Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 749 459

(13)

(51)

МПК

C12N15/63(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2020136988, 2020-11-10

(24)

Дата начала отсчета патента

2020-11-10

(22)

дата подачи заявки

2020-11-10

(45)

опубликовано

2021-06-11

(72)

авторы

Исаева Анастасия АлександровнаНесмеянова Валентина СергеевнаЗыбкина Анастасия ВладимировнаЩербаков Дмитрий НиколаевичШаньшин Даниил ВасильевичВолкова Наталья Вячеславовна

(73)

патентообладатели

Федеральное Бюджетное Учреждение Науки Научный Центр Вирусологии И Биотехнологии Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека Гнц Вб Роспотребнадзора)

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

WO 2019025984 A1, 07.02.2019WO 2020132382 A1, 25.06.2020.

Универсальный интеграционный вектор pVEAL и рекомбинантная плазмида pVEAL-15742, обеспечивающая синтез и секрецию scFv-Fc антител ADI-15742 против вируса Эбола в клетках млекопитающих и полученная с использованием вектора pVEAL Российский патент 2021 года по МПК C12N15/63

Описание патента на изобретение RU2749459C1

Изобретение относится к универсальному интеграционному вектору pVEAL и рекомбинантной плазмиде pVEAL-15742, обеспечивающей синтез и секрецию scFv-Fc антител ADI-15742, способных нейтрализовать вирус Эбола в клетках млекопитающих с применением универсального вектора pVEAL и может быть использовано в молекулярной генетике и биотехнологии.

Уровень техники. Препараты на основе моноклональных антител являются наиболее перспективным инструментом экстренного противодействия вирусам вследствие их высокой специфичности и минимальным побочным эффектам. В настоящий момент по меньшей мере 570 антител по всему миру прошли клинические испытания (Lu R.М. et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of biomedical science. 2020; 27(1): 1-30; Wong G. et al. Post-exposure therapy of filovirus infections. Trends Microbiol. 2014; 22(8):456-63; Saphire E.O. An update on the use of antibodies against the filoviruses. Immunotherapy. 2013; 5(11): 1221- 33). Значительные технологические достижения сделали открытие и разработку методов лечения с помощью моноклональных антител более быстрыми и эффективными.

В настоящее время широко распространено получение антител формата scFv-Fc. Это одноцепочечные (single chain) антитела, состоящие из вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей антитела и константной цепи. У scFv-Fc формата существует несколько преимуществ перед большими фрагментами или целыми антителами: меньшее количество сайтов расщепления для циркулирующих протеолитических ферментов и, следовательно, более высокая стабильность; scFv-Fc вариант подразумевает синтез одной цепи, что облегчает создание векторов и конструкций, упрощает схему получения и проверки, одноцепочечные антитела достигают цели быстрее, быстрее выводятся из организма (Huston J.S. et al. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins. Methods in enzymology. 1991, 203: 46-88; WO 1993/16185; US 5571894). Возможные аллергические реакции на неканоническую структуру несущественны в случае антител против инфекционных заболеваний. Такие антитела, в первую очередь должны обладать эффективностью et al. High level transient production of recombinant antibodies and antibody fusion proteins in HEK293 cells. BMC biotechnology. 2013, 13(1): 52; Girgis M.D. et al. Targeting CEA in pancreas cancer xenografts with a mutated scFv-Fc antibody fragment. EJNMMI research. 2011, 1(1): 1-10).

Одним из способов получения моноклональных scFv-Fc антител является встройка нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей антител, в интеграционные вектора. Эти вектора обеспечивают репликацию и экспрессию рекомбинантных генных конструкций в подходящем хозяине путем интеграции в хромосому данного хозяина. Интеграционный вектор включает в себя: рекомбинантные иммуноглобулиновые домены, точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность, доминантные маркерные последовательности, сигнальные последовательности, последовательности, контролирующие экспрессию и транскрипцию рекомбинантных генов, систему, отвечающую за интеграцию в геном (RU 2469093 С2, RU 2639519). Трансфекция линий клеток млекопитающих данными векторами и дальнейшее их культивирование позволяет клеткам синтезировать антитела непосредственно в культуральную жидкость (RU 2292353 С2).

В качестве интеграционного вектора могут выступать системы доставки на основе вирусов и невирусные ДНК-векторы. Системы доставки на основе вирусов имеют следующие недостатки: 1) препараты вирусов имеют риск заражения инфекционными агентами, включая репликационно-компетентный вирус; 2) вирусный вектор может вызывать нежелательные клеточные последствия, например острые иммунные, воспалительные или нейротоксические ответы; 3) эффективное генетическое размножение вирусных векторов может ограничивать размер терапевтического груза и может потребовать генетических мотивов для регуляции репликации вектора. Напротив, препараты невирусных ДНК-векторов на основе плазмид относительно недороги для очистки, в значительной степени неиммуногенны и не имеют жестких ограничений на последовательности, которые могут быть доставлены. Основные проблемы невирусных систем на основе плазмид заключаются в следующем: 1) низкие скорости доставки векторов к ядрам клеток-мишеней; 2) низкие скорости интеграции трансгенов, как правило, с сопутствующими плазмидными последовательностями, которые имеют склонность к подавлению экспрессии; 3) интеграция множественных копий трансгена, что также может подавлять их экспрессию (Hackett Р.В., et al. А transposon and transposase system for human application. Molecular therapy. 2010, 18(4): 674-683).

