtc ccattgctaa tactcaaatt tatattcttg atgccgattt acaaccagta 1080

aatattggtg tcactggtga aatttatatt ggtggtgtag gggttgctcg tggttatttg 1140

aataaagaag aattgaccaa agaaaaattt attattaatc cctttcccaa ttctgagttt 1200

aagcgacttt ataaaacagg tgatttagct cgttatttac ccgatggaaa tattgaatat 1260

cttggtagaa cagattatca agtaaaaatt cggggttata gaattgaaat tggcgagatt 1320

gaaaatgttt tatcttcaca cccacaagtc agagaagctg tagtcatagc gcgggatgat 1380

aacgctcaag aaaaacaaat catcgcttat attacctata actccatcaa acctcagctt 1440

gataatctgc gtgatttcct aaaagcaagg ctacctgatt ttatgattcc agccgctttt 1500

gtgatgctgg agcatcttcc tttaactccc agtggtaaag tagaccgtaa ggcattacct 1560

aagcctgatt tatttaatta tagtgaacat aattcctatg tagcgcctcg gaatgaagtt 1620

gaagaaaaat tagtacaaat ctggtcgaat attctgcatt tacctaaagt aggtgtgaca 1680

gaaaactttt tcgctattgg tggtaattcc ctcaaagctc tacatttaat ttctcaaatt 1740

gaagagttat ttgctaaaga gatatcctta gcaacacttt taacaaatcc agtaattgca 1800

gatttagcca aggttattca agcaaacaac caaatccata attcacccct agttccaatt 1860

caaccacaag gtaagcagca gcctttcttt tgtatacatc ctgctggtgg tcatgtttta 1920

tgctatttta aactcgcaca atatatagga actgaccaac cattttatgg cttacaagct 1980

caaggatttt atggagatga agcacccttg acgcgagttg aagatatggc tagtctctac 2040

gtcaaaacta ttagagaatt tcaaccccaa gggccttatc gtgtcggggg gtggtcattt 2100

ggtggagtcg tagcttatga agtagcacag cagttacata gacaaggaca agaagtatct 2160

ttactagcaa tattagattc ttacgtaccg attctgctgg ataaacaaaa acccattgat 2220

gacgtttatt tagttggtgt tctctccaga gtttttggcg gtatgtttgg tcaagataat 2280

ctagtcacac ctgaagaaat agaaaattta actgtagaag aaaaaattaa ttacatcatt 2340

gataaagcac ggagcgctag aatattcccg cctggtgtag aacgtcaaaa taatcgccgt 2400

attcttgatg ttttggtggg aactttaaaa gcaacttatt cctatataag acaaccatat 2460

ccaggaaaag tcactgtatt tcgagccagg gaaaaacata ttatggctcc tgacccgacc 2520

ttagtttggg tagaattatt ttctgtaatg gcggctcaag aaattaagat tattgatgtc 2580

cctggaaacc attattcgtt tgttctagaa ccccatgtac aggttttagc acagcgttta 2640

caagattgtc tggaaaataa ttcataa 2667

<210> 96

<211> 888

<212> PRT

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 96

Met Gln Thr Ile Asp Phe Asn Ile Arg Lys Leu Leu Val Glu Trp Asn

1 5 10 15

Ala Thr His Arg Asp Tyr Asp Leu Ser Gln Ser Leu His Glu Leu Ile

20 25 30

Val Ala Gln Val Glu Arg Thr Pro Glu Ala Ile Ala Val Thr Phe Asp

35 40 45

Lys Gln Gln Leu Thr Tyr Gln Glu Leu Asn His Lys Ala Asn Gln Leu

50 55 60

Gly His Tyr Leu Gln Thr Leu Gly Val Gln Pro Glu Thr Leu Val Gly

65 70 75 80

Val Cys Leu Glu Arg Ser Leu Glu Met Val Ile Cys Leu Leu Gly Ile

85 90 95

Leu Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu Tyr Pro Gln

100 105 110

Glu Arg Ile Ala Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gln Val Lys Val Leu Leu

