ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/182,020, поданной 19 июня 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Копия ASCII, созданная 16 июня 2016 года, названа 104018.000953_SL.txt и имеет размер 379,441 байт.

область техники

[0003] Согласно настоящему изобретению предложены конъюгированные через Cys80 иммуноглобулины и способы их получения.

уровень техники

[0004] Спектр применения моноклональных антител включает как фундаментальные исследования, так и использование в терапевтических и диагностических целях. Возможность конъюгирования антител с функциональными агентами еще больше расширяет их функциональность. Получение конъюгированных антител обычно включает конъюгирование линкера, лекарственного средства или другого функционального агента с реакционноспособными остатками лизина или цистеина на тяжелой (HC) и легкой (LC) цепях моноклонального антитела (mAb). Конъюгирование лизина, как правило, опосредовано химическими реакциями на основе сукцинимида (NHS) или изотиоцианата. Учитывая количество экспонированных на поверхности антитела лизинов, подходы, связанные с конъюгированием на основе амина, приводят к модификации множества лизинов, несмотря на то, что не все остатки лизина модифицируются в одинаковой степени. Таким образом, конечный продукт представляет собой гетерогенную смесь mAb с различным соотношением лекарственное средство-антитело (DAR).

[0005] Большинство цистеинов молекулы антитела образуют меж- или внутрицепочечные дисульфидные связи. Конъюгирование с цистеинами, таким образом, требует по меньшей мере частичного восстановления антитела. Подобно конъюгированию через лизин, конъюгирование через цистеин приводит к получению гетерогенной смеси конъюгированных антител, различающихся по нагрузке лекарственного средства и сайтам конъюгации. Каждый вид конъюгированного антитела может иметь различные свойства, которые в свою очередь могут приводить к широкой вариабельности фармакокинетических свойств in vivo. Кроме того, такая гетерогенность может затруднять получение конъюгированного антитела.

краткое описание изобретения

[0006] В настоящей заявке описаны способы получения конъюгированного иммуноглобулина, включающие: декэпирование цистеина в положении аминокислоты 80 («Cys80») в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, полученного от кролика, где указанный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0007] Также предложены способы получения антиген-связывающей молекулы, включающие инкубирование первого конъюгированного иммуноглобулина со вторым конъюгированным иммуноглобулином для получения указанной антиген-связывающей молекулы, где: первый конъюгированный иммуноглобулин содержит первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, где указанная первая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80¹») и указанный Cys80¹ конъюгирован с первым способным реагировать с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу; и второй конъюгированный иммуноглобулин содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80²») и указанный Cys80² конъюгирован со вторым способным реагировать с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0008] Согласно настоящему изобретению предложены иммуноглобулины, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys, а также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные иммуноглобулины, и клетки-хозяева, содержащие указанные молекулы нуклеиновой кислоты.

[0009] Также предложены конъюгированные иммуноглобулины, содержащие описанные иммуноглобулины, в которых цистеин в положении 80 конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0010] В настоящей заявке также описаны способы лечения рака у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества иммуноглобулина против иммуноглобулина, где указанный иммуноглобулин против мезотелина содержит любой из описанных иммуноглобулинов против мезотелина и реагирующее с тиолом соединение, содержащее способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент.

[0011] Согласно настоящему изобретению предложены антиген-связывающие молекулы, содержащие: первый конъюгированный иммуноглобулин, содержащий первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, где указанная первая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80¹») и указанный Cys80¹ конъюгирован с первым реагирующим с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу, и второй конъюгированный иммуноглобулин, содержащий вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80²») и указанный Cys80² конъюгирован со вторым реагирующим с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0012] В настоящей заявке также описаны вариабельные области легких цепей для применения в конъюгированном иммуноглобулине, где указанные вариабельные области легких цепей содержат цистеин в положении аминокислоты 80 («Cys80») и аминокислотный остаток в положении 83, отличный от Phe, Lys или Cys, где Cys80 является неспаренным.

краткое описание графических материалов

[0013] Рассмотрение краткого описания изобретения, а также следующего далее подробного описания изобретения совместно с прилагаемыми чертежами обеспечивает лучшее понимание изобретения. Для иллюстрации описанных способов, конъюгированных иммуноглобулинов, антиген-связывающих молекул, иммуноглобулинов и вариабельных областей легких цепей, типичные варианты реализации изобретения проиллюстрированы в чертежах; однако способы, конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей не ограничиваются конкретными описанными вариантами реализации.

Чертежи:

[0014] На Фигуре 1 представлено выравнивание последовательностей легких цепей кролика и человека. (A) Выравнивание последовательностей генов Vκ зародышевых линий кролика (IGKV1S2, X02336) и человека (IGKV1-5, Z00001). Жирный шрифт указывает на Cys80 (в соответствии с нумерацией по Kabat или Chothia) в последовательности кролика. (B) Выравнивание последовательностей Cκ зародышевых линий кролика (IGKC1, K01360) и человека (IGKC, J00241). Жирный шрифт указывает на Cys171 (EU-нумерация) в последовательности кролика.

[0015] На Фигуре 2 представлена структурная модель (A) mAb кролика, показывающая дисульфидную связь Cys80-Cys171, (B) структурная модель mAb человека и (C) структурная модель гибридного mAb, происходящего от кролика/человека, показывающая неспаренный Cys80.

[0016] На Фигуре 3 показано выравнивание семейств генов Vκ зародышевой линии кролика. Остаток в положении 80 указан стрелкой.

[0017] На Фигуре 4 показан пример масс-спектрометрического анализа легкой цепи xi155D5 при (A) восстановлении с применением жестких условий (20 мМ ДТТ, 60°C, 5 минут) и (B) восстановлении с применением мягких условий (100 мкМ ДТТ, 22°C, 30 минут).

[0018] На Фигуре 5 показан пример анализа стабильности xi155D5 с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. (A) Стабильность xi155D5 при хранении при -80°C. (B) Стабильность xi155D5 при хранении при 37°C в течение 1 недели. Наблюдали только очень незначительное повышение образования агрегатов или деградации продуктов. Y ось - мЕОП; x ось - время удерживания (минуты).

[0019] На Фигуре 6 показан пример эксперимента по декэпированию, указывающий на то, что цистеин, кэпирующий Cys80, можно удалять с помощью мягких восстанавливающих условий (использование буфера, содержащего 5 мМ цистеин, в течение 16 часов с последующей промывкой Трис-содержащим буфером без цистеина в течение 60 часов; все инкубации осуществляли при 4°C). Масса xi155D5 до (A) и после (B) декэпирования составляла 145,464 и 145,221 Да соответственно. Различие (243 Да) приблизительно соответствует массе двух свободных цистеинов.

[0020] На Фигуре 7 приведен пример эксперимента по конъюгированию, показывающий, что некэпированный Cys80 можно конъюгировать с малеимид-ПЭГ2- биотином. (A) Легкая цепь восстановленного xi155D5 (предсказанная масса 23,399 Да) имела массу 23,384 Да; (B) после инкубации с малеимид-ПЭГ2-биотином наблюдалось увеличение массы 94% продукта на 526 Да (23,910 Да). Звездочками обозначены пики, не соответствующие легкой цепи.

[0021] На Фигуре 8 показаны последовательности Vκ и VH 155D5 кролика после выравнивания с наиболее гомологичными вариабельными доменами зародышевой линии человека. Границы каркасной области (FWR) и определяющей комплементарность области (CDR) по нумерации Kabat указаны над последовательностью. CDR по нумерации Chothia подчеркнуты. C-концевая половина CDR2 по Kabat не считается CDR по нумерации Chothia и выделена курсивом.

[0022] На Фигуре 9 показан пример стандартного способа очистки zu155D5-1 с помощью белка A. Было обнаружено, что zu155D5-1 является кэпированным (A), о чем свидетельствует изменение массы после декэпирования (B) на 233 Да, что приблизительно соответствует массе двух кэпирующих цистеинов.

[0023] На Фигуре 10 показан пример структурных моделей гибридного xi155D5. Моделирование для определения удаленности Cys80 выполняли, как на Фигуре 2. Выделяли остатки, различающиеся между xi155D5 и zu155D5-1, и измеряли расстояние до Cys80 каждого из указанных остатков. (A) Остатки Val11, Ala14, Gly17, Thr18; (B) Lys63; (C) Thr76, Gly77, Val78, Ala83 и (D) Glu103 и Leu104 находятся в пределах 11 Å от Cys80, за исключением Lys63 (18 Å). Указанные остатки заменяли обратно на аминокислоты кролика в присутствии Cys80.

[0024] На Фигуре 11 показан пример последовательностей легкой цепи гуманизированных mAb 155D5, 1E4, 166B3 и 33O11.

[0025] На Фигуре 12 показан (A-D) скрининг с помощью проточной цитометрии сывороток от иммунизированных животных и (E) скрининг с помощью ИФА сывороток от иммунизированных животных. (A-D) Клетки инкубировали с сыворотками от взятой после иммунизации крови в указанных разведениях (A: после взятия крови, сыворотка кролика 1, разведенная в отношении 1:1000; B: после взятия крови, сыворотка кролика 1, разведенная в отношении 1:5000; C: после взятия крови, сыворотка кролика 2, разведенная в отношении 1:1000; и D: после взятия крови, сыворотка кролика 2, разведенная в отношении 1:5000). Показан сигнал от клеток, временно экспрессирующих MSLN человека (+MSLN), и сигнал от MSLN-отрицательных клеток (-MSLN). (E) Планшеты для ИФА покрывали MSLN человека в концентрации 1 мкг/мл при 4°C в течение ночи и блокировали с применением 1% БСА в PBS с 0,01% Tween (PBST) в течение 2 часов при комнатной температуре. После блокирования буфер удаляли, в лунки добавляли образцы крови, полученной до и после иммунизации в серийных разведениях. Планшет инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем промывали три раза PBST. HRP-конъюгированные антитела козы против антител кролика добавляли в блокирующем буфере и инкубировали в течение 1 часа. Планшет промывали три раза и добавляли TMB-субстрат. Реакцию останавливали и абсорбцию измеряли при 450 нм.

[0026] На Фигуре 13 показан пример пика белка масс-спектрометрического анализа с деконволюцией до и после конъюгации малеимид-ПЭГ2-ауристатина F (AuF) с Cys80.

[0027] На Фигуре 14 показана (A) цитотоксичность mAb MSLN-AuF, конъюгированного через Cys80, в отношении MSLN-отрицательных клеток A431 и (B) mAb MSLN-AuF, конъюгированного через Cys80, в отношении MSLN-положительных клеток A431-MSLN.

[0028] На Фигуре 15 показаны средние объемы опухолей в различных группах, проходящих лечение.

[0029] На Фигуре 16 показаны (A) средние объемы опухолей A431-MSLN (левый бок) в различных лечебных группах и (B) средние объемы опухолей A431 в различных группах, проходящих лечение (правый бок).

[0030] На Фигуре 17 представлены результаты анализа с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН примера конъюгированного антитела xi155D5-800CW. (A) mwm - маркер молекулярной массы; дорожка 1 - xi155D5, неконъюгированное, невосстановленное; дорожка 2 - xi155D5, xi155D5-800CW, невосстановленное; дорожка 3 - пробел; дорожка 4 - xi155D5, неконъюгированное, восстановленное; дорожка 5 - xi155D5, xi155D5-800CW, восстановленное. Все дорожки содержали 5 мкг белка, окрашивание Кумасси. (B) Тот же гель, что и в A, визуализированный на системе IVIS. Результаты указывают на то, что IRDye 800CW конъюгировал только с легкой цепью xi155D5. Анализ xi155D5-800CW с помощью ИФА указывает на то, что полное связывание с CA9 сохранялось (данные не представлены).

[0031] На Фигуре 18 показана опухоль-специфичная локализация примера конъюгированного с DyeIR 800CW антитела (xi155D5-800CW). Клетки человека colo205 (A-D) и HT-29 (E-H) трансплантировали мышам «nude», которым позже инъецировали xi155D5-800CW. За флуоресцентным сигналом (оранжево-красным) наблюдали в различные точки времени, включая 0 ч (A и E), 4 ч (B и F), 24 ч (C и G) и 72 ч (D и H) (показано время только от 0 до 72 часов и правый бок). Показано приблизительное расположение почки (K) и опухоли (T).

[0032] На Фигуре 19 показан пример очистки бивалентной/биспецифичной антиген-связывающей молекулы xi155D5/xi1-55-2. График хроматографии с гель-фильтрацией, показывающий пик, соответствующий бивалентной/биспецифичной антиген-связывающей молекуле xi155D5/xi1-55-2 (называемой «biFab») (A). Молекулярный вес фракции анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН (B). Фракции, содержащие бивалентную/биспецифическую антиген-связывающую молекулу xi155D5/xi1-55-2 (biFab) объединяли и массу определяли с помощью масс-спектрометрии (C).

[0033] На Фигуре 20 показана биспецифичность примера бивалентной/биспецифичной антиген-связывающей молекулы xi155D5/xi1-55-2 (biFab). Осуществляли захват биотинилированного CA9 человека на покрытые стрептавидином биосенсорные наконечники Octet. Соединение добавляли в момент времени, указанный первой стрелкой («соединение»), затем указанному соединению позволяли связываться. После этого добавляли растворимый TEM-1 человека (вторая стрелка; «TEM-1») и измеряли его связывание с захваченными комплексами CA9/соединение. Сдвиг ответа (двойная стрелка), указывающий на захват растворимого TEM-1, наблюдали только в случае бивалентной/биспецифичной антиген-связывающей молекулы xi155D5/xi1-55-2 (biFab).

