РЕЖИМ ДОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ АНТАГОНИСТОВ TFPI Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 C07K16/40 A61P7/04 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительным заявкам США № 62/802401, поданной 7 февраля 2019 года, и 62/744481, поданной 11 октября 2018 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

ОТСЫЛКА К СПИСКУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана в электронной форме через EFS-Web и включает предоставленный в электронной форме список последовательностей в формате.txt. Файл.txt содержит список последовательностей под названием "PC72450A_Sequence_Listing_ST25.txt", созданный 12 августа 2019 года и имеющий размер 42589 байт. Список последовательностей, находящийся в этом файле.txt, является частью описания и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к режимам дозирования антител-антагонистов TFPI.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Гемофилии A и B представляют собой X-сцепленные генетические нарушения в результате функционального дефицита белков плазмы фактора VIII (FVIII) или фактора IX (FIX), соответственно. Клиническая тяжесть гемофилии связана с остаточным уровнем активности фактора свертывания. Активность фактора <1% ассоциирована с тяжелым фенотипом, умеренная гемофилия ассоциирована с активностью фактора 2%-5% и мягкая гемофилия ассоциирована с активностью фактора 5%-40%. Настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительным заявкам США № 62/514242, поданной 2 июня 2017 года; и 62/663082, поданной 26 апреля 2018 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Стандартным способом лечения этих нарушений является восполнение отсутствующего фактора свертывания посредством внутривенных инфузий. Заместительным фактором часто является рекомбинантный белок, такой как Xyntha (фактор VIII) или BeneFIX (FIX), однако все еще применяются продукты плазмы различной чистоты. Эффективное профилактическое лечение требует внутривенной инъекции фактора 3-4 раза каждую неделю, что приводит к проблемам с соблюдением режима лечения и ухудшению качества жизни. Стоимость лечения также является высокой вследствие сложности производства факторов свертывания. Более того, у значительного количества пациентов, вплоть до у 32% пациентов с тяжелой гемофилией A, развиваются нейтрализующие антитела к введенным факторам, которые воспринимаются как чужеродные белки у пациентов с мутациями в этих генах. Этим пациентам требуются альтернативные способы лечения, такие как обходной фактор, фактор VIIa (NovoSeven).

Альтернативным подходом к терапии является обход необходимости в заместительных факторах посредством усиления внешнего пути. Пациенты с гемофилией обладают некоторой способностью к остановке кровотечения через их внешний путь; однако этого является недостаточно для подавления крупных кровотечений или для предотвращения спонтанных кровотечений. Внешний путь является недостаточным для обеспечения защиты, поскольку он быстро подавляется ингибитором пути тканевого фактора (TFPI).

В WO 2017/029583 описаны антитела-антагонисты TFPI и их применение и, таким образом, она включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Существует значительная неудовлетворенная потребность в идентификации режимов дозирования для антител-антагонистов TFPI, которые обеспечивают эффективную профилактическую защиту со сниженной частотой дозирования и возможностью альтернативных путей доставки (например, подкожный).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны и проиллюстрированы режимы дозирования для антител (и их антигенсвязывающих фрагментов), которые связываются с ингибитором пути тканевого фактора (TFPI). Специалистам в данной области будут понятны, или они способны установить с использованием не более чем стандартного экспериментирования, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются приведенными ниже вариантами осуществления (E).

E1. Способ укорочения времени кровотечения, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E2. Способ лечения или предупреждения дефицита свертывания крови или геморрагического нарушения, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E3. Способ лечения или предупреждения гемофилия A, B или C, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E4. Способ лечения или предупреждения болезни фон Виллебранда (vWD), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E5. Способ снижения активности TFPI, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E6. Способ согласно любому из E1-E5, где первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг и приблизительно 500 мг.

E7. Способ согласно любому из E1-E6, где первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 425 мг, приблизительно 450 мг, 475 мг и 500 мг.

E8. Способ согласно любому из E1-E7, где первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг и приблизительно 450 мг.

E9. Способ согласно любому из E1-E8, где первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг и приблизительно 450 мг.

E10. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг.

E11. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг.

E12. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 250 мг.

E13. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг.

E14. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет 300 мг.

E15. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 350 мг.

E16. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 400 мг.

E17. Способ согласно любому из E1-E9, где первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг.

E18. Способ согласно любому из E1-E16, дополнительно включающий введение индивидууму одной или нескольких последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E19. Способ согласно E18, где одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое является приблизительно таким же, меньшим или более высоким, чем первоначальная доза.

E20. Способ согласно E19, где одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое является приблизительно таким же, как и первоначальная доза.

E21. Способ согласно любому из E18-E20, где любая или обе из первоначальной дозы и последующей дозы выбраны из группы, состоящей из приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг и приблизительно 500 мг.

E22. Способ согласно любому из E18-E20, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы выбраны из группы, состоящей из 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 425 мг, 450 мг, 475 мг и 500 мг.

E23. Способ согласно любому из E18-E22, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы выбраны из группы, состоящей из приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг и приблизительно 450 мг.

E24. Способ согласно любому из E18-E23, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы выбраны из группы, состоящей из приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг и приблизительно 450 мг.

E25. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 150 мг.

E26. Способ согласно E25, где как первоначальная, так и последующая доза составляет приблизительно 150 мг.

E27. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 200 мг.

E28. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 250 мг.

E29. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 300 мг.

E30. Способ согласно E29, где как первоначальная доза, так и последующая доза составляет приблизительно 300 мг.

E31. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 350 мг.

E32. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 400 мг.

E33. Способ согласно E24, где любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 450 мг.

E34. Способ согласно E19, где последующую дозу вводят в количестве, которое меньше первоначальной дозы.

E35. Способ согласно E34, где последующая доза составляет приблизительно две трети от первоначальной дозы.

E36. Способ согласно E35, где первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг и последующая доза составляет приблизительно 300 мг.

E37. Способ согласно E35, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза составляет приблизительно 200 мг.

E38. Способ согласно E35, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза составляет приблизительно 100 мг.

E39. Способ согласно E34, где одна или несколько последующих доз составляют приблизительно половину от первоначальной дозы.

E40. Способ согласно E39, где первоначальная доза составляет приблизительно 400 мг и последующая доза составляет приблизительно 200 мг.

E41. Способ согласно E39, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза составляет приблизительно 150 мг.

E42. Способ согласно E39, где первоначальная доза составляет 300 мг и последующая доза составляет 150 мг.

E43. Способ согласно E39, где первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг и последующая доза составляет приблизительно 100 мг.

E44. Способ согласно E30, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза составляет приблизительно 75 мг.

E45. Способ согласно E34, где последующая доза составляет приблизительно одну треть от первоначальной дозы.

E46. Способ согласно E45, где первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг и последующая доза составляет приблизительно 150 мг.

E47. Способ согласно E45, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза составляет приблизительно 100 мг.

E48. Способ согласно E45, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза составляет приблизительно 50 мг.

E49. Способ согласно E34, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза составляет приблизительно 75 мг.

E50. Способ согласно E19, где одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое превышает первоначальную дозу.

E51. Способ согласно E50, где одна или несколько последующих доз в два раза превышают первоначальную дозу.

E52. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 75 мг и последующая доза составляет приблизительно 150 мг.

E53. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 100 мг и последующая доза составляет приблизительно 200 мг.

E54. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 125 мг и последующая доза составляет приблизительно 250 мг.

E55. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза составляет приблизительно 300 мг.

E56. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг и последующая доза составляет приблизительно 400 мг.

E57. Способ согласно E51, где первоначальная доза составляет приблизительно 225 мг и последующая доза составляет приблизительно 450 мг.

E58. Способ согласно E50, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг или приблизительно 450 мг.

E59. Способ согласно E50, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг или приблизительно 450 мг.

E60. Способ согласно любому из E18-E59, где одну или несколько последующих доз вводят один раз в сутки, один раз в 3 суток, один раз в 6 суток, два раза в неделю, один раз в неделю (еженедельно), один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели, один раз в 5 недель, один раз в 6 недель, один раз в 7 недель или один раз в 8 недель после первоначальной дозы.

E61. Способ согласно любому из E18-E60, где одну или несколько последующих доз вводят приблизительно через 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недели после первоначальной дозы.

E62. Способ согласно E61, где одну или несколько последующих доз вводят через 1 неделю после первоначальной дозы.

E63. Способ согласно E61, где одну или несколько последующих доз вводят один раз в неделю (еженедельно) после первоначальной дозы.

E64. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 150 мг.

E65. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 300 мг.

E66. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и одна или несколько последующих доз составляют приблизительно 150 мг.

E67. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная доза составляет 300 мг и одна или несколько последующих доз составляют 150 мг.

E68. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 450 мг.

E69. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг или приблизительно 450 мг.

E70. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 300 мг.

E71. Способ согласно любому из E61, E62 или E63, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг или приблизительно 450 мг.

E72. Способ согласно E71, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 400 мг.

E73. Способ согласно E71, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 425 мг.

E74. Способ согласно E71, где первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 450 мг.

E75. Способ согласно любому из E1-E74, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят подкожно.

E76. Способ согласно любому из E1-E74, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят внутривенно или внутримышечно.

E77. Способ согласно любому из E1-E76, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается с доменом Куница 1 (K1) TFPI.

E78. Способ согласно любому из E1-E77, где указанный эпитоп дополнительно содержит остатки Cys106, Gly108, Cys130, Leu131 и Gly132 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E79. Способ согласно любому из E1-E78, где указанный эпитоп дополнительно содержит Asp102, Arg112, Tyr127, Gly129, Met134 и Glu138 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E80. Способ согласно любому из E1-E79, где указанный эпитоп не содержит: E100, E101, P103, Y109, T111, Y113, F114, N116, Q118, Q121, C122, E123, R124, F125, K126 и L140 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E81. Способ согласно любому из E1-E80, где указанный эпитоп не содержит: D31, D32, P34, C35, K36, E100, E101, P103, Y109, K126 и G128 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

E82. Способ согласно любому из E1-E81, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

(b) определяющую комплементарность область два VH (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

(c) определяющую комплементарность область три VH (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

E83. Способ согласно любому из E1-E82, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 18 и 20.

E84. Способ согласно любому из E1-E83, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 18 и 20.

E85. Способ согласно любому из E1-E84, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

E86. Способ согласно любому из E1-E84, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

E87. Способ согласно любому из E1-E84, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

E88. Способ согласно любому из E1-E87, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

(b) определяющую комплементарность область два VL (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и

(c) определяющую комплементарность область три VL (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

E89. Способ согласно любому из E1-E88, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 11.

E90. Способ согласно любому из E1-E89, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

E91. Способ согласно любому из E1-E90, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

E92. Способ согласно любому из E1-E90, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

E93. Способ согласно любому из E1-E90, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

E94. Способ согласно любому из E1-E93, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E95. Способ согласно любому из E1-E81, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

(b) определяющую комплементарность область два VH (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

(c) определяющую комплементарность область три VH (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и

(ii) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

(b) определяющую комплементарность область два VL (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и

(c) определяющую комплементарность область три VL (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

E96. Способ согласно E95, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

E97. Способ согласно E96, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, кодируемую вставкой, присутствующей в плазмиде, депонированной под номером доступа ATCC № PTA-122329.

E98. Способ согласно E96 или E97, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VL, кодируемую вставкой, присутствующей в плазмиде, депонированной под номером доступа ATCC № PTA-122328.

E99. Способ согласно E96, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E100. Способ согласно E95, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

E101. Способ согласно E100, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E102. Способ согласно E95, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

E103. Способ согласно E102, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E104. Способ согласно любому из E1-E76, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

E105. Способ согласно любому из E1-E76, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

E106. Способ согласно любому из E1-E103, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 29 часов, по меньшей мере 30 часов по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 40 часов, по меньшей мере 50 часов, по меньшей мере 55 часов, по меньшей мере 60 часов, по меньшей мере 65 часов, по меньшей мере 70 часов, по меньшей мере 75 часов, по меньшей мере 80 часов, по меньшей мере 85 часов, по меньшей мере 90 часов, по меньшей мере 95 часов, по меньшей мере 100 часов, по меньшей мере 105 часов, по меньшей мере 110 часов, по меньшей мере 115 часов, по меньшей мере 120 часов или по меньшей мере 125 часов.

E107. Способ согласно любому из E1-E103, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет аффинность связывания (K_D) от приблизительно 5×10^-7 M до приблизительно 5×10^-11 M.

E108. Способ согласно любому из E1-E107, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет подкожную (п/к) биодоступность по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95 или по меньшей мере 99% относительно внутривенной биодоступности.

E109. Способ согласно любому из E1-E108, где индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту свертывания крови или геморрагическому нарушению.

E110. Способ согласно любому из E1-E109, где индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии A, B или C.

