СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР МУТАНТА EGFR СО ВСТАВКОЙ В ЭКЗОНЕ 20 Российский патент 2022 года по МПК A61K31/519 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2774629C2

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к противоопухолевому средству против рака, содержащему мутантный рецептор эпидермального фактора роста со вставкой в экзоне 20 (далее называемый EGFR).

Уровень техники

[0002]

EGFR представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая выполняет свою физиологическую функцию в нормальной ткани, будучи связанной с эпидермальным фактором роста (далее также называемым EGF), который является лигандом, и способствует росту и ингибированию апоптоза в эпителиальных тканях (NPL 1). Кроме того, соматическая мутация гена EGFR известна как ген, вызывающий рак; например, EGFR, в котором 746-750 аминокислоты в области экзона 19 делетированы (в дальнейшем также упоминается как «мутация с делецией в экзоне 19») и EGFR, в котором 858 аминокислота в области экзона 21 мутирована из лейцина в аргинин (далее также называемый «мутация L858R») постоянно индуцирует EGF-независимую киназную активность и способствует росту и выживанию раковых клеток (NPL 2). Эти мутации наблюдают, например, в 30-50% случаев немелкоклеточного рака легких в Восточной Азии. Мутации также наблюдаются примерно в 10% случаев немелкоклеточного рака легких в Европе и США и рассматривают как одну из причин возникновения рака (NPL 3).

[0003]

Таким образом, исследования и разработка ингибитора EGFR в качестве противоопухолевого средства активно проводятся и внедряются в лечение EGFR мутант-положительного рака легкого. Например, хотя введение гефитиниба, эрлотиниба и афатиниба в их терапевтической дозе вызывает, в виде побочных эффектов, расстройства желудочно-кишечного тракта и кожные заболевания, которые, как широко считается, связаны с ингибированием EGFR дикого типа, они оказывают высокий противоопухолевый эффект против мутанта с делецией в 19 экзоне и мутанта L858R EGFR-положительных раков легкого. Предполагается, что терапевтические эффекты этих средств обусловлены селективным ингибированием мутантного EGFR по сравнению с EGFR дикого типа ингибитором EGFR (NPL 4).

[0004]

Однако недавние исследования показали, что некоторые виды рака имеют EGFR с мутацией, в которой одна или более аминокислот вставлены в область экзона 20 (далее также называемая «мутация со вставкой в экзоне 20»), и что эти виды рака имеют низкую чувствительность в отношении ранее известных ингибиторов EGFR. Например, имеются клинические отчеты, показывающие значительно более низкие противоопухолевые эффекты афатиниба против EGFR мутант-положительного рака легкого в отношении мутации со вставкой в экзоне 20, по сравнению с мутацией с делецией в экзоне 19 или мутацией L858R (NPL 5). В связи с этим для пациентов с этими видами рака была использована химиотерапия. Однако, поскольку варианты лечения ограничены и достаточные терапевтические эффекты не были получены, требуется противоопухолевое средство с более высокими терапевтическими эффектами.

[0005]

В PTL 1 раскрыто соединение, пригодное для лечения заболеваний, характеризующихся мутантом EGFR со вставкой в экзоне 20. Однако соединение PTL 1 значительно отличается по своей структуре от соединения по настоящему изобретению, и PTL 1 нигде не раскрывает селективность, основанную на сравнении с EGFR дикого типа, или эффективность в модели in vivo.

[0006]

Кроме того, хотя в PTL 2 раскрыто хинолинзамещенное соединение, в PTL 2 нигде не раскрыта ингибирующая активность в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20.

Перечень цитируемых ссылочных документов

Патентная литература

[0007]

PTL 1: WO2015/175632A1

PTL 2: WO2015/025936A1

Непатентная литература

[0008]

NPL 1: Nat. Rev. Cancer, Vol. 6, pp. 803-812 (2006)

NPL 2: Nature Medicine, Vol. 19, pp. 1389-1400 (2013)

NPL 3: Nat. Rev. Cancer, Vol. 7, pp. 169-181 (2007)

NPL 4: Lancet Oncol. Vol. 13, e. 23-31 (2012)

NPL 5: Lancet Oncol. Vol. 16, pp. 830-838 (2015)

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая задача

[0009]

Задачей настоящего изобретения является создание противоопухолевого средства с уменьшенными побочными эффектами, возникающими в результате ингибирования EGFR дикого типа, противоопухолевого средства, служащего ингибитором, которое может обеспечить высокую селективность в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20, для которого терапевтические эффекты ранее известных ингибиторов EGFR недостаточны.

Решение задачи

[0010]

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования и обнаружили, что мутант EGFR со вставкой в экзоне 20 является подходящей мишенью при лечении рака, и что ингибиторы EGFR, обычно используемые для лечения, имеют низкую селективность между EGFR дикого типа и мутантом EGFR со вставкой в экзоне 20. Кроме того, авторы изобретения также подтвердили, что конкретное соединение проявляет селективность в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20 и эффекты ингибирования роста опухоли и, таким образом, считается превосходящим афатиниб, который является типичным лекарственным средством для EGFR мутация-положительного рака. Благодаря этому открытию, авторы изобретения осуществили настоящее изобретение.

[0011]

Соответственно, настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления.

[0012]

Пункт 1.

Противоопухолевое средство для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, содержащее соединение, выбранное из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида (далее в настоящем описании также называемый Соединение A);

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида (далее в настоящем описании также называемый Соединение B);

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида (далее в настоящем описании также называемый Соединение C); и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида (далее в настоящем описании также называемый Соединение D),

или его соль.

[0013]

Пункт 2.

Противоопухолевое средство по пункту 1, где соединение представляет собой (S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламид.

[0014]

Пункт 3.

Противоопухолевое средство по пункту 1 или 2, где пациент со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, является пациентом с раком легкого, раком молочной железы, раком головы и шеи, опухолью мозга, раком матки, гематобластозом или раком кожи.

[0015]

Пункт 4.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-3, где пациент со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, является пациентом с раком легкого.

[0016]

Пункт 5.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-4, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где одна или более аминокислот вставлены в область экзона 20.

[0017]

Пункт 6.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-5, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где 1-7 аминокислот вставлены в область экзона 20.

[0018]

Пункт 7.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-6, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где 1-4 аминокислот вставлены в область экзона 20.

[0019]

Пункт 8.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-7, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой A763_Y764insFQEA, V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insNPG, D770_N771insG, D770>GY, N771_P772insN, P772_R773insPR, H773_V774insNPH, H773_V774insPH, H773_V774insAH, H773_V774insH, V774_C774insHV или A761_E762insEAFQ.

[0020]

Пункт 9.

Противоопухолевое средство по любому из пунктов 1-8, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insG, H773_V774insNPH или H773_V774insPH.

[0021]

Пункт 10.

Способ лечения пациента со злокачественной опухолью, включающий стадию введения противоопухолевого средства, содержащего эффективное количество соединения, выбранного из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида;

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида;

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида,

или его соли пациенту со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0022]

Пункт 11.

Соединение, выбранное из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида;

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида;

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида,

или его соль для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0023]

Пункт 12.

Применение соединения, выбранного из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида;

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида; и

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида,

или его соли для получения противоопухолевого средства для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

Полезные эффекты изобретения

[0024]

Противоопухолевое средство по настоящему изобретению проявляет высокую селективность в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20 без ингибирования EGFR дикого типа. Таким образом, противоопухолевое средство по настоящему изобретению является полезным с точки зрения обеспечения противоопухолевого средства, имеющего уменьшенные побочные эффекты, возникающие в результате ингибирования EGFR дикого типа; и оказывающего превосходные терапевтические эффекты для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, для которого терапевтические эффекты ранее известных ингибиторов EGFR недостаточны.

[0025]

Ранее известные ингибиторы EGFR имеют низкую селективность в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20 по сравнению с EGFR дикого типа; таким образом, разница между дозировкой для обеспечения противоопухолевых эффектов и дозировкой, вызывающей побочные эффекты (кожные заболевания, расстройства желудочно-кишечного тракта и тому подобное), обусловленные ингибированием EGFR дикого типа, была небольшой. Соответственно, ранее известные ингибиторы EGFR имеют трудности в оказании достаточных терапевтических эффектов. Напротив, поскольку противоопухолевое средство по настоящему изобретению обладает высокой селективностью в отношении мутанта EGFR со вставкой в экзоне 20, можно увеличить дозировку, не вызывая побочных эффектов, вызванных EGFR дикого типа. Таким образом, противоопухолевое средство по настоящему изобретению проявляет превосходные терапевтические эффекты для пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий инсерцию в экзоне 20.

Краткое описание чертежей

[0026]

Фиг.1 иллюстрирует отношения IC50 EGFR дикого типа к EGFR с мутациями со вставкой в экзоне 20, рассчитанные по результатам теста на ингибирование роста клеток на EGFR дикого типа-экспрессирующих клеточных линиях и мутант EGFR-экспрессирующих клеточных линиях соединениями A, B, C и D, сравнительным соединением, гефитинибом, эрлотинибом и афатинибом.