115 120 125

Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Gln Ile Pro His His Gln Ala Gln Thr

130 135 140

Ile Cys Val Asp Arg Glu Trp Glu Lys Ile Ser Thr Gln Ala Asn Thr

145 150 155 160

Asn Pro Lys Ser Asn Ile Lys Thr Asp Asn Leu Ala Tyr Val Ile Tyr

165 170 175

Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys Gly Ala Met Asn Thr His Lys

180 185 190

Gly Ile Cys Asn Arg Leu Leu Trp Met Gln Glu Ala Tyr Gln Ile Asp

195 200 205

Ser Thr Asp Ser Ile Leu Gln Lys Thr Pro Phe Ser Phe Asp Val Ser

210 215 220

Val Trp Glu Phe Phe Trp Thr Leu Leu Thr Gly Ala Arg Leu Val Ile

225 230 235 240

Ala Lys Pro Gly Gly His Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Ile Asp Leu Ile

245 250 255

Thr Gln Glu Gln Ile Thr Thr Leu His Phe Val Pro Ser Met Leu Gln

260 265 270

Val Phe Leu Gln Asn Arg His Val Ser Lys Cys Ser Ser Leu Lys Arg

275 280 285

Val Ile Cys Ser Gly Glu Ala Leu Ser Ile Asp Leu Gln Asn Arg Phe

290 295 300

Phe Gln His Leu Gln Cys Glu Leu His Asn Leu Tyr Gly Pro Thr Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ile Asp Val Thr Phe Trp Gln Cys Arg Lys Asp Ser Asn Leu

325 330 335

Lys Ser Val Pro Ile Gly Arg Pro Ile Ala Asn Thr Gln Ile Tyr Ile

340 345 350

Leu Asp Ala Asp Leu Gln Pro Val Asn Ile Gly Val Thr Gly Glu Ile

355 360 365

Tyr Ile Gly Gly Val Gly Val Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Lys Glu Glu

370 375 380

Leu Thr Lys Glu Lys Phe Ile Ile Asn Pro Phe Pro Asn Ser Glu Phe

385 390 395 400

Lys Arg Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Pro Asp Gly

405 410 415

Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Tyr Gln Val Lys Ile Arg Gly

420 425 430

Tyr Arg Ile Glu Ile Gly Glu Ile Glu Asn Val Leu Ser Ser His Pro

435 440 445

Gln Val Arg Glu Ala Val Val Ile Ala Arg Asp Asp Asn Ala Gln Glu

450 455 460

Lys Gln Ile Ile Ala Tyr Ile Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Pro Gln Leu

465 470 475 480

Asp Asn Leu Arg Asp Phe Leu Lys Ala Arg Leu Pro Asp Phe Met Ile

485 490 495

Pro Ala Ala Phe Val Met Leu Glu His Leu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

500 505 510

Lys Val Asp Arg Lys Ala Leu Pro Lys Pro Asp Leu Phe Asn Tyr Ser

515 520 525

Glu His Asn Ser Tyr Val Ala Pro Arg Asn Glu Val Glu Glu Lys Leu

530 535 540

Val Gln Ile Trp Ser Asn Ile Leu His Leu Pro Lys Val Gly Val Thr

545 550 555 560

Glu Asn Phe Phe Ala Ile Gly Gly Asn Ser Leu Lys Ala Leu His Leu

565 570 575

Ile Ser Gln Ile Glu Glu Leu Phe Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ala Thr

580 585 590

Leu Leu Thr Asn Pro Val Ile Ala Asp Leu Ala Lys Val Ile Gln Ala

595 600 605

Asn Asn Gln Ile His Asn Ser Pro Leu Val Pro Ile Gln Pro Gln Gly

610 615 620

Lys Gln Gln Pro Phe Phe Cys Ile His Pro Ala Gly Gly His Val Leu

625 630 635 640

Cys Tyr Phe Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gly Thr Asp Gln Pro Phe Tyr