E111. Способ согласно любому из E1-E110, где индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии A или B.

E112. Способ согласно любому из E1-E109, где индивидуум страдает от или предрасположен к болезни фон Виллебранда (vWD).

E113. Способ согласно любому из E1-E109, где индивидуум страдает от или предрасположен к тромбоцитарному нарушению.

E114. Способ согласно любому из E1-E109, где индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту фактора VII.

E115. Способ согласно любому из E1-E109, где индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту фактора XI.

E116. Способ согласно любому из E1-115, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента: (i) уменьшает время свертывания при измерении в плазме в анализе протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT); (ii) снижает время свертывания в цельной крови при определении посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластографии; (iii) увеличивает образование тромбина; (iv) повышает активность FXa в присутствии TFPI; (v) повышает накопление тромбоцитов в присутствии TFPI; (vi) повышает образование фибрина в присутствии TFPI при измерении посредством D-димеров; (vii) повышает уровень фрагмента протромбина 1+2 (PF1+2); или (viii) обеспечивает любую их комбинацию.

E117. Способ согласно E116, где уменьшение времени свертывания в цельной крови определяют с использованием цельной крови, полученной от человека, имеющего гемофилию A или B.

E118. Способ согласно E117, где уменьшение времени свертывания в цельной крови определяют с использованием цельной крови, полученной от человека, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

E119. Способ согласно E116, где уменьшение времени свертывания при измерении в анализе dPT определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего гемофилию A или B.

E120. Способ согласно E119, где уменьшение времени свертывания при измерении в анализе dPT определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

E121. Способ согласно E116, где увеличение образования тромбина определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего гемофилию A или B.

E122. Способ согласно E121, где увеличение образования тромбина определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

E123. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99% от нормальной гемостатической активности.

E124. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента обеспечивает снижение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% общегодовой частоты кровотечения (ABR) по сравнению с ABR, наблюдаемой у контрольных индивидуумов, которые имеют нарушения свертываемости крови.

E125. Способ согласно E124, где снижение ABR сравнивают с контрольными индивидуумами, которые имеют гемофилию (например, гемофилию A или B).

E126. Способ согласно E125, где контрольных индивидуумов лечат заместительной терапией факторами свертывания по потребности (т.е. когда необходимо лечить внезапные кровотечения).

E127. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента обеспечивает снижение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% общегодовой частоты кровотечения (ABR) по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

E128. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно включающий введение индивидууму обеспечивающего свертывание средства.

E129. Способ согласно E128, где обеспечивающее свертывание средство выбрано из группы, состоящей из фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, транексамовой кислоты и обходных средств (например, FEIBA).

E130. Способ укорочения времени кровотечения, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), за которым следует введение последующей дозы 150 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где последующую дозу вводят один раз в неделю (еженедельно) и где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E131. Способ лечения гемофилии (например, гемофилия A или B), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), за которым следует введение последующей дозы 150 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где последующую дозу вводят один раз в неделю (еженедельно) и где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E132. Способ лечения болезни фон Виллебранда (vWD), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), за которым следует введение последующей дозы 150 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где последующую дозу вводят один раз в неделю (еженедельно) и где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E133. Способ укорочения времени кровотечения, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, еженедельно (один раз в неделю) дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E134. Способ лечения гемофилии (например, гемофилия A или B), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, еженедельно (один раз в неделю) дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E135. Способ лечения болезни фон Виллебранда (vWD), включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, еженедельно (один раз в неделю) дозы 300 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E136. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 75% по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

E137. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 80% по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

E138. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 90% по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

E139. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 95% по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

E140. Способ согласно E136, где процентное снижение ABR после введения по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения выбрано из группы, состоящей из:

a) снижения ABR на 82% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму и где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением;

b) снижения ABR на 90% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму и где количество составляет 300 мг, а затем 150 мг с повторяющимся введением;

c) снижения ABR на 80% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму и где количество составляет 450 мг с повторяющимся введением; и

d) снижения ABR на 96% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму, где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением, и где индивидуум имеет гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или имеет гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

E141. Способ согласно E140, где повторяющееся введение происходит один раз в неделю (QW).

E142. Способ согласно E140, где повторяющееся введение происходит один раз в две недели.

E143. Способ согласно E140, где повторяющееся введение происходит один раз в сутки (т.е. каждые сутки).

E144. Способ согласно любому из E136-E143, где антитело вводят подкожно (п/к) или внутривенно (в/в).

E145. Способ согласно E144, где антитело вводят п/к.

E146. Способ согласно E140(a), где средняя ABR до введения составляет по меньшей мере 23 кровотечения в год и ABR после введения составляет не более 4,2 кровотечения в год.

E147. Способ согласно E140(b), где средняя ABR до введения составляет по меньшей мере 14 кровотечений в год и ABR после введения составляет не более 1,5 кровотечения в год.

E148. Способ согласно E140(c), где средняя ABR до введения составляет по меньшей мере 20 кровотечений в год и ABR после введения составляет не более 4,2 кровотечения в год.

E149. Способ согласно E140(d), где средняя ABR до введения составляет по меньшей мере 17 кровотечений в год и ABR после введения составляет не более 0,72 кровотечения в год.

E150. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 75% по сравнению с историческим стандартом ABR.

E151. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 80% по сравнению с историческим стандартом ABR.

E152. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела-антагониста TFPI, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 90% по сравнению с историческим стандартом ABR.

E153. Способ согласно любому из E150-E152, где процентное снижение ABR после введения по сравнению с историческим стандартом ABR выбрано из группы, состоящей из:

a) снижения ABR на 85% по сравнению с историческим стандартом ABR и где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением;

b) снижения ABR на 95% по сравнению с историческим стандартом ABR и где количество составляет 300 мг, а затем 150 мг с повторяющимся введением; и

c) снижения ABR на 85% по сравнению с историческим стандартом ABR и где количество составляет 450 мг с повторяющимся введением; и

d) снижение ABR на 98% по сравнению с историческим стандартом ABR, где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением и где индивидуум имеет гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или имеет гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

E154. Способ согласно любому из E150-E153, где исторический стандарт ABR составляет по меньшей мере 27 кровотечений в год.

E155. Способ согласно любому из E153-E154, где повторяющееся введение происходит один раз в неделю (QW).

E156. Способ согласно любому из E153-E154, где повторяющееся введение происходит один раз в две недели.

E157. Способ согласно любому из E153-E154, где повторяющееся введение происходит каждые сутки.

E158. Способ согласно любому из E150-E157, где антитело вводят подкожно (п/к) или внутривенно (в/в).

E159. Способ согласно E158, где антитело вводят п/к.

E160. Способ согласно любому из E139-E157, где антитело выбрано из группы, состоящей из TFPI-23, TFPI-106, TFPI-107, концизумаба (т.е. hz4F36), 2A8 и 2A8-200.

E161. Способ согласно любому из E139-E158, где антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

E162. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), в способе по изобретению согласно любому из предшествующих вариантов осуществления.

E163. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), для применения согласно любому из предшествующих вариантов осуществления.

E164. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), для производства лекарственного средства для применения в способе согласно любому из предшествующих вариантов осуществления.

E165. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), для применения для лечения или предупреждения кровотечения или геморрагического нарушения, или дефицита свертывания крови, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в первоначальной дозе 300 мг, после чего следует введение последующей дозы 150 мг, где последующую дозу вводят один раз в неделю (еженедельно), и где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

E166. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения согласно E164, где время кровотечения укорачивается.

E167. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения согласно любому из E165-E166, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предназначены для совместного введения, или для одновременного, раздельного или последовательного введения со средством, обеспечивающим свертывание.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена схема, изображающая схему исследования в рамках настоящего изобретения (B7841002), представляющего собой открытое исследование безопасности, переносимости, фармакокинетики (PK), фармакодинамики (PD) и эффективности многократных подкожных (п/к) доз TFPI-106 у мужчин с тяжелой гемофилией A или B.

На фиг.2 представлено графическое изображение, демонстрирующее наблюдаемые концентрации в плазме TFPI-106 с наложением модельного прогнозирования медианы и 90% интервала прогнозирования (PI; показан серым цветом) для 300 мг п/к QW (группа 1) (фиг.2A), 150 мг п/к QW с нагрузочной дозой 300 мг (группа 2) (фиг.2B) и 450 мг п/к QW (группа 3) (фиг.2C).

На фиг.3 представлены срединные значения общего TFPI (фиг. 3A), пикового тромбина TGA (фиг.3B) или срединного изменения от исходного уровня для PF1+2 (фиг. 3C), dPT (фиг. 3D) и D-димера (фиг.3E) против времени в зависимости от группы дозирования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. ОБЗОР

Настоящее изобретение относится к неожиданному наблюдению, что антитела-антагонисты TFPI (например, TFPI 106, также известное как PF-06741086) с более низкой аффинностью связывания (K_D) по сравнению с другими антителами-антагонистами TFPI (например, концизумаб) обладают более желательными клиническими применениями вследствие их более низкой скорости интернализации и более длительного времени полужизни. В частности, было определено, что в противоположность дозированию каждые сутки или два раза в неделю, необходимому для антител-антагонистов TFPI с высокой аффинностью связывания с TFPI (например, K_D > 5×10^-11 M), дозирование раз в неделю антител-антагонистов TFPI с более низкой аффинностью (например, K_D от приблизительно 5×10^-7 M до приблизительно 5×10^-11 M) было достаточным для обеспечения неожиданно высокой частоты ответа (см., например, Eichler H et al. (2017) Concizumab (Anti-TFPI) exposure-response modeling in patients with Hemophilia A. Blood, 130 (Suppl 1), 3672, и Hilden et al. (2012) Hemostatic effect of a monoclonal antibody mAb 2021 blocking the interaction between FXa and TFPI in a rabbit hemophilia model. Blood. 119. 5871-8); против таблиц 3-4 и фиг.3 в настоящем описании). Введение раз в неделю 150 мг (с нагрузочной дозой 300 мг) (группа 2) или 300 мг (группа 1) иллюстративного антитела против TFPI, TFPI-106, обеспечивало неожиданное уменьшение на 95% или 85% общегодовой частоты кровотечений (ABR) по сравнению с ABR, наблюдаемой в исторической группе "по потребности" (т.е. индивидуумы с гемофилией, которых лечат способствующей свертыванию терапией при необходимости лечения внезапных кровотечений; также известные как исторический стандарт), и неожиданное снижение на 90% и 82% ABR по сравнению с ABR до лечения (таблицы 3-4). Кроме того, TFPI-106 оказалось безопасным и хорошо переносимым у этих индивидуумов. Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к режимам дозирования для антител-антагонистов TFPI, которые позволяют введение более низких эффективных дозировок и/или менее частое дозирование терапевтических антител.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., через по меньшей мере один участок распознавания антигена, находящийся в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающую часть") или его единичную цепь, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит участок распознавания антигена, включая, но не ограничиваясь ими, scFv, однодоменные антитела (например, антитела акулы и животных семейства верблюжьих), макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136). Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело не должно представлять собой антитело какого-либо конкретного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи антитела, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термин "антигенсвязывающий участок" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, как используют в рамках изобретения, относится к одному или нескольким фрагментам интактного антитела, которые сохраняют способность связываться с данным антигеном (например, TFPI). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают Fab; Fab'; F(ab')₂; Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент в виде однодоменного антитела (dAb) (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546) и выделенную определяющую комплементарность область (CDR).

Термин "моноклональное антитело" (Mab) относится к антителу, которое происходит из одной копии или клона, включая, например, эукариотического, прокариотического или фагового клона, а не к способу, посредством которого его продуцируют. Предпочтительно, моноклональные антитело по изобретению находится в однородной или по существу однородной популяции.

"Гуманизированное" антитело относится к формам не являющихся человеческими (например, мышиных) антител, которые представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из не являющегося человеческим иммуноглобулина. Предпочтительно гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR не являющегося человеком вида (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью.

Как используют в рамках изобретения, "антитело человека" означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, которое может продуцироваться у человека и/или которое получено с использованием любого из способов получения антител человека, известных специалистам в данной области или описанных в настоящем описании. Это определение антитела человека включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека. Антитела человека можно получать с использованием различных способов, известных в данной области. В одном варианте осуществления антитело человека выбрано из фаговой библиотеки, где эта фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Антитела человека также можно получать посредством иммунизации животных, которым локусы иммуноглобулинов человека были введены трансгенным путем вместо эндогенных локусов, например, мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. Альтернативно антитело человека можно получать посредством иммортализации B-лимфоцитов человека, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени (такие B-лимфоциты могут быть получены от индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и патент США № 5750373.

"Вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела и вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации. Как известно в данной области, каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области, которые участвуют в образовании антигенсвязывающего центра антител. Если являются желательными варианты рассматриваемой вариабельной области, в частности, с заменой аминокислотных остатков вне области CDR (т.е. в каркасной области), соответствующая аминокислотная замена, предпочтительно консервативная аминокислотная замена, может быть идентифицирована посредством сравнения рассматриваемой вариабельной области с вариабельными областями других антител, которые содержат последовательности CDR1 и CDR2 того же канонического класса, что и у рассматриваемой вариабельной области (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987). При выборе FR для фланкирования рассматриваемых CDR, например, при гуманизации или оптимизации антитела, предпочтительными являются FR из антител, которые содержат последовательности CDR1 и CDR2 последовательности того же канонического класса.

"Определяющая комплементарность область (CDR)" вариабельного домена представляет собой аминокислотные остатки в вариабельной области, которые идентифицированы в соответствии с определениями Kabat, Chothia, объединением Kabat и Chothia, AbM, определением контактных участков и/или конформационным определением, или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области. CDR антитела могут быть идентифицированы как гипервариабельные области, первоначально определенные Kabat et al. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Положения CDR также могут быть идентифицированы как структуры структурных петель, первоначально описанные Chothia и другими. См., например, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Другие подходы для идентификации CDR включают "определение AbM", которое представляет собой компромисс между Kabat и Chothia и осуществлено с использованием программного обеспечения для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (теперь Accelrys^®), или "определение контактных участков" CDR на основе наблюдаемых контактов с антигеном, указанного в MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. В другом подходе, упоминаемом в настоящем описании как "конформационное определение" CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые вносят энтальпический вклад в связывание антигена. См., например, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Другие определения границ CDR могут не строго следовать одному из указанных выше подходов, но, тем не менее, перекрываются по меньшей мере с частью CDR Kabat, хотя они могут быть укороченными или удлиненными введу прогнозирования или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки, или группы остатков, или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. Как используют в рамках изобретения, CDR может относиться к CDR, определяемым посредством любого подхода, известного в данной области, включая комбинации подходов. В способах, используемых в настоящем описании, могут использоваться CDR, определяемые в соответствии с любым из этих подходов. Для любого данного варианта осуществления, включающего более одной CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из определений Kabat, Chothia, расширенного определения, AbM, определения контактных участков и/или конформационного определения.

Как известно в данной области, "константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации.

"Эпитоп" относится к зоне или участку антигена (Ag), с которым специфически связывается антитело, например, к зоне или области, содержащей остатки, которые взаимодействуют с антителом (Ab). Эпитопы могут быть линейными или конформационными. В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) встречаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. "Нелинейный эпитоп" или "конформационный эпитоп" включает несоседние полипептиды (или аминокислоты) в антигенном белке, с которыми связывается антитело, специфичное к эпитопу. Термин "эпитоп", как используют в рамках изобретения, определяют как часть антигена, с которой антитело может специфически связываться, при определении любым способом, хорошо известным в данной области, например, посредством общепринятых способов иммуноанализа. Альтернативно в ходе процесса выявления получение и охарактеризация антител могут давать информацию о желаемых эпитопах. Затем на основе этой информации можно провести конкурентный скрининг антител в отношении связывания с тем же эпитопом. Подходом для достижения этого является проведение исследований конкуренции и перекрестной конкуренции для поиска антител, которые конкурируют или перекрестно конкурируют друг с другом за связывание с TFPI. Таким образом, антитела конкурируют за связывание с антигеном, так что антитела конкурируют за связывание с антигенсвязывающим центром антитела против TFPI по изобретению.

Антитело, которое "предпочтительно связывается" или "специфически связывается" (как используют взаимозаменяемо в настоящем описании) с эпитопом, представляет собой термин, хорошо понятный в данной области, и способы определения такого специфического или предпочтительного связывания также хорошо известны в данной области. Молекулу называют демонстрирующей "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание", если она реагирует или ассоциирует более часто, более быстро или более длительно и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело "специфически связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если оно связывается с более высокой аффинностью, авидностью, легче и/или более длительно, чем с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с эпитопом TFPI, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с более высокой аффинностью, авидностью, легче и/или более длительно, чем с другими эпитопами TFPI или эпитопами не TFPI. Также при прочтении этого определения понятно, что, например, антитело (или часть, или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно связываться или не связываться со второй мишенью. По существу, "специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" не обязательно требует (хотя оно может включать) исключительного связывания. Как правило, но не обязательно, указание на связывание означает предпочтительное связывание. "Специфическое связывание" или "предпочтительное связывание" включает соединение, например, белок, нуклеиновую кислоту, антителу и т.п., которые распознают и связывают специфическую молекулу, но по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце. Например, антитело или рецептор пептида, которые распознают и связывают собственный лиганд или партнер по связыванию (например, антитело против TFPI, которое связывает TFPI) в образце, но по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце, специфически связывается с этим собственным лигандом или партнером по связыванию. Таким образом, в определенных условиях анализа указанная связывающая часть (например, антитело или его антигенсвязывающая часть, или рецептор или его лиганд-связывающая часть) связывается предпочтительно с конкретной молекулой-мишенью и не связывается в значительном количестве с другими компонентами, присутствующими в тестируемом образце.

Для селекции антитела или пептида, которые специфически связываются с представляющей интерес молекулой, можно использовать различные форматы анализа. Например, твердофазный иммуноанализ ELISA, иммунопреципитация, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ), KinExA, сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS), Octet™ (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA) и вестерн-блоттинг находятся среди многих анализов, которые могут использоваться для идентификации антитела, которое специфически реагирует с антигеном, или рецептора, или его лигандсвязывающей части, которые специфически связываются с их собственным лигандом или партнером по связыванию. Как правило, специфическая или селективная реакция по меньшей мере в два раза превышает фоновый сигнал или шум, более конкретно более чем в 10 раз превышает фоновый сигнал, еще более конкретно более чем в 50 раз превышает фоновый сигнал, более конкретно, более чем в 100 раз превышает фоновый сигнал, еще более конкретно более чем в 500 раз превышает фоновый сигнал, еще более конкретно более чем в 1000 раз превышает фоновый сигнал и еще более конкретно более чем в 10000 раз превышает фоновый сигнал. Также антитело называют "специфически связывающим" антиген, когда равновесная константа диссоциации (K_D) составляет ≤ 7 нМ.

Термин "аффинность связывания" используют в настоящем описании в качестве меры силы нековалентного взаимодействия между двумя молекулами, например, антителом или его фрагментом и антигеном. Термин "аффинность связывания" используют для описания одновалентных взаимодействий (присущая активность).

Аффинность связывания между двумя молекулами, например антителом или его фрагментом и антитела, через одновалентное взаимодействие можно количественно определять посредством определения константы диссоциации (K_D). В свою очередь, K_D можно определять путем измерения кинетики образования и диссоциации комплекса с использованием, например, способа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (Biacore). Константы скоростей, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называют константой скорости ассоциации k_a (или k_on) и константой скорости диссоциации k_d (или k_off), соответственно. K_D связана с k_a и k_d через уравнение K_D=k_d/k_a. Величина константы диссоциации может быть определена непосредственно хорошо известными способами и может быть вычислена даже для комплексных смесей способами, такими как способы, например, указанные в Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362). Например, K_D можно определять с использованием анализа связывания с двойным нитроцеллюлозным фильтром, такого как анализ, описанный Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432). Другие стандартные способы анализа для оценки связывающей способности лигандов, такой как связывающая способность антител с антигенами-мишенями, известны в данной области, включая, например, ELISA, вестерн-блоттинг, RIA и проточная цитометрия, и другие способы анализа, проиллюстрированные в настоящем описании. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно оценивать стандартными способами анализа, известными в данной области, такими как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), например, с использованием системы Biacore™ или KinExA.

Антитело, которое специфически связывает его мишень, может связывать его мишень с высокой аффинностью, т.е. демонстрируя низкую K_D, как описано выше, и может связываться с другими не являющимися мишенью молекулами с более низкой аффинностью. Например, антитело может связываться с молекулами, не являющимися мишенями, с K_D 1×10^-6 M или более, более предпочтительно 1×10^-5 M или более, более предпочтительно 1×10^-4 M или более, более предпочтительно 1×10^-3 M или более, еще более предпочтительно 1×10^-2 M или более. Антитело по изобретению предпочтительно способно связываться с его мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза, в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или в 10000 раз или более превышает его аффинность в отношении другой молекулы, не являющейся TFPI.

Как используют в рамках изобретения, термин "ингибитор пути тканевого фактора или TFPI" относится к любой форме TFPI и его вариантов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TFPI. TFPI представляет собой мультивалентный домен Куница, содержащий ингибитор протеазы. Иллюстративные последовательности TFPI человека, мыши, яванского макака, кролика и крысы приведены в таблице 5. TFPI человека представляет собой внеклеточный гликопротеин с двумя преобладающими формами, TFPI-альфа и TFPI-бета. TFPI альфа, который представляет собой гликозилированный белок из 276 аминокислот (ММ 43 кДа) представляет собой самую большую форму TFPI и состоит из трех доменов, подобных домену Куница, и основной С-концевой области. Альтернативный сплайсинг приводит к TFPI-бета, который содержит домен Куница 1 (K1) и домен Куница 2 (K2), но содержит альтернативную C-концевую часть, лишенную домена Куница 3 (K3) и основной области. TFPI-бета заякорен на клеточных мембранах через посттрансляционную модификацию посредством гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря.

Основными мишенями TFPI являются протеазы фактор Xa (FXa) и фактор VIIa (FVIIa), которые являются ключевыми факторами стадии инициации каскада свертывания. Биохимический анализ продемонстрировал, что K2 является ингибитором FXa, в то время как K1 ингибирует комплекс FVIIa-тканевой фактор. Роль K3 неясна, поскольку он, по-видимому, не обладает прямой активностью ингибирования протеазы, но может служить в качестве участка распознавания для кофакторного белка S. C-концевой домен, уникальный для TFPI-альфа, может быть вовлечен в распознавание протромбиназы на поверхности тромбоцитов.

Домен Куница 1 (K1) соответствует аминокислотным остаткам 26-76 SEQ ID NO: 2, и домен Куница 2 (K2) соответствует остаткам 91-147 SEQ ID NO: 2. Домены K1 и K2 из других гомологов, изоформ, вариантов или фрагментов TFPI, могут быть идентифицированы посредством выравнивания последовательностей или структурного выравнивания против SEQ ID NO: 2.

TFPI по настоящему изобретению включает любую встречающуюся в природе форму TFPI, которая может происходить из любого подходящего организма. Например, TFPI может представлять собой TFPI млекопитающего, такую как TFPI человека, мыши, крысы, не являющегося человеком примата, животного подсемейства бычьих, животного семейства овечьих, животного семейства собачьих, животного семейства кошачьих или животного семейства свиных. В определенных вариантах осуществления TFPI представляет собой TFPI человека. TFPI может представлять собой зрелую форму TFPI (т.е. белок TFPI, который претерпел посттрансляционный процессинг в подходящей клетке). Такой зрелый белок TFPI может быть, например, гликозилированным.

TFPI по настоящему изобретению включает любые функциональные фрагменты или варианты, происходящие из встречающегося в природе TFPI. Функциональный фрагмент TFPI может представлять собой любую часть или участок TFPI, который сохраняет активность TFPI, такую как способность ингибировать фактор Xa (FXa), ингибировать активность комплекса FVIIa-тканевой фактор и/или функционировать в качестве негативного регулятора свертывания или гемостаза. Например, функциональный фрагмент может содержать домен Куница, такой как домен K1, домен K2 или домены как K1, так и K2 TFPI.

Функциональный вариант может содержать одну или несколько мутаций по сравнению со встречающимся в природе TFPI и все еще сохранять активность встречающегося в природе TFPI, такую как способность ингибировать фактор Xa (FXa) или способность ингибировать активность комплекса FVIIa-тканевой фактор. Например, вариант может иметь различные степени идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, такие как по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

Во фрагментах, вариантах, изоформах и гомологах TPFI по изобретению должны сохраняться важные остатки эпитопов (такие как Ile105, Arg107 и Leu131, если используются антитела TFPI-23 и TFPI-106), как описано в настоящем описании. Кроме того, TFPI может содержать пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более, или пятнадцать или более поверхностных доступных остатков домена K2 TFPI. Поверхностный доступный остаток представляет собой остаток, обладающий относительной доступностью более 40%.

Например, для домена K2 TFPI (см., например, SEQ ID NO: 2), следующие аминокислотные остатки обладают относительной доступностью более 40%: 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 и 144-145. TFPI может содержать пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более, или пятнадцать или более из этих остатков, как например, фрагмент TFPI, который включает пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более, или пятнадцать или более из этих остатков.