Фиг.2 иллюстрирует отношения GI50 EGFR дикого типа к EGFR с мутациями со вставкой в экзоне 20, рассчитанные по результатам теста на ингибирование роста клеток на EGFR дикого типа-экспрессирующих клеточных линиях человека и мутант EGFR-экспрессирующих клеточных линиях человека соединениями A, B, C и D, сравнительным соединением, гефитинибом, эрлотинибом и афатинибом.

Фиг.3 иллюстрирует относительный объем опухоли (который далее также называется «RTV») на мышиных моделя, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки NIH3T3-EGFRinsASV) для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 4 иллюстрирует изменение массы тела после образование групп мышиных моделей, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки NIH3T3-EGFRinsASV) для определения токсичности соединения A.

Фиг.5 иллюстрирует относительный объем опухоли на мышиных моделях, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки NIH3T3-EGFRinsSVD) для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 6 иллюстрирует массу тела после образование групп мышиных моделей, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки NIH3T3-EGFRinsSVD) для определения токсичности соединения A.

Фиг.7 иллюстрирует относительный объем опухоли на мышиных моделях, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки H1975-EGFRinsSVD) для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 8 иллюстрирует массу тела после образование групп мышиных моделей, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки H1975-EGFRinsSVD) для определения токсичности соединения A.

Фиг.9 иллюстрирует объем опухоли на мышиных моделях, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (NIH3T3-EGFRinsNPH) для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 10 иллюстрирует массу тела после образование групп мышиных моделей, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (NIH3T3-EGFRinsNPH) для определения токсичности соединения A.

Фиг. 11 иллюстрирует объем опухоли на моделях крыс, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки H1975-EGFRinsSVD) для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 12 иллюстрирует массу тела после образование групп крысиных моделей, которым подкожно трансплантировали мутант EGFR-экспрессирующие клеточные линии (клетки H1975-EGFRinsSVD) для определения токсичности соединения A.

Фиг. 13 иллюстрирует объем опухоли на мышиных моделях, которым подкожно трансплантировали опухоль, полученную от пациента с раком легкого, который был положительным в отношении EGFR с мутацией V769_D770insASV для определения противоопухолевого эффекта соединения A.

Фиг. 14 иллюстрирует массу тела после образование групп мышиных моделей, которым подкожно трансплантировали опухоль, полученную от пациента с раком легкого, который был положительным в отношении EGFR с мутацией V769_D770insASV для определения токсичности соединения A по настоящему изобретению.

На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность EGFR дикого типа (SEQ ID NO:1).

Описание вариантов осуществления

[0027]

Предпочтительные примеры различных определений в объеме настоящего изобретения, используемых в данном описании, подробно поясняются ниже.

[0028]

В настоящем описании «EGFR» относится к белку рецептора эпидермального фактора роста человека и также обозначается как ErbB-1 или HER1.

[0029]

В настоящем описании «EGFR дикого типа» относится к EGFR, свободному от соматической мутации, который представляет собой белок, включающий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 (GenBank accession number: NP_005219.2).

[0030]

В настоящем описании «мутация со вставкой в экзоне 20» относится к мутации, где одна или более аминокислот (предпочтительно 1-7, более предпочтительно 1-4) вставлены в область экзона 20 (от 761-й до 823-й аминокислотная последовательность в SEQ ID NO:1) EGFR и предпочтительно представляет собой мутацию, где аминокислотная последовательность FQEA (фенилаланин, глутамин, глутаминовая кислота и аланин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 763-м аланином и 764-м тирозином в области экзона 20 (A763_Y764insFQEA); мутацию, где аминокислотная последовательность ASV (аланин, серин и валин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 769-м валином и 770-й аспарагиновой кислотой в области экзона 20 (V769_D770insASV); мутацию, где аминокислотная последовательность SVD (серин, валин и аспарагиновая кислота в этом порядке от N-конца) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insSVD); мутацию, где аминокислотная последовательность NPG (аспарагин, пролин и глицин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insNPG); мутацию, где аминокислота G (глицин) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином (D770_N771insG); мутацию, где 770-я аспарагиновая кислота в области экзона 20 делетирована и аминокислотная последовательность GY (глицин и тирозин в этом порядке от N-конца) инсертирована вместо нее (D770>GY); мутацию, где аминокислота N (аспарагин) инсертирована между 771-м аспарагином и 772-м пролином в области экзона 20 (N771_P772insN); мутацию, где аминокислотная последовательность PR (пролин и аргинин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 772-м пролином и 773-м гистидином в области экзона 20 (P772_R773insPR); мутацию, где аминокислотная последовательность NPH (аспарагин, пролин и гистидин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insNPH); мутацию, где аминокислотная последовательность PH (пролин и гистидин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insPH); мутацию, где аминокислотная последовательность AH (аланин и гистидин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insAH); мутацию, где аминокислота H (гистидин) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insH); мутацию, где аминокислотная последовательность HV (гистидин и валин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 774-м валином и 775-м цистеином в области экзона 20 (V774_C775insHV); мутацию, где аминокислотная последовательность EAFQ (глютаминовая кислота, аланин, фенилаланин, и глутамин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 761-м аланином и 762-й глютаминовой кислотой в области экзона 20 (A761_E762insEAFQ); и тому подобное. Более предпочтительные мутации включают мутацию, где аминокислотная последовательность ASV (аланин, серин и валин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 769-м валином и 770-й аспарагиновой кислотой в области экзона 20 (V769_D770insASV); мутацию, где аминокислотная последовательность SVD (серин, валин и аспарагиновая кислота в этом порядке от N-конца) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insSVD); мутацию, где аминокислота G (глицин) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insG); мутацию, где аминокислотная последовательность NPH (аспарагин, пролин и гистидин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insNPH); и мутацию, где аминокислотная последовательность PH (пролин и гистидин в этом порядке от N-конца) инсертирована между 773-м гистидином и 774-м валином в области экзона 20 (H773_V774insPH). Более предпочтительные мутации включают мутацию, где аминокислотная последовательность SVD (серин, валин и аспарагиновая кислота в этом порядке от N-конца) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insSVD); и мутацию, где аминокислота G (глицин) инсертирована между 770-й аспарагиновой кислотой и 771-м аспарагином в области экзона 20 (D770_N771insG).

[0031]

В настоящем описании «пациент со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20» относится к пациенту со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, по меньшей мере, в одной части области экзона 20 EGFR. EGFR может иметь мутацию со вставкой в экзоне 20 в двух или более разных частях, но предпочтительно в одной его части. Кроме того, EGFR также может иметь мутацию, отличную от мутации со вставкой в экзоне 20 (такую как мутация с делецией в экзоне 19, мутация L858R или мутация L790M).

[0032]

В настоящем изобретении способ обнаружения мутации со вставкой в экзоне 20 EGFR, экспрессируемого у пациента со злокачественной опухолью, конкретно не ограничен, поскольку способ способен обнаруживать мутацию, и могут быть использованы любые известные способы обнаружения. Целью обнаружения при обнаружении мутации со вставкой в экзоне 20 может быть любая из геномной последовательности гена EGFR, продукта транскрипции гена EGFR и белка EGFR.

[0033]

Образец, используемый для обнаружения мутации со вставкой в экзоне 20, конкретно не ограничивается, при условии, что образец представляет собой биологический образец, выделенный от пациента со злокачественной опухолью, в частности, образец, который получен от пациента со злокачественной опухолью и содержит клетки злокачественной опухоли. Примеры биологических образцов включают биологические жидкости (например, кровь, мочу и тому подобное), ткани, их экстракты и культуры полученных тканей. Способ выделения биологического образца может быть соответствующим образом выбран в зависимости от типа биологического образца.

[0034]

Биологический образец получают путем соответствующей обработки в соответствии со способом обнаружения. Кроме того, реагент, используемый для обнаружения (например, реагент, содержащий праймер или зонд) может быть получен обычным способом в соответствии со способом обнаружения.

[0035]

В одном варианте осуществления настоящего изобретения стадию обнаружения присутствия мутации со вставкой в экзоне 20 EGFR, экспрессируемой у пациента со злокачественной опухолью, может быть осуществлена перед введением противоопухолевого средства пациенту со злокачественной опухолью.

[0036]

Соединения А-D (Соединения А, В, С и D) (в настоящем описании эти соединения также обычно называют «соединение настоящего изобретения» или «соединение по настоящему изобретению») и способ его получения описаны ниже.

[0037]

Соединение A ((S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламид) представлено следующей химической формулой.

[0038]

[0039]

Соединение B ((S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламид) представлено следующей химической формулой.

[0040]

[0041]

Соединение C ((S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламид) представлено следующей химической формулой.

[0042]

[0043]

Соединение D ((R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламид) представлено следующей химической формулой.

[0044]

[0045]

Соединения A-D могут быть получены, например, с помощью способа получения, раскрытого в WO2015/025936A1, способами, описанными в примерах, и тому подобное. Однако способы получения соединений А-D не ограничиваются этими примерами реакции.