Указанные выше основные проблемы, связанные с невирусными векторами, можно преодолеть, используя систему на основе транспозазы SB (Sleeping Beauty). Эта система проста и не требует создания вирусных конструкций. Для обеспечения интеграции последовательности в геном необходимо наличие двух векторов, один должен содержать последовательность целевой встройки, фланкированной последовательностями IR/DR (L/R), второй вектор долен обеспечивать синтез транспозазы SB. По увеличению активности фермента выделяют транспозазы SB10, SB11, SB100 и т.д. (Hackett Р.В., et al. A transposon and transposase system for human application. Molecular therapy. 2010, 18(4): 674-683; Tipanee J. et al. Transposons: moving forward from preclinical studies to clinical trials. Human Gene Therapy. 2017, 28(11): 1087-1104). Достоинства систем на основе транспозазы: биобезопасность, легкость в работе, длина встраиваемого фрагмента не ограничена, стабильная экспрессия встраиваемого гена.

Ближайшие аналоги. В работе (Оксанич А.С. и др. Конструирование плазмидного вектора для получения химерных антител заданной специфичности в клетках млекопитающих. Журн. микробиол. 2017, 6:56-63) представлен универсальный плазмидный вектор, позволяющий получать полноразмерные химерные антитела различной специфичности различных классов и изотипов. Данный вектор создан на основе известного эукариотического плазмидного вектора pCI-neo и включает в себя сильный промотор CMV, гены устойчивости к антибиотикам, легкую и тяжелую цепи заданного антитела. Вектор прост в конструировании, для получения готовых препаратов антител используются доступные и недорогие методики. Однако конечный выход антитела невелик (4 мг/л).

В международной заявке WO 2007/081336 описан вектор для получения рекомбинантных белков с высоким уровнем секреции. Достоинством данного изобретения является тройная лидерная последовательность, CMV промотор в комбинации с регуляторным элементом elongation factor-1, что должно обеспечивать значительный уровень синтеза белка. Также вектор содержит PolyA, SV40 ori, SV40 PA, pUC Origin Site, гены устойчивости к антибиотикам ампициллин, неомицин. В описании изобретения отсутствуют данные о том, какой выход белка можно получить.

Недостатками приведенных выше изобретений является отсутствие цис-регуляторных элементов. При трансфекции клеток такими векторами последние хаотично встраиваются в хромосому, конформация участка встройки значительно влияет на транскрипцию гена и его экспрессию. Цис-регуляторные элементы позволяют увеличить экспрессию гена без воздействия на структуру хроматина в регионе встройки. К цис-регуляторным элементам относятся: locus control region (LCR), scaffold/matrix attachment region (S/MAR), insulator, ubiquitous chromatin open element (UCOE), anti-repressor (STAR element).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является универсальный вектор, описанный в патенте Китая (CN 105255895, МПК C12N 15/85, опубл. 20.01.2016 г.). Авторы утверждают, что предложенная система экспрессии обеспечивает высокий выход белка, экспрессия является стабильной и длительной. Вектор создан на основе транспозазы SB, что позволяет легко интегрировать нужную последовательность в геном клетки. В качестве цис-регуляторного элемента выступает matrix attachment region - MAR2. Тяжелая и легкая цепи антитела соединены с помощью IRES. «Сайт внутренней посадки рибосомы» или «IRES» описывает последовательность, которая функционально обеспечивает инициацию трансляции и позволяет двум цистронам (открытым рамкам считывания) быть транслированными с одного транскрипта в животной клетке. Применение IRES элементов в векторных конструкциях описано ранее (Ramesh, N., et al. Nucl. Acids Res. 1996, 24: 2697-2700; Mosser, D.D. et al. BioTechniques. 1997, 22: 150-152). Для инициации транскрипции использовался цитогмегаловирусный промотр CMV.

Однако, известный универсальный вектор-прототип обеспечивает синтез только полноразмерных антител, которые, как упоминалось ранее, по многим параметрам уступают антителам формата scFv-Fc.

Прототипом рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей синтез антитела против вируса Эбола, является конструкция, описанная в патенте США (US 10640550, МПК А61Р 31/14, опубл. 05.05.2020 г.). Вектор, сконструированный в данной работе, содержит промотор с энхансером, IRES, PolyA, гены устойчивости к антибиотикам ампициллин, неомицин. Возможна интеграция генетического материала в геном с помощью системы на основе траспозазы. Наработка антитела может осуществляться с помощью гибридомной технологии, либо путем трансфекции эукариотических клеток с последующим выходом синтезированных антител в культуральную жидкость.

Недостатками данной конструкции является отсутствие цис-регуляторных элементов, необходимость встройки полноразмерных легкой и тяжелой цепей антитела. В описании вектора не указано какой промотор использовался для инициации транскрипции, отсутствуют данные о выходе целевого белка, что не позволяет судить об эффективности данной конструкции.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание универсального интеграционного вектора pVEAL и плазмидной генетической конструкции pVEAL-15742, обеспечивающей синтез и секрецию целевого белка - scFv-Fc антитела ADI 15742 против вируса Эбола (Anna Z. Wec, et al. Antibodies from a Human Survivor Define Sites of Vulnerability for Broad Protection against Ebolaviruses. Cell. 2017, 169(5): 878-890) в клетках млекопитающих CHO-K1, полученного с использованием указанного универсального вектора pVEAL, который лишен недостатков прототипа.

Указанный технический результат достигается тем, что универсальный интеграционный вектор pVEAL служит для создания целевых плазмидных конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию scFv-Fc моноклональных антител, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, следующие элементы:

- участок начала репликации ori (8616-9204);

- последовательности IR/DR (L/R), являющиеся частью системы на основе транспозазы SB100 (139-403, 7832-8127);

- последовательности UCOE, предотвращающих хромосомное «замалчивание» рекомбинантной экспрессионной кассеты (416 - 1549, 6272-7820);

- CMV Enhancer (2108-2487), CMV промотор (2488-2699) - сильный наиболее часто используемый промотор в генно-терапевтических конструкциях;

- Chimeric intron (2860-2992), увеличивающий эффективность CMV промотора;

- лидерный пептид VI9, обеспечивающий экспорт белка из клетки (3114-3164);

- место для встройки вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепей антитела, соединенных пептидным линкером, по сайтам гидролиза AfeI (3157), BamHI (3339);

- константную цепь антитела человека IgGl (СН1-СН2-СН3) (3348-4031) с мутациями M252Y, S254T, Т256Е, Е333А, H433K/N434F. Мутации увеличивают период полураспада антитела за счет взаимодействия с неонатальными рецепторами;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES (4046-4620);

- последовательность Bleo, кодирующую фактор устойчивости к антибиотику блеомицину (4625-4995);

- последовательность SV40 poly(A) signal, необходимую для стабилизации мРНК-транскриптов (5042-5163);

- SV40 промотор (5921-6262), обеспечивающий автономную репликацию в клетках млекопитающих, комбинация с CMV промотором существенно увеличивает выход белка;

- ген устойчивости к антибиотику ампициллин AmpR и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli (9375-10235).