645 650 655

Gly Leu Gln Ala Gln Gly Phe Tyr Gly Asp Glu Ala Pro Leu Thr Arg

660 665 670

Val Glu Asp Met Ala Ser Leu Tyr Val Lys Thr Ile Arg Glu Phe Gln

675 680 685

Pro Gln Gly Pro Tyr Arg Val Gly Gly Trp Ser Phe Gly Gly Val Val

690 695 700

Ala Tyr Glu Val Ala Gln Gln Leu His Arg Gln Gly Gln Glu Val Ser

705 710 715 720

Leu Leu Ala Ile Leu Asp Ser Tyr Val Pro Ile Leu Leu Asp Lys Gln

725 730 735

Lys Pro Ile Asp Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Leu Ser Arg Val Phe

740 745 750

Gly Gly Met Phe Gly Gln Asp Asn Leu Val Thr Pro Glu Glu Ile Glu

755 760 765

Asn Leu Thr Val Glu Glu Lys Ile Asn Tyr Ile Ile Asp Lys Ala Arg

770 775 780

Ser Ala Arg Ile Phe Pro Pro Gly Val Glu Arg Gln Asn Asn Arg Arg

785 790 795 800

Ile Leu Asp Val Leu Val Gly Thr Leu Lys Ala Thr Tyr Ser Tyr Ile

805 810 815

Arg Gln Pro Tyr Pro Gly Lys Val Thr Val Phe Arg Ala Arg Glu Lys

820 825 830

His Ile Met Ala Pro Asp Pro Thr Leu Val Trp Val Glu Leu Phe Ser

835 840 845

Val Met Ala Ala Gln Glu Ile Lys Ile Ile Asp Val Pro Gly Asn His

850 855 860

Tyr Ser Phe Val Leu Glu Pro His Val Gln Val Leu Ala Gln Arg Leu

865 870 875 880

Gln Asp Cys Leu Glu Asn Asn Ser

885

<210> 97

<211> 1233

<212> ДНК

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 97

atgagtaatg ttcaagcatc gtttgaagca acggaagctg aattccgcgt ggaaggttac 60

gaaaaaattg agtttagtct tgtctatgta aatggtgcat ttgatatcag taacagagaa 120

attgcagaca gctatgagaa gtttggccgt tgtctgactg tgattgatgc taatgtcaac 180

agattatatg gcaagcaaat caagtcatat tttagacact atggtattga tctgaccgta 240

gttcccattg tgattactga gcctactaaa acccttgcaa cctttgagaa aattgttgat 300

gctttttctg actttggttt aatccgcaag gaaccagtat tagtagtggg tggtggttta 360

accactgatg tagctgggtt tgcgtgtgct gcttaccgtc gtaagagtaa ctatattcgg 420

gttccgacaa cgctgattgg tctgattgat gcaggtgtag cgattaaggt tgcagtcaac 480

catcgcaagt taaaaaatcg cttgggtgca tatcatgctc ctttgaaagt catcctcgat 540

ttctccttct tgcaaacatt accaacggct caagttcgta atgggatggc agagttggtc 600

aaaattgctg ttgtggcgaa ctctgaagtc tttgaattgt tgtatgaata tggcgaagag 660

ttgctttcca ctcactttgg atatgtgaat ggtacaaagg aactgaaagc gatcgcacat 720

aaactcaatt acgaggcaat aaaaactatg ctggagttgg aaactccaaa cttgcatgag 780

ttagacctcg atcgcgtcat tgcctacggt cacacttgga gtccgacctt agaattagct 840

ccgatgatac cgttgtttca cggtcatgcc gtcaatatag acatggcttt gtctgcaact 900

attgcggcaa gacgtggcta cattacatca ggagaacgcg atcgcatttt gagcttgatg 960

agtcgtatag gtttatcaat cgatcatcct ctactagatg gcgatttgct ctggtatgct 1020

acccaatcta ttagcttgac gcgagacggg aaacaacgcg cagctatgcc taaacccatt 1080

ggtgagtgct tctttgtcaa cgatttcacc cgtgaagaac tagatgcagc tttagctgaa 1140

cacaaacgtc tgtgtgctac ataccctcgt ggtggagatg gcattgacgc ttacatagaa 1200

actcaagaag aatccaaact attgggagtg tga 1233

<210> 98

<211> 410

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 98

Met Ser Asn Val Gln Ala Ser Phe Glu Ala Thr Glu Ala Glu Phe Arg

1 5 10 15

Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Phe Ser Leu Val Tyr Val Asn Gly

