Область техники
Изобретение относится к рекомбинантному интегративному плазмидному вектору pVEAL2-B7, обеспечивающему экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы в клетках млекопитающих и рекомбинантному штамму клеточной линии СНО-K1-В7, содержащему экспрессионную кассету вектора pVEAL2-B7 и продуцирующему белок В7 вируса натуральной оспы, используемый для получения иммунобиологических препаратов и может быть использована в генной инженерии и биотехнологии для создания рекомбинантных вакцин и диагностических тест-систем, а также в качестве мишени для поиска широконейтрализующих антител против ортопоксвирусов и других средств терапии и профилактики.
Уровень техники
Ортопоксвирусные инфекции представляют серьезную проблему как для человека, так и для животных (doi: 10.3390/v13010043). Наиболее известный вирус натуральной оспы (ВНО) является возбудителем одного из самых опасных заболеваний в истории человечества (doi: 10.1038/nrmicro1099). Кампания глобальной вакцинации позволила остановить его распространение, однако, по-прежнему существует угроза возникновения вспышек заболевания в следствие лабораторных утечек или преднамеренного использования вируса в военных целях (doi: 10.15690/vramn1363).
Кроме того, последние два десятка лет происходят заметные вспышки других патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров, буйволов и верблюдов, и вакциноподобных вирусов, а также появляются новые близкородственные виды (doi: 10.1016/S1473-3099(19)30294-4, doi: 10.3201/eid2508.190112, doi: 10.1016/SO140-673 6(17)31428-9, doi: 10.4103/ijdvl.IJDVL_222_17, doi: 10.1111/ijd. 13890, doi: 10.1016/j.actatropica.2016.02.014, doi: 10.3389/fmicb.2018.03327).
Профилактическими мерами распространения ортопоксвирусных инфекций в первую очередь являются своевременная диагностика и вакцинация. Также в качестве профилактики и в составе комплексного лечения эффективно использование препаратов моноклональных антител и, в меньшей степени, сывороточных поликлональных иммуноглобулинов вакцинированных доноров, а также химиотерапевтических препаратов (http://www.who.int, doi: 10.1016/j.tmaid.2022.102528, doi: 10.1007/s40265-022-01742-у).
Изучение протеома модельного вируса осповакцины выявило несколько протективных антигенов ортопоксвирусов: H3L, A27L, B5R, D8L и L1R (doi: 10.1111/j.1600-065X.2010.00975.x).
Белок В7 вируса натуральной оспы (ортолог B5R вируса осповакцины) является одной из популярных иммунологических мишеней для изучения иммунного ответа у инфицированных и вакцинированных, поиска терапевтических антител и создания вакцин и диагностикумов (http://www.iedb.org, doi: 10.1016/j.vaccine.2020.07.018, doi: 10.1128/JVI.01504-21, doi: 10.1016/j.jviromet.2023.114772, doi: 10.3851/IMP1573).
Известны рекомбинантные аналоги белка В7 ВНО, полученные в клетках E.coli в виде эктодомена белка В5 осповакцины или В6 вируса оспы обезьян с His-меткой (doi: 10.1016/0042-6822(92)90535-W, патент США US 20100196491 А1) или слитого с GST эктодомена (а.о. 22-276) белка В5 вируса осповакцины (doi: 10.1128/JVI.01854-07). Общим недостатком обоих вариантов является использование прокариотической системы экспрессии, которая не обеспечивает необходимые посттрансляционные модификации белка - гликозилирование и образование дисульфидных связей. Кроме того, белок, полученный без партнера слияния, нарабатывается в виде телец включения и сопряжен с рисками потерь белка на этапе рефолдинга и образования некорректной третичной структуры молекул. Вариант со слитым GST обеспечивал наработку белка в растворимой форме, однако приводил к изменениям физико-химических свойств белка и олигомеризации молекул, которая для данного белка не характерна.
Известны аналоги белка, полученные в клетках насекомых (doi: 10.1128/JVI.79.10.6260-6271.2005, патент США US7560116 В2). Авторы получали эктодомены белка В 5 вируса осповакцины с His-меткой. Недостатком является отличное от клеток млекопитающих гликозилирование и процессинг белков.