Указанный технический результат достигается также тем, что плазмидная генетическая конструкция pVEAL-15742, обеспечивающая синтез и секрецию целевого белка - scFv-Fc антитела ADI 15742 против вируса Эбола, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2, следующие элементы:

- участок начала репликации ori (8616-9204);

- последовательности IR/DR (L/R), являющиеся частью системы на основе транспозазы SB 100 (139-403, 8393-8688);

- последовательности UCOE, предотвращающих хромосомное «замалчивание» рекомбинантной экспрессионной кассеты (416 - 1549, 6833-8381);

- Chimeric intron (2860-2992), увеличивающий эффективность CMV промотора;

- лидерный пептид VI9, обеспечивающий экспорт белка из клетки (3114-3164);

- ADI-15742-VH, последовательность, кодирующая вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела 15742 (3165-3533);

- ADI-15742-VK, последовательность, кодирующая вариабельный фрагмент легкой цепи антитела 15742 (3579-3903);

- константную цепь антитела человека IgG1 (СН1-СН2-СН3) (3909-4592) с мутациями M252Y, S254T, Т256Е, ЕЗЗЗА, H433K/N434F. Мутации увеличивают период полураспада антитела за счет взаимодействия с неонатальными рецепторами;

- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES (4607-5181);

- последовательность Bleo, кодирующую фактор устойчивости к антибиотику блеомицину (5186-5556);

- последовательность SV40 poly(A) signal, необходимую для стабилизации мРНК-транскриптов (5603-5724);

- SV40 промотор (6482-6823), обеспечивающий автономную репликацию в клетках млекопитающих, комбинация с CMV промотором существенно увеличивает выход белка;

Заявляемые плазмиды являются значительно усовершенствованными по сравнению с прототипами т.к. в качестве системы интеграции используется транспозаза SB 100, имеющая высокую активность фермента (Mates L et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 2009, 41(6):753-61), имеются сильные цис-регуляторные элементы UCOE, предотвращающие хромосомное замалчивание (Neville JJ et al. Ubiquitous Chromatin-opening Elements (UCOEs): Applications in biomanufacturing and gene therapy. Biotechnol Adv. 2017, 35(5):557-564), комбинация CMV промотора с энхансером, интроном А и промотром SV40 существенно увеличивает выход белка (RU 2639519), сильный лидерный пептид V19, увеличивающий секрецию рекомбинантного белка (WO 2008/148519 А2), связанная посредством EMCV IRES соэкспрессия селекционного маркера Bleo и последовательностей антител может улучшить селекционный процесс (RU 2639519), scFv-Fc формат антител облегчает создание конструкции, упрощает схему получения и проверки необходимого антитела.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 представлена физическая и генетическая карта универсального интеграционного вектора pVEAL. На фиг. 2 представлена физическая и генетическая карта интеграционного вектора pVEAL со вставкой scFv-Fc антитела ADI-15742 против вируса Эбола - pVEAL-15742. На фиг. 3 представлено определение минимальной концентрации блеомицина, необходимой для гибели нетрансфецированной линии клеток-хозяев. На фиг. 4 представлен анализ нейтрализующей активности моноклонального scFv-Fc антитела ADI 15742 против вируса Эбола. На фиг. 5 представлен анализ культуральной среды штамма-продуцента scFv-Fc антитела 15742. На фиг. 6 представлен анализ препарата scFv-Fc антитела 15742 после хроматографии на белке А.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры (1-5) его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K. et al. Science. 1988, 239(4839):487-491; Sanger F. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-5467).

Пример 1. Конструирование универсального интеграционного вектора pVEAL

Для проектирования вектора pVEAL-использовали акцепторный вектор рТ2НВ (Addgene plasmid # 26557). Интеграционный вектор был получен в несколько этапов. На первом этапе из вектора рТ2НВ при помощи сайт-направленного мутагенеза был удален сайт гидролиза BamHI. Для этого проводили ПЦР с использованием праймеров:

- и

ПЦР фрагмента PCR-pT2HB проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (плазмиды рТ2НВ), 10 пМ каждого праймера (pT2HB-F, pT2HB-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С 30 с - 58°С, 45 с - 72°С (25 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент PCR-pT2HB, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 709 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПНР-продукт PCR-pT2HB и исходную плазмиду рТ2НВ обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Psp124BI и KpnI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 688 и 2859 п. н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable с генотипом F' proA+В+lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) Δ(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ΔlacX74 galK16 galE15 el4- Ф80dlacZΔM15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), предоставленные производителем "Invitrogen" (США). Для этого к 100 мкл клеток добавляли 10 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду в течение 40 минут. После этого клетки подвергали «температурному шоку» при 42°С в течение 40 сек. Охлаждали клетки на льду в течение 4 минут, затем добавляли по 200 мкл среды "SOC" (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ KCl, 10 мМ MgCl2) и инкубировали при 30°С в течение 60 минут. По окончании инкубации трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида рТ2НВ2.