[0034] На Фигуре 21 показан анализ с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН mAb xi33O11-Aβ(1-16), конъюгированных через CYS80, и mAb xi1-55-2-Aβ(1-16), конъюгированных через CYS80. Показанные продукты представляют собой продукты до (B) и после (A) конъюгации mAb-DBCO с пептидом Aβ(1-16). MW - маркер молекулярной массы. LC - легкая цепь.

[0035] На Фигуре 22 показаны примеры масс-спектрометрического анализа исходных легких цепей (LC) xi1-55-2 и xi33O11 (A и B соответственно), CYS80-конъюгированных LC xi1-55-2-DBCO и xi33O11-DBCO (C и D соответственно) и CYS80- конъюгированных LC xi1-55-2-Aβ(1-16) и xi33O11-Aβ(1-16) (E и F соответственно).

[0036] На Фигуре 23 показан пример схемы получения антиген-связывающих молекул. Иммуноглобулины, происходящие от кролика, можно расщеплять с помощью папаина для получения Fab-фрагмента. Первый Fab можно инкубировать с малеимидо-DBCO и второй Fab можно инкубировать малеимидо-азидом. Первый и второй Fab можно объединять с получением биспецифичной связывающей молекулы Fab-Fab. SPAAC = облегченное напряжением конъюгирование алкин-азид.

подробное описание иллюстративных вариантов реализации изобретения

[0037] Совместное рассмотрение следующего далее подробного описания с сопутствующими графическими материалами, образующими часть настоящего изобретения, позволяет лучше понять описанные способы, конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей. Следует понимать, что описанные способы, конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей не ограничиваются конкретными вариантами реализации, описанными и/или показанными в настоящей заявке, и что терминология, используемая в настоящей заявке, приведена исключительно для описания конкретных вариантов реализации в качестве примера и не ограничивает заявленные способы, конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей.

[0038] Если иное специально не указано, предполагается, что любое описание, имеющее отношение к возможному механизму или способу действия или причине улучшения, приведено исключительно в качестве иллюстрации, и описанные способы, конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей не ограничиваются точностью или неточностью описания любого такого предполагаемого механизма или способа действия или причины улучшения.

[0039] На протяжении настоящей заявки описаны конъюгированные иммуноглобулины, антиген-связывающие молекулы, иммуноглобулины и вариабельные области легких цепей и способы их получения. Когда в описании описан или заявлен признак или вариант реализации изобретения, связанный с конъюгированным иммуноглобулином, антиген-связывающей молекулой, иммуноглобулином или вариабельной областью легкой цепи, такой признак или вариант реализации изобретения в равной степени применим к способам их получения. Подобным образом, когда в описание описан или заявлен признак или вариант реализации изобретения, связанный со способом создания конъюгированного иммуноглобулина, антиген-связывающей молекулы, иммуноглобулина или вариабельной области легкой цепи, такой признак или вариант реализации изобретения в равной степени применим к конъюгированному иммуноглобулину, антиген-связывающей молекуле, иммуноглобулину или вариабельной области легкой цепи.

[0040] Ссылка на конкретное числовое значение включает по меньшей мере указанное конкретное значение, если иное явно не следует из контекста. Когда приведен диапазон значений, другой вариант реализации изобретения включает значения от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Кроме того, ссылка на значения, указанные в диапазонах, включает все и каждое значение в пределах указанного диапазона. Все диапазоны являются инклюзивными и комбинируемыми.

[0041] Когда значения представлены в виде приблизительных значений, которым предшествует уточнение «приблизительно», следует понимать, что конкретное значение представляет собой другой вариант реализации изобретения.

[0042] Следует иметь в виду, что конкретные признаки описанных способов, конъюгированных иммуноглобулинов, антиген-связывающих молекул, иммуноглобулинов и вариабельных областей легких цепей, которые для ясности описаны в настоящей заявке в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть предложены в комбинации в одном варианте реализации изобретения. Напротив, различные признаки описанных способов, конъюгированных иммуноглобулинов, антиген-связывающих молекул, иммуноглобулинов и вариабельных областей легких цепей, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации изобретения, также могут быть представлены раздельно или в любой частичной комбинации.

[0043] Употребление в настоящей заявке предметов в единственном числе включает множественное число указанных предметов.

[0044] Предполагается, что термин «содержащий» включает примеры, включенные в термины «состоящий по существу из» и «состоящий из»; подобным образом, предполагается, что термин «состоящий по существу из» включает примеры, включенные в термин «состоящий из».

[0045] Различные термины, имеющие отношение к аспектам описания, используются на протяжении заявки и формулы изобретения. Такие термины следует рассматривать в их обычном значении, принятом в данной области техники, если иное специально не указано. Понимание других терминов, имеющих специфические определения, должно быть совместимым с определениями, предложенными в настоящей заявке.

[0046] Термин «приблизительно» при использовании со ссылкой на числовые диапазоны, пределы или конкретные значения указывает на то, что перечисленные значения могут варьировать в пределах 10% от указанного значения. Таким образом, термин «приблизительно» при его употреблении включает отклонения ± 10% или менее, отклонения ± 5% или менее, отклонения ± 1% или менее, отклонения ± 0,5% или менее или отклонения ± 0,1% или менее от конкретно указанного значения.

[0047] При использовании в настоящей заявке термин «биологический образец» относится к образцу, полученному от субъекта, включая образец биологической ткани или жидкости, полученный in vivo или in vitro. Такие образцы могут представлять собой, но не ограничиваются указанными, биологическую жидкость (например, кровь, плазму крови, сыворотку крови, молоко, спинно-мозговую жидкость, асциты или мочу), органы, ткани, фракции и клетки, выделенные из организма млекопитающих, включая людей. Биологические образцы также могут включать срезы образца, полученного от субъекта, включая ткани (например, срезы частей органа или ткани). Биологические образцы также могут включать экстракты из образца, полученного от субъекта, например, антиген из биологической жидкости (например, крови или мочи).

[0048] Термин «кэпирующий цистеин» относится к свободному цистеину из раствора, который образует дисульфидную связь с Cys80 вариабельной области легкой цепи.

[0049] Термин «гибридизованный», «гибридный», «гибридное антитело» и подобные термины относятся к иммуноглобулину, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, т.е. антиген-связывающий участок, из одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи, происходящей из другого источника или вида. Эти части можно соединять вместе химическим путем с помощью стандартных методов (например, синтетических) или получать в виде непрерывного полипептида с помощью методов генетической инженерии (например, можно осуществлять экспрессию ДНК, кодирующей части белка гибридного антитела, с получением непрерывной полипептидной цепи). Примеры гибридных иммуноглобулинов включают иммуноглобулины, содержащие вариабельную область, происходящую от кролика, и константную область, происходящую от человека. Такие гибридные иммуноглобулины, происходящие от кролика/человека, представляют собой продукт экспрессии генов иммуноглобулина, содержащий сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина, происходящие от кролика, и сегменты ДНК, кодирующие константные области, происходящие от человека. Другие формы «гибридных иммуноглобулинов», включенные в настоящее изобретение, представляют собой формы, в которых класс или подкласс иммуноглобулина модифицирован или изменен по сравнению с классом исходного иммуноглобулина (также называемые «иммуноглобулины с переключением классов»). На протяжении настоящей заявки гибридные иммуноглобулины в соответствии с настоящим изобретением обозначены «xi.», термин «гибридный иммуноглобулин» и подобные термины относятся к последовательности иммуноглобулина, а не к процессу, используемому для создания антитела.

[0050] При использовании в настоящей заявке «Cys80» относится к цистеиновому остатку в положении аминокислоты 80 вариабельной области легкой цепи в контексте вариабельной области легкой цепи с отсутствием лидирующей последовательности. Например, вариабельные области легких цепей, описанные в таблице 25, содержат лидирующую последовательность из 19 аминокислот (кодируемых 57 нуклеотидами). «Cys80» встречается в положении аминокислоты 99, когда присутствует лидирующая последовательность, и в положении аминокислоты 80, когда лидирующая последовательность отсутствует. Нумерация Cys80 основана на номенклатуре Kabat/Chothia.

[0051] Термин «декэпирование» относится к удалению кэпирующего цистеина с использованием способов, предложенных в настоящей заявке, в условиях, которые минимизируют разрушение нативных дисульфидных связей внутри и между цепями иммуноглобулина.

[0052] Термин «иммуноглобулин, происходящий из» относится к иммуноглобулинам или их частям, содержащим по меньшей мере CDR-области иммуноглобулина, происходящие от кролика. «Иммуноглобулин, полученный из», включает гибриды, происходящие от кролика/человека, или гуманизированные иммуноглобулины, происходящие от кролика. Степень вариабельности, допустимой при получении иммуноглобулина из кролика, может быть определена, например, Советом Соединенных Штатов по принятым наименованиям (USAN) Американской медицинской ассоциации (AMA).

[0053] При использовании в настоящей заявке «функциональный агент» относится к агенту, обладающему терапевтическим, диагностическим или другим функциональным свойством (свойствами). Различные функциональные агенты, которые включены в объем настоящего изобретения, описаны в другом месте в настоящей заявке.

[0054] Термин «гуманизированный», «гуманизированный иммуноглобулин» и подобные термины относятся к иммуноглобулинам, происходящим от кролика, в которых аминокислотные последовательности в пределах вариабельных областей заменены на последовательности, имеющие гомологию с вариабельной областью, происходящей от человека. Примеры гуманизированных иммуноглобулинов могут содержать вариабельный домен кролика, в котором остатки в пределах каркасной области (FWR) и/или CDR-областей заменены на последовательности, гомологичные иммуноглобулину человека. В некоторых примерах остатки FWR-области иммуноглобулина, происходящего от кролика, не заменены на соответствующие остатки, происходящие от человека. В качестве альтернативы, «гуманизированный», «гуманизированный иммуноглобулин» и подобные термины могут относиться к иммуноглобулинам человеческой природы, в которых остатки в пределах области FWR и/или CDR-областей заменены на последовательности, гомологичные иммуноглобулину, происходящему от кролика. Например, гуманизированные иммуноглобулины могут представлять собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из гипервариабельной области иммуноглобулина человека заменены на остатки из гипервариабельной области иммуноглобулина, происходящего от кролика, имеющей желаемую специфичность, аффинность и активность. Кроме того, гуманизированные иммуноглобулины могут содержать остатки, которые не встречаются в иммуноглобулине-реципиенте или иммуноглобулине-доноре. Указанные модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик иммуноглобулина. В целом, гуманизированный иммуноглобулин содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных участков соответствуют участкам иммуноглобулина не происходящего от человека и все или по существу все из FWR-областей представляют собой последовательности FWR иммуноглобулина человека. Гуманизированный иммуноглобулин может необязательно также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, константной области иммуноглобулина человека. См., например, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Согласно настоящему изобретению, на протяжении данной заявки «гуманизированные иммуноглобулины» обозначаются как «zu.», «гуманизированный иммуноглобулин» и подобные термины относятся к последовательности иммуноглобулина, а не к процессу, используемому для получения иммуноглобулина.

[0055] Термин «иммуноглобулин-донор» относится к иммуноглобулину, не происходящему от человека, который предоставляет аминокислотные последовательности вариабельных областей, CDR, или других функциональных фрагментов или их аналогов для гуманизированного иммуноглобулина и, таким образом, придает гуманизированному иммуноглобулину антигенную специфичность и нейтрализует активность, характерную для иммуноглобулина-донора.

[0056] Термин «иммуноглобулин-реципиент» относится к иммуноглобулину, гетерологичному по отношению к иммуноглобулину-донору, который предоставляет аминокислотные последовательности каркасных областей тяжелой и/или легкой цепи и/или константных областей тяжелой и/или легкой цепи для гуманизированного иммуноглобулина. Иммуноглобулин-реципиент может происходить из любого млекопитающего. Согласно предпочтительному варианту реализации, иммуноглобулин-реципиент не является иммуногенным у людей. Предпочтительно, иммуноглобулин-реципиент представляет собой иммуноглобулин человека.

[0057] «Гуманизация» относится к процессу создания гуманизированного иммуноглобулина и включает любой процесс для создания гуманизированных иммуноглобулинов, обладающих указанными выше характеристиками, включая, но не ограничиваясь указанными, гуманизация in silico, встраивание CDR вида/хозяина в иммуноглобулины человека, замену остатков каркасной области гибридного иммуноглобулина для ее совпадения с соответствующей каркасной областью человека и т.д.

[0058] «Гидрофобная аминокислота» относится к аминокислоте, обладающей превышающей ноль гидрофобность в соответствии с нормированной одобренной шкалой гидрофобности по Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Кодируемые генами гидрофобные аминокислоты включают Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G), и Tyr (Y).

