СПОСОБЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ АЛЛОГЕННЫХ И ВЫСОКОАКТИВНЫХ Т-КЛЕТОК ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2020 года по МПК C12N5/783 C12N5/22 A61K35/17 C12N9/22 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам конструирования неаллореактивных Т-клеток для иммунотерапии, точнее к способам модификации Т-клеток путем инактивации обоих генов, кодирующих рецептор Т-клеток, и по меньшей мере одного гена иммунной контрольной точки для активации потенциала иммунного ответа. Этот способ включает применение специфических редкощепящих эндонуклеаз, в частности TALE-нуклеаз (TAL effector endonuclease), и полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды, для точного нацеливания и отбора ключевых генов в Т-клетках, которые могут быть получены от доноров или из культуры первичных клеток. Изобретение также относится к другим специфическим свойствам, которые могут быть приданы таким сконструированным Т-клеткам, например, preTCRα («pTalpha») и другим их функциональным производным, химерному антигенному рецептору (Chimeric Antigen Receptor - CAR), многоцепочечному CAR, и их применению для повышения эффективности иммунотерапии. Настоящее изобретение открывает путь к стандартизации и возможным адаптивным стратегиям иммунотерапии для лечения рака и вирусных инфекций.

Уровень техники

Адаптивная иммунотерапия, которая включает перенос аутологических антиген-специфичных Т-клеток, выработанных ex vivo, представляет многообещающую стратегию в лечении вирусных инфекций и рака. Т-клетки, используемые для адаптивной иммунотерапии, могут быть получены размножением антиген-специфических Т-клеток или переадресацией Т-клеток за счет генетической инженерии (Park и др., 2011). Перенос специфических к вирусному антигену Т-клеток представляет твердо установленную процедуру, используемую для лечения трансплантат-ассоциированных вирусных инфекций и редких связанных с вирусом злокачественных заболеваний. Установлено, что аналогичные действия по выделению и переносу специфичных к опухолям Т-клеток, успешны в лечении меланомы.

Новые специфические свойства Т-клеток были успешно созданы путем генетического переноса трансгенных рецепторов Т-клеток или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena и др., 2010). CAR являются синтетическими рецепторами, включающими часть молекулы-мишени, которая ассоциирована с одним или несколькими сигнальными доменами в одной гибридной молекуле. В общем, связывающая часть молекулы CAR состоит из антиген-связывающего домена одноцепочечного антитела (single-chain antibody - scFv), включающего легкие и вариабельные фрагменты моноклонального антитела, соединенного гибким линкером. Также успешно применяют связывающие части молекулы, основанные на доменах рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первой генерации CAR производны от цепей цитоплазматической области CD3zeta или Fc receptor gamma. Установлено, что CAR первой генерации успешно перенаправляют цитотоксичность Т-клеток, однако они не могут обеспечить длительное распространение и противоопухолевую активность in vivo. Передающие сигнал домены от ко-стимулирующих молекул, включая CD28, ОХ-40 (CD134) и 4-1ВВ (CD137), добавляют отдельно (вторая генерация) или в комбинации (третья генерация) для повышения выживаемости и пролиферации CAR-модифицированных Т-клеток. CAR позволяет Т-клеткам успешно переориентироваться против антигенов, экспрессируемых на поверхности раковых клеток от разных злокачественных образований, включая лимфомы и плотные опухоли (Jena и др., 2010).

Описанные в настоящем изобретении CAR построены на конструкции, в которой все значимые домены содержатся в одном полипептиде. Такая структура делает необходимым серийное прикрепление сигнальных доменов, сдвигая некоторые домены с их природных примембранных позиций. Таким образом, структуры, в которых лиганды и сигнальные домены разделены, могут скорее улучшить функцию ко-стимулирующих доменов, помещенных в разные цепи в их нормальных примембранных позициях, чем присоединенных вместе с некоторыми доменами, расположенными удаленно от плазматической мембраны. Природный рецептор, обладающий высоким сродством с IgE рецептором (FcεRI), может быть такой структурой. FcεRI, который находится на тучных клетках и базофилах, связывает IgE с высоким сродством. FcεRI является тетрамерным рецепторным комплексом, состоящим из лиганд-связывающей альфа субъединицы, бета-субъединицы и гомодимера двух сигнал-передающих гамма субъединиц (Metzger и др., 1986). Альфа домен FcεRI состоит из внеклеточного домена, содержащего два Ig-подобных домена, которые связывают IgE, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического хвоста. Бета субъединица содержит четыре трансмембранных сегмента, разделяющих амино- и карбокси-концевые цитоплазматические хвосты. Гамма цепь в значительной степени состоит из трансмембранной области и цитоплазматического хвоста, содержащего один иммунорецепторный на основе тирозина активирующий мотив (immunoreceptor tyrosine-based activation motif - ITAM) (Cambier, 1995). Цепь zeta комплекса TCR тесно связана с цепью gamma и может замещать gamma цепь FcεRI (Howard и др., 1990).

Действующий протокол лечения пациентов, применяющий адаптивную иммунотерапию, основан на переносе аутологичных клеток. При таком подходе Т-лимфоциты выделяют от пациентов, генетически модифицируют или отбирают ex vivo, культивируют in vitro для амплификации числа клеток при необходимости и в итоге вводят пациенту инфузией. Помимо инфузии лимфоцитов организм хозяина может подвергаться иным манипуляциям таким образом, чтобы поддержать приживление трансплантата Т-клеток или их участие в иммунном ответе, например, предварительной обработке (радиацией или химиотерапией) и введению факторов роста лимфоцитов (например, IL-2). Каждый пациент получает индивидуально разработанное лечение, при этом используют собственные лимфоциты пациента (т.е. аутологическая терапия). Аутологическая терапия сталкивается со значительными техническими и логистическими препятствиями для практического применения, Ее разработка нуждается в дорогостоящих специализированных средствах, требуется участие высококвалифицированных специалистов, терапия должна быть разработана в короткие сроки после постановки диагноза пациенту, и во многих случаях предварительное лечение пациента приводит к ухудшению иммунной функции, при этом лимфоциты пациента могут плохо функционировать и присутствовать в малых количествах. Из-за таких препятствий полученные аутологические клетки каждого пациента являются эффективным новым продуктом, существенно варьирующим по эффективности и безопасности. В идеале хотелось бы применять стандартизированную терапию, в которой аллогенные терапевтические клетки могут быть получены предварительно, подробно изучены и доступны для неотложного введения пациентам. Понятие «аллогенные клетки» означает, что эти клетки получены от индивидуумов, принадлежащих к тому же виду, но генетически отличающихся. Однако применение аллогенных клеток в настоящее время имеет много препятствий. В организмах иммунокомпетентных хозяев аллогенные клетки быстро отторгаются, этот процесс называется «хозяин против трансплантата» (host versus graft rejection - HvG), и такие существенные ограничения препятствуют эффективности пересаженных клеток. В иммунно-некомпетентных хозяев аллогенные клетки могут быть пересажены, но их эндогенная TCR специфичность распознает ткань хозяина в качестве чужеродной, в результате получается состояние «трансплантат против хозяина» (graft versus host - GvHD), которое может привести к тяжелому повреждению тканей и смерти. Для эффективного использования аллогенных клеток требуется разрешить обе указанные проблемы.

В организмах иммунокомпетентных хозяев аллогенные клетки быстро отторгаются иммунной системой. Было показано, что аллогенные лейкоциты, имеющиеся в необлученных компонентах крови, могут сохраняться не более 5-6 суток (Boni и др., 2008). Таким образом, для предотвращения отторжения аллогенных клеток иммунную систему хозяина следует эффективно подавить. Глюкокортикостероиды широко применяются в терапевтических целях для иммуносупрессии (Coutinho и Chapman, 2011). Это класс стероидных гормонов связывается с глюкокортикоидным рецептором (glucocorticoid receptor - GR), находящимся в цитозоле Т-клеток, что приводит к транслокации в ядро и связыванию специфических мотивов ДНК, которые регулируют экспрессию ряда генов, участвующих в иммунологическом процессе. Обработка Т-клеток глюкокортикоидными стероидами приводит к пониженным уровням выработки цитокина, вызывая слабость Т-клеток и препятствуя активации Т-клеток. Алемтузумаб, также обозначаемый САМРАТН1-Н, является гуманизированным моноклональным антителом, нацеливающимся на CD52 - гликозилфосфатидилинозитол (glycosylphosphatidyl-inositol - GPI)-связанный гликопротеин из 12 аминокислот (Waldmann и Hale, 2005). CD52 экспрессируется на высоких уровнях на Т- и В-лимфоцитах и с более низкими уровнями на моноцитах, при этом отсутствует на гранулоцитах и предшественниках костного мозга. Показано, что лечение гуманизированным моноклональным антителом алемтузумабом, направленным против CD52, вызывает быстрое истощение циркулирующих лимфоцитов и моноцитов. Его часто применяют в лечении Т-клеточной лимфомы и в некоторых случаях в качестве компонента соответствующего режима для трансплантации. Однако в случае адаптивной иммунотерапии применение иммуносупрессорных лекарственных средств также может оказывать вредное воздействие на интродуцированные терапевтические Т-клетки. Следовательно, для эффективного применения адаптивного иммунотерапевтического подхода в таких условиях интродуцированные клетки могут нуждаться в устойчивости к иммуносупрессивному лечению.

С другой стороны рецепторы Т-клеток (TCR) - это рецепторы на поверхности клеток, которые участвуют в активации Т-клеток в ответ на антиген. Обычно TCR состоит из двух цепей, альфа и бета, сборка которых формирует гетеродимер и ассоциирует с CD3-трансдуцирующими субъединицами для формирования комплекса рецептора Т-клеток, находящегося на поверхности клеток. Каждая альфа и бета цепь TCR состоит из иммуноглобулин-подобной N-концевой вариабельной (V) и константной (С) областей, гидрофобного трансмембранного домена и короткой цитоплазматической области. Как и для молекул иммуноглобулина, вариабельная область альфа и бета цепей вырабатываются путем рекомбинации V(D)J, создавая большое разнообразие антигенных специфичностей в популяции Т-клеток. Однако в отличие от иммуноглобулинов, которые распознают интактный антиген, Т-клетки активируются процессированными пептидными фрагментами в ассоциации с молекулой МНС, выставляя внешнюю часть для распознавания антигена Т-клетками, что называют МНС-рестрикцией. Распознавание несоответствия МНС между донором и реципиентом через рецептор Т-клеток приводит к пролиферации Т-клеток и потенциальному развитию GVHD. Показано, что нормальная экспрессия на поверхности TCR зависит от координированного синтеза и сборки всех семи компонентов комплекса (Ashwell и Klusner, 1990). Инактивация TCRalpha или TCRbeta может привести к элиминации TCR с поверхности Т-клеток, предупреждая распознавание аллоантигена и соответственно GVHD. Однако разрушение TCR приводит к элиминации CD3 сигнального компонента и изменяет возможность дополнительного размножения Т-клеток.

Опосредованный Т-клетками иммунитет включает множество последовательных стадий, регулируемых балансом между ко-стимулирующими и ингибирующими сигналами, которые точно регулируют иммунный ответ. Ингибирующие сигналы, называемые иммунными контрольными точками, являются критическими для поддержания аутотолерантности, а также для ограничения иммуноопосредованного повреждения коллатеральных тканей. Экспрессия белка иммунных контрольных точек может быть нарушена опухолями. Способность опухолей кооптировать такие ингибирующие метаболические пути представляет важный механизм иммунной устойчивости и ограничивает успешность иммунотерапии. Одним из обнадеживающих подходов к активированию Т-клеточного иммунного ответа является блокада таких иммунных контрольных точек (Pardoll, 2012). Иммунные контрольные точки представляют существенные преграды для активирования функционального клеточного иммунитета при заболевании раком, и антагонистические антитела, специфичные в отношении ингибирующих лигандов на Т-клетках, включая CTLA4 и белок запрограммированной смерти 1 (PD-1), являются примерами направленных агентов, проходящих оценку в клиниках.

Цитотоксический-Т-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (Cytotoxic-T-lymphocyte-associated antigen 4 - CTLA-4; также обозначаемый CD152) снижает регуляцию амплитуды активации Т-клеток, и лечение антителами - антагонистами CTLA4 (ипилимумаб) показало преимущественное выживание пациентов с меланомой (Robert и Mateus, 2011). Белок запрограммированной гибели клеток (programmed cell death protein 1 - PD1 или PDCD1, также обозначаемый CD279) представляет другую весьма многообещающую мишень для иммунотерапии (Pardoll и Drake 2012; Pardoll 2012). В отличие от CTLA-4, PD1 ограничивает эффекторные функции Т-клеток в периферической ткани в момент воспалительного ответа на инфекцию и ограничения аутоиммунности. Первое клиническое испытание PD1 антитела показывает некоторые случаи регрессии опухолей (Brahmer и др., 2010). Множественные дополнительные иммунные белки контрольной точки представляют перспективные мишени для терапевтической блокады, что следует из предшествующих исследований.

В нормальных Т-клетках Т-клеточные рецепторы происходят от пре-Т-клеточных рецепторов (pre-T cell receptors - pTCR), которые экспрессируются незрелыми тимоцитами и являются критическими для развития Т-клеток от двойных отрицательных (CD4- CD8-) до двойных положительных (CD4+ CD8+) стадий. Pre-T-клетки, у которых происходит продуктивная перегруппировка локуса TCRbeta, экспрессируют функциональную цепь TCRbeta, которая спаривается с неизменной цепью preTalpha и CD3 компонентами передачи сигнала для формирования комплекса pre-TCR. Экспрессия pre-TCR на поверхности клетки необходима для инициации бета-селекции - процесса, который индуцирует размножение развивающихся Т-клеток, вынуждает аллельное исключение локуса TCRbeta и приводит к индукции повторной сборки по локусу TCRalpha (von Boehmer, 2005). После продуктивных перегруппировок TCRalpha и замещения pTalpha на TCRalpha для формирования зрелой формы TCR тимоциты претерпевают вторую стадию селекции, рассматриваемую в качестве положительной или TCRalpha/beta селекции при связывании собственных пептидных МНС комплексов, экспрессированных на эпителиальных тимусных клетках. Таким образом, зрелые формы Т-клеток распознают и отвечают на комплекс антиген/МНС через TCR. Самым быстрым последствием активации TCR является инициация сигнальных метаболических путей через ассоциированные субъединицы CD3, в результате чего возникают разнообразные события, включая клональное размножение Т-клеток, повышенную регуляцию маркеров активации на поверхности клеток и индукцию цитотоксичности или секрецию цитокинов.

Из-за природы отобранных цепей TCRbeta на протяжении спаривания с preTalpha при развития тимуса в Т-клетках, в которых инактивировали TCRalpha, гетерологичная интродукция трансгена pTalpha может привести к формированию preTCR. Такой pTCR может выступать в качестве средства активации или стимуляции Т-клеток без зависимости от МНС, таким образом, например, допуская непрерывное распространение альфа/бета Т-клеток, с последующей инактивацией TCRalpha. Важно отметить, что комплекс pTCR демонстрирует сходную биохимическую композицию с TCR в отношении ассоциации субъединиц CD3 (Carrasco и др., 2001). Кроме того, в отличие от TCR, pre-TCR передача сигнала частично может быть независимой от лиганда. Кристаллическая структура внеклеточного домена pTCR обеспечивается структурной основой для возможной лиганд-независимой передачи сигнала pTCR. Показано, что pTCR формирует димер голова-хвост, в котором ассоциированы два гетеродимера pTalpha-TCRbeta (Pang и др., 2010).

В настоящем изобретении достигнуто получение генетически модифицированных Т-клеток, которые преодолевают ограничения имеющихся стратегий иммунотерапии, позволяя им быть не аллореактивными и высоко активными. Хотя блокаду иммунных контрольных точек достигают с помощью антител, другой путь достижения подавления заключается в инактивации экспрессии генов иммунных контрольных точек в Т-клетках, что допускает выработку сконструированных аллогенных Т-клеток в качестве продукта «не с полки». Это стало возможным за счет инактивации генов, используя специфические TALE-нуклеазы, направленные против TCRalpha или TCRbeta, в сочетании с инактивацией генов, кодирующих белки иммунных контрольных точек, таких как PD1 и CTLA-4.

В частности инактивация TCRalpha или TCRbeta вместе с инактивацией генов иммунных контрольных точек в Т-лимфоцитах, полученных от аллогенного донора, существенно снижает риск GVHD за счет элиминации TCR, ответственного за распознавание несовместимости МНС, наряду с допустимой пролиферацией и активностью интродуцированных лимфоцитов. Таким образом, ожидают, что такие модифицированные аллогенные Т-клетки будут высоко активными в крови пациента, где они могут нацеливаться на опухолевые клетки или инфицированные клетки.

В дополнение к указанной выше концепции генетически модифицированных Т-клеток, которые могут быть высокоактивными, изобретатели с помощью конструкции специфических TALE-нуклеаз одновременно инактивируют разные гены в Т-клетках, тем самым, получая двойные мутанты. Собственно говоря, двойное генное нацеливание с помощью двухцепочечных разрывов в Т-клетках было очень далеко от успешного решения из-за трудностей с получением и поддержанием Т-клеток в культуре в течение времени из-за свойственной им низкой степени трансформации и утраты при процедуре селекции. Эти осложнения делают маловероятным успешное получение таких клеток.

Таким образом, одной из важных задач, решаемых в настоящем изобретении, является конструирование специфических TALE-нуклеаз, допускающих повышенные степени двухцепочечных разрывов (DSB) в Т-клетках, которые хорошо переносятся клетками (особенно при ко-трансфекции) и способны направленно отбирать гены по настоящему изобретению. С помощью применения редкощепящих эндонуклеаз, например, описанных в настоящем изобретении TALE-нуклеаз, возможность получения дважды инактивированных генов в трансфецированных Т-клетках существенно повышается, и соответственно в настоящее время появляется возможность получать сконструированные Т-клетки, доступные от донора на регулярной основе по стандартным процедурам.

Кроме того, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Т-клетки конструируют таким образом, чтобы допустить пролиферацию, когда инактивируется TCRalpha. Существенная проблема, связанная с Т-клетками, которые претерпели инактивацию субъединицы TCR, заключается в том, что клетки не могут в течение длительного времени распространяться из-за комплекса CD3. Для преодоления этой проблемы в настоящем изобретении предусматривают способы размножения Т-клеток, в которых TCRalpha инактивируют через комплекс CD3, путем экспрессии Talpha в клетках, таким образом, восстанавливая функциональный комплекс CD3 в отсутствии функционального alpha/beta TCR.

В итоге Т-клетки дополнительно трансформируют CAR, чтобы специфически перенаправить аллогенные клетки против ассоциированных с опухолями антигенов независимо от МНС. В частности настоящее изобретение относится к многоцепочечному CAR, в котором ко-стимулирующие домены помещают в их нормальные примембранные позиции для улучшения их функций и за счет этого повышения выживаемости и увеличения пролиферации сконструированных Т-клеток. В результате в настоящем изобретении предусматривают способы, полипептиды и полинуклеотиды, которые допускают эффективную трансформацию аллогенных Т-клеток для адаптивной иммунотерапии и их легко осуществимое распространение.

Краткое описание изобретения

Одна из задач, решаемых в настоящем изобретении, касается разработки способов конструирования Т-клеток, особенно аллогенных Т-клеток, получаемых от доноров, чтобы затем сделать их пригодными для целей иммунотерапии. Точнее, способы по настоящему изобретению допускают точную модификацию генома клеток, релевантных для иммунотерапии, путем инактивирования или замены генов, участвующих в распознавании МНС и/или белков иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированные клетки, релевантные для иммунотерапии, дополнительно включают экзогенные рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие CAR для специфического распознавания клеток. Указанные CAR являются отдельными гибридными молекулами, которые влекут за собой серийное присоединение сигнальных доменов. Передвижение сигнальных доменов с их природных примембранных позиций может нарушить их функцию. Для преодоления этого недостатка в настоящем изобретении сконструированы многоцепочечные CAR, полученные от FcεRI для того, чтобы стало возможным нормальное примембранное положение всех релевантных сигнальных доменов. С высоким сродством IgE связывающий домен альфа цепи FcεRI замещают внеклеточным лиганд-связывающим доменом, например scFv, чтобы перенаправить специфичность Т-клеток на клеточные мишени, и N- и/или С-концевые хвосты бета цепи FcεRI используют для размещения ко-стимулирующих сигналов в нормальных примембранных позициях.

Другая задача, решаемая в настоящем изобретении, заключается в индукции активации или стимуляции Т-клеток, в которых инактивирован TCRalpha, pTalpha или его функциональный вариант интродуцируют в сконструированные Т-клетки. pTalpha или его функциональным вариантом может быть pTalpha полной длины, сплайс-вариант (Saint-Ruf и др., 1998), С-концевая усеченная версия, для которых показано увеличение экспрессии на поверхности preTCR-клеток (Carrasco и др., 2001). Могут применяться другие дополнительные усечения, меньшие или большие, описанные в настоящем изобретении. Различные preTalpha версии могут дополнительно включать сигнальные фрагменты из других молекул (CD28, CD137, CD8, TCRalpha, etc.) для стимуляции пролиферации и выживания или включать мутации, которые влияют на способность димеризоваться, например мутации D22A, R24A, R102A или R117A, ранее описанные у мышей (Yamasaki и др., 2006), или мутацию W46R, описанную у людей (Pang и др., 2010), для снижения способности к пролиферации. scFv часть CAR также может быть гибридизована с внеклеточным доменом pTalpha или его функциональным вариантом, таким образом, соединяя специфичность в отношении целевых антигенов непосредственно с пролиферативной активностью preTCR.

Другая задача, решаемая в настоящем изобретении, относится к полипептидам и полинуклеотидам, которые кодируют редкощепящие эндонуклеазы, для точного нацеливания на указанные выше целевые гены, в частности TCRalpha, TCRbeta, иммунных контрольных точек, тем самым осуществляя генетическую модификацию Т-клеток для иммунотерапии. В настоящем изобретении более подробно описывают специфические целевые последовательности в этих генах и TALE-нуклеазы, сконструированные для соответствующего нацеливания на эти гены.

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам или линиям клеток, включающим какие-либо белки, полипептиды или векторы, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки по настоящему изобретению включают инактивированные гены TCRalpha, TCRbeta, иммунных контрольных точек для применения в иммунотерапии. Выделенные клетки по настоящему изобретению или линии клеток могут дополнительно включать экзогенные рекомбинантные полинуклеотиды, в особенности полинуклеотиды, кодирующие pTalpha или его функциональный вариант, CAR или многоцепочечные CAR.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированные Т-клетки применяют в качестве терапевтического продукта, в идеале «имеющегося в продаже» продукта.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака или инфекций у пациента путем введения сконструированных Т-клеток, получаемых описанными выше способами.

Краткое описание фигур и таблиц

Помимо перечисленных объектов настоящее изобретение дополнительно предусматривает другие признаки, которые могут проявляться исходя из последующего описания и прилагаемых иллюстраций.

Для более полной оценки настоящего изобретения и многих свойственных ему преимуществ приводятся фигуры и более подробное описание.

Фиг. 1. Схематическое описание нормального взаимодействия между Т-клетками и антиген-презентирующими клетками.

Фиг. 2. Схематическое описание генетически модифицированных терапевтических Т-клеток по настоящему изобретению и опухолевых клеток пациента.

Фиг. 3. Схематическое описание многоцепочечного CAR.

Фиг. 4. Схематическое описание разных версий многоцепочечных CAR. А. Схематическое описание рецептора FcεRI. Б, В. Разные версии многоцепочечных CAR (от scm1 до scm10), включающих scFv и стволовую область CD8, гибридизированных с трансмембранным доменом альфа цепи FcεRI. По меньшей мере один из доменов, 41ВВ, CD28 и/или CD3 zeta, может быть гибридизирован с FcεRI alpha, beta и/или gamma цепью.

Фиг. 5. Схематическое описание способа конструирования аллогенных клеток человека для иммунотерапии.

Фиг. 6. Концентрация в клетках/мл живых CD52-положительных или CD52-отрицательных клеток после лечения анти-CD52 антителом (САМРАТН1-Н) с комплементом или контролями.

Фиг. 7. Сравнение прямого светорассеяния - индикатора размера клеток, между TCR-положительными и TCR-отрицательными клетками, или между CD52-положительными и CD52-отрицательными клетками, и неактивированными клетками в качестве контроля.

Фиг. 8. Анализ методом жидкостной цитометрии экспрессии CD107a (маркера дегрануляции) на целевых CD52 и TCRalpha инактивированных Т-клетках. Экспрессию CD107 анализируют на CD52+TCRαβ+ клетках (первая колонка), CD52-TCRαβ- клетках (вторая колонка), CD52-TCRαβ+ клетках (третья колонка) и CD52+TCRαβ- клетках (четвертая колонка) до (А) и после инкубации с клетками Дауди (Б); (В) представляет анализ методом жидкостной цитометрии Т-клеток, дополнительно трансфецированных CAR и инкубированных с клетками Дауди; (Г) представляет анализ методом жидкостной цитометрии Т-клеток, трансфецированных CAR, но не инкубировавшихся с клетками Дауди, и (Д) представляет анализ методом жидкостной цитометрии Т-клеток, трансфецированных CAR и обработанных РМА/иономицином (положительный контроль).

Фиг. 9. Глубокий сиквенс-анализ потенциала CD52 и TRAC TALE-нуклеаз в отношении мишеней вне сайта.

Фиг. 10. Анализ PDCD1 и CTLA-4 геномного локуса путем исследования с применением Т7-эндонуклеазы. Стрелки указывают на расщепленные ПЦР продукты.

Фиг. 11. Схематическое описание некоторых примеров preTalpha конструкций.

Фиг. 12. Анализ методом жидкостной цитометрии эффективности трансдукции (% BFP + клеток) и активности конструкций FL, Δ18, Δ48 pTalpha (% CD3 экспрессии на поверхности) на TCR alpha инактивированных клетках Jurkat.

Фиг. 13. Схематическое описание лентивирусной конструкции, кодирующей pTalpha белок (preTCRα).