Следующим шагом была встройка последовательностей UCOE-R и UCOE-L. Для получения последовательностей UCOE-R и UCOE-L использовали геномную ДНК человека. Для амплификации последовательности UCOE-R была проведена ПЦР с помощью праймеров:

- и

ПЦР фрагмента UCOE-R проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (геномная ДНК человека), 10 пМ каждого праймера (UCOE-R-F, UCOE-R-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с - 59°С, 95 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент UCOE-R, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 1572 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПЦР-продукт UCOE-R обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BseX3I и BamHI, плазмиду рТ2НВ2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BseX3I и BglII согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 1555 и 3529 п. н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pT2HB2-UCOE-R.

Амплификация последовательности UCOE-L была проведена при помощи ПЦР с использованием праймеров:

- и

ПЦР фрагмента UCOE-L проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (геномная ДНК человека), 10 пМ каждого праймера (UCOE-L-F, UCOE-L-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с - 59°С, 97 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент UCOE-L, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 1593 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПЦР-продукт UCOE-L и плазмиду pT2HB2-UCOE-R обрабатывали эндонуклеазами рестрикции HindIII и BseX3I согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 1581 и 5051 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pT2HB2-UCOE-RL.

Дальнейшее конструирование вектора заключалось во встройке последовательности V19-ADI (синтезирована по заказу ООО «ДНК-синтез»), кодирующей лидерный пептид V19 и уникальные сайты гидролиза AfeI и BamHI, по которым будет проводиться вставка цепей необходимого антитела и scFV-Fc фрагмента.

Лигирование последовательности V19-ADI с коммерческим вектором pJet (CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo Scientific) проводили согласно инструкции производителя. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Получена конструкция pJet-V19-ADI.

Далее вставку последовательности V19-ADI проводили в вектор pCI-neo-hEST2 (#1781). Этот вектор был выбран, потому что содержит в своем составе сильный эукариотический промотор CMV, а также набор генов устойчивости к антибиотикам, делающим его удобным для работы.

Вектор pCI-neo-hEST2 и pJet-V19-ADI обрабатывали эндонуклеазами рестрикции PspCI и SalI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% и 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 5467 и 182 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pCI-neo-hEST2-V19-ADI.

Далее было проведено клонирование последовательности, кодирующей константную часть тяжелой цепи антитела человека (СН) Human IgG1 в вектор pCI-neo-hEST2-V19-ADI. Для амплификации последовательности, кодирующей константную часть тяжелой цепи антитела человека, использовали праймеры:

- и

В качестве ДНК матрицы использовали плазмиду pMAB-CH-100VH.

ПЦР фрагмента PCR-Human IgG1 проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (рМАВ-СН-100VH), 10 пМ каждого праймера (Hinge_Bspl3I_F, CH3_SalI_R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с - 60°С, 43 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент PCR-Human IgG1, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 708 п. н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПЦР-продукт PCR-Human IgG1 и плазмиду pCI-neo-hEST2-V19-ADI обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Bsp13I и SalI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 690 и 5635 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pCI-neo-hEST2-V19-ADI-CH-21.

Далее проводилась встройка гена устойчивости к антибиотику блеомицину и последовательности EMCV IRES. Праймеры, используемые для амплификации:

ПЦР фрагмента PCR-Bleo-scFv проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (FUGW, Addgene plasmid # 14883), 10 пМ каждого праймера (Bleo-scFv-F, Bleo-scFv-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с - 58°С, 25 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент PCR-Bleo-scFv, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 400 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПЦР-продукт PCR-Bleo-scFv и плазмиду pJet-EMCV-IRES-V17-100VH-CH-2018 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Msp20I и AsuNHI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 380 и 4578 п. н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pJet-IRES-Bleo.

ПЦР фрагмента EMCV-IRES-BleoR проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Праймеры, используемые для амплификации:

- и

Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК (pJet-IRES-Bleo), 10 пМ каждого праймера (IRES-scFv-R и IRES-Bleo-scFv-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с -58°С, 60 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую фрагмент EMCV-IRES-BleoR, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 984 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Затем выделенный ПЦР-продукт EMCV-IRES-BleoR и плазмиду pCI-neo-hEST2-V19-ADI-CH-21 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XhoI и NotI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 965 и 6300 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). В результате была получена плазмида pCI-neo- hEST2-V19-ADI-CH-IRES-BLEO-21.

Последним шагом в получении целевого вектора pVEAL являлось объединение конструкций pT2HB2-UCOE-RL и pCI-neo- hEST2-V19-ADI-CH-IRES-BLEO-21. Плазмиду pT2HB2-UCOE-RL обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и Mox20I, плазмиду pCI-neo-scFv-ADI-CH-IRES-BLEO-21 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BglII и HpaI.

Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 6617 и 4297 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск).

Встройка последовательностей вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепей любого антитела в универсальный вектор pVEAl проводится по уникальным сайтам гидролиза AfeI и BamHI.

Пример 2. Получение генетической конструкции pVEAL-15742, кодирующей scFv-Fc антитело ADI-15742, для трансфекции линии клеток СНО-K1.

Для подтверждения эффективности универсального интеграционного вектора pVEAL проводили встройку вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей антитела ADI-15742 и связывающего их sc-Fv фрагмента.