[0059] «Иммуноглобулин» при использовании в настоящей заявке относится к белку, содержащему один или более полипептидов, по существу кодирующихся генами иммуноглобулина, включая легкие каппа- и лямбда-цепи и тяжелые альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-цепи. Полноразмерные «легкие цепи» иммуноглобулина (приблизительно 25 кД или 214 аминокислот) кодируются геном вариабельной области на NH2-конце (приблизительно 110 аминокислот) и геном константной области каппа- или лямбда-цепи на COOH-конце. Полноразмерные «тяжелые цепи» иммуноглобулина (приблизительно 50 кД или 446 аминокислот) подобным образом кодируются геном вариабельной области (приблизительно 116 аминокислот) и одним из других перечисленных выше генов константной области, например, гамма-цепи (кодирует приблизительно 330 аминокислот). «Иммуноглобулины» включают: (a) полипептиды иммуноглобулина, т.е. полипептиды семейства иммуноглобулинов, которые содержат антиген-связывающий сайт, который специфично связывается со специфическим антигеном (например, MSLN, CA9, TEM1 и т.д.), включая все изотипы иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD и IgY), классы (например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), подклассы и различные мономерные и полимерные формы каждого изотипа, если иное специально не указано; и (b) варианты таких полипептидов иммуноглобулинов с консервативными заменами, которые иммуноспецифично связываются с антигеном (например, MSLN, CA9, TEM1 и т.д.). Иммуноглобулины в целом описаны, например, в источнике Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

[0060] Одна из форм иммуноглобулина, описанных в настоящей заявке, представляет собой основную структурную единицу антитела. Например, антитело может включать тетрамер и состоять из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, где каждая пара содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь. В целом, в каждой паре вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи вместе отвечают за связывание с антигеном, и константные области отвечают за эффекторные функции антитела.

[0061] Помимо антител, иммуноглобулины могут существовать в различных других формах, включая, например: антиген-связывающие фрагменты или части иммуноглобулина, такие как Fv, Fab, (Fab')₂и Fv фрагменты; и альтернативные формы антител, такие как одноцепочечные иммуноглобулины (scFV и scFab), диатела, триатела, тетратела, линейные антитела и мультиспецифичные антитела, например. См., например, James D. Marks, Antibody Engineering, Chapter 2, Oxford University Press (1995) (Carl K. Borrebaeck, Ed.)

[0062] При использовании в настоящей заявке, термин «иммуноспецифичный» относится к способности иммуноглобулина специфично связываться с антигеном, против которого указанный иммуноглобулин был создан, и не специфично связываться с другими пептидами или белками. Иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с антигеном, против которого указанный иммуноглобулин был создан, может не связываться с другими полипептидами или белками или может связываться с другими полипептидами или белками с более низкой аффинностью связывания по сравнению с антигеном, против которого указанный иммуноглобулин был создан, по результатам, например, иммунологического анализа, анализа BIAcore или других анализов, известных в данной области техники. Иммуноглобулин иммуноспецифично связывается с антигеном, против которого он был получен, когда указанный иммуноглобулин связывается с указанным антигеном с более высокой аффинностью связывания по сравнению с любым кросс-реактивным антигеном, по результатам экспериментальных методов, включая, но не ограничиваясь указанными, радиоиммунологические анализы (РИА) и иммуноферментные анализы (ИФА) (обсуждение, касающееся специфичности антител, см., например, в источнике Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989).

[0063] Термин «линкер» при использовании в настоящей заявке относится к спейсеру, который может представлять собой прямую или разветвленную цепь для связывания иммуноглобулина (через способную реагировать с тиолом группу неспаренного Cys80) с функциональным агентом. Такие линкеры могут быть расщепляемыми (например, кислотонеустойчивыми или поддающимися расщеплению протеазами) или нерасщепляемыми.

[0064] Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое происходит из единственного клеточного клона, включая любой клон эукариотической или прокариотической клетки или фага, и не относится к способу, с помощью которого производится указанное антитело. Моноклональное антитело обладает моноспецифичностью связывания и аффинностью в отношении конкретного эпитопа. Термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителом, полученным с помощью гибридомной технологии.

[0065] Термин «нативный» относится к последовательности иммуноглобулина дикого типа из видов, в которых указанный иммуноглобулин был получен. Например, согласно вариантам реализации изобретения, при которых Cys80 присутствует в вариабельной области легкой цепи вида, из которого он получен, считается, что Cys80 присутствует в нативной вариабельной области легкой цепи.

[0066] При использовании в настоящей заявке термин «процентная идентичность» и подобные ему термины используются для описания отношений по последовательностям между двумя или более нуклеиновыми кислотами, полинуклеотидами, белками или полипептидами и понимаются в контексте и вместе с такими терминами, как: (a) эталонная последовательность, (b) окно сравнения, (c) идентичность по последовательности и (d) процентная идентичность по последовательности.

(a) «Эталонная последовательность» представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой часть или целую конкретную последовательность; например, сегмент полноразмерной последовательности кДНК или гена или полную последовательность кДНК или гена. Для полипептидов примеры длины эталонной полипептидной последовательности включают по меньшей мере приблизительно 16 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 35 аминокислот, по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот или по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот. Для нуклеиновых кислот примеры длины эталонной последовательности нуклеиновой кислоты включают по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 100 нуклеотидов или по меньшей мере приблизительно 300 нуклеотидов или любое целое число около или между указанными значениями.

(b) «Окно сравнения» включает ссылку на непрерывный и точно определенный участок последовательности полинуклеотида или полипептида, где указанную последовательность полинуклеотида или полипептида можно сравнивать с эталонной последовательностью и где часть указанной полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать вставки, замены или делеции (т.е., пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит указанные вставки, замены или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Примеры окон сравнения могут представлять собой по меньшей мере 20 непрерывно расположенных нуклеотидов или аминокислот в длину и необязательно могут содержать 30, 40, 50, 100 или более нуклеотидов или аминокислот. Специалисту в данной области техники ясно, что во избежание недостоверного завышения подобия с эталонной последовательностью из-за включения пробелов, как правило, в последовательность полинуклеотида или полипептида вводят «штраф» за внесение пробела, который вычитают из количества совпадений.

(c) Способы выравнивания последовательностей для их сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения можно проводить с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита-Уотермана (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981); алгоритма выравнивания областей гомологии Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970); с помощью метода поиска сходства по Пирсону-Липману (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988); с помощью автоматизированного выполнения указанных алгоритмов, включая, но не ограничиваясь указанными: CLUSTAL в программе PC/Gene от компании Intelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Группа (GCG), 7 Science Dr., Мэдисон, Висконсин, США. Программа CLUSTAL хорошо описана Хиггинсом и Шарпом (Higgins и Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988) и в источниках Corpet, et al., Nucleic Acid Research, 16:881-90, 1988; Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:1-6, 1992; и Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:7-331, 1994. Семейство программ BLAST, которые можно использовать для поиска подобий в базах данных включает: программу BLASTN для запрашиваемой нуклеотидной последовательностей против базы данных нуклеотидных последовательностей; BLASTX для запроса нуклеотидных последовательностей против базы данных белковых последовательностей; BLASTP для запроса белковых последовательностей против базы данных белковых последовательностей; TBLASTN для запроса белковых последовательностей против базы данных нуклеотидных последовательностей и TBLASTX для запроса нуклеотидных последовательностей против базы данных нуклеотидных последовательностей (см., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995). В будущем несомненно появятся новые версии указанных выше программ или новые программы, которые можно будет использовать совместно с настоящим изобретением.

(d) «Процентная идентичность» означает значение, определенное путем сравнения двух оптимально выровненных по окну сравнения последовательностей, где часть последовательности полинуклеотида или полипептида в окне сравнения может содержать вставки, замены или делеции (т.е., пробелы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит указанных вставок, замен или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых одно и то же нуклеиновое основание или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, с определением количества совпадающих положений, деления указанного количества совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процентной идентичности по последовательности.

[0067] «Фармацевтически эффективное количество» относится к количеству иммуноглобулина, которое обеспечивает лечение субъекта.

[0068] «Полярная аминокислота» относится к гидрофильной аминокислоте, содержащей боковую цепь, которая является незаряженной при физиологическом значении pH, но содержит по меньшей мере одну связь, в которой пара электронов, принадлежащих одновременно двум атомам, располагается ближе к одному из атомов. Кодируемые генами полярные аминокислоты включают Asn (N), Gln (Q) Ser (S) и Thr (T).

[0069] Термин «субъект» при использовании в настоящей заявке относится к человеку или отличному от человека организму. Таким образом, способы, иммуноглобулины и конъюгированные иммуноглобулины, описанные в настоящей заявке, применимы для лечения заболеваний и состояний как человека, так и животных. Субъекты могут представлять собой «пациентов», т.е. живого человека или отличный от человека организм, которому проводят медицинское лечение заболевания или состояния, или человека или отличный от человека организм, не страдающий определенным заболеванием, которому проводят исследование для выявления признаков патологии или наличия/отсутствия конкретного состояния.

[0070] Термин «замена» относится к замещению (замене) одного аминокислотного остатка на другой. «Замена» включает, например, миссенс-мутации в одной или более пар оснований ДНК, кодирующей аминокислотный остаток, или конструирование белка с заменой одной аминокислоты на другую.

[0071] При использовании в настоящей заявке термин «лечение» и подобные ему термины относятся к снижению тяжести и/или частоты симптомов заболевания, устранению симптомов заболевания и/или причины, обуславливающей указанные симптомы, снижению частоты или вероятности появления симптомов заболеваний и/или причины, обусловливающей указанные симптомы, и улучшению или восстановлению повреждения, прямо или косвенно вызванного заболеванием. Примеры заболеваний включают рак, но не ограничиваются указанным.

[0072] «Реагирующая с тиолом группа» относится к реагенту или группе, которая может образовывать ковалентную связь с тиоловой группой цистеина.

[0073] «Неспаренный Cys80» относится к Cys80, присутствующему в иммуноглобулине и содержащему тиоловую функциональную группу, которая не вовлечена во внутримолекулярную или межмолекулярную дисульфидную связь. Например, тиоловая функциональная группа «неспаренного Cys80» не вовлечена в дисульфидную связь с Cys171.

[0074] При использовании в настоящей заявке термин «идентичный на 90%» включает идентичность эталонному элементу (например, биологической последовательности) по меньшей мере на 90%, на 91%, на 92%, на 93%, на 94%, на 95%, на 96%, на 97%, на 98%, на 99% или на 100%.

[0075] Следующие далее сокращения используются на протяжении всей заявки: конъюгаты антитела и лекарственного средства (ADC); лекарственное средство-антитело (DAR); каркасная область (FWR); определяющая комплементарность область (CDR); карбоангидраза IX (CA9); мезотелин (MSLN); ауристатин F (AuF); вариабельная область тяжелой цепи (VH); вариабельная область легкой цепи (VL); вариабельная область каппа-цепи (Vκ); происхождение от кролика (Rb; rabb); константная область гамма-цепи (Cγ); константная область каппа-цепи (Cκ); моноклональное антитело (mAb); цистеин в положении аминокислоты 80 (Cys80).

Получение конъюгированных иммуноглобулинов

[0076] В настоящей заявке описаны способы получения конъюгированных иммуноглобулинов, включающие:

декэпирование цистеина в положении аминокислоты 80 («Cys80») в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, происходящего от кролика, где указанный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и

конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0077] Подходящие вариабельные области легких цепей включают, например, вариабельную область легкой каппа-цепи. Вариабельные области легких цепей описанных иммуноглобулинов происходят от кролика. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, Cys80 может присутствовать в нативной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, происходящего от кролика. Примеры кроликов, из которых может происходить вариабельная область легкой цепи, содержащая Cys80, включают кролика вида Oryctolagus cuniculus, но не ограничиваются указанным. В некоторых аспектах, вариабельная область легкой цепи может, например, происходить из новозеландского белого кролика (NZW). Согласно другим аспектам, вариабельная область легкой цепи может происходить из кролика b9.

[0078] Примеры способов декэпирования Cys80 в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина включают инкубирование иммуноглобулина с восстанавливающим буфером с последующим инкубированием указанного иммуноглобулина с окисляющим буфером. Восстанавливающие буферы содержат один или более восстанавливающих агентов. Подходящие восстанавливающие агенты включают, например, цистеин (включая L-цистеин и D-цистеин), 2-меркаптоэтиламин, трис(2-карбоксиэтил)фосфин, 2-меркаптоэтансульфоновую кислоту, 2-меркаптопропионовую кислоту или их комбинации. Согласно предпочтительным вариантам реализации, восстанавливающий буфер может содержать мягкий восстановитель, такой как цистеин. Концентрация восстанавливающего агента может варьировать от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 2 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 70 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 10 мМ или от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 5 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 0,2 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 1 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 2 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 5 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 10 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 15 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 20 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 25 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 30 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 40 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 50 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 60 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 70 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 80 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 90 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 100 мМ.

[0079] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент, например, может содержать от приблизительно 2 мМ до приблизительно 10 мМ цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 2 мМ до приблизительно 10 мМ D-цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 2 мМ до приблизительно 10 мМ L-цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ 2-меркаптоэтиламина. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 2 мМ до приблизительно 20 мМ 2-меркаптоэтансульфоновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий агент может содержать от приблизительно 2 мМ до приблизительно 20 мМ 2-меркаптопропионовой кислоты.

[0080] Восстанавливающий буфер может дополнительно содержать буферные агенты, такие как фосфат натрия, фосфат калия, MOPS, HEPES, борат натрия, борат калия или любую их комбинацию. Подходящие концентрации буферного агента включают, но не ограничиваются указанными, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 35 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ.