[0046]

Когда соединения А-D по настоящему изобретению имеют изомеры, такие как оптические изомеры, стереоизомеры, поворотные изомеры и таутомеры, любые изомеры и их смеси включены в объем соединения по настоящему изобретению, если не указано иное. Например, когда соединения А-D по настоящему изобретению имеют оптические изомеры, рацемические смеси и оптические изомеры, выделенные из рацемической смеси, также включены в объем соединения настоящего изобретения, если не указано иное.

[0047]

Соли соединений A-D относятся к любым фармацевтически приемлемым солям; примеры включают соли присоединения основания и соли присоединения кислоты.

[0048]

Примеры солей присоединения основания включают соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия; соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и соли магния; соли аммония; и соли органических аминов, такие как соли триметиламина, соли триэтиламина, соли дициклогексиламина, соли этаноламина, соли диэтаноламина, соли триэтаноламина, соли прокаина и соли N,N'-дибензилэтилендиамина.

[0049]

Примеры солей присоединения кислоты включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, сульфаты, нитраты, фосфаты и перхлораты; соли органических кислот, такие как ацетаты, формиаты, малеаты, фумараты, тартраты, цитраты, аскорбаты и трифторацетаты; и сульфонаты, такие как метансульфонаты, изетионаты, бензолсульфонаты и п-толуолсульфонаты.

[0050]

Соединения А-D и их соли также включают их пролекарства. Пролекарство относится к соединению, которое превращается в соединения А-D, или его соли вследствие реакции с ферментом, желудочной кислотой или тому подобным в физиологических условиях in vivo, т.е. соединению, которое превращается в соединение по настоящему изобретению или его соль посредством ферментативного окисления, восстановления, гидролиза или тому подобного; или соединению, которое превращается в соединения А-D или его соль посредством гидролиза или тому подобного желудочной кислотой или тому подобным. Кроме того, пролекарство может представлять собой соединения, которые могут превращаться в соединения А-D или их соли в физиологических условиях, таких как описаны в ʺIyakuhin no Kaihatsu [Development of Pharmaceuticals],ʺ Vol. 7, Molecular Design, published in 1990 by Hirokawa Shoten Co., pp. 163-198.

[0051]

Описание заболеваний

Конкретные примеры опухолей, на которые нацелено настоящее изобретение, включают, но не ограничиваются ими, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта (рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак печени, рак желчных путей (например, рак желчного пузыря и желчных протоков), рак поджелудочной железы, колоректальный рак (например, рак толстой кишки и рак прямой кишки) и т.п.), рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и мезотелиома), рак молочной железы, рак половых органов (рак яичников, рак матки (например, рак шейки матки и рак эндометрия) и т.п.), рак мочеполовой системы (например, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы и тестикулярная опухоль), гематобластоз (например, лейкоз, злокачественная лимфома и множественная миелома), остеосаркома, саркома мягких тканей, рак кожи, опухоль мозга, и тому подобное. Предпочтительные примеры включают рак легкого, рак молочной железы, рак головы и шеи, опухоль мозга, рак матки, гематобластоз или рак кожи.

[0052]

Когда соединения А-D или их соли используют в качестве фармацевтического средства, может быть добавлен фармацевтический носитель, при необходимости, таким образом образуя подходящую лекарственную форму в соответствии с целями профилактики и лечения. Примеры лекарственной формы включают пероральные препараты, формы для инъекций, суппозитории, мази, пластыри и тому подобное. Такие лекарственные формы могут быть получены способами, обычно известными специалистам в данной области.

[0053]

В качестве фармацевтического носителя различные твердые органические или неорганические материалы-носители, используемые в качестве материалов для получения, могут быть смешаны в качестве эксципиента, связующего средства, дезинтегрирующего средства, смазывающего вещества или красителя в случае твердых форм лекарственного средства; или в качестве растворителя, солюбилизирующего средства, суспендирующего средства, изотонического средства, буфера или смягчающего средства в случае жидких форм лекарственного средства. Кроме того, также при необходимости в фармацевтических препаратах можно использовать добавки, такие как антисептики, антиоксиданты, красители, подсластители и стабилизаторы.

[0054]

Твердые пероральные лекарственные средства получают следующим образом. После добавления эксципиента, необязательно, со связующим средством, дезинтегрирующим средством, смазывающим веществом, красителем, средством, маскирующим вкус, или ароматизатором и т.п., к соединениям А-D, полученную смесь формуют в таблетки, таблетки с покрытием, гранулы, порошки, капсулы или тому подобное обычными методами.

[0055]

Примеры эксципиентов включают лактозу, сахарозу, D-маннит, глюкозу, крахмал, карбонат кальция, каолин, микрокристаллическую целлюлозу и ангидрид кремниевой кислоты. Примеры связующих веществ включают воду, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, простой сироп, жидкую глюкозу, жидкий α-крахмал, жидкий желатин, D-маннит, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилкрахмал, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, шеллак, фосфат кальция, поливинилпирролидон и тому подобное. Примеры дезинтегрирующих средств включают сухой крахмал, альгинат натрия, порошкообразный агар, гидрокарбонат натрия, карбонат кальция, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, лактозу и тому подобное. Примеры смазывающих веществ включают очищенный тальк, стеарат натрия, стеарат магния, буру, полиэтиленгликоль и тому подобное. Примеры красителей включают оксид титана, оксид железа, и тому подобное. Примеры маскирующих вкус веществ или ароматизаторов включают сахарозу, апельсиновую цедру, лимонную кислоту, винную кислоту, и тому подобное.

[0056]

При получении жидкого препарата для перорального введения к соединениям А-D могут быть добавлены маскирующее вкус вещество, буфер, стабилизатор, ароматизатор и тому подобное; и полученная смесь может быть приготовлена в виде жидкого препарата для перорального применения, сиропа, эликсира и т.п. в соответствии с обычным способом.

[0057]

Примеры маскирующего вкус средства или ароматизатора включают те, которые упомянуты выше. Примеры буферов включают цитрат натрия и тому подобное. Примеры стабилизаторов включают трагакант, гуммиарабик, желатин, и тому подобное. При необходимости эти препараты для перорального введения могут быть покрыты в соответствии со способами, известными в данной области техники, энтеросолюбильным покрытием или другим покрытием с целью, например, сохранения стойкости эффектов. Примеры таких покрывающих агентов включают гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, полиоксиэтиленгликоль и Tween 80 (зарегистрированный товарный знак).

[0058]

При получении раствора для инъекции, к соединениям А-D могут быть добавлены регулятор рН, буфер, стабилизатор, изотоническое средство, местный анестетик и тому подобное; и смесь может быть приготовлена в виде раствора для подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции в соответствии с обычным способом.

[0059]

Примеры регулирующего рН вещества и буфера, используемого в настоящем описании, включают цитрат натрия, ацетат натрия и фосфат натрия. Примеры стабилизатора включают пиросульфит, EDTA, тиогликолевую кислоту и тиомолочную кислоту. Примеры местного анестетика включают прокаина гидрохлорид и лидокаина гидрохлорид. Примеры средства, регулирующего тоничность, включают хлорид натрия, глюкозу, D-маннит и глицерин.

[0060]

При получении суппозитория, фармацевтически приемлемые носители, известные специалисту в данной области, такие как полиэтиленгликоль, ланолин, масло какао и триглицерид жирных кислот; и, если необходимо, поверхностно-активные вещества, такие как Tween 80 (зарегистрированный товарный знак), могут быть добавлены к соединениям A-D, и полученная смесь может быть приготовлена в виде суппозитория в соответствии с обычным способом.

[0061]

При получении мази, обычно используемое основание, стабилизатор, смачивающий агент, консервант и тому подобное можно при необходимости смешивать с соединениями А-D; и полученная смесь может быть смешана и приготовлена в виде мази в соответствии с обычным способом.

[0062]

Примеры основания включают жидкий парафин, белый вазелин, белый пчелиный воск, октилдодециловый спирт и парафин.

[0063]

Примеры консерванта включают метилпараоксибензоат, этилпараоксибензоат и пропилпараоксибензоат.

[0064]

При получении пластыря, описанную выше мазь, крем, гель, пасту или тому подобное можно наносить на обычный субстрат в соответствии с обычным способом.

[0065]

Примеры субстратов включают тканые ткани или нетканые ткани, включающие хлопок, штапельные волокна или химические волокна; и пленки или листовой пенопласт из мягкого винилхлорида, полиэтилена, полиуретана и т.п. являются подходящими.

[0066]

Количество соединений A-D, которое должно быть включено в каждую из таких единичных дозированных форм, зависит от состояния пациента, которому вводят соединение, его лекарственные формы и т.п. Как правило, в случае перорального средства количество соединения предпочтительно составляет 0,05-1000 мг на единичную дозированную форму. В случае инъекции количество соединения предпочтительно составляет 0,01-500 мг на единичную дозированную форму; и в случае суппозитория количество соединения предпочтительно составляет 1-1000 мг на единичную дозированную форму.