20 25 30

Ala Phe Asp Ile Ser Asn Arg Glu Ile Ala Asp Ser Tyr Glu Lys Phe

35 40 45

Gly Arg Cys Leu Thr Val Ile Asp Ala Asn Val Asn Arg Leu Tyr Gly

50 55 60

Lys Gln Ile Lys Ser Tyr Phe Arg His Tyr Gly Ile Asp Leu Thr Val

65 70 75 80

Val Pro Ile Val Ile Thr Glu Pro Thr Lys Thr Leu Ala Thr Phe Glu

85 90 95

Lys Ile Val Asp Ala Phe Ser Asp Phe Gly Leu Ile Arg Lys Glu Pro

100 105 110

Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Thr Thr Asp Val Ala Gly Phe Ala

115 120 125

Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Lys Ser Asn Tyr Ile Arg Val Pro Thr Thr

130 135 140

Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Gly Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn

145 150 155 160

His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Pro Leu Lys

165 170 175

Val Ile Leu Asp Phe Ser Phe Leu Gln Thr Leu Pro Thr Ala Gln Val

180 185 190

Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala Asn Ser

195 200 205

Glu Val Phe Glu Leu Leu Tyr Glu Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Ser Thr

210 215 220

His Phe Gly Tyr Val Asn Gly Thr Lys Glu Leu Lys Ala Ile Ala His

225 230 235 240

Lys Leu Asn Tyr Glu Ala Ile Lys Thr Met Leu Glu Leu Glu Thr Pro

245 250 255

Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr

260 265 270

Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Met Ile Pro Leu Phe His Gly

275 280 285

His Ala Val Asn Ile Asp Met Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg

290 295 300

Arg Gly Tyr Ile Thr Ser Gly Glu Arg Asp Arg Ile Leu Ser Leu Met

305 310 315 320

Ser Arg Ile Gly Leu Ser Ile Asp His Pro Leu Leu Asp Gly Asp Leu

325 330 335

Leu Trp Tyr Ala Thr Gln Ser Ile Ser Leu Thr Arg Asp Gly Lys Gln

340 345 350

Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Glu Cys Phe Phe Val Asn Asp

355 360 365

Phe Thr Arg Glu Glu Leu Asp Ala Ala Leu Ala Glu His Lys Arg Leu

370 375 380

Cys Ala Thr Tyr Pro Arg Gly Gly Asp Gly Ile Asp Ala Tyr Ile Glu

385 390 395 400

Thr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Leu Gly Val

405 410

<210> 99

<211> 834

<212> ДНК

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 99

atgaccagta ttttaggacg agataccgca agaccaataa cgccacatag cattctggta 60

gcacagctac aaaaaaccct cagaatggca gaggaaagta atattccttc agagatactg 120

acttctctgc gccaagggtt gcaattagca gcaggtttag atccctatct ggatgattgc 180

actacccctg aatcgaccgc attgacagca ctagcgcaga agacaagcat tgaagactgg 240

agtaaacgct tcagtgatgg tgaaacagtg cgtcaattag agcaagaaat gctctcagga 300

catcttgaag gacaaacact aaagatgttt gtgcatatca ctaaggctaa aagcatccta 360

gaagtgggaa tgttcacagg atattcagct ttggcaatgg cagaggcgtt accagatgat 420

gggcgactga ttgcttgtga agtagactcc tatgtggccg agtttgctca aacttgcttt 480

caagagtctc cccacggccg caagattgtt gtagaagtgg cacctgcact agagacgctg 540

cacaagctgg tggctaaaaa agaatccttt gatctgatct tcattgatgc ggataaaaag 600

gagtatatag aatacttcca aattatcttg gatagccatt tactagctcc cgacggatta 660

atctgtgtag ataatacttt gttgcaagga caagtttacc tgccatcaga acagcgtaca 720

gccaatggtg aagcgatcgc tcaattcaac cgcattgtcg ccgcagatcc tcgtgtagag 780

caagttctgt tacccatacg agatggtata accctgatta gacgcttggt ataa 834

<210> 100

<211> 277

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 100

Met Thr Ser Ile Leu Gly Arg Asp Thr Ala Arg Pro Ile Thr Pro His

1 5 10 15

Ser Ile Leu Val Ala Gln Leu Gln Lys Thr Leu Arg Met Ala Glu Glu

20 25 30

Ser Asn Ile Pro Ser Glu Ile Leu Thr Ser Leu Arg Gln Gly Leu Gln

35 40 45

Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Tyr Leu Asp Asp Cys Thr Thr Pro Glu

50 55 60

Ser Thr Ala Leu Thr Ala Leu Ala Gln Lys Thr Ser Ile Glu Asp Trp

65 70 75 80

Ser Lys Arg Phe Ser Asp Gly Glu Thr Val Arg Gln Leu Glu Gln Glu

85 90 95

Met Leu Ser Gly His Leu Glu Gly Gln Thr Leu Lys Met Phe Val His

100 105 110

Ile Thr Lys Ala Lys Ser Ile Leu Glu Val Gly Met Phe Thr Gly Tyr

115 120 125

Ser Ala Leu Ala Met Ala Glu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Arg Leu Ile

130 135 140

Ala Cys Glu Val Asp Ser Tyr Val Ala Glu Phe Ala Gln Thr Cys Phe

145 150 155 160

Gln Glu Ser Pro His Gly Arg Lys Ile Val Val Glu Val Ala Pro Ala

165 170 175

Leu Glu Thr Leu His Lys Leu Val Ala Lys Lys Glu Ser Phe Asp Leu

180 185 190

Ile Phe Ile Asp Ala Asp Lys Lys Glu Tyr Ile Glu Tyr Phe Gln Ile

195 200 205

Ile Leu Asp Ser His Leu Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Cys Val Asp