Фиг. 14. А. Представление протокола эксперимента. Б. Анализ методом жидкостной цитометрии TCR alpha/beta, CD3 экспрессии и BFP экспрессии на TCRalpha инактивированных Т-клетках (KO), трансдуцированных или BFP-2A-pTalphaΔ48 (KO/Δ48), или контрольным BFP лентивирусным вектором (KO/BFP), до и после очистки. В. Анализ методом жидкостной цитометрии TCR alpha/beta и CD3 экспрессии на очищенных TCR alpha инактивированных клетках, трансдуцированных (BFP-положительных) или не трансдуцированных (BFP-отрицательных) BFP-2A-pTalphaΔ48 лентивирусным вектором. NEP (non electroporated) представляет не подвергнутые электропортации клетки TRAC TALE-нуклеазами.

Фиг. 15 А, Б. Анализ методом жидкостной цитометрии раннего маркера активации CD69 (А), позднего маркера активации CD25 (Б) экспрессии через 24 и 48 ч после реактивации гранулами анти-CD3/CD28 соответствующим образом на неэлектропорированных клетках (NEP) и TCRalpha инактивированных клетках (KO), трансдуцированных BFP-2A-pTα-Δ48 лентивирусным вектором (рТα-Δ48), BFP-2A-pTα-Δ48.41BB лентивирусным вектором (рТα-Δ48.ВВ) или контрольным BFP вектором (BFP). рТα-Δ48 гистограммы соответствуют сигналу, выявляемому в TCR-инактивированных клетках, экспрессирующих pTα-Δ48 (BFP+ клетки), в то время как KO гистограммы соответствуют TCRalpha инактивированным клеткам, которые не экспрессируют рТα-Δ48 (BFP-клетки). рТα-Δ48.ВВ гистограммы соответствуют сигналу, выявляемому в TCR-инактивированных клетках, экспрессирующих рТα-Δ48.41ВВ (BFP+ клетки), в то время как KO гистограммы соответствуют TCRalpha инактивированным клеткам, которые не экспрессируют рТα-Δ48.41ВВ (BFP- клетки). NEP (не электропорированные) гистограммы соответствуют сигналу, выявляемому в неконструированных клетках. В. Анализ методом жидкостной цитометрии размера клеток через 72 ч после реактивации анти-CD3/CD28 гранулами на не электропорированных клетках (NEP) и TCRalpha инактивированных клетках (KO), трансдуцированных BFP-2A-pTα-Δ48 лентивирусным вектором (рТα-Δ48), BFP-2A-pTα-Δ48.41BB лентивирусным вектором (рТα-Δ48.ВВ) или контрольным BFP вектором (BFP). Величины, указанные в верхней части каждой графы, соответствуют среднему геометрическому значению флуоресценции каждой популяции.

Фиг. 16. Анализ роста TCR alpha инактивированных клеток (KO), трансдуцированных pTalpha-Δ48 (рТаΔ48) или контрольным вектором BFP (BFP) при поддержке IL2 или IL2 с анти-CD3/CD28 гранулами в разное время (x-ось). Число BFP+ клеток оценивают в разное время для каждого состояния и кратность индукции этих клеток (y-ось) оценивают относительно величины, полученной на вторые сутки после реактивации. Результаты получают от двух независимых доноров. Для второго донора также определяют рост клеток, трансдуцированных pTalpha-Δ48.41BB (рТа-Δ48.ВВ) и pTalpha- (pTa-FL) полной длины.

Фиг. 17. Анализ методом жидкостной цитометрии GFP-положительных клеток среди МКПК, подвергнутых электропорации по пяти разным программам Cytopulse. Верхняя линия соответствует трансфекции 6×10⁶ клеток на кювету, а нижняя линия соответствует трансфекции 3×10⁶ клеток на кювету.

Фиг. 18. Анализ методом жидкостной цитометрии гибели очищенных Т-клеток, используя прижизненный краситель (eFluor-450) и GFP-положительные клетки среди жизнеспособной популяции после электропорации GFP мРНК, GFP ДНК и контрольной pUC ДНК. NEP соответствует клеткам, которые поддерживают в буфере для электропорации, но они не подвергались электропорации, и NT соответствует клеткам, не подвергавшимся электропорации, поддерживаемым в культуральной среде.

Фиг. 19. Анализ методом жидкостной цитометрии TCR alpha/beta и CD3 экспрессии на первичных Т-клетках человека после электропорации мРНК TRAC TALE-нуклеазы (вверху). Глубокий сиквенс-анализ геномной ДНК, экстрагированной из первичных Т-клеток человека после электропорации мРНК TRAC TALE-нуклеазы (внизу).

Фиг. 20. А. Анализ методом жидкостной цитометрии CAR экспрессии (анти-F(ab')2) после электропорации Т-клеток мРНК, или без мРНК, одноцепочечного CAR. Б. Анализ методом жидкостной цитометрии CD107a экспрессии (маркера дегрануляции) на электропортированных Т-клетках, совместно культивируемых с клетками Дауди.

Фиг. 21. А. Представление мРНК, кодирующей многоцепочечный CAR. Б. Анализ методом жидкостной цитометрии CAR экспрессии (анти-F(ab')2) на жизнеспособных Т-клетках, подвергнутых электропорации полицистронной мРНК, или без нее, кодирующей многоцепочечный CAR. В. Анализ методом жидкостной цитометрии CD107a экспрессии (маркера дегрануляции) на электропорированных Т-клетках, совместно культивируемых с клетками Дауди.

Фиг. 22. Экспрессия многоцепочечных CAR в Т-клетках человека после электропорации полицистронных мРНК.

Фиг. 23. Экспрессия мульти-субъединичных CAR обусловлена экспрессией трех цепей: α, β и γ.

Фиг. 24. Т-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, дегранулируют после совместного культивирования с клетками-мишенями. А: от scm 1 до scm 5 CAR конструкции. Б: от scm 6 до scm 10 CAR конструкции.

Фиг. 25. Т-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, секретируют цитокины после совместного культивирования с клетками-мишенями (Т-клетки против клеток Дауди или K562). А: высвобождение IL8. Б: высвобождение IFNγ. В: высвобождение IL5.

Фиг. 26. Т-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR (конструкции от scm1 по scm10), лизируют целевые клетки.

Фиг. 27. Инактивирование CTLA4 в первичных Т-клетках, измеренное путем внутриклеточного окрашивания с применением флуоресцентного антитела и жидкостного цитометрического анализа.

Фиг. 28. Распределение флуоресцентных Т-клеток, экспрессирующих CTLA4, при трансфекции TALEN T1, Т2 и Т3. Пропорция клеток, экспрессирующих CTLA4, резко снижается относительно контрольных клеток.

Фиг. 29. Инактивирование PD1 в первичных Т-клетках, измеренное путем внутриклеточного окрашивания флуоресцентным антителом с применением метода жидкостной цитометрии. Пропорция клеток, экспрессирующих PD1, резко снижается относительно контрольных клеток.

Фиг. 30. Диаграмма, показывающая частоту делеций, наблюдаемых в Т-клетках при трансфекции TALEN Т01 и Т03, нацеленных на ген PD1.

Фиг. 31. Диаграмма, показывающая, что цитотоксическая активность возрастает в Т-клетках с разрушенным PD1, как в эксперименте, описанном в примере 3.

Таблица 1. Перечень генов иммунных контрольных точек, идентифицированных в настоящем изобретении в качестве приемлемых для получения аллогенных Т-клеток, более активных для иммунотерапии.

Таблица 2. Описание GR TALE-нуклеаз и последовательностей сайтов мишеней TALE-нуклеаз в гене человека GR.

Таблица 3. Расщепляющая активность GR TALE-нуклеаз в дрожжах. Величины находятся в диапазоне от 0 до 1. Максимальная величина равна 1.

Таблица 4. Процент направленного мутагенеза в сайтах-мишенях эндогенной TALE-нуклеазы в клетках HEK293.

Таблица 5. Процент направленного мутагенеза в эндогенных сайтах-мишенях TALE-нуклеазы в первичных Т-лимфоцитах.

Таблица 6. Описание CD52, TRAC и TRBC TALE-нуклеаз и последовательностей сайтов-мишеней TALE-нуклеаз в соответствующих генах человека.

Таблица 7. Дополнительные целевые последовательности TRAC и CD52 TALE-нуклеаз.

Таблица 8. Проценты инсерций-делеций в TALE-нуклеазе, нацеливающейся на мишени CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 и TRBC_T02.

Таблица 9. Проценты CD52-отрицательных, TCR-отрицательных и CD52/TCR-дважды отрицательных Т-лимфоцитов после трансфекции соответствующих TALE-нуклеаза-экспрессирующих полинуклеотидов.

Таблица 10. Проценты TCR-отрицательных Т-лимфоцитов после трансфекции TRBC TALE-нуклеаза-экспрессирующих полинуклеотидов.

Таблица 11. Описание CTLA4 и PDCD1 TALE-нуклеаз и последовательностей сайтой-мишеней TALE-нуклеаз в соответствующих генах человека.

Таблица 12. Описание подгруппы конструкций pTalpha.

Таблица 13. Активность разных конструкций pTalpha в клетках Jurkat с инактивированным TCR alpha. Активность измеряют методом жидкостной цитометрии по экспрессии CD3 в клетках Jurkat с инактивированным TCR alpha, трансфецированных разными конструкциями preTalpha.

Таблица 14. Различные программы Cytopulse, применяемые для определения минимального напряжения, требуемого для электропорации в Т-клетки, производные от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Таблица 15. Программа Cytopulse, используемая для электропорации очищенных Т-клеток.

Подробное описание изобретения

Если специально не указано иначе, все технические и научные термины имеют то же значение, что и обычно употребляемое специалистами в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.

Все методы и материалы, близкие или равные используемым в настоящем изобретении, могут применяться на практике или при тестировании настоящего изобретения, наряду с методами и материалами, описанными для применения в настоящем изобретении. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упоминаемые в настоящем изобретении, включены в него в виде ссылок на их целостную сущность. Особенно это касается объекта изобретения, раскрываемого в каждом из источников, который относится к объекту изобретения в примыкающих предложениях, параграфах или разделах, в которых источник цитируется. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, превалирует. Кроме того, все материалы, методы и примеры являются только иллюстрацией и не ограничивают настоящее изобретение, если не указано иначе.

В практике настоящего изобретения применяют, если не указано иначе, традиционные методы клеточной биологии, культур клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Эти методы подробно описаны в литературе. См., например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд., (Sambrook и др., 2001, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (под ред. M.J. Gait, 1984); Mullis и др., US 4683195; Nucleic Acid Hybridization (под ред. В.D. Harries и S.J. Higgins, 1984); Transcription And Translation (под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); серии, Methods In ENZYMOLOGY (под ред. J. Abelson и M. Simon, Academic Press, Inc., Нью-Йорк), в особенности Т. 154, 155 (под ред. Wu и др.) и Т. 185 "Gene Expression Technology" (под ред. D. Goeddel); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (под ред. Mayer и Walker, Academic Press, Лондон, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, T. I-IV (под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell, 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1986).

Главная задача настоящего изобретения заключается в разработке способов для новых адаптивных стратегий лечения рака и инфекций.

Высокоактивные Т-клетки для иммунотерапии, не являющиеся аллореактивными

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу конструирования Т-клеток специально для иммунотерапии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает:

а) получение Т-клеток,

б) интродукцию в указанные Т-клетки редкощепящих эндонуклеаз, способных селективно инактивировать ген иммунной контрольной точки путем расщепления ДНК; и

в) размножение указанных клеток.

В частности, этот способ включает:

а) модифицирование Т-клеток путем инактивирования по меньшей мере:

- первого гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки, и

- второго гена, кодирующего компонент Т-клеточного рецептора (TCR),

б) размножение указанных клеток.

Опосредованный Т-клетками иммунитет содержит множество последовательных стадий, включая клональную селекцию антигенспецифических клеток, их активацию и пролиферацию во вторичной лимфоидной ткани, их движение к сайтам антигена и воспалению, достижение прямой эффекторной функции и предоставление помощи (через цитокины и мембранные лиганды) множеству эффекторных иммунных клеток. Каждая и этих стадий регулируется противовесом стимулирующего и ингибирующего сигнала, который тонким образом настраивает ответ. Специалистам в данной области известно, что термин «иммунные контрольные точки» означает группу молекул, экспрессируемых Т-клетками. Эти молекулы эффективно служат в качестве «тормозов» для снижения модуляции или ингибирования иммунного ответа. К молекулам иммунных контрольных точек относятся, но ими перечень не ограничивается, белок запрограммированной смерти 1 (Programmed Death 1 - PD-1, также обозначаемый PDCD1 или CD279, номер доступа: NM_005018), антиген цитотоксического Т-лимфоцита 4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 - CTLA-4, также обозначаемый CD152, GenBank номер доступа: AF414120.1), белок LAG3 (также обозначаемый CD223, номер доступа: NM_002286.5), Tim3 (также обозначаемый HAVCR2, GenBank номер доступа: JX049979.1), BTLA (также обозначаемый CD272, номер доступа: NM_181780.3), BY55 (также обозначаемый CD160, GenBank номер доступа: CR541888.1), TIGIT (также обозначаемые VSTM3, номер доступа: NM_173799), В7Н5 (также обозначаемый C10orf54, гомолог гена мыши vista, номер доступа: NM_022153.1), LAIR1 (также обозначаемый CD305, GenBank номер доступа: CR542051.1), SIGLEC10 (GeneBank номер доступа: AY358337.1), 2В4 (также обозначаемый CD244, номер доступа: NM_001166664.1), которые непосредственно ингибируют иммунные клетки. Например, CTLA-4 является белком на поверхности клетки, экспрессируемым на определенных CD4 и CD8 Т-клетках; при связывании собственными лигандами (В7-1 и В7-2) на антиген-презентирующих клетках, подавляются активация и эффекторная функция Т-клеток. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу конструирования Т-клеток специально для иммунотерапии, включая генетически модифицированные Т-клетки, путем инактивирования по меньшей мере одного белка, участвующего в иммунной контрольной точке, в частности PD1 и/или CTLA-4.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа, основывающегося на инактивации одного гена, предпочтительно двух генов, выбранных из группы, включающей PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alpha и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации в способе основана на инактивации двух генов, выбранных из группы, включающей PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа основана на инактивации более двух генов. Генетическая модификация предпочтительно осуществляется ex-vivo.

Приведенная ниже табл. 1, которая не является исчерпывающей, показывает гены иммунных контрольных точек, которые могут быть инактивированы согласно изложенному в настоящем изобретении для того, чтобы улучшить эффективность и соответствие сконструированных Т-клеток. Ген иммунных контрольных точек предпочтительно выбран из генов, обладающих идентичностью по отношению к тем генам, которые перечислены в этой таблице и участвуют в функции ко-ингибирующего рецептора, гибели клеток, передаче цитокиновых сигналов, истощении аргинина и триптофана, активации TCR, индуцированной T-reg репрессии, контроля факторами транскрипции истощения или слабости, и устойчивости, опосредованной гипоксией.

Предполагают, что за счет инактивации гена целевой ген не экспрессируется в форме функционального белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения генетическая модификация метода основывается на экспрессии в предназначенных для конструирования клетках одной из редкощепящих эндонуклеаз таким образом, что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, тем самым инактивируя указанный целевой ген. Разрывы цепи нуклеиновой кислоты, вызванные редкощепящей эндонуклеазой, обычно подвергаются репарации через различные механизмы гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (non-homologous end joining - NHEJ). Однако NHEJ не является совершенным процессом репарации, что часто приводит к изменениям в последовательности ДНК по сайту расщепления. Механизмы включают воссоединение остатков двух концов ДНК путем прямого повторного лигирования (Critchlow и Jackson, 1998) или за счет так называемого основанного на микрогомологии соединения концов (Ма и др., 2003). Репарация путем соединения негомологичных концов (NHEJ) часто приводит к малым инсерциям или делециям и может применяться для создания специфических генных нокаутов. Указанная модификация может представлять замещение, делецию или вставку по меньшей мере одного нуклеотида. Клетки, в которых происходит мутагенез путем расщепления, т.е. мутагенез - следствие NHEJ, могут быть идентифицированы и/или выбраны методом, хорошо известным специалистам в этой области.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ конструирования клеток включает по меньшей мере одну из следующих стадий:

(а) получения Т-клеток, предпочтительно из культуры клеток или из образца крови;

(б) интродукции в указанные Т-клетки редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать путем расщепления ДНК, предпочтительно путем двухцепочечного разрыва, соответственно:

- указанный ген, кодирующий белок иммунной контрольной точки, и

- по меньшей мере один ген, кодирующий компонент рецептора Т-клеток (T-cell receptor - TCR);

(в) размножения указанных клеток.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ включает стадии:

(а) получения Т-клеток, предпочтительно из культуры клеток или из образца крови;

(б) трансформацию указанных Т-клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную селективно инактивировать за счет расщепления ДНК, предпочтительно путем двухцепочечного разрыва, соответственно:

- указанный ген, кодирующий белок иммунной контрольной точки, и

- по меньшей мере один ген, кодирующий компонент рецептора Т-клеток (T-cell receptor - TCR);

(в) экспрессии указанных редкощепящих эндонуклеаз в указанных Т-клетках;

(г) сортировки трансформированных Т-клеток, которые не экспрессируют TCR на своей поверхности;

(д) размножения указанных клеток.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически нацеливается на один ген, выбранный из группы, включающей: PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alpha и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения генетическая модификация способа основывается на экспрессии в полученных для конструирования клетках двух редкощепящих эндонуклеаз таким образом, что каждая из двух указанных редкощепящих эндонуклеаз специфически и соответствующим образом катализирует расщепление в каждой из пар генов, выбранных из группы, включающей: PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta, тем самым инактивируя указанные целевые гены. В другом варианте осуществления настоящего изобретения более двух редкощепящих эндонуклеаз могут экспрессироваться в клетках для конструирования с целью нацеливания и/или инактивирования более двух генов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая эндонуклеаза может быть мегануклеазой, цинк-пальцевой нуклеазой или TALE-нуклеазой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая эндонуклеаза является TALE-нуклеазой. Под TALE-нуклеазой подразумевается гибридный белок, состоящий из ДНК-связывающего домена, происходящего от эффектора, подобного активатору транскрипции (Transcription Activator Like Effector - TALE), и одного каталитического домена нуклеазы для расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты. (Boch и др., 2009; Moscou и Bogdanove, 2009; Christian и др., 2010; Cermak и др., 2011; Geissler и др., 2011; Huang и др., 2011; Li и др., 2011; Mahfouz и др., 2011; Miller и др., 2011; Morbitzer и др., 2011; Mussolino и др., 2011; Sander и др., 2011; Tesson и др., 2011; Weber и др., 2011; Zhang и др., 2011; Deng и др., 2012; Li и др., 2012; Mahfouz и др., 2012; Mak и др., 2012).

В настоящем изобретении сконструированы новые TALE-нуклеазы для точного нацеливания на релевантные гены для адаптивных стратегий иммунотерапии. Предпочтительными TALE-нуклеазами по настоящему изобретению являются те, которые распознают и расщепляют целевую последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78 (PD1), с SEQ ID NO: 74 по SEQ ID NO: 76 (CTLA-4), SEQ ID NO: 37, с SEQ ID NO: 57 по SEQ ID NO: 60 (TCRalpha), SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 39 (TCRbeta). Настоящее изобретение также относится к полипептидам TALE-нуклеаз, которые включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 79 по SEQ ID NO: 88 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 46.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 79 по SEQ ID NO: 88. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, векторам, кодирующим описанные выше редкощепящие эндонуклеазы по настоящему изобретению. Указанный способ может быть объединен с каким-либо из различных способов, изложенных в настоящем описании.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавочный каталитический домен может быть дополнительно интродуцирован в клетку с указанной редкощепящей эндонуклеазой для повышения мутагенеза с целью усиления их способности инактивировать целевые гены. В частности указанный дополнительный каталитический домен является ферментом, процессирующим конец ДНК. Примерами, которые не ограничивают настоящее изобретение, являются ферменты, процессирующие конец ДНК: 5-3' экзонуклеазы, 3-5' экзонуклеазы, 5-3' щелочные экзонуклеазы, 5' флэп-эндонуклеазы, геликазы, фосфатазы, гидролазы и независящие от матрицы ДНК-полимеразы. Примерами таких каталитических доменов, которые не ограничивают настоящее изобретение, являются белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранные из группы, включающей: hExoI (EXO1_HUMAN), Yeast ExoI (EXO1_YEAST), E. coli ExoI, Human TREX2, Mouse TREX1, Human TREX1, Bovine TREX1, Rat TREX1, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза), Human DNA2, Yeast DNA2 (DNA2_YEAST). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный дополнительный каталитический домен обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью, и в более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанным дополнительным каталитическим доменом является TREX, более предпочтительно каталитический домен TREX2 (WO 2012/058458). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный каталитический домен кодируется одноцепочечным полипептидом TREX (WO 2013/009525). Указанный дополнительный каталитический домен может быть гибридизирован с нуклеазным гибридным белком или химерным белком по настоящему изобретению необязательно пептидным линкером.

Известно, что эндонуклеотические разрывы стимулируют степень гомологической рекомбинации. Например, в другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации метода дополнительно включает стадию интродукции в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере последовательность, гомологичную части целевой последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, что гомологичная рекомбинация происходит между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота включает первую и вторую части, гомологичные области 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты, соответственно. В вариантах осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота также включает третью часть, расположенную между первой и второй частями, которая не имеет гомологии с областями 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты. После расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты гомологическая рекомбинация стимулируется между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно гомологичные последовательности, по меньшей мере из 50 п.о., предпочтительно более чем из 100 п.о. и более предпочтительно более чем из 200 п.о., применяют в указанном матриксе донора. Следовательно, экзогенная нуклеиновая кислота содержит предпочтительно от 200 п.о. до 6000 п.о., более предпочтительно от 1000 п.о. до 2000 п.о. В самом деле, общие гомологи нуклеиновой кислоты локализованы в областях, фланкирующих вниз по цепи и вверх по цепи сайт разрыва, и интродуцируемая последовательность нуклеиновой кислоты должна быть локализована между этими двумя плечами.

В частности, указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно включает первую область, гомологичную последовательностям, расположенным выше по цепи от указанного расщепления, последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, состоящей из генов иммунных контрольных точек TCR alpha и TCR beta, и вторую область, гомологичную последовательностям, расположенным ниже по цепи от указанного расщепления. Стадия указанной интродукции полинуклеотида может быть одновременно, до или после интродукции или экспрессии указанной редкощепящей эндонуклеазы. В зависимости от расположения целевой последовательности нуклеиновой кислоты, в которой происходит расщепление, такая экзогенная нуклеиновая кислота может применяться для нокаута гена, например, если экзогенная нуклеиновая кислота расположена в открытой рамке считывания указанного гена, или для интродукции новых последовательностей или целевых генов. Инсерции последовательностей с помощью такой экзогенной нуклеиновой кислоты могут применяться для модификации целевого имеющегося гена путем коррекции или замещения указанного гена (примером, который не ограничивает настоящее изобретение, является замещение аллеля), или путем повышения или понижения экспрессии целевого гена (примером, который не ограничивает настоящее изобретение, является замещение промотора), коррекции или замещения указанного целевого гена. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения инактивация генов из группы, включающей гены иммунных контрольных точек TCR alpha и TCR beta, может быть достигнута по строго определенному месту в геноме, на которое нацеливается специфическая TALE-нуклеаза, в котором указанная специфическая TALE-нуклеаза катализирует расщепление, и в котором указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно включает по меньшей мере область гомологии и последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, включающей гены иммунных контрольных точек TCR alpha и TCR beta, который интегрирован путем гомологической рекомбинации. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, несколько генов могут быть, последовательно или одновременно, инактивированы путем применения некоторых TALE-нуклеаз, соответствующим образом и специфически нацеливающихся на один определенный ген и несколько специфических полинуклеотидов для специфической генной инактивации.

Стадия дополнительной модификации генома также может заключаться в инактивации другого гена, выбранного из группы, включающей гены иммунных контрольных точек, TCR alpha и TCR beta. Выше отмечалось, что стадия дополнительной модификации генома может быть стадией инактивирования, включающей:

(а) интродукцию в указанные клетки по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы таким образом, что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одной целевой последовательности генома указанной клетки,

(б) необязательно интродукцию в указанные клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, последовательно включающей первую область, гомологичную последовательностям выше по цепи от указанного расщепления, последовательность, которую встраивают в геном указанной клетки, и вторую область, гомологичную последовательностям, расположенным ниже по цепи от указанного сайта расщепления,

причем указанная интродуцированная экзогенная нуклеиновая кислота инактивирует ген и интегрирует по меньшей мере одну экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один целевой рекомбинантный белок. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная полинуклеотидная последовательность объединяется с геном, выбранным из группы, состоящей из генов иммунных контрольных точек, TCR alpha и TCR beta.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ конструирования клеток дополнительно включает стадию модификации генома. С помощью дополнительной стадии модификации генома может быть осуществлена интродукция в клетки для конструирования одного целевого белка. Указанным целевым белком могут быть, например, pTalpha или его функциональный вариант, химерный антигенный рецептор (Chimeric Antigen Receptor - CAR), многоцепочечный CAR, биспецифическое антитело, согласно описанию настоящего изобретения, но этими примерами перечень не ограничивается. Указанный способ конструирования клеток также может дополнительно включать интродукцию редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать путем расщепления ДНК ген, кодирующий мишень указанного иммуносупрессирующего агента согласно описанию настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к TALE-нуклеазам. В основном настоящее изобретение относится к TALE-нуклеазе, включающей:

(а) эффектор нуклеаз, подобный активатору транскрипции (Transcription Activator Like Effector - TALE) ДНК-связывающий домен, который был сконструирован для связывания целевой последовательность в генах, выбранных из группы, состоящей из генов иммунных контрольных точек, TCR alpha и TCR beta;

(б) домен или полу домен расщепления.

Предпочтительными TALE-нуклеазами по настоящему изобретению являются нуклеазы, распознающие и расщепляющие целевую последовательность, выбранную из группы, включающей:

- SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78 (PD1)

- с SEQ ID NO: 74 по SEQ ID NO: 76 (CTLA-4),

- SEQ ID NO: 37, с SEQ ID NO: 57 по SEQ ID NO: 60 (TCRalpha), и

- SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 39 (TCRbeta).

