МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ FV-АНТИТЕЛА Российский патент 2022 года по МПК C07K16/46 C07K16/28 

Настоящее изобретение относится к мультивалентной и мультиспецифичной производной Fv-антитела, в частности к молекуле Fv-антитела, содержащей единицу диатела.

Биспецифичные антитела применяют для взаимодействия с двумя различными терапевтическими мишенями или выполнения двух различных функций. Такие антитела можно применять, например, для рекрутинга иммунных эффекторных клеток, например, Т- или NK-клеток к конкретной клетке-мишени. Известны и исследуются различные молекулы на основе фрагментов антител, например, при лечении рака.

Биспецифичные антитела можно конструировать с использованием только вариабельных доменов антител. Например, линкерную последовательность между V_H- и V_L-доменами можно укоротить до такой степени, чтобы они не могли укладываться друг на друга и попарно ассоциировать, вступая во внутримолекулярное взаимодействие. Такие короткие линкеры, например, из 2-12 остатков, предотвращают указанное образование мономерной молекулы одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и благоприятствуют межмолекулярному сопряжению V_H/V_L между комплементарными вариабельными доменами различных полипептидных цепей с образованием димерного "диатела" (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448). Такое диатело можно использовать для конструирования биспецифичных антител, получаемых за счет нековалентной ассоциации двух одноцепочечных полипептидных гибридных продуктов, каждый из которых состоит из V_H-домена одного антитела, соединенного коротким линкером с V_L-доменом другого антитела (или наоборот).

В WO 03/025018 описана биспецифичная антигенсвязывающая молекула, структура которой образована идентичными одноцепочечными полипептидами с четырьмя связывающими доменами. V_H- и V_L-домен в концевой части каждой полипептидной цепи связаны коротким линкером и межмолекулярно ассоциированы с соответствующими V_H- и V_L-доменами другой полипептидной цепи, а другие V_H- и V_L-домены каждой полипептидной цепи внутримолекулярно связаны друг с другом в пределах той же цепи с образованием антигенсвязывающей scFv-единицы. Такие конструкты являются гомодимерами, т.е. состоят из идентичных одноцепочечных полипептидов, которые попарно ассоциируют друг с другом.

Кроме того, желательны триспецифичные антитела, мишенью которых являются два опухолевых антигена, что обеспечивает повышенную селективность по отношению к раковым клеткам, сохранение здоровой ткани и приводит к расширению диапазона доз и терапевтической применимости, при которых указанное лекарственное вещество может эффективно уничтожать раковые клетки. Например, одно триспецифичное антитело можно применять для нацеленного воздействия на два различных опухолевых антигена, причем третья специфичность активирует цитотоксическое действие Т-клеток или NK-клеток.

В WO 2009/007124 описан триспецифичный гибрид одноцепочечного Fv (scFv), названный «тройным телом» и содержащий три scFv-фрагмента, расположенные в виде тандема, имеющие три различных специфичности (CD123 и CD33 (опухолевые маркеры) и одну к CD16 на NK-клетках). Эту молекула дополнительно стабилизирована дисульфидными связями в центральном scFv. Такие молекулы обеспечивают двойное нацеливание дважды положительные опухолевые клетки и одновалентное связывание с CD16 на NK-клетках.

Настоящее изобретение относится к мультивалентному Fv-антителу, содержащему единицу диатела, состоящую из двух пар вариабельных доменов, ассоциированных с двумя антигенсвязывающими сайтами. Термин «антигенсвязывающий сайт» обозначает антигенсвязывающий сайт Fv-фрагмента, состоящего из пары доменов VH/VL, т.е. антигенсвязывающий сайт VH/VL, или однодоменный антигенсвязывающий сайт. Каждая пара вариабельных доменов связана один за другим друг за другом в полипептиде. Единица диатела состоит из одного полипептида (единица одноцепочечного диатела) или двух полипептидов (единица диатела). По меньшей мере одна пара вариабельных доменов соединена в полипептиде с еще одним вариабельным доменом, находящимся со стороны N-конца от этой пары вариабельных доменов, и с еще одним вариабельным доменом - со стороны С-конца. Соответственно, такой полипептид содержит по меньшей мере четыре вариабельных домена, соединенных друг за другом, причем два расположенных рядом друг с другом вариабельных домена, соединенных друг за другом, представляют собой одну пару вариабельных доменов единицы диатела, а еще один вариабельный домен расположен со стороны N-конца от этой пары вариабельных доменов единицы диатела, и другие дополнительные вариабельные домены расположены со стороны С-конца от этой пары вариабельных доменов единицы диатела. Вариабельный домен, соединенный с N-концом этой пары вариабельных доменов единицы диатела, может представлять собой вариабельный домен легкой цепи (V_L) или вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), также, как и домен, соединенный с С-концом этой пары вариабельных доменов единицы диатела, может представлять собой вариабельный домен легкой цепи (V_L) или вариабельный домен тяжелой цепи (V_H). Такой полипептид представляет собой Fv-полипептид, содержащий по меньшей мере четыре соединенных друг за другом вариабельных домена, т.е. вариабельный домен, соединенный к N-концом пары вариабельных доменов единицы диатела, присоединенной по С-концу к еще одному вариабельному домену. В конкретных вариантах реализации шесть, восемь или десять вариабельных доменов соединены друг за другом в составе такого Fv-полипептида.