210 215 220

Asn Thr Leu Leu Gln Gly Gln Val Tyr Leu Pro Ser Glu Gln Arg Thr

225 230 235 240

Ala Asn Gly Glu Ala Ile Ala Gln Phe Asn Arg Ile Val Ala Ala Asp

245 250 255

Pro Arg Val Glu Gln Val Leu Leu Pro Ile Arg Asp Gly Ile Thr Leu

260 265 270

Ile Arg Arg Leu Val

275

<210> 101

<211> 1386

<212> ДНК

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 101

atggcacaat caatctcttt atctcttcct caatccacaa cgccatcaaa gggtgtgagg 60

ctaaaaatag cagctctact gaagactatc gggactctaa tactactgct gatagccttg 120

ccgcttaatg ctttgatagt attgatatct ctgatgtgta ggccgtttac aaaaaaacct 180

gccgtagcca ctcatcccca gaatatcttg gtcagtggcg gcaaaatgac caaagcattg 240

caacttgccc gctccttcca tgcagccgga cacagagtta ttctgattga aggtcataaa 300

tactggttat cagggcatag attctcaaat tctgtgagtc gtttttatac agttcctgca 360

ccacaagacg acccagaagg ctatacccaa gcgctattgg aaattgtcaa acgagagaag 420

attgacgttt atgtacccgt atgcagccct gtagctagtt attacgactc tttggcaaag 480

tctgcactat cagaatattg tgaggttttt cactttgatg ctgatataac caagatgctg 540

gatgataaat ttgcctttac cgatcgggcg cgatcgcttg gtttatcagc cccgaaatct 600

tttaaaatta ccgatcctga acaagttatc aacttcgatt ttagtaaaga gacgcgcaaa 660

tatattctta agagtatttc ttacgactca gttcgccgct taaatttaac caaacttcct 720

tgtgataccc cagaagagac agcagcgttt gtcaagagtt tacccatcag cccagaaaaa 780

ccttggatta tgcaagaatt tattcctggg aaagaattat gcacccatag cacagtccga 840

gacggcgaat taaggttgca ttgctgttca aattcttcag cgtttcagat taactatgaa 900

aatgtcgaaa atccccaaat tcaagaatgg gtacaacatt tcgtcaaaag tttacggctg 960

actggacaaa tatctcttga ctttatccaa gctgaagatg gtacagctta tgccattgaa 1020

tgtaatcctc gcacccattc ggcgatcaca atgttctaca atcacccagg tgttgcagaa 1080

gcctatcttg gtaaaactcc tctagctgca cctttggaac ctcttgcaga tagcaagccc 1140

acttactgga tatatcacga aatctggcga ttgactggga ttcgctctgg acaacaatta 1200

caaacttggt ttgggagatt agtcagaggt acagatgcca tttatcgcct ggacgatccg 1260

ataccatttt taactttgca ccattggcag attactttac ttttgctaca aaatttgcaa 1320

cgactcaaag gttgggtaaa gatcgatttt aatatcggta aactcgtgga attagggggc 1380

gactaa 1386

<210> 102

<211> 461

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 102

Met Ala Gln Ser Ile Ser Leu Ser Leu Pro Gln Ser Thr Thr Pro Ser

1 5 10 15

Lys Gly Val Arg Leu Lys Ile Ala Ala Leu Leu Lys Thr Ile Gly Thr

20 25 30

Leu Ile Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Leu Asn Ala Leu Ile Val Leu

35 40 45

Ile Ser Leu Met Cys Arg Pro Phe Thr Lys Lys Pro Ala Val Ala Thr

50 55 60

His Pro Gln Asn Ile Leu Val Ser Gly Gly Lys Met Thr Lys Ala Leu

65 70 75 80

Gln Leu Ala Arg Ser Phe His Ala Ala Gly His Arg Val Ile Leu Ile

85 90 95

Glu Gly His Lys Tyr Trp Leu Ser Gly His Arg Phe Ser Asn Ser Val

100 105 110

Ser Arg Phe Tyr Thr Val Pro Ala Pro Gln Asp Asp Pro Glu Gly Tyr

115 120 125

Thr Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Lys Arg Glu Lys Ile Asp Val Tyr

130 135 140

Val Pro Val Cys Ser Pro Val Ala Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Lys

145 150 155 160

Ser Ala Leu Ser Glu Tyr Cys Glu Val Phe His Phe Asp Ala Asp Ile

165 170 175

Thr Lys Met Leu Asp Asp Lys Phe Ala Phe Thr Asp Arg Ala Arg Ser

180 185 190

Leu Gly Leu Ser Ala Pro Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Pro Glu Gln

195 200 205

Val Ile Asn Phe Asp Phe Ser Lys Glu Thr Arg Lys Tyr Ile Leu Lys

210 215 220

Ser Ile Ser Tyr Asp Ser Val Arg Arg Leu Asn Leu Thr Lys Leu Pro

225 230 235 240

Cys Asp Thr Pro Glu Glu Thr Ala Ala Phe Val Lys Ser Leu Pro Ile

245 250 255

Ser Pro Glu Lys Pro Trp Ile Met Gln Glu Phe Ile Pro Gly Lys Glu

260 265 270

Leu Cys Thr His Ser Thr Val Arg Asp Gly Glu Leu Arg Leu His Cys

275 280 285

Cys Ser Asn Ser Ser Ala Phe Gln Ile Asn Tyr Glu Asn Val Glu Asn

290 295 300

Pro Gln Ile Gln Glu Trp Val Gln His Phe Val Lys Ser Leu Arg Leu

305 310 315 320

Thr Gly Gln Ile Ser Leu Asp Phe Ile Gln Ala Glu Asp Gly Thr Ala

325 330 335

Tyr Ala Ile Glu Cys Asn Pro Arg Thr His Ser Ala Ile Thr Met Phe

340 345 350

Tyr Asn His Pro Gly Val Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Pro Leu