Указанные TALE-нуклеазы предпочтительно включают полипептидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 79 по SEQ ID NO: 88 для расщепления соответствующей целевой последовательности с SEQ ID NO: 74 по SEQ ID NO: 78 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 46, для расщепления соответствующих целевых последовательностей с SEQ ID NO: 37 по SEQ ID NO: 39.

Поскольку некоторая вариабельность может возникнуть от генома, от которого происходят эти полипептиды, а также учитывая возможность замещения некоторых из аминокислот в составе этих полипептидов без значительной потери активности (функциональные варианты), настоящее изобретение включает варианты указанных выше полипептидов, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям, предусмотренным в настоящей патентной заявке.

Таким образом, настоящее изобретение представляет полипептиды, включающие полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 79 по SEQ ID NO: 88 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 46.

К области охвата настоящего изобретения также относятся полинуклеотиды, векторы, кодирующие описанные выше редкощепящие эндонуклеазы по настоящему изобретению.

К области охвата настоящего изобретения также относятся выделенные клетки или линии клеток, которые применимы для получения указанным способом конструированных клеток, в частности Т-клеток, в которых был инактивирован по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из генов иммунных контрольных точек, предпочтительно генов, выбранных из группы: PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alpha и TCR beta. Предпочтительно инактивированы два гена, выбранные из группы, включающей: PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta.

Согласно настоящему изобретению гены предпочтительно инактивированы по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазой. В настоящем изобретении установлено, что применение TALE-нуклеаз особенно полезно для достижения двойной инактивации в Т-клетках. Настоящее изобретение охватывает выделенные Т-клетки, включающие по меньшей мере два полинуклеотида, кодирующие по меньшей мере первую и вторую TALE-нуклеазы, предпочтительно первая TALE-нуклеаза нацеливается против гена, кодирующего TCR, а вторая нацеливается против гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки, например, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная выделенная клетка дополнительно включает одну дополнительную модификацию генома. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная дополнительная модификация генома представляет интеграцию по меньшей мере одной экзогенной полинуклеотидной последовательности. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная последовательность интегрирована в один ген, выбранный из группы, включающей PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alpha и TCR beta.

He аллореактивные и устойчивые к иммуносупрессии Т-клетки:

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу конструирования Т-клеток, особенно для иммунотерапии. В частности этот способ включает:

(а) модифицирование Т-клеток путем инактивирования по меньшей мере:

- первого гена, экспрессирующего мишень для иммуносупрессирующего агента, и

- второго гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (T-cell receptor - TCR),

(б) размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессирующего агента.

Иммуносупрессирующим называется агент, который супрессирует иммунную функцию по одному из нескольких механизмов действия. Иначе говоря, иммуносупрессирующий агент выступает в качестве вещества, которое проявляется по способности уменьшать степень проявления и/или интенсивность иммунного ответа. Примером, не ограничивающим области охвата настоящего изобретения, является иммуносупрессирующий агент, который может быть ингибитором кальценеврина, мишенью рапамицина, блокатором α-цепи интерлейкина-2, ингибитором инозинмонофосфатдегидрогеназы, ингибитором редуктазы дигидрофолиевой кислоты, кортикостероидом или иммуносупрессивным антиметаболитом. Классические цитотоксические иммуносупрессивные средства действуют путем ингибирования синтеза ДНК. Другие могут действовать через активирование Т-клеток или путем ингибирования активации клеток-хэлперов. Способ по настоящему изобретению позволяет придавать иммуносупрессивную устойчивость Т-клеткам для иммунотерапии путем активирования мишени иммуносупрессивного агента в Т-клетках. Примерами, не ограничивающими области охвата настоящего изобретения, являются мишени для иммуносупрессорного агента, которые могут быть рецептором для иммуносупрессорного агента, например: CD52, глюкокортикоидным рецептором (glucocorticoid receptor - GR), представителем семейства генов FKBP и представителем семейства генов циклофилина.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа зависит от инактивации гена, выбранного из группы, включающей CD52, GR, TCR alpha и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа зависит от инактивации двух генов, выбранных из группы, включающей CD52 и GR, CD52 и TCR alpha, CDR52 и TCR beta, GR и TCR alpha, GR и TCR beta, TCR alpha и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа зависит от инактивации более двух генов. Генетическую модификацию предпочтительно осуществляют ex-vivo.

Предполагают, что за счет инактивирования целевой ген не экспрессируется в форму функционального белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения генетическая модификация способа зависит от экспрессии в клетках, предусмотренных для конструирования, одной редкощепящей эндонуклеазы таким образом, что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, тем самым инактивируя указанный целевой ген. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ конструирования клеток включает по меньшей мере одну из следующих стадий:

(а) получения Т-клеток, предпочтительно из культуры клеток или из образца крови;

(б) отбора гена в указанных Т-клетках, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного агента;

(в) интродукции в указанные Т-клетки редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать за счет расщепления ДНК, предпочтительно за счет двухцепочечного расщепления соответствующим образом:

- указанного гена, кодирующего мишень для указанного иммуносупрессорного агента, и

- по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR);

(г) размножения указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессорного агента.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ включает:

(а) получение Т-клеток, предпочтительно из культуры клеток или из образца крови;

(б) отбор гена в указанных Т-клетках, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного агента;

(в) трансформацию указанных Т-клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную селективно инактивировать путем расщепления ДНК, предпочтительно за счет следующего двухцепочечного расщепления:

- указанного гена, кодирующего мишень для указанного иммуносупрессивного агента, и

- по меньшей мере, одного гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR);

(г) экспрессию указанных редкощепящих эндонуклеаз в указанных Т-клетках;

(д) сортировку трансформированных Т-клеток, которые не экспрессируют TCR на своей поверхности;

(е) размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессирующего агента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая нуклеаза специфически нацеливается на один ген, выбранный из группы, включающей CD52, GR, TCR alpha и TCR beta. В другом варианте осуществления настоящего изобретения генетическая модификация способ основана на экспрессии в клетках, предназначенных для конструирования, двух редкощепящих эндонуклеаз таким образом, что каждая из двух указанных редкощепящих эндонуклеаз специфически и соответствующим образом катализирует расщепление в каждой из пары генов, выбранных из группы, включающей CD52 и GR, CD52 и TCR alpha, CDR52 и TCR beta, GR и TCR alpha, GR и TCR beta, TCR alpha и TCR beta, тем самым инактивирую указанные целевые гены. В другом варианте осуществления настоящего изобретения более двух редкощепящих эндонуклеаз может экспрессироваться в клетках для конструирования с целью нацеливания и/или инактивирования более двух генов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным геном на стадии (б), специфическим для иммуносупрессивной обработки, является CD52, и иммуносупрессорная обработка на стадии (г) или (д) включает гуманизированное антитело, нацеленное на антиген CD52.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным геном на стадии (б), специфическим для иммуносупрессорной обработки, является глюкокортикоидный рецептор (GR) и иммуносупрессивная обработка на стадии (г) или (д) включает кортикостероид, например, дексаметазон.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным целевым геном на стадии (б), специфическим для иммуносупрессивной обработки, является представитель генного семейства FKBP или его вариант и иммуносупрессивная обработка на стадии (г) или (д) включает FK506, также называемый такролимусом или фуджимицином. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным представителем генного семейства FKBP является FKBP12 или его вариант.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанным геном на стадии (б), специфическим для иммуносупрессивной обработки, является представитель генного семейства циклофилина или его вариант и иммуносупрессивная обработка на стадии (г) или (д) включает циклоспорин.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая эндонуклеаза может быть мегануклеазой, цинк-пальцевой нуклеазой или TALE-нуклеазой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанной редкощепящей эндонуклеазой является TALE-нуклеаза. Предпочтительными TALE-нуклеазами по настоящему изобретению являются те TALE-нуклеазы, которые распознают и расщепляют целевую последовательность, выбранную из группы, включающей:

- SEQ ID NO: с 1 по 6 (GR),

- SEQ ID NO: 37, с 57 по 60 (TCR alpha),

- SEQ ID NO: 38 или 39 (TCR beta) и

- SEQ ID NO: 40, с 61 по 65 (CD52).

Указанные TALE-нуклеазы предпочтительно включают полипептидную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: 7 по SEQ ID NO: 18 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 48, для расщепления соответствующих целевых последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 6 и с SEQ ID NO: 37 про SEQ ID NO: 40.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения дополнительный каталитический домен может быть дополнительно интродуцирован в клетку с указанной эндонуклеазой для усиления мутагенеза с целью повышения ее способности инактивировать целевые гены. В частности, указанным дополнительным каталитическим доменом является фермент, процессирующий конец ДНК. Примерами, которые не ограничивают настоящее изобретение, являются ферменты, процессирующие конец ДНК: 5-3' экзонуклеазы, 3-5' экзонуклеазы, 5-3' щелочные экзонуклеазы, 5' флэп-эндонуклеазы, геликазы, фосфатазы, гидролазы и независящие от матрицы ДНК-полимеразы. Примерами таких каталитических доменов, не ограничивающих области охвата настоящего изобретения, являются белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранные из группы, включающей hExoI (EXO1_HUMAN), Yeast ExoI (EXO1_YEAST), E. coli ExoI, Human TREX2, Mouse TREX1, Human TREX1, Bovine TREX1, Rat TREX1, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза), Human DNA2, Yeast DNA2 (DNA2_YEAST). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный дополнительный каталитический домен обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью, и в более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанным дополнительным каталитическим доменом является TREX, более предпочтительно каталитический домен TREX2 (WO 2012/058458). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный каталитический домен кодируется одноцепочечным полипептидом TREX. Указанный дополнительный каталитический домен может быть гибридизирован с нуклеазным гибридным белком или химерным белком по настоящему изобретению, необязательно пептидным линкером.

Известно, что разрывы эндонуклеазами стимулируют степень гомологической рекомбинации. Так, в другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия генетической модификации способа дополнительно включает стадию интродукции в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере последовательность, гомологичную части целевой последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что происходит гомологичная рекомбинация между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота включает первую и вторую части, которые гомологичны области 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты, соответственно. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота в этих вариантах осуществления настоящего изобретения также включает третью часть, расположенную между первой и второй частями, которая не гомологична областям 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты. После расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты гомологичная рекомбинация стимулируется между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно гомологичные последовательности по меньшей мере из 50 п.о., предпочтительно более чем из 100 п.о. и более предпочтительно более чем из 200 п.о. входят в указанный матрикс донора. Следовательно, экзогенная нуклеиновая кислота содержит предпочтительно от 200 п.о. до 6000 п.о., более предпочтительно от 1000 п.о. до 2000 п.о. В самом деле, общие гомологи нуклеиновой кислоты локализованы в областях, фланкирующих вниз по цепи и вверх по цепи сайт разрыва, и интродуцируемая последовательность нуклеиновой кислоты должна быть локализована между этими двумя плечами.

В частности указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно включает первую область гомологии к последовательностям, расположенным вверх по цепи от указанного расщепления, последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta, и вторую область гомологии к последовательностям, расположенным вниз по цепи от указанного расщепления. Указанная стадия интродукции полинуклеотида может быть произведена одновременно, до или после интродукции или экспрессии указанной редкощепящей эндонуклеазы. В зависимости от локализации последовательности целевой нуклеиновой кислоты, в которой происходит расщепление, такая экзогенная нуклеиновая кислота может применяться для нокуата гена, например, если экзогенная нуклеиновая кислота локализована в открытой рамке считывания указанного гена, или для интродукции новых целевых последовательностей или генов. Инсерцию последовательностей с помощью такой экзогенной нуклеиновой кислоты можно осуществить для модификации имеющегося целевого гена путем коррекции или замещения указанного гена (примером, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, является замена аллеля), или для повышения или понижения регулирования экспрессии целевого гена (примером, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, является замена промотора). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения инактивация генов из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta, может быть произведена по точному месту геномной локализации, на которую нацелена специфическая TALE-нуклеаза, причем указанная специфическая TALE-нуклеаза катализирует расщепление, а указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно включает по меньшей мере область гомологии и последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, включающей: CD52, GR, TCR alpha и TCR beta, которые интегрированы путем гомологической рекомбинации. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, несколько генов могут быть, последовательно или одновременно, инактивированы с помощью нескольких TALE-нуклеаз, соответствующим образом и специфически нацеливающихся на один определенный ген и несколько специфических полинуклеотидов для специфической генной инактивации.

С помощью стадии дополнительной геномной модификации также может быть достигнута инактивация другого гена, выбранного из группы, включающей: CD52, GR, TCR alpha и TCR beta. Выше упоминалось, что указанная стадия дополнительной модификации генома может быть стадией инактивации, включающей:

(а) интродукцию в указанные клетки по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы таким образом, что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одной целевой последовательности генома указанной клетки;

(б) необязательно интродукцию в указанные клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, последовательно включающей первую область, гомологичную последовательностям выше по цепи от указанного расщепления, последовательность, которую встраивают в геном указанной клетки, и вторую область, гомологичную последовательностям, расположенным ниже по цепи от указанного сайта расщепления,

причем указанная интродуцированная экзогенная нуклеиновая кислота инактивирует ген и интегрирует, по меньшей мере, одну экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один целевой рекомбинантный белок. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанную экзогенную полинуклеотидную последовательность интегрируют в ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ конструирования клеток дополнительно включает стадию модификации генома. С помощью дополнительной стадии модификации генома может быть осуществлена интродукция в клетки для конструирования целевого белка. Указанным целевым белком могут быть, например, pTalpha или его функциональный вариант, химерный антигенный рецептор (Chimeric Antigen Receptor - CAR), многоцепочечный CAR, биспецифическое антитело или редкощепящая эндонуклеаза, нацеливающаяся на PDCD1 или CTLA-4 согласно описанию настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к TALE-нуклеазам. В основном настоящее изобретение относится к TALE-нуклеазе, включающей:

(а) Эффектор нуклеаз, подобный активатору транскрипции (Transcription Activator Like Effector - TALE), ДНК-связывающий домен, который был сконструирован для связывания целевой последовательность в генах, выбранных из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta;

(б) Домен расщепления или полудомен расщепления.

Предпочтительными TALE-нуклеазами по настоящему изобретению являются нуклеазы, распознающие и расщепляющие целевую последовательность, выбранную из группы, включающей:

- SEQ ID NO: с 1 по 6 (GR),

- SEQ ID NO: 37, с 57 по 60 (TCR alpha),

- SEQ ID NO: 38 или 39 (TCR beta) и

- SEQ ID NO: 40, с 61 по 65 (CD52).

Указанные TALE-нуклеазы предпочтительно включают полипептидную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: 7 по SEQ ID NO: 18 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 48 для расщепления соответствующих целевых последовательностей с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 6 и с SEQ ID NO: 37 по SEQ ID NO: 40.

Поскольку некоторая вариабельность может возникнуть от свойств генома, от которого происходят эти полипептиды, а также учитывая возможность замещения некоторых из аминокислот в составе этих полипептидов без значительной потери активности (функциональные варианты), настоящее изобретение включает варианты указанных выше полипептидов, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям, предусмотренным в настоящей патентной заявке.

Таким образом, настоящее изобретение представляет полипептиды, включающие полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 7 по SEQ ID NO: 18 и с SEQ ID NO: 41 по SEQ ID NO: 48.

К области охвата настоящего изобретения также относятся полинуклеотиды, векторы, кодирующие описанные выше редкощепящие эндонуклеазы по настоящему изобретению.

К области охвата настоящего изобретения также относятся выделенные клетки или линии клеток, пригодные для получения указанным методом конструирования клеток, в частности Т-клеток, в которых был инактивирован по меньшей мере один ген из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta. Предпочтительно были инактивированы два гена, выбранные из группы, включающей CD52 и GR, CD52 и TCR alpha, CDR52 и TCR beta, GR и TCR alpha, GR и TCR beta, TCR alpha и TCR beta.

Согласно настоящему изобретению гены предпочтительно инактивированы по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазой. В настоящем изобретении установлено, что применение TALE-нуклеаз особенно полезно для достижения двойной инактивации в Т-клетках. Настоящее изобретение охватывает выделенные Т-клетки, включающие по меньшей мере два полинуклеотида, кодирующие по меньшей мере первую и вторую TALE-нуклеазы, предпочтительно первая TALE-нуклеаза нацелена против гена, кодирующего TCR, а вторая нацелена против гена, кодирующего рецептор для иммуносупрессивного агента, например, CD52 или GR.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные отдельные клетки также включают одну дополнительную геномную модификацию. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная дополнительная геномная модификация представляет интеграцию по меньшей мере одной экзогенной полинуклеотидной последовательности. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная экзогенная последовательность интегрирована в один ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR, TCR alpha и TCR beta.

PreTalpha

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу размножения TCR alpha-недостаточных Т-клеток, включающему интродукцию в указанные Т-клетки pTalpha (также обозначаемого preTCRα) или его функционального варианта и размножение указанных клеток, необязательно через стимуляцию комплекса CD3. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает:

(а) Трансформацию указанных клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере фрагмент pTalpha для поддержки экспрессии CD3 на поверхности;

(б) Экспрессию указанного pTalpha в указанных клетках;

(в) Размножение указанных клеток, необязательно через стимуляцию комплекса CD3.

Настоящее изобретение также относится к способу получения Т-клеток для иммунотерапии, включающему стадии способа размножения Т-клеток.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотидная последовательность pTalpha может быть интродуцирована случайным образом или через гомологичную рекомбинацию, в частности инсерция может быть ассоциирована с инактивацией гена TCR alpha.

Согласно настоящему изобретению применяют различные функциональные варианты pTalpha. Понятие «функциональный вариант» пептида в контексте настоящего изобретения означает молекулу, которая по существу схожа с целым пептидом или с его фрагментом. «Фрагментом» pTalpha или его функциональным вариантом в настоящем изобретении обозначают какое-либо подмножество молекулы, представленное более короткими пептидами. Предпочтительный pTalpha или его функциональный вариант может быть pTalpha полной длины или усеченной С-концевой версией pTalpha. С-концевой усеченный pTalpha утратил с С-конца один или более остатков. Примером усеченной С-концевой версии pTalpha, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, является белок, утративший остатки 18, 48, 62, 78, 92, 110 или 114 с С-конца (последовательности с SEQ ID NO: 107 по SEQ ID NO: 114). Кроме того, варианты аминокислотной последовательности пептида могут быть получены за счет мутаций в ДНК, кодирующей пептид. Такие функциональные варианты включают, например, делеции, или инсерции, или замещения остатков в аминокислотной последовательности. Какая-либо комбинация делеции, инсерции и замещения также может быть произведена для достижения итоговой конструкции, при условии, что итоговая конструкция обладает требуемой активностью, в частности восстанавливает функциональный комплекс CD3. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одну мутацию интродуцируют в различные версии pTalpha согласно описанному выше для воздействия на димеризацию. В качестве примера, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, мутантными остатками могут быть по меньшей мере W46R, D22A, K24A, R102A или R117A в белке человека pTalpha или выровненными положениями, используя метод CLUSTALW применительно к семейству pTalpha или гомологичному представителю. Предпочтительно pTalpha или его вариант согласно описанному выше включает мутантный остаток W46R (SEQ ID NO: 123) или мутантные остатки D22A, K24A, R102A и R117A (SEQ ID NO: 124). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный pTalpha или его варианты также гибридизированы с сигнал-трансдуцирующим доменом, например, CD28, ОХ40, ICOS, CD27, CD137 (4-1ВВ) и CD8 (с SEQ ID NO: 115 по SEQ ID NO: 120), но эти примеры не ограничивают области охвата настоящего изобретения. Внеклеточный домен pTalpha или описанные выше варианты могут быть гибридизированы с фрагментом белка TCRalpha, особенно с трансмембранным и внутриклеточным доменом TCRalpha (SEQ ID NO: 122). Варианты pTalpha также могут быть гибридизированы с внутриклеточным доменом TCRalpha (SEQ ID NO: 121).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные версии pTalpha гибридизуют с внеклеточным лиганд-связывающим доменом и более предпочтительно pTalpha или его функциональный вариант гибридизуют с одноцепочечным фрагментом антитела (single chain antibody fragment - scFV), включающим легкий (V_L) и тяжелый (V_H) вариабельный фрагмент целевого антигенспецифического моноклонального антитела, соединенного гибким линкером. В качестве примера, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, аминокислотную последовательность pTalpha или его функционального варианта выбирают из группы, включающей последовательности от SEQ ID NO: 107 по SEQ ID NO: 124.

Поскольку некоторая вариабельность может возникнуть от свойств генома, от которого происходят эти полипептиды, а также учитывая возможность замещения некоторых из аминокислот в составе этих полипептидов без значительной потери активности (функциональные варианты), настоящее изобретение включает варианты указанных выше полипептидов, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям, предусмотренным в настоящей патентной заявке.

Таким образом, настоящее изобретение представляет полипептиды, включающие полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей последовательности с SEQ ID NO: 107 по SEQ ID NO: 124.

TCR alpha-недостаточной Т-клеткой называют выделенную Т-клетку, которая утратила экспрессию функциональной TCR alpha цепи. Это может быть достигнуто разными средствами, например, путем конструирования Т-клетки таким образом, что она не экспрессирует функционального TCR alpha на своей поверхности, или путем конструирования Т-клетки таким образом, что она продуцирует очень слабо функциональную TCR alpha цепь на своей поверхности, или путем конструирования Т-клетки для экспрессии мутантной или усеченной формы TCR alpha цепи; эти примеры не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения.

TCR alpha-недостаточные клетки уже не могут быть размножены из-за комплекса CD3. Поэтому для решения данной проблемы и для осуществления пролиферации TCR alpha-недостаточных клеток, pTalpha или его функциональный вариант интродуцируют в указанные клетки, тем самым восстанавливая функциональный CD3 комплекс. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает интродукцию в указанные Т-клетки редкощепящих эндонуклеаз, способных селективно инактивировать путем расщепления ДНК один ген, кодирующий компонент рецептора Т-клеток (T-cell receptor - TCR). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретении указанными редкощепящими эндонуклеазами являются TALE-нуклеазы. В качестве примеров, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения, TALE-нуклеаза направлена против одной из целевых последовательностей TCRalpha, выбранных из группы, включающей последовательности SEQ ID NO: 37 и с SEQ ID NO: 57 по SEQ ID NO: 60. Предпочтительно TALE-нуклеазы выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ размножения TCRalpha-недостаточных Т-клеток включает дополнительную стадию модификации генома. С помощью дополнительной стадии модификации генома может быть осуществлена интродукция в клетки для конструирования одного целевого белка. Примером, не ограничивающим рамок охвата настоящего изобретения, может быть указанный целевой белок химерный антигенный рецептор (Chimeric Antigen Receptor - CAR), в частности CAR, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, многоцепочечный CAR, особенно многоцепочечный CAR, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125 биспецифического антитела, редкощепящие эндонуклеазы, нацеливающиеся на PDCD1 или CTLA-4, особенно нацеливающиеся на последовательности нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 74 по SEQ ID NO: 78, или редкощепящая эндонуклеаза, нацеливающаяся на мишень для иммуносупрессивного агента согласно описанию настоящего изобретения.

В рамках охвата настоящего изобретения также описаны полипептиды, кодирующие pTalpha, особенно описанные выше функциональные варианты. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к pTalpha или его функциональным вариантам, гибридизованным с сигнал-трансдуцирующим доменом, например, CD28, ОХ40, ICOS, CD137 и CD8. Точнее, настоящее изобретение относится к функциональному варианту pTalpha, включающему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 107 по SEQ ID NO: 124. В рамках охвата настоящего изобретения также описаны полинуклеотиды, векторы, кодирующие pTalpha или его функциональные варианты, описанные выше.

К области охвата настоящего изобретения также относятся выделенные клетки или линии клеток, пригодные для осуществления указанного способа. В частности указанные выделенные клетки или линии клеток получают путем интродукции в указанные клетки pTalpha или его функционального варианта для поддержания экспрессии CD3 на поверхности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанную выделенную клетку или линию клеток дополнительно модифицируют путем инактивирования гена TCRalpha. Этот ген предпочтительно инактивируют по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная редкощепящая эндонуклеаза является TALE-нуклеазой.

Многоцепочечный химерный антигенный рецептор (Chimeric Antigen Receptor - CAR)

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к многоцепочечному химерному антигенному рецептору (CAR), в высокой степени адаптированному к получению и размножению сконструированных Т-клеток по настоящему изобретению. Многоцепочечный CAR включает по меньшей мере два из следующих компонентов:

(а) один полипептид, включающий трансмембранный домен FcεRI alpha цепи и внеклеточный лиганд-связывающий домен,

(б) один полипептид, включающий часть N- или С-концевого цитоплазматического хвоста и трансмембранный домен FcεRI beta цепи, и/или

(в) два полипептида, каждый из которых включает часть внутрицитоплазматического хвоста и трансмембранный домен FcεRI gamma цепи, благодаря чему чего разные полипептиды спонтанно мультимеризуются вместе с формированием двумерного, трехмерного или тетрамерного CAR.