Известен аналог белка В7 ВНО, полученный в виде эктодомена с метками с-Мус и His с помощью трансгенных растений: томатов, табака и листовой капусты (патент США US 20170239345 A1). Недостатком данного варианта является продукция в клетках растений, которые значительно отличаются от клеток млекопитающих паттерном гликозилирования и большой гетерогенностью гликанов при биосинтезе гликозилированных белков.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный белок В7 ВНО с His-меткой, полученный в клетках E.coli (doi: 10.1016/j.virol.2007.09.029). Однако полученный продуцент обеспечивает накопление белка в тельцах включения и имеет те же ограничения системы экспрессии, что и аналоги, указанные выше.
Таким образом разработка стабильного штамма-продуцента белка В7 ВНО, обеспечивающего продукцию белка, сохраняющего характерные для вирусного белка посттрансляционные модификации, остается актуальной задачей.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом изобретения является конструирование такого интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую эктодомен белка В7 вируса натуральной оспы с His-tag и Avi-tag на С-конце белка, и получение такого рекомбинантного штамма клеточной линии-продуцента, которые обеспечивали бы продукцию рекомбинантного белка В7, сохраняющего характерные для вирусного белка посттрансляционные модификации.
Указанный технический результат достигается тем, что сконструирован интегративный плазмидный вектор pVEAL2-B7, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы в клетках млекопитающих, имеющий размер 10019 п.н., нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержащий в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг.1, следующие элементы:
- участок начала репликации ori, имеющий координаты 7721-8309;
- IR/DR - прямой и инвертированный повторы, узнаваемые транспозазой SB100, имеющие координаты 139-403 и 6937-7232 соответственно;
- UCOE-элементы, предотвращающие хромосомное «замалчивание» экспрессионной кассеты, имеющие координаты 416-1964 и 5377-6925 соответственно;
- CMV энхансер с координатами 2108-2487 и промотор с координатами 2488-2699, используемые для экспрессии генов в клетках млекопитающих;
- Chimeric intron, имеющий координаты 2860-2992 - химерный интрон, используемый для усиления экспрессии целевого гена;
- лидерный пептид V19, имеющий координаты 3110-3153 и обеспечивающий экспорт белка из клетки;
- нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующая эктодомен (а.о. 20-279) белка В7 вируса натуральной оспы, имеющая координаты 3161-4003 и содержащая последовательности His-tag и Avi-tag на С- конце;
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющая координаты 4025-4599;
- последовательность PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты 4612-5211;
- последовательность SV40 poly(A) signal для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования, имеющая координаты 5246-5367;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR, имеющий координаты 8480-9340 и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, имеющий координаты 9341-9445.
Указанный технический результат достигается также тем, что получен рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-К1-В7 - продуцент рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы, содержащий экспрессионную кассету интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7 по п. 1 и обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы.
Указанный технический результат достигается также тем, что создан рекомбинантный белок В7 вируса натуральной оспы, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-К1-В7 по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, молекулярную массу около 35 кДа и предназначенный для получения иммунобиологических препаратов.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1, кодирует фрагмент белка В7 ВНО (20-279) и содержит последовательности His-tag и Avi-tag на С - конце.
Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-B7 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и обеспечивает стабильную экспрессию и продукцию белка В7 ВНО, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и молекулярную массу -35 кДа, в клетках млекопитающих.
Полученный белок В7 ВНО (B5R) имеет молекулярную массу около 35 кДа, участвует в обертывании зрелых вирионов (MV) с образованием оболочечных вирионов (EV) и обратном процессе при проникновении вируса в клетку. Эктодомен зрелого белка (20-279 а.о.) стабилизирован несколькими дисульфидными связями и трижды гликозилирован.
Наличие указанных посттрансляционных модификаций учтены при разработке продуцента белка для сохранения его корректной структуры и свойств.
Полученный рекомбинантный белок В7 ВНО может быть использован для создания рекомбинантных вакцин и диагностических тест-систем, а также в качестве мишени для поиска широконейтрализующих антител против ортопоксвирусов и других средств терапии и профилактики.