[0067]

Кроме того, суточная доза лекарственного средства в такой лекарственной форме зависит от состояния, массы тела, возраста, пола и т.п. пациента и не может быть обобщена. Например, суточная доза для взрослого человека (масса тела: 50 кг) соединений A-D в качестве активного ингредиента может обычно составлять 0,05-5000 мг и предпочтительно 0,1-1000 мг; и предпочтительно вводится в одной дозе или в двух-трех разделенных дозах в день.

[0068]

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента со злокачественной опухолью, включающему стадию введения эффективного количества противоопухолевого средства, содержащего соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений A-D, или его соль, пациенту со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0069]

Настоящее изобретение также относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из соединений А-D, или его соли для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0070]

Настоящее изобретение также относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений A-D, или его соли для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0071]

Настоящее изобретение также относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений А-D, или его соли для получения противоопухолевого средства для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0072]

Настоящее изобретение также представляет собой способ прогнозирования терапевтических эффектов химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, включающего в качестве активного ингредиента соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений A-D, или его соль, у пациента со злокачественной опухолью, причем способ включает стадии (1) и (2) ниже:

(1) стадия обнаружения наличия или отсутствия мутации гена EGFR, содержащегося в биологическом образце, полученном от пациента; и

(2) стадия прогнозирования того, что пациент с высокой вероятностью будет иметь достаточные терапевтические эффекты от химиотерапии, когда результаты детектирования на стадии (1) показали, что ген EGFR имеет мутацию со вставкой в экзоне 20.

[0073]

Настоящее изобретение также представляет собой способ лечения пациента со злокачественной опухолью, включающий стадии (1)-(3) ниже:

(1) стадия обнаружения наличия или отсутствия мутации гена EGFR, содержащегося в биологическом образце, полученном от пациента;

(2) стадия прогнозирования того, что пациент с высокой вероятностью будет иметь достаточные терапевтические эффекты от химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, включающего соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений A-D или его соли, когда результаты детектирования на стадии (1) показали, что ген EGFR имеет мутацию со вставкой в экзоне 20; и

(3) стадия введения противоопухолевого средства пациенту, который, согласно прогнозам стадии (2) с высокой вероятностью достаточно ответит на химиотерапию.

[0074]

Последовательность оснований гена EGFR общеизвестна. Идентификационный номер GenBank последовательности оснований кДНК представляет собой NM_005228.4.

[0075]

«Терапевтические эффекты» можно оценивать на основании эффектов уменьшения размеров опухоли, эффектов подавления рецидива, эффектов увеличения продолжительности жизни и тому подобное. Эффекты подавления рецидива могут быть представлены как степень увеличения продолжительности жизни без рецидива и/или степень улучшения частоты возникновения рецидивов; и эффекты увеличения продолжительности жизни могут быть представлены как степень общего времени выживания и/или степень увеличения медианы выживаемости без развития заболевания или тому подобное. «Достаточные терапевтические эффекты» химиотерапии с использованием противоопухолевого средства, включающего в качестве активного ингредиента соединение А или его соль, означают, что превосходные терапевтические эффекты достигаются при введении противоопухолевого средства, включающего в качестве активного ингредиента соединение А или его соль, такие как значительное увеличение времени выживания, значительное подавление рецидива и тому подобное, по сравнению с лечением без введения.

Примеры

[0076]

Далее настоящее изобретение описывается более подробно со ссылкой на следующие примеры испытаний. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами (примеры испытаний).

[0077]

Пример испытаний 1

Тест in vitro эффективности лекарственного средства

Оценка эффекта ингибирования роста клеток на клеточные линии, экспрессирующие EGFR дикого типа или мутант EGFR (1)

Ингибирующую активность соединений в отношении EGFR дикого типа и мутантного EGFR оценивали, используя клетки Ba/F3 (линии клеток-предшественников B-лимфоцитов мыши), в которые были введены гены EGFR человека. Клетки Ba/F3 поддерживали в среде RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) и 1 нг/мл интерлейкин-3 мыши (mlL-3) (CST). Вектор PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro или вектор PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro, в котором был закодирован человеческий ген EGFR (дикий тип (WT), V769_D770insASV (insASV), D770_N771insSVD (insSVD), D770_N771insG (insG), H773_V774insNPH (insNPH) или H773_V774insPH (insPH)), вводили в клетки вместе с вектором экспрессии Super PiggyBac транспозазы путем электропорации с использованием Amaxa (товарный знак) набора V Cell Line Nucleofector (товарный знак) с последующим отбором с использованием пуромицина (SIGMA). Клетки Ba/F3, экспрессирующие EGFR дикого типа (которые в дальнейшем также обозначаются как «Ba/F3-EGFR_WT»), демонстрировали mlL-3-независимый рост в присутствии 50 нг/мл EGF (R&D Systems); и клетки Ba/F3, экспрессирующие мутантный EGFR со вставкой в экзоне 20 (который в дальнейшем также упоминается как ʺBa/F3-EGFRinsASV,ʺ ʺBa/F3-EGFRinsSVD,ʺ ʺBa/F3-EGFRinsG,ʺ ʺBa/F3-EGFRinsNPH,ʺ или ʺBa/F3-EGFRinsPHʺ) демонстрировали mlL-3-независимый рост в отсутствие EGF.

[0078]

Для оценки эффекта ингибирования роста клеток клетки Ba/F3-EGFR_WT суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 нг/мл EGF; и суспензию клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном так, чтобы количество клеток на лунку составляло 30000. Клетки Ba/F3, экспрессирующие EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20, суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; и суспензию клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном так, чтобы количество клеток на лунку составляло 15000. Потом, (S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламид (соединение A), (S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламид (соединение B), (S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламид (соединение C), и (R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламид (соединение D), полученное в соответствии со способом получения, раскрытым в PTL 2, и (S)-N-(4-амино-5-(хинолин-3-ил)-6,7,8,9-тетрагидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламид, полученный в соответствии со способом получения, раскрытым в WO2013/125709A1 (соединение примера 1 в WO2013/125709A1, которое ниже по тексту также называется ʺсравнительное соединениеʺ) растворяли в DMSO, и разбавляли DMSO или средой, используемой для суспендирования клеток. Эти соединения индивидуально добавляли в каждую лунку планшета для культивирования клеток и инкубировали в 5% CO2 газ-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 3 дней. Количество клеток после инкубации измеряли с использованием CellTiter-Glo (товарный знак) для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток (Promega Corporation) в соответствии с рекомендованным протоколом производителя. Скорость роста рассчитывали, используя следующую формулу, и определяли концентрацию каждого тестируемого соединения для 50% ингибирования (IC50 (мкМ)).

[0079]

Скорость роста (%)=T/C×100

T: интенсивность люминесценции лунки, в которую было добавлено тестируемое соединение.

C: интенсивность люминесценции лунки, в которую не было добавлено тестируемое соединение.

[0080]

Кроме того, отношение IC50 между EGFR дикого типа и EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20 определяли с использованием следующей формулы. На фиг. 1 показаны результаты.

[0081]

отношение IC50=IC50 (WT)/IC50 (ex20ins)

IC50 (WT): IC50 для EGFR дикого типа

IC50 (ex20ins): IC50 для EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20

[0082]

Как видно из фиг. 1, соединения А-D проявляют ингибирующее действие на рост клеток на клеточных линиях, экспрессирующих EGFR со вставкой в экзоне 20; и их мутационная селективность была выше, чем у сравнительного соединения, гефитиниба, эрлотиниба и афатиниба.

[0083]

Пример испытаний 2

Эффект ингибирования роста клеток на EGFR дикого типа- или мутантных EGFR-экспрессирующих клеточных линиях человека (2)

Для оценки ингибирующей активности соединений в отношении EGFR дикого типа и мутантного EGFR были использованы следующие клетки: клетки NCI-H1975, которые представляют собой клеточные линии аденокарциномы легкого человека, экспрессирующие EGFR с мутацией D770_N771insSVD путем модификации генов (которая в дальнейшем также упоминается как «H1975-EGFRinsSVD»); и клетки A431, которые представляют собой клеточные линии эпителиального рака человека, экспрессирующие EGFR дикого типа. Клетки H1975-EGFRinsSVD получали следующим образом. Вектор PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro, в котором был закодирован D770_N771insSVD (insSVD), вводили в клетки NCI-H1975, вместе с вектором экспрессии Super PiggyBac Транспозаза, путем электропорации с использованием Amaxa (товарный знак) набора R Cell Line Nucleofector (товарный знак), с последующим отбором с использованием пуромицина (SIGMA). XTN (товарный знак) TALEN сайт-специфичные нуклеазы (Transposagen) вводили в клетки, путем электропорации с использованием Amaxa (товарный знак) набора R клеточных линий Nucleofector (товарный знак), и эндогенные-EGFR (T790M/L858R)-нокаутные клетки отбирали путем секвенирования.