Пример тетрамерного CAR приведен на фиг. 3. Различные версии многоцепочечных CAR представлены на фиг. 4. Одним из примеров является многоцепочечный CAR, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125. Понятие «часть» относится к подмножеству молекул, являющихся более короткими пептидами. В другом варианте функциональные варианты аминокислотной последовательности полипептида могут быть получены путем мутаций ДНК, кодирующей полипептид. К таким функциональным вариантам относятся, например, формы с делециями, или инсерциями, или замещениями остатков в аминокислотной последовательности. Какая-либо комбинация делеции, инсерции и замещения также может быть сделана для получения итоговой конструкции, предусматривая, что итоговая конструкция проявляет требуемую активность, особенно специфическую клеточную иммунную активность в отношении мишени.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанным внеклеточным лиганд-связывающим доменом является scFv. Помимо scFv также может применяться другой связывающий домен для предопределенного нацеливания лимфоцитов, например, фрагменты камелидизированных однодоменных антител или лиганды рецепторов, такие как полипептид - фактор роста эндотелия сосудов, интегрин-связывающий пептид, херегулин или IL-13 мутеин, антитело-связывающие домены, гипервариабельные петли антитела или CDR; указанные примеры не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид по п. (а) дополнительно включает стволовую область между указанным внеклеточным лиганд-связывающим доменом и указанным трансмембранным доменом. Понятие «стволовая область» в контексте настоящего изобретения обычно означает какой-либо олиго- или полипептид, функция которого заключается в связывании трансмембранного домена с внеклеточным лиганд-связывающим доменом. В частности стволовую область применяют для обеспечения большей гибкости и доступности по отношению к внеклеточному лиганд-связывающему домену. Стволовая область может включать до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Стволовая область может быть производной от всех или части природных молекул, например, от всех или части внеклеточной области CD8, CD4 или CD28, или от всех или части константной области антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стволовая область может быть синтетической последовательностью, которая соответствует природной стволовой последовательности, или может быть полностью синтетической стволовой последовательностью.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид по пунктам (а), (б) и/или (в) дополнительно включает по меньшей мере один сигнал-трансдуцирующий домен. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный сигнал-трансдуцирующий домен выбран из группы, включающей CD28, ОХ40, ICOS, CD137 и CD8.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный С-концевой цитоплазматический хвост фрагмента цепи FcεRI alpha, beta и/или gamma дополнительно включает TNFR-ассоциированные фактор-2 (TRAF2) связывающие мотивы. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный С-концевой цитоплазматический хвост FcεRI alpha, beta и/или gamma цепи замещен внутрицитоплазматическим хвостом ко-стимулирующего представителя семейства TNFR. Цитоплазматический хвост ко-стимулирующего представителя семейства TNFR содержит TRAF2-связывающие мотивы, состоящие из крупного консервативного мотива (P/S/A)X(Q/E)E) или минорного мотива (PXQXXD), где X означает какую-либо аминокислоту. Белки TRAF рекрутируются к внутриклеточным хвостам многих TNFR в ответ на тримеризацию рецептора.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный внутрицитоплазматический домен цепи FcεRI alpha, beta и/или gamma замещен внутрицитоплазматическим доменом цепи TCR zeta (также называемым CD3 zeta). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный внутрицитоплазматический домен цепи FcεRI alpha, beta и/или gamma включает по меньшей мере один дополнительный активирующий тирозиновый мотив иммунных рецепторов (immunoreceptor tyrosine-based activation motif - ITAM). Мотивы ITAM являются хорошо охарактеризованными сигнальными мотивами, обнаруженными во внутрицитоплазматическом хвосте различных рецепторов, которые служат связующими сайтами для тирозиновых киназ класса syk/zap70. К примерам ITAM, применяемым в настоящем изобретении, относятся производные TCRzeta, FCRgamma, FCRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d.

В качестве примера, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, на фиг. 4 приведены разные версии многоцепочечных CAR.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения многоцепочечный CAR включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125. Настоящее изобретение относится к полипептидам, включающим полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95% 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 125.

В рамки охвата настоящего изобретения также включены полинуклеотиды и векторы, кодирующие описанные выше многоцепочечные CAR по настоящему изобретению.

В рамках охвата предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения Т-клеток для иммунотерапии, включающему интродукцию в указанные Т-клетки разных полипептидов, образующих указанный многоцепочечный CAR, и размножение указанных клеток.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ дополнительно включает стадию генетической модификации указанных клеток путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один компонент TCR и/или мишень для иммуносупрессирующего агента. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный ген выбран из группы, состоящей из TCR alpha, TCR beta, CD52 и GR. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ дополнительно включает интродукцию в указанные Т-клетки редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать путем расщепления ДНК указанные гены. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанной редкощепящей эндонуклеазой является TALE-нуклеаза. К предпочтительным TALE-нуклеазам по настоящему изобретению относятся те TALE-нуклеазы, которые распознают и расщепляют последовательность-мишень, выбранную из группы, состоящей из последовательностей: с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 6 (GR), SEQ ID NO: 37, с SEQ ID NO: 57 по SEQ ID NO: 60 (TCR alpha), SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 39 (TCR beta), SEQ ID NO: 40, с SEQ ID NO: 61 по SEQ ID NO: 65 (CD52).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный способ дополнительно включает стадию модификации генома. С помощью дополнительной стадии модификации генома может быть произведена интродукция в клетки для конструирования одного целевого белка. Указанный целевой белок может быть биспецифическим антителом, редкощепящей эндонуклеазой, нацеливающейся на PDCD1 или CTLA-4, pTalpha или их функциональными вариантами, описанными в настоящем изобретении, однако эти примеры не ограничивают области охвата настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам или линиям клеток, пригодным для получения указанным способом конструированных клеток. В частности указанные выделенные клетки включают экзогенные полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, составляющие указанный многоцепочечный CAR.

Биспецифические антитела

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения сконструированные Т-клетки, полученные разными ранее описанными способами, могут быть дополнительно обработаны биспецифическими антителами. Указанные Т-клетки могут быть обработаны биспецифическими антителами ex vivo до введения пациенту или in vivo после введения пациенту. Указанные биспецифические антитела включают две вариабельные области с разными антигенными свойствами, в результате чего сконструированные клетки вступают в непосредственную близость с целевым антигеном. В качестве примера, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, указанное биспецифическое антитело направляется непосредственно против опухолевого маркера и антигена лимфоцита, например CD3, и имеет возможность перенаправить и активировать какие-либо Т-клетки в кровяном русле против опухолей.

Способы доставки

Разные описанные выше способы включают интродукцию в клетку pTalpha или его функциональных вариантов, редкощепящей эндонуклеазы, TALE-нуклеазы, CAR или многоцепочечного CAR необязательно с ДНК-концевым процессирующим ферментом или экзогенной нуклеиновой кислотой. Примером, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, является интродукция в качестве трансгенов, кодируемых одним или разными плазмидными векторами, указанных pTalpha или его функциональных вариантов, редкощепящих эндонуклеаз, TALE-нуклеаз, CAR или многоцепочечных CAR необязательно с ДНК-концевым процессирующим ферментом или экзогенной нуклеиновой кислотой. Разные трансгены могут быть включены в один вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность рибосомального проскока, например, последовательность, кодирующую пептид 2А. Пептиды 2А, идентифицированные в подгруппе Aphthovirus пикорнавирусов, вызывают рибосомальный «проскок (скип)» от одного кодона к другому без формирования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (Donnelly и др.,, J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly и др.,, J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina и др., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins и др.,, RNA 13: 803-810 (2007)). Понятие «кодон» означает три нуклеотида в мРНК (или в смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, полипептиды могут быть синтезированы из одной смежной открытой рамки считывания в мРНК, где полипептиды разделены олигопептидной последовательностью 2А, имеющейся в рамке. Такие механизмы рибосомальных проскоков известны в данной области, а также известно, что они используются в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной мРНК. В качестве примера, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, пептиды 2А используют для экспрессии в клетке редкощепящей эндонуклеазы, фермента, процессирующего конец ДНК, или различных полипептидов многоцепочечного CAR.

Указанный плазмидный вектор может содержать селективный маркер, который предназначен для идентификации и/или отбора клеток, получивших указанный вектор.

Полипептиды могут быть синтезированы in situ в клетке в качестве результата интродукции в клетку полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные полипептиды могут быть выработаны вне клетки и затем интродуцированы в нее. Методы интродукции полинуклеотидной конструкции в клетки животных известны в данной области, их примерами, которые не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения, являются методы стабильной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и методы, основанные на вирусах. Указанные полинуклеотиды могут быть интродуцированы в клетку, например, с помощью рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусных, аденовирусных), липосом и других. Например, к методам кратковременной трансформации относятся микроинъекции, электропорация или бомбардировка частицами. Указанные полинуклеотиды могут быть включены в векторы, точнее в плазмиды или вирусы, имея в виду, что они будут экспрессироваться в клетках.

Электропорация

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, могут быть молекулами мРНК, которую интродуцируют непосредственно в клетки, например, с помощью электропорации. В настоящем изобретении определяют оптимальное условие электропорации мРНК в Т-клетки.

В настоящем изобретении применяют технологию cytoPulse, которая позволяет с помощью пульсирующих электрополей кратковременно делать живые клетки проницаемыми для поступления вещества в клетки. Эта технология, основанная на применении колебательных волн для электропорации от генератора PulseAgile (собственность фирмы Cellectis), обеспечивает точный контроль длительность импульса, его интенсивности, а также интервалу между импульсами (US 6010613, WO 2004083379). Все эти параметры могут быть модифицированы для достижения наилучших условий для высокоэффективной трансфекции при минимальной гибели. По существу, первые высокие импульсы электрического поля формируют поры, последующие низкие импульсы электрического поля позволяют перемещать полинуклеотид в клетку. В одном из объектов осуществления настоящего изобретения описывают стадии, которые приводят к эффективности трансфекции мРНК в Т-клетки >95%, и применение протокола электропорации для кратковременной экспрессии белков разного типа в Т-клетки. В частности настоящее изобретение относится к способу трансформации Т-клеток, включающему контакт указанной Т-клетки с РНК и применение к Т-клетке последовательности быстро сменяемых импульсов, состоящей из:

(а) одного электрического импульса в диапазоне электрического напряжения от 2250 до 3000 В/см при длительности импульса 0,1 мсек и интервале между импульсами от 0,2 до 10 мсек на стадиях (а) и (б);

(б) одного электрического импульса в диапазоне электрического напряжения от 2250 до 3000 В при длительности импульса 100 мсек и интервале 100 мсек между электрическими импульсами на стадиях (б) и первого электрического импульса на стадии (в); и

(в) 4 электрических импульсов с напряжением 325 В при длительности импульса 0,2 мсек и интервале 2 мсек между каждым из 4 электрических импульсов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ трансформации Т-клеток включает контакт указанных Т-клеток с РНК и применение к Т-клеткам последовательности быстро сменяемых импульсов, состоящей из:

(а) одного электрического импульса с напряжением 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В/см, при длительности импульса 0,1 мсек и интервале между электрическими импульсами на стадиях (а) и (б) 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мсек;

(б) одного электрического импульса в диапазоне от 2250, составляющего 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В при длительности импульса 100 мсек и интервале 100 мсек между электрическими импульсами на стадиях (б) и первого электрического импульса на стадии (в); и

(в) 4 электрических импульсов с напряжением 325 В при длительности импульса 0,2 мсек и интервале 2 мсек между каждым из 4 электрических импульсов.

Какие-либо величины, включенные в диапазон величин, описаны выше и раскрыты в настоящей патентной заявке. Средой для электропорации может быть какая-либо приемлемая среда, известная в данной области. Предпочтительно среда для электропорации имеет электропроводность в диапазоне, охватывающем от 0,01 до 1,0 мСм.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения примером, который не ограничивает рамок охвата настоящего изобретения, является указанная РНК, которая кодирует редкощепящую эндонуклеазу, один мономер редкощепящей эндонуклеазы, например, полу-TALE-нуклеазы, химерный антигенный рецептор, по меньшей мере один компонент многоцепочечного химерного антигенного рецептора, pTalpha или его функциональный вариант, экзогенную нуклеиновую кислоту, один дополнительный каталитический домен.

Активирование и размножение Т-клеток

Независимо от того, была уже проведена модификация Т-клеток или нет, Т-клетки могут быть активированы и размножены в основном методами, описанными, например, в патентах US 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и в заявке на патент US 20060121005. Т-клетки могут быть размножены in vitro или in vivo.

Как правило, Т-клетки по настоящему изобретению размножают контактом с поверхностью, к которой присоединен антиген, стимулирующий ассоциированный с CD3 TCR комплексом сигнал, и лиганд, стимулирующий ко-стимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток.

В частности популяции Т-клеток могут быть простимулированы in vitro, например, за счет контакта с анти-CD3 антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, или анти-CD2 антителом, иммобилизованным на поверхности, или путем контакта с активатором протеинкиназы С (например, с бриостатином) в сцеплении с ионофором кальция. Для ко-стимуляции дополнительной молекулы на поверхности Т-клетки применяют лиганд, который связывает дополнительную молекулу. Например, популяция Т-клеток может контактировать с анти-CD3 антителом и анти-CD28 антителом в условиях, пригодных для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для стимуляции пролиферации либо CD4+ Т-клеток, либо CD8+ Т-клеток, применяют анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. Например, агенты, обеспечивающие каждый сигнал, могут быть в растворе или соединены с поверхностью. Специалисты в данной области могут определить соотношение частиц и клеток в зависимости от размера частиц относительно клеток-мишеней. В других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки, например Т-клетки, объединяют с гранулами с нанесенным на них агентом, затем гранулы и клетки разделяют, после чего клетки культивируют. В другом варианте осуществления настоящего изобретения перед культивированием гранулы с нанесенным агентом и клетки не разделяют, а культивируют совместно. Белки поверхности клетки могут быть лигированы за счет парамагнитных гранул, к которым присоединены анти-CD3 и анти-CD28 (3×28 гранул) для контакта с Т-клетками. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки (например, от 4 до 10 клеток) и гранулы (например, парамагнитные гранулы DYNABEADS® М-450 CD3/CD28 Т в соотношении 1:1) объединяют в буфере, предпочтительно ФСБ (не содержащем двухвалентных катионов, например, кальция и магния). Кроме того, специалисты в данной области могут подобрать какую-либо концентрацию клеток для применения. Смесь могут культивировать на протяжении от нескольких часов (примерно 3 ч) до 14 суток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения смесь могут инкубировать до 21 суток. К условиям, пригодным для культуры Т-клеток, относится соответствующая среда (например, минимальная поддерживающая среда, или среда RPMI 1640, или X-vivo 5, (фирма Lonza)), которая может содержать факторы, требуемые для пролиферации и жизнеспособности. К таким факторам относятся сыворотка (например, фетальная сыворотка теленка или сыворотка человека), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp и TNF- или какие-либо другие факторы для роста клеток, известные специалистам в данной области. К другим дополнительным факторам для роста клеток относятся, но ими перечень не ограничивается, поверхностно-активное вещество, плазманат, и восстанавливающие агенты, например, N-ацетил-цистеин и 2-меркаптоэтанол. К средам относятся RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, а-МЕМ, F-12, Х-Vivo 1 и X-Vivo 20, Optimizer, в которые добавляют аминокислоты, пируват натрия и витамины, не добавляют или добавляют требуемое количество сыворотки (или плазмы), или определенный набор гормонов, и/или количество цитокина (цитокинов), достаточное для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, добавляют только в экспериментальные культуры, но не в те культуры клеток, которые вводят субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, требуемых для сохранения роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°С) и атмосфере (например, воздух плюс 5% СО₂). Т-клетки, подвергнутые различной стимуляции, могут проявлять разные свойства.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки могут размножать путем совместного культивирования с тканью или клетками. Указанные клетки также могут быть размножены in vivo, например, в крови субъекта после введения указанной клетки субъекту.

Модифицированные Т-клетки

В рамки охвата настоящего изобретения также включена выделенная Т-клетка, полученная одним из ранее описанных способов. Указанная Т-клетка по настоящему изобретению может быть производной стволовой клетки. Стволовые клетки могут быть стволовыми клетками взрослых, эмбриональными стволовыми клетками, особенно стволовыми клетками, не являющимися стволовыми клетками человека, стволовыми клетками пуповинной крови, клетками-предшественницами, стволовыми клетками костного мозга, индуцированными мультипотентными стволовыми клетками, тотипотентными стволовыми клетками или кроветворными стволовыми клетками. Образцом клеток человека являются клетки человека CD34+. Указанные выделенные клетки также могут быть древовидными клетками, клетками - природными киллерами, В-клетками или Т-клетками, выбранными из группы, состоящей из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или лимфоцитов Т-хелперов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная клетка может быть производной от группы клеток, включающей CD4+ Т-лимфоциты и CD8+ Т-лимфоциты. Перед размножением и генетической модификацией клеток по настоящему изобретению источник клеток может быть получен от субъекта один из многочисленных методов, перечень которых не ограничен. Т-клетки могут быть получены от ряда источников, которыми перечень не ограничивается и к которым относятся мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфоузла, ткань тимуса, ткань из места инъекции, асцит, плевральное истечение, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может применяться какое-либо количество доступных линий Т-клеток, известных и доступных специалистам в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки могут быть получены от здорового донора, от пациента с диагнозом рак, или от пациента с диагнозом инфекция. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная клетка является частью смешанной популяции клеток, обладающих разными фенотипическими характеристиками. В рамки охвата настоящего изобретения также включена линия клеток, полученная от трансформированных Т-клеток ранее описанным методом. Модифицированные клетки устойчивые к иммуносупрессивному лечению и чувствительные, полученные предшествующими методами, входят в рамки охвата настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная выделенная клетка по настоящему изобретению включает один инактивированный ген, выбранный из группы, включающей CD52, GR, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alpha и TCR beta и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или pTalpha трансген. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная выделенная клетка по настоящему изобретению включает два инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из CD52 и GR, CD52 и TCR alpha, CDR52 и TCR beta, GR и TCR alpha, GR и TCR beta, TCR alpha и TCR beta, PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или pTalpha трансген.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения TCR становится нефункциональным в клеткам по настоящему изобретению за счет инактивирования гена (генов) TCR alpha и/или TCR beta. Указанные выше подходы применяют в частности для того, чтобы избежать GvHD. Настоящее изобретение также предусматривает способ получения модифицированных клеток, производных от индивидуума, причем указанные клетки могут пролиферировать независимо от сигнального пути главного комплекса гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex - МНС). Указанный способ включает следующие стадии:

(а) Выделения клеток от указанного индивидуума;

(б) Генетической модификации указанных клеток ex-vivo путем инактивирования генов TCR alpha или TCR beta;

(в) Культивирования генетически модифицированных Т-клеток in vitro в соответствующих условиях для амплификации указанных клеток.

Модифицированные клетки, которые могут пролиферировать независимо от сигнального пути главного комплекса гистосовместимости и могут быть получены данным способом, находятся в рамках охвата настоящего изобретения. Указанные модифицированные клетки могут применяться в определенном объекте настоящего изобретения для лечения пациентов, нуждающихся в этом, у которых наблюдают процесс отторжения «хозяин против трансплантата» (host versus graft rejection - HvG) и болезнь «трансплантат против хозяина» (graft versus host - GvHD); таким образом, в рамках охвата настоящего изобретения находится способ лечения пациентов, нуждающихся в этом, от процесса отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного пациента путем введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, включающих инактивированный ген (гены) TCR alpha и/или TCR beta.

Применение в терапии

В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенную клетку, полученную разными методами, или линию клеток, производную от указанной выделенной клетки согласно ранее описанному, можно использовать в качестве лекарственного средства. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное лекарственное средство можно использовать для лечения рака или инфекций у пациента, нуждающегося в этом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная выделенная клетка по настоящему изобретению или линия клеток, производная от указанной выделенной клетки, может применяться для получения лекарственного средства для лечения рака или вирусной инфекции у пациента, нуждающегося в этом.

Другой объект настоящего изобретения относится к способам лечения пациента, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает по меньшей мере одну из следующих стадий:

(а) получения Т-клетки каким-либо из ранее описанных способов;

(б) введения указанных трансформированных Т-клеток указанному пациенту.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные Т-клетки по настоящему изобретению могут претерпевать in vivo надежное размножение Т-клеток и могут сохраняться на протяжении длительного времени.

Указанное лечение может улучшать состояние больного, быть лечебным или профилактическим. Оно может быть либо частью аутологической иммунотерапии, либо частью аллогенной иммунотерапии. Понятие «аутологические» означает, что клетки, линии клеток или популяция клеток, используемые для лечения пациентов, происходят от указанного пациента или от совместимого донора человеческого лейкоцитарного антигена (Human Leucocyte Antigen - HLA). Понятие «аллогенные» означает, что клетки или популяция клеток, используемые для лечения пациентов, происходят не от указанного пациента, а от донора.

Настоящее изобретение в частности настолько применимо для аллогенной иммунотерапии, насколько оно позволяет трансформировать Т-клетки, обычно получаемые от доноров, в неаллореактивные клетки. Трансформация может быть выполнена по стандартным протоколам и воспроизводится столько раз, сколько требуется. Полученные модифицированные Т-клетки могут быть объединены и введены одному или нескольким пациентам, т.е. могут выступать в качестве доступного продукта «с полки».

Клетки, которые могут применяться в раскрываемых способах, описаны в предыдущем разделе. Указанное лечение могут применять для лечения пациентов с диагнозами рак, вирусная инфекция, аутоиммунные расстройства или состояние «трансплантат против хозяина» (GvHD). К заболеваниям раком, которые можно вылечить, относятся неваскуляризированные опухоли или еще недостаточно васкуляризированные опухоли, а также васкуляризованные опухоли. К заболеваниям раком могут относиться несолидные опухоли (например, онкологические заболевания системы кроветворения, лейкозы и лимфомы) или солидные опухоли. К типам рака, поддающимся лечению CAR по настоящему изобретению, относятся, но ими не ограничиваются, карцинома, бластома и саркома, а также некоторые формы лейкоза или лимфоидных злокачественных заболеваний, доброкачественные и злокачественные опухоли, и такие злокачественные заболевания, как саркомы, карциномы и меланомы. К этому перечню также относятся опухоли/рак взрослых и опухоли/рак детей.

Лечение рака могут проводить в комбинации с одной или несколькими другими терапиями, выбранными из группы, включающей лечение антителами, химиотерапию, терапию цитокинами, терапию древовидными клетками, генную терапию, терапию гормонами, терапию светом лазера и терапию радиацией.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное лечение могут назначать пациентам с иммуносупрессивным заболеванием. В самом деле, настоящее изобретение предпочтительно относится к клеткам или популяции клеток, которые сделали устойчивыми по меньшей мере к одному иммуносупрессорному агенту из-за инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммуносупрессивного агента. Поэтому иммуносупрессивное лечение может способствовать отбору и размножению Т-клеток по настоящему изобретению в организме пациента.

Введение клеток или популяции клеток по настоящему изобретению может быть выполнено каким-либо традиционным путем, включая аэрозольную ингаляцию, инъекцию, проглатывание, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Описанные в настоящем изобретении композиции могут вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, внутрь узлов, интрамедуллярно, внутримышечно, внутривенной или внутрилимфатической инъекцией, или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции клеток по настоящему изобретению предпочтительно вводят внутривенной инъекцией.

Введение клеток или популяции клеток по настоящему изобретению может заключаться во введении 10⁴-10⁹ клеток/кг массы тела, предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг массы тела, включая все целые величины количества клеток в данных диапазонах. Клетки или популяции клеток могут вводить в виде одной или более доз. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные эффективные количества клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы на протяжении определенного периода времени. Сроки введения находятся в пределах, установленных врачом, и зависят от клинического состояния пациента. Клетки или популяции клеток могут получать от какого-либо источника, например, из банка крови или от донора. Хотя индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств полученных клеток для определенного заболевания или состояния находится в ведении специалиста в данной области. Эффективным является количество, обеспечивающее терапевтическую или профилактическую пользу. Вводимая доза зависит от возраста, здоровья и массы тела реципиента, типа сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты лечения и природы требуемого эффекта.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное эффективное количество клеток или композиции, включающей эти клетки, вводят парентерально. Указанное введение может быть внутривенным введением. Указанное введение может быть выполнено инъекцией непосредственно в опухоль.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациенту вводят клетки в сочетании (например, до, одновременно или после) с каким-либо числом соответствующих методов лечения, включая, но ими не ограничиваясь, лечение агентами, например, противовирусными средствами цидофовиром и интерлейкином-2, цитарабином (также называемым ARA-C) или натализумабом для пациентов с рассеянным склерозом, или лечение эфализумабом пациентов с псориазом, или другие формы лечения для пациентов с прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатией (ПМЛ). В других вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки по настоящему изобретению могут применять в комбинации с химиотерапией, радиацией, иммуносупрессивными агентами, например, с циклоспорином, азатиоприном, метотрексатом, микофенолятом и FK506, антителами или другими иммуноабляционными агентами, например, САМРАТН, анти-CD3 антителами или другими антителами, предназначенными для лечения, цитоксином, фладарабином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные средства ингибируют или кальций-зависимую фосфатазу кальценеврин (циклоспорин и FK506), или ингибируют p70S6 киназу, которая важна для передачи сигнала, индуцированного фактором роста (рапамицин) (Liu и др., Cell 66, 1991; Henderson и др., 1991; Bierer и др., 1993). В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиции клеток по настоящему изобретению вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с трансплантатом костного мозга, Т-клеточной абляционной терапией, используя химиотерапевтические агенты, например, флударабин, наружную дистанционную лучевую терапию (НДЛТ), циклофосфан или антитела, например, OKT3 или САМРАТН. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиции клеток по настоящему изобретению назначают после В-клеточной абляционной терапии, например, агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения субъекты могут пройти стандартное лечение высокими дозами химиотерапевтических средств с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения после трансплантации субъекты получают инфузию размноженных иммунных клеток по настоящему изобретению. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства. Указанные модифицированные клетки, полученные каким-либо из способов, описанных в настоящем изобретении, могут применять в определенном объекте настоящего изобретения для лечения пациентов, нуждающихся в этом, в случае отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD); таким образом, в рамках охвата настоящего изобретения находится способ лечения пациентов, нуждающихся в этом, от процесса отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного пациента путем введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, включающих инактивированные гены TCR alpha и/или TCR beta.

Пример способа конструирования аллогенных клеток человека для иммунотерапии

Для лучшего понимания настоящего изобретения на фиг. 5 приводят пример способа конструирования аллогенных клеток человека для иммунотерапии. Способ включает комбинацию одной или нескольких из следующих стадий:

1. Получения Т-клеток из культуры клеток, или из образца крови от индивидуального пациента, или из банка крови, и активирование указанных Т-клеток, используя анти-CD3/С28 активаторные гранулы. Гранулы обеспечивают как первичные, так и ко-стимулирующие сигналы, необходимые для активирования и размножения Т-клеток.