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг.1 представлено разделение продуктов ПНР амплификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок В7 ВНО (а.о. 20-279) в 1% агарозном геле: М - маркер. На фиг.2 изображена физическая карта интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7, имеющего размер 10 019 п. н. На фиг.3 приведен анализ очищенного белка В7 ВНО в 15% ДСН-ПААГ:
- М - маркеры молекулярных масс;
- 1-3 - фракции элюата при очистке белка В7 с помощью аффинной хроматографии;
- 4 - сконцентрированный белок В7.
На фиг.4 приведено взаимодействие рекомбинантного белка В7 ВНО со специфическим моноклональным антителом 283 (А) и поликлональными сывороточными IgG кролика, иммунизированного осповакциной, в ИФА. Показаны средние значения ± SD. На фиг.5 представлена продукция биотинилированного белка В 7 ВНО в клетках СНО-К1: А-Б -иммуноблоттинг культуральной жидкости СНО-К1-В7, продуцента белка В7 и CHO-K1-BirA-B7, продуцента in vivo биотинилированного белка В7 ВНО, с антителами к His-метке (А) и стрептавидином (Б), В - наличие биотинилированного белка В7 в культуральной среде при разных концентрациях биотина. На фиг.6 приведена SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент белка В7 (а.о. 20-279) с His-tag и Avi-tag на С-конце. На фиг.7 представлена SEQ ID NO: 2 - нуклеотидная последовательность вектора pVEAL2-B7. На фиг.8 приведена SEQ ID NO: 3 - аминокислотная последовательность белка В7 ВНО.
Ниже приведены примеры конкретного осуществления изобретения.
Пример 1. Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей белок В7 вируса натуральной оспы
Нуклеотидную последовательность, кодирующую белок В7 ВНО, извлекали из базы данных GenBank и синтезировали в ООО «ДНК-синтез» в составе вектора pGH-B7R. ДНК, кодирующую фрагмент В7 (а.о. 20-279), получали в ПЦР на матрице pGH-B7R с использованием праймеров B7R_Afe_F (5'-gctggccatggacggaactcttttccctgg-3') и B7R_Avi_R (5'-tttttgcggccgcattattcatgccactcgatcttctgagcctcgaagatgtcgttcaggccgtggtgatggtggtgatgat gataagttgcttctaacgattctatttct-3') одновременно вводя нуклеотидные последовательности, кодирующие метки His-tag и Avi-tag, а также последовательности сайтов гидролиза эндонуклеаз рестрикции AfeI и CciNI.
ПЦР проводили по стандартному протоколу. Реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержала 3-5 нг ДНК-матрицы, 5 мкл SE-буфера для PfuSE ДНК полимеразы, 0,5 мкл PfuSE ДНК полимеразы и 1 мкл 50xBSA («СибЭнзим», г. Новосибирск), 0,2 мМ дНТФ, 0,2 мкМ праймеры.
Температурный режим реакции состоял из начальной денатурации при 95°С в течение 2 мин, 30 циклов амплификации (30 сек денатурации при 95°С, 15 сек отжига при 58°С и 1 мин 30 сек элонгации при 72°С) и финальной элонгации при 72°С в течение 2 мин.
Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле (фиг.1). Затем очищали ДНК из реакционной смеси с помощью набора «DNA CleanUp Standart» («Евроген», Москва) и проводили встройку по сайтам гидролиза AfeI и CciNI в вектор pSWS. Секвенирование по методу Сенгера подтвердило структуру полученной последовательности, и установило нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
Пример 2. Конструирование интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7 для продукции
На основе вектора pVEAL2 был получен интегративный плазмидный вектор pVEAL2-B7 (фиг.2), имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.
Для субклонирования последовательности SEQ ID NO: 1 в вектор pVEAL2 целевой фрагмент получали в ПЦР на матрице pSWS-B7R с использованием праймеров CTLA4-F (5'-ctatttaaatgggtgccgcggcaa-3') и Avi-Sal_R (5 '-tcagttttgtatatccgtggtagcaataacca-3').
ПЦР проводили по стандартному протоколу. Реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержала 3-5 нг ДНК-матрицы, 5 мкл SE-буфера для PfuSE ДНК полимеразы, 0,5 мкл PfuSE ДНК полимеразы и 1 мкл 50xBSA («СибЭнзим», г. Новосибирск), 0,2 мМ дНТФ и 0,2 мкМ праймеры.
Температурный режим реакции состоял из начальной денатурации при 95°С в течение 2 мин, 30 циклов амплификации (30 сек денатурации при 95°С, 15 сек отжига при 60°С и 1 мин 30 сек элонгации при 72°С) и финальной элонгации при 72°С в течение 2 мин.
Полученные ДНК фрагменты, а также вектор pVEAL2 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и Sail, затем разделяли продукты реакции в 1% агарозном геле, вырезали целевые фрагменты и выделяли из геля с помощью набора «DNA CleanUp Standart» («Евроген», Москва). Фрагменты лишировали в 5Х Quick Ligation буфере («Евроген», Москва) с помощью Т4 ДНК-лигазы и полученной лигазной смесью проводили heat-shock трансформацию клеток E.coli NEB stable. Трансформанты высевали на селективную агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Отдельные колонии культивировали в среде LB, выделяли пДНК с помощью набора Plasmid Miniprep («Евроген», Москва) и секвенировали по методу Сенгера для подтверждения структуры полученной конструкции.
Пример 3. Продукция белка В7 ВНО в клетках млекопитающих с использованием вектора pVEAL2-B7
Для стабильной продукции рекомбинантного белка В7 ВНО была разработана трансгенная культура клеток СНО-К1-В7.
Клетки СНО-К1 были трансфецированы плазмидой pVEAL2-B7, содержащей целевую экспрессионную кассету, и плазмидой pCMV(CAT)T7-SB100, кодирующей транспозазу SB 100 для интеграции экспрессионной кассеты в геном клеток. Трансфекцию проводили с помощью набора «Lipofectamine 3000 reagent» («Thermo Fisher Scientific)), США) согласно прилагаемой инструкции. После трансфекции клетки инкубировали в течение 3 суток, затем заменяли питательную среду на свежую поддерживающую, содержащую селективный антибиотик пуромицин в финальной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 5 дней до гибели клеток в отрицательном контроле. Затем культуральную среду меняли с периодичностью 3-5 дней, повышая концентрацию антибиотика для отбора наиболее продуктивных клонов. Наличие целевого белка определяли с помощью иммуноблоттинга с антителами к His-метке.
Полученный белок В7 включающий последовательностью (20 - 279), по сравнению с полноразмерным, является растворимым и содержит аминокислотные последовательности (НННННН) 6xhis и (GLNDIFEAQKIEWHE) avi- тэгов, которые позволяют проводить аффинную очистку и специфическую конъюгацию с биотином.
Пример 4. Наработка и очистка белка В7 ВНО
Культуры клеток продуцентов масштабировали и культивировали на роллерных установках в среде DMEM/F-12(1:1), содержащей 2% FBS и 50 мкг/мл гентамицина с периодической заменой питательной среды. По окончании цикла культивирования культуральную среду отделяли от клеток центрифугированием, фильтровали через фильтр-системы (0,22 мкм) для удаления клеточного дебриса и очищали с помощью Ni-аффинной хроматографии (GE Healthcare). Клеточную среду уравновешивали базовым буфером (20 тМ имидазол, 500 тМ NaCl в 0.01% PBS рН 7.4), наносили на колонку и промывали базовым буфером. Элюировали в градиенте концентрации имидазола (20 - 500 мМ), отбирая фракции по 2 мл. Фракции элюата анализировали в 15% ДСН-ПААГ по Лэммли (фиг.3). Белок концентрировали и диализовали против PBS. Выход белка составил 10-20 мг/л при адгезионном культивировании на роллерных установках.
Пример 5. Исследование антигенных свойств рекомбинантного белка В7 ВНО
Препарат белка В7 сорбировали в буфере PBS в 96-луночные планшеты в концентрации 100 нг/лунка в течение ночи при +4°С. В качестве контроля сорбировали казеин (1% р-р в PBS). Трижды промывали буфером PBST (0,1% Tween-20 в PBS) и блокировали лунки 1% раствором казеина в PBS в течение 1,5 ч при 37°С. Затем трижды промывали лунки буфером PBST и вносили антитело 283 (4 мг/мл) или сывороточные антитела (3 мг/мл) в разведениях 1:101 - 1:108. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С, затем трижды промывали PBST и вносили соответствующие видоспецифические антитела, конъюгированные с HRP. После инкубации, планшеты промывали и вносили раствор ТМВ (Amresco, США), инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и терминировали реакцию добавлением стоп-реагента (1Н H2SO4). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на планшетном ридере Varioskan Lux multimode microplate reader (Thermo Fisher Scientific, США). Графики строили с помощью программы GraphPad Prism 8.0.
Взаимодействие рекомбинантного белка В7 ВНО со специфическим моноклональным антителом 283 (А) и поликлональными сывороточными IgG кролика, иммунизированного осповакциной, в ИФА приведены на фиг.4.
Пример 6. Биосинтез in vivo биотинилированного белка В7 ВНО в клетках млекопитающих
Для получения культуры продуцента биотинилированного белка В7 ВНО в культуру СНО-К1-В7 вводили трансген, кодирющий BirA - биотин-лигазу E.coli, обеспечивающую специфическое in vivo биотинилирование белков в клетках по последовательности Avi-tag. Для этого проводили ко-трансфекцию клеток СНО-К1-В7 плазмидами pVEAL-BirA и pCMV(CAT)T7-SB100 как указано выше и отбор трансформантов с использованием одновременно двух селективных антибиотиков: Zeocin (475 мкг/мл) и пуромицин (10 мкг/мл). Для продукции биотинилированного белка В7 в культуральную среду добавляли раствор биотина до 50-100 мкМ в финальной концентрации. Наличие белка определяли с помощью иммуноблоттинга с антителами к His-метке, наличие биотинилированного В7 определяли по взаимодействию со стрептавидином в ИФА и иммуноблоттинге. Результаты представлены на фиг.5.
Технический результат достигается за счет (примеры 1-6):
- получения продуцента белка В7 на основе клеточной линий СНО-К1 с помощью плазмиды pVEAL2-B7;
- получения продуцента in vivo биотинилированного белка В7 на основе клеточной линий СНО-К1 с помощью плазмид pVEAL2-B7 и pVEAL-BirA;
- очистки рекомбинантного белка В7 из культуральной среды клеток-продуцента с помощью аффинной хроматографии;
- подтверждения получения белка В7 ВНО, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и сохранения его антигенных свойств.
Заявленные изобретения имеют существенные достоинства перед известными аналогами. Интегративный плазмидный вектор pVEAL2, благодаря особенностям конструктивных элементов и системе транспозазы SB100X позволяет получать стабильные культуры продуцентов белка на основе клеток млекопитающих, которые обеспечивают высокий уровень продукции белка. Клетки СНО-К1 при биосинтезе белка обеспечивают необходимые посттрансляционные модификации белка В7. Клеточные линии на основе СНО-К1 могут быть использованы как для адгезионного, так и суспензионного культивирования, обеспечивающего наибольший выход целевого продукта.
Экспрессия фрагмента белка В7 ВНО (а.о. 20-279), лишенного трансмембранной и интравирионной областей (189-317 а.о.) обеспечивает получение растворимой формы белка, с сохранением его антигенных и иммуногенных свойств, а замена лидерного пептида (а.о. 1-20) на сигнальную последовательность V19 в составе вектора обеспечивает эффективную секрецию белка в культуральную среду. Последовательность полигистидиновой метки (НННННН) введена для последующей очистки рекомбинантного белка В7 с помощью аффинной хроматографии. Благодаря введенной последовательности Avi-tag (GLNDIFEAQKIEWHE), при необходимости, белок В7 может быть ферментативно биотинилирован в условиях in vivo или in vitro с помощью биотин-лигазы BirA.
--->
Перечень последовательностей, представленных в соответствии со
стандартом ВОИС ST26
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"
PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2023-10-11"
softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence"
fileName="Приложение_Инт Вектор_Штамм CHO_Белок B7 ВНО.xml"
dtdVersion="V1_3" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru"
originalFreeTextLanguageCode="ru">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-10-11</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>123456</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>12345</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-10-11</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение
науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора)</ApplicantName> <ApplicantNameLatin>Federalnoe
byudzhetnoe uchrezhdenie nauki "Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr
virusologii i biotekhnologii "Vektor" Federalnoj sluzhby po nadzoru v
sfere zashchity prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN
GNTS VB "Vektor" Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Интегративный плазмидный вектор
pVEAL2-B7, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка
B7 вируса натуральной оспы (ВНО) в клетках млекопитающих,
рекомбинантный штамм клеточной линии СНО-К1-B7 и рекомбинантный белок
B7 ВНО, продуцируемый штаммом клеточной линии CHO- К1-B7 и
используемый для получения иммунобиологических
препаратов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>868</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..868</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctggccacatgtactgtacccactatgaataacgctaaattaacgtctacc
gaaacatcgtttaatgataaacaaaaagttacatttacatgtgattcgggatattattctttggatccaa
atgctgtctgtgaaacagataaatggaaatacgaaaatccatgtaaaaaaatgtgtacagtttctgatta
tgtctctgaactatataataaaccgctatacgaagtaaatgccatcataacactaatttgtaaagacgaa
acaaaatattttcgttgtgaagaaaaaaatggaaatacttcttggaatgatactgttacgtgtcctaatg
cggaatgtcaatctcttcaattagatcacggatcgtgtcaaccagttaaagaaaaatactcatttgggga
acatataactatcaactgtgatgttggatatgaggttattggtgcttcgtacataacttgtacagctaat
tcttggaatgttattccatcatgtcaacaaaaatgtgatataccgtctctatctaatggattaatttccg
gatctacattttctatcggtggcgttatacatcttagttgtaaaagtggttttatactaacgggatctcc
atcatccacatgtatcgacggtaaatggaatcccgtactcccaatatgtatacgatctaacgaagaattt
gatccagtggaggatggtcccgatgatgagacagatctgagcaaactctcaaaagacgttgtacaatatg
aacaagaaatagaatcgttagaagcaacttatcatcatcaccaccatcaccacggcctgaacgacatctt
cgaggctcagaagatcgagtggcatgaataatgcggccgctttttt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>10019</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..10019</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaa
aacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattggagctcggttccctatacagt
tgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaattt
cttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcattttt
ccaacaattgtttacagacagattatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagt
ttacatacactaagttgactgtgcctttaaacagcttggaaaattccagaaaatgatgtcatggctttag
aagcttcattggcgccctccgcgcctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcg
cgcggggccgccggggggaggggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgc
gcgcgcggcggggggaggggccggcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcg
ccgacgaccgcggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggc
ggggcgaggacagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgcc
aaaaccggactccgcccacttcctcgcccgccggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagg
gggagttgggagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccag
gggtcagttccacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttga
ttcgggtgtttccggaaggggccgagtcaatccgccgagttggggcacggaaaacaaaaagggaaggcta
ctaagatttttctggcgggggttatcattggcgtaactgcagggaccacctcccgggttgagggggctgg
atctccaggctgcggattaagcccctcccgtcggcgttaatttcaaactgcgcgacgtttctcacctgcc
ttcgccaaggcaggggccgggaccctattccaagaggtagtaactagcaggactctagccttccgcaatt
cattgagcgcatttacggaagtaacgtcgggtactgtctctggccgcaagggtgggaggagtacgcattt
ggcgtaaggtggggcgtagagccttcccgccattggcggcggatagggcgtttacgcgacggcctgacgt
agcggaagacgccttagtgggggggaaggttctagaaaagcggcggcagcggctctagcggcagtagcag
cagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcagagttgtttctccagcagcggcagttctcactacag
cgccaggacgagtccggttcgtgttcgtccgcggagatctctctcatctcgctcggctgcgggaaatcgg
gctgaagcgactgagtccgcgatggaggtaacgggtttgaaatcaatgagttattgaaaagggcatggcg
aggccgttggcgcctcagtggaagtcggccagccgcctccgtgggagagaggcaggaaatcggaccaatt
cagtagcagtggggcttaaggtttatgaacggggtcttgagcggaggcctgagcgtacaaacagcttccc
caccctcagcctcccggcgccatttcccttcactgggggtgggggatggggagctttcacatggcggacg
ctgccccgctggggtgaaagtggggcgcggaggcgggacttcttattccctttctaaagcacgctgcttc
gggggccacggcgtctcctcggggatcttcaatattggccattagccatattattcattggttatatagc
ataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggc
tcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggt
cattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc
gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttc
cattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgc
caagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt
acgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttgg
cagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca
atgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgcc
ccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaacc
gtcagatcactagaagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctga
cacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctcttaaggtagccttgcagaagttggtcgtgaggcac
tgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacag
agaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag
gtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagcct
cgagaattcgtcctgctgcgcacgaagccctggccccggccgccaccatgatgaggcccatcgtgctggt
gctgctgttcgccacctcagcgctggccacatgtactgtacccactatgaataacgctaaattaacgtct
accgaaacatcgtttaatgataaacaaaaagttacatttacatgtgattcgggatattattctttggatc
caaatgctgtctgtgaaacagataaatggaaatacgaaaatccatgtaaaaaaatgtgtacagtttctga
ttatgtctctgaactatataataaaccgctatacgaagtaaatgccatcataacactaatttgtaaagac
gaaacaaaatattttcgttgtgaagaaaaaaatggaaatacttcttggaatgatactgttacgtgtccta
atgcggaatgtcaatctcttcaattagatcacggatcgtgtcaaccagttaaagaaaaatactcatttgg
ggaacatataactatcaactgtgatgttggatatgaggttattggtgcttcgtacataacttgtacagct
aattcttggaatgttattccatcatgtcaacaaaaatgtgatataccgtctctatctaatggattaattt
ccggatctacattttctatcggtggcgttatacatcttagttgtaaaagtggttttatactaacgggatc
tccatcatccacatgtatcgacggtaaatggaatcccgtactcccaatatgtatacgatctaacgaagaa
tttgatccagtggaggatggtcccgatgatgagacagatctgagcaaactctcaaaagacgttgtacaat
atgaacaagaaatagaatcgttagaagcaacttatcatcatcaccaccatcaccacggcctgaacgacat
cttcgaggctcagaagatcgagtggcatgaataagtcgaccgagcggttcccgcccctctccctcccccc
cccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccac
catattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctagg
ggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaag
cttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtg
cctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtg
agttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgccc
agaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgag
gttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatg
gccacaaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtac
gcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcga
gcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcg
gacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgaga
tcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggc
gccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaag
ggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctgg
agacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggt
gcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgattcgcatatgggttaatgctt
cgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgct
ttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttccacg
gccggccctccgcgcctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcgcgcggggcc
gccggggggaggggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgcgcgcgcggc
ggggggaggggccggcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcgccgacgacc
gcggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggcggggcgagg
acagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgccaaaaccgga
ctccgcccacttcctcgcccgccggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagggggagttgg
gagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccaggggtcagtt
ccacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttgattcgggtgt
ttccggaaggggccgagtcaatccgccgagttggggcacggaaaacaaaaagggaaggctactaagattt
ttctggcgggggttatcattggcgtaactgcagggaccacctcccgggttgagggggctggatctccagg
ctgcggattaagcccctcccgtcggcgttaatttcaaactgcgcgacgtttctcacctgccttcgccaag
gcaggggccgggaccctattccaagaggtagtaactagcaggactctagccttccgcaattcattgagcg
catttacggaagtaacgtcgggtactgtctctggccgcaagggtgggaggagtacgcatttggcgtaagg
tggggcgtagagccttcccgccattggcggcggatagggcgtttacgcgacggcctgacgtagcggaaga
cgccttagtgggggggaaggttctagaaaagcggcggcagcggctctagcggcagtagcagcagcgccgg
gtcccgtgcggaggtgctcctcgcagagttgtttctccagcagcggcagttctcactacagcgccaggac
gagtccggttcgtgttcgtccgcggagatctctctcatctcgctcggctgcgggaaatcgggctgaagcg
actgagtccgcgatggaggtaacgggtttgaaatcaatgagttattgaaaagggcatggcgaggccgttg
gcgcctcagtggaagtcggccagccgcctccgtgggagagaggcaggaaatcggaccaattcagtagcag
tggggcttaaggtttatgaacggggtcttgagcggaggcctgagcgtacaaacagcttccccaccctcag
cctcccggcgccatttcccttcactgggggtgggggatggggagctttcacatggcggacgctgccccgc
tggggtgaaagtggggcgcggaggcgggacttcttattccctttctaaagcacgctgcttcgggggccac
ggcgtctcctcggggatctagcttgtggaaggctactcgaaatgtttgacccaagttaaacaatttaaag
gcaatgctaccaaatactaattgagtgtatgtaaacttctgacccactgggaatgtgatgaaagaaataa
aagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcct
aactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgt
atttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtatagggttcctctagctagagacgacctcgg
gtacccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc
ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctg
gggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctctt
ccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaa
ggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaa
aaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatc
acaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccc
tggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctccct
tcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctcca
agctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttga
gtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgagg
tatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttg
gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaac
caccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa
gatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtca
tgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaag
tatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgt
ctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccat
ctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaacca
gccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgt
tgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggca
tcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttg
gccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagat
gcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctc
ttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaa
cgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtg
cacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaa
tgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattat
tgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaa
taggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggc
gggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttc
ttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggt
tccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggcc
atcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttc
caaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcgg
cctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttac
aatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattac
gccagctggcgaaagggggatgtgctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>281</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..281</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYYSLDPNAVCETDKWKYENP
CKKMCTVSDYVSELYNKPLYEVNAIITLICKDETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQSLQLDHGSCQ
PVKEKYSFGEHITINCDVGYEVIGASYITCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSC
KSGFILTGSPSSTCIDGKWNPVLPICIRSNEEFDPVEDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYHHH
HHHHGLNDIFEAQKIEWHE</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан интегративный плазмидный вектор pVEAL2-B7, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы в клетках млекопитающих, имеющий размер 10019 п.н. Также описаны рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-В7 - продуцент рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы, и рекомбинантный белок В7 вируса натуральной оспы, продуцируемый указанным рекомбинантным штаммом. Техническим результатом изобретения является конструирование такого интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую эктодомен белка В7 вируса натуральной оспы с His-tag и Avi-tag на С-конце белка, и получение такого рекомбинантного штамма клеточной линии-продуцента, которые обеспечивали бы продукцию рекомбинантного белка В7, сохраняющего характерные для вирусного белка посттрансляционные модификации. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.
1. Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-B7, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы в клетках млекопитающих, имеющий размер 10019 п.н., нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и содержащий в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг.1, следующие элементы:
- участок начала репликации ori, имеющий координаты 7721-8309;
- IR/DR - прямой и инвертированный повторы, узнаваемые транспозазой SB100, имеющие координаты 139-403 и 6937-7232 соответственно;
- UCOE-элементы, предотвращающие хромосомное «замалчивание» экспрессионной кассеты, имеющие координаты 416-1964 и 5377-6925 соответственно;
- CMV энхансер с координатами 2108-2487 и промотор с координатами 2488-2699, используемые для экспрессии генов в клетках млекопитающих;
- Chimeric intron, имеющий координаты 2860-2992 - химерный интрон, используемый для усиления экспрессии целевого гена;
- лидерный пептид VI9, имеющий координаты 3110-3153 и обеспечивающий экспорт белка из клетки;
- нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1, имеющая координаты 3161-4003 и кодирующая эктодомен белка В7 вируса натуральной оспы с His-tag и Avi-tag на С-конце;
- участок внутренней посадки рибосомы EMCV IRES, имеющая координаты 4025-4599;
- последовательность PuroR, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину и имеющая координаты 4612-5211;
- последовательность SV40 poly(A) signal для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования, имеющая координаты 5246-5367;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR, имеющий координаты 8480-9340 и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, имеющий координаты 9341-9445.
2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-В7 - продуцент рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы, содержащий экспрессионную кассету интегративного плазмидного вектора pVEAL2-B7 по п. 1 и обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного белка В7 вируса натуральной оспы.
3. Рекомбинантный белок В7 вируса натуральной оспы, продуцируемый рекомбинантным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-В7 по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, молекулярную массу 35 кДа и предназначенный для создания иммунобиологических препаратов.
