[Область изобретения]

Описание настоящего изобретения относится к микроорганизму, продуцирующему микоспорин-подобную аминокислоту, и к способу получения микоспорин-подобной аминокислоты с использованием микроорганизма.

[Предшествующий уровень техники]

Ультрафиолетовые (УФ) лучи, излучаемые солнцем, состоят из УФ-А (с длиной волны от приблизительно 320 нм до приблизительно 400 нм), УФ-В (с длиной волны от приблизительно 290 нм до приблизительно 320 нм) и УФ-С (с длиной волны от приблизительно 100 нм до приблизительно 280 нм). Известно, что лучи УФ-А проникают в слой кожи, в основном вызывая пигментацию и старение кожи, и вовлечены в возникновение светочувствительного заболевания кожи, тогда как лучи УФ-В представляют собой лучи, несущие высокий уровень энергии, которые проникают в эпидермис и базальный слой дермы и вовлечены в возникновение солнечных ожогов, пигментацию и возникновение рака кожи.

Для того, чтобы предотвратить эти побочные действия УФ лучей, предпринимаются попытки блокировать УФ лучи. Типы солнцезащитных агентов включают химические солнцезащитные агенты и физические солнцезащитные агенты. Химические солнцезащитные агенты предотвращают проникновение УФ лучей в основном путем поглощения УФ лучей, тогда как физические солнцезащитные агенты предотвращают проникновение УФ лучей путем отражения и рассеяния.

Компоненты, которые, как известно, содержатся в химических солнцезащитных агентах, могут включать агенты, которые в основном поглощают лучи УФ-В (например РАВА (пара-аминобензойная кислота), сложные эфиры РАВА (амилдиметил-РАВА, октилдиметил-РАВА), циннаматы (циноксат), салицилаты (гомоментил-салицилат), камфора и т.п.); и агенты, которые в основном поглощают лучи УФ-А (например бензофеноны (оксибензон, диоксибензон и сульфобензол), дибензоилметан, антранилат и т.п.). Хотя эти химические солнцезащитные агенты могут обеспечить действия, поглощающие и блокирующие УФ лучи, известно, что некоторые из этих химических солнцезащитных агентов могут раздражать кожу или глаза, и, в частности, РАВА, сложные эфиры РАВА, бензофеноны и циннаматы и т.п.могут вызывать контактный дерматит.Дополнительно, сообщалось о том, что другие из этих химических солнцезащитных агентов вызывают светочувствительную реакцию на коже и т.п.Соответственно, в некоторых странах применение или объем использования этих химических солнцезащитных агентов ограничен.

Компоненты, которые, как известно, содержатся в физических солнцезащитных агентах, могут включать диоксид титана, тальк (силикат магния), оксид магния, оксид цинка, каолин и т.п. Физические солнцезащитные агенты обладают преимуществами, заключающимися в том, что они не вызывают побочные действия, такие как контактный дерматит, и что они не удаляются легко водой. Тем не менее, они обладают недостатками, заключающимися в том, что сложно с их помощью поддерживать эффективное содержание при использовании желаемых композиций и что возникает белый налет и т.п. при их нанесении на кожу.

Микоспорин-подобные аминокислоты (МАА) представляют собой вещества, представленные в организмах в природе и они, как известно, эффективно поглощают УФ-А и УФ-В. Известно, что в природе существует более 35 видов МАА {Mar. Biol., 1991, 108: 157-166; Planta Med., 2015, 81: 813-820). Недавно сообщали о том, что МАА, к которым прикреплены различные типы Сахаров, существуют в микроводорослях, и они обладают превосходной антиоксидантной функцией (Journal of Photochemistry and Photobiology, 2015, 142: 154-168). Дополнительно, МАА, как известно, обеспечивают не только способность блокировать УФ лучи, но также устойчивость к окислению, осмосу, температурному стрессу и т.п. (Comp. Biochem. Physiol.C Toxicol. Pharmacol., 2007, 146: 60-78; J. Photochem. Photobiol. В., 2007, 89: 29-35).

Тем не менее, количество МАА, продуцируемое в микроводорослях, является очень низким, находясь на уровне нескольких микрограмм, и условия для разделения, экстракции и очистки МАА после культивирования микроводорослей затруднены. Таким образом, сложно массово продуцировать материал МАА.

[Документы предшествующего уровня техники]

[Непатентные документы]

(Непатентный документ 1) Comp. Biochem. Physiol. В 1995, 112: 105-114.

(Непатентный документ 2) FEMSMicrobiol Lett. 2007,269: 1-10.

(Непатентный документ 3) Ann.Rev. Physiol. 2002, 64: 223-262.

Непатентный документ 4) Mar. Biol. 1991, 108: 157-166.

(Непатентный документ 5) Journal of Photochemistry and Photobiology В: Biology. 2015, 142: 154-168

(Непатентный документ 6) Biol. Rev. 1999, 74: 311-345.

(Непатентный документ 7) Mol. Biol. Evol. 2006, 23: 1437-1443.

(Непатентный документ 8) Science, 2010, 329: 1653-1656.

(Непатентный документ 9) Genomics 2010, 95: 120-128.

(Непатентный документ 10) Geomicrobiol. J. 1997. 14: 231-241.

(Непатентный документ 11) Comp. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2007. 146: 60-78.

(Непатентный документ 12) Can. J. Bot. 2003. 81: 131-138.

(Непатентный документ 13) J. Photochem. Photobiol. B. 2007, 89: 29-35.

(Непатентный документ 14) J. Bacteriol. 2011. 193(21): 5923-5928.

(Непатентный документ 15) Planta Med. 2015. 81: 813-820

(Непатентный документ 16) ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. 7: 16558-16564

(Непатентный документ 11) Appl Environ Microbiol. 2016, 82(20): 6167-6173

(Непатентный документ 18) ChemBioChem. 2015, 16: 320-327

(Непатентный документ 19) MethodsMolBiol. 2013, 1073: 43-7

(Непатентный документ 20) Nature Review, 2011, 9: 791-802

[Описание изобретения]

[Техническая проблема]

Авторы настоящего изобретения предприняли множество попыток для увеличения продукции МАА в микроорганизмах. В результате они подтвердили то, что продукция МАА может быть увеличена в микроорганизмах, продуцирующих МАА, при помощи различных исследований, ассоциированных с усилением активности белков 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и транскетолазы в микроорганизмах, таким образом, завершая описание настоящего изобретения.

[Техническое решение]

Задача в соответствии с описанием настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм, продуцирующий микоспорин-подобную аминокислоту (ММА), в котором усилена активность по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы,

фосфоенолпируватсинтетазы и транскетолазы.

Еще одна задача в соответствии с описанием настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения микоспорин-подобной аминокислоты, который включает культивирование микроорганизма в среде; и выделение микоспорин-подобной аминокислоты из культивированного микроорганизма или среды.

Еще одна задача в соответствии с описанием настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение микроорганизма для продуцирования микоспорин-подобной аминокислоты.

[Благоприятные эффекты]

Поскольку микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения обладает увеличенной способностью продуцировать микоспорин-подобную аминокислоту (ММА), он может быть эффективно использован в получении микоспорин-подобных аминокислот.

[Наилучший способ осуществления изобретения]

Описание настоящего изобретения подробно изложено ниже. В то же самое время, соответствующие описания и воплощения, раскрытые в описании настоящего изобретения, также могут быть применены в отношении других описаний и воплощений. То есть, все комбинации различных элементов, раскрытые в описании настоящего изобретения, оказываются в объеме изобретения в соответствии с описанием настоящего изобретения. Кроме того, объем изобретения в соответствии с описанием настоящего изобретения не ограничивается приведенным ниже конкретным описанием изобретения. Кроме того, специалист в данной области техники может обнаружить или идентифицировать множество эквивалентов некоторых аспектов в соответствии с описанием настоящего изобретения исключительно при помощи стандартных экспериментов. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты включены в описание настоящего изобретения.

Для достижения вышеприведенных задач в аспекте в соответствии с описанием настоящего изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий микоспорин-подобную аминокислоту (ММА), в котором усилена активность по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и транскетолазы.

Используемый здесь термин "2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза" относится к ферменту, который катализирует обратимую реакцию на следующей реакционной схеме, и, в частности, может относиться к ферменту, который синтезирует 3-дезокси-D-арабино-гептулозонат-7-фосфат (DAHP), но не ограничивается ими.

[Реакционная схема]

Фосфоенолпируват + D-эритроза-4-фосфат + Н₂О

↔ 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат + фосфат

В описании настоящего изобретения 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза может быть использована взаимозаменяемо с 3-дезокси-D-арабино-гептулозонат-7-фосфат (DAHP) синтазой.

Используемый здесь термин "фосфоенолпируватсинтетаза" относится к ферменту, который катализирует обратимую реакцию на следующей реакционной схеме, и, в частности, может относиться к ферменту, который синтезирует фосфоенолпируват, но не ограничивается им.

[Реакционная схема]

АТФ + пируват +Н₂О

↔ AMP + фосфоенолпируват + фосфат

Используемый здесь термин "транскетолаза" относится к ферменту, который катализирует обратимую реакцию на следующей реакционной схеме.

[Реакционная схема]

Седогептулозо-7-фосфат+ D-глицеральдегид-3-фосфат

↔ D-рибозо-5-фосфат + D-ксилулозо-5-фосфат

или

Фруктозо-6-фосфат + D-глицеральдегид-3-фосфат

↔ эритрозо-4-фосфат + D-ксилулозо-5-фосфат

Генетическая информация о 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазе, фосфоенолпируватсинтетазе и транскетолазе могут быть получены в известной базе данных (например GenBank database в National Center for Biotechnology Information (Национальном центре биотехнологической информации) (NCBI) и т.п.), но не ограничивается ей.

2-Дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза, фосфоенолпируватсинтетаза и транскетолаза не ограничиваются своим происхождением или последовательностями, поскольку существуют случаи, когда белки, демонстрирующие активности, отличаются по своим аминокислотным последовательностям в зависимости от видов микроорганизма или самого микроорганизма.

В частности, 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, 37 или 124; фосфоенолпируватсинтетаза может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 19 или 98; и транскетолаза может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 24, 96 или 123, но аминокислотные последовательности этих белков не ограничиваются ими. Используемый здесь термин "белок, включающий аминокислотную последовательность" может быть использован взаимозаменяемо с выражением "белок, имеющий аминокислотную последовательность", или "белок, состоящий из аминокислотной последовательности".

Дополнительно, в описании настоящего изобретения эти ферменты могут включать белки, которые имеют аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO, описанными выше, а также 80% или более высокую, 85% или более высокую, 90% или более высокую, 91% или более высокую, 92% или более высокую, 93% или более высокую, 94% или более высокую, 95% или более высокую, 96% или более высокую, 97% или более высокую, 98% или более высокую, 99% или более высокую гомологию или идентичность с вышеприведенными аминокислотными последовательностями, до тех пор, пока белки обладают биологической активностью, идентичной или соответствующей каждому из этих ферментов.

Дополнительно, понятно, что любой белок, который имеет аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности, также может быть включен в объем изобретения в соответствии с описанием настоящего изобретения, до тех пор, пока аминокислотная последовательность обладает гомологией или идентичностью с SEQ ID NO, описанными выше, и обладает биологической активностью, по существу идентичной или соответствующей белкам ферментов в соответствии с SEQ ID NO, описанными выше.

Используемый здесь термин "гомология или идентичность" относится к степени соответствия между заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и могут быть выражены в процентных долях. В описании настоящего изобретения гомологичная последовательность, обладающая активностью, идентичной или похожей на активность для заданной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, представлена как "% гомологии" или "% идентичности". Например, гомология может быть подтверждена с использованием стандартного программного обеспечения, в частности BLAST 2.0, для расчета параметров, таких как оценка, идентичность и сходство, или путем сравнения последовательностей путем гибридизации по Саузерну при определенных жестких условиях. Определенные подходящие условия гибридизации могут находиться в объеме уровня техники и могут быть определены при помощи способа, хорошо известного специалистам в данной области техники (например J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Термин "жесткие условия" относится к условиям, которые обеспечивают специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Например, такие условия, в частности, раскрыты в литературе (например J. Sambrook et al., выше).

2-Дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза, фосфоенолпируватсинтетаза и транскетолаза в соответствии с описанием настоящего изобретения могут включать полинуклеотиды, кодирующие белки, которые имеют аминокислотные последовательности в соответствии с описанными выше SEQ ID NO, или 80% или более высокую, 85% или более высокую, 90% или более высокую, 91% или более высокую, 92% или более высокую, 93% или более высокую, 94% или более высокую, 95% или более высокую, 96% или более высокую, 97% или более высокую, 98% или более высокую, 99% или более высокую гомологию или идентичность с аминокислотными последовательностями в соответствии с SEQ ID NO, описанными выше, до тех пор, пока эти полинуклеотиды обладают биологической активностью, идентичной или соответствующей каждому из этих ферментов.

Дополнительно, рассматривая кодоны, предпочтительные в организме, когда должен экспрессироваться белок, вследствие вырожденности кодонов различные модификации могут быть осуществлены в кодирующей области нуклеотидной последовательности в объеме изобретения, не изменяющие аминокислотную последовательность белка, экспрессирующегося с кодирующей области. Таким образом, любой полинуклеотид, имеющий последовательность, кодирующую каждый из белков-ферментов, может быть включен без ограничения.

Дополнительно, любая последовательность, которая кодирует белок, обладающий активностью белков-ферментов 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы,

фосфоенолпируватсинтетазы или транскетолазы, путем гибридизации с любым зондом, который могут быть получен из известных последовательностей генов (например последовательности, комплементарные всей или части вышеприведенной полинуклеотидной последовательности), в жестких условиях, может быть включена без ограничения.

Термин "жесткие условия" относится к условиям, которые обеспечивают специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Такие условия, в частности, описаны в литературе (например J Sambrook et al., выше). Например условия гибридизации между генами, имеющими высокую гомологию или идентичность, гомология или идентичность 40% или выше, в частности, 90% или выше, в частности, 95% или выше, в частности, 97% или выше, и, в частности, 99% или выше, без гибридизации между генами, имеющими гомологию или идентичность ниже, чем гомологии или идентичности, описанные выше; или могут быть перечислены обычные условия отмывания для гибридизации по Саузерну, т.е. однократное отмывание, в частности, два или три раза при концентрации соли и температуре, соответствующей 60°С, 1×SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и, в частности, 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS.

Гибридизация требует того, что два полинуклеотида обладают комплементарными последовательностями, хотя некомплементарности между основаниями возможны в зависимости от жесткости гибридизации. Термин "комплементарный" используют для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые могут гибрид изо в аться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину и цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, описание настоящего изобретения также может включать выделенные полинуклеотидные фрагменты, комплементарные полноразмерной последовательности, а также, по существу, похожие полинуклеотидные последовательности.

В частности, полинуклеотиды, обладающие гомологией или идентичностью, могут быть обнаружены с использованием условий гибридизации, которые включают стадию гибридизации при величине T_m 55°С и с использованием условий, описанных выше. Дополнительно, величина T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но температура не ограничивается ими, и может быть подходящим образом скорректирована специалистом в данной области техники в зависимости от задачи.

Жесткость, подходящая для гибридизации полинуклеотидов, зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, и варианты хорошо известны в области техники (смотри Sambrook et al., выше, 9.50-9.51 и 11.7-11.8). Используемый здесь термин "усиление активности" означает, что введена активность белка-фермента, или активность усилена по сравнению с собственной эндогенной активностью или активностью до его модификации, которую демонстрирует микроорганизм. "Введение" активности означает, что микроорганизм естественным или искусственным образом демонстрирует активность конкретного белка, которая исходно не демонстрируется микроорганизмом. В частности, микроорганизм с усиленной активностью белка-фермента относится к микроорганизму, в котором активность белка-фермента усилена по сравнению с активностью природного микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма. Усиление активности может включать, например как усиление активности путем введения экзогенной 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и/или транскетолазы в микроорганизм; так и усиление активности эндогенных 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и/или транскетолазы.

В частности, в описании настоящего изобретения способ усиления активности может включать:

(1) способ увеличения количества копий полинуклеотидов, кодирующих ферменты;

(2) способ модификации последовательности, контролирующей экспрессию, для увеличения экспрессии полинуклеотидов;

(3) способ модификации полинуклеотидных последовательностей на хромосоме для усиления активностей ферментов; или

(4) способ модификации для усиления путем комбинирования вышеприведенных способов (1)-(3) и т.п, но способы не ограничиваются ими.

Способ (1) увеличения количества копий полинуклеотидов может быть осуществлен в форме, при которой полинуклеотид функционально связан с вектором, или путем встраивания полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина, но не ограничен конкретно ими. Дополнительно, в качестве альтернативы, количество копий может быть увеличено путем введения экзогенного полинуклеотида, демонстрирующего активность фермента, или оптимизированного по кодонам модифицированного полинуклеотида относительно вышеприведенного полинуклеотида в клетку-хозяина. Экзогенный полинуклеотид может быть использован без ограничения своего происхождения или последовательности до тех пор, пока полинуклеотид демонстрирует активность, идентичную или похожую на активность фермента. Введение может быть осуществлено специалистом в данной области техники путем надлежащего выбора известного способа трансформации, и активность фермента может быть усилена таким образом, что введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, таким образом, продуцируя фермент.

Затем, способ (2) модификации последовательности, контролирующей экспрессию, для увеличения экспрессии полинуклеотидов, может быть осуществлен путем индукции модификации в последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного усиления активности последовательности, контролирующей экспрессию; или путем замены последовательности нуклеиновой кислоты на последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую более сильной активностью, но способ по существу не ограничивается ими. Последовательность, контролирующая экспрессию, может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, последовательности, контролирующие прекращение транскрипции и трансляции и т.п., но последовательность, контролирующая экспрессию, не ограничена конкретно ими.

В частности, сильный гетерологический промотор вместо исходного промотора может быть связан выше относительно полинуклеотидного экспрессирующегося фрагмента, и примеры сильного промотора могут включать промотор CJ7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асе А или асеВ и т.п. В частности, полинуклеотидный экспрессирующийся фрагмент может быть функционально связан с промотором, происходящим из Corynebacterium, таким как промотор lysCP1 (WO 2009/096689), промотор CJ7 (WO 2006/065095), промотор SPL (KR 10-1783170 В) или промотор о2 (KR 10-1632642 В), для улучшения уровня экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент, но способ не ограничивается ими.

Дополнительно, способ (3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме может быть осуществлен путем индукции модификации в последовательности, контролирующей экспрессию, путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного усиления активности полинуклеотидной последовательности; или путем замены последовательности нуклеиновой кислоты на улучшенную полинуклеотидную последовательность, обладающую более сильной активностью, но способ не ограничивается конкретно ими.

Наконец, способ (4) модификации для усиления путем комбинирования способов (1)-(3) может быть осуществлен путем применения вместе одного или более чем одного способа из числа способов: способа увеличения числа копий полинуклеотидов, кодирующих ферменты; способа модификации последовательности, контролирующей экспрессию, для увеличения экспрессии; и способа модификации полинуклеотидных последовательностей на хромосоме или способа модификации экзогенных полинуклеотидов, демонстрирующих активность фермента или его оптимизированного по кодонам модифицированного полинуклеотида.

Полинуклеотиды могут быть описаны как гены, когда они представляют собой ансамбль из полинуклеотидов, способных функционировать. В описании настоящего изобретения полинуклеотиды и гены могут быть использованы взаимозаменяемо, и полинуклеотидные последовательности и нуклеотидные последовательности могут быть использованы взаимозаменяемо.

Используемый здесь термин "вектор" относится к конструкции ДНК, включающей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего желаемый белок, в которой желаемый белок функционально связан с подходящей контролирующей последовательностью таким образом, что он может экспрессироваться в подходящем хозяине. Контролирующая последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательности, контролирующие прекращение транскрипции и трансляции. Вектор после трансформации в подходящую клетку-хозяина может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может интегрироваться в геном самого хозяина.

Вектор, используемый в описании настоящего изобретения, не ограничен конкретным образом, пока вектор может реплицироваться в клетке-хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в области техники. Примеры обычных векторов могут включать природную или рекомбинантную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг.Например pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A и т.п. могут быть использованы в качестве фагового вектора или космидного вектора; и pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL и pET и т.п.могут быть использованы в качестве плазмидного вектора. В частности, могут быть использованы векторы, такие как pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pSKH, pRS-413, pRS-414 и pRS-415 и т.п., но векторы не ограничиваются ими.

Векторы, используемые в описании настоящего изобретения, не ограничены конкретным образом, и может быть использован любой экспрессирующий вектор. Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий желаемый белок на хромосоме, может быть встроен в хромосому при помощи вектора для хромосомного встраивания в клетку. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено с использованием любого способа, известного в области техники (например, путем гомологичной рекомбинации), но способ встраивания не ограничивается ими. Также может быть включен селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер используется для отбора клеток, трансформированных вектором (т.е. для подтверждения того, встроилась ли желаемая молекула нуклеиновой кислоты), и могут быть использованы маркеры, способные обозначать отбираемые фенотипы (например лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных белков). В условиях, когда обрабатывают селективными агентами, тогда только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выживать или экспрессировать другие фенотипические признаки, и, таким образом, легко могут быть отобраны трансформированные клетки.

Используемый здесь термин "трансформация" относится к введению вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий желаемый белок, в клетку-хозяина, таким образом, что белок, кодируемый полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может не ограничиваться конкретным образом, пока он может экспрессироваться в клетке-хозяине независимо от того, встроен ли трансформированный полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, располагаясь в ней, или располагается за пределами хромосомы. Дополнительно, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие желаемый белок. До тех пор, пока полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней, не имеет значения, в какой форме встроен полинуклеотид. Например полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все элементы, необходимые для ее экспрессии. Экспрессионная кассета может включать промотор, который функционально связан с полинуклеотидом, сигнал прекращения транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал прекращения трансляции. Экспрессионная кассета может представлять собой самореплицирующийся экспрессирующий вектор. Дополнительно, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, который вводят в клетку-хозяина в виде самого полинуклеотида и который связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничивается ими. Способы трансформации включают любой способ введения в клетку нуклеиновой кислоты, и могут быть осуществлены путем выбора подходящего стандартного способа, известного в области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, способы трансформации могут включать электропорацию, осаждение при помощи фосфата кальция (CaPO₄), осаждение при помощи хлорида кальция (CaCl₂), микроинъекцию, полиэтиленгликолевый способ (PEG), способ с использованием ЕАЕ-декстрана, катионный липосомальный способ, способ с использованием ацетата лития-DMSO (диметилсульфоксид) и т.п., но способы не ограничиваются ими.

Дополнительно, используемый здесь темин "функционально связанный" обозначает функциональную связь между промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего желаемый белок в соответствии с описанием настоящего изобретения, и полинуклеотидной последовательностью. Функциональная связь может быть получена при помощи способа генетической рекомбинации, известного в области техники, и сайт-специфическое расщепление ДНК и лигирование могут быть осуществлены с использованием рестрикционного фермента, лигазы и т.п., известных в области техники, не ограничиваясь ими.

В микроорганизме в соответствии с описанием настоящего изобретения активность 3-дегидрохинатдегидратазы может быть дополнительно инактивирована.

Используемый здесь термин "3-дегидрохинатдегидратаза" относится к ферменту, который катализирует обратимую реакцию в приведенной ниже реакционной схеме, и, в частности, она может превращать 3-дегидрохинат в 3-дегидрошикимат, но не ограничивается ими.

[Реакционная схема]

3-дегидрохинат ↔ 3-дегидрошикимат + Н₂О

3-Дегидрохинатдегидратаза не ограничена в своем происхождении или последовательности, поскольку существуют случаи, когда белки, демонстрирующие активность 3-дегидрохинатдегидратазы, отличаются по своей аминокислотной последовательности в зависимости от вида микроорганизма или микроорганизмов. В частности, 3-дегидрохинатдегидратаза может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 90, но не ограничивается ей. Дополнительно, 3-дегидрохинатдегидратаза может включать аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 90 или аминокислотную последовательность, обладающую гомологией или идентичностью по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 90. Дополнительно, понятно, что любая аминокислотная последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности также может быть включена в объем изобретения в соответствии с описанием настоящего изобретения до тех пор, пока аминокислотная последовательность обладает гомологией или идентичностью, описанными выше, и обладает биологической активностью, идентичной или соответствующей вышеприведенному белку.

Используемый здесь термин "инактивация" относится к случаю, когда активность белка фермента ослаблена по сравнению с эндогенной активностью белка фермента или его активностью до модификации, исходно демонстрируемой микроорганизмом; случаю, когда белок не экспрессируется вовсе; или случаю, когда белок экспрессируется, но не обладает активностью. Инактивация представляет собой ситуацию, которая включает: случай, когда активность самого фермента ослаблена по сравнению с его эндогенной активностью, демонстрируемой микроорганизмом, вследствие модификации полинуклеотида, кодирующего фермент, и т.п, или активность удалена; случай, когда степень общей внутриклеточной активности фермента ниже по сравнению с активностью в микроорганизме дикого типа или активность удалена вследствие ингибирования экспрессии или трансляции гена, кодирующего фермент, и т.п; случай, когда весь ген или часть гена, кодирующего фермент, удален; и их комбинация, но инактивация не ограничивается ими. То есть, микроорганизм, в котором активность фермента инактивирована, относится к микроорганизму, в котором активность белка-фермента ниже по сравнению с активностью у его природного микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма или в котором активность удалена.

Инактивация активности фермента может быть достигнута путем применения различных способов, известных в области техники. Примеры вышеприведенных способов могут включать: 1) способ делеции на хромосоме всего гена или части гена, кодирующего фермент; 2) способ модификации на хромосоме последовательности, контролирующей экспрессию, для уменьшения экспрессии гена, кодирующего белок; 3) способ модификации на хромосоме последовательности гена, кодирующего белок, таким образом, что активность белка удаляется или ослабляется; 4) способ введения антисмыслового олигонуклеотида (например антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена на хромосоме, кодирующего белок; 5) способ, приводящий к невозможности прикрепления рибосомы за счет вторичной структуры, образующейся при добавлении последовательности, которая комплементарна последовательности Шайна-Дальгарно (SD), на переднем конце последовательности SD гена на хромосоме, кодирующего белок; 6) способ инженерии с обратной транскрипцией (RTE), при котором промотор, который транскрибируется в обратном направлении добавляется по 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) полинуклеотидной последовательности, кодирующей белок, и т.п; и инактивация может быть осуществлена путем их комбинирования, но способы не ограничены конкретно ими.

Способ делеции всего гена или части гена на хромосоме, кодирующего фермент, может быть осуществлен путем замены полинуклеотида на хромосоме, кодирующего эндогенный желаемый белок, на полинуклеотид или маркерный ген, имеющий частично подвергнутую делеции нуклеотидную последовательность, с использованием вектора для встраивания в хромосому. В качестве примера способа делеции всего или части полинуклеотида может быть использован способ делеции полинуклеотида путем гомологичной рекомбинации, но способ не ограничивается им.

Способ модификации последовательности, контролирующей экспрессию, может быть осуществлен путем индукции модификации последовательности нуклеиновой кислоты в последовательности, контролирующей экспрессию, путем делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены или их комбинации таким образом, чтобы дополнительно ослабить активность последовательности, контролирующей экспрессию; или путем замены последовательности нуклеиновой кислоты на последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую более слабой активностью. Последовательность, контролирующая экспрессию, может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность для регулирования транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.

Способ модификации последовательности гена на хромосоме может быть осуществлен путем индукции модификации в последовательности гена путем делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены или их комбинации таким образом, чтобы дополнительно ослабить активность фермента; или путем замены последовательности гена на последовательность гена, модифицированного таким образом, что он обладает более слабой активностью, или на последовательность гена, модифицированного таким образом, что он вовсе не обладает активностью, но способ не ограничивается ими.

В вышеприведенном описании термин "часть", независимо от того, что может варьировать в зависимости от типа полинуклеотида, может составлять, в частности, от 1 нуклеотида до 300 нуклеотидов, в частности, от 1 нуклеотида до 100 нуклеотидов, и, в частности, от 1 нуклеотида до 50 нуклеотидов, но не ограничивается конкретно ими.

В микроорганизме в соответствии с описанием настоящего изобретения активность белка 3-дегидрохинатсинтазы может быть дополнительно усилена по сравнению с активностью у немодифицированного микроорганизма.

3-Дегидрохинатсинтаза относится к ферменту, который катализирует обратимую реакцию следующей реакционной схемы, и, в частности, может синтезировать 3-дегидрохинат (3-DHQ), но не ограничивается ими.

[Реакционная схема]

3-дезокси-арабино-гептулозонат-7-фосфат

↔ 3-дегидрохинат + фосфат

Используемый здесь термин "микоспорин-подобная аминокислота (МАА)" относится к циклическому соединению, которое поглощает ультрафиолетовые (УФ) лучи. В описании настоящего изобретения микоспорин-подобная аминокислота не ограничена до тех пор, пока она может поглощать УФ лучи, и в частности, она может представлять собой соединение, которое имеет центральное кольцо циклогексанона или циклогексенимина; или может представлять собой соединение, в котором различные вещества (например аминокислоты и т.п.) связаны с центральным кольцом, и, в частности, оно может представлять собой микоспорин-2-глицин, палитинол, палитеновую кислоту, дезоксигадузол, микоспорин-метиламин-треонин, микоспорин-глицин-валин, палитин, астерину-330 (asterina-330), шинорин, порфиру-334 porphyra-334), эухалотец-362 (euhalothece-362), микоспорин-глицин, микоспорин-орнитин, микоспорин-лизин, микоспорин-глутаминовая кислота-глицин, микоспорин-метиламин-серин, микоспорин-таурин, палитен, палитин-серин, палитин-серин-сульфат, палитинол, усуджирен или их комбинацию.

В описании настоящего изобретения термин микоспорин-подобная аминокислота может быть использован взаимозаменяемо с МАА и МАА.

Используемый здесь термин "микроорганизм, продуцирующий микоспорин-подобную аминокислоту (МАА)" может относиться к микроорганизму, который включает ген фермента, вовлеченного в биосинтез МАА, или кластер этих генов, или микроорганизму, в котором кластер введен или усилен. Дополнительно, используемый здесь термин "кластер генов биосинтеза микоспорин-подобной аминокислоты (МАА)" может относиться к группе генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в биосинтез МАА, и, в частности, может включать ген биосинтеза МАА, ген фермента, обладающего активностью, присоединяющей дополнительный аминокислотный остаток к МАА, или кластер вышеприведенных генов. Ген биосинтеза МАА включает как экзогенные гены, так и/или эндогенные гены микроорганизма, до тех пор, пока микроорганизм, включающий такой ген, может продуцировать МАА. Экзогенные гены могут быть гомогенными или гетерогенными.

Виды микроорганизмов, из которых происходит ген биосинтеза МАА, не ограничены, пока микроорганизмы, включающие этот ген, могут продуцировать ферменты, вовлеченные в биосинтез МАА, и следовательно могут продуцировать МАА. В частности, виды микроорганизмов, из которых происходит ген биосинтеза МАА, могут представлять собой цианобактерии (например Anabaena variabilis, Nostoc punctiforme, Nodularia spumigena, Cyanothece sp. PCC 7424, Lyngbya sp. PCC 8106, Microcystis aeruginosa, Microcoleus chthonoplastes, Cyanothece sp. ATCC 51142, Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp. CCY 0110, Cylindrospermum stagnate sp. PCC 7417, Aphanothece halophytica или Trichodesmium erythraeum); грибы (например Magnaporthe orzyae, Pyrenophora tritici-repentis, Aspergillus clavatus, Nectria haematococca, Aspergillus nidulans, Gibberella zeae, Verticillium albo-atrum, Botryotinia fuckeliana или Phaeosphaeria nodorum); или Nematostella vectensis; Heterocapsa triquetra, Oxyrrhis marina, Karlodinium micrum, Actinosynnema mirum и т.п, но не ограничиваться ими.

В соответствии с воплощением микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения, который продуцирует МАА, включает ген биосинтеза МАА или его кластер. В частности, в микроорганизм может быть введен генный кластер биосинтеза МАА или активности белков, кодируемых генами, могут быть усилены по сравнению с эндогенными активностями или активностями до модификации, но микроорганизм не ограничивается ими.

Дополнительно, хотя ген биосинтеза МАА не ограничен в своем названии ферментами или микроорганизмами, из которых происходят эти гены, пока микроорганизмы могут продуцировать МАА, этот ген биосинтеза МАА может включать ген, кодирующий белок-фермент, обладающий активностью, идентичной и/или похожей на один или более чем один, в частности, один или более чем один, два или более чем два, три или более чем три, или все из белков-ферментов, выбранных из группы, состоящей из 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазы, О-метилтрансферазы и C-N-лигазы.

Например, 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтаза представляет собой фермент, который превращает седогептулозу-7-фосфат в 2-деметил-4-дезоксигадузол. О-Метилтрансфераза представляет собой фермент, который превращает 2-деметил-4-дезоксигадузол в 4-дезоксигадузол, глицилирование 4-дезоксигадузола катализируется С-N-лигазой.

Дополнительно, микроорганизм, продуцирующий МАА, может включать ген фермента, который обладает активностью, присоединяющей дополнительный аминокислотный остаток к МАА, или кластер генов. Хотя вышеприведенный ген или кластер генов не ограничен в своих названиях ферментами или микроорганизмами, из которых происходят эти гены, пока микроорганизмы, продуцирующие МАА, могут продуцировать МАА, к которым присоединены два или более чем два аминокислотных остатка. Микроорганизмы, продуцирующие МАА, могут включать ген, кодирующий белок-фермент, обладающий активностью, идентичной и/или похожей на один или более чем один, в частности, один или более чем один, два или более чем два, три или более чем три или все из белков-ферментов, выбранных из группы, состоящей из нерибосомальной пептидсинтетазы (NRPS), фермента, подобного нерибосомальной пептидсинтетазе (NRPS-подобный фермент), и D-аланин D-аланин-лигазы (D-Ala-D-Ala лигаза; DDL).

Некоторые из МАА включают второй аминокислотный остаток в микоспорин-глицине. Один или более чем один фермент, которые выбраны из группы, состоящей из нерибосомальной пептидсинтетазы, фермента, подобного нерибосомальной пептидсинтетазе, и D-Ala-D-Ala-лигазы, могут присоединять второй аминокислотный остаток к микоспорин-глицину.

В соответствии с воплощением микроорганизм, продуцирующий МАА, может включать без ограничения названия ферментов или виды микроорганизмов, из которых происходят гены биосинтеза МАА, ферменты, пока они обладают активностью, способной присоединять вторую аминокислоту к микоспорин-глицину, как в нерибосомальной пептидсинтетазе, ферменте, подобном нерибосомальной пептидсинтетазе и D-Ala-D-Ala-лигазе.

Например, фермент, подобный нерибосомальной пептидсинтетазе (Ava_3855), в АпаЬаепа variabilis или D-Ala-D-Ala-лигаза (NpF5597) в Nostoc punctiforme могут присоединять сериновый остаток к микоспорин-глицину с образованием шинорина. В еще одном примере микоспорин-2-глицин может быть получен путем присоединения второго глицинового остатка при помощи гомолога D-Ala-D-Ala-лигазы (Ар_3855) в Aphanothece halophytica. Аналогично, в Actinosynnema mirum серии или аланин могут быть присоединены при помощи D-Ala-D-Ala-лигазы и, таким образом, может образовываться шинорин или микоспорин-глицин-аланин. Микроорганизм в соответствии с воплощением в соответствии с описанием настоящего изобретения может быть выбран и включать ферменты, которые подходят для получения желаемых МАА, среди вышеописанных ферментов или ферментов, обладающими активностями, идентичными и/или похожими на активность вышеописанных ферментов.

2-Деметил-4-дезоксигадузолсинтаза, О-метилтрансфераза, C-N-лигаза, не рибосомальная пептидсинтетаза, фермент, подобный нерибосомальной пептидсинтетазе, и/или D-Ala-D-Ala-лигаза, которые могут быть использованы в описании настоящего изобретения, не ограничены видами микроорганизмов, из которых происходят эти ферменты, пока ферменты, которые, как известно, способны выполнять функции и роли, идентичные и/или похожие на функции и роли для вышеописанных ферментов, и диапазон гомологии или идентичности среди них также не ограничен. Например MylA, MylB, MylD, MylE и MylC из С. stagnale PCC 7417 гомологичны с 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазой, О-метилтрансферазой, C-N-лигазой и D-Ala-D-Ala-лигазой, происходящими из Anabaena variabilis и Nostoc punctiforme, и степень сходства между ними находится в диапазоне от приблизительно 61% до приблизительно 88% (Appl Environ Microbiol, 2016, 82(20), 6167-6173; J Bacteriol, 2011, 193(21), 5923-5928). To есть, ферменты, которые могут быть использованы в описании настоящего изобретения, не ограничены существенно видами, из которых происходят ферменты, гомологией последовательностей или идентичностью последовательностей, до тех пор, пока они, как известно, демонстрируют идентичные и/или похожие функции и действия. Дополнительно, непатентные документы, описанные в предшествующем уровне техники, включены в полном объеме, как ссылка на описание настоящего изобретения в целом.

Дополнительно, ген биосинтеза МАА может представлять собой полинуклеотид, кодирующий белок, который включает аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 или 122, но ген биосинтеза МАА не ограничивается ими.

Дополнительно, ген биосинтеза МАА может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который включает аминокислтную последовательность, имеющую 50%, 60% или 70% или более высокую, в частности, 80% или более высокую, в частности, 90% или более высокую, в частности, 95% или более высокую, и, в частности, 99% или более высокую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 или 122, и может включать без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который выходит за пределы диапазона вышеприведенной гомологии или идентичности, до тех пор, пока микроорганизм может продуцировать ММА. В частности, ген биосинтеза МАА может включать нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109, но не ограничивается ими.

Дополнительно, понятно, что любая аминокислотная последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности, также может быть включена в описание настоящего изобретения, до тех пор, пока аминокислотная последовательность обладает гомологией или идентичностью с вышеприведенными последовательностями и по существу обладает биологической активностью, идентичной или соответствующей белкам в соответствии с SEQ ID NO, описанными выше.

Дополнительно, рассматривая кодоны, предпочтительные в организме, в котором должен экспрессироваться белок, вследствие вырожденности кодонов различные модификации могут быть осуществлены в кодирующей области нуклеотидной последовательности в объеме изобретения, не изменяющие аминокислотную последовательность белка, экспрессируемого с кодирующей области. Таким образом, в отношении гена биосинтеза МАА, любая нуклеотидная последовательность может быть включена в описание настоящего изобретения без ограничения, пока нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, вовлеченный в биосинтез МАА.

Альтернативно, любая последовательность, которая кодирует белок, вовлеченный в биосинтез МАА, путем гибридизации с любым зондом, который может быть получен из известных последовательностей генов (например последовательности, комплементарные всей или части полинуклеотидной последовательности) в жестких условиях, может быть включена в описание настоящего изобретения без ограничения.

В соответствии с воплощением микроорганизм, продуцирующий МАА, может включать гены биосинтеза МАА, имеющие различное происхождение.

В описании настоящего изобретения усиление активности белка и/или введение генов может быть осуществлено одновременно, последовательно и в обратном порядке независимо от самого порядка.

Микроорганизм, продуцирующий МАА, может продуцировать МАА за счет включения генного кластера биосинтеза МАА, и дополнительно, может представлять собой микроорганизм, в котором способность продуцировать МАА увеличена путем усиления активности одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и транскетолазы. Дополнительно, микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения не ограничен до тех пор, пока он представляет собой микроорганизм, в котором способность продуцировать МАА увеличена путем усиления активности одного или более чем одного белка, выбранного из группы, состоящей из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы. В частности, микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, микроорганизм рода Escherichia или дрожжи.

Микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой, в частности, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens и т.п., и, в частности, может представлять собой Corynebacterium glutamicum, но микроорганизм не ограничивается ими.

Микроорганизм рода Escherichia может представлять собой, в частности, Escherichia albertii, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris и т.п., и, в частности, может представлять собой Escherichia coli, но микроорганизм не ограничивается ими.

Дрожжи могут представлять собой, в частности, Saccharomycotina и Taphrinomycotina типа Ascomycota, Agar i corny с otina типа Basidiomycota, микроорганизм, относящийся к типу Pucciniomycotina и т.п., в частности, микроорганизм рода Saccharomyces, микроорганизм рода Schizosaccharomyces, микроорганизм рода Phaffia, микроорганизм рода Kluyveromyces, микроорганизм рода Pichia и микроорганизм рода Candida, и, в частности, Saccharomyces cerevisiae, но микроорганизм не ограничивается ими.

В еще одном аспекте в соответствии с описанием настоящего изобретения предложен способ получения микоспорин-подобной аминокислоты, который включает культивирование микроорганизма в соответствии с описанием настоящего изобретения в среде; и выделение микоспорин-подобной аминокислоты (МАА) из культивированного микроорганизма или среды.

"Микроорганизм" и "микоспорин-подобная аминокислота (МАА)" являются такими, как описано выше.

Используемый здесь термин "культивирование" означает, что микроорганизм выращивается при надлежащим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования в соответствии с описанием настоящего изобретения может быть осуществлен в подходящей культуральной среде и условиях культивирования, известных в области техники. Такой процесс культивирования могут быть легко скорректирован для применения специалистом в данной области техники в зависимости от выбранного микроорганизма. Стадия культивирования микроорганизма может быть осуществлена в периодической культуре, непрерывной культуре, культуре с подпиткой и т.п., известными в области техники, но стадия культивирования микроорганизма не ограничивается конкретно ими. Среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования микроорганизма в соответствии с описанием настоящего изобретения, не ограничены конкретно ими, и может быть использована любая среда, используемая для обычного выращивания микроорганизма. В частности, микроорганизм в соответствии с описанием настоящего изобретения, может быть выращен в аэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин и т.п, путем корректирования температуры, рН и т.п. В частности, рН могут быть скорректирован с использованием основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например фосфорная кислота или серная кислота) с получением оптимального рН (например рН от 5 до 9, в частности, рН от 6 до 8, и, в частности, рН 6,8), но способ корректирования рН не ограничивается ими. Дополнительно, кислород или содержащий кислород газ может быть инжектирован в культуру для поддержания аэробного состояния в культуре; или газ азот, водород или диоксид углерода может быть инжектирован в культуру без инжекции газа для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния в культуре, но газ не ограничивается ими. Дополнительно, температура в культуре может поддерживаться на уровне от 20°С до 45°С, и, в частности, от 25°С до 40°С, и культивирование может быть осуществлено в течение от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов, не ограничиваясь ими. Дополнительно, во время культивирования антивспенивающий агент (например полигликолевый эфир жирной кислоты) может быть добавлен для предупреждения образования пены, но не ограничивается им.

Дополнительно, в качестве источника углерода, используемого в среде для культивирования, сахариды и углеводы (например глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза), масла и жиры (например соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирты (например глицерин и этанол), органические кислоты (например уксусная кислота) и т.п. могут быть использованы сами по себе или в комбинации, но источник углерода не ограничивается ими. В качестве источника азота азотсодержащее органическое соединение (например пептон, дрожжевой экстракт, мясная подливка, солодовый экстракт, кукурузный сироп, бобовая мука и мочевина) и неорганическое соединение (например сульфат аммония, хлорида аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и т.п. могут быть использованы сами по себе или в комбинации, но источник азота не ограничивается ими. В качестве источника фосфора дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и натрийсодержащие соли, соответствующие им, могут быть использованы сами по себе или в комбинации, но источник фосфора не ограничивается ими. Дополнительно, среда может включать не заменимые способствующие росту вещества, такие как соль металла (например сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.

МАА, продуцируемые путем культивирования, могут быть секретированы в среду или остаются в клетках.

Используемый здесь термин "среда" относится к культуральной среде для выращивания микроорганизма в соответствии с описанием настоящего изобретения и/или продукту, получаемому после выращивания. Среда представляет собой то, что включает форму, в которую включен микроорганизм, и форму, в которой микроорганизм удаляется из содержащего микроорганизм культурального раствора путем центрифугирования, фильтрования и т.п.

На стадии выделения МАА, продуцируемых на вышеизложенной стадии культивирования в соответствии с описанием настоящего изобретения, желаемые МАА могут быть собраны из культурального раствора с использованием подходящего способа, известного в области техники, в соответствии со способом культивирования. Например может быть использовано центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) и т.п., и желаемые МАА могут быть выделены из культивируемого микроорганизма или среды с использованием подходящего способа, известного в области техники. Стадия выделения МАА может дополнительно включать стадию разделения и/или стадию очистки.

В еще одном аспекте в соответствии с описанием настоящего изобретения предложено применение микроорганизма в соответствии с описанием настоящего изобретения для получения микоспорин-подобной аминокислоты (ММА).

"Микроорганизм" и "микоспорин-подобная аминокислота" являются такими, как описано выше.

[Способ осуществления изобретения]

Далее описание настоящего изобретения будет раскрыто более подробно со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее, эти примеры приведены исключительно для иллюстративных задач, и объем описания не ограничен этими примерами.

Получение рекомбинантного микроорганизма на основе Е. сой, продуцирующего МАА, и продукция МАА с его использованием

Пример 1: Получение штамма, в котором усилена активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилена активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы. В частности, дополнительно вводили ген aroG (2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза; SEQ ID NO: 1 и 2) на основе штамма Е. coli W3110. Матрицы и праймеры, используемые для получения плазмид, представлены в таблице 1 ниже.

После амплификации фрагментов гена путем ПЦР с использованием вышеприведенных матриц и праймеров амплифицированные фрагменты лигировали с вектором pSKH, в котором фрагменты генов fhuA arm 1 и fhuA arm 2 обрабатывали ферментами рестрикции BamH1-SpeI с использованием набора для клонирования In-FusionR HD (Clontech), и полученный вектор был назван pSKH-ΔfhuA. Вследствие делеции renajhuA фаговое инфицирование Е. coli подавлялось.

Фрагмент гена Pn_aroG лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали ферментами рестрикции Spel-EcoRV с использованием набора для клонирования In-Fusion^R HD (Clontech). После разрезания фрагментов гена Ptrc и Pcj1, которые известны как усиленные промоторы, при помощи ферментов рестрикции Spe1-Nde1 и разрушения фрагмента гена aroG ферментами рестрикции Nde1-EcoRV, фрагменты гена Ptrc и aroG или фрагменты гена Pcj1 (Корейский патент №10-620092) и aroG соответственно лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали ферментами рестрикции Spel-EcoRV, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD^R (Clontech). Полученные векторы были названы соответственно pSKH-ΔfhuA-Pn-aroG, pSKH-ΔfhuA-Ptrc-aroG и pSKH-ΔfhuA-Pcjl-aroG.

Вышеприведенные векторы подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе, и затем трансформировали в каждом штамме дикого типа Е. coli W3110 путем электропорации. Каждый трансформированный ген вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссовер), и область плазмиды вырезали из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссовер). Для каждого из трансформированного штамма Е. coli, в котором вторичная рекомбинация завершена, введение гена aroG подтверждали путем ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 (прямой) и 8 (обратный).

Пример 2: Получение вектора, сверхэкспрессирующего полученный из микроводорослей ген биосинтеза шинорина

Основанный на A. variabilis генный кластер для биосинтеза шинорина состоит из четырех генов (Ava_ABCD), который кодирует 2-деметил-4-дезоксигадузолсинтазу, О-метилтрансферазу, C-N-лигазу и нерибосомальную пептид с интетазу. Генный кластер для биосинтеза шинорина идентифицировали с использованием геномной ДНК A. variabilis АТСС29413. Вектор, включающий ген биосинтеза шинорина, полученный из A. variabilis АТСС29413, получали с использованием вектора pECCG117_Pcj1_GFP терминатор. Название вектора, экспрессирующего ген биосинтеза шинорина, и соответствующая матрица и праймеры для получения вектора представлены в таблице 2 ниже.

Фрагменты гена получали с использованием вышеприведенных матрицы и праймеров, и каждый фрагмент гена лигировали с вектором pECCG 117_Pcj1_GFP терминатор, который обрабатывали ферментами рестрикции EcoRY-Xbal, с использованием набора для клонирования In-Fusion^R HD (Clontech). Полученный вектор был назван pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, и успех клонирования и последовательности гена вектора подтверждали путем секвенирования. Нуклеотидная последовательность гена Ava_ABCD представлена в SEQ ID NO: 17.

Пример 3: Оценка способности продуцировать шинорин штаммом, в котором активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы усилена

Плазмиду pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, полученную в примере 2, путем электропорации вводили в каждый из штаммов, полученных в примере 1, в котором усилен ген aroG, и штамм дикого типа W3110, и каждый трансформированный штамм высевали на твердую среду LB. Штаммы выращивали в инкубаторе в течение ночи при 37°С и затем одну платиновую петлю со штаммом инокулировали в 25 мл среды для титрования [состав среды: глюкоза 40 г/л, KH₂PO₄ 0,3 г/л, K₂HPO₄ 0,6 г/л, (NH₄)₂SO₄ 15 г/л, MgSO₄⋅7H₂O 1 г/л, NaCl 2,5 г/л, цитрат натрия 1,2 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, карбонат кальция 40 г/л: рН 7,0], которую инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Получающиеся в результате штаммы анализировали при помощи HPLC (Waters Corp.) и результаты представлены в таблице 3 ниже.

Как представлено в таблице 3 выше, концентрация шинорина продуцируемого в штамме (W3110ΔfhuA::Pn-arcG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD), в котором усилен ген aroG, увеличивалась приблизительно на 20% по сравнению с контрольной группой. В частности, в случае штаммов, в которых усилен ген aroG путем усиления промотора (т.е. W3110ΔfhuA::Ptrc-araG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD и W3110ΔfhuA::Pcj1-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD), концентрация шинорина увеличивалась на величину, составляющую 69% и 94% соответственно.

Пример 4: Получение штамма, в котором усилена активность фосфоенолпируватсинтетазы

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилена активность фосфоенолпируватсинтетазы. В частности, ген pps (фосфоенолпируватсинтетаза; SEQ ID NO: 18 и 19) дополнительно вводили на основе штамма Е. coli W3110. Матрица и праймеры, используемые для получения плазмиды, представлены в таблице 4 ниже.

После амплификации фрагментов гена с использованием вышеприведенных матрицы и праймеров фрагмент гена Pn_pps лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали при помощи ферментов рестрикции Spel-EcoRY, с использованием набора для клонирования m-Fusion^R HD (Clontech). После разрушения фрагментов гена Ptrc и Pcj1, полученных в примере 1, при помощи ферментов рестрикции Spe1-Nde1, и разрушения фрагмента гена pps при помощи ферментов рестрикции NdeI-EcoRV, фрагменты гена. Ptrc и pps или фрагменты тепа. Pcj1 и pps соответственно лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали при помощи ферментов рестрикции Spel-EcoRV, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD^R (Clontech). Полученные векторы были названы pSKH-ΔfhuA-Pn-pps, pSKH-ΔfhuA-Ptrc-pps и pSKH-ΔfhuA-Pcj1-pps, соответственно.

Вышеприведенные векторы подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе, и затем трансформировали в каждый штамм дикого типа Е. coli W3110 путем электропорации. Каждый трансформированный ген вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссовер), и область плазмиды вырезали из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссовер). Для каждого из трансформированных штаммов Е. coli, в котором вторичная рекомбинация завершена, введение гена pps подтверждали путем ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 (прямой) и 21 (обратный).

Пример 5: Оценка способности продуцировать шинорин штаммом, в котором усилена активность фосфоенолпируватсинтетазы

Плазмиду pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, полученную в примере 2, путем электропорации вводили в каждый из штаммов, полученных в примере 4, в которые введен ген pps, и штамм дикого типа W3110, и каждый трансформированный штамм высевали на твердую среду LB. Штаммы выращивали в инкубаторе в течение ночи при 37°С, и одну платиновую петлю со штаммом инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 3, которую затем инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 5 ниже.

Как представлено в таблице 5 выше, концентрация шинорина, продуцируемого в штамме, в котором усилен ген pps, увеличивалась на 41%, и в случае, когда его активность усилена путем замены на сильный промотор, концентрация шинорина увеличивалась на величину, составляющую до 60%, по сравнению с контрольной группой.

Пример 6: Получение штамма, в котором усилена активность транскетолазы

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилена активность транскетолазы. В частности, в штамм Е. coli W3110 вводили ген tktA (транскетолаза; SEQ ID NO: 23 и 24). Матрица и праймеры, используемые для получения плазмиды, представлены в таблице 6 ниже.

После амплификации фрагментовгена путем ПЦР с использованием вышеприведенных матрицы и праймеров фрагмент гена Vn_tktA лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали при помощи ферментов рестрикции Spel-EcoRY, с использованием набора для клонирования In-Fusion^R HD (Clontech). После разрезания фрагментов гена Ptrc и Pcj1, полученных в примере 1, при помощи ферментов рестрикции Spe1, Nde1 и разрушения фрагмента гена tktA при помощи ферментов рестрикции Nde1-EcoRY, фрагменты гена Ptrc и tktA или фрагменты гена Pcj1 и tktA соответственно лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали при помощи ферментов рестрикции Spel-EcoRV, с использованием набора для клонирования ш-Fusion HD^R (Clontech). Полученные векторы названы соответственно pSKH-ΔfhuA-Pn-tktA, pSKH-ΔfhuA-Ptrc-tAtA и pSKH-ΔfhuA-Pcj1-tktA.

Вышеприведенные векторы подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе, и затем трансформировали в каждый штамм дикого типа Е. coli W3110 путем электропорации. Каждый трансформированный ген вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссовер), и область плазмиды вырезали из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссовер). Для каждого из трансформированных штаммов Е. coli, в котором вторичная рекомбинация завершена, введение гена tktA подтверждали путем ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 (прямой) и 26 (обратный).

Пример 7: Оценка способности продуцировать шинорин в штамме, в котором усилена активность транскетолазы

Плазмиду pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, полученную в примере 2, путем электропорации вводили в каждый из штаммов, полученных в примере 6, в который введен ген tktA, и штамм дикого типа W3110, и каждый трансформированный штамм высевали на твердую среду LB. Штаммы выращивали в инкубаторе в течение ночи при 37°С, и одну платиновую петлю с ночной культурой каждого штамма инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 3, которую затем инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 7 ниже.

Как представлено в таблице 7 выше, концентрация шинорина продуцируемого в штамме, в котором усилен ген tktA, увеличивалась на 4,5%, и в случае, когда его активность усилена путем замены на сильный промотор, тогда концентрация шинорина увеличивалась на величину, составляющую до 32%, по сравнению с контрольной группой.

Пример 8: Получение штамма, в котором усилены активности 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилена активность каждой из 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы. В частности, в штамм Е. coli W3110 дополнительно вводили каждый из гена aroG, гена pps и гена tktA. Матрицы и праймеры, используемые для получения плазмид, представлены в таблице 8 ниже.

После амплификации фрагментов гена с использованием вышеприведенных матриц и праймеров каждый фрагмент гена лигировали с вектором pSKH-ΔfhuA, который разрезали при помощи ферментов рестрикции Spel-EcoRY, с использованием набора для клонирования In-Fusion^R HD (Clontech). Полученный вектор назван pSKH-ΔfhuA-Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA.

Вышеприведенный вектор подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательностей генов в векторе и затем путем электропорации трансформировали в штамм дикого типа Е. coli W3110. Трансформированные гены вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссовер), и область плазмиды вырезали из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссовер). Для трансформированных штаммов Е. coli, в которых вторичная рекомбинация завершена, введение генов aroG, pps и tktA подтверждали путем ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 14 (прямой) и 26 (обратный).

Пример 9: Оценка способности продуцировать шинорин в штамме, в котором усилены активности 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, фосфоенолпируватсинтетазы и транскетолазы

Плазмиду pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD, полученную в примере 2, путем электропорации вводили в каждый из штаммов, полученных в примере 8, в который введены гены aroG, pps и tktA, и штамм дикого типа W3110, и каждый трансформированный штамм высевали на твердую среду LB. Штаммы выращивали в инкубаторе в течение ночи при 37°С, и одну платиновую петлю с ночной культурой каждого штамма инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 3, которую затем инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 9 ниже.

Как представлено в таблице 9 выше, концентрация шинорина, продуцируемого в штамме, в котором три типа генов (т.е. aroG, pps и tktA) комбинированы и усилены, увеличивалась на 267% по сравнению с контрольной группой. Этот результат является неожиданным, демонстрируя улучшение, превосходящее ожидание по сравнение с суммой максимальных увеличений, обнаруженных при замене промотора каждого гена на сильный промотор. То есть, последнее подтверждает то, что когда комбинируют три гена (т.е. aroG, pps и tktA), тогда возможно продуцировать шинорин в более высокой концентрации.

Пример 10: Получение штамма, в котором инактивирована активность 3-дегидрохинатдегидратазы

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых инактивирована активность 3-дегидрохинатдегидратазы (aroD).

В частности, ген резистентности к хлорамфениколу плазмиды pKD3 использовали в качестве маркера встраивания гена, и кассету с делецией по aroD, которая включает часть гена aroD и ген резистентности к хлорамфениколу пазмиды pKD3, получали путем ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 32 (прямой) и 33 (обратный). Компетентные клетки получали путем трансформации штамма дикого типа Е. coli W3110 и штамма, полученного в примере 8, в который введены гены aroG, pps и tktA, плазмидой pKD46, включающей ген рекомбиназы фага лямбда-ред, а затем путем индукции экспрессии соответствующего гена с использованием арабинозы. После введения кассеты с делецией по aroD в компетентные клетки путем электропорации получающиеся в результате компетентные клетки высевали на твердую среду LB, содержащую 30 мг/л хлорамфеникола. Полученный таким образом штамм подвергали ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 34 (прямой) и 35 (обратный), и делецию по гену aroD подтверждали путем обнаружения амплифицированного фрагмента 1300 п.о.

Пример 11: Оценка способности продуцировать шинорин штаммом, в котором инактивир ована 3 -дегидрохинатдегидр атаза

Плазмиду pECCG117 Pcj1_Ava_ABCD, полученную в примере 2, путем электропорации вводили в штамм, полученный в примере 10, в котором осуществлена делеция по гену aroD, и получающийся в результате штамм высевали на твердую среду LB. Штамм выращивали в инкубаторе в течение ночи при 37°С, и одну платиновую петлю со штаммом инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 3, которую инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 10 ниже.

Как представлено в таблице 10 выше, концентрация шинорина, продуцируемого в штамме, в котором ген aroD дополнительно подвергнут делеции, увеличивалась на 66% по сравнению со штаммом, продуцирующим шинорин, в котором усилены гены aroG, pps и tktA. Штамм W3110ΔfhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA/pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD, который представляет собой штамм, в котором усилены гены aroG, pps и tktA, назван СВ06-0020 и депонирован в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 14 февраля 2018 года в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM) и под идентификационным номером КССМ12224Р.

Получение рекомбинантного микроорганизма на основе Corynebacterium gtutamicum, продуцирующего МАА, и продукция МАА с его использованием

Пример 12: Получение вектора, в котором усилена активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы, и оценка его способности продуцировать шинорин

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилена активность 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы. В частности, ген aroG (2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолаза; SEQ ID NO: 36 и 37) дополнительно вводили на основе штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032. Матрица и праймеры, используемые для получения плазмиды, представлены в таблице 11 ниже.

После получения фрагментов гена с использованием вышеприведенных матрицы и праймеров каждый фрагмент гена лигировали с векторами ECCG 117 и pECCG 117_Pcj7_GFP_терминатор (Корейский патент №10-620092, p117-cj7-gfp), которые обрабатывали ферментами рестрикции EcoRV/XbaI, с использованием набора для клонирования m-Fusion^R HD (Clontech). Полученные векторы названы pECCG117 Pn_cg1_aroG и pECCG117 Pcj7_cg1_aroG, соответственно. Вышеприведенные векторы подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе.

Во-первых, поскольку микроорганизм рода Corynebacterium не может продуцировать шинорин, получали штамм, в который введен путь биосинтеза шинорина. В частности, ген Ava_ABCD подвергали ПЦР с использованием pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD в качестве матрицы вместе с парой праймеров SEQ ID NO: 42 (прямой) и 43 (обратный). pDZTn_Ava_ABCD получали путем лигирования приблизительно 7 т.п.о. фрагмента ПЦР с вектором pDZTn (WO 2009-125992А), который обрабатывали ферментом рестрикции NdeI, с использованием набора для клонирования In-Fusion^R HD (Clontech). Затем фрагмент промотора O2 (Корейский патент №10-1632642) подвергали ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 44 (прямой) и 45 (обратный), и лигировали в pDZTn_Ava_ABCD, который обрабатывали ферментом рестрикции NdeI, с использованием набора для клонирования ш-Fusion HD (Clontech), таким образом получая pDZTn_PO2_Ava_ABCD.

Рекомбинантную плазмиду трансформировали в штамм дикого типа АТСС13032 путем электропорации (van der Rest et al. 1999) и плазмиду вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссовер), и область плазмиды вырезали из хромосомы путем вторичной рекомбинации (кроссовер).

Для каждого из трансформированных штаммов Corynebacterium glutamicum, в котором вторичная рекомбинация завершена, введение гена Ava_ABCD подтверждали путем ПЦР с использованием специфической для гена пары праймеров SEQ ID NO: 42 (прямой) и 43 (обратный). Полученный штамм назван Corynebacterium glutamicum 13032 ΔN1021PO2_Ava_ABCD.

Каждый из векторов pECCG117_Pn_cgl aroG и pECCG117_Pcj7_cgl aroG путем электропорации трансформировали в штамм Corynebacterium glutamicum 13032 ΔN1021_PO2_Ava_ABCD.

Полученные выше штаммы и контрольную группу Corynebacterium glutamicum АТСС13032 (cgl 13032) выращивали в течение ночи в твердой среде BHIS, содержащей канамицин, и одну платиновую петлю со штаммом инокулировали в 25 мл среды для титрования [состав среды: глюкоза 40 г/л, KH₂PO₄ 1 г/л, (NH₄)₂SO₄ 10 г/л, MgSO₄7H₂O 5 г/л, NaCl 5 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, карбонат кальция 30 г/л: рН 7,0], которую инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 12 ниже.

Как представлено в таблице 12 выше, когда уровень экспрессии aroG увеличивался в штамме, содержащем ген биосинтеза шинорина, тогда концентрация шинорина увеличивалась на 39%. В частности, когда промотор был усилен, тогда это подтверждало то, что концентрация шинорина может увеличиваться на величину, составляющую до 80%.

Пример 13: Получение вектора, в котором усилены активности фосфоенолпируватсинтетазы/транскетолазы, и оценка его способности продуцировать шинорин

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Corynebacterium glutamicum, в которых усилена активность tkt или pps. В частности, дополнительно вводили tkt (транскетолаза; SEQ ID NO: 95 и 96) или pps (фосфоенолпируватсинтетаза; SEQ ID NO: 97 и 98) на основе штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032. Матрица и праймеры, используемые для получения плазмиды, представлены в таблице 13 ниже.

Векторы получали путем лигирования фрагментов гена, которые получали при помощи технологии ПЦР, в которой матрица соответствовала комбинации праймеров, с векторами pECCG117, pECCG117_Ptrc_GFP_терминатор и pECCG117_Pcj7_GFP терминатор, которые обрабатывали ферментами рестрикции EcoRY/XbaI, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD^R(Clontech). Полученные векторы названы pECCG117-Pn-tkt/pECCG117-Pcj7-tkt и pECCG117-Ptrc-pps/pECCG117-Pcj7-pps соответственно. Вышеприведенные векторы подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе и затем путем электропорации трансформировали в штамм Corynebacterium glutamicum 13032 ΔN1021_PO2_Ava_ABCD. Каждый штамм выращивали на содержащей канамицин твердой среде BHIS в течение ночи, и платиновую петлю со средой инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 12, которую инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 14 ниже.

Как представлено в таблице 14 выше, подтверждено, что когда ген tkt или ген pps усилен, тогда продукция шинорина увеличивалась на величину, составляющую до 57% или 72% соответственно.

Пример 14: Получение штамма, в котором усилены активности 2-дегидро-3-дезоксифосфогептонатальдолазы/фосфоенолпируватсинтетазы/тр анскетолазы, и его оценка

Для увеличения способности микроорганизма продуцировать МАА получали штаммы Е. coli, в которых усилены активности генов aroG, pps и tkt, и для подтверждения большей продукции МАА дополнительно инактивировали 3-дегидрохинатдегидратазу (aroD). В частности, для усиления генов aroG, pps и tkt получали плазмиду pDZ-ΔaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA. Матрицы и праймеры, используемые для получения плазмиды pDZ-ΔaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA, представлены в таблице 15 ниже.

Во-первых, для получения штамма Corynebacterium glutamicum, в котором осуществлена делеция по гену aroD (SEQ ID NO: 89 и 90), получали плазмиду pDZ-AaroD, в которой открытая рамка считывания гена aroD подвергнута внутренней делеции. Внутреннюю делецию гена в плазмиде pDZ-AaroD осуществляли путем проведения перекрестной ПЦР с использованием геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы вместе с SEQ ID NO: 91 и 92 и SEQ ID NO: 93 и 94 в качестве пары прямого и обратного праймеров в последующим введением получающихся в результате фрагментов гена в вектор pDZ.

Затем каждый фрагмент генов aroG, pps и tkt амплифицировали при помощи ПЦР с использованием матриц и праймеров, представленных в таблице 15 выше, и затем вводили в вектор pDZ-AaroD, соответственно расщепленный при помощи фермента рестрикции SpeI. Вышеприведенные два типа векторов подтверждали путем секвенирования в отношении успеха клонирования и последовательности гена в каждом векторе и затем трансформировали путем электропорации в штамм Corynebacterium glutamicum 13032ΔN1021_PO2_Ava_ABCD. Каждый штамм выращивали на содержащей канамицин твердой среде BHIS в течение ночи, и платиновую петлю с ночной культурой каждого штамма инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с примером 12, которую инкубировали в инкубаторе при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 16 ниже.

Как представлено в таблице 16 выше, концентрация шинорина, продуцируемого в штамме, в котором усилены три типа генов {aroG, pps и tktA), увеличивалась на приблизительно 25%. Подтверждено, что даже в штамме, в котором способность продуцировать шинорин увеличена путем делеции по гену aroD, шинорин может продуцироваться в высокой концентрации путем комбинации трех типов генов. Дополнительно, можно интерпретировать, что когда ген aroD дополнительно инактивирован в штамме, в котором комбинированы три типа генов, тогда шинорин может продуцироваться при еще более высокой концентрации.

Получение рекомбинантного микроорганизма на основе дрожжей, продуцирующего МАА, и продукция МАА с его использованием

Пример 15: Получение штамма Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), продуцирующего шинорин

Для использования штамма Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) в качестве штамма, продуцирующего шинорин, ген биосинтеза шинорина, полученный из А. variabilis АТСС29413, вводили в вектор для экспрессии в дрожжах. Гены Ava_A и Ava_B встраивали в вектор pRS-413 с использованием промотора GPD. В частности, области pGPD-Ava_A и pGPD-Ava_B лигировали при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами. Векторы и продукты ПЦР обрабатывали ферментами рестрикции BamIIl и SalI и затем лигировали с использованием лигазы Т4 для получения вектора pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_В.

Затем гены Ava_A и Ava_B встраивали в вектор pRS-414 с использованием промотора GPD. В частности, области pGPD-Ava_С и pGPD-Ava_D лигировали при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами, и затем векторы и продукты ПЦР обрабатывали BamHI и SalI и лигировали с использованием лигазы Т4 для получения вектора pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D. Праймеры и матрицы ДНК, используемые для получения вектора, представлены в таблице 17 ниже.

Вектор pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B и вектор pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D (S. cerevisiae CEN.PK-1D) путем трансформации при помощи ацетата лития, и затем подтверждали продукцию шинорина. Этот штамм высевали на синтетической полной (SC) твердой среде, из которой исключены Trp и His (т.е. ауксотрофные маркеры), и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 30°С Одну платиновую петлю со штаммом, выращенным в течение ночи в синтетической полной (SC) твердой среде, из которой исключены Trp и His, инокулировали в 25 мл среды для титрования в соответствии с таблицей 18, и затем выращивали в инкубаторе при 30°С при 150 об./мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 19 ниже.

В качестве результата эксперимента подтвердили, что штамм дикого типа Saccharomyces cerevisiae, не продуцирующий шинорин, продуцировал 331 мг/л шинорина вследствие введения гена биосинтеза шинорина.

Пример 16: Увеличение продукции шинорина путем усиления TKL1 (транскетолазы) Saccharomyces cerevisiae

Для увеличения способности продуцировать МАА получали штамм Saccharomyces cerevisiae, в котором усилена активность TKL1. Для этой задачи экспрессию гена TKL1 усиливали путем клонирования гена TKL1 (SEQ ID NO: 110 и 123) в векторы pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF.

Промотор GPD, включенный в вектор pRS-415-pGPD, представляет собой промотор генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и изозима 3 (TDH3), и он включает последовательность от -674 п.о. до -1 п.о. относительно кодона инициации ORF гена THD3.

Промотор ADH, включенный в вектор pRS-415-pADH, представляет собой промотор гена алкогольдегидрогеназы (ADH1), и он включает последовательность от -1500 п.о. до -1 п.о. относительно кодона инициации ORF гена.ADH1.

Промотор TEF, включенный в вектор pRS-415-pTEF, представляет собой промотор фактора элонгации трансляции гена EF-1 альфа (TEFL), и он включает последовательность от -500 п. о. до -1 п. о. относительно кодона инициации ORF гена TEFL

В частности, ген TEF1 подвергали ПЦР с использованием праймеров в соответствии с таблицей 20 ниже, и продукты ПЦР и векторы pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SalI, и затем лигировали с использованием лигазы Т4 с получением векторов pRS-415-pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1 и pRS-415-pTEF-TKL1.

Затем, плазмиду для биосинтеза шинорина, полученную в примере 15, вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D вместе с pRS-415-pGPD-TKL1, pRS-415-pADH-TKL1 и pRS-415-pTEF-TKL1, и каждый получающийся в результате штамм высевали на синтетической полной твердой среде (SC), из которой исключены Trp, Ura и His, и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 30°С Одну платиновую петлю со штаммом, выращиваемым в течение ночи в синтетической полной твердой среде (SC), из которой исключены Trp, Ura и His, инокулировали в 25 мл среды для титрования, и затем выращивали в инкубаторе при 30°С при 150 об./мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 21 ниже.

Как представлено в таблице 21 выше, подтверждено, что продукция шинорина увеличивалась в штамме, в котором экспрессия гена TKL1 усилена с использованием промотора GPD, по сравнению со штаммом WT. Дополнительно, также подтверждено, что по мере усиления силы промотора (т.е. pGPD>pTEF>pADH) увеличивается продукция шинорина.

Пример 17: Увеличение продукции шинорина путем усиления ARQ4 (3-дезокси-D-арабино-гептулозонат-7-фосфат (DAHP) синтазы) в Saccharomyces cerevisiae

Для увеличения способности продуцировать МАА получали штаммы Saccharomyces cerevisiae, в которых усилена активность ARO4. Для этой задачи использовали стратегию, при которой экспрессию гена ARO4 увеличивали путем клонирования гена AR04 (SEQ ID NO: 111 и 124) в векторы pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF. В частности, ген ARO4 подвергали ПЦР с использованием праймеров в соответствии с таблицей 22 ниже, и продукты ПЦР векторов ARO4 и pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SalI, и затем лигировали с использованием лигазы Т4 с получением векторов pRS-415-pGPD-ARO4, pRS-415-pADH-ARO4 и pRS-415-pTEF-ARO4.

Затем, плазмиду для биосинтеза шинорина, полученную в примере 15, вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D вместе с pRS-415-pGPD-ARO4, pRS-415-pADH-ARO4 и pRS-415-pTEF-ARO4, и каждый получающийся в результате штамм высевали на синтетическую полную (SC) твердую среду, из которой исключены Trp, Ura и His, и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 30°С. Одну платиновую петлю со штаммом, выращиваемым в течение ночи в синтетической полной (SC) твердой среде, из которой исключены Trp, Ura и His, инокулировали в 25 мл среды для титрования, и затем выращивали в инкубаторе при 30°С при 150 об./мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 23 ниже.

Как представлено в таблице 23 выше, подтверждено, что продукция шинорина увеличилась на 187% в штамме, в котором усилена экспрессия гена ARO4 с использованием промотора GPD по сравнению со штаммом WT.

Пример 18: Увеличение продукции шинорина путем усиления фосфоенолпируватсинтетазы (pps) в Saccharomyces cerevisiae

Для увеличения способности продуцировать МАА получали штаммы Saccharomyces cerevisiae, в которых усилена активность pps. Для этой задачи использовали стратегию, при которой экспрессия гена pps усилена путем клонирования гена pps в векторы pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF, и усилена экспрессия гена pps.

В частности, ген pps подвергали ПЦР с использованием праймеров в соответствии с таблицей 24 ниже и продукты ПЦР векторов pps и pRS-415-pGPD, pRS-415-pADH и pRS-415-pTEF обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SalI и затем лигировали с использованием лигазы Т4 с получением векторов pRS-415-pGPD-pps, pRS-415-pADH-pps npRS-415-pTEF-pps.

Затем плазмиду для биосинтеза шинорина, полученную в примере 15, вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D вместе с pRS-415-pGPD-pps, pRS-415-pADH-pps и pRS-415-pTEF-pps, и каждый получающийся в результате штамм высевали на синтетической полной (SC) твердой среде, из которой исключены Trp, Ura и His, и выращивали в течение ночи при 30°С в инкубаторе. Одну платиновую петлю со штаммом, выращиваемым в течение ночи на синтетической полной (SC) твердой среде, из которой исключены Trp, Ura и His, инокулировали в 25 мл среды для титрования, и затем выращивали в инкубаторе при 30°С при 150 об./мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 25 ниже.

Как представлено в таблице 25 выше, подтверждено, что продукция шинорина увеличивалась на 70% в штамме, в котором происходит сверэкспрессия гена pps, по сравнению со штаммом WT. Дополнительно, также подтвердили, что по мере увеличения силы промотора (т.е. pGPD>pTEF>pADH) увеличивается продукция шинорина.

Пример 19: Увеличение продукции шинорина путем усиления TKL1, усиления ARO4 и введения гена pps в штамм Saccharomyces cerevisiae

На основе результатов примеров 16, 17 и 18 гены TKL1, ARO4 и pps (Е. coli) отобраны в качестве эффективных факторов, которые оказывают влияние на биосинтез шинорина в Saccharomyces cerevisiae, и сделаны попытки увеличить биосинтез шинорина путем одновременного усиления этих трех типов генов. Для введения этих трех типов генов получали векторы pRS-415-pGVD-TKLl-pGVD-ARO4 и pRS-416-pGPD-pps. В частности, после связывания областей pGFD-TKL1 и pGFD-ARO4 при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами векторы и продукты ПЦР обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SalI, и затем лигировали с использованием лигазы Т4 для получения вектора pRS-415-pGRD-TKL1-pGPD-ARO4.

Затем, ген pps, полученный из Е. coli, подвергали ПЦР. Продукты ПЦР гена pps и вектор pRS-416-pGPD обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SailI и затем лигировали с использованием лигазы Т4 для получения вектора pRS-416-pGPD-pps. Праймеры и матрицы ДНК, используемые для получения векторов, представлены в таблице 26 ниже.

Затем, плазмиду для биосинтеза шинорина, полученную в примере 15, вводили в штамм Saccharomyces cerevisiae CEN.PK-1D вместе с векторами pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4 и pRS-416-pGPD-pps, и каждый получающийся в результате штамм высевали на синтетическую полную твердую среду (SC), из которой исключены Leu, Trp, Ura и His, и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 30°С Одну платиновую петлю со штаммом, выращенным в течение ночи в синтетической полной твердой среде (SC), из которой исключены Leu, Trp, Ura и His, инокулировали в 25 мл среды для титрования, и затем выращивали в инкубаторе при 30°С при 150 об./мин в течение 24 часов. Результаты представлены в таблице 27 ниже.

Как представлено в таблице 27 выше, подтверждено, что продукция шинорина значительно увеличивалась на 230% в штамме, в котором осуществляется сверхэкспрессия трех типов эффективных генов (т.е. pps, TKL1 и ARO4), по сравнению со штаммом WT.

В этом описании изобретения подробные изложения содержания, которое может полностью быть понято и принято специалистом в данной области техники, опущены. Дополнительно к конкретным воплощениям, изложенным в этом описании изобретения, возможны различные модификации без изменения технической сущности или важных составляющих описания настоящего изобретения. Таким образом, описание настоящего изобретения может быть реализовано образом, отличающимся от конкретно описанного и подкрепленного примерами в данном описании изобретения, который может быть понятен специалистам в данной области техники.

--->

Последовательности

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> A microorganism for producing a Mycosporine-like amino acid and a

method for preparing a Mycosporine-like amino acid using the same

<130> OPA18547-PCT

<150> KR10-2018-0022185

<151> 2018-02-23

<160> 124

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Escherichia coli W3110

<400> 1

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 2

Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala

20 25 30

Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys

35 40 45

Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His

50 55 60

Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu

85 90 95

Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His

100 105 110

Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys

115 120 125

Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly

145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala

165 170 175

Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys

195 200 205

Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser

210 215 220

Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala

245 250 255

Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser

260 265 270

Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln

275 280 285

Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His

290 295 300

Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr

305 310 315 320

Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly

340 345 350

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fhuA arm 1_F

<400> 3

ccaagcgacg cccaacctgc catcatggcg cgttccaaaa ctgctcagc 49

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fhuA arm 1_R

<400> 4

tatcctcgag actagtgagc tcctttcagc ggttcggtgg 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fhuA arm 2_F

<400> 5

ctagtctcga ggatatcgac cacaccctgc tgaccggtgt 40

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fhuA arm 2_R

<400> 6

atagaatacc aattggcatg ctttttagaa acggaaggtt gcggttgc 48

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn_aroG_F

<400> 7

aaaggagctc actagtagga tgctcctgtt atgg 34

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn_aroG_R

<400> 8

cagggtgtgg tcgatatctt acccgcgacg cgcttt 36

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc_F

<400> 9

aaaggagctc actagtccgc ttgctgcaac tctc 34

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc_R

<400> 10

tggacgatac tcatatgttt cctgtgtgaa attgttatcc 40

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1_F

<400> 11

aaaggagctc actagtaccg cgggcttatt ccatt 35

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1_R

<400> 12

atctatagtc tgcatatgtt aatctcctag attgggtttc a 41

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroG_F

<400> 13

taggagatta acatatgaat tatcagaacg ac 32

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> certification primer

<400> 14

ggaacgctca gattgcgt 18

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_ABCD_F

<400> 15

acaatttcac acaggaaaga tatcatgagt atcgtccaag caaag 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_ABCD_R

<400> 16

ctcatccgcc aaaacagctc tagattatga attattttcc agaca 45

<210> 17

<211> 6461

<212> DNA

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 17

atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60

gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120

ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180

cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240

tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300

gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360

attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420

attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480

catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540

ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600

aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660

ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720

cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780

ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840

cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900

atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960

agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020

actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080

ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140

cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200

tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260

tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320

gaaagagaag gctacgcaaa taatcggaca ctaattgtct ttaattttga attttgaatt 1380

ttgaattttg aattggagcg aagcgacttg acaaatgtga ttgtccaacc aacagctaga 1440

cctgttacac cattgggaat tttaaccaag cagttagaag ccatagtcca agaggttaag 1500

caacatccag atttacctgg ggaattgata gcaaacatcc atcaggcttg gcgtttagcc 1560

gcaggtatag acccttattt ggaagaatgc accactccag aatctcctga actcgctgca 1620

ttggcaaaaa ccacagccac cgaagcctgg ggagaacact tccacggagg tacaaccgtc 1680

cgtcctctag aacaagagat gctttctggt catatcgaag gacaaacctt aaagatgttt 1740

gttcacatga ccaaagctaa aaaagtctta gaaattggga tgtttaccgg ttattcggcg 1800

ctggcgatgg cggaagcatt accagaggat ggactgcttg tggcttgtga agttgaccct 1860

tacgcggcgg aaattggaca gaaagccttt caacaatctc cccacggtgg aaagattcgt 1920

gtggaattgg atgcagcctt agcaactctt gataagttag cagaagctgg ggagtctttt 1980

gacttggtat ttatcgacgc agataaaaaa gagtatgtag cctattttca caagttgcta 2040

ggtagcagtt tgttagcacc agatggcttt atttgtgtag ataacacctt attacaaggg 2100

gaagtttatc taccagcaga ggaacgtagc gtcaatggtg aagcgatcgc gcaatttaat 2160

catacagtag ctatagaccc ccgtgtagaa caggttttgt tgccgttgcg agatggttta 2220

acaattatcc gcagaataca accttaattg tccaatcgac tatggcacaa tcccttcccc 2280

tttcttccgc acctgctaca ccgtctcttc cttcccagac gaaaatagcc gcaattatcc 2340

aaaatatctg cactttggct ttgttattac tagcattgcc cattaatgcc accattgttt 2400

ttatatcctt gttagtcttc cgaccgcaaa aggtcaaagc agcaaacccc caaaccattc 2460

ttatcagtgg cggtaagatg accaaagctt tacaactagc aaggtcattc cacgcggctg 2520

gacatagagt tgtcttggtg gaaacccata aatactggtt gactggtcat cgtttttccc 2580

aagcagtgga taagttttac acagtccccg caccccagga caatccccaa gcttacattc 2640

aggctttggt agatatcgtc aaacaagaaa acatcgatgt ttatattccc gtcaccagtc 2700

cagtgggtag ctactacgac tcattagcca aaccagagtt atcccattat tgcgaagtgt 2760

ttcactttga cgcagatatt acccaaatgt tggatgataa atttgcgttg acacaaaaag 2820

cgcgatcgct tggtttatca gtacccaaat cctttaaaat tacctcacca gaacaagtca 2880

tcaacttcga tttttctgga gagacacgta aatacatcct caaaagcatt ccctacgact 2940

cagtgcggcg gttggactta accaaactcc cctgtgctac tccagaggaa acagcagcat 3000

tcgtcagaag tttgccaatt actcccgaaa aaccgtggat tatgcaggaa tttatccccg 3060

gtaaggaatt ctgcacccat agcaccgttc ggaatgggga actcagactg cattgctgtt 3120

gcgaatcttc agccttccaa gttaattatg agaatgtaaa taacccgcaa attaccgaat 3180

gggtacagca ttttgtcaag gaactgaaac tgacaggaca gatttccttt gactttatcc 3240

aagccgaaga cggaacagtt tacgccatcg agtgtaaccc ccgcacacat tcagcaatta 3300

ccacatttta cgaccacccc caggtagcag aagcgtactt gagtcaagca ccgacgactg 3360

aaaccataca accactaacg acaagcaagc ctacctattg gacttatcac gaagtttggc 3420

gtttaactgg tatccgttct ttcacccagt tgcaaagatg gctggggaat atttggcgcg 3480

ggactgatgc gatttatcag ccagatgacc ccttaccgtt tttgatggta catcattggc 3540

aaattcccct actgttattg aataatttgc gtcgtcttaa aggttggacg cggatagatt 3600

tcaatattgg gaagttggtg gaattggggg gagattagtt tttaaacgca gagggacgct 3660

gaggttagcg cagcgaaaag ttctggagga gggtttccct ccgtaggaaa cttttcaaga 3720

gagagggacg cggagtgtgt tttctctgcg tctctgcgtg agaaattttt tattattgag 3780

caaagttaga agatatgcag actatagatt ttaatattcg taagttactt gtagagtgga 3840

acgcgaccca cagagattat gatctttccc agagtttaca tgaactaatt gtagctcaag 3900

tagaacgaac acctgaggcg atcgctgtca cctttgacaa gcaacaacta acttatcaag 3960

aactaaatca taaagcaaac cagctaggac attatttaca aacattagga gtccagccag 4020

aaaccctggt aggcgtttgt ttagaacgtt ccttagaaat ggttatctgt cttttaggaa 4080

tcctcaaagc tgggggtgct tatgttccta ttgaccctga atatcctcaa gaacgcatag 4140

cttatatgct agaagattct caggtgaagg tactactaac tcaagaaaaa ttactcaatc 4200

aaattcccca ccatcaagca caaactatct gtgtagatag ggaatgggag aaaatttcca 4260

cacaagctaa taccaatccc aaaagtaata taaaaacgga taatcttgct tatgtaattt 4320

acacctctgg ttccactggt aaaccaaaag gtgcaatgaa cacccacaaa ggtatctgta 4380

atcgcttatt gtggatgcag gaagcttatc aaatcgattc cacagatagc attttacaaa 4440

aaaccccctt tagttttgat gtttccgttt gggagttctt ttggacttta ttaactggcg 4500

cacgtttggt aatagccaaa ccaggcggac ataaagatag tgcttacctc atcgatttaa 4560

ttactcaaga acaaatcact acgttgcatt ttgtcccctc aatgctgcaa gtgtttttac 4620

aaaatcgcca tgtaagcaaa tgcagctctc taaaaagagt tatttgtagc ggtgaagctt 4680

tatctataga tttacaaaat agatttttcc agcatttgca atgtgaatta cataacctct 4740

atggcccgac agaagcagca attgatgtca cattttggca atgtagaaaa gatagtaatt 4800

taaagagtgt acctattggt cgtcccattg ctaatactca aatttatatt cttgatgccg 4860

atttacaacc agtaaatatt ggtgtcactg gtgaaattta tattggtggt gtaggggttg 4920

ctcgtggtta tttgaataaa gaagaattga ccaaagaaaa atttattatt aatccctttc 4980

ccaattctga gtttaagcga ctttataaaa caggtgattt agctcgttat ttacccgatg 5040

gaaatattga atatcttggt agaacagatt atcaagtaaa aattcggggt tatagaattg 5100

aaattggcga gattgaaaat gttttatctt cacacccaca agtcagagaa gctgtagtca 5160

tagcgcggga tgataacgct caagaaaaac aaatcatcgc ttatattacc tataactcca 5220

tcaaacctca gcttgataat ctgcgtgatt tcctaaaagc aaggctacct gattttatga 5280

ttccagccgc ttttgtgatg ctggagcatc ttcctttaac tcccagtggt aaagtagacc 5340

gtaaggcatt acctaagcct gatttattta attatagtga acataattcc tatgtagcgc 5400

ctcggaatga agttgaagaa aaattagtac aaatctggtc gaatattctg catttaccta 5460

aagtaggtgt gacagaaaac tttttcgcta ttggtggtaa ttccctcaaa gctctacatt 5520

taatttctca aattgaagag ttatttgcta aagagatatc cttagcaaca cttttaacaa 5580

atccagtaat tgcagattta gccaaggtta ttcaagcaaa caaccaaatc cataattcac 5640

ccctagttcc aattcaacca caaggtaagc agcagccttt cttttgtata catcctgctg 5700

gtggtcatgt tttatgctat tttaaactcg cacaatatat aggaactgac caaccatttt 5760

atggcttaca agctcaagga ttttatggag atgaagcacc cttgacgcga gttgaagata 5820

tggctagtct ctacgtcaaa actattagag aatttcaacc ccaagggcct tatcgtgtcg 5880

gggggtggtc atttggtgga gtcgtagctt atgaagtagc acagcagtta catagacaag 5940

gacaagaagt atctttacta gcaatattag attcttacgt accgattctg ctggataaac 6000

aaaaacccat tgatgacgtt tatttagttg gtgttctctc cagagttttt ggcggtatgt 6060

ttggtcaaga taatctagtc acacctgaag aaatagaaaa tttaactgta gaagaaaaaa 6120

ttaattacat cattgataaa gcacggagcg ctagaatatt cccgcctggt gtagaacgtc 6180

aaaataatcg ccgtattctt gatgttttgg tgggaacttt aaaagcaact tattcctata 6240

taagacaacc atatccagga aaagtcactg tatttcgagc cagggaaaaa catattatgg 6300

ctcctgaccc gaccttagtt tgggtagaat tattttctgt aatggcggct caagaaatta 6360

agattattga tgtccctgga aaccattatt cgtttgttct agaaccccat gtacaggttt 6420

tagcacagcg tttacaagat tgtctggaaa ataattcata a 6461

<210> 18

<211> 2379

<212> DNA

<213> Escherichia coli W3110

<400> 18

atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg ctttggtata accaactcgg catgaatgat 60

gtagacaggg ttgggggcaa aaatgcctcc ctgggtgaaa tgattactaa tctttccgga 120

atgggtgttt ccgttccgaa tggtttcgcc acaaccgccg acgcgtttaa ccagtttctg 180

gaccaaagcg gcgtaaacca gcgcatttat gaactgctgg ataaaacgga tattgacgat 240

gttactcagc ttgcgaaagc gggcgcgcaa atccgccagt ggattatcga cactcccttc 300

cagcctgagc tggaaaacgc catccgcgaa gcctatgcac agctttccgc cgatgacgaa 360

aacgcctctt ttgcggtgcg ctcctccgcc accgcagaag atatgccgga cgcttctttt 420

gccggtcagc aggaaacctt cctcaacgtt cagggttttg acgccgttct cgtggcagtg 480

aaacatgtat ttgcttctct gtttaacgat cgcgccatct cttatcgtgt gcaccagggt 540

tacgatcacc gtggtgtggc gctctccgcc ggtgttcaac ggatggtgcg ctctgacctc 600

gcatcatctg gcgtgatgtt ctccattgat accgaatccg gctttgacca ggtggtgttt 660

atcacttccg catggggcct tggtgagatg gtcgtgcagg gtgcggttaa cccggatgag 720

ttttacgtgc ataaaccgac actggcggcg aatcgcccgg ctatcgtgcg ccgcaccatg 780

gggtcgaaaa aaatccgcat ggtttacgcg ccgacccagg agcacggcaa gcaggttaaa 840

atcgaagacg taccgcagga acagcgtgac atcttctcgc tgaccaacga agaagtgcag 900

gaactggcaa aacaggccgt acaaattgag aaacactacg gtcgcccgat ggatattgag 960

tgggcgaaag atggccacac cggtaaactg ttcattgtgc aggcgcgtcc ggaaaccgtg 1020

cgctcacgcg gtcaggtcat ggagcgttat acgctgcatt cacagggtaa gattatcgcc 1080

gaaggccgtg ctatcggtca tcgcatcggt gcgggtccgg tgaaagtcat ccatgacatc 1140

agcgaaatga accgcatcga acctggcgac gtgctggtta ctgacatgac cgacccggac 1200

tgggaaccga tcatgaagaa agcatctgcc atcgtcacca accgtggcgg tcgtacctgt 1260

cacgcggcga tcatcgctcg tgaactgggc attccggcgg tagtgggctg tggagatgca 1320

acagaacgga tgaaagacgg tgagaacgtc actgtttctt gtgccgaagg tgataccggt 1380

tacgtctatg cggagttgct ggaatttagc gtgaaaagct ccagcgtaga aacgatgccg 1440

gatctgccgt tgaaagtgat gatgaacgtc ggtaacccgg accgtgcttt cgacttcgcc 1500

tgcctaccga acgaaggcgt gggccttgcg cgtctggaat ttatcatcaa ccgtatgatt 1560

ggcgtccacc cacgcgcact gcttgagttt gacgatcagg aaccgcagtt gcaaaacgaa 1620

atccgcgaga tgatgaaagg ttttgattct ccgcgtgaat tttacgttgg tcgtctgact 1680

gaagggatcg cgacgctggg tgccgcgttt tatccgaagc gcgtcattgt ccgtctctct 1740

gattttaaat cgaacgaata tgccaacctg gtcggtggtg agcgttacga gccagatgaa 1800

gagaacccga tgctcggctt ccgtggcgcg ggccgctatg tttccgacag cttccgcgac 1860

tgtttcgcgc tggagtgtga agcagtgaaa cgtgtgcgca acgacatggg actgaccaac 1920

gttgagatca tgatcccgtt cgtgcgtacc gtagatcagg cgaaagcggt ggttgaagaa 1980

ctggcgcgtc aggggctgaa acgtggcgag aacgggctga aaatcatcat gatgtgtgaa 2040

atcccgtcca acgccttgct ggccgagcag ttcctcgaat atttcgacgg cttctcaatt 2100

ggctcaaacg atatgacgca gctggcgctc ggtctggacc gtgactccgg cgtggtgtct 2160

gaattgttcg atgagcgcaa cgatgcggtg aaagcactgc tgtcgatggc tatccgtgcc 2220

gcgaagaaac agggcaaata tgtcgggatt tgcggtcagg gtccgtccga ccacgaagac 2280

tttgccgcat ggttgatgga agaggggatc gatagcctgt ctctgaaccc ggacaccgtg 2340

gtgcaaacct ggttaagcct ggctgaactg aagaaataa 2379

<210> 19

<211> 792

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 19

Met Ser Asn Asn Gly Ser Ser Pro Leu Val Leu Trp Tyr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly

35 40 45

Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly

50 55 60

Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile

85 90 95

Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr

100 105 110

Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser

115 120 125

Ser Ala Thr Ala Glu Asp Met Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln

130 135 140

Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val

145 150 155 160

Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg

165 170 175

Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val

180 185 190

Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser

195 200 205

Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala

210 215 220

Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val

245 250 255

Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr

260 265 270

Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln

275 280 285

Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys

290 295 300

Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu

305 310 315 320

Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg

325 330 335

Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu

340 345 350

His Ser Gln Gly Lys Ile Ile Ala Glu Gly Arg Ala Ile Gly His Arg

355 360 365

Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn

370 375 380

Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Leu Val Thr Asp Met Thr Asp Pro Asp

385 390 395 400

Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly

405 410 415

Gly Arg Thr Cys His Ala Ala Ile Ile Ala Arg Glu Leu Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu

435 440 445

Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Phe Ser Val Lys Ser Ser Ser Val Glu Thr Met Pro

465 470 475 480

Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu

500 505 510

Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu

515 520 525

Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met

530 535 540

Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile

565 570 575

Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly

580 585 590

Gly Glu Arg Tyr Glu Pro Asp Glu Glu Asn Pro Met Leu Gly Phe Arg

595 600 605

Gly Ala Gly Arg Tyr Val Ser Asp Ser Phe Arg Asp Cys Phe Ala Leu

610 615 620

Glu Cys Glu Ala Val Lys Arg Val Arg Asn Asp Met Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala

645 650 655

Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly

660 665 670

Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala

675 680 685

Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp

690 695 700

Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser

705 710 715 720

Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met

725 730 735

Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly

740 745 750

Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu

755 760 765

Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp

770 775 780

Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys

785 790

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-pps_F

<400> 20

aaaggagctc actagttttg ttcttcccgt gatg 34

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-pps_R

<400> 21

cagggtgtgg tcgatatctt atttcttcag ttcagc 36

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pps_F

<400> 22

taggagatta acatatgtcc aacaatggct cg 32

<210> 23

<211> 1992

<212> DNA

<213> Escherichia coli W3110

<400> 23

atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60

aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120

tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180

gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240

gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300

ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360

gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420

ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480

ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540

ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600

accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660

gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720

ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780

cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840

tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900

caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960

gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020

gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080

tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140

gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200

gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260

atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320

gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380

cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440

tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500

gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560

cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620

tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680

gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740

gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800

ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860

aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920

gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980

gaactgctgt aa 1992

<210> 24

<211> 663

<212> PRT

<213> Escherichia coli W3110

<400> 24

Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met

1 5 10 15

Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly

20 25 30

Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn

35 40 45

Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn

50 55 60

Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys

85 90 95

Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr

100 105 110

Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile

115 120 125

Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile

130 135 140

Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu

145 150 155 160

Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His

180 185 190

Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr

195 200 205

Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly

245 250 255

Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu

260 265 270

Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser

275 280 285

Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu

290 295 300

Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln

305 310 315 320

Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp

325 330 335

Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro

340 345 350

Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe

355 360 365

Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro

370 375 380

Ser Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala

385 390 395 400

Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala

405 410 415

Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser

420 425 430

Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala

435 440 445

Ala Leu Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile

450 455 460

Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala

465 470 475 480

Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln

485 490 495

Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly

500 505 510

Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg

515 520 525

Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly Tyr Val Leu Lys

530 535 540

Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu

545 550 555 560

Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val

565 570 575

Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln

580 585 590

Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg

595 600 605

Val Ala Val Glu Ala Gly Ile Ala Asp Tyr Trp Tyr Lys Tyr Val Gly

610 615 620

Leu Asn Gly Ala Ile Val Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro

625 630 635 640

Ala Glu Leu Leu Phe Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val

645 650 655

Ala Lys Ala Lys Glu Leu Leu

660

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-tktA_F

<400> 25

aaaggagctc actagtgttt tctcttccgc acaa 34

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-tktA_R

<400> 26

cagggtgtgg tcgatatctt acagcagttc ttttgc 36

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tktA_F

<400> 27

taggagatta acatatgtcc tcacgtaaag ag 32

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1-aroG_R

<400> 28

cccgcggttt acccgcgacg cgcttt 26

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1-pps_F

<400> 29

gcgggtaaac cgcgggctta ttccat 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1-pps_R

<400> 30

cccgcggttt atttcttcag ttcagc 26

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj1-tktA_F

<400> 31

agaaataaac cgcgggctta ttccat 26

<210> 32

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD deletion cassette_F

<400> 32

tcatggggtt cggtgcctga caggctgacc gcgtgcagaa agggtaaaaa gctggagctg 60

cttcgaagtt c 71

<210> 33

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD deletion cassette_R

<400> 33

atatattttt tagttcggcg gggagggtgt tcccgccgaa atattattgc gccatggtcc 60

atatgaatat cctccttag 79

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD deletion_F

<400> 34

caaagatttc cctctggaat atg 23

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD deletion_R

<400> 35

cagatgtgat tttccctacg c 21

<210> 36

<211> 1389

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 36

gtgagttgga cagttgatat ccctaaagaa gttctccctg atttgccacc attgccagaa 60

ggcatgcagc agcagttcga ggacaccatt tcccgtgacg ctaagcagca acctacgtgg 120

gatcgtgcac aggcagaaaa cgtgcgcaag atccttgagt cggttcctcc aatcgttgtt 180

gcccctgagg tacttgagct gaagcagaag cttgctgatg ttgccaacgg taaggccttc 240

ctcttgcagg gtggtgactg tgcggaaact ttcgagtcaa acactgagcc gcacattcgc 300

gccaacgtaa agactctgct gcagatggca gttgttttga cctacggtgc atccactcct 360

gtgatcaaga tggctcgtat tgctggtcag tacgcaaagc ctcgctcttc tgatctggat 420

ggaaatggtc tgccaaacta ccgtggcgat atcgtcaacg gtgtggaggc aaccccagag 480

gctcgtcgcc acgatcctgc ccgcatgatc cgtgcttacg ctaacgcttc tgctgcgatg 540

aacttggtgc gcgcgctcac cagctctggc accgctgatc tttaccgtct cagcgagtgg 600

aaccgcgagt tcgttgcgaa ctccccagct ggtgcacgct acgaggctct tgctcgtgag 660

atcgactccg gtctgcgctt catggaagca tgtggcgtgt ccgatgagtc cctgcgtgct 720

gcagatatct actgctccca cgaggctttg ctggtggatt acgagcgttc catgctgcgt 780

cttgcaaccg atgaggaagg caacgaggaa ctttacgatc tttcagctca ccagctgtgg 840

atcggcgagc gcacccgtgg catggatgat ttccatgtga acttcgcatc catgatctct 900

aacccaatcg gcatcaagat tggtcctggt atcacccctg aagaggctgt tgcatacgct 960

gacaagctcg atccgaactt cgagcctggc cgtttgacca tcgttgctcg catgggccac 1020

gacaaggttc gctccgtact tcctggtgtt atccaggctg ttgaggcatc cggacacaag 1080

gttatttggc agtccgatcc gatgcacggc aacactttca ccgcatccaa tggctacaag 1140

acccgtcact tcgacaaggt tatcgatgag gtccagggct tcttcgaggt ccaccgcgca 1200

ttgggcaccc acccaggcgg aatccacatt gagttcactg gtgaagatgt caccgagtgc 1260

ctcggtggcg ctgaagacat caccgatgtt gatctgccag gccgctacga gtccgcatgc 1320

gatcctcgcc tgaacactca gcagtctttg gagttggctt tcctcgttgc agaaatgctg 1380

cgtaactaa 1389

<210> 37

<211> 462

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 37

Met Ser Trp Thr Val Asp Ile Pro Lys Glu Val Leu Pro Asp Leu Pro

1 5 10 15

Pro Leu Pro Glu Gly Met Gln Gln Gln Phe Glu Asp Thr Ile Ser Arg

20 25 30

Asp Ala Lys Gln Gln Pro Thr Trp Asp Arg Ala Gln Ala Glu Asn Val

35 40 45

Arg Lys Ile Leu Glu Ser Val Pro Pro Ile Val Val Ala Pro Glu Val

50 55 60

Leu Glu Leu Lys Gln Lys Leu Ala Asp Val Ala Asn Gly Lys Ala Phe

65 70 75 80

Leu Leu Gln Gly Gly Asp Cys Ala Glu Thr Phe Glu Ser Asn Thr Glu

85 90 95

Pro His Ile Arg Ala Asn Val Lys Thr Leu Leu Gln Met Ala Val Val

100 105 110

Leu Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Val Ile Lys Met Ala Arg Ile Ala

115 120 125

Gly Gln Tyr Ala Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu Asp Gly Asn Gly Leu

130 135 140

Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Ile Val Asn Gly Val Glu Ala Thr Pro Glu

145 150 155 160

Ala Arg Arg His Asp Pro Ala Arg Met Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Ala

165 170 175

Ser Ala Ala Met Asn Leu Val Arg Ala Leu Thr Ser Ser Gly Thr Ala

180 185 190

Asp Leu Tyr Arg Leu Ser Glu Trp Asn Arg Glu Phe Val Ala Asn Ser

195 200 205

Pro Ala Gly Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Ala Arg Glu Ile Asp Ser Gly

210 215 220

Leu Arg Phe Met Glu Ala Cys Gly Val Ser Asp Glu Ser Leu Arg Ala

225 230 235 240

Ala Asp Ile Tyr Cys Ser His Glu Ala Leu Leu Val Asp Tyr Glu Arg

245 250 255

Ser Met Leu Arg Leu Ala Thr Asp Glu Glu Gly Asn Glu Glu Leu Tyr

260 265 270

Asp Leu Ser Ala His Gln Leu Trp Ile Gly Glu Arg Thr Arg Gly Met

275 280 285

Asp Asp Phe His Val Asn Phe Ala Ser Met Ile Ser Asn Pro Ile Gly

290 295 300

Ile Lys Ile Gly Pro Gly Ile Thr Pro Glu Glu Ala Val Ala Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Lys Leu Asp Pro Asn Phe Glu Pro Gly Arg Leu Thr Ile Val Ala

325 330 335

Arg Met Gly His Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Pro Gly Val Ile Gln

340 345 350

Ala Val Glu Ala Ser Gly His Lys Val Ile Trp Gln Ser Asp Pro Met

355 360 365

His Gly Asn Thr Phe Thr Ala Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Arg His Phe

370 375 380

Asp Lys Val Ile Asp Glu Val Gln Gly Phe Phe Glu Val His Arg Ala

385 390 395 400

Leu Gly Thr His Pro Gly Gly Ile His Ile Glu Phe Thr Gly Glu Asp

405 410 415

Val Thr Glu Cys Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ile Thr Asp Val Asp Leu

420 425 430

Pro Gly Arg Tyr Glu Ser Ala Cys Asp Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gln

435 440 445

Ser Leu Glu Leu Ala Phe Leu Val Ala Glu Met Leu Arg Asn

450 455 460

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-cgl aroG_F

<400> 38

ggtatcgata agcttgattc gatctgctcc cattcc 36

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-cgl aroG_R

<400> 39

cggtggcggc cgctctagtt agttacgcag catttc 36

<210> 40

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-cgl aroG_F

<400> 40

cgaaaggaaa cactcgatgt gagttggaca gttgatatc 39

<210> 41

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-cgl aroG_R

<400> 41

ccgccaaaac agctctagtt tagttacgca gcatttc 37

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_ABCD_F

<400> 42

ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gatgagtatc gtccaagcaa agtttgaagc 60

60

<210> 43

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_ABCD_R

<400> 43

agagggtgac gctagtcaga actagtttat gaattatttt ccagacaatc ttgtaaacgc 60

60

<210> 44

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> O2 promoter_F

<400> 44

ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gcaataatcg tgaattttgg cagc 54

<210> 45

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> O2 promoter_R

<400> 45

caaactttgc ttggacgata ctcattgttt tgatctcctc caataatcta tgc 53

<210> 46

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-cgl tkt_F

<400> 46

ggtatcgata agcttgataa gattgatcac acctttg 37

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pn-cgl tkt_R

<400> 47

cggtggcggc cgctctagtt aaccgttaat ggagtc 36

<210> 48

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-cgl tkt_F

<400> 48

cgaaaggaaa cactcgattt gaccaccttg acgctg 36

<210> 49

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-cgl tkt_R

<400> 49

ccgccaaaac agctctagtt taaccgttaa tggagtc 37

<210> 50

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc-cgl pps_F

<400> 50

tcacacagga aagatatcat gaccaacagt ttgaac 36

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc-cgl pps_R

<400> 51

ccgccaaaac agctctagtt tacttcgtgc cggtcattg 39

<210> 52

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-cgl pps_F

<400> 52

cgaaaggaaa cactcgatat gaccaacagt ttgaac 36

<210> 53

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-aroG_F

<400> 53

ttagaaatgg aacctaaaag aaacatccca gcgctac 37

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-aroG_R

<400> 54

tagcgctggg atgtttcttt agttacgcag catttc 36

<210> 55

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-tkt_F

<400> 55

gaaatgctgc gtaactaaag aaacatccca gcgcta 36

<210> 56

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-tkt_R

<400> 56

gtagcgctgg gatgtttctt taaccgttaa tggagtc 37

<210> 57

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-pps_F

<400> 57

gactccatta acggttaaag aaacatccca gcgctac 37

<210> 58

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pcj7-pps_R

<400> 58

ggagaatact gtcgttcatt tacttcgtgc cggtcattg 39

<210> 59

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 59

ggatccacag tttattcctg gcatcc 26

<210> 60

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 60

tttgcttgga cgatactcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_A_F

<400> 61

aaacacacat aaacaaacaa atgagtatcg tccaagcaaa 40

<210> 62

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_A_R

<400> 62

ggatgccagg aataaactgt ttatttaaca ctcccgatta 40

<210> 63

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 63

taatcgggag tgttaaataa acagtttatt cctggcatcc 40

<210> 64

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 64

tggacaatca catttgtcaa ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 65

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_B_F

<400> 65

aaacacacat aaacaaacaa ttgacaaatg tgattgtcca 40

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_B_R

<400> 66

gtcgacttaa ggttgtattc tgcgga 26

<210> 67

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 67

ggatccacag tttattcctg gcatcc 26

<210> 68

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 68

aaagagattg attgtgccat ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 69

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_C_F

<400> 69

aaacacacat aaacaaacaa atggcacaat caatctcttt 40

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_C_R

<400> 70

ggatgccagg aataaactgt ttagtcgccc cctaattcca 40

<210> 71

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 71

tggaattagg gggcgactaa acagtttatt cctggcatcc 40

<210> 72

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 72

aggatattaa gtactggcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 73

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_D_F

<400> 73

aaacacacat aaacaaacaa atgccagtac ttaatatcct 40

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ava_D_R

<400> 74

gtcgactcaa ttttgtaaca cctttt 26

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TKL1_F

<400> 75

ggatccatga ctcaattcac tgacat 26

<210> 76

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TKL1_R

<400> 76

gtcgacttag aaagcttttt tcaaag 26

<210> 77

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ARO4_F

<400> 77

ggatccatga gtgaatctcc aatgtt 26

<210> 78

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ARO4_R

<400> 78

gtcgacctat ttcttgttaa cttctc 26

<210> 79

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pps_F

<400> 79

ggatccatgt ccaacaatgg ctcgtc 26

<210> 80

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pps_R

<400> 80

gtcgacttat ttcttcagtt cagcca 26

<210> 81

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 81

ggatccacag tttattcctg gcatcc 26

<210> 82

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 82

atgtcagtga attgagtcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 83

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TKL1_F

<400> 83

aaacacacat aaacaaacaa atgactcaat tcactgacat 40

<210> 84

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TKL1_R

<400> 84

ggatgccagg aataaactgt ttagaaagct tttttcaaag 40

<210> 85

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_F

<400> 85

ctttgaaaaa agctttctaa acagtttatt cctggcatcc 40

<210> 86

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pGPD_R

<400> 86

aacattggag attcactcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40

<210> 87

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ARO4_F

<400> 87

aaacacacat aaacaaacaa atgagtgaat ctccaatgtt 40

<210> 88

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ARO4_R

<400> 88

gtcgacctat ttcttgttaa cttctc 26

<210> 89

<211> 438

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 89

atgcctggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60

cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120

gcgaagcacg gccttgaggt tgaggcgctg cagagcaatc acgaaggtga gctaatcgat 180

gcgctgcaca acgctcgcgg cacccacatc ggttgcgtga ttaaccccgg cggcctgact 240

cacacttcgg tggcgctttt ggatgctgtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300

cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360

gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420

gcaaatctca aaaagtag 438

<210> 90

<211> 145

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 90

Met Pro Gly Lys Ile Leu Leu Leu Asn Gly Pro Asn Leu Asn Met Leu

1 5 10 15

Gly Lys Arg Glu Pro Asp Ile Tyr Gly His Asp Thr Leu Glu Asp Val

20 25 30

Val Ala Leu Ala Thr Ala Glu Ala Ala Lys His Gly Leu Glu Val Glu

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Asn His Glu Gly Glu Leu Ile Asp Ala Leu His Asn

50 55 60

Ala Arg Gly Thr His Ile Gly Cys Val Ile Asn Pro Gly Gly Leu Thr

65 70 75 80

His Thr Ser Val Ala Leu Leu Asp Ala Val Lys Ala Ser Glu Leu Pro

85 90 95

Thr Val Glu Val His Ile Ser Asn Pro His Ala Arg Glu Glu Phe Arg

100 105 110

His His Ser Tyr Ile Ser Leu Ala Ala Val Ser Val Ile Ala Gly Ala

115 120 125

Gly Ile Gln Gly Tyr Arg Phe Ala Val Asp Ile Leu Ala Asn Leu Lys

130 135 140

Lys

145

<210> 91

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD_F

<400> 91

gatcggatcc cactggacgt ttgggtgaga cc 32

<210> 92

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD_R

<400> 92

gatcggatcc actagtttta ggttccattt ctaattg 37

<210> 93

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD_F

<400> 93

gatcactagt atgaacgaca gtattctcc 29

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aroD_D

<400> 94

gatcaagctt gttacatcct gacgttgtgg 30

<210> 95

<211> 2103

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 95

ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca ctgtacgcaa ttacccctct 60

gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc gtgtcctcgc tgcagacgct 120

gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga gcctggctcc ccttgcatac 180

accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca ccaactgggc aggccgtgac 240

cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt acatccagct ttacttgggt 300

ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca cctgggattc cttgacccca 360

ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca ccactggccc tcttggccag 420

ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc gtgagcgtgg cctattcgac 480

ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca tctacgtcat tgcttctgat 540

ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca tcgctggcac ccagcagctg 600

ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca tcgaagacaa cactgagatc 660

gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg gctggcagac cattgaggtt 720

gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg ctgaggctaa gaaggacacc 780

aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct tcccagctcc aactatgatg 840

aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg aggttgcagc aaccaagact 900

gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg atgaggttat cgctcacacc 960

cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat ggcaggtcaa gttcgatgag 1020

tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc gcctgaactc ccgtgagctt 1080

ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag atgagaaggg cgtcgcaact 1140

cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga cccttcctga gctgtggggc 1200

ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca agggctcccc ttccttcggc 1260

cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt acggccgtaa cctgcacttc 1320

ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca tttccctcca cggtggcacc 1380

cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca tgcgtcctgc agttcgtctt 1440

gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc acgactccat cggtctgggc 1500

gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg cactgcgcgc catcccaggt 1560

ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc aggcttgggc tgcagcactt 1620

gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc agaacgttcc tgttctggaa 1680

ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg gctacgtcct ggttgagggt 1740

tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct ccgaggttca gcttgcagtt 1800

aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc gcgttgtttc cgttccttgc 1860

atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt ccgttctgcc tgcagctgtg 1920

accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt ggtaccgctt cttgggcacc 1980

cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg cggattacca gaccctgttt 2040

gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg ccaaggactc cattaacggt 2100

taa 2103

<210> 96

<211> 700

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 96

Met Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg

1 5 10 15

Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr

20 25 30

Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His

35 40 45

Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln

50 55 60

Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp

65 70 75 80

Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln

85 90 95

Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu

100 105 110

Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr

115 120 125

Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser

130 135 140

Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp

145 150 155 160

Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val

165 170 175

Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser

180 185 190

Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp

195 200 205

Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu

210 215 220

Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val

225 230 235 240

Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala

245 250 255

Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile

260 265 270

Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala

275 280 285

Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe

290 295 300

Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ile Ala His Thr

305 310 315 320

Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val

325 330 335

Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe

340 345 350

Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu

355 360 365

Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser

370 375 380

Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly

385 390 395 400

Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser

405 410 415

Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu

420 425 430

Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly

435 440 445

Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly

450 455 460

Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu

465 470 475 480

Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser

485 490 495

Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu

500 505 510

Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp

515 520 525

Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu

530 535 540

Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu

545 550 555 560

Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val

565 570 575

Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser

580 585 590

Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala

595 600 605

Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe

610 615 620

Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val

625 630 635 640

Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg

645 650 655

Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala

660 665 670

Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp

675 680 685

Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly

690 695 700

<210> 97

<211> 1095

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 97

atgaccaaca gtttgaacat cccgtttgtc cagcgcttcg atgaaggcct ggatcctgtt 60

ctagaagtac tcggtggcaa gggcgcttca ctagtcacca tgacagatgc tggaatgccc 120

gttccacctg gatttgtggt cactactgcc agctttgatg aattcatccg tgaagcaggg 180

gttgctgaac acatcgataa attcctaaac gatctcgatg cagaagatgt taaggaagtg 240

gatcgagttt ctgcgatcat ccgcgatgag ctgtgcagtc ttgacgttcc agagaatgct 300

cgtttcgcag tgcaccaggc ttatcgcgat ctcatggaac gatgcggtgg cgacgtcccg 360

gttgctgtcc ggtcatcggc cactgccgaa gatctgcccg atgcttcctt cgcagggcaa 420

caggacacct atctgtggca agtcggtttg agcgctgtca ctgaacacat ccgtaaatgc 480

tgggcttcgc tgttcacttc ccgtgccatt atctaccgtc tgaaaaacaa catccccaat 540

gagggcctct ccatggcggt agttgttcaa aaaatggtca actctcgtgt cgcaggcgtg 600

gcaatcacta tgaatccttc caacggcgac cgctcgaaga tcaccatcga ttcctcatgg 660

ggtgttggtg aaatggtggt ctcaggtgaa gtgacaccag acaatatctt gctggacaag 720

atcacgctgc aggttgtctc cgaacacatt ggaagcaaac acgctgaact catccccgat 780

gccaccagtg gaagcctcgt ggaaaagccc gttgatgaag aacgcgcaaa ccgccgcagt 840

ctgactgatg aggaaatgct cgctgtggca caaatggcta agcgtgcaga aaaacactac 900

aagtgcccac aagatatcga atgggcgctg gacgctgatc tgccagatgg agaaaacctt 960

ctgttattgc aatcccgccc ggaaactatc cactccaacg gtgtgaagaa ggaaacccca 1020

actccgcagg ctgccaaaac cataggcacc ttcgatttca gctcaatcac cgtcgcaatg 1080

accggcacga agtaa 1095

<210> 98

<211> 364

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 98

Met Thr Asn Ser Leu Asn Ile Pro Phe Val Gln Arg Phe Asp Glu Gly

1 5 10 15

Leu Asp Pro Val Leu Glu Val Leu Gly Gly Lys Gly Ala Ser Leu Val

20 25 30

Thr Met Thr Asp Ala Gly Met Pro Val Pro Pro Gly Phe Val Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ser Phe Asp Glu Phe Ile Arg Glu Ala Gly Val Ala Glu His

50 55 60

Ile Asp Lys Phe Leu Asn Asp Leu Asp Ala Glu Asp Val Lys Glu Val

65 70 75 80

Asp Arg Val Ser Ala Ile Ile Arg Asp Glu Leu Cys Ser Leu Asp Val

85 90 95

Pro Glu Asn Ala Arg Phe Ala Val His Gln Ala Tyr Arg Asp Leu Met

100 105 110

Glu Arg Cys Gly Gly Asp Val Pro Val Ala Val Arg Ser Ser Ala Thr

115 120 125

Ala Glu Asp Leu Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln Asp Thr Tyr

130 135 140

Leu Trp Gln Val Gly Leu Ser Ala Val Thr Glu His Ile Arg Lys Cys

145 150 155 160

Trp Ala Ser Leu Phe Thr Ser Arg Ala Ile Ile Tyr Arg Leu Lys Asn

165 170 175

Asn Ile Pro Asn Glu Gly Leu Ser Met Ala Val Val Val Gln Lys Met

180 185 190

Val Asn Ser Arg Val Ala Gly Val Ala Ile Thr Met Asn Pro Ser Asn

195 200 205

Gly Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile Asp Ser Ser Trp Gly Val Gly Glu

210 215 220

Met Val Val Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Asn Ile Leu Leu Asp Lys

225 230 235 240

Ile Thr Leu Gln Val Val Ser Glu His Ile Gly Ser Lys His Ala Glu

245 250 255

Leu Ile Pro Asp Ala Thr Ser Gly Ser Leu Val Glu Lys Pro Val Asp

260 265 270

Glu Glu Arg Ala Asn Arg Arg Ser Leu Thr Asp Glu Glu Met Leu Ala

275 280 285

Val Ala Gln Met Ala Lys Arg Ala Glu Lys His Tyr Lys Cys Pro Gln

290 295 300

Asp Ile Glu Trp Ala Leu Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Glu Asn Leu

305 310 315 320

Leu Leu Leu Gln Ser Arg Pro Glu Thr Ile His Ser Asn Gly Val Lys

325 330 335

Lys Glu Thr Pro Thr Pro Gln Ala Ala Lys Thr Ile Gly Thr Phe Asp

340 345 350

Phe Ser Ser Ile Thr Val Ala Met Thr Gly Thr Lys

355 360

<210> 99

<211> 3926

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 99

ttggtcatgc ttatgaagct atactaaccc cacaagcatt acatggtgaa tgtgtgtcca 60

ttggtatggt taaagaggcg gaattatccc gttatttcgg tattctctcc cctacccaag 120

ttgcacgtct atccaagatt ttggttgcct acgggttgcc tgtttcgcct gatgagaaat 180

ggtttaaaga gctaacctta cataagaaaa caccattgga tatcttattg aagaaaatga 240

gtattgacaa gaaaaacgag ggttccaaaa agaaggtggt cattttagaa agtattggta 300

agtgctatgg tgactccgct caatttgtta gcgatgaaga cctgagattt attctaacag 360

atgaaaccct cgtttacccc ttcaaggaca tccctgctga tcaacagaaa gttgttatcc 420

cccctggttc taagtccatc tccaatcgtg ctttaattct tgctgccctc ggtgaaggtc 480

aatgtaaaat caagaactta ttacattctg atgatactaa acatatgtta accgctgttc 540

atgaattgaa aggtgctacg atatcatggg aagataatgg tgagacggta gtggtggaag 600

gacatggtgg ttccacattg tcagcttgtg ctgacccctt atatctaggt aatgcaggta 660

ctgcatctag atttttgact tccttggctg ccttggtcaa ttctacttca agccaaaagt 720

atatcgtttt aactggtaac gcaagaatgc aacaaagacc aattgctcct ttggtcgatt 780

ctttgcgtgc taatggtact aaaattgagt acttgaataa tgaaggttcc ctgccaatca 840

aagtttatac tgattcggta ttcaaaggtg gtagaattga attagctgct acagtttctt 900

ctcagtacgt atcctctatc ttgatgtgtg ccccatacgc tgaagaacct gtaactttgg 960

ctcttgttgg tggtaagcca atctctaaat tgtacgtcga tatgacaata aaaatgatgg 1020

aaaaattcgg tatcaatgtt gaaacttcta ctacagaacc ttacacttat tatattccaa 1080

agggacatta tattaaccca tcagaatacg tcattgaaag tgatgcctca agtgctacat 1140

acccattggc cttcgccgca atgactggta ctaccgtaac ggttccaaac attggttttg 1200

agtcgttaca aggtgatgcc agatttgcaa gagatgtctt gaaacctatg ggttgtaaaa 1260

taactcaaac ggcaacttca actactgttt cgggtcctcc tgtaggtact ttaaagccat 1320

taaaacatgt tgatatggag ccaatgactg atgcgttctt aactgcatgt gttgttgccg 1380

ctatttcgca cgacagtgat ccaaattctg caaatacaac caccattgaa ggtattgcaa 1440

accagcgtgt caaagagtgt aacagaattt tggccatggc tacagagctc gccaaatttg 1500

gcgtcaaaac tacagaatta ccagatggta ttcaagtcca tggtttaaac tcgataaaag 1560

atttgaaggt tccttccgac tcttctggac ctgtcggtgt atgcacatat gatgatcatc 1620

gtgtggccat gagtttctcg cttcttgcag gaatggtaaa ttctcaaaat gaacgtgacg 1680

aagttgctaa tcctgtaaga atacttgaaa gacattgtac tggtaaaacc tggcctggct 1740

ggtgggatgt gttacattcc gaactaggtg ccaaattaga tggtgcagaa cctttagagt 1800

gcacatccaa aaagaactca aagaaaagcg ttgtcattat tggcatgaga gcagctggca 1860

aaactactat aagtaaatgg tgcgcatccg ctctgggtta caaattagtt gacctagacg 1920

agctgtttga gcaacagcat aacaatcaaa gtgttaaaca atttgttgtg gagaacggtt 1980

gggagaagtt ccgtgaggaa gaaacaagaa ttttcaagga agttattcaa aattacggcg 2040

atgatggata tgttttctca acaggtggcg gtattgttga aagcgctgag tctagaaaag 2100

ccttaaaaga ttttgcctca tcaggtggat acgttttaca cttacatagg gatattgagg 2160

agacaattgt ctttttacaa agtgatcctt caagacctgc ctatgtggaa gaaattcgtg 2220

aagtttggaa cagaagggag gggtggtata aagaatgctc aaatttctct ttctttgctc 2280

ctcattgctc cgcagaagct gagttccaag ctctaagaag atcgtttagt aagtacattg 2340

caaccattac aggtgtcaga gaaatagaaa ttccaagcgg aagatctgcc tttgtgtgtt 2400

taacctttga tgacttaact gaacaaactg agaatttgac tccaatctgt tatggttgtg 2460

aggctgtaga ggtcagagta gaccatttgg ctaattactc tgctgatttc gtgagtaaac 2520

agttatctat attgcgtaaa gccactgaca gtattcctat catttttact gtgcgaacca 2580

tgaagcaagg tggcaacttt cctgatgaag agttcaaaac cttgagagag ctatacgata 2640

ttgccttgaa gaatggtgtt gaattccttg acttagaact aactttacct actgatatcc 2700

aatatgaggt tattaacaaa aggggcaaca ccaagatcat tggttcccat catgacttcc 2760

aaggattata ctcctgggac gacgctgaat gggaaaacag attcaatcaa gcgttaactc 2820

ttgatgtgga tgttgtaaaa tttgtgggta cggctgttaa tttcgaagat aatttgagac 2880

tggaacactt tagggataca cacaagaata agcctttaat tgcagttaat atgacttcta 2940

aaggtagcat ttctcgtgtt ttgaataatg ttttaacacc tgtgacatca gatttattgc 3000

ctaactccgc tgcccctggc caattgacag tagcacaaat taacaagatg tatacatcta 3060

tgggaggtat cgagcctaag gaactgtttg ttgttggaaa gccaattggc cactctagat 3120

cgccaatttt acataacact ggctatgaaa ttttaggttt acctcacaag ttcgataaat 3180

ttgaaactga atccgcacaa ttggtgaaag aaaaactttt ggacggaaac aagaactttg 3240

gcggtgctgc agtcacaatt cctctgaaat tagatataat gcagtacatg gatgaattga 3300

ctgatgctgc taaagttatt ggtgctgtaa acacagttat accattgggt aacaagaagt 3360

ttaagggtga taataccgac tggttaggta tccgtaatgc cttaattaac aatggcgttc 3420

ccgaatatgt tggtcatacc gctggtttgg ttatcggtgc aggtggcact tctagagccg 3480

ccctttacgc cttgcacagt ttaggttgca aaaagatctt cataatcaac aggacaactt 3540

cgaaattgaa gccattaata gagtcacttc catctgaatt caacattatt ggaatagagt 3600

ccactaaatc tatagaagag attaaggaac acgttggcgt tgctgtcagc tgtgtaccag 3660

ccgacaaacc attagatgac gaacttttaa gtaagctgga gagattcctt gtgaaaggtg 3720

cccatgctgc ttttgtacca accttattgg aagccgcata caaaccaagc gttactcccg 3780

ttatgacaat ttcacaagac aaatatcaat ggcacgttgt ccctggatca caaatgttag 3840

tacaccaagg tgtagctcag tttgaaaagt ggacaggatt caagggccct ttcaaggcca 3900

tttttgatgc cgttacgaaa gagtag 3926

<210> 100

<211> 2247

<212> DNA

<213> Anabaena variabilis ATCC29413

<400> 100