2. (а) Трансдукции указанных клеток pTalpha или функциональным вариантом его трансгена для поддержки экспрессии CD3 на поверхности и осуществления размножения клеток через стимуляцию комплекса CD3. Предполагают, что разрушение комплекса TCR приводит к элиминации комплекса TCR и удалению аллореактивности (GvHD), но может разрушать размножение аллогенных клеток из-за утраты CD3 сигнального компонента. Ожидают, что трансдуцированные клетки экспрессируют цепь pTalpha или ее функциональный аналог. Такая цепь pTalpha спаривается с цепью TCRbeta и сигнальными компонентами CD3 для формирования комплекса preTCR и таким образом восстановления функционального комплекса CD3 и поддержки активации или стимуляции инактивированных клеток TCRalpha. Трансдукция Т-клеток pTalpha лентивирусным вектором может быть реализована до или после инактивации TCRalpha.

(б) Трансдукции указанных клеток многоцепочечными CAR позволяют перенаправить Т-клетки против антигенов, экспрессированных на поверхности целевых клеток разных злокачественных образований, включая лимфомы и солидные опухоли. Для улучшения функции ко-стимулирующего домена в настоящем изобретении сконструирован многоцепочечный CAR, производный от FcεRI, согласно ранее описанному. Трансдукция может быть осуществлена до или после инактивирования TCRalpha и других генов, например, генов CD52.

3. Конструирования неаллореактивных и устойчивых к иммуносупрессии Т-клеток:

(а) Возможно инактивировать TCR alpha в указанных клетках для элиминации TCR с поверхности клетки и предупреждения распознавания ткани хозяина в качестве чужеродной аллогенным TCR и таким образом избежать GvHD.

(б) Также возможно инактивировать один ген, кодирующий мишень для иммуносупрессивного агента для компенсации устойчивости указанных клеток к иммуносупрессивной обработке для предупреждения отторжения трансплантата без воздействия на трансплантированные Т-клетки. В этом примере мишенью иммуносупрессивных агентов является CD52 и иммуносупрессивным агентом является гуманизированное моноклональное анти-CD52 антитело.

В настоящем изобретении установлено, что применение TALE-нуклеазы, обеспечивающее более высокую степень двунитевых разрывов (DSB) в Т-клетках, особенно предпочтительно для достижения указанной выше двойной инактивации в Т-клетках. Предпочтительно гены TCRalpha и CD52 инактивируют путем электропорации Т-клеток мРНК, кодирующей указанные гены, на которые нацеливается TALE-нуклеаза. В настоящем изобретении установлено, что применение мРНК, приводящее к высокой степени трансформации, менее губительно для Т-клеток и поэтому является критическим в процессе конструирования Т-клеток. Затем инактивированные Т-клетки сортируют, используя магнитные гранулы. Например, Т-клетки, экспрессирующие CD52, удаляют фиксацией на плотной поверхности, и инактивированные клетки не подвергаются стрессу при пропуске через колонку. Такой мягкий метод повышает концентрацию должным образом сконструированных Т-клеток.

4. Размножения in vitro сконструированных Т-клеток перед введением пациенту или in vivo после введения пациенту путем стимуляции комплекса CD3. Перед стадией введения пациенты могут подвергаться иммуносупрессивной обработке, например, САМРАТН1-Н, гуманизированным моноклональным антителом анти-CD52.

5. Необязательной обработки указанных клеток биспецифическими антителами ex vivo перед введением пациенту или in vivo после введения пациенту для доставки сконструированных клеток к целевому антигену.

Другие определения

- Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности представлены в настоящем изобретении однобуквенным кодом, в котором, например, Q означает Gln или глютаминовый остаток, R означает Arg или остаток аргинина и D означает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.

- Аминокислотная замена означает замещение одного аминокислотного остатка на другой, например, замещение остатка аргинина на остаток глютамина в пептидной последовательности является аминокислотным замещением.

- Нуклеотиды обозначают следующим образом: однобуквенный код применяют для обозначения основания нуклеозида: a означает аденин, t означает тимин, с означает цитозин и g означает гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r представляет g или а (пуриновые нуклеотиды), k представляет g или t, s представляет g или с, w представляет а или t, m представляет a или c, y представляет t или с (пиримидиновые нуклеотиды), d представляет g, а или t, v представляет g, а или с, b представляет g, t или с, h представляет a, t или с, и n представляет g, a, t или с.

- В контексте настоящего изобретения понятия «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотиды» относятся к нуклеотидам и/или полинуклеотидам, например, к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, полученным полимеразной цепной реакцией (ПЦР), и фрагментам, полученным за счет какой-либо из следующих активностей: лигированием, расщеплением, действием эндонуклеазы и действием экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, являющихся природными нуклеотидами (например, ДНК и РНК), или аналогов природных нуклеотидов (например, энантиомерных форм природных нуклеотидов), или из комбинации обоих. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в остатках сахаров и/или в частях пиримидиновых или пуриновых оснований. Модификации сахаров включают, например, замещение одной или более гидроксильных групп на галогены, алкильные группы, амины и азидо-группы, или сахара могут функционировать в качестве эфиров или сложных эфиров. Кроме того, весь остаток сахара может быть заменен на структуры, схожие стерически и электронно, например, на аза-сахара и карбоциклические аналоги сахаров. К примерам модификаций в основаниях относятся алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирной связью или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.

- Понятие «полинуклеотид, последовательно включающий первую область, гомологичную последовательностям выше по цепи от указанного двухцепочечного расщепления, последовательность, которую встраивают в геном указанной клетки, и вторую область, гомологичную последовательностям, расположенным ниже по цепи от указанного двухцепочечного расщепления» означает конструкцию или матрикс ДНК, куда включены первая и вторая части, гомологичные областям 5' и 3' целевой ДНК in situ. Конструкция ДНК также включает третью часть, расположенную между первой и второй частями, которая обладает некоторой гомологией с соответствующей последовательностью ДНК in situ или, в другом варианте, не обладает гомологией с областями 5' и 3' целевой ДНК in situ. После расщепления целевой ДНК стимулируется гомологическая рекомбинация между геномом, содержащим целевой ген с целевым локусом, и таким матриксом, причем геномная последовательность, содержащая целевую ДНК, замещена третью частью матрикса и вариабельной частью первой и второй частей указанного матрикса.

- Понятия «целевая ДНК», «последовательность целевой ДНК», «целевая последовательность ДНК», «целевая последовательность нуклеиновой кислоты», «целевая последовательность» или «процессируемый сайт» означают полинуклеотидную последовательность, на которую может нацеливаться и которую может процессировать редкощепящая эндонуклеаза по настоящему изобретению. Эти обозначения относятся к специфическому расположению ДНК, предпочтительно геномному расположению в клетке, но также к части генетического материала, который может существовать независимо относительно основного генетического материала, например, в составе плазмид, эписом, вирусов, транспозонов или органелл, например, митохондрий, однако приведенными примерами перечень не ограничивается. Примерами мишеней TALE-нуклеаз, которые не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения, являются геномные последовательности нацеливания, обычно состоящие из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером из 15 п.о. Каждую полумишень распознают повторы TALE-нуклеаз, которые кодируются плазмидами под контролем промотора EF1-alpha или промотора Т7, перечисленные в табл. 2, 6, 7 и 11 в качестве примеров, не ограничивающих настоящее изобретение. Целевая последовательность нуклеиновой кислоты выражена последовательностью 5' к 3' одной цепи указанной мишени, показанной в табл. 2, 6, 7 и 11.

- Понятие «химерный антигенный рецептор (CAR)» означает молекулы, которые объединяют связывающий домен против компонента, присутствующего на целевых клетках, например, специфичность на основе антитела в отношении желаемого антигена (например, опухолевого антигена) с Т-клеточный-рецептор-активирующим внутриклеточным доменом для получения химерного белка, который проявляет специфичную клеточную иммунную активность против мишени. Обычно CAR состоит из внеклеточного одноцепочечного антитела (scFvFc), гибридизированного с внутриклеточным сигнальным доменом Т-клеточного антигенного комплекса zeta цепи (scFvFc:ζ) и способен, при экспрессии в Т-клетках, переориентировать распознавание антигена, основанное на специфичности моноклональных антител. Одним из примеров CAR, используемым в настоящем изобретении, является CAR, направленный против антигена CD19 и способный включать в качестве примера, не ограничивающего настоящее изобретение, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73.

- Понятия «вектор доставки» или «векторы доставки» означают какой-либо вектор доставки, который может применяться в настоящем изобретении для обеспечения контакта с клеткой («контактирования») или доставки внутрь клеток или субклеточных компартментов («интродукция») агентов/химических соединений и молекул (белков или нуклеиновых кислот), необходимых по настоящему изобретению. К ним относятся, но ими перечень не ограничивается, липосомальные векторы доставки, вирусные векторы доставки, лекарства - векторы доставки, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (эхоконтрастные препараты), наночастицы, эмульсии или другие соответствующие векторы переноса. Такие векторы доставки позволяют доставлять молекулы, химические соединения, макромолекулы (гены, белки) или другие векторы, например, плазмиды, пептиды, разработанные фирмой Diatos. В этих случаях векторы доставки являются молекулярными носителями. Понятия «вектор доставки» или «векторы доставки» также означают методы доставки для осуществления трансфекции.

- Понятия «вектор» или «векторы» означают молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой связан вектор. В контексте настоящего изобретения к векторам относятся, но ими перечень не ограничивается, вирусный вектор, плазмида, вектор РНК, или линейная или кольцевая молекула ДНК или РНК, которая может состоять из хромосомы, не хромосомных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительными являются те векторы, которые способны к автономной репликации (эписомальный вектор) и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны (векторы экспрессии). Специалистам в данной области известно большое количество применимых и коммерчески доступных векторов.

К вирусным векторам относятся ретровирусы, аденовирусы, парвовирусы (например, аденоассоциированные вирусы), коронавирусы, вирусы, содержащие минус-цепь РНК, например, ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и вирус Сендай), вирусы, содержащие плюс-цепь РНК, например, пикорнавирус и альфавирус, вирусы двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, герпесвирус (например, Herpes Simplex вирус, тип 1 и 2, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) и поксвирус (например, вирус осповакцины, вирус оспы кур, канарипокс). К другим вирусам относятся, например, вирус Норволк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповирус, гепаднавирусы и вирусы гепатита. К примерам ретровирусов относятся: вирус лейкоза-саркомы птиц, вирусы млекопитающих типа С, вирусы типа В, вирусы типа D, вирусы группы HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin в кн.: «Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology», подред. Fields и др., 1996, 3-е изд., изд-во Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia).

- Понятия «лентивирусный вектор» означает лентивирусные векторы на основе ВИЧ, которые весьма перспективны для доставки генов благодаря их относительно большой вместимости, пониженной иммуногенности и способности стабилизировать трансдукцию с высокой эффективностью в большом диапазоне клеток разных типов. Лентивирусные векторы обычно получают в результате кратковременной трансфекции трех (упаковка, оболочка и перенос) или более плазмид в клетки-продуценты. Подобно ВИЧ, лентивирусные векторы входят в целевые клетки через взаимодействие гликопротеинов на поверхности вируса с рецепторами на поверхности клетки. После вхождения в клетку РНК вируса подвергается обратной транскрипции, которая опосредуется комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая является объектом для интеграции вируса в ДНК инфицированных клеток. Понятие «интегративные лентивирусные векторы (LV)» относится к вирусам, которые являются примерами, но не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения; они могут интегрировать в геном целевых клеток. Противоположное понятие «неинтегративные лентивирусные векторы (NILV)» относится к эффективным векторам генной доставки, которые не интегрируют в геном целевых клеток через действие вирусной интегразы.

- Векторы доставки и векторы могут быть ассоциированы или скомбинированы с какими-либо методами клеточной проницаемости, например, с сонопорацией, или электропорацией, или производными этих методов.

- Понятие «клетка» или «клетки» означает какие-либо живые клетки, первичные клетки и линии клеток, производные от этих организмов для культур in vitro.

- Понятие «первичная клетка» или «первичные клетки» означает клетки, взятые непосредственно от живой ткани (т.е. материал биопсии) для роста in vitro; эти клетки претерпели очень мало удвоений клеточной популяции, и, следовательно, они более пригодны по многим функциональным компонентам и свойствам тканей, от которых они производны, по сравнению с непрерывными опухолеродными или искусственно иммортализованными линиями клеток.

Примеры клеточных линий, которые не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения, могут быть выбраны из группы, включающей клетки СНО-K1; клетки HEK293; клетки Сасо2; клетки U2-OS; клетки NIH 3Т3; клетки NSO; клетки SP2; клетки CHO-S; клетки DG44; клетки K-562, клетки U-937; клетки MRC5; клетки IMR90; клетки Jurkat; клетки HepG2; клетки HeLa; клетки НТ-1080; клетки НСТ-116; клетки Hu-h7; клетки Huvec; клетки Molt 4.

Все эти клеточные линии могут быть модифицированы способом, представленным в настоящем изобретении, для получения клеточной линии для выработки, экспрессии, измерения, обнаружения, изучения целевого гена или белка; эти модели также можно использовать для скрининга представляющих интерес биологически активных молекул в исследовании и выработке и в различных областях, например, химической, в биотопливе, терапевтической и агрономической в качестве примеров, не ограничивающих рамок охвата настоящего изобретения.

- Понятие «мутация» означает замещение, делецию, инсерцию, которые затрагивают до одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или более нуклеотидов/аминокислот в последовательности полинуклеотида (кДНК, ген) или полипептида. Мутация может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она также может воздействовать на структуру геномной последовательности или на структуру/стабильность кодированной мРНК.

- Понятие «вариант (варианты)» означает повторяющийся вариант, ДНК-связывающий вариант, вариант TALE-нуклеазы, полипептидный вариант, полученный мутацией или замещением по меньшей мере одного остатка в аминокислотной последовательности исходной молекулы.

- Понятие «функциональный вариант» означает каталитически активный мутант белка или белкового домена; такой мутант может иметь ту же активность, что и его исходный белок или белковый домен, или может обладать дополнительными свойствами, или повышенной или пониженной активностью.

- Понятие «ген» означает основную единицу наследственности, состоящую из сегмента ДНК, собранного линейно вдоль хромосомы, которая кодирует специфический белок или сегмент белка. Ген обычно включает промотор, 5' нетранслируемую область, одну или более кодирующих последовательностей (экзонов), необязательно интронов, 3' нетранслируемую область. Ген может дополнительно включать терминатор, энхансеры и/или сайленсеры.

- В контексте настоящего изобретения понятие «локус» означает специфическую физическую локализацию последовательности ДНК (например, гена) на хромосоме. Понятие «локус» может означать специфическую физическую локализацию целевой последовательности редкощепящей эндонуклеазы на хромосоме. Такой локус может включать целевую последовательность, которая распознается и/или расщепляется редкощепящей эндонуклеазой по настоящему изобретению. Очевидно, что целевой локус по настоящему изобретению может не только уточнить последовательность нуклеиновой кислоты, которая существует в основном массиве генетического материала (т.е. в хромосоме) клетки, но также часть генетического материала, которая может существовать независимо от указанного основного массива генетического материала, например, плазмиды, эписомы, вирусы, транспозоны или в органеллах, например, в митохондриях, однако приведенные примеры не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения.

- Понятие «эндонуклеаза» означает какой-либо фермент дикого типа или его вариант, способный катализировать гидролиз (расщепление) связей между нуклеиновыми кислотами в молекуле ДНК или РНК, предпочтительно в молекуле ДНК. Эндонуклеазы не расщепляют молекулу ДНК или РНК независимо от ее последовательности, но распознают и расщепляют молекулу ДНК или РНК по специфическим полинуклеотидным последовательностям, далее называемым «целевыми последовательностями», «целевыми сайтами» или «последовательностями-мишенями». Эндонуклеазы могут быть классифицированы как редкощепящие эндонуклеазы, если обладают сайтом полинуклеотидного распознавания обычно более 12 п.о. в длину, более предпочтительно 14-55 п.о. Редкощепящие эндонуклеазы существенно повышают HR путем индукции двухцепочечных разрывов ДНК (DNA double-strand breaks - DSB) в определенном локусе (Rouet, Smih и др., 1994; Choulika, Perrin и др., 1995; Pingoud, Silva 2007). Редкощепящие эндонуклеазы могут быть, например, хоминг-эндонуклеазами (Paques, Duchateau, 2007), химерными цинковопальцевыми нуклеазами (Zinc-Finger nuclease - ZFN), образующимися в результате слияния сконструированных цинковопальцевых доменов с каталитическим доменом фермента рестрикции, например, FokI (Porteus, Carroll, 2005), или химическими эндонуклеазами (Eisenschmidt, Lanio и др., 2005; Arimondo, Thomas и др., 2006). В химических эндонуклеазах химический или пептидный расщепляющий агент конъюгирован либо с полимером нуклеиновой кислоты, либо с другой ДНК, распознающей специфическую целевую последовательность, тем самым нацеливая расщепляющую активность на определенную последовательность. К химическим эндонуклеазам также относятся синтетические эндонуклеазы, например, конъюгаты ортофенатролина, ДНК-расщепляющие молекулы, триплекс-формирующие олигонуклеотиды (triplex-forming oligonucleotides - TFO), о которых известно, что они способны связывать последовательности ДНК (Kalish, Glazer, 2005). В контексте настоящего изобретения такие химические эндонуклеазы также относятся к понятию «эндонуклеаза».

Редкощепящие эндонуклеазы также могут быть, например, TALE-нуклеазами - новым классом химерных нуклеаз, использующих каталитический домен FokI и ДНК-связывающий домен, производный от эффектора, подобного активатору транскрипции (Transcription Activator Like Effector - TALE), - семейства белков, задействованных в инфекционном процессе патогенами растений из рода Xanthomonas (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou, Bogdanove 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Li, Huang и др.). Функциональная конфигурация TALE-нуклеазы на основе FokI (TALE-нуклеазы) практически представляет TALE-нуклеазу ZFN с цинкопальцевым ДНК-связывающим доменом, замещенным на домен TALE. По существу, расщепление ДНК TALE-нуклеазой нуждается в областях распознавания, фланкирующих неспецифичную центральную область. В контексте настоящего изобретения редкощепящие эндонуклеазы также могут быть производными от TALE-нуклеаз.

Редкощепящие эндонуклеазы могут быть хоминг-эндонуклеазой, также называемой мегануклеазой. Такие хоминг-нуклеазы известны в данной области (Stoddard, 2005). Хоминг-нуклеазы распознают целевую последовательность ДНК и производят одно- или двухцепочечные разрывы. Хоминг-нуклеазы высокоспецифичны, распознают сайты целевой ДНК, варьирующие от 12 до 45 п.о. в длину, обычно варьирующие от 14 до 40 п.о. в длину. Хоминг-нуклеазы по настоящему изобретению могут, например, соответствовать LAGLIDADG эндонуклеазе, HNH эндонуклеазе, или GIY-YIG эндонуклеазе. Предпочтительной хоминг-эндонуклеазой по настоящему изобретению может быть вариант I-CreI.

- Понятие «TALE-эндонуклеаза (TALEN)» означает гибридный белок, состоящий из домена, связывающего нуклеиновую кислоту, обычно производного от эффектора, подобного активатору транскрипции (Transcription Activator Like Effector - TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Предпочтительно каталитическим доменом является нуклеазный домен и более предпочтительно домен, обладающий эндонуклеазной активностью, например, I-TevI, ColE7, NucA и Fok-I. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен TALE может быть гибридизирован с мегануклеазой, например, I-CreI и I-OnuI или ее функциональным вариантом. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанной нуклеазой является мономерная TALE-нуклеаза. Мономерной TALE-нуклеазой является TALE-нуклеаза, которая не требует димеризации для специфического распознавания и расщепления, например, гибриды сконструированных повторов TAL с каталитическим доменом I-TevI, описанным в WO 2012138927. Эффекторами, подобными активатору транскрипции (TALE), являются белки бактерий рода Xanthomonas, которые включают множество повторяющихся последовательностей, каждая из которых включает двойные остатки в положениях 12 и 13 (RVD), специфичные для каждого нуклеотидного основания целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Связывающие домены со сходными модульными основание-на-основание нуклеиновой кислоты связывающими свойствами (modular base-per-base nucleic acid binding properties - MBBBD) также могут быть производными от новых модулярных белков, ранее описанных заявителем у разных бактериальных видов. Новые модулярные белки имеют преимущество в проявлении большей вариабельности последовательности по сравнению с повторами TAL. Предпочтительно RVD, ассоциированными с распознаванием разных нуклеотидов, являются HD для распознавания С, NG для распознавания Т, NI для распознавания А, NN для распознавания G или A, NS для распознавания А, С, G или Т, HG для распознавания Т, IG для распознавания Т, NK для распознавания G, НА для распознавания С, ND для распознавания С, HI для распознавания С, HN для распознавания G, NA для распознавания G, SN для распознавания G или А и YG для распознавания Т, TL для распознавания A, VT для распознавания А или G и SW для распознавания А. В другом варианте осуществления настоящего изобретения критические аминокислоты 12 и 13 могут быть мутированы на другие аминокислотные остатки для модулирования специфичности по нуклеотидам А, Т, С и G и в частности для повышения их специфичности. TALE-нуклеаза уже была описана и использована для стимулирования нацеливания гена и генных модификаций (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou, Bogdanove 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Li, Huang и др.). Сконструированные TAL-нуклеазы коммерчески доступны под торговой маркой TALEN™ (фирма Cellectis, Париж, Франция).

- Понятие «расщепление» относится к разрыву ковалентного каркаса полинуклеотида. Расщепление могут инициировать разными методами, включая, но ими не ограничиваясь, ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможно как одноцепочечное, так и двухцепочечное расщепление, причем двухцепочечное расщепление может происходить в качестве результата двух отдельных однонитевых расщеплений. Двухцепочечное расщепление ДНК, РНК или гибрида ДНК/РНК может привести к формированию тупых или смещенных концов.

- Понятие «гибридный белок» относится к продукту известного в данной области процесса, состоящего из соединения двух или более генов, которые исходно кодируют отдельные белки или их часть. Трансляция указанного «гибридного белка» приводит к образованию единого полипептида с функциональными свойствами, производными от каждого из исходных белков.

- Понятие «идентичность» относится к идентичности последовательностей двух молекул нуклеиновой кислоты или полипептидов. Идентичность может быть определена сравнением положения в каждой последовательности, которая может быть выровнена для сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же самым основанием, тогда молекулы идентичны по этому положению. Степень схожести или идентичности последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией ряда идентичных или сопряженных нуклеотидов в положениях, общих для последовательностей нуклеиновых кислот. Различные алгоритмы и/или программы выравнивания могут применяться для подсчета идентичности между двумя последовательностями, включая FASTA или BLAST, которые доступны в качестве части пакета анализа последовательности GCG (Висконсинский университет, Мэдисон, США) и могут применяться, например, при несоответствующем окружении. В настоящем изобретении рассматривают, например, полипептиды, обладающие, по меньшей мере 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичностью по отношению к специфическим полипептидам, описанным в настоящем изобретении, и предпочтительно проявляющие в существенной степени те же функции, а также полинуклеотид, кодирующий такие полипептиды.

- Понятие «сходство» означает взаимосвязь между аминокислотными последовательностями двух или более полипептидов. BLASTP также можно использовать для идентификации аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% схожа с референсной аминокислотной последовательностью, используя матрицы сходства, например, BLOSUM45, BLOSUM62 или BLOSUM80. Если не указано иначе, оценку сходства обосновывают по BLOSUM62. При использовании BLASTP процент сходства основывают на оценке идентичности BLASTP. «Идентичность» BLASTP показывает число и фракцию совокупных остатков с высокой оценкой пар в последовательности, которые идентичны; «Положительная оценка» BLASTP показывает число и фракцию остатков, для которых оценки выравнивания имеют положительные значения и которые схожи друг с другом. Рассматривают аминокислотные последовательности, обладающие такими степенями идентичности или сходства или промежуточными степенями идентичности или сходства с аминокислотными последовательностями, описанными в настоящем изобретении, и они охватываются настоящим изобретением. Полинуклеотидные последовательности схожих полипептидов определяют, используя генетический код, и они могут быть получены традиционными методами. Например, функциональный вариант pTalpha может иметь 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% сходство последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 107. Полинуклеотид, кодирующий такой функциональный вариант, может быть получен путем обратной трансляции его аминокислотной последовательности, используя генетический код.

- Понятие «сигнал-трансдуцирующий домен» или «ко-стимулирующий лиганд» означает молекулу на антиген-презентирующей клетке, которая специфически связывает родственную ко-стимулирующую молекулу на Т-клетке, тем самым обеспечивая сигнал, который дополнительно к первичному сигналу обеспечивается, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой МНС, нагруженной пептидом, опосредует ответ Т-клетки, включая, но ими не ограничиваясь, активирование пролиферации, дифференциации и др. Ко-стимулирующий лиганд может включать, но ими рамки охвата настоящего изобретения не ограничиваются, CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимулирующий лиганд (inducible costimulatory ligand - ICOS-L), межклеточную адгезивную молекулу ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, М1СВ, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, которое связывает лиганд Toll-рецептора и лиганд, который специфически связывает В7-Н3. К понятию «ко-стимулирующий лиганд» также относят наряду с другими антитело, которое специфически связывает ко-стимулирующую молекулу, присутствующую на Т-клетках, например, из числа молекул, которыми однако рамки охвата настоящего изобретения не ограничиваются, CD27, CD28, 4-IBB, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, функционально связанного антигена лимфоцитов 1 (lymphocyte function-associated antigen-1 - LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, лиганда, который специфически связывает CD83.

Понятие «ко-стимулирующая молекула» относится к родственному связывающему партнеру на Т-клетке, который специфически связывает ко-стимулирующий лиганд, тем самым опосредуя ко-стимулирующий ответ клетки, например, пролиферацию, но не только ее. К ко-стимулирующим молекулам относятся, но ими перечень не ограничивается, молекула МНС класса I, BTLA и Toll-лигандный рецептор.

Понятие «ко-стимулирующий сигнал» в контексте настоящего изобретения относится к сигналу, который в комбинации с первичным сигналом, например, TCR/CD3 лигированием, приводит к Т-клеточной пролиферации и/или повышенной или пониженной регуляции ключевых молекул.