[0081] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать, например, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ фосфата натрия. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ фосфата калия. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ MOPS. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ HEPES. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ бората натрия. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, восстанавливающий буфер может содержать от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ бората калия.

[0082] Восстанавливающий буфер может дополнительно содержать хелатирующий агент, включая, но не ограничиваясь указанными, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту), DTPA (диэтилентриаминпентауксусную кислоту) или их комбинацию. Подходящие концентрации хелатирующих агентов включают от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ.

[0083] Подходящие диапазоны значения pH восстанавливающего буфера включают от приблизительно 6,8 до приблизительно 8,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 6,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 6,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 7,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH восстанавливающего буфера может составлять приблизительно 8,0.

[0084] Иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение от приблизительно 12 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 18 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 30 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 42 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 54 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 90 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 78 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 66 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 54 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 42 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 36 часов или от приблизительно 12 часов до приблизительно 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 18 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 24 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 42 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 54 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 60 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 66 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 72 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 78 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 84 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 90 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение приблизительно 96 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с восстанавливающим буфером в течение более чем 96 часов.

[0085] Подходящие окисляющие буферы включают, но не ограничиваются указанными, буферы на основе Трис-буфера, глутамина, аргинина или другие буферы на основе аминокислоты или первичного амина. Концентрация окисляющего буфера может варьировать от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 80 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 80 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 60 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 20 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 25 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 30 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 40 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 50 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 60 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 70 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 80 мМ. Концентрация окисляющего буфера может составлять приблизительно 90 мМ. Концентрация восстанавливающего агента может составлять приблизительно 100 мМ.

[0086] Иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение от приблизительно 24 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 30 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 42 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 48 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 54 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 90 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 84 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 78 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 72 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 66 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 54 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 42 часов или от приблизительно 24 часов до приблизительно 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 24 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 42 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 54 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 60 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 66 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 72 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 78 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 84 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 90 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение приблизительно 96 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин можно инкубировать с окисляющим буфером в течение более чем 96 часов.

[0087] Подходящие диапазоны pH окисляющего буфера включают от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 7,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 7,6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 7,7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 7,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 7,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 8,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH окисляющего буфера может составлять приблизительно 9,0.

[0088] Способ может дополнительно включать осуществление иммобилизации иммуноглобулина на подложке (матрице) перед осуществлением инкубирования с восстанавливающим агентом и элюирование указанного иммуноглобулина из подложки после инкубирования с окисляющим буфером. Подходящие подложки включают любую поверхность, с которой иммуноглобулин может связываться и из которой его можно элюировать, включая, но не ограничиваясь указанными, белок A, белок G, белок L, антитело против Fab-фрагмента, антитело против Fc-фрагмента, аффинные подложки на основе антител против mAb и сильные катионообменные смолы. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может представлять собой белок A. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может представлять собой белок G. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может представлять собой белок L. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может содержать антитело против Fab-фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может содержать антитело против Fc-фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может содержать антитела против mAb. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, подложка может содержать сильную катионообменную смолу.

[0089] Описанные способы декэпирования иммуноглобулина могут включать: уравновешивание подложки; иммобилизацию иммуноглобулина на подложке; инкубирование иммобилизированного иммуноглобулина на подложке с восстанавливающим буфером для удаления кэпирующей группы; инкубирование иммобилизированного иммуноглобулина на подложке с окисляющим буфером; элюирование иммуноглобулина из подложки и нейтрализация иммуноглобулина.

[0090] Специалистам в данной области техники очевидно, что буфер, концентрация, pH и время элюирования иммуноглобулина из подложки зависит, по меньшей мере отчасти, от подложки. Например, согласно вариантам реализации, при которых подложка представляет собой белок A, иммуноглобулин можно элюировать из белка A с применением глицина (например, 0,1 M глицина при pH 2,9). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, элюирование можно осуществлять при низком значении pH буфера.

[0091] Нейтрализация иммуноглобулина может включать инкубирование указанного иммуноглобулина в буфере на основе Трис-буфера, фосфата натрия или фосфата калия (называемом в настоящей заявке также «нейтрализующий буфер»). Концентрация нейтрализующего буфера может составлять от приблизительно 0,5 M до приблизительно 2 M, и значение pH указанного буфера может составлять от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,5.

[0092] Конъюгирование можно осуществлять путем растворения реагирующего с тиолом соединения в смеси для растворения и инкубирования растворенного реагирующего с тиолом соединения с иммуноглобулином в буфере для конъюгации.

[0093] Для нерастворимых в воде реагирующих с тиолом соединений, которые могут включать соединения на основе малеимида, но не ограничиваются ими, подходящие растворы для растворения включают органические смешивающиеся с водой растворители, такие как диметилсульфоксид (ДМСО). Для водорастворимых реагирующих с тиолом соединений подходящие растворы для растворения включают, но не ограничиваются указанными, водные или водные буферные растворы, такие как фосфатно-солевой буфер, pH 7,2 (1 x PBS).

[0094] Подходящие концентрации реагирующих с тиолом соединений включают от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 55 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 70 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 10 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 20 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 30 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 40 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 50 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 60 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 70 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 80 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 90 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация реагирующего с тиолом соединения может составлять приблизительно 100 мМ.

[0095] Подходящие концентрации иммуноглобулина включают от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 15 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 12 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 2 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 0,1 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 0,5 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 1 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 2 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 5 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 10 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 15 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация иммуноглобулина может составлять приблизительно 20 мг/мл.

[0096] Подходящие отношения реагирующего с тиолом соединения к иммуноглобулину включают от приблизительно 3:1 до 20:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 3:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 4:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 5:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 6:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 7:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 8:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 9:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 10:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 11:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 12:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 13:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 14:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 15:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 16:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 17:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 18:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 19:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин может составлять 20:1.

[0097] Инкубирование можно осуществлять в ряде подходящих буферов для конъюгации, включая, например, 1xPBS, pH 7,2, фосфат натрия, фосфат калия, борат натрия и HEPES. Концентрация буфера для конъюгации включает от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 45 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 90 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 45 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 10 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 20 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 30 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 40 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 50 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 60 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 70 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 80 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 90 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация буфера для конъюгации может составлять приблизительно 100 мМ.

[0098] Буфер для конъюгации дополнительно может содержать хлорид натрия. Подходящие концентрации хлорида натрия включают от приблизительно 0 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 400 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0 мМ до приблизительно 50 мМ или от приблизительно 0 мМ до приблизительно 25 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 25 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 50 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 75 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 100 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 150 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 200 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 250 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 300 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 350 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 400 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация хлорида натрия может составлять приблизительно 500 мМ.

[0099] Значение pH буфера для конъюгации может составлять от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 6,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 6,6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 6,7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 6,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 6,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 7,9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,0. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, значение pH буфера для конъюгации может составлять приблизительно 8,5.

[0100] Для облегчения растворения реагирующего с тиолом соединения в буфере для конъюгации конечная концентрация органического смешиваемого с водой растворителя в буфере для конъюгации может составлять от приблизительно 0% до приблизительно 20%, от приблизительно 2% до приблизительно 20%, от приблизительно 5% до приблизительно 20%, от приблизительно 8% до приблизительно 20%, от приблизительно 11% до приблизительно 20%, от приблизительно 16% до приблизительно 20%, от приблизительно 0% до приблизительно 18%, от приблизительно 0% до приблизительно 15%, от приблизительно 0% до приблизительно 12%, от приблизительно 0% до приблизительно 10%, от приблизительно 0% до приблизительно 8%, от приблизительно 0% до приблизительно 6% или от приблизительно 0% до приблизительно 2%.

[0101] Буфер для конъюгации может дополнительно содержать пропиленгликоль для облегчения растворения реагирующего с тиолом соединения в буфере для конъюгации. Подходящие концентрации пропиленгликоля включают от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 30% до приблизительно 50%, от приблизительно 40% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 10% до приблизительно 30% или от приблизительно 10% до приблизительно 20%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация пропиленгликоля может составлять приблизительно 10%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация пропиленгликоля может составлять приблизительно 20%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация пропиленгликоля может составлять приблизительно 30%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация пропиленгликоля может составлять приблизительно 40%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация пропиленгликоля может составлять приблизительно 50%.

[0102] Буфер для конъюгации может дополнительно содержать неионный детергент для облегчения растворения конъюгированного иммуноглобулина в буфере для конъюгации. Примеры неионных детергентов включают полисорбат-20 или полисорбат-80, но не ограничиваются указанными. Подходящие концентрации неионного детергента включают от приблизительно 0% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,3% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,7% до приблизительно 1%, от приблизительно 0% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0% до приблизительно 0,4% или от приблизительно 0% до приблизительно 0,2%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,1%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,2%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,3%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,4%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,5%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,6%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,7%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,8%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 0,9%. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, концентрация неионного детергента может составлять приблизительно 1,0%.

[0103] Инкубирование можно осуществлять в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 6 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 12 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 24 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 30 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 36 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 42 часов до приблизительно 48 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 42 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 36 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 30 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 24 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 18 часов, в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 12 часов или в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 6 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 2 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 6 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 18 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 24 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 42 часов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять в течение 48 часов.

[0104] Температура инкубирования может составлять от приблизительно 18ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 20ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 22ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 24ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 26ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 28ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 30ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 32ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 34ºC до приблизительно 37ºC, от приблизительно 18ºC до приблизительно 34ºC, от приблизительно 18ºC до приблизительно 32ºC, от приблизительно 18ºC до приблизительно 30ºC, от приблизительно 18ºC до приблизительно 28ºC, от приблизительно 18ºC до приблизительно 26ºC или от приблизительно 18ºC до приблизительно 24ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 18ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 20ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 22ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 24ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 26ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 28ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 30ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 32ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 34ºC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, инкубирование можно осуществлять при 37ºC.

[0105] Не связанные реагирующие с тиолом соединения можно отделять от конъюгированного иммуноглобулина с помощью хроматографии с обессоливанием с применением ряда подходящих смол, включая, но не ограничиваясь указанными, смолу G-25, смолу G-50, Biogel P10 или другие смолы с эксклюзионным пределом в диапазонах 5,000-10,000 Да. Хроматографию можно осуществлять на колонке или спин-колонке в зависимости от объема. Подходящие буферы для обессоливания включают, например, 1xPBS, фосфат натрия, фосфат калия, борат натрия, или же буферы на основе HEPES могут заменять 1x PBS.

[0106] Согласно типичным вариантам реализации изобретения, конъюгирование можно осуществлять путем растворения реагирующего с тиолом соединения на основе малеимида в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) при конечной концентрации реагирующего с тиолом соединения 10 мМ. Растворенное реагирующее с тиолом соединение затем можно инкубировать с иммуноглобулином при концентрации иммуноглобулина 5 мг/мл в 1xPBS, pH 7,2, при молярном отношении реагирующее с тиолом соединение:иммуноглобулин 5:1 при тщательном перемешивании. Инкубирование можно осуществлять в течение 24 часов при 22ºC. Невключенное в иммуноглобулин реагирующее с тиолом соединение можно отделять от конъюгированного иммуноглобулина с помощью хроматографии с обессоливанием с применением смолы G-25 с использованием 1x PBS в качестве электродного буфера.

[0107] Предпочтительно, реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с Cys80 через способную реагировать с тиолом группу. Способные реагировать с тиолом группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилoилы, арилирующие агенты, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB-тиолы и дисульфид-восстанавливающие агенты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать малеимид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать галогенацетил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать азиридин. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать акрилоил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать арилирующий агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать винилсульфон. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать пиридилдисульфид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать TNB-тиол. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать дисульфид-восстанавливающий агент.

[0108] Способные реагировать с тиолом группы могут происходить из ряда подходящих реагентов, включая йодацетамиды, малеимиды, бензиловые галиды и бромметилкетоны, которые могут вступать в реакцию через S-алкилирование тиолов с образованием стабильных тиоэфирных продуктов.

[0109] Способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру. Линкеры могут представлять собой нерасщепляемые линкеры или расщепляемые линкеры. Примеры линкеров включают, например, содержащие дисульфид линкеры, линкеры на основе ацеталей и линкеры на основе кеталей. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой нерасщепляемый линкер. Подходящие нерасщепляемые линкеры включают, но не ограничиваются указанными, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или алкил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, линкер может содержать ПЭГ. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой расщепляемый линкер. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, валин-цитруллин-пара-аминобензил. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой содержащий дисульфид линкер. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой линкер на основе ацеталя. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой линкер на основе кеталя. Примеры линкеров, ковалентно присоединенных к способной реагировать с тиолом группе, описаны, например, в публикации заявки на патент США № 20140050746.

[0110] Реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент. Подходящие функциональные агенты включают, например, флуорофоры, флуоресцентные красители, полипептиды, иммуноглобулины, антибиотики, нуклеиновые кислоты, радионуклиды, химические линкеры, малые молекулы, хелаторы, липиды и лекарственные средства. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать флуорофор. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать флуоресцентный краситель. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать полипептид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать иммуноглобулин. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать антибиотик. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать нуклеиновую кислоту (такую как ДНК или РНК). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать радионуклид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать химический линкер (например, дибензилциклооктин (DBCO) или азид). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать малую молекулу. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать хелатор (например, DOTA, CHX-A”-DTPA, NOTA и др.). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать липид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать лекарственное средство. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать комбинацию любых из перечисленных выше функциональных агентов.