[0084]

Для оценки эффекта ингибирования роста клеток, отдельные типы клеток суспендировали в среде, рекомендованной ATCC. Суспензии клеток высевали в каждую лунку соответствующих 96-луночных планшетов с плоским дном так, чтобы количество клеток на лунку составляло 3000, и инкубировали в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 1 дня. Соединение A, сравнительное соединение, гефитиниб, эрлотиниб и афатиниб индивидуально растворяли в DMSO, и разбавляли DMSO так, что концентрация этих испытуемых соединений в 200 раз превышала конечную концентрацию. Эти растворы DMSO тестируемых соединений разбавляли средой, используемой для суспендирования клеток, и добавляли в каждую лунку культуральных планшетов клеток таким образом, чтобы конечная концентрация DMSO составляла 0,5%, и клетки инкубировали в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 3 дней. Количество клеток в момент начала инкубации (день 0) и количество клеток после инкубации (день 3) измеряли с использованием CellTiter-Glo (товарный знак) для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток (Promega Corporation) в соответствии с рекомендованным протоколом производителя. Скорость роста рассчитывали, используя следующую формулу, и определяли концентрацию каждого тестируемого соединения для 50% ингибирования (GI50 (мкМ)). В таблице 1 показаны результаты.

[0085]

1) Если T в день 3 ≥ C в день 0:

Скорость роста (%)=(T в день 3 - C в день 0)/(C в день 3 - C в день 0)×100

T: интенсивность люминесценции лунки, в которую было добавлено тестируемое соединение.

C: интенсивность люминесценции лунки, в которую не было добавлено тестируемое соединение.

День 0: день, когда было добавлено тестируемое соединение.

День 3: день, когда была выполнена оценка.

[0086]

2) Если T в день 3 < C в день 0:

Скорость роста (%)=(T в день 3 - C в день 0)/(C в день 0)×100

T: интенсивность люминесценции лунки, в которую было добавлено тестируемое соединение.

C: интенсивность люминесценции лунки, в которую не было добавлено тестируемое соединение.

День 0: день, когда было добавлено тестируемое соединение.

День 3: день, когда была выполнена оценка.

[0087]

Таблица 1

GI50 (мкM)

A431 H1975 EGFRinsSVD Соединение A 0,396 0,031 Сравнительное соединение 0,543 0,364 гефитиниб 0,310 1,903 эрлотиниб 0,612 2,775 афатиниб 0,023 0,189 осимертиниб 0,321 0,194

[0088]

Кроме того, отношение GI50 между EGFR дикого типа и EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20 определяли с использованием следующей формулы. В таблице 2 показаны результаты.

[0089]

Отношение GI50=GI50 (A431)/GI50 (H1975 EGFRinsSVD)

GI50 (A431): GI50 для EGFR дикого типа

GI50 (H1975 EGFRinsSVD): GI50 для EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20

[0090]

Как видно из таблицы 1 и фиг. 2, соединение А проявляло ингибирующее действие на рост клеток на клеточных линиях, экспрессирующих мутантный EGFR со вставкой в экзоне 20, их мутационная селективность была выше, чем у сравнительного соединения, гефитиниба, эрлотиниба, афатиниба и осимертиниба.

[0091]

Пример испытаний 3

Оценка ингибирующей активности фосфорилированного EGFR против EGFR дикого типа- или мутантных EGFR-экспрессирующих клеточных линий человека

Клетки A431, которые представляют собой клеточные линии эпителиального рака человека, сверхэкспрессирующие EGFR дикого типа, и клетки H1975-EGFRinsSVD, которые являются клеточными линиями аденокарциномы легкого человека, экспрессирующими EGFR с мутацией D770_N771insSVD путем модификации генов, суспендировали в соответствующих средах. Эти клеточные суспензии индивидуально высевали в 60-мм чашку и инкубировали в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 1 дня. Соединение А растворяли в DMSO, и разбавляли DMSO так, что концентрация испытуемого соединения в 1000 раз превышала конечную концентрацию. Раствор DMSO тестируемого соединения разбавляли каждой средой, используемой для суспендирования клеток, и каждый разбавленный раствор добавляли в соответствующие чашки для культивирования клеток таким образом, чтобы конечная концентрация DMSO составляла 0,1%, с последующей инкубацией в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 6 часов. После инкубации клетки собирали и хранили при -80°C в форме пеллет до использования. К пеллетам добавляли буфер RIPA (Thermo Fisher Scientific), содержащий смесь ингибиторов протеаз (Thermo Fisher Scientific), и белки внутри клеток экстрагировали. Концентрацию белков измеряли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific), и каждый образец корректировали таким образом, чтобы иметь концентрацию белка, подходящую для измерения экспрессии фосфорилированного EGFR. Экспрессию фосфорилированного EGFR измеряли с использованием системы анализа Simple Western (товарный знак) (ProteinSimple) в соответствии с рекомендованным протоколом производителя. Первичное антитело, использованное при измерении, представляло собой рецептор фосфо-EGF (Tyr1068) #3777 (CST), разведенный до 1/50.

[0092]

Для каждого типа клеток была получена калибровочная кривая концентрации белка (ось x) и уровня экспрессии фосфорилированного EGFR (ось y), и уровень экспрессии фосфорилированного EGFR каждого образца был преобразован в концентрацию белка на основании калибровочной кривой. Скорость фосфорилированного EGFR рассчитывали с использованием следующей формулы для определения концентрации испытуемого соединения, при которой фосфорилированный EGFR ингибируется на 50% (IC50 (мкM)).

[0093]

Скорость фосфорилированного EGFR (%)=T/C×100

T: эквивалентное количество для концентрации белка образца, к которому было добавлено испытуемое соединение.

C: эквивалентное количество для концентрации белка образца, к которому не было добавлено испытуемое соединение.

[0094]

Кроме того, селективность в отношении EGFR дикого типа и EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20 рассчитывали с использованием следующей формулы. В таблице 2 показаны результаты.

[0095]

Отношение IC50=IC50 (A431)/IC50 (H1975 EGFRinsSVD)

IC50 (A431): IC50 для EGFR дикого типа

IC50 (H1975 EGFRinsSVD): IC50 EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20

[0096]

Таблица 2

IC50 (мкM) A431 H1975 EGFRinsSVD IC50 (мкM) 0,535 0,023 Отношение IC50 - 23,3

[0097]

Как видно из таблицы 2, соединение А проявляло селективную ингибирующую активность против EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20.

[0098]

Пример испытаний 4

Оценка ингибирующей активности фосфорилированного EGFR против EGFR дикого типа- или мутантных EGFR-экспрессирующих клеточных линий человека (2)

Ингибирующую аутофосфорилирование активность соединения против EGFR дикого типа и мутантного EGFR оценивали с помощью клеток NIH-3T3, являющихся линиями клеток фибробластов мыши, в которые был введен ген EGFR человека. Клетки NIH-3T3 поддерживали в среде D-MEM (с высоким содержанием глюкозы) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), содержащей 10% сыворотку новорожденных телят (NBCS), 1500 мг/л гидрокарбоната натрия и 100 ед/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific). Вектор PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro, в котором был закодирован ген EGFR человека (WT, insASV, insSVD, insG, insNPH или insPH), вводили в клетки, вместе с вектором экспрессии Super PiggyBac Транспозаза, путем электропорации с использованием Amaxa (товарный знак) набора R Cell Line Nucleofector (товарный знак), с последующим отбором с использованием пуромицина (SIGMA). Клетки NIH-3T3, экспрессирующие EGFR дикого типа (которые далее также называются ʺNIH3T3-EGFR_WTʺ), демонстрировали рост в присутствии 50 нг/мл EGF (R&D Systems) в условиях 1% NBCS. Клетки NIH-3T3, экспрессирующие EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20 (которые далее также называются ʺNIH3T3-EGFRinsASV,ʺ ʺNIH3T3-EGFRinsSVD,ʺ ʺNIH3T3-EGFRinsG,ʺ ʺNIH3T3-EGFRinsNPHʺ или ʺNIH3T3-EGFRinsPHʺ) демонстрировали рост в отсутствие EGF в условиях 1% NBCS.

[0099]

Для оценки активности, ингибирующей EGFR-аутофосфорилирование, клетки NIH3T3, в которые был введен EGFR человека, суспендировали в соответствующих средах. Эти клеточные суспензии индивидуально высевали в 60-мм чашку или 6-луночный планшет с плоским дном, и инкубировали в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 1 дня. Соединение А растворяли в DMSO, и разбавляли DMSO так, что концентрация испытуемого соединения в 400 раз превышала конечную концентрацию. Растворы DMSO тестируемого соединения разбавляли средой, используемой для суспендирования клеток, и добавляли в чашки для культивирования клеток таким образом, чтобы конечная концентрация DMSO составляла 0,25%. Кроме того, EGF добавляли в чашку для культивирования клеток NIH3T3-EGFR_WT с получением конечной концентрации 50 нг/мл. Все чашки для культивирования подвергали инкубации. Все чашки для культивирования подвергали инкубации в 5% CO2-содержащем инкубаторе при 37°C в течение 6 часов. После инкубации клетки собирали и хранили при -80°C в форме пеллет до использования. К пеллетам добавляли буфер RIPA (Thermo Fisher Scientific), содержащий смесь ингибиторов протеаз (Thermo Fisher Scientific), и белки внутри клеток экстрагировали. Концентрацию белка измеряли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific), и каждый образец доводили до концентрации белка, подходящей для измерения экспрессии фосфорилированного EGFR. Экспрессию фосфорилированного EGFR измеряли с использованием системы анализа (ProteinSimple) Simple Western (товарный знак) в соответствии с рекомендованным протоколом производителя. Первичное антитело, использованное при измерении, представляло собой рецептор фосфо-EGF (Tyr1068) #3777 (CST), разведенный до 1/50.