- Понятие «биспецифическое антитело» относится к антителу, которое имеет сайты связывания для двух разных антигенов в одной молекуле антитела. Специалистам в данной области следует учитывать, что другие молекулы дополнительно к канонической структуре антитела могут быть сконструированы с двойной связывающей специфичностью. Также следует учитывать, что связывание антигена биспецифическими антителами может быть одновременным или последовательным. Биспецифические антитела могут быть получены химическими методами (см., например, Kranz и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1981, с. 5807), методами «polydoma» (US 4474893) или методами рекомбинации ДНК, суть которых известна. Каждый связывающий домен включает по меньшей мере одну вариабельную область из тяжелой цепи антитела («VH или Н область»), причем VH область первого связывающего домена специфически связывается с лимфоцитарным маркером, например, CD3, и VH область второго связывающего домена специфически связывается с опухолевым антигеном; данный пример не ограничивает области охвата настоящего изобретения.

- Понятие «внеклеточный лиганд-связывающий домен» в контексте настоящего изобретения относится к олиго- или полипептиду, который способен связывать лиганд. Предпочтительно домен может взаимодействовать с молекулой на поверхности клетки. Например, внеклеточной лиганд-связывающий домен может быть выбран для распознавания лиганда, который действует как маркер на поверхности клеток, ассоциированный с определенной стадией заболевания. Таким образом, к маркерам на поверхности клетки, которые могут действовать в качестве лигандов, относятся те, которые ассоциированы с вирусным, бактериальным или паразитарным заражением, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.

Понятие «субъект» или «пациент» в контексте настоящего изобретения относится ко всем представителям царства животных, включая обезьян и людей.

Изложенное выше описание настоящего изобретения представляет способ и процесс получения и применения, которые изложены таким образом, что любой специалист в данной области сможет осуществить и применить настоящее изобретение, подробно изложенное в настоящем описании, особенно в формуле изобретения, которая представляет часть настоящего описания.

Если в настоящем изобретении указывают численный предел или диапазон, то конечные или ограничительные точки включены и указаны.

Приведенное выше описание представлено для того, чтобы специалист в данной области мог осуществить и использовать настоящее изобретение, поясненное конкретными примерами. Различные модификации вариантов осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники, и общие принципы, изложенные в настоящем изобретении, могут быть применены к другим вариантам осуществления настоящего изобретения, не выходящим за пределы сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается приведенными примерами, и может применяться широко в соответствии с описанными в нем нормами и свойствами.

Приведенные ниже конкретные примеры поясняют изложенное описание, служат его иллюстрацией и никоим образом не ограничивают рамок охвата настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. TALE-нуклеазы, расщепляющие ген GR человека

Шесть гетеродимерных TALE-нуклеаз, которые нацеливаются на экзоны гена GR человека, были разработаны и получены. Приведенная ниже табл. 2 представляет последовательности-мишени, расщепленные каждой из TALE-нуклеаз. GR TALE-нуклеаза составлена из двух независимых элементов (называемых полу-TALE-нуклеазами), каждый из которых содержит повторяющуюся последовательность, сконструированную для связи и расщепления последовательностей-мишеней GR, состоящих из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером из 15 п.о.

Аминокислотные последовательности N-концевого и С-концевого доменов и повтор основаны на AvrBs3 TALE (номер в GenBank: Х16130.1). N-концевой и С-концевой домены разделены двумя сайтами рестрикции BsmBI. Повторные матрицы (с SEQ ID NO: 7 по SEQ ID NO: 18), нацеливаемые на требуемые последовательности (с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 6), были синтезированы, используя метод жесткой основы, состоящий из последовательных стадий рестрикции/лигирования/промывания (WO 2013/017950). Вкратце, первый блок (кодирование di-повтора) иммобилизуют на жесткой основе путем взаимодействия биотина/стрептавидина, второй блок (tri-повтор) затем лигируют с первым и после расщепления SfaNI присоединяют третий блок (tri-повтор). Процесс повторяют, используя блоки tri- или di-повторов для получения требуемой матрицы повторов. Затем продукт клонируют в классической плазмиде pAPG10 для амплификации в Е. coli и секвенируют. Последовательности полученных таким образом матриц повторов субклонируют в дрожжевом векторе экспрессии TALE, используя ферменты рестрикции BsmBI типа IIS для получения плазмиды и BbvI и SfaNI для инсерции последовательностей повторов. ДНК, кодирующую полу-TALE-нуклеазу, которая содержит TALE-производный ДНК-связывающий домен, гибридизированный с каталитическим доменом фермента рестрикции FokI, амплифицируют в Е. coli, восстанавливают стандартными микрометодами и секвенируют для оценки целостности вставки.

Активность GR TALE-нуклеаз в дрожжах

Нуклеазную активность шести GR-TALE-нуклеаз тестируют при 37°С и 30°С методом yeast SSA, ранее описанным авторами настоящего изобретения (WO 2004/067736; Epinat и др., 2003; Chames и др., 2005; Arnould и др., 2006; Smith и др., 2006), на мишенях, содержащих две TALE целевые последовательности, расположенные навстречу друг к другу на цепи ДНК и разделенные спейсером из 15 п.о., в результате чего образуются последовательности с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 6. Все дрожжевые целевые репортерные плазмиды, содержащие целевые последовательности ДНК TALE-нуклеаз, конструируют согласно ранее описанному (WO 2004/067736; Epinat и др., 2003; Chames и др., 2005; Arnould и др., 2006; Smith и др., 2006). В дрожжах уровни расщепляющей активности TALE-нуклеаз отдельных клонов на мишенях представлены в табл. 3.

Величины находятся в диапазоне от 0 до 1. Максимальная величина равна 1.

Активность GR TALE-нуклеаз в клетках HEK293

Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонируют, используя фермент рестрикции в составе экспрессирующего вектора млекопитающих под контролем длинного промотора pEF1alpha.

Один миллион клеток HEK293 высевают за день до трансфекции. Клетки подвергают совместной трансфекции 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих левую и правую половину GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 или GRex5T3 TALE-нуклеазы, распознающей две полумишени целевых геномных последовательностей в гене GR под контролем промотора EF1alpha, используя 25 мкл липофектамина (фирма Invitrogen) по инструкциям производителя. В качестве контроля клетки подвергают совместной трансфекции 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих левую и правую половину TALE-нуклеаз, нацеливающихся на сайт-мишень области константной цепи Т-клеточного рецептора альфа (TRAC_T01) ((TRAC_T01-L и -R TALE-нуклеаза (SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42, TRAC_T01 сайт-мишень (SEQ ID NO: 37)) под контролем промотора EF1alpha. Двухцепочечный разрыв, произведенный TALE-нуклеазами в кодирующей последовательности GR, индуцирует негомологичное соединение концов (non homologous end joining - NHEJ), которое является механизмом, допускающим ошибки. Активность TALE-нуклеаз измеряют по частоте инсерций или делеций в геномном локусе нацеливания.

На 2 или 7 сутки после трансфекции клетки собирают и осуществляют локус-специфичную ПЦР по отношению к экстрагированной геномной ДНК, используя следующие праймеры: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (форвардная адаптерная последовательность)-10N (TAG)-локус-специфичная форвардная последовательность для GR экзона 2: 5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 31), для GR экзона 3: 5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (SEQ ID NO: 32) и для GR экзона 5: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (SEQ ID NO: 33) и реверсный праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (реверсная адаптерная последовательность)-локус-специфичная реверсная последовательность для GR экзона 2: 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (SEQ ID NO: 34), для GR экзона 3: 5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3' (SEQ ID NO: 35) и для GR экзона 5: 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (SEQ ID NO: 36).

Продукты ПЦР секвенируют с помощью системы секвенирования 454 (454 Life Sciences). Примерно 10000 последовательностей получают в качестве продукта ПЦР и затем анализируют на наличие сайт-специфической инсерции или делеции. Табл. 4 показывает процент последовательностей с инсерциями или делециями в целевом сайте TALE-нуклеазы от общего числа последовательностей в образце. Результаты репрезентативного эксперимента перечислены в табл. 4 для GRex2, GRex3T2 и GRex3T4.

Во всех исследованных случаях процент мутагенеза близок на 7 сутки к такому же показателю в образце на 2 сутки после трансфекции. Природу мутаций также анализируют, выявляя большинство делеций во всех случаях сравнения с инсерциями.

Активность GR TALE-нуклеаз в первичных Т-лимфоцитах

Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонируют, используя фермент рестрикции в векторе экспрессии под контролем промотора Т7.

мРНК, кодирующую TALE-нуклеазы, которые расщепляют GR геномные последовательности, синтезируют с каждой плазмиды, несущей кодирующие последовательности вниз по цепи от промотора Т7. Т-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активируют в течение 5 суток, используя анти-CD3/CD28 активаторные гранулы (фирма Life technologies), и 5 миллионов клеток трансфецируют путем электропорации 10 мкг каждой из двух мРНК, кодирующих обе полу-TALE-нуклеазы, используя прибор CytoLVT-P (фирма BTX-Harvard apparatus). Т-клетки, трансфецированные 10 мкг каждой из двух мРНК, кодирующих обе полу-TALE-нуклеазы, нацеливающиеся на ген CD52 (CD52_T02-L и -R TALEN (SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56), целевая последовательность CD52_T02 SEQ ID NO: 40) применяют в качестве контроля.

Через 3 и 7 суток после трансфекции геномную ДНК выделяют из трансфецированных клеток и проводят локус-специфическую ПЦР, используя описанные выше праймеры. Продукты ПЦР секвенируют с помощью системы секвенирования 454 (454 Life Sciences). Примерно 10000 последовательностей получают в расчете на ПЦР продукт и затем анализируют на наличие сайт-специфической инсерции или делеции; результаты показаны в табл. 5.

Пример 2. Расщепление TALE-нуклеазами гена человека CD52, константной цепи рецептора альфа Т-клеток человека (T-cell receptor alpha constant chain - TRAC) и константных цепей 1 и 2 рецептора бета Т-клеток (Т-cell receptor beta constant chains - TRBC)

Согласно описанию в примере 1, конструируют и получают гетеродимерные TALE-нуклеазы, нацеливающиеся соответствующим образом на гены CD52, TRAC и TRBC. Целевые геномные последовательности состоят из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером из 11 или 15 п.о. Каждую полумишень распознают по повторам полу-TALE-нуклеаз, перечисленных в табл. 6. Геном человека содержит две функциональные бета цепи рецептора Т-клеток (TRBC1 и TRBC2). На протяжении развития альфа/бета Т-лимфоцитов одну из этих двух константных цепей выбирают в каждой клетке для сплайсирования с вариабельной областью TCR-beta и формируют функциональную полной длины цепь бета. Две TRBC мишени выбирают из последовательностей, сохраненных между TRBC1 и TRBC2 таким образом, что соответствующая TALE-нуклеаза может расщеплять обе цепи, TRBC1 и TRBC2, одновременно.

Сконструированы другие последовательности мишеней в генах TRAC и CD52, представленные в табл. 7.

Активность CD52-TALE-нуклеазы, TRAC-TALE-нуклеазы и TRBC-TALE-нуклеазы в клетках HEK293

Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонируют, используя фермент рестрикции в составе экспрессирующего вектора млекопитающих под контролем pEF1alpha длинного промотора. Один миллион клеток HEK293 высевают за день до трансфекции. Клетки подвергают совместной трансфекции 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих TALE-нуклеазы, распознающие две полумишени в целевой геномной последовательности в гене CD52, область константной цепи рецептора альфа Т-клеток (TRAC) или область константной цепи рецептора бета Т-клеток (TRBC) под контролем промотора EF1-alpha, или 5 мкг контрольного вектора pUC (pCLS0003), используя 25 мкл липофектамина (фирма Invitrogen) по инструкциям производителя. Двухцепочечное расщепление, полученной под действием TALE-нуклеаз в CD52 или TRAC кодирующих последовательностях, репарируют в живых клетках путем негомологичного соединения концов (non homologous end joining - NHEJ), которое является механизмом, допускающим ошибки. Активность TALE-нуклеаз в живых клетках измеряют по частоте инсерций или делеций в геномном локусе нацеливания. Через 48 ч после трансфекции геномную ДНК выделяют из трансфецированных клеток и локус-специфическую ПЦР осуществляют, используя следующие праймеры: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (форвардная адаптерная последовательность)-10N (ТАG)-локус-специфичная форвардная последовательность для CD52: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 66), для TRAC: 5'-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3' (SEQ ID NO: 67), для TRBC1: 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (SEQ ID NO: 68) или для TRBC2: 5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (SEQ ID NO: 69), и реверсный праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (реверсная адаптерная последовательность) - эндогенная локус-специфичная реверсная последовательность для CD52: 5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 70), для TRAC: 5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (SEQ ID NO: 71), для TRBC1 и TRBC2: 5'-ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3' (SEQ ID NO: 72). Продукты ПЦР секвенируют с помощью системы секвенирования 454 (454 Life Sciences). Примерно 10000 последовательностей получают в расчете на ПЦР продукт и затем анализируют на наличие сайт-специфической инсерции или делеции; результаты показаны в табл. 8.

Активность CD52-TALE-нуклеазы, TRBC-TALE-нуклеазы и TRAC-TALE-нуклеазы в первичных Т-лимфоцитах

Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонируют, используя фермент рестрикции в векторе экспрессии млекопитающих под контролем промотора Т7.

мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляет CD52 TRAC и TRBC геномную последовательность, синтезируют с плазмиды, несущей кодирующие последовательности вниз по цепи от промотора Т7. Т-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активируют в течение 5 суток, используя анти-CD3/CD28 активаторные гранулы (фирма Life technologies), и затем 5 миллионов клеток трансфецируют путем электропорации с 10 мкг каждой из 2 мРНК, кодирующих обе полу-TALE-нуклеазы (или некодирующую РНК в качестве контроля), используя прибор CytoLVT-P. В результате инсерций и делеций, индуцированных NHEJ, кодирующая последовательность CD52 и/или TRAC может быть вне рамки во фракции клеток, в результате чего получают нефункционирующие гены. Через 5 суток после электропорации клетки метят флуорохром-конъюгированным анти-CD52 или анти-TCR антителом жидкостной цитометрией на наличие CD52 или TCR на поверхности клеток. Поскольку все Т-лимфоциты, размноженные из периферической крови, в норме экспрессируют CD52 и TCR, пропорция CD52-отрицательных или TCR-отрицательных клеток является прямым показателем активности TALE-нуклеазы. В табл. 9 перечислены результаты репрезентативного эксперимента. В табл. 10 представлены результаты репрезентативного эксперимента по тестированию эффективности TRBC TALE-нуклеаз.

Функциональный анализ Т-клеток с целевым геном CD52

Целью инактивации гена CD52 является компенсация устойчивости Т-лимфоцитов к иммуносупрессии, опосредованной анти-CD52 антителом. Согласно описанному в предыдущем абзаце, в Т-лимфоциты трансфецируют мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляет CD52. Через 7 суток после трансфекции клетки обрабатывают 50 мкг/мл анти-CD52 моноклональным антителом (или IgG крысы в качестве контроля) с добавлением или без добавления 30% комплемента кролика (фирма Cedarlane). Через 2 ч инкубирования при 37°С клетки метят флуорохром-конъюгированным анти-CD52 антителом вместе с флуоресцентным прижизненным красителем (фирма eBioscience) и анализируют с помощью жидкостной цитометрии для измерения частоты CD52-положительных и СD52-отрицательных клеток среди живых клеток. Фиг. 6 показывает результат репрезентативного эксперимента, демонстрирующего, что CD52-отрицательные клетки полностью устойчивы к токсичности комплемент-опосредованного анти-CD52 антитела.

Функциональный анализ Т-клеток с целевым геном TRAC

Целью инактивации гена TRAC является компенсация неспособности Т-лимфоцитов стимулировать рецептор Т-клеток. Согласно описанному в предыдущем разделе, Т-лимфоциты трансфецируют мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляет TRAC или CD52. Через 16 суток после трансфекции клетки обрабатывают фитогемагглютинином (phytohemagglutinin - РНА; фирма Sigma-Aldrich) в концентрации до 5 мкг/мл, митогеном Т-клеток, действующим через рецептор Т-клеток. Клетки с функциональным Т-клеточным рецептором могут увеличиться в размере после обработки РНА. Через трое суток инкубирования клетки метят флуорохром-конъюгированным анти-CD52 или анти-TCR антителом и анализируют жидкостной цитометрией для сравнения распределения размера клеток между TCR-положительными и TCR-отрицательными клетками, или между CD52-положительными и CD52-отрицательными клетками. Фиг. 7 показывает, что TCR-положительные клетки существенно больше в размере после обработки РНА, тогда как TCR-отрицательные клетки имеют тот же размер, что и необработанные клетки, что свидетельствует о том, что инактивирование TRAC компенсирует неспособность реагировать на TCR-передачу сигнала. Напротив, CD52-положительные и CD52-отрицательные клетки увеличиваются в размере в той же степени.

Функциональный анализ Т-клеток с целевыми CD52 и TRAC генами

Для того, чтобы убедиться, что инженерия генома не влияет на способность Т-клеток проявлять противоопухолевую активность при обеспечении химерным антигенным рецептором (CAR), трансфецируют Т-клетки, на которые была нацелена CD52-TALE-нуклеаза и TRAC-TALE-нуклеаза с 10 мкг РНК, кодирующей анти-CD19 CAR (SEQ ID NO: 73). Через 24 ч Т-клетки инкубируют в течение 4 ч с CD19-экспрессирующими клетками Дауди. Повышение регуляции на поверхности клеток CD107a - маркера высвобождения цитотоксических гранул Т-лимфоцитами (процесс называют дегрануляцией), измеряют методом жидкостной цитометрии (Betts, Brenchley и др., 2003). Результаты, представленные на фиг. 8, показывают, что CD52-отрицательные/TCRαβ-отрицательные клетки и CD52-положительные/TCRαβ-положительные клетки имеют ту же способность к дегрануляции в ответ на РМА/иономицин (положительный контроль) или CD19+ клетки Дауди. Повышенная регуляция CD107 зависит от наличия CD19+. Эти данные показывают, что конструирование генома не оказывает негативного воздействия на способность Т-клеток повышать контролируемый противоопухолевый ответ.

Геномная безопасность CD52-TALE-нуклеазы и TRAC-TALE-нуклеазы в первичных Т-лимфоцитах

Поскольку конструкции в настоящем изобретении включают нуклеазные субъединицы, важно установить, приводит ли множественная TALE-нуклеазная трансфекция к генотоксичности и расщеплению вне мишени в «близко прилежащих» целевых последовательностях или около ошибочного спаривания полу-TALE-нуклеаз. Чтобы оценить воздействие TRAC-TALE-нуклеазы и CD52-TALE-нуклеазы на целостность клеточного генома, в настоящем изобретении перечислены последовательности в геноме человека, которые обладают потенциалом для расщепления вне сайта. Для создания такого перечня идентифицируют все последовательности в геноме с числом замещений, доходящих до 4, при сравнении с исходными полумишенями, и затем идентифицируют пары потенциальных полумишеней с ориентацией голова-к-голове со спейсером друг от друга от 9 до 30 п.о. Этот анализ включает сайты, на которые потенциально нацелены гомодимеры молекулы полу-TALE-нуклеазы или гетеродимеры, сформированные одной CD52 полу-TALE-нуклеазой и одной TRAC полу-TALE-нуклеазой. Проводят оценку потенциала мишеней вне сайта, основываясь на специфических данных, принимая во внимание цену отдельных замещений и положение замещений (где несоответствия более устойчивы для оснований с 3' конца полумишени). Получены 173 уникальные последовательности с оценкой, отражающей вероятность расщепления. Отобраны 15 последовательностей с наивысшими оценками и проанализирована методом глубокого секвенирования частота мутаций, обнаруженных по этому локусу в Т-клетках, одновременно трансфецированных CD52 и TRAC TALE-нуклеазой, очищенных магнитным сепарированием и разделенных на CD52-отрицательные и TCRαβ-отрицательные. Результаты представлены на фиг. 9. Наибольшая частота инсерций/делеций составляет 7×10^-4. Эти результаты делают мнимую мишень вне сайта по меньшей мере в 600 раз менее вероятной для формирования мутаций чем намеченные мишени. Таким образом, TALE-нуклеазные реагенты, используемые в этом исследовании, проявляют чрезвычайно высокую специфичность.

Пример 3. TALE-нуклеазы, расщепляющие ген человека CTLA4 и ген человека PDCD1.

В примере 1 показано, что гетеродимерные TALE-нуклеазы, нацеливающиеся соответствующим образом на гены PDCD1 и CTLA4, конструируют и нарабатывают. Целевые геномные последовательности, состоящие из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемые полумишенями), разделены спейсерами длиной 11 или 15 п.о. Каждую полумишень распознают с помощью повторов полу-TALE-нуклеаз, перечисленных в табл. 11.

Активность CTLA4-TALE-нуклеазы и PDCD1-TALE-нуклеазы в клетках HEK293

Каждую TALE-нуклеазную конструкцию субклонируют, используя фермент рестрикции в составе экспрессирующего вектора млекопитающих под контролем длинного промотора pEF1alpha. Миллион HEK293 высевают за сутки до трансфекции. Клетки трансфецируют совместно 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих TALE-нуклеазы, распознающие две полумишени в целевой геномной последовательности в генах PDCD1 и CTLA-4 под контролем промотора EF1-alpha, и 5 мкг контрольного вектора pUC (pCLS0003), используя 25 мкл липофектамина (фирма Invitrogen) по инструкциям производителя. Двухцепочечное расщепление, которое производят TALE-нуклеазы в кодирующих последовательностях PDCD1 или CTLA-4, репарируется в живых клетках путем негомологичного соединения концов (non homologous end joining - NHEJ), которое является механизмом, допускающим ошибки. Активность TALE-нуклеаз в живых клетках измеряют по частоте инсерций или делеций в целевом геномном локусе. Через 48 ч после трансфекции ДНК выделяют из трансфецированных клеток и осуществляют локус-специфичные ПЦР, используя следующие праймеры: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (форвардная адаптерная последовательность)-10N (TAG)-локус-специфичная форвардная последовательность для CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (SEQ ID NO: 99), для CTLA4_T03/T04: 5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (SEQ ID NO: 100), для PDCD1_T01: 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (SEQ ID NO: 101) или для PDCD1_T03: 5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (SEQ ID NO: 102) и реверсный праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (реверсная адаптерная последовательность)- - эндогенная локус-специфичная реверсная последовательность для CTLA4_T01: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (SEQ ID NO: 103), для CTLA4_T03/T04: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (SEQ ID NO: 104), для PDCD1_T01: 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 105) или для PDCD1_T03: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (SEQ ID NO: 106).

ПЦР продукты анализируют с помощью Т7-эндонуклеазы: вкратце, после денатурации и повторного отжига ПЦР продукта Т7-эндонуклеаза может специфически расщеплять несоответствующую ДНК, состоящую из цепей дикого типа и мутантных. Продукт расщепления затем разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. Наличие расщепляющегося продукта является показателем мутантных последовательностей, индуцированных действием TALE-нуклеазы. Результаты показаны на фиг. 10, где стрелки указывают на продукты расщепления ПЦР. Из результатов следует, что PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 и CTLA4_T4 TALE-нуклеазы все проявляют мутагенную нуклеазную активность в соответствующих сайтах-мишенях.

CTLA4 инактивация в первичных Т-клетках

Первичные Т-клетки человека инактивируют гранулами CD3/28. Через 5 суток проводят электропорацию 5×10⁶ клеток 20 мкг РНК, кодирующей одну из трех TALEN™ (T1, Т2 и Т3), сконструированных для гена CTLA4, или без РНК в качестве контроля. Через 3 суток после электропорации CTLA4 экспрессию измеряют путем внутриклеточного окрашивания, используя флуоресцентное антитело и метод жидкостной цитометрии (фиг. 27 и 28).

Все три TALEN™ индуцируют снижение регуляции экспрессии CTLA4, что коррелирует с их эффективностью в линиях клеток HEK293 (Т1 более эффективен, чем Т3 и Т4).

Секвенирование геномной ДНК, выделенной из трансфецированных клеток с помощью технологии 454 (фирма Roche), выявил, что 96% аллелей CTLA4 мутированы в TALEN Т1-обработанных клетках по сравнению с 0,1% в контрольном образце без TALEN.

PD1 инактивация в первичных Т-клетках

Первичные Т-клетки человека активируют гранулами CD3/28. Через 5 суток проводят электропорацию 5×10⁶ клеток 20 мкг РНК, кодирующей одну из двух последовательностей TALEN, специфичных в отношении гена человека PD1, или без РНК в качестве контроля. Через 10 суток клетки реактивируют и 3 суток после реактивации PD1 экспрессию измеряют окрашиванием поверхности, используя флуоресцентное антитело и метод жидкостной цитометрии (фиг. 29).

Обе TALEN индуцируют снижение регуляции экспрессии PD1.

Секвенирование геномной ДНК, выделенной из клеток, трансфецированных TALEN Т1 и TALEN Т03 соответствующим образом используя технологию 454 (фирма Roche), выявил, что 34% и 39% аллелей PD1 были соответствующим образом мутированы (результаты показаны на фиг. 30).

Повышенная противоопухолевая активность PD1-TALEN обработанных клеток:

Первичные Т-клетки человека активируют гранулами CD3/28. Через пять суток 5×10⁶ клеток электропорируют 20 мкг РНК, кодирующей TALEN, специфичную в отношении гена человека PD1, или без РНК в качестве контроля. Через неделю клетки электропорируют мРНК, кодирующей химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении CD19 человека, или без РНК в качестве отрицательного контроля. Через сутки их противоопухолевую активность измеряют в анализе клеточной цитотоксичности, используя CD19+ клетки Дауди (против K562 в качестве контроля) или клетки НСТ116, которые экспрессируют PD1 лиганд 1 (PDL1), трансдуцированный с вектором экспрессии CD19 (против исходных НСТ116 в качестве контроля). Цитотоксическую активность определяют путем сравнения жизнеспособности целевых клеток и контрольных клеток. Результаты показаны в диаграммах на фиг. 31. PD1 TALEN трансфекция восстанавливает цитотоксическую активность против PDL1-экспрессирующих клеток НСТ116 и улучшает цитотоксическую активность против клеток Дауди.