[0111] Реагирующее с тиолом соединение (т.е. первое реагирующее с тиолом соединение) может быть связано со вторым реагирующим с тиолом соединением, где указанное второе реагирующее с тиолом соединение связано со вторым иммуноглобулином, содержащим вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении аминокислоты 80 («Cys80²»), и где второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу, связанную с Cys80². Например, первое реагирующее с тиолом соединение и второе реагирующее с тиолом соединение могут содержать первый и второй химический линкер в качестве первого и второго функционального агента соответственно. Первый и второй химические линкеры можно соединять друг с другом с помощью ряда подходящих способов, включая, например, реакции клик-химии.

[0112] Согласно предпочтительному варианту реализации, Cys80 может быть неспаренным. Подходящие способы получения неспаренного Cys80 включают, например, гибридизацию вариабельной области легкой цепи, содержащей Cys80, с константным доменом, содержащим аминокислотный остаток в положении 171, отличный от цистеина.

[0113] Описанные способы можно осуществлять на гибридизованном иммуноглобулине. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин может представлять собой гибридизованный иммуноглобулин. Согласно вариантам реализации изобретения, при которых иммуноглобулин является гибридизованным, способы получения конъюгированного иммуноглобулина могут включать: декэпирование Cys80 в вариабельной области легкой цепи гибридного иммуноглобулина, где указанный гибридизованный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0114] В качестве альтернативы, описанные способы могут дополнительно включать гибридизацию иммуноглобулина до этапа декэпирования. Например, способы получения конъюгированного иммуноглобулина могут включать: гибридизацию иммуноглобулина, содержащего вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит Cys80; декэпирование указанного Cys80 и конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0115] Описанные способы можно осуществлять на гуманизированном иммуноглобулине. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин может представлять собой гуманизированный иммуноглобулин. Согласно вариантам реализации изобретения, при которых иммуноглобулин является гуманизированным, способы получения конъюгированного иммуноглобулина могут включать: декэпирование Cys80 в вариабельной области легкой цепи гуманизированного иммуноглобулина, где указанный гуманизированный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0116] В качестве альтернативы, описанные способы могут дополнительно включать гуманизацию иммуноглобулина до этапа декэпирования. Например, способы получения конъюгированного иммуноглобулина могут включать: гуманизацию иммуноглобулина, содержащего вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит Cys80; декэпирование Cys80 и конъюгирование реагирующего с тиолом соединения с Cys80, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0117] Способы могут дополнительно включать замену аминокислотного остатка в положении 83 на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys. Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на аланин («Ala83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на валин («Val83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на изолейцин («Ile83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на треонин («Thr83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на аргинин («Arg83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на аспарагин («Asn83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на аспарагиновую кислоту («Asp83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на глутаминовую кислоту («Glu83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на глутамин («Gln83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на глицин («Gly83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на гистидин («His83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на лейцин («Leu83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на метионин («Met83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на пролин («Pro83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на серин («Ser83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на триптофан («Trp83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену фенилаланина в положении 83 вариабельной области легкой цепи на тирозин («Tyr83»). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы могут включать замену аминокислотного остатка в положении 83 на полярную или гидрофобную аминокислоту, включая, но не ограничиваясь указанными, аланин, валин, изолейцин или треонин.

[0118] Аминокислотный остаток в положении 83, отличный от Phe, Lys или Cys, в комбинации с описанными способами декэпирования может вызывать снижение степени агрегации и повышать эффективность Cys80-конъюгации иммуноглобулина. Подходящая степень агрегации иммуноглобулина, достигаемая с помощью описанных способов, включает, например, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 12%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 17%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 22% или менее чем приблизительно 25%. Подходящая эффективность конъюгации, достигаемая с помощью описанных способов, включает, например, больше чем приблизительно 70%, больше чем приблизительно 73%, больше чем приблизительно 76%, больше чем приблизительно 79%, больше чем приблизительно 82%, больше чем приблизительно 85%, больше чем приблизительно 88%, больше чем приблизительно 91%, больше чем приблизительно 94%, больше чем приблизительно 97% или больше чем приблизительно 99%.

Способы получения антиген-связывающих молекул

[0119] Согласно настоящему изобретению также предложены способы получения антиген-связывающей молекулы, включающие инкубирование первого конъюгированного иммуноглобулина со вторым конъюгированным иммуноглобулином для получения указанной антиген-связывающей молекулы, где:

первый конъюгированный иммуноглобулин содержит первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, где указанная первая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80¹») и указанный Cys80¹ конъюгирован с первым реагирующим с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу; и

второй конъюгированный иммуноглобулин содержит вторую вариабельную области тяжелой цепи и вторую вариабельную область легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80²») и указанный Cys80² конъюгирован со вторым реагирующим с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0120] Антиген-связывающие молекулы включают мультивалентные и/или мультиспецифичные антиген-связывающие молекулы. Например, антиген-связывающие молекулы включают бивалентные, тривалентные и тетравалентные антиген-связывающие молекулы, которые являются моноспецифичными или биспецифичными. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться бивалентной и моноспецифичной. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться бивалентной и биспецифичной. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться тривалентной и моноспецифичной. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться тривалентной и биспецифичной. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться тетравалентной и моноспецифичной. Согласно некоторым аспектам, антиген-связывающая молекула может являться тетравалентной и биспецифичной. Согласно некоторым аспектам, валентность может превышать тетравалентность. Согласно некоторым аспектам, специфичность может превышать биспецифичность.

[0121] Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80² могут быть неспаренными. Подходящие способы получения неспаренного Cys80 включают, например, гибридизацию вариабельной области легкой цепи, содержащей Cys80, с константным доменом, содержащим в положении 171 аминокислотный остаток, отличный от цистеина.

[0122] Согласно некоторым аспектам, способы могут дополнительно включать декэпирование Cys80¹. Согласно некоторым аспектам, способы могут дополнительно включать декэпирование Cys80². Согласно другим аспектам, способы могут дополнительно включать декэпирование Cys80¹ и Cys80².

[0123] Декэпирование может включать инкубирование первого иммуноглобулина, второго иммуноглобулина или первого и второго иммуноглобулина с восстанавливающим буфером с последующим инкубированием указанного первого иммуноглобулина, второго иммуноглобулина или первого и второго иммуноглобулина с окисляющим буфером. Согласно некоторым аспектам способов получения антиген-связывающих молекул, декэпирование может дополнительно включать осуществлении иммобилизации первого иммуноглобулина, второго иммуноглобулина или первого и второго иммуноглобулина на подложке до этапа инкубирования с восстанавливающим буфером и элюирование указанного первого иммуноглобулин, второго иммуноглобулина или первого и второго иммуноглобулина из подложки после инкубирования с окисляющим буфером.

[0124] Подходящие условия декэпирования и конъюгации, включая восстанавливающие буферы, окисляющие буферы, концентрации, значения pH, временные интервалы и подложки, описаны в разделе под названием «Получение конъюгированных иммуноглобулинов» и в равной степени применимы согласно настоящему изобретению.

[0125] Согласно некоторым аспектам, способы могут дополнительно включать конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹, где указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу. Согласно некоторым аспектам, способы могут дополнительно включать конъюгирование второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80², где указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу. Согласно другим аспектам, способы могут дополнительно включать конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹ и второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80², где указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу, и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0126] Способы могут дополнительно включать декэпирование и конъюгирование. Например, способы могут дополнительно включать (до этапа инкубирования)

декэпирование Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80²; и

конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹, второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80² или конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹ и второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80², где указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу, и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0127] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулины могут быть гибридизованными. В других случаях способы могут дополнительно включать гибридизацию первого иммуноглобулина, гибридизацию второго иммуноглобулина или гибридизацию первого и второго иммуноглобулина. Способы, например, могут дополнительно включать до этапа инкубирования:

гибридизацию первого иммуноглобулина, содержащего Cys80¹, для создания первого гибридного иммуноглобулина;

гибридизацию второго иммуноглобулина, содержащего Cys80², для создания второго гибридного иммуноглобулина;

декэпирование Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80² и

конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹, второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80² или первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹ и второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80², где указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу, и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу,

но не ограничиваются указанными этапами.

[0128] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулины могут быть гуманизированными. В другом случае способы могут дополнительно включать гуманизацию первого иммуноглобулина, гуманизацию второго иммуноглобулина или гуманизацию первого и второго иммуноглобулина. Например, способы могут дополнительно включать до этапа инкубирования:

гуманизацию первого иммуноглобулина, содержащего Cys80¹ для создания первого гуманизированного иммуноглобулина;

гуманизацию второго иммуноглобулина, содержащего Cys80² для создания второго гуманизированного иммуноглобулина;

декэпирование Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80²; и

конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹, второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80² или конъюгирование первого реагирующего с тиолом соединения с Cys80¹ и второго реагирующего с тиолом соединения с Cys80², где указанное первое реагирующее с тиолом соединение содержит первую способную реагировать с тиолом группу, и указанное второе реагирующее с тиолом соединение содержит вторую способную реагировать с тиолом группу,

но не ограничиваются указанными этапами.

[0129] Предпочтительно, первое и второе реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с Cys80¹ и Cys80² соответственно через первую способную реагировать с тиолом группу и вторую способную реагировать с тиолом группу. Подходящие способные реагировать с тиолом группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилоилы, арилирующие агенты, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB-тиолы и дисульфид-восстанавливающие агенты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать малеимид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать галогенацетил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать азиридин. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать акрилоил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать арилирующий агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать винилсульфон. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать пиридилдисульфид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать TNB-тиол. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать дисульфид-восстанавливающий агент.

[0130] Первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут быть присоединены к линкеру. Согласно некоторым аспектам, первая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру («первый линкер»). Согласно некоторым аспектам, вторая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру («второй линкер»). Согласно другим аспектам первая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к первому линкеру, и вторая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена ко второму линкеру. Подходящие первый и второй линкеры могут представлять собой нерасщепляемые линкеры или расщепляемые линкеры. Примеры первого и второго линкеров включают, например, содержащие дисульфид линкеры, линкеры на основе ацеталей и линкеры на основе кеталей. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой нерасщепляемые линкеры. Подходящие нерасщепляемые линкеры включают полиэтиленгликоль (PEG) или алкил, но не ограничиваются указанными. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут содержать PEG. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой расщепляемый линкер. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, валин-цитруллин-парааминобензил. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой содержащий дисульфид линкер. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой линкер на основе ацеталя. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой линкер на основе кеталя. Примеры линкеров, ковалентно присоединенных к способной реагировать с тиолом группе, описаны, например, в публикации заявки на патент США № 20140050746.

[0131] Первое реагирующее с тиолом соединение, второе реагирующее с тиолом соединение или первое и второе реагирующее с тиолом соединение могут дополнительно содержать функциональный агент. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент («первый функциональный агент»). Согласно некоторым аспектам, второе реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент («второй функциональный агент»). Согласно другим аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать первый функциональный агент, и второе реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать второй функциональный агент.

[0132] Подходящие функциональные агенты включают, например, химические линкеры. Предпочтительно, химический линкер первого реагирующего с тиолом соединения («первый химический линкер») и химический линкер второго реагирующего с тиолом соединения («второй химический линкер») могут быть соединены. Например, один из первого и второго химического линкера может представлять собой дибензилциклооктин (DBCO), и другой из первого или второго химического линкера может представлять собой азид, но не ограничивается указанными соединениями. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый химический линкер, например, может представлять собой DBCO, и второй химический линкер может представлять собой азид. В противоположном случае первый химический линкер может представлять собой азид, и второй химический линкер может представлять собой DBCO. DBCO и азид можно соединять, что приводит к конъюгированию первого иммуноглобулина и второго иммуноглобулина. Например, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин можно конъюгировать друг с другом с помощью реакций клик-химии.

[0133] Согласно типичным вариантам реализации изобретения, способные реагировать с тиолом соединения могут включать малеимид-ПЭГ4-азид и малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может, например, представлять собой малеимид-ПЭГ4-азид, и второе реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин, и второе реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-азид.

[0134] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин могут представлять собой Fab-фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может представлять собой Fab («первый Fab»). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, второй иммуноглобулин может представлять собой Fab («второй Fab»). Согласно другим вариантам реализации, первый иммуноглобулин может представлять собой первый Fab, и второй иммуноглобулин может представлять собой второй Fab.

[0135] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы включают создание первого Fab, второго Fab или первого и второго Fab до этапа инкубирования. Подходящие способы создания Fab-фрагментов известны в данной области техники и включают, например, расщепление полноразмерного иммуноглобулина или части иммуноглобулина с получением Fab-фрагмента или экспрессию рекомбинантного иммуноглобулина в виде Fab-фрагмента. Например, способы создания антиген-связывающих молекул могут дополнительно включать (до этапа инкубирования)

расщепление первого иммуноглобулина, второго иммуноглобулина или первого и второго иммуноглобулина папаином для получения первого Fab, второго Fab или первого и второго Fab, где первый иммуноглобулин содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, и указанная первая легкая цепь содержит цистеин в положении 80 («Cys80¹»), и где второй иммуноглобулин содержит вторую тяжелую цепь и вторую легкую цепь, и указанная вторая легкая цепь содержит цистеин в положении 80 («Cys80²»), или

экспрессию рекомбинантного первого Fab, содержащего первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, содержащую цистеин в положении 80 (Cys80¹), экспрессию рекомбинантного второго Fab, содержащего вторую тяжелую цепь и вторую легкую цепь, содержащую цистеин в положении 80 (Cys80²), или экспрессию рекомбинантного первого Fab, содержащего первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, содержащую цистеин в положении 80 (Cys80¹), и экспрессию рекомбинантного второго Fab, содержащего вторую тяжелую цепь и вторую легкую цепь, содержащую цистеин в положении 80 (Cys80²);

и конъюгирование первого Fab через Cys80¹ с первым реагирующим с тиолом соединением для получения первого конъюгированного Fab, конъюгирование второго Fab через Cys80² со вторым реагирующим с тиолом соединением для получения второго конъюгированного Fab или конъюгирование первого Fab через Cys80¹ с первым реагирующим с тиолом соединением для получения первого конъюгированного Fab и конъюгирование второго Fab через Cys80² со вторым реагирующим с тиолом соединением для получения второго конъюгированного Fab.