355 360 365

Ala Ala Pro Leu Glu Pro Leu Ala Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Trp Ile

370 375 380

Tyr His Glu Ile Trp Arg Leu Thr Gly Ile Arg Ser Gly Gln Gln Leu

385 390 395 400

Gln Thr Trp Phe Gly Arg Leu Val Arg Gly Thr Asp Ala Ile Tyr Arg

405 410 415

Leu Asp Asp Pro Ile Pro Phe Leu Thr Leu His His Trp Gln Ile Thr

420 425 430

Leu Leu Leu Leu Gln Asn Leu Gln Arg Leu Lys Gly Trp Val Lys Ile

435 440 445

Asp Phe Asn Ile Gly Lys Leu Val Glu Leu Gly Gly Asp

450 455 460

<210> 103

<211> 1047

<212> ДНК

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 103

atgccagtac ttaatatcct tcatttagtt gggtctgcac acgataagtt ttactgtgat 60

ttatcacgtc tttatgccca agactgttta gctgcaacag cagatccatc gctttataac 120

tttcaaattg catatatcac acccgatcgg cagtggcgat ttcctgactc tctcagtcga 180

gaagatattg ctcttaccaa accgattcct gtgtttgatg ccatacaatt tctaacaggc 240

caaaacattg acatgatgtt accacaaatg ttttgtattc ctggaatgac tcagtaccgt 300

gccctattcg atctgctcaa gatcccttat ataggaaata ccccagatat tatggcgatc 360

gcggcccaca aagccagagc caaagcaatt gtcgaagcag caggggtaaa agtgcctcgt 420

ggagaattgc ttcgccaagg agatattcca acaattacac ctccagcagt cgtcaaacct 480

gtaagttctg acaactcttt aggagtagtc ttagttaaag atgtgactga atatgatgct 540

gccttaaaga aagcatttga atatgcttcg gaggtcatcg tagaagcatt catcgaactt 600

ggtcgagaag tcagatgcgg catcattgta aaagacggtg agctaatagg tttacccctt 660

gaagagtatc tggtagaccc acacgataaa cctatccgta actatgctga taaactccaa 720

caaactgacg atggcgactt gcatttgact gctaaagata atatcaaggc ttggatttta 780

gaccctaacg acccaatcac ccaaaaggtt cagcaagtgg ctaaaaggtg tcatcaggct 840

ttgggttgtc gccactacag tttatttgac ttccgaatcg atccaaaggg acaaccttgg 900

ttcttagaag ctggattata ttgttctttt gcccccaaaa gtgtgatttc ttctatggcg 960

aaagcagccg gaatccctct aaatgattta ttaataaccg ctattaatga aacattgggt 1020

agtaataaaa aggtgttaca aaattga 1047

<210> 104

<211> 348

<212> PRT

<213> Nostoc punctiforme ATCC29133

<400> 104

Met Pro Val Leu Asn Ile Leu His Leu Val Gly Ser Ala His Asp Lys

1 5 10 15

Phe Tyr Cys Asp Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gln Asp Cys Leu Ala Ala

20 25 30

Thr Ala Asp Pro Ser Leu Tyr Asn Phe Gln Ile Ala Tyr Ile Thr Pro

35 40 45

Asp Arg Gln Trp Arg Phe Pro Asp Ser Leu Ser Arg Glu Asp Ile Ala

50 55 60

Leu Thr Lys Pro Ile Pro Val Phe Asp Ala Ile Gln Phe Leu Thr Gly

65 70 75 80

Gln Asn Ile Asp Met Met Leu Pro Gln Met Phe Cys Ile Pro Gly Met

85 90 95

Thr Gln Tyr Arg Ala Leu Phe Asp Leu Leu Lys Ile Pro Tyr Ile Gly

100 105 110

Asn Thr Pro Asp Ile Met Ala Ile Ala Ala His Lys Ala Arg Ala Lys

115 120 125

Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Val Lys Val Pro Arg Gly Glu Leu Leu