[0100]

Для каждого типа клеток была получена калибровочная кривая концентрации белка (ось x) и уровня экспрессии фосфорилированного EGFR (ось y), и уровень экспрессии фосфорилированного EGFR каждого образца был преобразован в концентрацию белка на основании калибровочной кривой. Скорость ингибирования фосфорилированного EGFR рассчитывали с использованием следующей формулы для определения концентрации испытуемого соединения, при которой фосфорилированный EGFR ингибируется на 50% (IC50 (мкM)).

[0101]

Скорость ингибирования фосфорилированного EGFR (%)=T/C×100

T: эквивалентное количество для концентрации белка образца, к которому было добавлено испытуемое соединение.

C: эквивалентное количество для концентрации белка образца, к которому не было добавлено испытуемое соединение.

[0102]

Кроме того, селективность в отношении EGFR дикого типа и EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20 рассчитывали с использованием следующей формулы. В таблице 3 показаны результаты.

[0103]

Отношение IC50=IC50 (WT)/IC50 (мутация EGFR со вставкой в экзоне 20)

[0104]

Таблица 3

WT insASV insSVD insG insNPH insPH IC50 (мкM) 0,571 0,197 0,033 0,073 0,083 0,159 Отношение IC50 - 2,9 17,1 7,9 6,9 3,6

[0105]

Как видно из таблицы 3, соединение А проявляло селективную ингибирующую активность против EGFR с мутациями со вставкой в экзоне 20.

[0106]

Как видно из результатов примеров испытаний 1-4, соединения A-D проявляли эффект ингибирования роста клеток, сопровождаемый эффектом ингибирования EGFR, на клеточных линиях, экспрессирующих EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20; и эффект и их мутационная селективность были выше, чем у сравнительного соединения, гефитиниба, эрлотиниба, афатиниба и осимертиниба.

[0107]

Пример испытаний 5

Тест In Vivo эффективности лекарственного средства

Оценка противоопухолевого эффекта на модели с подкожно трансплантированными мутант EGFR-экспрессирующими клеточными линиями

"Голым" мышам подкожно трансплантировали клетки NIH3T3-EGFRinsASV, клетки NIH3T3-EGFRinsSVD или клетки H1975-EGFRinsSVD, в которые был введен мутантный EGFR человека. В тот момент, когда объем опухоли привитой опухоли у ʺголыхʺ мышей вырос до примерно 100-200 мм3, мышей распределяли по группам, по 5-6 мышей на каждую группу, путем стратифицированной рандомизации таким образом, чтобы средний объем опухоли между группами был одинаковым. Затем мышам перорально вводили соединение А или афатиниб один раз в день в течение 14 дней подряд.

Доза афатиниба составляла 20 мг/кг/день, что является максимально переносимой дозой (максимальная доза, при которой потеря массы в течение периода дозирования составляет менее 20%) в течение 14 дней, период дозирования в этом тесте; и доза соединения А составляла 200 мг/кг/сутки (максимально переносимая доза). Максимальную переносимую дозу определяли в соответствии с ʺGuidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Ratsʺ of the National Cancer Institute (NCI), с гуманитарной точки зрения.

[0108]

Для сравнения изменений роста опухоли с течением времени, обусловленных введением отдельных тестируемых соединений, был рассчитан относительный объем опухоли (далее также именуемый ʺRTVʺ) на основе объема опухоли на момент разделения мышей на группы (который принимается за 1 для индекса роста опухоли), используя следующую формулу. Для индекса токсичности измеряли массу тела с течением времени, и среднее изменение массы тела (далее также именуемое ʺBWC (%)ʺ) со дня деления мышей на группы рассчитывали по следующей формуле. На фиг. 3-8 показаны изменения среднего RTV и среднего BWC у мышей.

[0109]

RTV=(объем опухоли в день измерения объема опухоли)/(объем опухоли в день, когда мышей разделили на группы)

BWC (%)=(масса тела, измеренная в день измерения массы тела)/(масса тела в день, когда мышей разделили на группы)

[0110]

Когда среднее значение RTV в группе, которой вводили соединение A, в последний день оценки, было меньше, чем среднее значение RTV в группе, которой вводили афатиниб, и в то же время наблюдалось статистически значимое различие (t-критерий Стьюдента, p <0,05), было определено, что соединение A является значительно более эффективным, чем афатиниб. Такой случай обозначен символом «*» на фигурах. Т/С (%) в последний день оценки рассчитывали в соответствии со следующей формулой. В таблице 4 показаны результаты.

[0111]

Таблица 4

Трансплантированная опухоль Соединение 20 мг/кг 200 мг/кг NIH3T3
EGFRinsASV
Соединение А по настоящему изобретению N.D. 3
Афатиниб 46 N.D. NIH3T3
EGFRinsSVD
Соединение А по настоящему изобретению N.D. 5
Афатиниб 39 N.D. H1975
EGFRinsSVD
Соединение А по настоящему изобретению N.D. 6
Афатиниб 79 N.D.

N.D.: данные отсутствуют.

[0112]

Как видно из результатов фиг.3-8 и таблицы 4, соединение А продемонстрировало значительный противоопухолевый эффект на клеточных линиях, экспрессирующих EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20, подкожно трансплантированных ʺголымʺ мышам. Эффект также был выше, чем у афатиниба, без симптомов, таких как серьезная потеря массы, ненормальный кал или ненормальная кожа у мышей.

[0113]

Пример испытаний 6

Тест In Vivo эффективности лекарственного средства

Оценка противоопухолевого эффекта на модели с подкожно трансплантированными мутант EGFR-экспрессирующими клеточными линиями

"Голым" мышам подкожно трансплантировали клетки NIH3T3-EGFRinsNPH, в которые был введен мутантный EGFR человека. В тот момент, когда объем привитой опухоли у ʺголыхʺ мышей вырос до примерно 100-200 мм3, мышей распределяли по группам, по 6 мышей на каждую группу, путем стратифицированной рандомизации таким образом, чтобы средний объем опухоли между группами был одинаковым. Затем мышам перорально вводили соединение А или афатиниб один раз в день в течение 10 дней подряд.

[0114]

Доза афатиниба составляла 20 мг/кг/день, что является максимально переносимой дозой (максимальная доза, при которой потеря массы в течение периода дозирования составляет менее 20%); и доза соединения А составляла 100 и 200 мг/кг/день. Максимальную переносимую дозу определяли в соответствии с ʺGuidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Ratsʺ of the National Cancer Institute (NCI), с гуманитарной точки зрения.

[0115]

Для сравнения изменений роста опухоли с течением времени, обусловленных введением отдельных тестируемых соединений, объем опухоли (который далее также называется ʺTVʺ) каждой мыши рассчитывали с использованием следующей формулы. Для индекса токсичности измеряли массу тела с течением времени, и изменение массы тела (далее также именуемое ʺBWC (%)ʺ) со дня деления мышей на группы рассчитывали по следующей формуле. На фиг. 9 и 10 показаны изменения в среднем TV и среднем BWC мышей.

[0116]

TV (мм3)=(большая ось × короткая ось2)/2

BWC (%)=(масса тела, измеренная в день измерения массы тела)/(масса тела в день, когда мышей разделили на группы)

[0117]

Когда среднее значение TV в группе, которой вводили соединение A, на следующий день после окончательного введения было меньше, чем среднее значение TV в контрольной группе, в то же время наблюдалось статистически значимое различие (тест Даннетта, p <0,05), было определено, что соединение A является эффективным в противоопухолевом эффекте. Такой случай обозначен символом «*» на фигурах. Т/С (%) в последний день оценки рассчитывали в соответствии со следующей формулой. В таблице 5 показаны результаты.

[0118]

T/C (%)=(объем опухоли группы, которой вводили тестируемое соединение)/(объем опухоли контрольной группы)

[0119]

Таблица 5

Трансплантированная опухоль Соединение 20 мг/кг 200 мг/кг NIH3T3
EGFRinsNPH
Соединение A N.D. 2
Афатиниб 59 N.D.

N.D.: данные отсутствуют.

[0120]

Как видно из фиг. 9 и 10, и таблицы 5, соединение А по настоящему изобретению продемонстрировало значительный противоопухолевый эффект на клеточных линиях, экспрессирующих EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20, подкожно трансплантированных ʺголымʺ мышам, сопровождаемый ингибированием роста опухоли или регрессией опухоли. В оценке, мыши также не показали серьезную потерю массы.