Для начала были амплифицированы тяжелая и легкая цепи антитела ADI-15742. ПЦР фрагмента PCR-ADI-15742VH проводилась с синтезированной последовательности ADI-15742VH (ООО «ДНК-синтез») с помощью праймеров:

- и

ПЦР фрагмента PCR-ADI-15742VK с синтезированной последовательности ADI-15742VK (ООО «ДНК-синтез») с помощью праймеров:

- и

ПЦР фрагментов PCR-ADI-15742VH, PCR-ADI-15742VK проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционные смеси объемом 50 мкл содержали 2 мкг ДНК (ADI-15742VH/ ADI-15742VK), 10 пМ каждого праймера (V19-ADI-F, V19-ADI-L-R/ V19-ADI-L-F, V19-ADI-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с -58°С, 30 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционные смеси, содержащие фрагменты PCR-ADI-15742VH, PCR-ADI-15742VK, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле е с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие продуктам амплификации - 487 и 384 п. н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее был проведен отжиг и последующая амплификация последовательностей PCR-ADI-15742VH, PCR-ADI-15742VK с использованием праймеров V19-ADI-F и V19-ADI-R при помощи ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 2 мкг ДНК каждого фрагмента (PCR-ADI-15742VH, PCR-ADI-15742VK), 10 пМ каждого праймера (V19-ADI-F и V19-ADI-R), 5 мкл 10xTaq буфера (фирмы Sibenzyme (Россия)), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. ДНК-полимеразы Taq-SE фирмы Sibenzyme (Россия); реакцию осуществляли при следующих параметрах: 3 мин - 95°С; 30 с - 95°С, 30 с -58°С, 51 с - 72°С (30 циклов); 120 с - 72°С.

Реакционную смесь, содержащую амплифицированный фрагмент scFv-ADI-15742, разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, соответствующую продукту амплификации - 851 п.н., визуализированную при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Универсальный интеграционный вектор pVEAL и фрагмент scFv-ADI-15742 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AfeI и BamHI согласно протоколу фирмы-производителя (Sibenzyme (Россия)). Рестрицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосы, соответствующие необходимым фрагментам - 10732 и 743 п.н., визуализированные при помощи ультрафиолета (УФ), вырезали из агарозного геля, помещали в пробирки объемом 1,5 мл. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора «Gel Extraction Kit» фирмы Qiagen (Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Далее проводили лигирование фрагментов ДНК-лигазой фага Т4 (Sibenzyme (Россия)) в стандартном буферном растворе по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали «компетентные» клетки E.coli штамма NEB Stable как было описано выше. Трансформированные клетки высевали на чашку Петри с твердой питательной средой LB (среда LB с 1,5% агара), содержащей антибиотик (ампициллин, 50-100 мкг/мл). Чашку Петри помещали в термостат на 18 часов при 30°С. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 30°С и проводили выделение плазмидной ДНК при помощи наборов "Plasmid Mini Kit", "Qiagen" (Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Первичную структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г.Новосибирск). В результате была получена плазмида pVEAL-15742.

Пример 3. Получение клонов-продуцентов scFv-Fc антитела 15742

Для получения клеток продуцентов были выбраны клетки СНО-K1 (клон К1 линии СНО, выделенной из яичника китайского хомячка). Использование этих клеток опирается на опыт их коммерческого использования для создания продуцентов терапевтических белков, в том числе антител. Линия поддерживалась в среде на основе DMEM/F12 с добавлением 10% термоинактивированной (30 мин при температуре 56°С) фетальной сыворотки крови коров (FBS), L-глутамина. По достижении монослоя клетки пересаживались.

Для получения стабильной клеточной линии, синтезирующей рекомбинантный белок, определяли минимальную концентрацию селективного антибиотика блеомицина, необходимую для гибели нетрансфецированной линии клеток-хозяев. Для определения IC50 и IC100 блеомицина клетки рассаживали в 12-луночный культуральный планшет со средой DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной сыворотки крови коров (FBS) и L-глутамином, по достижении 90% конфлюэнтности монослоя производили замену культуральной среды на 2% DMEM/F12 с добавлением антибиотика блеомицина (50-700 мкг/мл). В течение 14 суток каждые 48-72 часов производили замену культуральной среды в лунках на 2% DMEM/F12 с добавлением блеомицина (50-700 мкг/мл).

При добавлении блеомицина чувствительные к нему клетки проявляли следующие морфологические изменения:

• Увеличение размера (аналогично воздействию цитомегаловируса, инфицирующего клетки)

• Аномальная форма клеток, включая появление длинных придатков

• Наличие больших пустых везикул в цитоплазме (пробой эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи)

• Разрушение плазмы и ядерной мембраны (появление множества отверстий в этих мембранах). В конце концов, клетки полностью разрушатся, и останется только клеточный «мусор».

Указанные изменения проиллюстрированы на фиг. 3. На фиг. 3а представлена фотография клеток, не подвергшихся воздействию блеомицина, - положительный контроль К+. На фиг. 3б - 3и представлены фотографии клеток, подвергшихся воздействию блеомицина в количестве от 50 до 700 мкг/мл. На данных фигурах показано, что при увеличении концентрации антибиотика клетки существенно меняются морфологически. На фиг. 3д при концентрации блеомицина 300 мкг/мл видно, что примерно половина клеток сохраняют жизнеспособность и присущую им морфологию. На фиг. 3е, 3ж клетки практически полностью погибли, преобладают измененные и разрушенные клетки.

Таким образом, установлена полуингибирующая и ингибирующая дозы блеомицина для СНО-K1 (IC50=325 мкг/мл, IC100=475 мкг/мл).

Для встройки экспрессионой кассеты проводили котрансфекцию методом катионно-липидной трансфекции (Lipofectamine 3000, Invitrogen) клеток СНО-K1 двумя плазмидами. Первая содержала последовательность scFv-Fc антитела 15742, pVEAL-15742, вторая содержала последовательность транспозазы SB100, pCMV(CAT)T7-SB100. После трансфекции инкубировали клетки 96 часов в CO2-инкубаторе согласно рекомендациям производителя Lipofectamine 3000. Затем проводили замену среды на поддерживающую (с содержанием 2% фетальной бычьей сыворотки) с добавлением селективного антибиотика блеомицина (475 мкг/мл). Эту манипуляцию повторяли каждые 72-96 часов на протяжении 2-3 недель до тех пор, пока в отрицательном контроле клетки не погибли. Затем делали один пассаж на культуральных чашках и рассаживали в 96-луночные планшеты по одной клетке на лунку.