Конкретные положения остатков аминокислот в TFPI пронумерованы согласно SEQ ID NO: 2 (K1K2K3 TFPIα человека). Однако настоящее изобретение не ограничивается SEQ ID NO: 2. Соответствующие остатки из других гомологов, изоформ, вариантов или фрагментов TFPI могут быть идентифицированы посредством выравнивания последовательностей или структурного выравнивания, которое известно в данной области. Например, выравнивание можно проводить вручную или с использованием хорошо известных программ для выравнивания последовательностей, таких как ClustalW2 или "BLAST 2 Sequences" с использованием параметров по умолчанию. Например, Arg107 SEQ ID NO: 2 соответствует Arg104 K1K2 TFPI мыши (SEQ ID NO: 4).

Как используют в рамках изобретения, "антитело-антагонист TFPI" (взаимозаменяемо называемое "антителом против TFPI") относится к антителу, которое способно связываться с TFPI и ингибировать биологическую активность TFPI и/или нижеследующий путь(и), опосредуемый передачей сигнала TFPI. Антитело-антагонист TFPI охватывает антитела, которые блокируют, осуществляют антагонизм, подавляют или снижают (в том числе значительно) биологическую активность TFPI, в том числе последующих каскадов, опосредуемых передачей сигнала TFPI, такую как связывание лиганда и/или индукция клеточного ответа на TFPI. Для целей настоящего изобретения будет хорошо понятно, что термин "антитело-антагонист TFPI" охватывает все ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, при которых происходит по существу устранение, снижение или нейтрализация в какой-либо значимой степени самого TFPI, биологической активности TFPI (включая, но не ограничиваясь ими, способность опосредовать какой-либо аспект свертывания крови), или последствий биологической активности. В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист TFPI связывает TFPI и препятствует связыванию и/или ингибированию посредством TFPI комплекса тканевой фактор (TF)/фактор VIIa. В других вариантах осуществления антитело против TFPI связывает TFPI и препятствует связыванию и/или ингибированию посредством TFPI фактора Xa. Примеры антител-антагонистов TFPI приведены в настоящем описании.

Термин "конкурировать", как используют в рамках изобретения в отношении антитела, означает, что связывание первого антитела или его антигенсвязывающей части с антигеном снижает последующее связывание того же антигена с вторым антителом или его антигенсвязывающей частью. Как правило, связывание первого антитела обеспечивает пространственное препятствование, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом (или его частью), так что связывание второго антитела с тем же антигеном снижается. Для определения того, конкурируют ли два антитела друг с другом, можно использовать стандартные конкурентные способы анализа. Один подходящий анализ конкуренции антител вовлекает применение технологии Biacore, которая может измерять степень взаимодействий с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как правило, с использованием биосенсорной системы (такой как система BIACORE®). Например, SPR можно использовать в анализе ингибирования конкурентного связывания in vitro для определения способности одного антитела ингибировать связывание второго антитела. В другом способе анализа для измерения конкуренции антител используется подход на основе ELISA. Более того, высокопроизводительный способ "биннинга" антител на основе их конкуренции описан в международной патентной заявке № WO2003/48731. Конкуренция присутствует, если одно антитело (или фрагмент) снижает связывание другого антитела (или фрагмента) с TFPI. Например, можно использовать анализ последовательной конкуренции за связывание, в котором различные антитела добавляют последовательно. Первое антитело можно добавлять для достижения связывания, близкого к насыщению. Затем добавляют второе антитело. Если связывание второго антитела с TFPI не определяется или значительно снижено (например, снижение по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80% или по меньшей мере приблизительно на 90%) по сравнению с параллельным анализом в отсутствии первого антитела (величина для которого может быть взята за 100%), два антитела считаются конкурирующими друг с другом.

Антитело против TFPI по изобретению может обладать способностью конкурировать или перекрестно конкурировать с другим антителом по изобретению за связывание с TFPI, как описано в настоящем описании. Например, антитело по изобретению может конкурировать или перекрестно конкурировать с антителами, описанными в настоящем описании, за связывание с TFPI, или с подходящим фрагментом или вариантом TFPI, который связывается антителами, описанными в настоящем описании.

Таким образом, если первое антитело против TFPI конкурирует со вторым антителом за связывание с TFPI, но не конкурирует, когда второе антитело сначала связывается с TFPI, его считают "конкурирующим" со вторым антителом (что также называют однонаправленной конкуренцией). Когда антитело конкурирует с другим антителом независимо от того, какое антитело сначала связалось с TFPI, тогда антитело "перекрестно конкурирует" за связывание TFPI с другим антителом. Такие конкурирующие или перекрестно конкурирующие антитела можно идентифицировать на основе их способности конкурировать/перекрестно конкурировать с известным антителом по изобретению в стандартных анализах связывания. Например, для демонстрации конкуренции/перекрестной конкуренции можно использовать SPR, например, с использованием системы Biacore™, способы анализа ELISA или проточную цитометрию. Такая конкуренция/перекрестная конкуренция может указывать на то, что эти два антитела связываются с идентичными, перекрывающимися или сходными эпитопами.

Таким образом, антитело против TFPI по изобретению можно идентифицировать способом, который включает анализ связывания, который оценивает способно ли тестируемое антитело конкурировать/перекрестно конкурировать с эталонным антителом по изобретению (например, TFPI-23, TFPI-106) за участок связывания на молекуле-мишени.

Термин "лечение" включает профилактическое и/или терапевтическое лечение. При введении до клинического проявления состояния лечение считается профилактическим. Терапевтическое лечение включает, например, смягчение или снижение тяжести заболевания или уменьшение длительности заболевания.

"Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, питомцев, приматов (например, обезьян), лошадей, собак, кошек, мышей и крыс.

Как используют в рамках изобретения, "исторический стандарт общегодовой частоты кровотечений (ABR)" представляет собой ABR, полученную для группы "исторического стандарта" (т.е. контрольной группы) (также называемой "исторической группой по потребности" или группой "по потребности"). Эту группу создают, чтобы она служила в качестве компаратора (т.е. контроля) для анализа клинической эффективности. В некоторых вариантах осуществления группа включает данные, полученные проспективно от индивидуумов с гемофилией, которых лечили заместительной терапией фактором свертывания при необходимости (т.е. по потребности) для лечения внезапных кровотечений. В некоторых вариантах осуществления данные (т.е. ABR), полученные для индивидуумов, которых лечили по потребности в одном или нескольких из следующих клинических испытаний, можно использовать для группы исторического стандарта: ReFacto AF 3082B2-4432 (B1831004), BeneFIX (B1821010) и BeneFIX 3090A1-400 (B1821004).

Указание на "приблизительно" величину или параметр в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к самой этой величине или параметру. Например, описание, указывающее на "приблизительно X", включает описание "X". Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. В общем, термин "приблизительно" относится к указанной величине переменной и ко всем величинам переменной, которые находятся в пределах экспериментальной погрешности указанной величины (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанной величины, в зависимости от того, что больше. Когда термин "приблизительно" используют в контексте периода времени (годы, месяцы, недели, сутки и т.д.), термин "приблизительно" означает этот период времени плюс или минус одну величину следующего низшего периода времени (например, приблизительно 1 год означает 11-13 месяцев; приблизительно 6 месяцев означает 6 месяцев плюс или минус 1 неделя; приблизительно 1 неделя означает 6-8 суток; и т.д.), или в пределах 10 процентов от указанной величины, в зависимости от того, что больше.

Когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в терминах группы Маркуша или другой группировки альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, приведенную в целом, но и каждого представителя индивидуально и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу за исключением одного или нескольких представителей группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или несколько из представителей группы из заявленного изобретения.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. Иллюстративные способы и материалы описаны в настоящем описании, хотя также для применения на практике или тестирования настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании. Все публикации и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречий настоящее описание, в том числе определения, имеет преимущество. Хотя в настоящем описании цитирован ряд документов, это цитирование не является допущением, что какой-либо из этих документов формирует часть общего знания в данной области. На протяжении настоящего описания и формулы изобретения слово "содержать" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" следует понимать как включающее указанное целое число или группу целых чисел, но не исключающее любое другое целое число или группу целых чисел. Если контекстом не требуется иное, термины в форме единственного числа включают множественное число и термины в множественном числе включают единственное число. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предполагается, что они являются ограничивающими.

Понятно, что, когда варианты осуществления описаны в настоящем описании с помощью формулировки "содержащий", также предусматриваются в остальном аналогичные варианты осуществления, описанные терминами "состоящий из" и/или "по существу состоящий из".

3. Дозирование антитела против TFPI

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что антитела-антагонисты TFPI с более низкой аффинностью связывания (K_D) (например, TFPI 106; K_D в диапазоне нМ) по сравнению с другими антителами-антагонистами TFPI с более высокой аффинностью связывания (например, концизумаб; K_D в диапазоне пМ) обеспечивают неожиданно высокую частоту ответа с более желательными режимами дозирования, в частности, для лечения хронических состояний (например, гемофилия), которые требуют многократных инъекций. Настоящее изобретение относится к режимам дозирования, которые позволяют введение более низких эффективных дозировок и/или менее частое дозирование терапевтических антител.

Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу укорочения времени кровотечения, к способу лечения или предупреждения дефицита свертывания крови или геморрагического нарушения, способу лечения или предупреждения гемофилии A, B или C, способу лечения или предупреждения болезни фон Виллебранда (vWD) и к способу снижения активности TFPI. Эти способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, первоначальной дозы от приблизительно 50 мг до приблизительно 500 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг, и приблизительно 500 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг и приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг и приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 250 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 350 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 400 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг.

В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза выбрана из группы, состоящей из 50 мг, 75 мг, 100 мг, 125 мг, 150 мг, 175 мг, 200 мг, 225 мг, 250 мг, 275 мг, 300 мг, 325 мг, 350 мг, 375 мг, 400 мг, 425 мг, 450 мг, 475 мг и 500 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет 150 мг.

В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят одну или несколько последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Одна или несколько последующих доз могут быть приблизительно такими же, меньшими или большими, чем первоначальная доза.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое является приблизительно таким же, как и первоначальная доза. В некоторых вариантах осуществления либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг, и приблизительно 500 мг. В некоторых вариантах осуществления либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг и приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг и приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 250 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 350 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 400 мг. В некоторых вариантах осуществления любая или обе из первоначальной дозы или последующей дозы составляют приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления как первоначальная, так и последующая доза, составляет 300 мг. В некоторых вариантах осуществления как первоначальная, так и последующая доза, составляет 150 мг.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое является меньшим, чем первоначальная доза. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько последующих доз составляют приблизительно две трети от первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько последующих доз составляют приблизительно половину от первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько последующих доз составляют приблизительно одну треть от первоначальной дозы.

В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг, и последующая доза составляет приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза составляет приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза составляет приблизительно 100 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 400 мг, и последующая доза составляет приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза составляет приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет 300 мг, и последующая доза составляет 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг, и последующая доза составляет приблизительно 100 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза составляет приблизительно 75 мг. В некоторых вариантах осуществления последующая доза составляет приблизительно одну треть от первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 450 мг, и последующая доза составляет приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза составляет приблизительно 100 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза составляет приблизительно 50 мг.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят в количестве, которое превышает первоначальную дозу. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько последующих доз в два раза превышают первоначальную дозу. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 75 мг, и последующая доза составляет приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 100 мг, и последующая доза составляет приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 125 мг, и последующая доза составляет приблизительно 250 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза составляет приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 200 мг, и последующая доза составляет приблизительно 400 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 225 мг, и последующая доза составляет приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, или приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг или приблизительно 450 мг.

4. Интервалы между введениями антител против TFPI

Настоящее изобретение охватывает варианты осуществления, где одну или несколько последующих доз антител-антагониста TFPI вводят один раз в сутки, раз в 3 суток, раз в 6 суток, два раза в неделю, один раз в неделю (еженедельно), один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели, один раз в 5 недель, один раз в 6 недель, один раз в 7 недель или один раз в 8 недель после первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят приблизительно через 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недели после первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят два раза в неделю после первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят приблизительно через 1 неделю (т.е. один раз в неделю, еженедельно) после первоначальной дозы. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз вводят один раз в 2 недели после первоначальной дозы. Первоначальная и одна или несколько последующих доз могут быть выбраны из любого из количеств, описанных в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение раз в неделю антител-антагонистов TFPI, описанных в настоящем описании, где либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг, и приблизительно 500 мг. В некоторых вариантах осуществления либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг и приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления либо первоначальная доза, либо последующая доза, либо как первоначальная, так и последующая доза, выбраны из группы, состоящей из приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг и приблизительно 450 мг.

В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение раз в неделю антител-антагонистов TFPI, описанных в настоящем описании, где первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 200 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 250 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг и последующая доза составляет приблизительно 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная и последующая доза составляют 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет 300 мг и последующая доза составляет 150 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная и последующая доза составляют приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, или приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 150 мг и последующая доза увеличена до приблизительно 300 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, или приблизительно 450 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 400 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 425 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальная доза составляет приблизительно 300 мг, и последующая доза увеличена до приблизительно 450 мг.