[0136] Способы создания антиген-связывающих молекул могут дополнительно включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys. Способы создания антиген-связывающих молекул могут дополнительно включать замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys. Способы создания антиген-связывающих молекул могут дополнительно включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys, и замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи на аминокислотный остаток, отличный от Phe, Lys или Cys.

[0137] Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или замену аминокислотного остатка в положении 83 первой и второй вариабельной области легкой цепи на аланина(«Ala83»), валин («Val83»), изолейцин («Ile83»), треонин («Thr83»), аргинин («Arg83»), аспарагин («Asn83»), аспарагиновую кислоту («Asp83»), глутаминовую кислоту («Glu83»), глутамин («Gln83»), глицин («Gly83»), гистидин («His83»), лейцин («Leu83»), метионин («Met83»), пролин («Pro83»), серин («Ser83»), триптофан («Trp83») или тирозин («Tyr83»).

[0138] Аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может являться такой же, как аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи. В противоположном случае аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может отличаться от полярной или гидрофобной аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи. Аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, первой вариабельной области легкой цепи и/или аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой полярную или гидрофобную аминокислоту, включая, но не ограничиваясь указанными, аланин, валин, изолейцин или треонин. Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или замену аминокислотного остатка в положении 83 первой и второй вариабельной области легкой цепи на валин («Val83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или замену аминокислотного остатка в положении 83 первой и второй вариабельной области легкой цепи на изолейцин («Ile83»). Согласно некоторым аспектам, способы могут включать замену аминокислотного остатка в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, замену аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или замену аминокислотного остатка в положении 83 первой и второй вариабельной области легкой цепи на треонин («Thr83»). Полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может являться такой же или отличаться от полярной или гидрофобной аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи.

[0139] Подходящие вариабельные области легких цепей включают, например, вариабельную область легкой каппа-цепи. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80² могут присутствовать в нативной вариабельной области легкой цепи. Первая вариабельная область легкой цепи и вторая вариабельная область легкой цепи происходят от кролика. Примеры кроликов, из которых может происходить первая вариабельная область легкой цепи, вторая вариабельная область легкой цепи или первая и вторая вариабельная область легкой цепи, включают кролика вида Oryctolagus cuniculus, но не ограничиваются указанным. Согласно некоторым аспектам, например, вариабельная область (области) легкой цепи может происходить из новозеландского белого кролика (NZW). Согласно другим аспектам, вариабельная область (области) легкой цепи может происходить из кролика b9.

Иммуноглобулиновые компоненты конъюгированных иммуноглобулинов

[0140] В настоящей заявке описаны иммуноглобулины, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys.

[0141] Подходящие вариабельные области легких цепей включают, например, вариабельную область легкой каппа-цепи. Вариабельная область легкой цепи происходит от кролика. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, Cys80 может присутствовать в нативной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, происходящего от кролика. Примеры кроликов, из которых может происходить вариабельная область легкой цепи, содержащая Cys80, включают кролика вида Oryctolagus cuniculus, но не ограничиваются указанным. Согласно некоторым аспектам, вариабельная область легкой цепи может, например, происходить из новозеландского белого кролика (NZW). Согласно другим аспектам, вариабельная область легкой цепи может происходить из кролика b9.

[0142] Аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, включает аланин («Ala83»), валин («Val83»), изолейцин («Ile83»), треонин («Thr83»), аргинин («Arg83»), аспарагин («Asn83»), аспарагиновую кислоту («Asp83»), глутаминовую кислоту («Glu83»), глутамин («Gln83»), глицин («Gly83»), гистидин («His83»), лейцин («Leu83»), метионин («Met83»), пролин («Pro83»), серин («Ser83»), триптофан («Trp83») или тирозин («Tyr83»).

[0143] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, может представлять собой полярную или гидрофобную аминокислоту, включая, но не ограничиваясь указанными, аланин, валин, изолейцин или треонин. Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой аланин («Ala83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой валин («Val83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой изолейцин («Ile83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой треонин («Thr83»).

[0144] Cys80 может быть неспаренным. Например, вариабельная область легкой цепи, содержащая Cys80, может быть гибридизована с константным доменом, содержащим аминокислотный остаток в положении 171, отличный от цистеина.

[0145] Предпочтительно, Cys80 декэпирован.

[0146] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулины могут быть гибридизованными. Согласно другим вариантам реализации, иммуноглобулины могут быть гуманизированными.

[0147] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, описанный иммуноглобулин иммуноспецифично связывается с CA9 человека. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, содержит:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющуюаминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-141 последовательности xi155D5HC (SEQ ID NO:52), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi155D5LC (SEQ ID NO:78);

b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-144 последовательности zu155D5HC (SEQ ID NO:54), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104) или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);

c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-138 последовательности xi1E4HC (SEQ ID NO:58), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi1E4LC (SEQ ID NO:110);

d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-140 последовательности zu1E4HC (SEQ ID NO:60), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);

e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi166B3HC (SEQ ID NO:74), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi166B3LC (SEQ ID NO:132); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu166B3HC (SEQ ID NO:76), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).

[0148] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, содержит:

a. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-141 последовательности xi155D5HC (SEQ ID NO:52), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности xi155D5LC (SEQ ID NO:78);

b. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-144 последовательности zu155D5HC (SEQ ID NO:54), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104) или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);

c. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-138 последовательности xi1E4HC (SEQ ID NO:58), и вариабельную область легкой цепи, указанную как аминокислоты 20-130 последовательности xi1E4LC (SEQ ID NO:110);

d. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-140 последовательности zu1E4HC (SEQ ID NO:60), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);

e. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-142 последовательности xi166B3HC (SEQ ID NO:74), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности xi166B3LC (SEQ ID NO:132); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-145 последовательности zu166B3HC (SEQ ID NO:76), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136).

[0149] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, содержит:

a. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi155D5HC, представленные как SEQ ID NO:146, 148 и 150 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi155D5LC, представленные как SEQ ID NO:224, 226 и 228 соответственно;

b. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu155D5HC, представленные как SEQ ID NO:152, 154 и 156 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu155D5LC-3, представленные как SEQ ID NO:242, 244 и 246 соответственно, zu155D5LC-4, представленные как SEQ ID NO:248, 250 и 252 соответственно, zu155D5LC-5, представленные как SEQ ID NO:254, 256 и 258 соответственно, zu155D5LC-6, представленные как SEQ ID NO:260, 262 и 264 соответственно, zu155D5LC-7, представленные как SEQ ID NO:266, 268 и 270 соответственно, zu155D5LC-huVK2-40, представленные как SEQ ID NO 278, 280 и 282 соответственно, zu155D5LC-huVK4-1, представленные как SEQ ID NO 290, 292 и 294 соответственно, zu155D5LC-huVK6-21, представленные как SEQ ID NO 296, 298 и 300 соответственно, zu155D5LC-huVK6D-41, представленные как SEQ ID NO 302, 304 и 306 соответственно или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81, представленные как SEQ ID NO 308, 310 и 312 соответственно;

c. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1E4HC, обозначенную как SEQ ID NO 164, 166 и 168 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1E4LC, обозначенную как SEQ ID NO 320, 322 и 324 соответственно;

d. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu1E4HC, представленные как SEQ ID NO:170, 172 и 174 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu1E4LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:332, 334 и 336 соответственно;

e. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi166B3HC, представленные как SEQ ID NO:212, 214 и 216 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi166B3LC, представленные как SEQ ID NO:386, 388 и 390 соответственно; или

f. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu166B3HC, представленные как SEQ ID NO:218, 220 и 222 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu166B3LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:398, 400 и 402 соответственно.

[0150] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, описанные иммуноглобулины иммуноспецифично связываются с белком TEM1 человека. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с TEM1 человека, содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-139 последовательности xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-129 последовательности xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).

[0151] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с TEM1 человека, содержит вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-139 последовательности xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-129 последовательности xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108).

[0152] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с TEM1 человека, содержит участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1-55-2HC, представленные как SEQ ID NO:158, 160 и 162 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1-55-2LC, представленные как SEQ ID NO:314, 316 и 318 соответственно.

[0153] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, описанные иммуноглобулины иммуноспецифично связываются с мезотелином человека. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с мезотелином человека, содержит:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130).

[0154] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с мезотелином человека, содержит:

a. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

b. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

c. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

d. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

e. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130).

[0155] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с мезотелином человека, содержит:

a. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi33O11HC, представленные как SEQ ID NO: 176, 178 и 180 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi33O11LC, представленные как SEQ ID NO:338, 340 и 342 соответственно;

b. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu33O11HC, представленные как SEQ ID NO:182, 184 и 186 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu33O11LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:350, 352 и 354 соответственно или zu33O11LC-CXXI, представленные как SEQ ID NO:356, 358 и 360 соответственно;

c. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi324O5HC, представленные как SEQ ID NO:188, 190 и 192 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi324O5LC, представленные как SEQ ID NO:362, 364 и 366 соответственно;

d. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi178F16HC, представленные как SEQ ID NO:194, 196 и 198 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi178F16LC, представленные как SEQ ID NO:368, 370 и 372 соответственно;

e. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi237N18HC, представленные как SEQ ID NO:200, 202 и 204 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi237N18LC, представленные как SEQ ID NO:374, 376 и 378 соответственно; или

f. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi383I18HC, представленные как SEQ ID NO:206, 208 и 210 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi383I18LC, представленные как SEQ ID NO:380, 382 и 384 соответственно.

Конъюгированные иммуноглобулины

[0156] В настоящей заявке также описаны конъюгированные иммуноглобулины, содержащие любой из иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке, где цистеин в положении 80 («Cys80») конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, и указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу.

[0157] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированные иммуноглобулины включают иммуноглобулин, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит Cys80 и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys, где указанный Cys80 конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, и указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вариабельная область легкой цепи может содержать Cys80 и полярную или гидрофобную аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys.

[0158] Иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Подходящие вариабельные области легких цепей включают, например, вариабельную область легкой каппа-цепи. Вариабельная область легкой цепи происходит от кролика. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, Cys80 может присутствовать в нативной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, происходящего от кролика. Примеры кроликов, из которых может происходить вариабельная область легкой цепи, содержащая Cys80, включают кролика вида Oryctolagus cuniculus, но не ограничиваются указанным. Согласно некоторым аспектам, вариабельная область легкой цепи может, например, происходить из новозеландского белого кролика (NZW). Согласно другим аспектам, вариабельная область легкой цепи может происходить из кролика b9.

[0159] Вариабельная область легкой цепи может содержать Cys80 и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys. Аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, включает аланин («Ala83»), валин («Val83»), изолейцин («Ile83»), треонин («Thr83»), аргинин («Arg83»), аспарагин («Asn83»), аспарагиновую кислоту («Asp83»), глутаминовую кислоту («Glu83»), глутамин («Gln83»), глицин («Gly83»), гистидин («His83»), лейцин («Leu83»), метионин («Met83»), пролин («Pro83»), серин («Ser83»), триптофан («Trp83») или тирозин («Tyr83»). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вариабельная область легкой цепи может содержать Cys80 и полярную или гидрофобную аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys. Подходящие полярные или гидрофобные аминокислоты включают, но не ограничиваются указанными, аланин, валин, изолейцин или треонин. Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой аланин («Ala83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой валин («Val83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой изолейцин («Ile83»). Согласно некоторым аспектам, полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, представляет собой треонин («Thr83»).

[0160] Cys80 может быть неспаренным. Например, вариабельная область легкой цепи, содержащая Cys80, может быть гибридизована с константным доменом, содержащим аминокислотный остаток в положении 171, отличный от цистеина.

[0161] Предпочтительно, Cys80 декэпирован.

[0162] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин может быть гибридизованным. Согласно другим вариантам реализации, иммуноглобулин может быть гуманизированным.

[0163] Предпочтительно, реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с Cys80 через способную реагировать с тиолом группу. Способные реагировать с тиолом группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилоилы, арилирующие агенты, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB-тиолы и дисульфид-восстанавливающие агенты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать малеимид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать галогенацетил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать азиридин. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать акрилоил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать арилирующий агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать винилсульфон. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать пиридилдисульфид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать TNB-тиол. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способная реагировать с тиолом группа может содержать дисульфид-восстанавливающий агент.