130 135 140

Arg Gln Gly Asp Ile Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala Val Val Lys Pro

145 150 155 160

Val Ser Ser Asp Asn Ser Leu Gly Val Val Leu Val Lys Asp Val Thr

165 170 175

Glu Tyr Asp Ala Ala Leu Lys Lys Ala Phe Glu Tyr Ala Ser Glu Val

180 185 190

Ile Val Glu Ala Phe Ile Glu Leu Gly Arg Glu Val Arg Cys Gly Ile

195 200 205

Ile Val Lys Asp Gly Glu Leu Ile Gly Leu Pro Leu Glu Glu Tyr Leu

210 215 220

Val Asp Pro His Asp Lys Pro Ile Arg Asn Tyr Ala Asp Lys Leu Gln

225 230 235 240

Gln Thr Asp Asp Gly Asp Leu His Leu Thr Ala Lys Asp Asn Ile Lys

245 250 255

Ala Trp Ile Leu Asp Pro Asn Asp Pro Ile Thr Gln Lys Val Gln Gln

260 265 270

Val Ala Lys Arg Cys His Gln Ala Leu Gly Cys Arg His Tyr Ser Leu

275 280 285

Phe Asp Phe Arg Ile Asp Pro Lys Gly Gln Pro Trp Phe Leu Glu Ala

290 295 300

Gly Leu Tyr Cys Ser Phe Ala Pro Lys Ser Val Ile Ser Ser Met Ala

305 310 315 320

Lys Ala Ala Gly Ile Pro Leu Asn Asp Leu Leu Ile Thr Ala Ile Asn

325 330 335

Glu Thr Leu Gly Ser Asn Lys Lys Val Leu Gln Asn

340 345

1

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан микроорганизм для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты, в котором активность 3-дегидрохиннатдегидратазы инактивирована, а также способ получения микоспорин-подобной аминокислоты с использованием этого микроорганизма. Изобретение позволяет увеличить продуцирование микоспорин-подобных аминокислот. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 16 табл., 17 пр.

1. Микроорганизм для продуцирования микроспорин-подобной аминокислоты, в котором активность 3-дегидрохиннатдегидратазы инактивирована по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

2. Микроорганизм по п. 1, содержащий ген, кодирующий по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазы, О-метилтрансферазы и C-N лигазы.

3. Микроорганизм по п. 1, содержащий ген, кодирующий по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из синтетазы нерибосомных пептидов, фермента, подобного синтетазе нерибосомных пептидов (NRPS-подобного фермента), и D-Ala-D-Ala лигазы.

4. Микроорганизм по п. 1, в котором активность по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы, транскетолазы I/II и 3-дегидрохиннатсинтазы, дополнительно усилена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

5. Микроорганизм по п. 1, представляющий собой микроорганизм рода Corynebacterium, микроорганизм рода Escherichia или дрожжи.

6. Микроорганизм по п. 5, где в дрожжи введен ген, кодирующий 3-дегидрохиннатсинтазу.

7. Микроорганизм по п. 1, где микоспорин-подобная аминокислота представляет собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из микоспорин-2-глицина, палитинола, палитеновой кислоты, дезоксигадузола, микоспорин-метиламин-треонина, микоспорин-глицин-валина, палитина, астерина-330 (asterina-330), шинорина (shinorine), порфира-334, эугалотек-362 (euhalothece-362), микоспорин-глицина, микоспорин-орнитина, микоспорин-лизина, микоспорин-глутаминовой кислоты, микоспорин-метиламин-серина, микоспорин-таурина, палитена, палитин-серина, палитин-серин-сульфата, палитинола и усуджирена (usujirene).

8. Способ получения микоспорин-подобной аминокислоты, включающий:

культивирование микроорганизма по любому одному из пп. 1-7 и

извлечение микроспорин-подобной аминокислоты из культивируемого микроорганизма или из среды.