Антитело-антагонист TFPI или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, можно вводить индивидууму любым подходящим путем. Специалисту в данной области должно быть понятно, что примеры, описанные в настоящем описании, предназначены не для ограничения, а для иллюстрации доступных способов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист TFPI или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например, в качестве болюса или посредством непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, посредством подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, интрацереброспинального, трансдермального, внутристуставного, сублингвального, интрасиновиального, посредством инсуффляции, интратекального, перорального, ингаляционного или местного путей. Введение может быть системным, как например, внутривенное введение, или локализованным. Антитело можно вводить один раз, по меньшей мере два раза или в течение по меньшей мере периода времени до тех пор, пока не будет осуществлено лечение, облегчение или излечение состояния. Антитело, как правило, вводят настолько долго, насколько присутствует состояние.

5. Антитела-антагонисты TFPI

Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам TFPI (т.е. антитело против TFPI) в общем и к их применению. Иллюстративные антитела-антагонисты TFPI включают, но не ограничиваются ими, антитела, описанные в WO 2017/029583, WO 2010/017196, WO 2011/109452, WO 2014/144577, WO 2010/072687, WO 2012/001087, WO 2014/140240 и WO 2015/007880, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист TFPI выбрано из группы, состоящей из TFPI 106 (также известного как PF-06741086), TFPI-23, TFPI-107, концизумаба (также известного как mAb-2021, hz4F36), 2A8 (см., например, US20170073428) и 2A8-200.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления антитело против TFPI не связывается с доменом Куница 1 (K1) TFPI. В некоторых вариантах осуществления эпитоп дополнительно содержит остатки Cys106, Gly108, Cys130, Leu131 и Gly132 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эпитоп дополнительно содержит Asp102, Arg112, Tyr127, Gly129, Met134 и Glu138 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эпитоп не содержит: E100, E101, P103, Y109, T111, Y113, F114, N116, Q118, Q121, C122, E123, R124, F125, K126 и L140 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления эпитоп не содержит: D31, D32, P34, C35, K36, E100, E101, P103, Y109, K126 и G128 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VH (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

(b) определяющую комплементарность область два VH (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

(c) определяющую комплементарность область три VH (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 18 и 20. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 18 и 20. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую:

(a) определяющую комплементарность область один VL (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

(b) определяющую комплементарность область два VL (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и

(c) определяющую комплементарность область три VL (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:

(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

(b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и

(c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и

(ii) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую:

(a) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

(b) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и

(c) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Иллюстративные антитела по настоящему изобретению депонированы в American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, on July 22, 2015. Плазмидный вектор mAb-TFPI-106 VH, имеющий номер доступа ATCC № PTA-122329, содержит ДНК-вставку, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела TFPI-106, и плазмидный вектор mAb-TFPI-106 VL, имеющий номер доступа ATCC № PTA-122328, содержит ДНК-вставку, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела TFPI-106.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 29 часов, по меньшей мере 30 часов по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 40 часов, по меньшей мере 50 часов, по меньшей мере 55 часов, по меньшей мере 60 часов, по меньшей мере 65 часов, по меньшей мере 70 часов, по меньшей мере 75 часов, по меньшей мере 80 часов, по меньшей мере 85 часов, по меньшей мере 90 часов, по меньшей мере 95 часов, по меньшей мере 100 часов, по меньшей мере 105 часов, по меньшей мере 110 часов, по меньшей мере 115 часов, по меньшей мере 120 часов или по меньшей мере 125 часов. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 29 часов или по меньшей мере 30 часов. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 29 часов. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 30 часов. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет время полужизни в сыворотке по меньшей мере 115 часов, по меньшей мере 120 часов или по меньшей мере 125 часов.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладают аффинностью связывания (K_D) от приблизительно 5×10^-7 M до приблизительно 5×10^-11 M. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладают K_D от приблизительно 1×10 ^-8 M до приблизительно 1×10^-10 M (от 0,1 до 10 нм). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют K_D ≤1нМ, ≤500 пМ, ≤250 пМ, ≤200 пМ, ≤100 пМ, ≤50 пМ, ≤20 пМ или ≤10 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело его антигенсвязывающий фрагмент имеют K_D в нижнем пМ-диапазоне (т.е. ≤100 пМ). В некоторых аспектах K_D измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых аспектах поверхностный плазмонный резонанс можно измерять с использованием Biacore. В некоторых аспектах SPR можно измерять с использованием Biacore с иммобилизованным антителом и TFPI человека в фазе раствора.

В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 10% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 15% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 20% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 25% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 27% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 30% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 35% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 40% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 50% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 60% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 70% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 80% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 90% относительно внутривенной биодоступности. В некоторых аспектах подкожная биодоступность антитела или антигенсвязывающего фрагмента может составлять по меньшей мере 99% относительно внутривенной биодоступности.

В некоторых аспектах способы по изобретению обеспечивают значительно увеличенную клиническую пользу. Клиническую пользу можно оценивать по частоте ответа и оценке прогрессирования заболевания. Например, клиническую пользу можно оценивать путем определения времени свертывания в плазме на основе анализа протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT), путем измерения свертывания в цельной крови посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии, путем измерения образования тромбина, путем измерения активности FXa в присутствии TFPI, путем измерения накопления тромбоцитов в присутствии TFPI, путем измерения образования фибрина в присутствии TFPI при определении по D-димерам, путем измерения уровня протромбинового фрагмента 1+2, или любой их комбинации. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут иметь один или несколько видов клинической пользы: (i) снижение времени свертывания при измерении в плазме на основе анализа протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT); (ii) снижение времени свертывания в цельной крови при измерении посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии; (iii) увеличение образования тромбина; (iv) повышение активности FXa в присутствии TFPI; (v) повышение накопления тромбоцитов в присутствии TFPI; (vi) повышение образования фибрина в присутствии TFPI при измерении по D-димерам; (vii) повышение уровня протромбинового фрагмента 1+2 или (viii) любую их комбинацию. В некоторых аспектах способы по изобретению обеспечивают значительно увеличенную клиническую пользу. Клиническую пользу можно оценивать по частоте ответа и посредством оценки прогрессирования заболевания. Например, клиническую пользу можно оценивать путем определения времени свертывания в плазме на основе анализа протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT), путем измерения свертывания в цельной крови посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии, путем измерения образования тромбина, путем измерения активности FXa в присутствии TFPI, путем измерения накопления тромбоцитов в присутствии TFPI, путем измерения образования фибрина в присутствии TFPI при определении по D-димерам, путем измерения уровня протромбинового фрагмента 1+2, или любой их комбинации. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут иметь один или несколько видов клинической пользы: (i) снижение времени свертывания при измерении в плазме на основе анализа протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT); (ii) снижение времени свертывания в цельной крови при измерении посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии; (iii) увеличение образования тромбина; (iv) повышение активности FXa в присутствии TFPI; (v) повышение накопления тромбоцитов в присутствии TFPI; (vi) повышение образования фибрина в присутствии TFPI при измерении по D-димерам; (vii) повышение уровня протромбинового фрагмента 1+2 или (viii) любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления снижение времени свертывания в цельной крови определяют с использованием цельной крови, полученной от индивидуума, имеющего гемофилию A или B. В некоторых вариантах осуществления снижение времени свертывания в цельной крови определяют с использованием цельной крови, полученной от индивидуума, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

В некоторых вариантах осуществления снижение времени свертывания при измерении в анализе dPT определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего гемофилию A или B. В некоторых вариантах осуществления снижение времени свертывания при измерении в анализе dPT определяют с использованием плазмы, полученной от индивидуума, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека. В некоторых вариантах осуществление повышение образования тромбина определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего гемофилию A или B. В некоторых вариантах осуществление повышение образования тромбина определяют с использованием плазмы, полученной от человека, имеющего (i) гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или (ii) гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают клиническую пользу при определении по снижению по меньшей мере на 20% общегодовой частоты кровотечений (ABR) по сравнению с ABR, наблюдаемой у контрольных индивидуумов, которые имеют нарушения свертывания. В некоторых вариантах осуществления снижение ABR сравнивают с контрольными индивидуумами, которые имеют гемофилию (например, гемофилию A или B). В некоторых вариантах осуществления контрольных индивидуумов с гемофилией не лечат заместительной терапией факторами свертывания. В некоторых вариантах осуществления контрольных индивидуумов с гемофилией лечат заместительной терапией факторами свертывания при необходимости для лечения внезапных кровотечений (т.е. по потребности). В некоторых вариантах осуществления группу исторического стандарта (т.е. по потребности) можно формировать с использованием данных, полученных проспективно в ходе клинических испытаний, связанных с гемофилией. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут обеспечить снижение по меньшей мере на 20% средней ABR по сравнению с исторической группой "по потребности". Группа исторического стандарта может включать данные, полученные проспективно от клинических испытаний, связанных с гемофилией, таких как, но не ограничиваясь ими: ReFacto AF 3082B2-4432 (B1831004), BeneFIX (B1821010) и BeneFIX 3090A1-400 (B1821004). В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% ABR по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% ABR по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 80% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 82% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 85% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 87% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR на по меньшей мере 90% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 94% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 95% по сравнению с группой исторического стандарта. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению обеспечивают снижение ABR по меньшей мере на 98% по сравнению с группой исторического стандарта.

В некоторых вариантах осуществления снижение ABR сравнивают со снижением ABR у индивидуума до лечения антителом против TFPI или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут обеспечивать снижение ABR по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% по сравнению с ABR у индивидуума до лечения антителом против TFPI или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления среднее значение ABR до введения антитела-антагониста TFPI или его антигенсвязывающего фрагмента составляет по меньшей мере 28 кровотечений в год, по меньшей мере 27,6 кровотечения в год, по меньшей мере 27 кровотечений в год, по меньшей мере 26 кровотечений в год, по меньшей мере 25 кровотечений в год по меньшей мере 24 кровотечения в год, по меньшей мере 23 кровотечения в год, по меньшей мере 22 кровотечения в год, по меньшей мере 22,6 кровотечения в год, по меньшей мере 21 кровотечение в год, по меньшей мере 20 кровотечений в год, по меньшей мере 19 кровотечений в год, по меньшей мере 18 кровотечений в год, по меньшей мере 17 кровотечений в год, по меньшей мере 16 кровотечений в год, по меньшей мере 15 кровотечений в год, по меньшей мере 14 кровотечений в год, по меньшей мере 13 кровотечений в год, по меньшей мере 12 кровотечений в год, по меньшей мере 11 кровотечений в год или по меньшей мере 10 кровотечений в год. В некоторых вариантах осуществления средняя ABR до введения антитела-антагониста TFPI или его антигенсвязывающего фрагмента составляет по меньшей мере 27 кровотечений в год или по меньшей мере 23 кровотечения в год.

В некоторых вариантах осуществления средняя ABR после введения антитела-антагониста TFPI или его антигенсвязывающего фрагмента составляет не более 5 кровотечений в год, не более 4,2 кровотечения в год, не более 4 кровотечений в год, не более 3 кровотечений в год, не более 2 кровотечений в год, не более 1,5 кровотечения в год, не более 1 кровотечения в год, не более 0,7 кровотечения или без (т.е. 0) кровотечений в год.

В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 1% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 2% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 3% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 4% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 5% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 10% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 15% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 20% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 25% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 30% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 40% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 50% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 55% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 60% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 65% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 70% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 75% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 80% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 85% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 90% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 95% от нормальной гемостатической активности. В некоторых вариантах осуществления введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 99% от нормальной гемостатической активности.

Способы анализа для измерения гемостатической активности хорошо известны в данной области (см., например, WO 2017/029583, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Иллюстративные способы анализа включают, но не ограничиваются ими, ротационную тромбоэластографию (ROTEM), анализ образования тромбина (TGA) и анализ протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT). Нормальная гемостатическая активность относится к величине гемостатической активности необработанной цельной крови или плазмы, полученной от здоровых (без гемофилии) индивидуумов.

6. Терапевтические применения

Изобретение предусматривает терапевтические способы. Терапевтический способ включает введение соединения или композиции по изобретению индивидууму, нуждающемуся в этом.

Иллюстративные терапевтические применения антитела и фрагменты антитела по изобретению включают укорочение времени кровотечения у индивидуума, нуждающегося в этом, лечение или предупреждение дефицита свертывания крови или нарушения крови (например, гемофилия A, гемофилия B, гемофилия C, болезнь фон Виллебранда (vWD), дефицит фактора VII или дефицит фактора XI), лечение или предупреждение тромбоцитопении, и лечение или предупреждение тромбоцитарных нарушений (нарушения функции или количества тромбоцитов). Антитела и фрагменты антител также можно использовать для лечения неконтролируемого кровотечения (например, неконтролируемое кровотечение при таких показаниях, как травма и геморрагический инсульт). Антитела и фрагменты антител также можно использовать для профилактического лечения (например, для лечения или предупреждения кровотечения перед хирургической операцией).

В частности, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, можно использовать для лечения дефицита или дефектов свертывания или нарушений свертывания. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, можно использовать для снижения или ингибирования взаимодействия TFPI с FXa, или для снижения TFPI-зависимого ингибирования активности TF/FVIIa/FXa.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту свертывания крови или нарушению крови, такому как следующие: гемофилия A, B или C. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии A или B. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии A и имеет нейтрализующие антитела (т.е. ингибиторы) против фактора свертывания VIII. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии B и имеет нейтрализующие антитела (т.е. ингибиторы) против фактора свертывания IX. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к болезни фон Виллебранда (vWD). В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к тромбоцитарному нарушению. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту фактора VII. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает от или предрасположен к дефициту фактора XI.

Антитела-антагонисты TFPI или антигенсвязывающие части, описанные в настоящем описании, можно использовать в комбинации со средством, обеспечивающим свертывание. Настоящее изобретение относится раздельному, одновременному или последовательному введению антител по изобретению со средством, обеспечивающим свертывание. Примеры средства, обеспечивающего свертывание, включают, но не ограничиваются ими, фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, транексамовую кислоту и обходного средства (например, комплекс анти-ингибитор-коагулянт или FEIBA).

ПРИМЕРЫ

Изобретение далее подробно описано с помощью следующих экспериментальных примеров. Эти примеры предоставлены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения, если нет иных указаний. Таким образом, изобретение никоим образом не должно быть истолковано как ограниченное приведенными ниже примерами, а вместо этого оно должно быть истолковано как охватывающее любые и все варианты, которые станут очевидными посредством идей, описанных в настоящем описании.

ПРИМЕР 1: СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ

Было запланировано открытое исследование безопасности, переносимости, PK, PD и эффективности множества п/к доз TFPI-106 (т.е. PF-06741086) у мужчин с тяжелой гемофилией A или B (B7841002).

Более конкретно, были включены группы многократных доз и проводили испытание с повышением дозы, начиная с дозы 300 мг подкожно (п/к). На фиг.1 представлена диаграмма, иллюстрирующая схему исследования. Индивидуумов включали в исследование и распределяли на группы лечения следующим образом:

Группа 1: было включено 7 индивидуумов, и их лечили 300 мг TFPI-106 п/к один раз в неделю (QW) (n=7).

Группа 2: было включено 6 индивидуумов, и их лечили нагрузочной дозой 300 мг п/к TFPI-106, а затем 150 мг п/к один раз в неделю (QW).

Группа 3 (n=6): было включено 6 индивидуумов, и их лечили 450 мг TFPI-106 п/к один раз в неделю (QW).

Группа 4: было включено 7 индивидуумов с ингибиторами фактора VIII или фактора IX, и их лечили 300 мг TFPI-106 один раз в неделю (QW).

Как отмечалось выше, индивидуумы с ингибиторами FVIII или FIX были включены в специальную группу (группа 4, в которой проводили лечение 300 мг п/к QW). Дополнительных индивидуумов и/или группы включают в случае, когда количество групп дозирования или размер групп дозирования возрастает. Увеличение количество групп дозирования и/или размер групп дозирования может лучше определить диапазон доз и/или клинический профиль при соответствующих уровнях доз.

Группу исторического стандарта (также называемую "исторической группой по потребности" или "по потребности") формировали, чтобы она служила для сравнения в анализе клинической эффективности. Группа "по потребности" включает данные, проспективно полученные от индивидуумов с гемофилией, которых лечили заместительной терапией факторами свертывания по потребности (т.е. при необходимости для лечения внезапных кровотечений). В частности, данные, полученные от индивидуумов, которых лечили по потребности в следующих клинических испытаниях, использовали для формирования исторической группы "по потребности": ReFacto AF 3082B2-4432 (B1831004), BeneFIX (B1821010) и BeneFIX 3090A1-400 (B1821004). Полученный набор данных далее фильтровали, чтобы он соответствовал ключевым критериям включения/исключения настоящего исследования на основе возраста и активности фактора (18 ≤ возраст ≤ 65 и активность фактора ≤ 1%). Всех индивидуумов, удовлетворяющих этим критериям, включали в историческую контрольную группу "по потребности".

ЗАДАЧИ И КОНЕЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТОКОЛА

Основной задачей этого исследования было определение безопасности и переносимости многократных доз TFPI-106, вводимых индивидуумам с тяжелой гемофилией A и B с ингибиторами FVIII или FIX или без них.

Первичные конечные результаты были следующими:

Частоту, тяжесть и причинно-следственную связь для возникших после начала лечения нежелательных явлений (TEAE) и прекращения участия вследствие TEAE оценивали с 1 суток вплоть до 113 суток.

Оценивали частоту и величину аномальных лабораторных данных, включая, но не ограничиваясь ими, анализ гематологии, протромбиновое время/международное нормализованное отношение (PT/INR), активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), анализ мочи, активность антитромбина III и сердечный тропонин I с 1 суток вплоть до 113 суток.

Индивидуумов также исследовали в отношении изменений от исходного уровня основных показателей жизнедеятельности (например, кровяное давление, пульс, температура и частота дыхания, электрокардиограмма (ЭКГ) и физикальное обследование) с 1 суток вплоть до 113 суток.

Частоту, тяжесть и причинно-следственную связь для реакций в области инфузии и инъекции также оценивали с 1 суток вплоть до 113 суток.

Ключевой вторичной задачей является оценка клинической эффективности многократного дозирования TFPI-106. Ключевым вторичным результатом является оценка общегодовой частоты эпизодов кровотечений с 1 суток вплоть до 85 суток.

ПРИМЕР 2: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всех индивидуумов, которым вводили по меньшей мере 1 дозу TFPI-106, включали в анализ и перечень безопасности, т.е. выборку для анализа безопасности (SAS).

Выборка анализа по протоколу (PPAS) представляет собой подгруппу выборки для анализа безопасности. Эта выборка не включает индивидуумов со значительными отклонениями от протокола. Значительные отклонения от протокола включают, но не ограничиваются ими, не соблюдения режима введения исследуемого лекарственного средства и нарушения в отношении сопутствующих лекарственных средств.

Ключевые демографические и исходные характеристики исследуемых индивидуумов

Ключевые демографические и исходные характеристики выборки, распределенной на лечение, обобщенно представлены в таблице 1

Таблица 1: Ключевые демографические и исходные характеристики (выборка для анализа безопасности)

Все мужчины 300 мг п/к QW без ингибитора (N=7) Нагрузка 300 мг п/к +150 мг QW без ингибитора (N=6) 450 мг п/к QW без ингибитора (N=6) 300 мг п/к QW с ингибитором (N=5) Общая - 300 мг п/к QW (N=12) 7 (100%) 6 (100%) 6 (100%) 7 (100%) 14 (100%) Возраст (лет) Среднее значение (SD) 31,9
(8,17) 28,7
(8,31) 41,7
(15,87) 44,1
(9,44) 38,0
(10,61) Медиана (min, max) 28,0
(26, 49) 25,5
(21, 43) 44,5
(19, 58) 40
(36, 63) 36,5
(26, 63) Раса Белые 3 (42,9%) 2 (33,3%) 6 (100%) 3 (42,9%) 6 (42,9%) Черные или афро-американцы 4 (57,1%) 4 (66,7%) 0 4 (57,1%) 8 (57,1%) Этническая принадлежность Испанцы или латиноамериканцы 5 (71,4%) 2 (33,3%) 3 (50%) 1 (14,3%) 6 (42,9%) Не испанцы или латиноамериканцы 2 (28,6%) 4 (66,7%) 3 (50%) 6 (85,7%) 8 (57,1%) Масса тела (кг) N 7 6 6 7 14 Среднее значение (SD) 75,89
(13,245) 62,28
(9,832) 83,95
(7,149) 72,71
(16,401) 74,30 (14,416) Median (min, max) 78,00
(53,2, 92,0) 61,60
(50,2, 79,8) 82,85
(74,8, 94,8) 67,00
(52,0, 96,0) 73,85
(52,0, 96,0) Индекс массы тела (BMI) (кг/м²) n 7 6 6 7 14 Среднее значение (SD) 25,06 (4,504) 21,01 (1,397) 26,05 (1,059) 24,12 (4,297) 24,59 (4,258) Медиана (min, max) 25,28 (18,0, 30,4) 21,26 (19,0, 22,8) 26,30 (24,7, 27,2) 23,01 (17,8, 29,6) 24,42 (17,8, 30,4) Гемофилия A 6 (85,7%) 5 (83,3%) 5 (83,3%) 7 (100%) 13 (92,9%) Гемофилия B 1 (14,3%) 1 (16,7%) 1 (16,7%) 0 1 (7,1%) Гемофильная артропатия 7 (100%) 3 (50%) 6 (100%) 6 (85,7%) 13 92,9%) Сустав-мишень (≥1) 7 (100%) 5 (83,3%) 6 (100%) 6 (85,7%) 13 (92,9%)

Безопасность

На сегодняшний день не было идентифицировано очевидных или предполагаемых сигналов безопасности для TFPI-106 при трех уровнях доз, исследованных у индивидуумов с гемофилией A и B без ингибиторов, или в данных для индивидуумов с гемофилией A или B с ингибиторов.

Заключение: Неблагоприятные явления, лабораторные данные, анализ свертывания, основные показатели жизнедеятельности и данные ЭКГ показали, что режимы 300 мг п/к QW и 150 мг п/к QW были в основном безопасными и хорошо переносимыми.

Эффективность

Эпизоды кровотечений, которые возникали в ходе периода исследования, т.е. с 1 суток по 85 сутки, приведены ниже (таблица 2). У одного из индивидуумов в группе 3 доза была модифицирована до 300 мг пк QW (с 450 мг п/к) на 30 сутки вследствие множества тяжелых реакций в области инъекции. Этот индивидуум имел два спонтанных эпизода кровотечения после модификации дозы.

Таблица 2. Перечень явлений кровотечений в PPAS

Группа Пациент День испытания, когда произошло кровотечение ТИП КРОВОТЕЧЕНИЯ ОБЛАСТЬ(И) КРОВОТЕЧЕНИЯ Кровотечение сустава-мишени 1 10021005 31 ТРАВМАТИЧЕСКОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОТЬ Нет 1 10021007 34 СПОНТАННОЕ ЛЕВОЕ КОЛЕНО Да 1 10021007 84 ТРАВМАТИЧЕСКОЕ ПРАВАЯ ЛОДЫЖКА Нет 1 10021009 12 СПОНТАННОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОСТЬ Да 1 10021009 45 СПОНТАННОЕ ПРАВЫЙ ЛОКОСТЬ Да 1 10041002 2 СПОНТАННОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОТЬ Нет 2 10021013 37 ТРАВМАТИЧЕСКОЕ ПРАВОЕ ПРЕДПЛЕЧЬЕ Нет 2 10031004 66 СПОНТАННОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОТЬ Да 3 10021015* 13 ТРАВМАТИЧЕСКОЕ ЛЕВОЕ КОЛЕНО Да 3 10021015* 70 СПОНТАННОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОТЬ Нет 3 10021015* 77 СПОНТАННОЕ ЛЕВЫЙ ЛОКОТЬ Нет 3 10041005 11 СПОНТАННОЕ ПРАВОЕ КОЛЕНО Нет 3 10041005 51 СПОНТАННОЕ ПРАВОЕ КОЛЕНО Нет 3 10041005 78 СПОНТАННОЕ ВНУТРИЧЕРЕПНОЕ** Нет 4 10031008 74 СПОНТАННОЕ РЕКТАЛЬНОЕ Нет *индивидуум 10021015 был переключен с 450 мг п/к QW на 300 мг п/к QW на 30 сутки вследствие множественных тяжелых реакций в области инъекции. ** Неподтвержденное внутричерепное кровотечение. Не проводилось подтверждающих исследований (например, КТ-сканирование).

Ключевым вторичным конечным результатом исследования является общегодовая частота кровотечений (ABR) с 1 суток по 85 сутки. ABR в группах 1-3 в PPAS сравнивали с исторической группой "по потребности" с использованием отрицательной биномиальной модели (таблица 3). ABR на основе модели составляло 4,2 для группы 1 (300 мг п/к QW), 1,5 для группы 2 (нагрузочная доза 300 мг п/к, за которой следовала доза 150 мг п/к QW), 4,2 для группы 3 (450 мг п/к QW), 2,5 для группы 4 (300 мг п/к QW с ингибиторами) и 27,6 для исторической группы "по потребности" соответственно. Процентное уменьшение ABR по сравнению с исторической группой "по потребности" составляло 85% (80%CI: 71%, 92%; p=0,0002) для группы 1 (300 мг п/к QW), 95% (80%CI: 86%, 98%; p=0,0001) для группы 2 (нагрузочная доза 300 мг п/к, а затем 150 мг п/к QW), 85% (80%CI 71%, 92%; p=0,0002) для группы 3 (450 п/к QW) и 98% (80%CI 90%, 99%; p=0,0005) для группы 4 (300 мг п/к QW с ингибиторами) (таблица 3). Срединное ABR составляло 4,2 для группы 1 (300 мг п/к QW), 0 для группы 2 (нагрузочная доза 300 мг п/к, а затем 150 мг п/к QW), 0 для группы 3 (450 п/к QW), 0 для группы 4 (300 мг п/к QW с ингибиторами) и 22,6 для исторической группы "по потребности", соответственно.

Процентное снижение ABR по сравнению с периодом до лечения составляло 82% (80%CI: 69%, 89%; p<0,0001) для группы 1 (300 мг п/к QW); 90% (80%CI: 78%, 96%; p=0,0002) для группы 2 (нагрузочная доза 300 мг п/к, а затем 150 мг п/к QW), 80% (80%CI: 53%, 91%; p=0,0154) для группы 3 (450 п/к QW) и 96% (80%CI 86%, 99%; p=0,0005) для группы 4 (300 мг п/к QW с ингибиторами) (таблица 4).

Таблица 3. Общегодовая частота кровотечений против исторической группы "по потребности" (PPAS)

Историческая группа "по потребности" 300 мг п/к QW Значение p Нагрузочная доза 300 мг+150 мг п/к QW Значение p 450 мг п/к QW Значение p 300 мг п/к QW с ингибитором Значение p N 65 6 6 6 6 ABR (80%CI) * 27,6 (24,7, 30,9) 4,2 (2,2, 7,9) 1,5 (0,6, 3,9) 4,2 (2,2, 7,9) 0,72 (0,19, 2,73) Соотношение ABR (80%CI) 0,15 (0,08, 0,29) 0,05 (0,02, 0,14) 0,15 (0,08, 0,29) 0,03 (0,01, 0,10) % снижение (80%CI) 85% (71%, 92%) 0,0002* 95% (86%, 98%) 0,0001* 85% (71%, 92%) 0,0002* 98% (90%, 99%) 0,0005* Срединное ABR (Диапазон) 22,6 (0,5,
67,6) 4,2 (0, 8,5) <0,0001# 0 (0, 5,5) <0,0001# 0 (0, 12,6) <0,0001# 0 (0,3,9) <0,0001# *негативная биномиальная модель;
#Точный критерий суммы рангов Уилкоксона

Таблица 4. Общегодовая частота кровотечений против данных до лечения в PPAS

300 мг п/к QW Значение p Нагрузочная доза 300 мг+150 мг п/к QW Значение p 450 мг п/к QW Значение p 300 мг п/к QW с ингибитором Значение p N 6 6 6 6 Данные до лечения -Среднее ABR 23 (19,7, 26,9) 14,7 (13,9, 15,5) 20,3 (15,8, 26,2) 17,3 (16,0, 18,8) ABR (80%CI) * 4,2 (2,7, 6,5) 1,5 (0,7, 3,2) 4,2 (2,0, 8,7) 0,7 (0,2, 2,3) Соотношение ABR (80%CI) 0,18(0,11, 0,31) 0,10 (0,04, 0,22) 0,20 (0,09, 0,47) 0,04 (0,01, 0,14) % снижение (80%CI) 82% (69%, 89%) <0,0001* 90% (78%, 96%) 0,0002* 80% (53%, 91%) 0,0154* 96% (86%, 99%) 0,0005 Данные до лечения -срединная ABR 24 (12, 30) 15 (12, 16) 17 (12, 42) 18 (12, 20) Срединная ABR (диапазон) 4,2 (0, 8,5) 0,0313# 0 (0, 5,5) 0,0313# 0 (0, 12,6) 0,0313# 0 (0, 3,9) 0,0313# *негативная биномиальная модель; #знаковый ранговый критерий Уилкоксона

Иммуногенность

Отсутствовали подтвержденные положительные по антителам против лекарственного средства (ADA) индивидуумы в группе 1 (300 мг п/к QW) или 2 (150 мг п/к QW). Проводится оценка других групп.

Фармакокинетика (PK)

Популяционную модуль PK для TFPI-106 получали на основе данных предыдущего первого на людях (FIH) испытания (B7841001) на здоровых индивидуумах.

Распределение ключевой демографической информации об индивидуумах в настоящем испытании (B7841002) использовали для имитации экспозиции TFPI-106. На наблюдаемые концентрации в плазме в настоящем испытании (B7841002) накладывали модельное прогнозирование для группы 1 (300 мг п/к QW) (фиг.2A), для группы 2 (нагрузочная доза 300 мг п/к, а затем 150 мг п/к QW) (фиг.2B) и для группы 3 (450 мг п/к QW) (фиг.2C). Наблюдаемая экспозиция для TFPI-106 групп 1 и 2 согласуется с модельным прогнозированием. Эти данные указывают на то, что отсутствуют очевидные отличия в PK между здоровыми индивидуумами в исследовании FIH и у пациентов с гемофилией в настоящем испытании.

Фармакодинамика (PD)

Оцененные конечные результаты PD отражали связывание мишени посредством TFPI-106 (общие уровни TFPI) или последующие фармакологические эффекты ингибирования TFPI (т.е. анализ образования тромбина (TGA), образование протромбинового фрагмента 1+2 (PF1+2), протромбиновое время с разведенным тромбопластином (dPT) и образование D-димера).

Срединные значения (общий TFPI, пиковый тромбин TGA и D-димер) или срединное изменение от исходного уровня (dPT и PF1+2) против времени в зависимости от групп доз представлены на фиг.3. Связанные с лечением изменения наблюдали для всех доступных конечных результатов PD. Они включали (i) зависимое от дозы повышение общего TFPI, которое согласуется со связыванием TFPI с TFPI-106 (фиг.3A); (ii) нормализацию (т.е. 90% CI [44, 176 нМ], полученный с использованием логарифмического преобразование пиковых величин тромбина до дозирования от всех индивидуумов в испытании FIH (B7841001) для отображения нормального диапазона у здоровых индивидуумов) пикового тромбина TGA (фиг.3B); (iii) зависимое от дозы повышение PF1+2 (фиг.3C); (iv) укорочение протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT) (фиг.3D); и (v) увеличение уровня D-димера (фиг.3E). Эти результаты указывают на то, что лечение TFPI-106 повышало активность свертывания и нормализацию образования тромбина.

Дефицит FVIII и FIX (активность ≤1% при тяжелой гемофилии A и B, соответственно) приводит к недостаточной активации фактора X (FX), снижению образования тромбина и последующей неспособности расщеплять достаточные уровни фибриногена для образования фибрина для формирования сгустка. Срединный пиковый уровень тромбина до лечения для индивидуумов с гемофилией в группе 1 (22,1 нМ, диапазон 16,2-60,0) и группе 2 (26,8 нМ, диапазон 14,3-57,2) указывает на это сниженное образование тромбина. В качестве сравнения, здоровые добровольцы (с нормальными уровнями FVIII и FIX) из испытания FIH фазы 1 (B7841001) имели приблизительно в 4 раза более высокое образование тромбина до лечения (93,2 нМ, диапазон 71,4-132,7). После лечения TFPI-106 все индивидуумы в группе 1, группе 2 и группе 3 в стационарных концентрациях достигли максимального образования тромбина, приблизительно достигающего нормального диапазона, демонстрируемого здоровыми добровольцами из испытания FIH (B7841001).

Таблица 5. Последовательности

Seq ID Описание Последовательность 1 K1K2 TFPIα человека (номер доступа #P10646, остатки 29-177) DSEEDEEHTI ITDTELPPLK LMHSFCAFKA DDGPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCE GNQNRFESLE ECKKMCTRDN ANRIIKTTLQ QEKPDFCFLE EDPGICRGYI TRYFYNNQTK QCERFKYGGC LGNMNNFETL EECKNICED 2 K1K2K3 TFPIα человека (номер доступа #P10646, остатки 29-282) DSEEDEEHTI ITDTELPPLK LMHSFCAFKA DDGPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCE GNQNRFESLE ECKKMCTRDN ANRIIKTTLQ QEKPDFCFLE EDPGICRGYI TRYFYNNQTK QCERFKYGGC LGNMNNFETL EECKNICEDG PNGFQVDNYG TQLNAVNNSL TPQSTKVPSL FEFHGPSWCL TPADRGLCRA NENRFYYNSV IGKCRPFKYS GCGGNENNFT SKQECLRACK KGFIQRISKG GLIK 3 K1K2K3 TFPI2 человека (номер доступа # P48307,1, остатки 23-211) DAAQEPTGNN AEICLLPLDY GPCRALLLRY YYDRYTQSCR QFLYGGCEGN ANNFYTWEAC DDACWRIEKV PKVCRLQVSV DDQCEGSTEK YFFNLSSMTC EKFFSGGCHR NRIENRFPDE ATCMGFCAPK KIPSFCYSPK DEGLCSANVT RYYFNPRYRT CDAFTYTGCG GNDNNFVSRE DCKRACAKA 4 K1K2 TFPI мыши (номер доступа #O54819, остатки 29-174) LSEEADDTDS ELGSMKPLHT FCAMKADDGP CKAMIRSYFF NMYTHQCEEF IYGGCEGNEN RFDTLEECKK TCIPGYEKTA VKAASGAERP DFCFLEEDPG LCRGYMKRYL YNNQTKQCER FVYGGCLGNR NNFETLDECK KICENP 5 K1K2 TFPI яванского макака (номер доступа #Q2PFV4, остатки 29-177) DSEEDEEYTI ITDTELPPLK LMHSFCAFKP DDGPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCG GNQNRFESME ECKKVCTRDN VNRIIQTALQ KEKPDFCFLE EDPGICRGYI TRYFYNNQSK QCERFKYGGC LGNMNNFETL EECKNTCED 6 K1K2 TFPI кролика (номер доступа #P19761, остатки 29-173) AAEEDEEFTN ITDIKPPLQK PTHSFCAMKV DDGPCRAYIK RFFFNILTHQ CEEFIYGGCE GNENRFESLE ECKEKCARDY PKMTTKLTFQ KGKPDFCFLE EDPGICRGYI TRYFYNNQSK QCERFKYGGC LGNLNNFESL EECKNTCEN 7 K1K2 TFPI крысы (номер доступа #Q02445, остатки 29-176) LPEEDDDTIN TDSELRPMKP LHTFCAMKAE DGPCKAMIRS YYFNMNSHQC EEFIYGGCRG NKNRFDTLEE CRKTCIPGYK KTTIKTTSGA EKPDFCFLEE DPGICRGFMT RYFYNNQSKQ CEQFKYGGCL GNSNNFETLE ECRNTCED 8 CDR1 LC mAb-TFPI-23 TGSSSNIGAG YDVH 9 CDR2 LC mAb-TFPI-23 GNSNRPS 10 CDR3 LC mAb-TFPI-23 QSYDSSLSGS GV 11 VL LC mAb-TFPI-23
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты QSVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGSSSNIG AGYDVHWYQQ LPGTAPKLLI YGNSNRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAITGL QAEDEADYYC QSYDSSLSGS GVFGGGTKLT VLG 12 mAb-TFPI-23
mAb-TFPI-106 LC
mAb-TFPI-107 LC
CDR1, 2, 3 подчеркнуты. Последовательность вариабельной области выделена курсивом QSVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGSSSNIG AGYDVHWYQQ LPGTAPKLLI YGNSNRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAITGL QAEDEADYYC QSYDSSLSGS GVFGGGTKLT VLGQPKAAPS VTLFPPSSEE LQANKATLVC LISDFYPGAV TVAWKADSSP VKAGVETTTP SKQSNNKYAA SSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQ VTHEGSTVEK TVAPTECS 13 CDR1 HC mAb-TFPI-23 GFTFSSYAMS 14 CDR2 HC mAb-TFPI-23 AISGSGGSTY YADSVKG 15 CDR3 HC mAb-TFPI-23 LGATSLSAFD I 16 VH mAb-TFPI-23
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAILG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS 17 HC mAb-TFPI-23
CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты. Последовательность вариабельной области выдилена курсивом. Мутации эффекторной функции выделены полужирным шрифтом QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAILG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 18 VH mAb-TFPI-106
CL Ig лямбда человека с мутациями Q1E, V5L, выделенными полужирным шрифтом EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAILG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS 19 HC mAb-TFPI-106
CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты. Последовательность вариабельной области выделена курсивом. Мутации Q1E, V5L выделены полужирным шрифтом. Мутации эффекторной функции выделены полужирным шрифтом. EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAILG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 20 VH mAb-TFPI-107
CL Ig лямбда человека с мутациями Q1E, V5L, I94K, выделенными полужирным шрифтом EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKLG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS 21 HC mAb-TFPI-107
CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты. Последовательность вариабельной области выделена курсивом. Мутации Q1E, V5L, I94K выделены полужирным шрифтом. Мутации эффекторной функции выделены полужирным шрифтом. EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKLG ATSLSAFDIW GQGTMVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG 22 LC 2A8-200
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты
Последовательность вариабельной области выделена курсивом DIELTQPPSV SVAPGQTARI SCSGDNLRNY YAHWYQQKPG QAPVVVIFYD VNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAE DEADYYCQSW WDGVPVFGGG TKLTVLGQPK AAPSVTLFPP SSEELQANKA TLVCLISDFY PGAVTVAWKA DSSPVKAGVE TTTPSKQSNN KYAASSYLSL TPEQWKSHRS YSCQVTHEGS TVEKTVAPTE CS 23 HC 2A8-200
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты
Последовательность вариабельной области выделена курсивом QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFR SYGMDWVRQA PGKGLEWVSS IRGSRSSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARLY RYWFDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG 24 LC hz4F36
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты
Последовательность вариабельной области выделена курсивом DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL ESDGKTYLNW YLQKPGQSPQ LLIYLVSILD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCLQATHFP QTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 25 HC hz4F36
CDR1, CDR2, CDR3 подчеркнуты
Последовательность вариабельной области выделена курсивом EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQT PEKRLEWVAT ISRSGSYSYF PDSVQGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARLG GYDEGDAMDS WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK

Различные признаки и варианты осуществления настоящего изобретения, упоминаемые в отдельных разделах выше, применимы, если уместно, к другим разделам с учетом необходимых изменений. Следовательно, признаки, указанные в одном разделе, можно комбинировать с признаками, указанными в других разделах, в зависимости от обстоятельств. Все ссылки, цитированные в настоящем описании, включая патенты, патентные заявки, статьи, справочники и цитированные номера доступа последовательностей, и ссылки, цитированные в них, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В случае, когда один или несколько из включенных источников литературы и сходных материалов отличаются от или противоречат настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, определенные термины, использованием терминов, описанные способы и т.п., настоящая заявка имеет преимущество.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PFIZER INC.

ZHU, Tong

ARKIN, Steven

CARDINAL, Matthew H.

LIM, Chay Ngee

NAYAK, Satyaprakash

<120> РЕЖИМ ДОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ АНТАГОНИСТОВ TFPI

<130> PC72450A

<150> 62/744481

<151> 2018-10-11

<150> 62/802401

<151> 2019-02-07

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 149

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp

145

<210> 2

<211> 254

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys

245 250

<210> 3

<211> 189

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu

1 5 10 15

Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu

35 40 45

Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys

50 55 60

Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys Arg Leu Gln Val Ser Val

65 70 75 80

Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys Tyr Phe Phe Asn Leu Ser

85 90 95

Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly Gly Cys His Arg Asn Arg

100 105 110

Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr Cys Met Gly Phe Cys Ala

115 120 125

Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gly Leu

130 135 140

Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe Asn Pro Arg Tyr Arg Thr

145 150 155 160

Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asp Asn Asn Phe

165 170 175

Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala

180 185

<210> 4

<211> 146

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Leu Ser Glu Glu Ala Asp Asp Thr Asp Ser Glu Leu Gly Ser Met Lys

1 5 10 15

Pro Leu His Thr Phe Cys Ala Met Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys

20 25 30

Ala Met Ile Arg Ser Tyr Phe Phe Asn Met Tyr Thr His Gln Cys Glu

35 40 45

Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Glu Asn Arg Phe Asp Thr

50 55 60

Leu Glu Glu Cys Lys Lys Thr Cys Ile Pro Gly Tyr Glu Lys Thr Ala

65 70 75 80

Val Lys Ala Ala Ser Gly Ala Glu Arg Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu

85 90 95

Glu Asp Pro Gly Leu Cys Arg Gly Tyr Met Lys Arg Tyr Leu Tyr Asn

100 105 110

Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Gly

115 120 125

Asn Arg Asn Asn Phe Glu Thr Leu Asp Glu Cys Lys Lys Ile Cys Glu

130 135 140

Asn Pro

145

<210> 5

<211> 149

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu Tyr Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Pro Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Met Glu Glu Cys Lys Lys Val Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Val Asn Arg Ile Ile Gln Thr Ala Leu Gln Lys Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Thr Cys Glu Asp

145

<210> 6

<211> 149

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Ala Ala Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Asn Ile Thr Asp Ile Lys Pro

1 5 10 15

Pro Leu Gln Lys Pro Thr His Ser Phe Cys Ala Met Lys Val Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Arg Ala Tyr Ile Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Leu Thr

35 40 45

His Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Glu Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Glu Lys Cys Ala Arg Asp Tyr

65 70 75 80

Pro Lys Met Thr Thr Lys Leu Thr Phe Gln Lys Gly Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Leu Asn Asn Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Thr Cys Glu Asn

145

<210> 7

<211> 148

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Leu Pro Glu Glu Asp Asp Asp Thr Ile Asn Thr Asp Ser Glu Leu Arg

1 5 10 15

Pro Met Lys Pro Leu His Thr Phe Cys Ala Met Lys Ala Glu Asp Gly

20 25 30

Pro Cys Lys Ala Met Ile Arg Ser Tyr Tyr Phe Asn Met Asn Ser His

35 40 45

Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Arg

50 55 60

Phe Asp Thr Leu Glu Glu Cys Arg Lys Thr Cys Ile Pro Gly Tyr Lys

65 70 75 80

Lys Thr Thr Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ala Glu Lys Pro Asp Phe Cys

85 90 95

Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Phe Met Thr Arg Tyr

100 105 110

Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Gln Phe Lys Tyr Gly Gly

115 120 125

Cys Leu Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Arg Asn

130 135 140

Thr Cys Glu Asp

145

<210> 8

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly Val

1 5 10

<210> 11

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly

<210> 12

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 18

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 20

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 22

<211> 212

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Phe

35 40 45

Tyr Asp Val Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Trp Asp Gly Val Pro Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

115 120 125

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

130 135 140

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

195 200 205

Thr Glu Cys Ser

210

<210> 23

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 24

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 25

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<---

Группа изобретений относится к режимам дозирования антител-антагонистов TFPI для лечения нарушений свертываемости крови. Способы предусматривают введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI): а) с первоначальной дозой 300 мг и с одной или более последующей дозой 150 мг раз в неделю; b) с недельной дозой 300 мг или с) с недельной дозой 450 мг. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12. Способы способствуют укорочению времени кровотечения у индивидуума, лечению гемофилии A, B или C у индивидуума, нуждающегося в этом, уменьшению общегодовой частоты кровотечений (ABR). ABR после введения снижается по меньшей мере на 80% и составляет не более 1-4 кровотечений в год. 3 н. и 29 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 2 пр.

1. Способ укорочения времени кровотечения у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму:

а) с первоначальной дозой 300 мг и с одной или более последующей дозой 150 мг раз в неделю;

b) с недельной дозой 300 мг; или

с) с недельной дозой 450 мг;

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

2. Способ по п.1, где указанный эпитоп содержит остатки Ile105, Arg107 и Leu131 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят подкожно.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный эпитоп дополнительно содержит остатки Cys106, Gly108, Cys130, Leu131 и Gly132 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный эпитоп дополнительно содержит Asp102, Arg112, Tyr127, Gly129, Met134 и Glu138 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2.

6. Способ лечения гемофилии A, B или C, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму:

а) с первоначальной дозой 300 мг и с одной или более последующей дозой 150 мг раз в неделю;

b) с недельной дозой 300 мг; или

c) с недельной дозой 450 мг;

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму с недельной дозой 300 мг с последующим введением последующей дозы 150 мг, где последующую дозу вводят раз в неделю (недельная доза), и где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму с недельной (раз в неделю) дозой 300 мг, где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму с недельной (раз в неделю) дозой 450 мг, где антитело содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет одну или несколько из следующих характеристик: (i) время полужизни по меньшей мере 25 часов, (ii) аффинность связывания (K_D) от приблизительно 5×10^-7 M до приблизительно 5×10^-11 M и/или (iii) подкожная (п/к) биодоступность по меньшей мере 10% относительно внутривенной биодоступности.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индивидуум страдает от или предрасположен к заболеванию свертывания крови.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индивидуум страдает от или предрасположен к гемофилии A или B.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента: (i) снижает время свертывания при измерении в плазме в анализе протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT); (ii) снижает время свертывания в цельной крови при измерении посредством тромбоэластографии или ротационной тромбоэластометрии; (iii) повышает образование тромбина; (iv) повышает активность FXa в присутствии TFPI; (v) повышает накопление тромбоцитов в присутствии TFPI; (vi) повышает образование фибрина в присутствии TFPI при измерении посредством D-димеров; (vii) повышает уровень фрагмента протромбина 1+2; или (viii) любая их комбинация.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является достаточным для достижения по меньшей мере 5% от нормальной гемостатической активности.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента обеспечивает снижение по меньшей мере на 20% общегодовой частоты кровотечений (ABR) по сравнению с ABR, наблюдаемой у индивидуумов, которые имеют нарушения свертывания.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий введение индивидууму средства, обеспечивающего свертывание.

17. Способ по п.16, где средство, обеспечивающее свертывание, выбрано из группы, состоящей из фактора VIIa, фактора VIII, фактора IX, транексамовой кислоты и обходного средства (например, FEIBA).

18. Способ уменьшения общегодовой частоты кровотечений (ABR) у индивидуума с гемофилией, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с эпитопом в домене Куница 2 (K2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI),

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму:

а) с первоначальной дозой 300 мг и с одной или более последующей дозой 150 мг раз в неделю;

b) с недельной дозой 300 мг; или

c) с недельной дозой 450 мг;

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

19. Способ по п.18, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 80% по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения.

20. Способ по п.18, где ABR после введения снижается по меньшей мере на 85% по сравнению с историческим стандартом ABR.

21. Способ по п.19, где процентное снижение ABR после введения по сравнению с ABR у указанного индивидуума до введения выбрано из группы, состоящей из:

a) снижения ABR на 82% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму, и где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением;

b) снижения ABR на 90% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму, и где количество составляет 300 мг, а затем 150 мг с повторяющимся введением;

c) снижения ABR на 80% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму, и где количество составляет 450 мг с повторяющимся введением; и

d) снижения ABR на 96% по сравнению с ABR до введения указанного антитела указанному индивидууму, где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением, и где индивидуум имеет гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или имеет гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

22. Способ по любому из пп.18-21, где антитело вводят подкожно (п/к) или внутривенно (в/в).

23. Способ по п.22, где антитело вводят п/к.

24. Способ по п.21, где среднее ABR до введения составляет по меньшей мере 23 кровотечения в год, и ABR после введения составляет не более 4,2 кровотечения в год.

25. Способ по п.21, где среднее ABR до введения составляет по меньшей мере 14 кровотечений в год, и ABR после введения составляет не более 1,5 кровотечения в год.

26. Способ по п.21, где среднее ABR до введения составляет по меньшей мере 20 кровотечений в год, и ABR после введения составляет не более 4,2 кровотечения в год.

27. Способ по п.21, где среднее ABR до введения составляет по меньшей мере 17 кровотечений в год, и ABR после введения составляет не более 0,7 кровотечения в год.

28. Способ по п.20, где процентное снижение ABR после введения по сравнению с историческим стандартом ABR выбрано из группы, состоящей из:

a) снижения ABR на 85% по сравнению с историческим стандартом ABR, и где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением;

b) снижения ABR на 95% по сравнению с историческим стандартом ABR, и где количество составляет 300 мг, а затем 150 мг с повторяющимся введением;

c) снижения ABR на 85% по сравнению с историческим стандартом ABR, и где количество составляет 450 мг с повторяющимся введением; и

d) снижения ABR на 98% по сравнению с историческим стандартом ABR, где количество составляет 300 мг с повторяющимся введением, и где индивидуум имеет гемофилию A и ингибиторные антитела против фактора VIII человека или имеет гемофилию B и ингибиторные антитела против фактора IX человека.

29. Способ по п.18 или 20, где исторический стандарт ABR составляет по меньшей мере 27 кровотечений в год.

30. Способ по любому из пп.20, 28, 29, где антитело вводят подкожно (п/к) или внутривенно (в/в).

31. Способ по п.30, где антитело вводят п/к.

32. Способ по п.18, где после введения антитела ABR составляет не более 4 кровотечения в год, не более 3 кровотечения в год, не более 2 кровотечения в год, не более 1,5 кровотечения в год или не более 1 кровотечения в год.