[0164] Способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру. Линкеры могут представлять собой нерасщепляемые линкеры или расщепляемые линкеры. Примеры линкеров включают, например, содержащие дисульфид линкеры, линкеры на основе ацеталей и линкеры на основе кеталей. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой нерасщепляемый линкер. Подходящие нерасщепляемые линкеры включают, но не ограничиваются указанными, полиэтиленгликоль (PEG) или алкил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, линкер может содержать PEG. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой расщепляемый линкер. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, валин-цитруллин-парааминобензил. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой содержащий дисульфид линкер. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой линкер на основе ацеталя. Согласно некоторым аспектам, линкер может представлять собой линкер на основе кеталя. Примеры линкеров, ковалентно присоединенных к способной реагировать с тиолом группе, описаны, например, в публикации патента США № 20140050746.

[0165] Реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент. Подходящие функциональные агенты включают, например, флуорофоры, флуоресцентные красители, полипептиды, иммуноглобулины, антибиотики, нуклеиновые кислоты, радионуклиды, химические линкеры, малые молекулы, хелаторы, липиды и лекарственные средства. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать флуорофор. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать флуоресцентный краситель. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать полипептид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать иммуноглобулин. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать антибиотик. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать нуклеиновую кислоту (такую как ДНК или РНК). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать радионуклид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать химический линкер (например, дибензилциклооктин, DBCO, или азид). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать малую молекулу. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать хелатор (например, DOTA, CHX-A”-DTPA, NOTA и др.). Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать липид. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать лекарственное средство. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может содержать комбинацию любых из перечисленных выше функциональных агентов.

[0166] Таким образом, описанные конъюгированные иммуноглобулины включают: конъюгаты иммуноглобулин-флуорофор, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-флуоресцентный краситель, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-полипептид, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-иммуноглобулин, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-антибиотик, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-нуклеиновая кислота, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-радионуклид, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-химический линкер, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-малая молекула, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-хелатор, образованные через Cys80, конъюгаты иммуноглобулин-липид, образованные через Cys80, и конъюгаты иммуноглобулин-лекарственное средство, образованные через Cys80.

[0167] Любой из иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке, может быть конъюгирован с любым из функциональных агентов, описанных в настоящей заявке. Например, конъюгированный иммуноглобулин может содержать иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, и флуорофор, флуоресцентный краситель, полипептид, иммуноглобулин, антибиотик, нуклеиновую кислоту, радионуклид, химический линкер, малую молекулу, хелатор, липид или лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-флуорофор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-флуоресцентный краситель, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-полипептид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-иммуноглобулин, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-антибиотик, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-нуклеиновая кислота, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-радионуклид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-химический линкер, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-малая молекула, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-хелатор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-липид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-лекарственное средство, образованный через Cys80.

[0168] Подходящие иммуноглобулины, которые иммуноспецифично связываются с CA9 человека, которые можно конъюгировать через Cys80 с любым из перечисленных выше функциональных агентов, содержат:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-141 последовательности xi155D5HC (SEQ ID NO:52), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi155D5LC (SEQ ID NO:78);

b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-144 последовательности zu155D5HC (SEQ ID NO:54), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104) или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);

c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-138 последовательности xi1E4HC (SEQ ID NO:58), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi1E4LC (SEQ ID NO:110);

d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-140 последовательности zu1E4HC (SEQ ID NO:60), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);

e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi166B3HC (SEQ ID NO:74), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности xi166B3LC (SEQ ID NO:132);

f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu166B3HC (SEQ ID NO:76), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-130 последовательности zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);

g. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-141 последовательности xi155D5HC (SEQ ID NO:52), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности xi155D5LC (SEQ ID NO:78);

h. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-144 последовательности zu155D5HC (SEQ ID NO:54), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu155D5LC-3 (SEQ ID NO:84), zu155D5LC-4 (SEQ ID NO:86), zu155D5LC-5 (SEQ ID NO:88), zu155D5LC-6 (SEQ ID NO:90), zu155D5LC-7 (SEQ ID NO:92), zu155D5LC-huVK2-40 (SEQ ID NO:96), zu155D5LC-huVK4-1 (SEQ ID NO:100), zu155D5LC-huVK6-21 (SEQ ID NO:102), zu155D5LC-huVK6D-41 (SEQ ID NO:104) или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81 (SEQ ID NO:106);

i. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-138 последовательности xi1E4HC (SEQ ID NO:58), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности xi1E4LC (SEQ ID NO:110);

j. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-140 последовательности zu1E4HC (SEQ ID NO:60), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu1E4LC-CXXA (SEQ ID NO:114);

k. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-142 последовательности xi166B3HC (SEQ ID NO:74), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности xi166B3LC (SEQ ID NO:132);

l. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-145 последовательности zu166B3HC (SEQ ID NO:76), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-130 последовательности zu166B3LC-CXXA (SEQ ID NO:136);

m. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi155D5HC, представленные как SEQ ID NO:146, 148 и 150 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi155D5LC, представленные как SEQ ID NO:224, 226 и 228 соответственно;

n. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu155D5HC, представленные как SEQ ID NO:152, 154 и 156 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu155D5LC-3, представленные как SEQ ID NO:242, 244 и 246 соответственно, zu155D5LC-4, представленные как SEQ ID NO:248, 250 и 252 соответственно, zu155D5LC-5, представленные как SEQ ID NO:254, 256 и 258 соответственно, zu155D5LC-6, представленные как SEQ ID NO:260, 262 и 264 соответственно, zu155D5LC-7, представленные как SEQ ID NO:266, 268 и 270 соответственно, zu155D5LC-huVK2-40, представленные как SEQ ID NO 278, 280 и 282 соответственно, zu155D5LC-huVK4-1, представленные как SEQ ID NO 290, 292 и 294 соответственно, zu155D5LC-huVK6-21, представленные как SEQ ID NO 296, 298 и 300 соответственно, zu155D5LC-huVK6D-41, представленные как SEQ ID NO 302, 304 и 306 соответственно или zu155D5LC-huVK7-3-Glu81, представленные как SEQ ID NO 308, 310 и 312 соответственно;

o. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1E4HC, представленные как SEQ ID NO:164, 166 и 168 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1E4LC, представленные как SEQ ID NO:320, 322 и 324 соответственно;

p. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu1E4HC, представленные как SEQ ID NO:170, 172 и 174 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu1E4LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:332, 334 и 336 соответственно;

q. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi166B3HC, представленные как SEQ ID NO:212, 214 и 216 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi166B3LC, представленные как SEQ ID NO:386, 388 и 390 соответственно; или

r. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu166B3HC, представленные как SEQ ID NO:218, 220 и 222 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu166B3LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:398, 400 и 402 соответственно.

[0169] Конъюгированный иммуноглобулин может содержать иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с белком TEM1 человека, и флуорофор, флуоресцентный краситель, полипептид, иммуноглобулин, антибиотик, нуклеиновую кислоту, радионуклид, химический линкер, малую молекулу, хелатор, липид или лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-флуорофор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-флуоресцентный краситель, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-полипептид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-иммуноглобулин, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-антибиотик, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-нуклеиновая кислота, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-радионуклид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-химический линкер, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-малая молекула, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-хелатор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-липид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат TEM1-лекарственное средство, образованный через Cys80.

[0170] Подходящие иммуноглобулины, которые иммуноспецифично связываются с белком TEM1 человека и которые можно конъюгировать через Cys80 с любым из перечисленных выше функциональных агентов, содержат:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-139 последовательности xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-129 последовательности xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108);

b. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-139 последовательности xi1-55-2HC (SEQ ID NO:56), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-129 последовательности xi1-55-2LC (SEQ ID NO:108); или

c. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi1-55-2HC, представленные как SEQ ID NO:158, 160 и 162 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi1-55-2LC, представленные как SEQ ID NO:314, 316 и 318 соответственно.

[0171] Конъюгированный иммуноглобулин может содержать иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с мезотелином (MSLN) человека, и флуорофор, флуоресцентный краситель, полипептид, иммуноглобулин, антибиотик, нуклеиновую кислоту, радионуклид, химический линкер, малую молекулу, хелатор, липид или лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-флуорофор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-флуоресцентный краситель, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-полипептид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-иммуноглобулин, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-антибиотик, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-нуклеиновая кислота, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-радионуклид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-химический линкер, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-малая молекула, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-хелатор, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-липид, образованный через Cys80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат MSLN-лекарственное средство, образованный через Cys80.

[0172] Подходящие иммуноглобулины, которые иммуноспецифично связываются с MSLN человека и которые можно конъюгировать через Cys80 с любым из перечисленных выше функциональных агентов, содержат:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128);

f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130);

g. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

h. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

i. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

j. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

k. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128);

l. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130);

m. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi33O11HC, представленные как SEQ ID NO: 176, 178 и 180 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi33O11LC, представленные как SEQ ID NO:338, 340 и 342 соответственно;

n. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu33O11HC, представленные как SEQ ID NO:182, 184 и 186 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu33O11LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:350, 352 и 354 соответственно или zu33O11LC-CXXI, представленные как SEQ ID NO:356, 358 и 360 соответственно;

o. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi324O5HC, представленные как SEQ ID NO:188, 190 и 192 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi324O5LC, представленные как SEQ ID NO:362, 364 и 366 соответственно;

p. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi178F16HC, представленные как SEQ ID NO:194, 196 и 198 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi178F16LC, представленные как SEQ ID NO:368, 370 и 372 соответственно;

q. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi237N18HC, представленные как SEQ ID NO:200, 202 и 204 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi237N18LC, представленные как SEQ ID NO:374, 376 и 378 соответственно; или

r. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi383I18HC, представленные как SEQ ID NO:206, 208 и 210 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi383I18LC, представленные как SEQ ID NO:380, 382 и 384 соответственно.

[0173] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с MSLN человека, можно конъюгировать с низкомолекулярным противоопухолевым агентом, таким как ауристатин. Согласно некоторым аспектам, функциональный агент может представлять собой ауристатин F (AuF). Таким образом, описанные конъюгированные иммуноглобулины включают любой их описанных выше иммуноглобулинов, который иммуноспецифично связывается с MSLN человека, где указанный иммуноглобулин конъюгирован с ауристатином F (конъюгат MSLN-AuF, образованный через Cys80).

[0174] Согласно вариантам реализации изобретения, при которых иммуноглобулин содержит вариабельные области двух легких цепей, отношение иммуноглобулин:функциональный агент в конъюгированном иммуноглобулине может составлять 2:1, при этом каждая легкая цепь содержит функциональный агент, конъюгированный через Cys80.

Антиген-связывающие молекулы

[0175] Согласно настоящему изобретению, также предложены антиген-связывающие молекулы, содержащие:

первый конъюгированный иммуноглобулин, содержащий первую вариабельную область тяжелой цепи и первую вариабельную область легкой цепи, где указанная первая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80¹») и указанный Cys80¹ конъюгирован с первым реагирующим с тиолом соединением, содержащим первую способную реагировать с тиолом группу, и

второй конъюгированный иммуноглобулин, содержащий вторую вариабельную область тяжелой цепи и вторую вариабельную области легкой цепи, где указанная вторая вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80²») и указанный Cys80² конъюгирован со вторым реагирующим с тиолом соединением, содержащим вторую способную реагировать с тиолом группу.

[0176] Первый конъюгированный иммуноглобулин и второй конъюгированный иммуноглобулин могут представлять собой любой из конъюгированных иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке.

[0177] Подходящие вариабельные области легких цепей включают, например, вариабельную область легкой каппа-цепи. Первая вариабельная область легкой цепи и вторая вариабельная область легкой цепи происходят от кролика. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80² могут присутствовать в нативной вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, происходящего от кролика. Примеры кроликов, из которых может происходить первая вариабельная область легкой цепи, вторая вариабельная область легкой цепи или первая и вторая вариабельная область легкой цепи, включают вид Oryctolagus cuniculus, но не ограничиваются им. Согласно некоторым аспектам, вариабельная область (области) легкой цепи может происходить, например, из новозеландского белого кролика (NZW). Согласно другим аспектам, вариабельная область (области) легкой цепи может происходить из кролика b9.

[0178] Cys80¹, Cys80² или Cys80¹ и Cys80² могут быть неспаренными. Подходящие способы получения неспаренного Cys80¹ и/или Cys80² включают, например, гибридизацию вариабельной области легкой цепи (первой вариабельной области легкой цепи, второй вариабельной области легкой цепи или первой и второй вариабельной области легкой цепи), содержащей Cys80, с константным доменом, содержащим в положении 171 аминокислотный остаток, отличный от цистеина.

[0179] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин могут быть гибридизованными. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может быть гибридизованным. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, второй иммуноглобулин может быть гибридизован. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут быть гибридизованы.

[0180] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин могут быть гуманизированными. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может быть гуманизированным. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, второй иммуноглобулин может быть гуманизированным. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут быть гуманизированными.

[0181] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может быть гибридизованным, а второй иммуноглобулин может быть гуманизированным. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может быть гуманизированным, а второй иммуноглобулин может быть гибридизованным.