Получено 4 клона 15742 с нейтрализующим титром, определенным для IC90, (анализировали культуральную среду) от 1:8 до 1:32768. Реакцию вируснейтрализации проводили на псевдовирусной системе.

Пример 4. Анализ нейтрализующей активности scFv-Fc моноклонального антитела ADI15742 против вируса Эбола

Препараты антитела 15742 титровали с шагом 4, инкубировали 30 мин в CO2-инкубаторе со смесью псевдовирусных частиц вируса Эбола (50 мкл, физический титр 5×10⁸ частиц) и переносили в 96-луночный плоскодонный планшет к суспензии культуры клеток HEK293T (50 мкл, 100 тыс/мл). Инкубировали 48 ч в CO2-инкубаторе. По истечении времени из лунок планшета удаляли ростовую среду, промывали 100 мкл PBS, добавляли 40 мкл 1×лизирующего буфера (Promega, США), инкубировали 10 минут при комнатной температуре, суспендировали и переносили по 35 мкл в оптический планшет, добавляли 35 мкл LAR (Promega, США), и считывали результаты при помощи люминометра (LuMate). Результаты анализа на примере одного из клонов представлены на фиг. 4. График, приведенный на фиг. 4, отражает зависимость нейтрализующей активности scFv-Fc антитела ADI 15742 против вируса Эбола, определенной для IC90, от степени разведения препарата. При разведении 1:8 препарат антитела обладает стопроцентной нейтрализующей активностью. При разведении до 1:32768 нейтрализующая активность составляет 75%.

Пример 5. Наработка и очистка scFv-Fc моноклонального антитела ADI15742

Каждый индивидуальный клон-продуцент рекомбинантного scFv-Fc антитела 15742 нарабатывался в культуральной среде DMEM/F12 с 10% содержанием фетальной телячьей сыворотки. Культивирование клонов-продуцентов проводилось в объеме 200 мл в роллерных бутылях при 37°С в течение 10 суток. Затем среда заменялась на поддерживающую, содержащую 2% фетальной телячьей сыворотки. Культивирование продолжали до тех пор, пока клетки сохраняли жизнеспособность. Далее полученную культуральную жидкость сливали, осаждали клеточный дебрис при помощи центрифугирования при 6000 g, 4°С в течение 15 мин.

Очистку рекомбинантных антител проводили при помощи аффинной хроматографии с использованием сорбента, содержащего на своей поверхности белок A (MabSelect SuRe, GE Healthcare, США), и хроматографической системы AKTAprime plus (GE Healthcare, США). Очистка включает в себя следующие стадии: уравновешивание хроматографической колонки, нанесение образца, промывка колонки, элюция белка.

Уравновешивание хроматографической колонки включает в себя промывание пятикратным объемом базового буфера (50 mM Трис-НСl, 150 мМ NaCl, рН 7,0-7,2). Скорость потока определялась временем контакта буфера с сорбентом, время контакта составляло не менее 4 мин.

Далее наносили культуральную жидкость, содержащую антитела, на колонку, время контакта образца с сорбентом составляло не менее 5 мин.

Отмывку колонки от несвязавшихся белков, а также от белков, обладающих низкой силой взаимодействия с сорбентом, проводили при помощи последовательной промывки хромоатографической колонки базовым буфером и буфером для промывки (20 мМ Трис-HCl, рН 6,8-7,0). Объемы базового и промывочного буферов составляли 3,5 объема колонки. Скорость потока определялась временем контакта буфера с сорбентом, время контакта составляло не менее 3,5 мин.

Элюцию проводили пятикратным объемом элюирующего буфера (100 mM Глицин-HCl, рН 3,4-3,5). Скорость потока определялась временем контакта буфера с сорбентом, время контакта составляло не менее 6 мин. Полученные образцы нейтрализовали до рН 7,0 при помощи буфера для титрования (1М Трис). Полученные препараты анализировали при помощи разделения в полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартной методике (Фиг. 5). Препараты, нанесенные на ПААГ: дорожка 1 - исходная культуральная жидкость, содержащая наработанное антитело, до очистки на хроматографической колонке, 10 мкл; дорожка 2 - культуральная жидкость, прошедшая через хроматографическую колонку, и содержащая несвязавшиеся с сорбентом клеточные белки, 10 мкл; дорожка 3 - препарат после промывки колонки уравновешивающим буфером, содержит слабо связавшиеся с сорбентом клеточные белки, 10 мкл; дорожка 4 - препарат после промывки колонки буфером для промывки, содержит остатки несвязавшихся белков, 10 мкл; 5 - маркер длин белков 10-260 kDa; дорожка 6 - препарат антитела 15742 после очистки, 10 мкл. На представленной электрофореграмме видно, что полученное антитело очищено от посторонних белков, имеет массу порядка 50 kDa.

Препараты, содержащие рекомбинантное антитело, фильтровали от выпавших в осадок белков при помощи насадки на шприц с диаметром пор 0,22 мкм (ТРР, Швейцария). Элюаты концентрировались при помощи центрифугирования препаратов антитела в концентраторах (Sartorius AG, Германия) при 6000 g, 17°С. Концентрация антител определялась с помощью прибора для определения сверхмалых концентраций NanoPhotometer NP80 (Implen, Германия) согласно инструкции производителя. Контроль проводили при помощи разделения в ПААГ. Пример определения концентрации препарата очищенного scFv-Fc антитела 15742, полученного с одного из клонов-продуцентов, приведен на фиг. 6. Для определения приблизительной концентрации разводили препараты очищенного scFv-Fc антитела 15742 в 10, 20, 40, 80 раз и сравнивали с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в концентрации от 0,025 до 1 мкг. Препараты, нанесенные на ПААГ: дорожка 1 - препарат очищенного антитела 15742 после концентрирования в 1-кратном разведении (выделение из 1 л культуральной среды), 10 мкл; дорожка 2 - препарат очищенного антитела 15742 до концентрирования в 10-кратном разведении (выделение из 1 л культуральной среды), 10 мкл; дорожка 3 - препарат очищенного антитела 15742 до концентрирования в 20-кратном разведении (выделение из 1 л культуральной среды), 10 мкл; дорожка 4 - препарат очищенного антитела 15742 до концентрирования в 40-кратном разведении (выделение из 1 л культуральной среды), 10 мкл; дорожка 5 - препарат очищенного антитела 15742 до концентрирования в 80-кратном разведении (выделение из 1 л культуральной среды), 10 мкл; дорожка 6-маркер длин белков 10-260 kDa; 7 - БСА - 1 мкг; 8 - БСА - 0,1 мкг; 9 - БСА - 0,05 мкг; 10 - БСА - 0,025 мкг. При сопоставлении концентраций scFv-Fc антитела 15742 и БСА сделан вывод, что концентрация целевого белка, полученная с одного из клонов-продуцентов, составляет примерно 150 мг/л.

Анализ культуральной жидкости различных клонов-продуцентов показал, что наработка антител у них идет неравномерно. Содержание антител в препаратах после хроматографии и концентрирования варьируется в пределах от 35 мг до 150,6 мг с одного литра культуральной жидкости.

Список последовательностей:

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в

сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Универсальный интеграционный вектор pVEAL и рекомбинантная плазмида

pVEAL-15742, обеспечивающая синтез и секрецию scFv-Fc антитела ADI-15742

против вируса Эбола в клетках млекопитающих и полученная с использованием

вектора pVEAL

<160> SEQ ID NO 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 10914

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Нуклеотидная последовательность универсального интеграционного

вектора pVEAL

<400> 1

1 caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg

61 ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcggt tccctataca

121 gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta

181 ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt

241 gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat

301 tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt

361 aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagcttca ttggcgccct

421 ccgcgcctac agctcaagcc acatccgaag ggggagggag ccgggagctg cgcgcggggc

481 cgccgggggg aggggtggca ccgcccacgc cgggcggcca cgaagggcgg ggcagcgggc

541 gcgcgcgcgg cggggggagg ggccggcgcc gcgcccgctg ggaattgggg ccctaggggg

601 agggcggagg cgccgacgac cgcggcactt accgttcgcg gcgtggcgcc cggtggtccc

661 caaggggagg gaagggggag gcggggcgag gacagtgacc ggagtctcct cagcggtggc

721 ttttctgctt ggcagcctca gcggctggcg ccaaaaccgg actccgccca cttcctcgcc

781 cgccggtgcg agggtgtgga atcctccaga cgctggggga gggggagttg ggagcttaaa

841 aactagtacc cctttgggac cactttcagc agcgaactct cctgtacacc aggggtcagt

901 tccacagacg cgggccaggg gtgggtcatt gcggcgtgaa caataatttg actagaagtt

961 gattcgggtg tttccggaag gggccgagtc aatccgccga gttggggcac ggaaaacaaa

1021 aagggaaggc tactaagatt tttctggcgg gggttatcat tggcgtaact gcagggacca

1081 cctcccgggt tgagggggct ggatctccag gctgcggatt aagcccctcc cgtcggcgtt

1141 aatttcaaac tgcgcgacgt ttctcacctg ccttcgccaa ggcaggggcc gggaccctat

1201 tccaagaggt agtaactagc aggactctag ccttccgcaa ttcattgagc gcatttacgg

1261 aagtaacgtc gggtactgtc tctggccgca agggtgggag gagtacgcat ttggcgtaag

1321 gtggggcgta gagccttccc gccattggcg gcggataggg cgtttacgcg acggcctgac

1381 gtagcggaag acgccttagt gggggggaag gttctagaaa agcggcggca gcggctctag

1441 cggcagtagc agcagcgccg ggtcccgtgc ggaggtgctc ctcgcagagt tgtttctcca

1501 gcagcggcag ttctcactac agcgccagga cgagtccggt tcgtgttcgt ccgcggagat

1561 ctctctcatc tcgctcggct gcgggaaatc gggctgaagc gactgagtcc gcgatggagg

1621 taacgggttt gaaatcaatg agttattgaa aagggcatgg cgaggccgtt ggcgcctcag

1681 tggaagtcgg ccagccgcct ccgtgggaga gaggcaggaa atcggaccaa ttcagtagca

1741 gtggggctta aggtttatga acggggtctt gagcggaggc ctgagcgtac aaacagcttc

1801 cccaccctca gcctcccggc gccatttccc ttcactgggg gtgggggatg gggagctttc

1861 acatggcgga cgctgccccg ctggggtgaa agtggggcgc ggaggcggga cttcttattc

1921 cctttctaaa gcacgctgct tcgggggcca cggcgtctcc tcggggatct tcaatattgg

1981 ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta ttggccattg

2041 catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc aatatgaccg

2101 ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt

2161 catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga

2221 ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca

2281 atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca

2341 gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg

2401 cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc

2461 tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt

2521 ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt

2581 ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg cgatcgcccg

2641 ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc

2701 gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg

2761 ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta

2821 aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga

2881 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc

2941 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac

3001 tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact ataggctagc

3061 ctcgagaatt cgtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccgcc accatgatga

3121 ggcccatcgt gctggtgctg ctgttcgcca cctcagcgct ggccggcgag tgcgagtgcg

3181 agtgcgagtc gtacgtacgt acgtacgtac gtacgtatat atatatatat attatatata

3241 ttaatatatg gcgagtgcga gtgcgagtgc gagtcgtacg tacgtacgta cgtacgtacg

3301 tatatatata tatatattat atatattaat atatatatgg atccggagac aaaactcaca

3361 catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc

3421 caaaacccaa ggacaccctc tacatcaccc gggaacctga ggtcacatgc gtggtggtgg

3481 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc

3541 ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg

3601 tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca

3661 acaaagccct cccagccccc atcgcgaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag

3721 aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc

3781 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg

3841 ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct

3901 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat

3961 gctccgtgat gcatgaggct ctgaagttcc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc

4021 cgggtaaatg agtcgagcgg ttcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc

4081 cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg

4141 ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct

4201 aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca

4261 gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg

4321 aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct

4381 gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa

4441 tggctcacct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt

4501 atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa

4561 aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat

4621 atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc

4681 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt

4741 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac

4801 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag

4861 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag

4921 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc

4981 gaggagcagg actgagcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg

5041 ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt

5101 atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa

5161 gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt

5221 ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct

5281 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg

5341 gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag

5401 cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt

5461 tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt

5521 ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg

5581 tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt

5641 taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt

5701 tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca

5761 aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt

5821 ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc

5881 ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc

5941 tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta

6001 tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag

6061 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa

6121 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac

6181 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt

6241 agtgaggagg cttttttgga ggccacggcc ggccctccgc gcctacagct caagccacat

6301 ccgaaggggg agggagccgg gagctgcgcg cggggccgcc ggggggaggg gtggcaccgc

6361 ccacgccggg cggccacgaa gggcggggca gcgggcgcgc gcgcggcggg gggaggggcc

6421 ggcgccgcgc ccgctgggaa ttggggccct agggggaggg cggaggcgcc gacgaccgcg

6481 gcacttaccg ttcgcggcgt ggcgcccggt ggtccccaag gggagggaag ggggaggcgg

6541 ggcgaggaca gtgaccggag tctcctcagc ggtggctttt ctgcttggca gcctcagcgg

6601 ctggcgccaa aaccggactc cgcccacttc ctcgcccgcc ggtgcgaggg tgtggaatcc

6661 tccagacgct gggggagggg gagttgggag cttaaaaact agtacccctt tgggaccact

6721 ttcagcagcg aactctcctg tacaccaggg gtcagttcca cagacgcggg ccaggggtgg

6781 gtcattgcgg cgtgaacaat aatttgacta gaagttgatt cgggtgtttc cggaaggggc

6841 cgagtcaatc cgccgagttg gggcacggaa aacaaaaagg gaaggctact aagatttttc

6901 tggcgggggt tatcattggc gtaactgcag ggaccacctc ccgggttgag ggggctggat

6961 ctccaggctg cggattaagc ccctcccgtc ggcgttaatt tcaaactgcg cgacgtttct

7021 cacctgcctt cgccaaggca ggggccggga ccctattcca agaggtagta actagcagga

7081 ctctagcctt ccgcaattca ttgagcgcat ttacggaagt aacgtcgggt actgtctctg

7141 gccgcaaggg tgggaggagt acgcatttgg cgtaaggtgg ggcgtagagc cttcccgcca

7201 ttggcggcgg atagggcgtt tacgcgacgg cctgacgtag cggaagacgc cttagtgggg

7261 gggaaggttc tagaaaagcg gcggcagcgg ctctagcggc agtagcagca gcgccgggtc

7321 ccgtgcggag gtgctcctcg cagagttgtt tctccagcag cggcagttct cactacagcg

7381 ccaggacgag tccggttcgt gttcgtccgc ggagatctct ctcatctcgc tcggctgcgg

7441 gaaatcgggc tgaagcgact gagtccgcga tggaggtaac gggtttgaaa tcaatgagtt

7501 attgaaaagg gcatggcgag gccgttggcg cctcagtgga agtcggccag ccgcctccgt

7561 gggagagagg caggaaatcg gaccaattca gtagcagtgg ggcttaaggt ttatgaacgg

7621 ggtcttgagc ggaggcctga gcgtacaaac agcttcccca ccctcagcct cccggcgcca

7681 tttcccttca ctgggggtgg gggatgggga gctttcacat ggcggacgct gccccgctgg

7741 ggtgaaagtg gggcgcggag gcgggacttc ttattccctt tctaaagcac gctgcttcgg

7801 gggccacggc gtctcctcgg ggatctagct tgtggaaggc tactcgaaat gtttgaccca

7861 agttaaacaa tttaaaggca atgctaccaa atactaattg agtgtatgta aacttctgac

7921 ccactgggaa tgtgatgaaa gaaataaaag ctgaaatgaa tcattctctc tactattatt

7981 ctgatatttc acattcttaa aataaagtgg tgatcctaac tgacctaaga cagggaattt

8041 ttactaggat taaatgtcag gaattgtgaa aaagtgagtt taaatgtatt tggctaaggt

8101 gtatgtaaac ttccgacttc aactgtatag ggttcctcta gctagagacg acctcgggta

8161 cccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag

8221 ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc

8281 ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc

8341 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa

8401 cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg

8461 ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg

8521 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag

8581 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac

8641 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga

8701 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt

8761 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc

8821 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc

8881 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta

8941 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat

9001 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca

9061 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct

9121 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt

9181 acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct

9241 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc

9301 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa

9361 acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta

9421 tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc

9481 ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat

9541 ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta

9601 tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt

9661 aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt

9721 ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg

9781 tgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc

9841 gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc

9901 gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg

9961 cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga

10021 actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta

10081 ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct

10141 tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag

10201 ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga

10261 agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat

10321 aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgc gccctgtagc

10381 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc

10441 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt

10501 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac

10561 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag

10621 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa

10681 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg

10741 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac

10801 aaaatattaa cgcttacaat ttccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc

10861 gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctg

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 11475

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pVEAL-15742,

обеспечивающая синтез и секрецию scFv-Fc антитела ADI-15742 против

вируса Эбола.

<400> 2