Пример 4. pTalpha допускает экспрессию CD3 на поверхности инактивированных TCR alpha Т-лимфоцитах:

Описание разных версий preTalpha:

Ген pTalpha человека кодирует трансмембранный гликопротеин, включающий внеклеточный Ig-подобный домен, гидрофобный трансмембранный домен и крупный С-концевой внутрицитоплазматический хвост. Разные версии, производные от pTalpha гликопротеина человека, были сконструированы и описаны в табл. 2 и представлены на фиг. 11.

Разные исследованные preTalpha конструкции включают:

1. Мутанты pTalpha с делениями. Получают разные делеции во внутриклеточном цитоплазматическом хвосте белка человека pTalpha (который включает 114 аминокислот) (SEQ ID NO: 107). Исследуемые конструкции включали версию белка полной длины (FL) и мутанты, в которых аминокислоты 18, 48, 62, 78, 92, 110 и 114 были делетированы с С-конца белка (с SEQ ID NO: 108 по SEQ ID NO: 114).

2. Мутанты pTalpha, содержащие внутриклеточные домены активации. Варианты FL и Δ48 гибридизируют с CD8, CD28 или 41ВВ внутриклеточными доменами активации по С-концам (с SEQ ID NO: 115 по SEQ ID NO: 120).

3. pTalpha/TCRα химерные мутанты: В одной из конструкций TCRα внутриклеточный домен (intracellular domain - IC) гибридизируют с бесхвостой версией (Δ114) pTalpha (SEQ ID NO: 121). Также получают вторую конструкцию, в которой внеклеточный домен pTalpha гибридизируют с трансмембранным (ТМ) и IC доменами от TCRα (SEQ ID NO: 122).

4. pTalpha мутанты димеризации: В литературе описаны мутации, способные изменять способность к олигомеризации/димеризации комплекса preTCR. Предполагают, что эти мутанты допускают экспрессию preTCR на поверхности Т-клеток без индукции конститутивной передачи сигнала (предположительно индукция происходит при олигомеризации preTCR). Мутации, интродуцированные в вариант pTalphaΔ48:

- 1× MUT: W46R (SEQ ID NO: 123)

- 4× MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (SEQ ID NO: 124)

Активность разных preTalpha конструкций в TRAC-инактивированных клетках Jurkat.

Для скрининга различных вариантов pTalpha по способности восстанавливать экспрессию CD3 на поверхности TCRalpha-инактивированных клеток, получают линию клеток, в которой ген TCRalpha разорван с помощью нацеливания TALEN на TRAC. Клетки Jurkat (линия лейкозных Т-клеток) методом CytoPulse электропорации трансфецируют плазмидами, кодирующими TALEN, которая расщепляет TRAC, и клетки KO (TCR_α/β^NEG; CD3^NEG) затем очищают методом отрицательной селекции, используя магнитные гранулы CD3. Популяцию клеток KO (JKT_KO×3 клетки) амплифицируют и используют для скрининга разных вариантов pTalpha. Скрининг проводят путем трансфекции одного миллиона JKT_KO×3 клеток 15 мкг плазмиды, кодирующей разные варианты pTalpha под контролем промотора EF1α, с последующим анализом жидкостной цитометрией экспрессии CD3 на поверхности клеток через 48 ч после трансфекции. На фиг. 12 показывают типичный пример эффективности трансфекции (% BFP+ клеток) и активности FL, Δ18 и Δ48 pTalpha конструкций в JKT_KO×3 клетках на основании процента клеток CD3+, определенных жидкостной цитометрией. Результаты по разным конструкциям представлены по группам в табл. 13.

Активность pTalpha-FL и pTalpha-Δ48 в первичных Т-лимфоцитах с инактивированным TCR alpha

Для тестирования способности версий pTalpha-FL и pTalpha-Δ48 индуцировать экспрессию CD3 на поверхности Т-лимфоцитов с инактивированным TCR alpha, pTalpha-FL и pTalpha-Δ48 кодирующие последовательности клонируют в самоинактивирующем лентивирусном векторе pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA, который кодирует синий флуоресцентный белок (Blue Fluorescent protein - BFP) под контролем промотора SFFV и следующий за ним саморасщепляющий пептид Т2А (фиг. 13).

Т-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активируют в течение 72 ч, используя анти-CD3/CD28 активирующие гранулы (фирма Life technologies), и 4,5 миллиона клеток подвергают трансфекции путем электропорации с помощью прибора CytoLVT-S (фирма BTX-Harvard Harbour) 10 мкг мРНК, кодирующей TALE-нуклеазу, которая нацеливается на область константной цепи TCR alpha (TRAC). Через 2 суток после электропорации Т-клетки трансдуцируют или LV-SFFV-BFP-2A-pTalpha-Δ48, или LV-SFFV-BFP-2А-контрольными лентивирусными векторами. CD3 отрицательные Т-клетки и Т-клетки с низким содержанием CD3 затем очищают, используя анти-CD3 магнитные гранулы (фирма Miltenyi Biotech). Протокол этого эксперимента представлен на фиг. 14А.

На фиг. 14Б представлен анализ методом жидкостной цитометрии TCRalpha/beta, экспрессию на поверхности клеток CD3 и экспрессию BFP на TCRalpha-инактивированных Т-клетках (KO), трансдуцированных BFP-2A-pTalphaΔ48 (KO/Δ48) или контрольным BFP лентивирусным вектором (KO/BFP) до и после очистки гранулами CD3. TCRalpha-инактивированные клетки, трансдуцированные BFP-T2A-pTalpha-Δ48 вектором (BFP+ клетки), показывают повышенные уровни CD3 по сравнению с уровнями нетрансдуцированных клеток (BFP- клетки). Нет отличий среди клеток, трансдуцированных контрольным вектором BFP. Эти результаты показывают, что pTalpha опосредует восстановление экспрессии CD3 на поверхности TCRalpha инактивированных клеток. Напротив, TCRalpha/beta окрашивание сохраняет, как и ожидалось, неизменными клетки, трансдуцированные или не трансдуцированные вектором экспрессии pTalpha-Δ48.

pTalpha-опосредованная CD3 экспрессия поддерживает активацию TCR-недостаточных Т-клеток

Для определения способности pTalpha трансдуцировать сигналы активации клеток, исследуют сигналы маркеров ранней и поздней активации на TCR alpha-инактивированных Т-клетках, трансдуцированных pTalpha-Δ48 и pTalpha-Δ48.41ВВ. Т-клетки с инактивированным TCR alpha, трансдуцированные pTalpha-Δ48 и pTalpha-Δ48.41BB, получают из первичных Т-клеток человека согласно описанному в предыдущем разделе и на фиг. 14А.

Для обнаружения передачи сигнала через CD3 клетки реактивируют, используя гранулы с анти-CD3/CD28 покрытием через 3 суток после очистки TCR alpha инактивированных Т-клеток гранулами CD3 (фиг. 14А). Клетки окрашивают конъюгированными с флюорохромом анти-CD69 (маркер ранней активации) и анти-CD25 (маркер поздней активации) через 24 и 48 ч после реактивации, соответственно, и анализируют методом жидкостной цитометрии (фиг. 15А, Б). На фиг. 15А и Б показано, что TCR alpha-инактивированные клетки, экспрессирующие pTalpha-Δ48 (KO/рТα-Δ48) или pTalpha-Δ48.41BB (KO/рТα-Δ48.ВВ), проявляют повышенную регуляцию маркеров активации до уровней, схожих с уровнями, наблюдаемыми в TCRalpha/beta экспрессирующих клетках (клетки, не подвергшиеся электропорации; NEP - non electroporated).

Другим индикатором активации Т-клеток является увеличение размера клеток, которое иногда называют «губительным». Способность комплексов preTCR индуцировать «губительный» размер измеряют методом жидкостной цитометрии, определяя размер клеток через 72 ч после реактивации, используя анти-CD3/CD28- гранулы (фиг. 15В). Стимуляция анти-CD3/CD28 гранулами индуцировала сопоставимые повышения размера тех клеток, которые экспрессируют комплексы TCRalpha/beta, при сравнении с клетками, экспрессирующими pTalpha-Δ48 или pTalpha-Δ48.41BB. Анализируемые вместе, эти результаты означают, что комплексы preTCR компетентны для трансдукции сигналов, которые эффективно сочетаются с механизмами, опосредующими повышение регуляции маркеров активации.

pTalpha опосредованная CD3 экспрессия поддерживает размножение TCR-недостаточных первичных Т-клеток, используя стимулирующие анти-CD3/CD28 антитела

Для оценки способности комплексов preTCR поддерживать долгосрочную пролиферацию клеток, измеряют пролиферацию клеток, выработанных согласно описанному ранее. Через 10 суток после первоначальной активации клетки поддерживают в IL2 (нет реактивации) или в IL2 с анти-CD3/CD28 гранулами (реактивация). Для каждого состояния клетки подсчитывают и анализируют методом жидкостной цитометрии в разные моменты времени для оценки числа клеток BFP+. Рост TCRalpha инактивированных клеток (KO), трансдуцированных BFP или BFP-T2A-preTCRα-Δ48 векторами, сравнивают и оценивают и кратную индукцию этих клеток оценивают относительно величины, полученной на 2 сутки после реактивации. На фиг. 16 показывают результаты, полученные от двух независимых доноров. В обоих случаях TCRalpha инактивированные клетки, экспрессирующие pTalpha-Δ48, обладают повышенным размножением по сравнению с TCRalpha инактивированными клетками, экспрессирующими только BFP контрольный вектор. Для второго донора TCRalpha инактивированные клетки, экспрессирующие pTalpha-Δ48.41ВВ или pTalpha полной длины, также включены и также проявляют повышенное размножение по сравнению с TCRalpha инактивированными клетками, экспрессирующими только BFP контрольный вектор.

Пример 5. Оптимизация трансфекции мРНК в Т-клетки, используя метод Cytopulse

Определение оптимизированной программы Cytopulse

Первую серию экспериментов проводят на неактивированных мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) для того, чтобы определить диапазон напряжения, при котором клетки могут быть трансфецированы. Пять протестированных разных программ представлены в табл. 14.

Электропорируют 3 или 6 миллионов клеток в кювете для электропорации с просветом 0,4 см (30 или 15×10⁶ клеток/мл) с 20 мкг плазмид, кодирующих GFP, и контрольные плазмид pUC, используя разные программы Cytopulse. Через 24 ч после электропорации исследуют экспрессию GFP в электропорированных клетках методом жидкостной цитометрии для определения эффективности трансфекции. Полученные данные на фиг. 17 показывают минимальное напряжение, требуемое для электропорации плазмиды в МКПК производные Т-клетки. Эти результаты свидетельствуют, что программы cytopulse 3 и 4 допускают эффективную трансформацию Т-клеток (ЕР#3 и #4).

Электропорации мРНК в очищенные Т-клетки

После определения наилучшей программы Cytopulse, которая позволяет осуществить эффективную электропорацию ДНК в Т-клетки, устанавливают применимость настоящего метода для электропорации мРНК.

5×10⁶ очищенных Т-клеток, предварительно активированных 6 суток с PHA/IL2, ресуспендируют в буфере Т для цитопорации (фирма BTX-Harvard apparatus) и электропорируют в 0,4 см кюветах с 10 мкг мРНК, кодирующей GFP или 20 мкг плазмид, кодирующих GFP или pUC, используя предпочтительную программу Cytopulse, определенную в предыдущем разделе (табл. 15).

Таблица 15. Программа Cytopulse, используемая для электропорации очищенных Т-клеток.

Через 48 ч после трансфекции клетки окрашивают прижизненным красителем (eFluor-450) и определяют выживаемость клеток и процент жизнеспособных GFP+ клеток методом жидкостной цитометрии (фиг. 18).

Представленные на фиг. 18 результаты показывают, что электропорация РНК в оптимальных условиях, определенных в настоящем изобретении, не является токсичной и позволяет осуществить трансфекцию более чем 95% жизнеспособных клеток.

Полученные в совокупности результаты показывают, что Т-клетки могут быть эффективно трансфецированы как ДНК, так и РНК. В частности трансфекция РНК не влияет на выживаемость клеток и позволяет единообразить уровни экспрессии трансфецированных целевых генов в популяции клеток.

Эффективная трансфекция может быть достигнута после клеточной активации раньше независимо от применяемого метода активирования (PHA/IL-2 или CD3/CD28-покрытые-гранулы). В настоящем изобретении достигли эффективности в трансфекции клеток >95% через 72 ч после активирования. Кроме того, также может быть эффективной трансфекция Т-клеток после оттаивания и активирования по тому же протоколу электропорации.

Электропорация мРНК в первичные Т-клетки человека для функциональной экспрессии TALE-нуклеазы

После того, как было установлено, что электропорация мРНК приводит к эффективной экспрессии GFP в первичных Т-клетках человека, исследовали применимость настоящего способа для экспрессии других целевых белков. Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALE-нуклеазы), являются сайт-специфичными нуклеазами, образованными в результате гибридизации TAL ДНК-связывающего домена с ДНК-расщепляющим доменом. Они представляют мощные инструменты редактирования генома, поскольку индуцируют двухцепочечные разрывы практически в любой последовательности ДНК, в которой это требуется. Такие двухцепочечные разрывы активируют соединение негомологичных концов (Non-homologous end-joining - NHEJ), подверженный ошибкам механизм репарации ДНК, потенциально приводящий к инактивации какого-либо требуемого целевого гена. В другом варианте, если адекватная репарирующая матрица одновременно интродуцирована в клетки, индуцированные TALE-нуклеазой разрывы ДНК могут быть репарированы путем гомологичной рекомбинации, вследствие этого открывая возможность модификации требуемой последовательности.

В настоящем описании применяют электропорацию мРНК для экспрессии TALE-нуклеазы, сконструированной для специфического расщепления последовательности в гене человека, кодирующем цепь альфа антигенного рецептора Т-клеток (T-cell antigen receptor - TRAC). Предполагают, что мутации, индуцированные в этой последовательности, приводят к инактивации гена и утрате комплекса TCRαβ с поверхности клетки. РНК TRAC TALE-нуклеазы или некодирующую РНК в качестве контроля трансфецируют в активированные первичные Т-лимфоциты человека, используя метод Cytopulse. Последовательность электропорации описана в табл. 15: она включает 2 импульса 1200 В и затем 4 импульса 130 В.

С помощью анализа методом жидкостной цитометрии экспрессии TRC на поверхности клеток через 7 суток после электропорации (фиг. 19, верхняя панель) установлено, что 44% Т-клеток утратили экспрессию TCRαβ. Исследование геномной ДНК трансфецированных клеток методом ПЦР амплификации локуса TRAC с помощью системы высокопродуктивного секвенирования 454. 33% секвенированных аллелей (727 из 2153) содержат инсерции или делеции в сайте расщепления TALE-нуклеазы. Фиг. 19 (нижняя панель) показывает примеры мутантных аллелей.

Полученные данные показывают, что электропорация мРНК методом цитопульса приводит к функциональной экспрессии TRAC TALE-нуклеазы.

Электропорация Т-клеток моноцистронной мРНК, кодирующей анти-CD19 одноцепочечный химерный антигенный рецептор (CAR)

5×10⁶ Т-клетки, предварительно активированные за несколько суток (за 3-5 суток) гранулами с анти-CD3/CD28 покрытием и IL2, ресуспендируют в буфере Т для цитопорации и проводят электропорацию в 0,4 см кюветах без мРНК или с 10 мкг мРНК, кодирующей одноцепочечный (SEQ ID NO: 73), используя программу, представленную в табл. 15.

Через 24 ч после электропорации клетки окрашивают фиксирующим прижизненным красителем eFluor-780 и РЕ-конъюгированным козьим антимышиным IgG F(ab')2 фрагментом, специфичным для оценки экспрессии CAR на поверхности живых клеток. Полученные данные на фиг. 20. А показывают, что огромное большинство живых Т-клеток, электропорированных описанной ранее моноцистронной мРНК, экспрессируют на своей поверхности CAR. Через 24 ч после электропорации Т-клетки культивируют совместно с клетками Дауди (CD19⁺) в течение 6 ч и анализируют методом жидкостной цитометрии для обнаружения экспрессии маркера дегранулирования CD107a на своей поверхности (Betts, Brenchley и др., 2003).

Представленные на фиг. 20 данные показывают, что большинство клеток, электропорированных описанной ранее моноцистронной мРНК, дегранулирует в присутствии целевых клеток, экспрессирующих CD19. Эти результаты четко показывают, что экспрессируемый на поверхности электропорированных Т-клеток CAR активен.

Электропорация Т-клеток полицистронной мРНК, кодирующей анти-CD19 мультисубъединичный химерный антигенный рецептор (CAR):

5×10⁶ Т-клеток, заранее активированных (за 3-5 суток) гранулами с покрытием анти-CD3/CD28 и IL2, подвергают электропорации в буфере Т для цитопорации и осуществляют электропорацию в 0,4 см кюветах без мРНК или с 45 мкг мРНК, кодирующей многоцепочечный CAR (SEQ ID NO: 125, кодируемая SEQ ID NO: 126, фиг. 21А и фиг. 4Б (мСм 4)), используя программу, представленную в табл. 15.

Через 24 ч после электропорации клетки окрашивают фиксирующим прижизненным красителем eFluor-780 и РЕ-конъюгированным козьим антимышиным IgG F(ab')2 фрагментом, специфичным для оценки экспрессии CAR на поверхности живых клетках. Представленные на фиг. 21 данные показывают, что огромное большинство живых Т-клеток, электропорированных ранее описанной полицистронной мРНК, экспрессируют CAR на поверхности.

Через 24 ч после электропорации Т-клетки культивируют совместно с клетками Даути (CD19⁺) в течение 6 ч и анализируют методом жидкостной цитометрии для обнаружения экспрессии на их поверхности маркера дегрануляции CD107. Представленные на фиг. 21 данные показывают, что большинство клеток, подверженных электропорации ранее описанной полицистронной мРНК, дегранулирует в присутствии целевых клеток, экспрессирующих CD19. Эти результаты четко показывают, что экспрессированный на поверхности подвергшихся электропорации Т-клеток CAR активен.

Литература

Arimondo Р.В., С.J. Thomas и др. «Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates.» Mol Cell Biol 26(1), 2006, cc. 324-333.

Arnould S., P. Chames, и др. «Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases that induce recombination on novel DNA targets.» J Mol Biol 355(3), 2006, cc. 443-458.

Ashwell J.D., R.D. Klusner «Genetic and mutational analysis of the T-cell antigen receptor.» Annu Rev Immunol 8, 1990, cc. 139-167.

Betts M.R., J.M. Brenchley и др. «Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation.» J Immunol Methods 281(1-2), 2003, cc. 65-78.

Boch J., H. Scholze «Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.» Science 326(5959), 2009, cc. 1509-1512.

Boni A., P. Muranski и др. «Adoptive transfer of allogeneic tumor-specific T cells mediates effective regression of large tumors across major histocompatibility barriers.» Blood 112(12), 2008, cc. 4746-4754.

Brahmer J.R., C.G. Drake и др. «Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.» J Clin Oncol 28(19), 2010, cc. 3167-3175.

Cambier J.C. «Antigen and Fc receptor signaling. The awesome power of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM).» J Immunol 155(7), 1995, cc. 3281-3285.

Carrasco Y.R., A.R. Ramiro и др. «An endoplasmic reticulum retention function for the cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR) alpha chain: potential role in the regulation of cell surface pre-TCR expression levels.» J Exp Med 193(9), 2001, cc. 1045-1058.

Cermak Т., E.L. Doyle и др. «Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.» Nucleic Acids Res 39(12), 2011, c. e82.

Chames P., J.C. Epinat и др. «In vivo selection of engineered homing endonucleases using double-strand break induced homologous recombination.» Nucleic Acids Res 33(20), 2005, c. e178.

Choulika A., A. Perrin и др. «Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae.» Mol Cell Biol 15(4), 1995, cc. 1968-1973.

Christian M., T. Cermak и др. «Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.» Genetics 186(2), 2010, cc. 757-761.

Coutinho A.E., K.E. Chapman «The anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and mechanistic insights.» Mol Cell Endocrinol 335(1), 2011, cc. 2-13.

Critchlow, S.E., S.P. Jackson «DNA end-joining: from yeast to man.» Trends Biochem Sci 23(10), 1998, cc. 394-398.

Deng, D., C. Yan и др., (2012). "Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors." Science 335(6069), 2012, cc. 720-723.

K. Eisenschmidt, T. Lanio и др. «Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage.» Nucleic Acids Res 33(22), 2005, cc. 7039-7047.

Epinat J.C., S. Arnould и др. «A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells.» Nucleic Acids Res 31(11), 2003, cc. 2952-2962.

Geissler, R., H. Scholze и др. «Transcriptional activators of human genes with programmable DNA-specificity.» PLoS One 6(5), 2011, c. e19509.

Howard F.D., H.R. Rodewald и др. «CD3 zeta subunit can substitute for the gamma subunit of Fc epsilon receptor type I in assembly and functional expression of the high-affinity IgE receptor: evidence for interreceptor complementation.» Proc Natl Acad Sci USA 87(18), 1990, cc. 7015-7019.

Huang P., A. Xiao и др. «Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.» Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 699-700.

Jena В., G. Dotti и др. «Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.» Blood 116(7), 2010, cc. 1035-1044.

Kalish J.M., P.M. Glazer «Targeted genome modification via triple helix formation.» Ann NY Acad Sci 1058, 2005, cc. 151-161.

Li L., M.J. Piatek и др. «Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcriptional regulators and nucleases for genome modification.» Plant Mol Biol 78(4-5), 2012, cc. 407-416.

Li Т., S. Huang и др. «TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain.» Nucleic Acids Res 39(1), 2011, cc. 359-372.

Li Т., S. Huang и др. «Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.» Nucleic Acids Res 39(14), 2011, cc. 6315-6325.

Ma J.L., E.M. Kim и др. «Yeast Mre11 and Rad1 proteins define a Ku-independent mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences.» Mol Cell Biol 23(23), 2003, cc. 8820-8828.

Mahfouz M.M., L. Li и др. «Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein.» Plant Mol Biol 78(3), 2012, cc. 311-321.

Mahfouz M.M., L. Li и др. «De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks.» Proc Natl Acad Sci USA 108(6), 2011, cc. 2623-2628.

Mak A.N., P. Bradley и др. «The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target.» Science 335(6069), 2012, cc. 716-719.

Metzger H., G. Alcaraz и др. «The receptor with high affinity for immunoglobulin E.» Annu Rev Immunol 4, 1986, cc. 419-70.

Miller J.C., S. Tan и др. «A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.» Nat Biotechnol 29(2), 2011, cc. 143-148.

Morbitzer R., P. Romer и др. «Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors.» Proc Natl Acad Sci USA 107(50), 2011, cc. 21617-21622.

Moscou M.J., A.J. Bogdanove «A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.» Science 326(5959), 2009, c. 1501.

Mussolino C., R. Morbitzer и др. «A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity.» Nucleic Acids Res 39(21), 2011, cc. 9283-9293.

Pang S.S., R. Berry и др. «The structural basis for autonomous dimerization of the pre-T-cell antigen receptor.» Nature 467(7317), 2010, cc. 844-848.

Paques F., P. Duchateau «Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy.» Curr Gene Ther 7(1), 2007, cc. 49-66.

Pardoll D., C. Drake «Immunotherapy earns its spot in the ranks of cancer therapy.» J Exp Med 209(2), 2012, cc. 201-209.

Pardoll D.M. «The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.» Nat Rev Cancer 12(4), 2012, cc. 252-264.

Park T.S., S.A. Rosenberg и др. «Treating cancer with genetically engineered T cells.» Trends Biotechnol 29(11), 2011, cc. 550-557.

Pingoud A., G.H. Silva «Precision genome surgery." Nat Biotechnol 25(7), 2007, cc. 743-744.

Porteus M.H., D. Carroll «Gene targeting using zinc finger nucleases.» Nat Biotechnol 23(8), 2005, cc. 967-973.

Robert С., C. Mateus «Anti-CTLA-4 monoclonal antibody: a major step in the treatment of metastatic melanoma.» Med Sci (Paris) 27(10), 2011, cc. 850-858.

Rouet P., F. Smih и др. «Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.» Mol Cell Biol 14(12), 1994, cc. 8096-8106.

Saint-Ruf С., O. Lechner и др. «Genomic structure of the human pre-T cell receptor alpha chain and expression of two mRNA isoforms.» Eur J Immunol 28(11), 1998, cc. 3824-3831.

Sander J.D., L. Cade и др. «Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.» Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 697-698.

Smith J., S. Grizot и др. «A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences.» Nucleic Acids Res 34(22), 2006, c. e149.

Stoddard B.L. «Homing endonuclease structure and function.» Q Rev Biophys 38(1), 2005, cc. 49-95.

Tesson L., C. Usal и др. «Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs.» Nat Biotechnol 29(8), 2011, cc. 695-696.

von Boehmer H. «Unique features of the pre-T-cell receptor alpha-chain: not just a surrogate.» Nat Rev Immunol 5(7), 2005, cc. 571-577.

Waldmann H., G. Hale «САМРАТН: from concept to clinic.» Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 360(1461), 2005, cc. 1707-1711.

Weber E., R. Gruetzner и др. «Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning.» PLoS One 6(5), 2011, c. e19722.

Yamasaki S., E. Ishikawa и др. «Mechanistic basis of pre-T cell receptor-mediated autonomous signaling critical for thymocyte development.» Nat Immunol 7(1), 2006, cc. 67-75.