[0121]

Пример испытаний 7

Оценка противоопухолевого эффекта на крысиной модели с подкожно трансплантированными мутант EGFR-экспрессирующими клеточными линиями

"Голым" крысам подкожно трансплантировали клетки H1975-EGFRinsSVD, в которые был введен мутантный EGFR человека. В тот момент, когда объем опухоли привитой опухоли у ʺголыхʺ крыс вырос до примерно 200-500 мм3, крыс распределяли по группам, по 6 крыс на каждую группу, путем стратифицированной рандомизации таким образом, чтобы средний объем опухоли между группами был одинаковым. Затем крысам перорально вводили соединение А один раз в день в течение 14 дней подряд.

[0122]

Доза составляла 20 или 40 мг/кг/день, что меньше максимальной переносимой дозы (максимальная доза, при которой потеря массы в течение периода дозирования составляет менее 20%) в течение 14 дней, период дозирования в этом тесте. Максимальную переносимую дозу определяли в соответствии с ʺGuidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Ratsʺ of the National Cancer Institute (NCI), с гуманитарной точки зрения.

Для сравнения изменений роста опухоли с течением времени, обусловленных введением тестируемых соединений, объем опухоли (который далее также называется ʺTVʺ) каждой крысы рассчитывали с использованием следующей формулы. Для индекса токсичности измеряли массу тела с течением времени, и изменение массы тела (далее также именуемое ʺBWC (%)ʺ) со дня деления крыс на группы рассчитывали по следующей формуле. На фиг. 11 и 12 показаны изменения в среднем TV и среднем BWC крыс.

[0123]

TV (мм3)=(большая ось × короткая ось2)/2

BWC (%)=(масса тела, измеренная в день измерения массы тела)/(масса тела в день, когда крыс разделили на группы)

[0124]

Когда среднее значение TV в группе, которой вводили соединение A в последний день оценки, было меньше, чем среднее значение TV в контрольной группе, в то же время наблюдалось статистически значимое различие (тест Даннетта, p <0,05), было определено, что соединение A является эффективным в противоопухолевом эффекте. Такой случай обозначен символом «*» на фигурах. Т/С (%) в последний день оценки рассчитывали в соответствии со следующей формулой. В таблице 6 показаны результаты.

[0125]

T/C (%)=(объем опухоли группы, которой вводили тестируемое соединение)/(объем опухоли контрольной группы)

[0126]

Таблица 6

Трансплантированная опухоль Соединение 20 мг/кг 40 мг/кг H1975
EGFRinsSVD
Соединение A 7 3

[0127]

Как видно из фиг. 11 и 12, и таблицы 6, соединение А продемонстрировало значительный противоопухолевый эффект на клеточных линиях, экспрессирующих EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20, подкожно трансплантированных ʺголымʺ крысам, сопровождаемый ингибированием роста опухоли или регрессией опухоли. В оценке, крысы не показали серьезную потерю массы.

[0128]

Пример испытаний 8

Оценка противоопухолевого эффекта на мышиной модели c подкожно трансплантированной опухолью, полученной от пациента c мутант EGFR-положительным раком легкого

"Голым" мышам подкожно трансплантировали LXF 2478, которая представляет собой опухоль, полученную от пациента с раком легкого человека, который был положительным для EGFR с мутацией V769_D770insASV. В тот момент, когда объем опухоли привитой опухоли у ʺголыхʺ мышей вырос до примерно 100-200 мм3, мышей распределяли по группам, по 8 мышей на каждую группу, путем стратифицированной рандомизации таким образом, чтобы средний объем опухоли между группами был одинаковым. Затем мышам перорально вводили соединение А или афатиниб один раз в день в течение 28 дней подряд, и был установлен двухнедельный период наблюдения.

[0129]

Доза афатиниба составляла 20 мг/кг/день, что является максимально переносимой дозой (максимальная доза, при которой потеря массы в течение периода дозирования составляет менее 20%); и доза соединения А составляла 100 и 200 мг/кг/день. Максимальную переносимую дозу определяли в соответствии с ʺGuidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Ratsʺ of the National Cancer Institute (NCI), с гуманитарной точки зрения.

[0130]

Для сравнения изменений роста опухоли с течением времени, обусловленных введением отдельных тестируемых соединений, был рассчитан относительный объем опухоли (далее также именуемый ʺRTVʺ) на основе объема опухоли на момент разделения мышей на группы (который принимается за 1 для индекса роста опухоли), используя следующую формулу. Для индекса токсичности измеряли массу тела с течением времени, и изменение массы тела (далее также именуемое ʺBWC (%)ʺ) со дня деления мышей на группы рассчитывали по следующей формуле. На фиг. 13 и 14 показаны изменения среднего RTV и среднего BWC у мышей.

[0131]

RTV=(объем опухоли в день измерения объема опухоли)/(объем опухоли в день, когда мышей разделили на группы)

BWC (%)=(масса тела, измеренная в день измерения массы тела)/(масса тела в день, когда мышей разделили на группы)

[0132]

Когда среднее значение RTV в группе, которой вводили соединение А, на следующий день после последнего введения (день 28), было меньше, чем среднее значение RTV в контрольной группе, при этом также наблюдалось статистически значимое различие (тест Даннетта, p <0,05), было определено, что соединение A является эффективным. Такой случай обозначен символом «*» на фигурах. T/C (%) на следующий день после последнего введения (день 28), рассчитывали в соответствии со следующей формулой. В таблице 7 показаны результаты.

[0133]

T/C (%)=(RTV группы, которой вводили тестируемое соединение)/(RTV контрольной группы)

[0134]

Таблица 7

Трансплантированная опухоль Соединение 20 мг/кг 100 мг/кг 200 мг/кг LXF2478 Соединение A N.D. 2,0 0,1 Афатиниб 16,8 N.D. N.D.

[0135]

Как видно из фиг. 13 и 14, и таблицы 7 соединение А продемонстрировало значительный противоопухолевый эффект на опухоль, полученную у пациента с раком легкого, который был положительным на EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20, подкожно трансплантированную ʺголымʺ мышам, сопровождающийся регрессией опухоли. Эффект сохранялся в течение периода наблюдения, и у мышей не наблюдалось серьезной потери массы.

[0136]

Пример испытаний 9

Оценка эффекта продления жизни на модели с трансплантированными мутант EGFR-экспрессирующими клеточными линиями в легком

Штамм H1975-EGFRinsSVD-Luc был создан путем введения люциферазы в H1975-EGFRinsSVD, которая представляет собой человеческую мутант EGFR-введенную клеточную линию. pJTI (товарный знак) Fast DEST вектор, который был получен путем кодирования люциферазы в клетки NCI-H1975-EGFRinsSVD, вводили в клетки H1975-EGFRinsSVD-Luc, вместе с вектором экспрессии интегразы pJTI (товарный знак) PhiC31, путем электропорации с использованием Amaxa (товарный знак) набора R Cell Line Nucleofector (товарный знак), с последующей селекцией с использованием гигромицина B (Nacalai Tesque Inc.).

[0137]

При оценке эффекта продления жизни эквивалентное количество Matrigel добавляли к суспензии культивируемых клеток H1975-EGFRinsSVD-Luc для получения клеточной суспензии, и клеточную суспензию трансплантировали в правое легкое ʺголыхʺ мышей. На 6 день после трансплантации всем живым мышам вводили люциферин через хвостовую вену и распределяли по группам по 9 мышей на каждую группы путем стратифицированной рандомизации, так что средняя интенсивность люминесценции между группами была одинаковой. Затем мышам перорально вводили соединение А или афатиниб один раз в день в последовательные дни. Доза афатиниба составляла 20 мг/кг/день, что является максимально переносимой дозой (максимальная доза, при которой потеря массы в течение периода дозирования составляет менее 20%); и доза соединения А составляла 100 и 200 мг/кг/день. Максимальную переносимую дозу определяли в соответствии с ʺGuidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Mice and Ratsʺ of the National Cancer Institute (NCI), с гуманитарной точки зрения.

[0138]

Для оценки эффекта продления жизни наблюдали период выживания после трансплантации и определяли время выживания каждой мыши. Из времени выживания рассчитывали среднее время выживания (которое далее также называется «MST») для каждой группы и эффект продления периода выживания (то есть увеличение продолжительности жизни, которое далее также называют ʺI.L.S. (%)ʺ) рассчитывали на основании MST контрольной группы и группы, которой вводили тестируемое соединение, используя следующую формулу. Для индекса токсичности измеряли массу тела с течением времени, и изменение массы тела (далее также именуемое ʺBWC (%)ʺ) со дня деления мышей на группы рассчитывали по следующей формуле.

[0139]

I.L.S. (%)=(T/C-1)×100

T: MST группы, которой вводили тестируемое соединение

C: MST контрольной группы

[0140]

BWC (%)=(масса тела, измеренная в день измерения массы тела)/(масса тела в день, когда мышей разделили на группы)

[0141]

Когда MST группы, которой вводили соединение A, было больше, чем MST контрольной группы, при этом демонстрируя статистически значимое различие (тест Уилкоксона, p <0,05), было определено, что соединение A является эффективным для продления жизни. В таблице 8 показаны результаты.

[0142]

Таблица 8

Трансплантированная опухоль Соединение MST I.L.S. (%) Значение p H1975
EGFR
insSVD
Контроль с введением растворителя 44 N.A. N.A.
Соединение A
100 мг/кг
70 59 <0,01
Соединение A
200 мг/кг
89 102 <0,01
Афатиниб
20 мг/кг
54 23 N.S.

N.A.: Анализ не применен.

N.S.: Никаких существенных различий не наблюдали.

[0143]

Как видно из Таблицы 8, соединение А демонстрировало значительный эффекта продления жизни на моделях ʺголыхʺ мышей, которым трансплантировали в одной и той же части их легкого клеточные линии, экспрессирующие EGFR с мутацией со вставкой в экзоне 20. Однако афатиниб не проявлял такого эффекта продления жизни на моделях мышей. Мыши, которым вводили соединение А, также не показали серьезной потери массы.

[0144]

Пример испытаний 10

Оценка фосфорилированный-EGFR ингибирующей активности в трансплантированной опухоли и ткани кожи мыши

"Голым" мышам подкожно трансплантировали клетки NIH3T3-EGFRinsSVD, в которые был введен мутантный EGFR человека. В тот момент, когда объем опухоли опухоли, привитой у ʺголыхʺ мышей, вырос до примерно 250-500 мм3, мышей распределяли по группам, по 3 мыши на каждую группу, путем стратифицированной рандомизации таким образом, чтобы средний объем опухоли между группами был одинаковым. Затем мышам перорально вводили соединение А или афатиниб один раз. Через один час и три часа после введения, то есть примерно в то время, когда достигается максимальная концентрация соединения А и афатиниба в крови, собирали опухоль и ткани кожи. Собранную ткань подвергали мгновенному замораживанию с жидким азотом и хранили при -80°С до использования. Опухоль и ткань кожи гомогенизировали с добавлением буфера RIPA (Thermo Fisher Scientific), содержащего смесь ингибиторов протеаз (Thermo Fisher Scientific), и белки внутри клеток экстрагировали. Концентрацию белка измеряли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific), и каждый образец доводили до концентрации белка, подходящей для измерения экспрессии фосфорилированного EGFR. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF. После блокирования рецептор фосфо-EGF (Tyr1068)#2234 (CST), который является первичным антителом, разбавляли 0,1% буфером TBS-T до 1/1000 и давали возможность взаимодействовать при 4°C в течение ночи. После этого HRP-меченное анти-кроличье антитело #NA9340V (GE Healthcare), которое является вторичным антителом, разбавляли до 1/2500 5% раствором обезжиренного молока, с 0,1% буфером TBS-T, и давали взаимодействовать при комнатной температуре в течение 40 минут. После взаимодействия с ECL-Prime (GE Healthcare) детектирование осуществляли с помощью анализатора изображения LAS-3000 (GE Healthcare).

[0145]

Результаты испытаний показывают, что соединение A избирательно ингибирует мутантный EGFR в опухоли по сравнению с EGFR дикого типа в коже.

Список последовательностей

P17-145WO_PCT_exon 20insertion mutation _20171013_112510_12.txt

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР МУТАНТА EGFR С ИНСЕРЦИЕЙ В ЭКЗОНЕ 20

<130> P17-145WO

<150> JP 2016-213072

<151> 2016-10-31

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe

1010 1015 1020

Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu

1025 1030 1035

Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn

1040 1045 1050

Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg

1055 1060 1065

Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp

1070 1075 1080

Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro

1085 1090 1095

Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln

1100 1105 1110

Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro

1115 1120 1125

His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln

1130 1135 1140

Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala

1145 1150 1155

Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln

1160 1165 1170

Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys

1175 1180 1185

Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln

1190 1195 1200

Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

1205 1210

<---

Похожие патенты RU2774629C2

название год авторы номер документа
СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР EGFR, ИМЕЮЩЕГО МУТАЦИЮ В ЭКЗОНЕ 18 И/ИЛИ ЭКЗОНЕ 21 2018
  • Абе, Наоми
  • Хасако, Синити
RU2785657C2
L718 И/ИЛИ L792 МУТАНТНЫЙ ИНГИБИТОР РЕЗИСТЕНТНОГО К ЛЕЧЕНИЮ EGFR 2019
  • Хасако, Синити
  • Уно, Такао
RU2809621C2
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК EGFR/CD16 2019
  • Клюге Михаэль
  • Тесар Михаэль
  • Фучек Ивица
  • Элльвангер Кристина
  • Ройщ Уве
  • Дамрат Михаэль
  • Райкович Эрих
  • Тредер Мартин
RU2792240C2
КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПУТЕМ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО MVA И АНТИТЕЛА 2018
  • Хохрайн, Хубертус
  • Лаутербах, Хеннинг
  • Медина Эчеверс, Хосе
  • Хабьян, Маттиас
RU2795103C2
МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ CD137 И OX40 2019
  • Тьюна, Михрибан
  • Гаспар, Мигель
  • Морроу, Мишель
  • Пун, Эдмунд
RU2817602C2
СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ PD-L1 и LAG-3 2017
  • Кемпбелл, Джейми
  • Сэнди, Николь
  • Тьюна, Михрибан
  • Воллертон Ван Хорк, Франциска
  • Эверетт, Кэти Луиз
  • Гаспар, Мигель
  • Краман, Мэттью
  • Кмичик, Катаржина
  • Фаруди, Мустафа
  • Фош, Натали
  • Хебеис, Барбара
RU2784388C2
ЛЕЧЕНИЕ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИ-NKG2A СРЕДСТВ 2015
  • Андре Паскаль
  • Блери Матьё
  • Сулас Каролина
  • Вагтманн Николай
RU2721271C2
АНТИТЕЛО ПРОТИВ SIRPα 2019
  • Матодзаки Такаси
  • Суе Маюми
  • Накамура Кенсуке
  • Йосимура Тигуса
RU2791002C2
АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD147 2018
  • Фукути, Кейсуке
  • Нанаи, Каёко
  • Амано, Масато
  • Йонеда, Кодзо
  • Тотоки, Юсуке
  • Ямамото, Сёдзи
RU2785293C2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ VSIG4 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2019
  • Квон, Биоунг С.
  • Ким, Хие Дзеонг
  • Хванг, Сунхее
  • Ли, Дзоонгвон
  • Ли, Сеунг Хиун
  • Им, Сун-Воо
  • Чой, Дзин Киунг
  • Сон, Хиун Тае
  • Парк, Хиеок-Дзун
RU2776638C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 774 629 C2

Реферат патента 2022 года СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР МУТАНТА EGFR СО ВСТАВКОЙ В ЭКЗОНЕ 20

Изобретение относится к способу лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, соединением, выбранным из группы, состоящей из: (S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида; (S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида; и (S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и (R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида или его соли. Также предложено применение указанного соединения для получения противоопухолевого средства для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 10 пр.

Формула изобретения RU 2 774 629 C2

1. Способ лечения пациента со злокачественной опухолью, включающий стадию введения эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида;

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида;

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида,

или его соли пациенту со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

2. Способ по п. 1, где соединение представляет собой (S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламид.

3. Способ по п. 1 или 2, где пациент со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, является пациентом с раком легкого, раком молочной железы, раком головы и шеи, опухолью мозга, раком матки, гематобластозом или раком кожи.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где пациент со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20, является пациентом с раком легкого.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где одна или более аминокислот вставлены в область экзона 20.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где 1-7 аминокислот вставлены в область экзона 20.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой мутацию, где 1-4 аминокислот вставлены в область экзона 20.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где мутация со вставкой в экзоне 20 представляет собой V769_D770insASV, D770_N771insSVD, D770_N771insG, H773_V774insNPH или H773_V774insPH.

9. Применение соединения, выбранного из группы, состоящей из:

(S)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)акриламида;

(S)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)акриламида; и

(S,E)-N-(4-амино-6-метилен-5-(хинолин-3-ил)-7,8-дигидро-6H-пиримидо[5,4-b]пирролизин-7-ил)-3-хлоракриламида; и

(R)-N-(4-амино-6-метил-5-(хинолин-3-ил)-8,9-дигидропиримидо[5,4-b]индолизин-8-ил)-N-метилакриламида,

или его соли для получения противоопухолевого средства для лечения пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей EGFR, имеющий мутацию со вставкой в экзоне 20.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2774629C2

WO2015025936 A1, 26.02.2015 & RU 2016110096 A, 27.09.2017
YASUDA, Hiroyuki, "EGFR exon 20 insertion mutations in non-small-cell lung cancer: preclinical data and clinical implications", Lancet Oncol, 2012; 13: e23-31;
HIRANO, Toshiyuki, "In vitro modeling to deternine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically

RU 2 774 629 C2

Авторы

Миядера, Кадзутака

Аояги, Йосими

Хасако, Синити

Даты

2022-06-21Публикация

2017-10-13Подача