[0182] Аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может представлять собой аминокислоту, отличную от Phe, Lys или Cys, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой аминокислоту, отличную от Phe, Lys или Cys, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может представлять собой аминокислоту, отличную от Phe, Lys или Cys, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe, и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой аминокислоту, отличную от Phe, Lys или Cys, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи и/или второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой аланин («Ala83»), валин («Val83»), изолейцин («Ile83»), треонин («Thr83»), аргинин («Arg83»), аспарагин («Asn83»), аспарагиновую кислоту («Asp83»), глутаминовую кислоту («Glu83»), глутамин («Gln83»), глицин («Gly83»), гистидин («His83»), лейцин («Leu83»), метионин («Met83»), пролин («Pro83»), серин («Ser83»), триптофан («Trp83») или тирозин («Tyr83»). Аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может являться такой же, как аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи. В противоположном случае аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может отличаться от аминокислотного остатка в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи.

[0183] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может представлять собой полярный или гидрофобный остаток, отличный от Phe, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой полярный или гидрофобный остаток, отличный от Phe, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи может представлять собой полярный или гидрофобный остаток, отличный от Phe, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe, и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой полярный или гидрофобный остаток, отличный от Phe, если аминокислотный остаток в положении 83 представляет собой Phe. Подходящие полярные или гидрофобные аминокислоты включают, но не ограничиваются указанными, аланин, валин, изолейцин или треонин. Согласно некоторым аспектам, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой аланин («Ala83»). Согласно некоторым аспектам, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой валин («Val83»). Согласно некоторым аспектам, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой изолейцин («Ile83»). Согласно некоторым аспектам, аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи, аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи или аминокислотный остаток в положении 83 первой вариабельной области легкой цепи и аминокислотный остаток в положении 83 второй вариабельной области легкой цепи может представлять собой Треонин («Thr83»). Полярная или гидрофобная аминокислотный остаток в положении 83 в первой вариабельной области легкой цепи может являться такой же или отличаться от полярной или гидрофобной аминокислотного остатка в положении 83 во второй вариабельной области легкой цепи.

[0184] Первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут связываться с одними и теми же антигенами. Согласно некоторым аспектам, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут связываться с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Согласно другим аспектам, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут связываться с различными эпитопами одного антигена. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, например, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, где первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин конъюгированы с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут представлять собой иммуноглобулины, которые иммуноспецифично связываются с TEM1 человека, где указанный первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин конъюгированы с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут представлять собой иммуноглобулины, которые иммуноспецифично связываются с MSLN человека, где указанный первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин конъюгированы с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства.

[0185] Первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин могут связываться с различными антигенами. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый конъюгированный иммуноглобулин может представлять собой, например, иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека, где первый иммуноглобулин, который связывается с CA9 человека, конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства, тогда как второй иммуноглобулин может представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с TEM1 человека или MSLN человека. Согласно таким вариантам реализации, второй иммуноглобулин может быть конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый конъюгированный иммуноглобулин может представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с TEM1 человека, где указанный иммуноглобулин конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства, тогда как второй иммуноглобулин может представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека или MSLN человека. Согласно таким вариантам реализации, второй иммуноглобулин может быть конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклеотида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый конъюгированный иммуноглобулин может представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с MSLN человека, где указанный иммуноглобулин конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства, тогда как второй иммуноглобулин может представлять собой иммуноглобулин, который иммуноспецифично связывается с CA9 человека или TEM1 человека. Согласно таким вариантам реализации, второй иммуноглобулин может быть конъюгирован с любым из флуорофора, флуоресцентного красителя, полипептида, иммуноглобулина, антибиотика, нуклеиновой кислоты, радионуклида, химического линкера, малой молекулы, хелатора, липида или лекарственного средства.

[0186] Подходящие способные реагировать с тиолом группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилоилы, арилирующие агенты, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB-тиолы и дисульфид-восстанавливающие агенты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать малеимид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать галогенацетил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать азиридин. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать акрилоил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать арилирующий агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать винилсульфон. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать пиридилдисульфид. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать TNB-тиол. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут содержать дисульфид-восстанавливающий агент.

[0187] Первая способная реагировать с тиолом группа, вторая способная реагировать с тиолом группа или первая и вторая способная реагировать с тиолом группа могут быть присоединены к линкеру. Согласно некоторым аспектам, первая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру («первый линкер»). Согласно некоторым аспектам, вторая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к линкеру («второй линкер»). Согласно другим аспектам, первая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена к первому линкеру, и вторая способная реагировать с тиолом группа может быть присоединена ко второму линкеру. Подходящий первый и второй линкеры могут представлять собой нерасщепляемые линкеры или расщепляемые линкеры. Примеры первого и второго линкеров включают, например, дисульфид-содержащие линкеры, линкеры на основе ацеталей и линкеры на основе кеталей. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой нерасщепляемый линкер. Подходящие нерасщепляемые линкеры включают, но не ограничиваются указанными, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или алкил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут содержать PEG. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой расщепляемый линкер. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, валин-цитруллин-парааминобензил. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой дисульфид-содержащий линкер. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой линкер на основе ацеталя. Согласно некоторым аспектам, первый линкер, второй линкер или первый и второй линкер могут представлять собой линкер на основе кеталя. Примеры линкеров, ковалентно присоединенных к способной реагировать с тиолом группе, предложены, например, в публикации заявки на патент США № 20140050746.

[0188] Первое реагирующее с тиолом соединение, второе реагирующее с тиолом соединение или первое и второе реагирующее с тиолом соединение могут дополнительно содержать функциональный агент. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент («первый функциональный агент»). Согласно некоторым аспектам, второе реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать функциональный агент («второй функциональный агент»). Согласно другим аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать первый функциональный агент, и второе реагирующее с тиолом соединение может дополнительно содержать второй функциональный агент.

[0189] Подходящие функциональные агенты включают, например, химические линкеры. Предпочтительно, химический линкер первого реагирующего с тиолом соединения («первый химический линкер») и химический линкер второго реагирующего с тиолом соединения («второй химический линкер») могут быть соединены. Например, один из первого и второго химического линкера может представлять собой дибензилциклооктин (DBCO), и другой из первого и второго химического линкера может представлять собой азид, но не ограничиваются указанными соединениями. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый химический линкер может, например, представлять собой DBCO, и второй химический линкер может представлять собой азид. В противоположном случае первый химический линкер может представлять собой азид, и второй химический линкер может представлять собой DBCO. DBCO и азид можно соединять, приводя, таким образом, к конъюгированию первого иммуноглобулина и второго иммуноглобулина. Например, первый иммуноглобулин и второй иммуноглобулин можно конъюгировать друг с другом с помощью реакций клик-химии.

[0190] Согласно типичным вариантам реализации изобретения, реагирующие с тиолом соединения могут включать малеимид-ПЭГ4-азид и малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может представлять собой, например, малеимид-ПЭГ4-азид, и второе реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин. Согласно некоторым аспектам, первое реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-дибензоциклооктин, и второе реагирующее с тиолом соединение может представлять собой малеимид-ПЭГ4-азид. Таким образом, первое реагирующее с тиолом соединение может отличаться от второго реагирующего с тиолом соединения.

[0191] Первый иммуноглобулин, второй иммуноглобулин или первый и второй иммуноглобулин могут представлять собой Fab-фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первый иммуноглобулин может представлять собой Fab («первый Fab»). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, второй иммуноглобулин может представлять собой Fab («второй Fab»). Согласно другим вариантам реализации, первый иммуноглобулин может представлять собой первый Fab, и второй иммуноглобулин может представлять собой второй Fab.

Способы лечения рака у субъекта

[0192] В настоящей заявке также описаны способы лечения рака у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина против мезотелина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин против мезотелина содержит:

любой из конъюгированных иммуноглобулинов против мезотелина, описанных в настоящей заявке, и

реагирующее с тиолом соединение, содержащее способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент.

[0193] Следует понимать, что любые из характеристик, признаков и вариантов реализации, имеющих отношение к описанным конъюгированным иммуноглобулинам, в равной степени применимы к конъюгированным иммуноглобулинам, используемым в описанных способах лечения рака. Соответственно, описанные способы могут включать введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина против мезотелина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин против мезотелина содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys, где Cys80 конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, и указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, представляет собой полярную или гидрофобную аминокислоту.

[0194] Предпочтительно, рак представляет собой мезотелин-экспрессирующий рак. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированные антитела для применения в описанных способах могут содержать:

a. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

b. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

c. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

d. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

e. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130).

[0195] Антитела (a)-(f) можно конъюгировать с рядом подходящих реагирующих с тиолом соединений, включая, но не ограничиваясь указанными, способные реагировать с тиолом соединения, содержащие в качестве функционального агента противоопухолевый агент, такие как ауристатин. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы могут включать введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин содержит один или более иммуноглобулинов (a)-(f), каждый из которых конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, содержащим ауристатин F, где указанное реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с вариабельной областью легкой цепи иммуноглобулина через Cys80.

[0196] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированные антитела для применения в описанных способах могут содержать:

a. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-142 последовательности xi33O11HC (SEQ ID NO:62), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности xi33O11LC (SEQ ID NO:116);

b. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-145 последовательности zu33O11HC (SEQ ID NO:64), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-131 последовательности zu33O11LC-CXXA (SEQ ID NO:120) или zu33O11LC-CXXI (SEQ ID NO:122);

c. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi324O5HC (SEQ ID NO:66), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi324O5LC (SEQ ID NO:124);

d. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi178F16HC (SEQ ID NO:68), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi178F16LC (SEQ ID NO:126);

e. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-132 последовательности xi237N18HC (SEQ ID NO:70), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi237N18LC (SEQ ID NO:128); или

f. вариабельную область тяжелой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-137 последовательности xi383I18HC (SEQ ID NO:72), и вариабельную область легкой цепи, обозначенную как аминокислоты 20-127 последовательности xi383I18LC (SEQ ID NO:130).

[0197] Антитела (a)-(f) можно конъюгировать с рядом подходящих реагирующих с тиолом соединений, включая, но не ограничиваясь указанными, способные реагировать с тиолом соединения, содержащие в качестве функционального агента противоопухолевый агент, такой как ауристатин. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы могут включать введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин содержит один или более из иммуноглобулинов (a)-(f), каждый из которых конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, содержащим ауристатин F, где указанное реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с вариабельной областью легкой цепи иммуноглобулина через Cys80.

[0198] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, конъюгированные антитела для применения в описанных способах могут содержать:

a. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi33O11HC, представленные как SEQ ID NO: 176, 178 и 180 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi33O11LC, представленные как SEQ ID NO:338, 340 и 342 соответственно;

b. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности zu33O11HC, представленные как SEQ ID NO:182, 184 и 186 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности zu33O11LC-CXXA, представленные как SEQ ID NO:350, 352 и 354 соответственно или zu33O11LC-CXXI, представленные как SEQ ID NO:356, 358 и 360 соответственно;

c. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi324O5HC, представленные как SEQ ID NO:188, 190 и 192 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi324O5LC, представленные как SEQ ID NO:362, 364 и 366 соответственно;

d. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi178F16HC, представленные как SEQ ID NO:194, 196 и 198 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi178F16LC, представленные как SEQ ID NO:368, 370 и 372 соответственно;

e. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi237N18HC, представленные как SEQ ID NO:200, 202 и 204 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi237N18LC, представленные как SEQ ID NO:374, 376 и 378 соответственно; или

f. участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи последовательности xi383I18HC, представленные как SEQ ID NO:206, 208 и 210 соответственно, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи последовательности xi383I18LC, представленные как SEQ ID NO:380, 382 и 384 соответственно.

[0199] Антитела (a)-(f) можно конъюгировать с рядом подходящих реагирующих с тиолом соединений, включая, но не ограничиваясь указанными, способные реагировать с тиолом соединения, содержащие противоопухолевый агент в качестве функционального агента, такой как ауристатин. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы могут включать введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин содержит один или более из иммуноглобулинов (a)-(f), каждый из которых конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, содержащим ауристатин F, где указанное реагирующее с тиолом соединение конъюгировано с вариабельной областью легкой цепи иммуноглобулина через Cys80.

Способы выявления рака

[0200] В настоящей заявке также описаны способы выявления рака у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы можно осуществлять на субъекте. Например, способы могут включать введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгированного иммуноглобулина, где указанный конъюгированный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys, где указанный Cys80 конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, где указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, является полярной или гидрофобной.

[0201] В качестве альтернативы, способы можно осуществлять на биологическом образце, полученном от субъекта. Например, способы могут включать приведение биологического образца в контакт с конъюгированным иммуноглобулином, где указанный конъюгированный иммуноглобулин содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит цистеин в положении 80 («Cys80») и аминокислоту в положении 83, отличную от Phe, Lys или Cys, где Cys80 конъюгирован с реагирующим с тиолом соединением, и указанное реагирующее с тиолом соединение содержит способную реагировать с тиолом группу, линкер и функциональный агент. Аминокислотный остаток в положении 83, отличная от Phe, Lys или Cys, является полярной или гидрофобной. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы можно осуществлять ex vivo. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способы можно осуществлять in vivo.

[0202] Функциональный агент представляет собой флуорофор или флуоресцентный краситель.

[0203] Любой из иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке, может быть конъюгирован с флуорофором или флуоресцентным красителем и использоваться в описанных способах выявления рака. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, рак представляет собой CA9-экспрессирующий рак, и конъюгированный иммуноглобулин представляет собой конъюгат CA9-флуорофор, образованный через Cys80, или конъюгат CA9-флуоресцентный краситель, образованный через Cys80, содержащий: