Способ определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных Российский патент 2025 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Коронавирусное заболевание собак проявляется воспалением тонкого отдела кишечника от легкой до тяжелой степени. Хроническое течение заболевания приводит к атрофии слизистой оболочки кишечника у щенков [1, 2]. Возбудитель коронавирусной инфекции собак принадлежит виду Canine Coronavirus (CСoV), роду Alphacoronavirus, подсемейству Orthocoronavirinae, семейству Coronaviridae [3].

Геном коронавируса представлен одноцепочечной положительно заряженной молекулой РНК длиной 29400-30000 н.о. Около 2/3 геномной РНК вируса занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF), ORF1a и ORF1b, которые кодируют два полипротеина, приводящих к образованию вирусной репликазы. С 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н.о.) состоит из других ORF, кодирующих структурные и неструктурные белки. Структурные белки включают белки S, E, M и N, кодируемые ORF2, ORF4, ORF5 и ORF6 соответственно [4, 5].

Пять основных генов кодируют следующие белки: шипообразный белок (S-белок), мембранный гликопротеин (M-белок), нуклеокапсид
(N-белок), белок оболочки (E-белок) и ORF1ab (большой полипротеин, известный как репликаза/протеаза). Полные вирионы состоят из РНК коронавируса и пяти белков, указанных выше, тем самым, определяя иммуногенность культуральных инактивированных вакцин против коронавирусной инфекции животных [6].

Система мер борьбы с коронавирусной инфекцией собак и ее профилактика заболевания предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [4, 7].

Для вакцинации щенков применяют культуральные инактивированные вакцины против коронавирусной инфекции собак. В процессе производства данных вакцин промышленное сырье исследуют на определение концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак.

Как правило, для определения данного компонента применяют физический метод, который предусматривает процесс ультрацентрифугирования для выделения в градиенте сахарозы вирионов возбудителя коронавирусной инфекции с последующим определением оптической плотности [8] (прототип).

Существенными недостатками указанного способа являются:

1) ограничения по чувствительности из-за наличия белковых примесей после отделения фракции с градиента сахарозы;

2) трудоемкость процесса по причине использования процесса ультрацентрифугирования;

3) субъективность получаемых результатов по причине сложности отбора опалесцирующей фракции после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы;

4) продолжительность проводимого анализа (не менее 48 ч) [9-11].

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных с помощью современных методов исследования.

Предлагаемый способ позволяет определять концентрацию вирионов коронавируса собак в производственном сырье при изготовлении культуральных вакцин в течение 3 часов (быстрее в 16 раз по сравнению с прототипом); не имеет ограничений по чувствительности по причине вычитания фоновых значений; менее трудоемкий по сравнению с прототипом; высокочувствительный и объективный.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных, который позволяет:

1) сократить время проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации вирионов коронавируса собак до 3 ч;

2) повысить чувствительность и специфичность анализа;

3) исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине использования приборного обеспечения для детекции результатов;

4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией вирионов коронавируса собак (C_CCoV) и порогового цикла амплификации ампликонов участка M-гена CCoV (C_t), представленной в виде линейной функции:

C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9998).

Предложенная модель позволяет определять концентрацию вирионов коронавируса собак в сырье при изготовлении культуральных вакцин по данным порогового цикла амплификации для ампликонов таргетного участка M-гена коронавируса.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Зависимость между концентрацией вирионов коронавируса собак (C_CCoV) и порогового цикла амплификации ампликонов участка M-гена CCoV (C_t) (n=5, p<0,005).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера CCoV-С-F;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность нуклеотидов молекулярного зонда CCoV-С-P;

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера CCoV-C-R.

Сущность изобретения заключается в особом подходе по определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Заявляемый способ основан на: 1) выделении РНК возбудителя коронавирусной инфекции собак; 2) проведении обратной транскрипции и амплификации специфического фрагмента M-гена кДНК коронавируса собак с применением оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем ROX (карбокси-X-родамин, длина волны возбуждения - 580 нм, флуоресценции - 602 нм) и тушителем свечения BHQ-2 (λ_max поглощения = 575 нм); 3) детектировании ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде графика накопления флуоресцентного сигнала; 4) определении значений пороговых циклов амплификации C_t; 5) расчете концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением линейной функции:

C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9998).

В настоящее время обратная транскрипция и реакция амплификации в режиме реального времени используется для выявления нуклеиновой кислоты и генотипирования возбудителя коронавирусной инфекции собак. Для определения концентрации вирионов коронавируса в промышленном сырье при изготовлении культуральных вакцин ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных олигонуклеотидов не применялся. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных авторами не обнаружено.

Разработанный способ определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью, специфичностью и скоростью выполнения анализа.

В отличие от прототипа разработанный способ включает следующие этапы анализа: 1) выделение РНК возбудителя коронавирусной инфекции собак; 2) обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени при амплификации специфического фрагмента M-гена кДНК коронавируса собак с применением специфичных праймеров и молекулярного зонда; 3) детектирование ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоидного графика; 4) определение значений пороговых циклов амплификации C_t; 5) расчет концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением линейной функции:

C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9998).

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации вирионов коронавируса собак до 3 ч; повысить чувствительность и специфичность анализа; исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине наличия приборного обеспечения для детекции результатов; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией вирионов коронавируса собак и пороговым циклом амплификации ампликонов таргетного участка M-гена. Исходя их этого, актуально применять разработанный способ для определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение пороговых циклов амплификации для ампликонов таргетного участка M-гена коронавируса и расчет концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин с использованием разработанной квадратичной функции.

Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении реакции амплификации с использованием оригинальных специфичных олигонуклеотидов, рассчитанных на участок M-гена кДНК вирионов коронавируса собак, и разработанной функции (фиг. 1).

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность:

- повысить чувствительность и специфичность за счет применения олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для участка M-гена кДНК коронавируса собак;

- увеличить достоверность проводимого анализа благодаря применению оптимальных температурного и временного режимов термоциклирования;

- повысить скорость проводимого анализа в 16 раз по сравнению с прототипом.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графических материалах - «Зависимость между концентрацией вирионов коронавируса собак (C_CCoV) и порогового цикла амплификации ампликонов участка M-гена CCoV (C_t) (n=5, p<0,005)» (фиг. 1).

С целью определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных отдельно подготавливают положительный контрольный образец. Для этого проводят репродукцию коронавируса собак в монослойной перевиваемой клеточной линии почки кошки Крэнделла Риса CRFK (Crandell Feline Kidney) до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.

Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергают центрифугированию при 2000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирают для последующих исследований. Проводят ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте сахарозы (10-50%) при 45000 g в течение 2 ч при температуре 15±2°С. Опалесцирующий слой отбирают в отдельный пенициллиновый флакон, переносят в центрифужные пробирки, доливают объем пробирок с помощью 1/15 М фосфатно-солевого буферного раствора (водородный показатель 7,4-7,6). Осаждают вирионы для очищения от остатков сахарозы с помощью центрифугирования при 45 000 g в течение 1 ч при 15±2°С. Полученный осадок растворяют в необходимом количестве 1/15 М фосфатно-солевого буферного раствора.

В готовой суспензии определяют концентрацию вирионов с помощью спектрометрического метода. Проводят вертикальный белковый гель-электрофорез в 12%-ном полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, для оценки степени чистоты положительного контрольного препарата. Таким образом, получают охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами используют в дальнейшей работе.

На следующем этапе исследования составляют контрольную панель положительных стандартов суспензий вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак со следующими концентрациями: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяют суспензию клеток линии CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяют нуклеиновую кислоту. Для этого применяют набор «РИБО-сорб» (ООО «Интерлабсервис») в соответствии с инструкцией производителя.

Проводят обратную транскрипцию для получения комплементарной ДНК (кДНК) коронавируса собак и ПЦР в режиме реального времени. Для этого готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидов отражен в таблице 2.

В качестве гомологичных участку M-гена коронавируса собак используют следующие олигонуклеотидные праймеры:

CCoV-С-F-праймер с дизайном 5'- CCAGATATGTAATGTTCGGCTT-3',

CCoV-С-R-праймер с дизайном 5'-ATCTGTTGAGTAATCACCAGC-3',

CCoV-С-P-зонд с дизайном 5'- ROX-GGTGGTCTTTCAACCCTGAA-BHQ-2-3',

в концентрации 6 пМ на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 0,25 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5-кратный), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют 3,0 мМ хлорида магния. В качестве катализатора реакции амплификации применяют Taq-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (3 е.а.). Элюаты РНК каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах B. Deiman и R. Sooknanan [12, 13]. Длины
прямого, обратного праймеров и зонда составляют 22, 21, 20 н.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.). Молекулярный вес олигонуклеотидов равен 6740,5; 6405,2; 6108 (с учетом флуорофора и гасителя свечения), соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RHQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в реакции амплификации. В качестве флуоресцентного красителя был выбран ROX. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ2.

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидов методом, учитывающим концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) [12-14].

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления (T_m) олигонуклеотидных праймеров и зонда представлены в таблице 3, из которой следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 172,3, ккал/моль, 26,5 ккал/моль, 454,1 кал/(°K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 162,4 ккал/моль, 24,8 ккал/моль, 427,6 кал/(°K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного зонда составили 168 ккал/моль, 25,3 ккал/моль, 444 кал/(°K⋅моль), соответственно [15]. Полученные значения использовались для расчета температур плавления, представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для всех олигонуклеотидов составили 57-58°С.

Экспериментально температуру отжига определяли по кривым плавления гетеродимера олигонуклеотида и матрицы с помощью модели фолдинга с использованием программного обеспечения Hybrid. В результате проведения эксперимента было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 55°С.

Последовательности оригинальных олигонуклеотидов проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [16, 17]. Выявлено, что для используемых олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Проведение обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 20 минут. Перед проведением реакции амплификации осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 98°С в течение 5 минут для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. Амплификация включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 98°С в течение 5 с, отжиг праймеров и зонда - при температуре 55°С в течение 20 с, элонгация - при температуре 72°С в течение 30 с. Количество циклов ПЦР - 40.

Результаты реакции амплификации анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и сигмоидной функции вида Fl = f (C_t). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. При наличии в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы график имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоидные графики, полученные при анализе флуоресценции красителя ROX, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы оцениваются как отрицательные, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.

На следующем этапе анализа устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией вирионов коронавируса собак в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Оценивают достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной линейной функции рассчитывают значение концентрации вирионов коронавируса собак в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение положительного контрольного образца для выявления зависимости между пороговым циклом амплификации и концентрацией вирионов коронавируса собак в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.

Для получения положительного контрольного образца проводили репродукцию коронавируса собак в монослойной перевиваемой клеточной линии почки кошки CRFK до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.

Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергали центрифугированию при 2000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирали для последующих исследований. Проводили ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте сахарозы (10-50%) при
45 000 g в течение 2 ч при температуре 15±2°С. Опалесцирующий слой отбирали в отдельный пенициллиновый флакон, перенося в центрифужные пробирки, доливали объем пробирок с помощью 1/15 М фосфатно-солевого буферного раствора. Осаждали вирионы для очищения от остатков сахарозы с помощью центрифугирования при 45000 g в течение 1 ч при 15±2°С. Полученный осадок растворяли в необходимом количестве 1/15 М фосфатно-солевого буферного раствора.

В готовой суспензии определяли концентрацию вирионов с помощью спектрометрического метода (прототип). По данным прототипного способа анализа концентрация вирионов составляла 4,3 мг/мл. Проводили вертикальный белковый гель-электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, в результате которого определили, что получен чистый препарат вирионов коронавируса собак. Из данного препарата с помощью 1/15 М фосфатно-солевого буферного раствора приготовили положительный контрольный образец с концентрацией вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак 8,0 мкг/мл. Таким образом, получили охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами использовали в дальнейшей работе.

Пример 2. Выражение функции зависимости концентрации вирионов коронавируса собак в сырье для изготовления культуральных вакцин и порогового цикла амплификации.

Для выражения функции зависимости концентрации вирионов коронавируса собак в сырье для изготовления культуральных вакцин и порогового цикла амплификации составляли контрольную панель положительных стандартов вирионов возбудителя коронавирусной инфекции собак, в качестве которых использовали очищенные препараты со следующими концентрациями аналита: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток линии CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяли нуклеиновую кислоту, как описано выше.

Проводили обратную транскрипцию для получения комплементарной ДНК (кДНК) коронавируса собак и ПЦР в режиме реального времени, как указано выше.

Результаты ПЦР анализировали, оценивали и сравнивали графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и графика вида Fl = f (C_t). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией вирионов коронавируса собак в сырье для культуральной вакцины в процессе построения графика квадратичной функции. Полученные данные отражены на фиг. 1 и выражены в виде линейной функции:

C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9998), что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [18].

Пример 3. Тестирование способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Для тестирования использовали 6 суспензий культурального коронавируса собак со следующими концентрациями вирионов: 0,32; 1,12; 1,99; 2,85; 3,15; 4,50 мкг/мл, соответственно (пробы № 1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию вирионов коронавируса собак с концентрацией аналита 8,00 мкг/мл. Отрицательным контролем служила суспензия клеток линии CRFK, не контаминированная микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Все этапы исследования проводили, как представлено выше.

По результатам исследования определили, что средние значения пороговых циклов амплификации для проб № 1-6 составляли 30,31±0,01, 27,68±0,01, 24,68±0,02, 21,92±0,01, 20,82±0,01, 16,46±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной выше формулой, рассчитали средние значения концентрации вирионов для проб № 1-6, которые составили 0,32; 1,11; 2,01; 2,84; 3,17; 4,48 мкг/мл, соответственно (различия не существенны, p<0,005). Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 4,74±0,01, что соответствовало концентрации вирионов коронавируса собак, равной 8,0 мкг/мл. Для отрицательного контроля сигмоида не была сформирована, что означало отсутствие возбудителя коронавирусной инфекции в данном контроле.

Таким образом, разработанный способ позволяет определять концентрацию вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Пример 4. Определение степени достоверности способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Для подтверждения степени достоверности использовали 300 суспензий культурального коронавируса с концентрациями вирионов 0,01-8,00 мкг/мл. Анализ проводили, как описано выше, в трех повторностях.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной линейной функцией, представленной выше, с получением значений концентрации вирионов CCoV для каждой из 300 проб. Для положительного контроля значение C_t составило 4,74±0,01, что соответствовало концентрации вирионов коронавируса собак, равному 8,00 мкг/мл. Для отрицательных контролей сигмоида не была сформирована, что означало отсутствие в нем возбудителя коронавирусной инфекции.

Данные, полученные с помощью разработанного способа (табл. 5), коррелировали со значениями стандартов на 99,42-100,00% для 8,0-5,0 мкг/мл (n=60), на 99,13-100,00% для 4,9-2,0 мкг/мл (n=60), на 98,78-99,89% для 1,9-0,3 мкг/мл (n=60), на 97,65-99,70% для 0,29-0,01 мкг/мл (n=60), на 93,65-97,64% для концентрации менее 0,01 мкг/мл (n=60).

Аналитическая чувствительность составила 0,01 мкг/мл с достоверностью определения концентрации вирионов 97,65%. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Пример 5. Определение специфичности разработанного способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Для оценки специфичности разработанного способа определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных, исследовали суспензии вируса ящура серотипа SAT-3, а также возбудителей парвовирусного бешенства, энтерита собак и аденовируса 1 серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составляло не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 5,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,01 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю коронавирусного заболевания у собак и может быть использован для определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин.

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа опосредованного определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных.

Анализировали 354 культуральных суспензий коронавируса собак с разными значениями концентрации вирионов коронавируса собак (0,01-8,00 мкг/мл). Данные пробы являлись заведомо положительными. Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 354 исследуемых образцов в 351 пробе концентрация определена верно, в 3 - отличия были существенными.

Для исследования специфичности метода тестировали 200 отрицательных суспензий клеток линии CRFK, не содержащих коронавирус собак. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 200 проб были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,56-99,83%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,0%, k-критерий - 0,995; общая точность (DAc) - 98,06-99,76%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является сокращение времени проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации вирионов коронавируса собак до 3 часов (в 16 раз быстрее по сравнению с прототипом); повышение аналитической, диагностической чувствительности и специфичности анализа; исключение фактора субъективности получаемых результатов за счет использования приборного обеспечения для детекции результатов; повышение достоверности проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией вирионов коронавируса собак (C_CCoV) и пороговым циклом амплификации участка M-гена (C_t), представленной в виде линейной функции:

C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9998).

Предложенная модель позволяет определять концентрацию вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье при изготовлении культуральных вакцин.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных»:

1. Naylor M.J, Harrison G.A, Monckton R.P, McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39. - P. 1036-1041.

2. Bandai C., Ishiguro S., Masuya N., Hohdatsu T., Mochizuki M. Canine coronavirus infections in Japan: virological and epidemiological aspects // J. Vet. Med. Sci. - 1999. - V. 61. - P. 731-736.

3. Enjuanes, L., Brian, D., Cavanagh, D., Holmes, K., Lai, M.M.C., Laude, H., Masters, P., Rottier, P., Siddell, S., Spaan, W.J.M., Taguchi, F., Talbot, P. Coronaviridae. In: van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R., Wickner, R.B. (Eds.), Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses. - Academic Press, New York. - 2000. - P. 835-849.

4. Keenan K.P., Jervis H.R., Marchwicki R.H., Binn L.N. Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1-71: studies by virologic, histologic, histochemical and immunofluorescent techniques // Am. J. Vet. Res. - 1976. - V. 37. - P. 247-256.

5. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia C. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P.209-213.

6. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и собак: Руководство для практикующих ветеринарных врачей под редакцией Т.И. Алипера. Москва, 2017; 207-212.

7. Naylor M.J., Harrison G.A., Monckton R.P., McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39. - P. 1036-1041.

8. Timurkan MO, Aydin H, Dincer E, Coskun N. Molecular characterization of canine coronaviruses: an enteric and pantropic approach. Arch Virol. 2021 Jan;166(1):35-42. doi: 10.1007/s00705-020-04826-w. Epub 2020 Oct 1.

9. Pratelli A., Buonavoglia D., Martella V., Tempesta M., Lavazza A., Buonavoglia C. Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-PCR // J. Virol. Methods - 2000. - V. 84. - P. 91-94.

10. Pratelli A., Martella V., Elia G., Decaro N., Aliberti A., Buonavoglia D., Tempesta M., Buonavoglia C. Variation of the sequence in the gene encoding for transmembrane protein M of canine coronavirus (CCoV) // Mol. Cell. Probes. - 2001. - V. 15. - P. 229-233.

11. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia C. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P. 209-213.

12. Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.

13. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.

14. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.

15. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 25.04.2020).

16. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.

17. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4. - P. 1460-1465.

18. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories:Infectious Diseases. - 2nd ed. - Paris, France, 2008. - 67 p.

Таблица 1

Состав смеси компонентов для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для разработки способа определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин (предлагаемое изобретение)

Наименование компонента смеси Концентрация компонента CCoV-C-F-праймер 6 пМ CCoV-C-R-праймер 6 пМ CCoV-C-P-зонд 6 пМ Дезоксирибоаденозинтрифосфат
(dATP, 25 мМ) по 0,25 мМ каждого Дезоксирибогуанозинтрифосфат
(dGTP, 25 мМ) Дезоксирибоцитидинтрифосфат
(dCTP, 25 мМ) Дезоксириботимидинтрифосфат
(dTTP, 25 мМ) Хлорид магния (25 мМ) 3,0 мМ AMV-ревертаза 2 е.а. Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) 20% от объема
реакционной смеси Tag-ДНК-зависимая ДНК-полимераза 3 ед. Деионизированная вода, свободная от нуклеаз до 25 мкл от общего объема смеси

Примечание: объем вносимого элюата РНК - 5 мкл,

объем реакционной смеси - 25 мкл.

Таблица 2

Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для разработки способа определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидных праймеров Дизайн олигонуклеотидов (5'…3') CCoV-С-F CCAGATATGTAATGTTCGGCTT CCoV-С-R ATCTGTTGAGTAATCACCAGC CCoV-С-P ROX-GGTGGTCTTTCAACCCTGAA-BHQ-2

Таблица 3

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидов для определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин (предлагаемое изобретение)

Параметры Характеристики олигонуклеотидов CCoV-С-F CCoV-С-R CCoV-С-P Длина (L), н.о. 22 21 20 Молекулярный вес (Mw) 6740,5 6405,2 6108 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 172,3 162,4 168 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 26,5 24,8 25,3 Дифференциал энтальпии (dS), кал/°К⋅моль 454,1 427,6 444 Температура плавления (Tm), °С:
- с коррекцией концентрации солей 58 57 58

Примечание: термодинамические параметры оригинальных олигонуклеотидов рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,

температура 25°С,

водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 4

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и реакции амплификации для определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин

(предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Количество циклов Обратная транскрипция - 50 20 мин 1 Предварительный прогрев - 98 5 мин 1 ПЦР в режиме реального времени Денатурация 98 5 с 40 Отжиг праймеров и зонда 55 20 с Элонгация* 72 30 с

Примечание: * - на данном подэтапе регистрируют степень флуоресцентного сигнала.

Таблица 5

Достоверность определения концентрации вирионов возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин (предлагаемое изобретение)

(n=3 для каждой пробы)

Значения концентрации вирионов коронавируса собак (стандарты), мкг/мл Достоверность (%) определения аналита с помощью разработанного способа 8,0-5,0 99,42-100,00 4,9-2,0 99,13-100,00 1,9-0,3 98,78-99,89 0,29-0,01 97,65-99,70 <0,01 93,65-97,64

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="C-CCoV.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-08-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-08-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>580</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-08-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя

коронавирусной инфекции животных</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagatatgtaatgttcggctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atctgttgagtaatcaccagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtggtctttcaaccctgaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных. Способ включает проведение амплификации фрагмента M-гена кДНК возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением олигонуклеотидных праймеров: прямой праймер SEQ ID NO:1, молекулярный зонд SEQ ID NO:2 и обратный праймер SEQ ID NO:3, и определение значений порогового цикла амплификации с применением линейной функции: C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242. Способ позволяет сократить сокращение время проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации вирионов коронавируса собак до 3 часов, повысить аналитическую, диагностическую чувствительность и специфичность анализа; повысить достоверность проводимого анализа. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Способ определения концентрации вирионов производственных штаммов возбудителя коронавирусной инфекции животных, включающий проведение амплификации фрагмента M-гена кДНК возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением олигонуклеотидных праймеров: прямой праймер SEQ ID NO:1, молекулярный зонд SEQ ID NO:2 и обратный праймер SEQ ID NO:3, и определение значений порогового цикла амплификации с применением линейной функции: C_CCoV = - 0,3004 × C_t + 9,4242, с достоверностью аппроксимации 0,9998.

2. Способ по п. 1, где аналитическая чувствительность составляет не менее 0,01 мкг/мл, диагностическая чувствительность – 97,56-99,83%, диагностическая специфичность – 98,17-100,00%.

3. Способ по п. 1, где сокращается время проведения анализа в 16 раз.