Zhang F., L. Cong и др. «Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.» Nat Biotechnol 29(2), 2011, cc. 149-153.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЕЛЛЕКТИС

<120> СПОСОБЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ АЛЛОГЕННЫХ И ВЫСОКО АКТИВНЫХ Т-КЛЕТОК

ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ

<130> 435147WO (DI2013-18PCT)

<160> 126

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex2

<400> 1

tattcactga tggactccaa agaatcatta actcctggta gagaagaaa 49

<210> 2

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T2

<400> 2

tgcctggtgt gctctgatga agcttcagga tgtcattatg gagtcttaa 49

<210> 3

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T4

<400> 3

tgctctgatg aagcttcagg atgtcattat ggagtcttaa cttgtggaa 49

<210> 4

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T1

<400> 4

tggtgtcact gttggaggtt attgaacctg aagtgttata tgcaggata 49

<210> 5

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T2

<400> 5

tatgatagct ctgttccaga ctcaacttgg aggatcatga ctacgctca 49

<210> 6

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T3

<400> 6

ttatatgcag gatatgatag ctctgttcca gactcaactt ggaggatca 49

<210> 7

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex2-LPT9-L1

<400> 7

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 8

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex2-LPT9-R1

<400> 8

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 9

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex3T2-L1

<400> 9

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 10

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex3T2-R1

<400> 10

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 11

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex3T4-L1

<400> 11

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 12

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex3T4-R1

<400> 12

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 13

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T1-LPT8-L1

<400> 13

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 14

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T1-LPT8-R1

<400> 14

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 15

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T2-L1

<400> 15

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 16

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T2-R1

<400> 16

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 17

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T3-L1

<400> 17

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 18

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор-GRex5T3-R1

<400> 18

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 19

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex2-L TALEN

<400> 19

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 20

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex2-R TALEN

<400> 20

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 21

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T2-L TALEN

<400> 21

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 22

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T2-R TALEN

<400> 22

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 23

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T4-L TALEN

<400> 23

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 24

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex3T4-R TALEN

<400> 24

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 25

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T1-L TALEN

<400> 25

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 26

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T1-R TALEN

<400> 26

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 840

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 27

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T2-L TALEN

<400> 27

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 28

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T2-R TALEN

<400> 28

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 840

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 29

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T3-L TALEN

<400> 29

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 30

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> GRex5T3-R TALEN

<400> 30

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 840

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1380

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 31

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер GR exon 2

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 31

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn ggttcattta acaagctgcc 60

<210> 32

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер GR exon 3

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 32

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn gcattctgac tatgaagtga 60

<210> 33

<211> 69

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер GR exon 5

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 33

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn tcagcaggcc actacaggag 60

tctcacaag 69

<210> 34

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR exon 2

<400> 34

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag agccagtgag ggtgaagacg 50

<210> 35

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR exon 3

<400> 35

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag gggctttgca tataatggaa 50

<210> 36

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR exon 5

<400> 36

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ctgactctcc ccttcatagt ccccagaac 59

<210> 37

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T01

<400> 37

ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49

<210> 38

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T01

<400> 38

tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa aaggccaca 49

<210> 39

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T02

<400> 39

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca 50

<210> 40

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T02

<400> 40

ttcctcctac tcaccatcag cctcctggtt atggtacagg taagagcaa 49

<210> 41

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRAC_T01-L

<400> 41

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 42

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRAC_T01-R

<400> 42

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 43

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRBC_T01-L

<400> 43

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 44

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRBC_T01-R

<400> 44

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 45

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRBC_T02-L

<400> 45

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 46

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор TRBC_T02-R

<400> 46

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 47

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CD52_T02-L

<400> 47

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 48

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CD52_T02-R

<400> 48

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 49

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T01-L TALEN

<400> 49

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 50

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T01-R TALEN

<400> 50

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 51

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T01-L TALEN

<400> 51

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 52

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T01-R TALEN

<400> 52

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 53

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T02-L TALEN

<400> 53

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 54

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRBC_T02-R TALEN

<400> 54

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1260

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 55

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T02-L TALEN

<400> 55

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 56

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T02-R TALEN

<400> 56

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 57

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T02

<400> 57

tttagaaagt tcctgtgatg tcaagctggt cgagaaaagc tttgaaaca 49

<210> 58

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T03

<400> 58

tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc gattttgatt ctcaaacaa 49

<210> 59

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T04

<400> 59

tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaaga 49

<210> 60

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> TRAC_T05

<400> 60

tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaa 49

<210> 61

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T01

<400> 61

ttcctcttcc tcctaccacc atcagcctcc tttacctgta ccataac 47

<210> 62

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T04

<400> 62

ttcctcctac tcaccacagc ctcctggtct tacctgtacc ata 43

<210> 63

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T05

<400> 63

tcctactcac catcagctcc tggttatttg ctcttacctg tac 43

<210> 64

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T06

<400> 64

ttatcccact tctcctctac agatacaaac tttttgtcct gagagtc 47

<210> 65

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CD52_T07

<400> 65

tggactctca ggacaaacga caccagccaa atgctgaggg gctgctg 47

<210> 66

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер CD52

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 66

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn cagatctgca gaaaggaagc 60

<210> 67

<211> 61

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер TRAC

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 67

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn atcactggca tctggactcc 60

a 61

<210> 68

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер TRBC1

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 68

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn agagccccta ccagaaccag 60

ac 62

<210> 69

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер TRBC2

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 69

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn ggacctagta acataattgt 60

gc 62

<210> 70

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR CD52

<400> 70

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag cctgttggag tccatctgct g 51

<210> 71

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR TRAC

<400> 71

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag cctcatgtct agcacagttt 50

<210> 72

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер GR TRBC1-2

<400> 72

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag accagctcag ctccacgtgg t 51

<210> 73

<211> 495

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> анти-CD19 CAR

<400> 73

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr

65 70 75 80

Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr

180 185 190

Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro

245 250 255

Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro

260 265 270

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

275 280 285

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

290 295 300

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

305 310 315 320

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

325 330 335

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

340 345 350

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

355 360 365

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

370 375 380

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

385 390 395 400

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

405 410 415

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

420 425 430

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

435 440 445

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

450 455 460

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

465 470 475 480

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 74

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T01

<400> 74

tggccctgca ctctcctgtt ttttcttctc ttcatccctg tcttctgca 49

<210> 75

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T03

<400> 75

ttttccatgc tagcaatgca cgtggcccag cctgctgtgg tactggcca 49

<210> 76

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T04

<400> 76

tccatgctag caatgcacgt ggcccagcct gctgtggtac tggccagca 49

<210> 77

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T01

<400> 77

ttctccccag ccctgctcgt ggtgaccgaa ggggacaacg ccaccttca 49

<210> 78

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T03

<400> 78

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagaga 49

<210> 79

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T01-L

<400> 79

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 80

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T01-R

<400> 80

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 81

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T03-L

<400> 81

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 82

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T03-R

<400> 82

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 83

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T04-L

<400> 83

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 84

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор CTLA4_T04-R

<400> 84

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 85

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор PDCD1_T01-L

<400> 85

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

340 345 350

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 86

<211> 529

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор PDCD1_T01-R

<400> 86

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

65 70 75 80

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln

275 280 285

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His

290 295 300

Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly

305 310 315 320

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

325 330 335

Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

340 345 350

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

355 360 365

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

370 375 380

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

385 390 395 400

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile

405 410 415

Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

420 425 430

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

435 440 445

Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

450 455 460

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

465 470 475 480

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

485 490 495

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

500 505 510

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu

515 520 525

Glu

<210> 87

<211> 530

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор PDCD1_T03-L

<400> 87

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

420 425 430

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val

435 440 445

Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

450 455 460

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu

465 470 475 480

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

500 505 510

Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala

515 520 525

Leu Glu

530

<210> 88

<211> 529

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Повтор PDCD1_T03-R

<400> 88

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

50 55 60

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His

65 70 75 80

Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

85 90 95

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

100 105 110

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

115 120 125

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala

130 135 140

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

145 150 155 160

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val

165 170 175

Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

180 185 190

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln

195 200 205

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

210 215 220

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr

225 230 235 240

Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala

245 250 255

Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly

260 265 270

Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys

275 280 285

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala

290 295 300

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly

305 310 315 320

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

325 330 335

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

340 345 350

Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

355 360 365

Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala

370 375 380

Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

385 390 395 400

Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala

405 410 415

Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

420 425 430

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val

435 440 445

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

450 455 460

Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln

465 470 475 480

Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

485 490 495

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro

500 505 510

Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu

515 520 525

Glu

<210> 89

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T01-L TALEN

<400> 89

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 90

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T01-R TALEN

<400> 90

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 91

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T03-L TALEN

<400> 91

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 92

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T03-RTALEN

<400> 92

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 840

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1440

atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 93

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T04-L TALEN

<400> 93

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 900

caggtggtgg ccatcgccag caataatggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 94

<211> 2832

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> CTLA4_T04-R TALEN

<400> 94

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 540

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 660

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 720

gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840

aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1140

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260

caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440

atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560

ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1800

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1860

attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1980

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040

caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100

cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160

gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220

agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280

ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340

gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400

aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460

gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520

caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580

cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640

tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700

tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760

ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820

gccgactgat aa 2832

<210> 95

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T01-L TALEN

<400> 95

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260

caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740

ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 96

<211> 2829

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T01-R TALEN

<400> 96

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caagtcgtcg caatcgccag caataacgga 540

gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc 600

cttacccctg agcaggtggt ggccatcgca agtaacattg gaggaaagca agccttggag 660

acagtgcagg ccctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc 720

gtggccattg cctccaacat cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca ggccctgctg 780

cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat 840

aacggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct 900

catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acaacggggg caagcaggcc 960

cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa 1020

caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc 1080

ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc 1140

agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc 1200

caggcacacg ggctgacccc ccagcaggtg gtggctatcg ccagcaataa tgggggcaag 1260

caggccctgg aaacagtcca gcgcctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact 1320

cccgaacagg tcgtggcaat cgcctccaac ggagggaagc aggctctgga gaccgtgcag 1380

agactgctgc ccgtcttgtg ccaggcccac ggactcacac ctcagcaggt cgtcgccatt 1440

gcctctaaca acgggggcaa acaagccctg gagacagtgc agcggctgtt gcctgtgttg 1500

tgccaagccc acggcttgac tcctcaacaa gtggtcgcca tcgcctcaaa tggcggcgga 1560

aaacaagctc tggagacagt gcagaggttg ctgcccgtcc tctgccaagc ccacggcctg 1620

actccccaac aggtcgtcgc cattgccagc aacggcggag gaaagcaggc tctcgaaact 1680

gtgcagcggc tgcttcctgt gctgtgtcag gctcatgggc tgacccccca gcaagtggtg 1740

gctattgcct ctaacaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca 1800

gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacggc 1860

gggggcaaac aggcattgga aaccgtccag cgcctgcttc cagtgctctg ccaggcacac 1920

ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg 1980

gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa 2040

gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag 2100

ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc 2160

tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc 2220

cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg 2280

aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac 2340

cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag 2400

cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac 2460

tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag 2520

gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc 2580

aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc 2640

ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 2700

aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc 2760

accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc 2820

gactgataa 2829

<210> 97

<211> 2814

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T03-L TALEN

<400> 97

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60

gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120

aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180

acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240

aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300

ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360

agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420

gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480

ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 540

acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600

gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780

cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900

caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1020

agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080

caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1140

caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200

ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1260

cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1320

atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380

ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440

ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500

ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1560

acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620

gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680

ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740

gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800

cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860

ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920

caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980

ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040

agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100

ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160

cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220

aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280

gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340

aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400

aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460

gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520

aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580

gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640

aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700

tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760

gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814

<210> 98

<211> 2829

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> PDCD1_T03-R TALEN

<400> 98

atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60

gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120

cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180

ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240

ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300

gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360

acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420

attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480

acgggtgccc cgctcaactt gacccccgag caagtcgtcg caatcgccag ccatgatgga 540

gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc 600

cttacccctc agcaggtggt ggccatcgca agtaacggag gaggaaagca agccttggag 660

acagtgcagc gcctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc 720

gtggccattg cctcccatga cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca gaggctgctg 780

cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat 840

ggcggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct 900

catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acgggggggg caagcaggcc 960

cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa 1020

caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc 1080

ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc 1140

agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc 1200

caggcacacg ggctgacccc cgagcaggtg gtggctatcg ccagcaatat tgggggcaag 1260

caggccctgg aaacagtcca ggccctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact 1320

ccccagcagg tcgtggcaat cgcctccaac ggcggaggga agcaggctct ggagaccgtg 1380

cagagactgc tgcccgtctt gtgccaggcc cacggactca cacctgaaca ggtcgtcgcc 1440

attgcctctc acgatggggg caaacaagcc ctggagacag tgcagcggct gttgcctgtg 1500

ttgtgccaag cccacggctt gactcctcaa caagtggtcg ccatcgcctc aaatggcggc 1560

ggaaaacaag ctctggagac agtgcagagg ttgctgcccg tcctctgcca agcccacggc 1620

ctgactcccc aacaggtcgt cgccattgcc agcaacaacg gaggaaagca ggctctcgaa 1680

actgtgcagc ggctgcttcc tgtgctgtgt caggctcatg ggctgacccc cgagcaagtg 1740

gtggctattg cctctaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca 1800

gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacaac 1860

gggggcaaac aggcattgga aaccgtccag cgcctgcttc cagtgctctg ccaggcacac 1920

ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg 1980

gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa 2040

gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag 2100

ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc 2160

tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc 2220

cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg 2280

aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac 2340

cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag 2400

cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac 2460

tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag 2520

gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc 2580

aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc 2640

ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 2700

aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc 2760

accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc 2820

gactgataa 2829

<210> 99

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер CTLA4_T01

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 99

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn ctctacttcc tgaagacctg 60

<210> 100

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер CTLA4_T03/T04

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 100

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn acagttgaga gatggagggg 60

<210> 101

<211> 59

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер PDCD1_T01

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 101

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn ccacagaggt aggtgccgc 59

<210> 102

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер PDCD1_T03

<220>

<221> разные свойства

<222> (31)..(40)

<223> n означает a, или c, или t, или g

<400> 102

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn gacagagatg ccggtcacca 60

<210> 103

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер CTLA4_T01

<400> 103

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag tggaatacag agccagccaa 50

<210> 104

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер CTLA4_T03/04

<400> 104

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ggtgcccgtg cagatggaat 50

<210> 105

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер PDCD1_T01

<400> 105

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ggctctgcag tggaggccag 50

<210> 106

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер PDCD1_T03

<400> 106

cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ggacaacgcc accttcacct 50

<210> 107

<211> 281

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-FL

<400> 107

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Arg

245 250 255

Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Arg Gly Asp Leu

260 265 270

Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala

275 280

<210> 108

<211> 263

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta18

<400> 108

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Arg

245 250 255

Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser

260

<210> 109

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta48

<400> 109

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val

225 230

<210> 110

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta62

<400> 110

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg

210 215

<210> 111

<211> 203

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta78

<400> 111

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly

195 200

<210> 112

<211> 189

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta92

<400> 112

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg

180 185

<210> 113

<211> 171

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta110

<400> 113

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys

165 170

<210> 114

<211> 167

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta114

<400> 114

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu

165

<210> 115

<211> 344

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-FL-CD28

<400> 115

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Arg

245 250 255

Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Arg Gly Asp Leu

260 265 270

Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Gly Gly Val Leu Ala

275 280 285

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

290 295 300

Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

305 310 315 320

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

325 330 335

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

340

<210> 116

<211> 311

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-FL-CD8

<400> 116

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Arg

245 250 255

Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Arg Gly Asp Leu

260 265 270

Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser His Arg Asn Arg Arg

275 280 285

Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro

290 295 300

Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

305 310

<210> 117

<211> 325

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-FL-41BB

<400> 117

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Arg

245 250 255

Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Arg Gly Asp Leu

260 265 270

Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys

275 280 285

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

290 295 300

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

305 310 315 320

Gly Gly Cys Glu Leu

325

<210> 118

<211> 296

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta48-CD28

<400> 118

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Ala Ser Gly Gly Val Leu Ala

225 230 235 240

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

245 250 255

Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

260 265 270

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

275 280 285

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

290 295

<210> 119

<211> 263

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta48-CD8

<400> 119

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Ala Ser His Arg Asn Arg Arg

225 230 235 240

Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

260

<210> 120

<211> 277

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta48-41BB

<400> 120

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys

225 230 235 240

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

245 250 255

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Gly Gly Cys Glu Leu

275

<210> 121

<211> 172

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha-Delta114-TCRalpha.IC

<400> 121

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Arg Leu Trp Ser Ser

165 170

<210> 122

<211> 173

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha.EC-TCRalpha. TM. IC

<400> 122

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

145 150 155 160

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

165 170

<210> 123

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha.EC-Delta48-1xMUT

<400> 123

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val

225 230

<210> 124

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> pTalpha.EC-Delta48-4xMUT

<400> 124

Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro

20 25 30

Ile Met Leu Leu Val Ala Gly Ala Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu

35 40 45

Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser

50 55 60

Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly

100 105 110

Ala Glu Gly His Ser Ala Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu

115 120 125

Ala Ser Thr Ala Ala Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro

130 135 140

Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala

165 170 175

Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly

180 185 190

Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr

195 200 205

Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro

210 215 220

Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val

225 230

<210> 125

<211> 848

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> Многоцепочечный CAR

<400> 125

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser

20 25 30

Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn

65 70 75 80

Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr

100 105 110

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr

115 120 125

Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro

165 170 175

Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn

180 185 190

Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln

195 200 205

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

210 215 220

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg

225 230 235 240

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

245 250 255

His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

260 265 270

Lys Arg Ala Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

290 295 300

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

305 310 315 320

Asp Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr

325 330 335

Gly Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile

340 345 350

Lys Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro

355 360 365

Asn Pro Lys Asn Asn Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys

370 375 380

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg

385 390 395 400

Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe

405 410 415

Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu

420 425 430

Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys

435 440 445

Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile

450 455 460

Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys Ser Val Leu Asp Ile Ser His

465 470 475 480

Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp

485 490 495

Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu

500 505 510

Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr

515 520 525

Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn

530 535 540

Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His Ile His Ser Cys Gln Lys Phe

545 550 555 560

Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser Phe Ser Thr Glu Ile Val Val

565 570 575

Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu

580 585 590

Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu

595 600 605

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

610 615 620

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

625 630 635 640

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Ser Gly Val Lys Gln

645 650 655

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

660 665 670

Pro Gly Pro Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val

675 680 685

Glu Gln Ala Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp

690 695 700

Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg

705 710 715 720

Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser

725 730 735

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

740 745 750

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

755 760 765

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

770 775 780

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

785 790 795 800

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

805 810 815

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

820 825 830

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

835 840 845

<210> 126

<211> 2547

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Многоцепочечный CAR

<400> 126

atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60

gatggcgtgt tagcagaggt gcagttgcag cagtcagggc cagagttgat taagcccgga 120

gcctccgtca agatgtcctg caaggccagc gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180

tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240

gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300

tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360

tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420

actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480

agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540

agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600

tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660

gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720

atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780

ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840

gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900

gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960

gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020

tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080

cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca gagccgaggg cagaggcagc 1140

ctgctgacct gcggcgacgt ggaggagaac ccaggcccca tggacacaga aagtaatagg 1200

agagcaaatc ttgctctccc acaggagcct tccagtgtgc ctgcatttga agtcttggaa 1260

atatctcccc aggaagtatc ttcaggcaga ctattgaagt cggcctcatc cccaccactg 1320

catacatggc tgacagtttt gaaaaaagag caggagttcc tgggggtaac acaaattctg 1380

actgctatga tatgcctttg ttttggaaca gttgtctgct ctgtacttga tatttcacac 1440

attgagggag acattttttc atcatttaaa gcaggttatc cattctgggg agccatattt 1500

ttttctattt ctggaatgtt gtcaattata tctgaaagga gaaatgcaac atatctggtg 1560

agaggaagcc tgggagcaaa cactgccagc agcatagctg ggggaacggg aattaccatc 1620

ctgatcatca acctgaagaa gagcttggcc tatatccaca tccacagttg ccagaaattt 1680

tttgagacca agtgctttat ggcttccttt tccactgaaa ttgtagtgat gatgctgttt 1740

ctcaccattc tgggacttgg tagtgctgtg tcactcacaa tctgtggagc tggggaagaa 1800

ctcaaaggaa acaaggttcc agagaaacgg ggccggaaga agctcctcta catttttaag 1860

cagcctttca tgcggccagt gcagacaacc caagaggagg atgggtgttc ctgcagattc 1920

cctgaggaag aggaaggcgg gtgcgagctg ggttctggcg tgaaacagac tttgaatttt 1980

gaccttctca agttggcggg agacgtggag tccaacccag ggcccatgat tccagcagtg 2040

gtcttgctct tactcctttt ggttgaacaa gcagcggccc tgggagagcc tcagctctgc 2100

tatatcctgg atgccatcct gtttctgtat ggaattgtcc tcaccctcct ctactgtcga 2160

ctgaagatcc aagtgcgaaa ggcagctata accagctatg agaaatcaag agtgaagttc 2220

tccaggagcg cagatgcccc cgcctatcaa cagggccaga accagctcta caacgagctt 2280

aacctcggga ggcgcgaaga atacgacgtg ttggataaga gaagggggcg ggaccccgag 2340

atgggaggaa agccccggag gaagaaccct caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2400

gataagatgg ccgaggccta ctcagagatc gggatgaagg gggagcggcg ccgcgggaag 2460

gggcacgatg ggctctacca ggggctgagc acagccacaa aggacacata cgacgccttg 2520

cacatgcagg cccttccacc ccggtga 2547

<---

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ подготовки Т-клетки (Т-клеток) для иммунотерапии при лечении рака, включающий генетическую модификацию указанной(ных) Т-клетки (Т-клеток) путем инактивации гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки, и гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR); и интродукцию в Т-клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор, направленный против антигена, ассоциированного с опухолью. Также рассмотрены: выделенная Т-клетка или линия клеток, получаемые указанным способом; фармацевтическая композиция для лечения рака и способ лечения пациента. Данная группа изобретений может найти применение в адаптивной терапии рака. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 31 ил., 15 табл., 5 пр.

1. Способ подготовки Т-клетки (Т-клеток) для иммунотерапии при лечении рака, включающий:

(а) получение и активацию цитотоксичных Т-клеток,

(б) генетическую модификацию указанной(ных) Т-клетки (Т-клеток) путем инактивации по меньшей мере:

- первого гена, кодирующего белок иммунной контрольной точки, и

- второго гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR); выбранный из α и β цепи TCR;

(в) интродукцию в Т-клетки, полученные на стадии (б), нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор, направленный против антигена, ассоциированного с опухолью, экспрессируемого указанным раком, и экспрессирующей указанный химерный антигенный рецептор; и

(г) размножение указанной Т-клетки (Т-клеток), полученной(ых) на этапе (б).

2. Способ по п. 1, включающий модификацию Т-клеток путем:

(а) интродукции в указанную Т-клетку по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать за счет расщепления ДНК соответственно:

- указанный ген, кодирующий белок иммунной контрольной точки, и

- по меньшей мере один ген, кодирующий один компонент рецептора Т- клеток (TCR), выбранный из α и β цепи TCR; и

(б) размножения указанных Т-клеток.

3. Способ по п. 1, в котором указанный ген иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10 и 2В4.

4. Способ по п. 1, в котором указанные модифицированные Т-клетки размножают в крови пациентов.

5. Способ по п. 1, в котором указанные модифицированные Т-клетки размножают in vivo.

6. Способ по п. 1, в котором указанным геном иммунной контрольной точки является PD1 или CTLA-4.

7. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере первый и второй инактивированные гены выбраны из группы, состоящей из PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta.

8. Способ no п. 2, в котором указанная по меньшей мере одна редкощепящая эндонуклеаза кодируется мРНК.

9. Способ по п. 2, который включает интродукцию одной или нескольких редкощепящих эндонуклеаз в указанную Т-клетку на стадии (а) путем электропорации РНК.

10. Способ по п. 2, в котором указанной по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазой является TALE-нуклеаза.

11. Способ по п. 10, в котором по меньшей мере одна TALE-нуклеаза направлена против одной из генных целевых последовательностей TCRalpha, выбранной из SEQ ID NO: 37 или из с SEQ ID NO: 57 по SEQ ID NO: 60.

12. Способ по п. 10, в котором по меньшей мере одна TALE-нуклеаза направлена против одной из генных целевых последовательностей TCRbeta, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39.

13. Способ по п. 10, в котором по меньшей мере одна TALE-нуклеаза направлена против одной из генных целевых последовательностей PD1, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

14. Способ по п. 10, в котором по меньшей мере одна TALE-нуклеаза направлена против одной из генных целевых последовательностей CTLA-4, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 76.

15. Способ по п. 1, дополнительно включающий интродукцию в указанную(ые) Т-клетку (Т-клетки) химерного антигенного рецептора (CAR).

16. Выделенная Т-клетка или линия клеток, получаемая способом по любому из пп. 1-15, экспрессирующая химерный антигенный рецептор, направленный против ассоциированного с опухолью антигена, для получения иммунотерапевтического агента для лечения рака, экспрессирующего указанный ассоциированный с опухолью антиген.

17. Выделенная Т-клетка по п. 16, в которой были инактивированы по меньшей мере два гена, выбранные из группы, состоящей из PD1 и TCR alpha, PD1 и TCR beta, CTLA-4 и TCR alpha, CTLA-4 и TCR beta, LAG3 и TCR alpha, LAG3 и TCR beta, Tim3 и TCR alpha, Tim3 и TCR beta, BTLA и TCR alpha, BTLA и TCR beta, BY55 и TCR alpha, BY55 и TCR beta, TIGIT и TCR alpha, TIGIT и TCR beta, B7H5 и TCR alpha, B7H5 и TCR beta, LAIR1 и TCR alpha, LAIR1 и TCR beta, SIGLEC10 и TCR alpha, SIGLEC10 и TCR beta, 2B4 и TCR alpha, 2B4 и TCR beta.

18. Выделенная Т-клетка по п. 16 или 17, в которой указанным химерным антигенным рецептором является многоцепочечный химерный антигенный рецептор.

19. Выделенная Т-клетка по любому из пп. 16-18, в которой указанный химерный антигенный рецептор содержит по меньшей мере один сигнал-трансдуцирующий домен, где указанный сигнал-трансдуцирующий домен является CD137 (4-1ВВ).

20. Выделенная Т-клетка по любому из пп. 16-19 для применения в качестве лекарственного средства.

21. Выделенная Т-клетка по любому из пп. 16-19 для лечения лимфомы.

22. Фармацевтическая композиция для лечения рака с помощью иммунотерапии, включающая эффективное количество выделенных Т-клеток по любому из пп. 16-19.

23. Способ лечения пациента, включающий:

(а) получение популяции модифицированных Т-клеток согласно любому из пп. 16-19, и

(б) введение указанных модифицированных Т-клеток указанному пациенту.

24. Способ по п. 23, в котором у указанного пациента диагностирован рак.