Мультивалентное Fv-антитело является по меньшей мере четырехвалентным и содержит по меньшей мере четыре антигенсвязывающих сайта. Соответственно, Fv-полипептид Fv-антитела, содержащего по меньшей мере четыре вариабельных домена, где два из по меньшей мере четырех вариабельных доменов представляют собой пару из двух расположенных рядом друг с другом вариабельных доменов единицы диатела, ассоциирующих с другой парой вариабельных доменов единицы диатела с образованием двух (первого и второго) антигенсвязывающих сайтов, содержит по меньшей мере дополнительный (третий) вариабельный домен по N-концу Fv-полипептида, ассоциирующий с соответствующим вариабельным доменом с образованием дополнительного (третьего) антигенсвязывающего сайта, и по меньшей мере дополнительный (четвертый) вариабельный домен по С-концу Fv-полипептида, ассоциирующий с соответствующим вариабельным доменом с образованием дополнительного (четвертого) антигенсвязывающего сайта. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере четыре антигенсвязывающих сайта мультивалентного Fv-антитела образованы двумя Fv-полипептидами, а в других вариантах реализации эти по меньшей мере четыре антигенсвязывающих сайта образованы в результате внутримолекулярного фолдинга одиночного Fv-полипептида.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации каждый из других вариабельных доменов, связанных по N-концу и С-концу с парой вариабельных доменов единицы диатела в одном и том же полипептиде, является частью дополнительного антигенсвязывающего сайта. Соответственно, одна пара вариабельных доменов единицы диатела (первая пара) ассоциирована с другой парой вариабельных доменов единицы диатела (второй парой) с образованием двух антигенсвязывающих сайтов (первого и второго антигенсвязывающих сайтов), а дополнительный вариабельный домен, расположенный с N-конца, ассоциирует с соответствующим вариабельным доменом с образованием третьего антигенсвязывающего сайта, и дополнительный вариабельный домен, расположенный с С-конца, ассоциирует с соответствующим вариабельным доменом с образованием четвертого антигенсвязывающего сайта. Таким образом, такое мультивалентное Fv-антитело является по меньшей мере четырехвалентным. В некоторых вариантах реализации этот антигенсвязывающий сайт содержит дополнительный вариабельный домен, связанный по N-концу и/или С-концу с парой вариабельных доменов единицы диатела в scFv-единице или единице одноцепочечного диатела. В других вариантах реализации дополнительные вариабельные домены, соединенные по N-концу и С-концу с парой вариабельных доменов единицы диатела в составе одного и того же полипептида (первого полипептида), ассоциированы с соответствующими V_H- или V_L-доменами еще одного полипептида (второго полипептида), содержащего вторую (другую) пару вариабельных доменов единицы диатела, тем самым образуя еще два (третий и четвертый) V_H/V_L антигенсвязывающих сайта между вариабельными доменами двух (первого и второго) полипептидов.

В некоторых вариантах реализации две пары вариабельных доменов единицы диатела представляют собой пару вариабельных доменов легкой цепи (V_L-V_L), соединенных друг за другом в полипептиде, и пару вариабельных доменов тяжелой цепи (V_H-V_H), соединенных друг за другом в полипептиде, причем пара V_L-V_L и пара V_H-V_H ассоциируют в два (первый и второй) V_L/V_H-антигенсвязывающих сайта.

В некоторых вариантах реализации молекула мультивалентного антитела содержит единицу диатела, т.е. пару вариабельных доменов единицы диатела, встроенные в полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере шесть, например, шесть, восемь или десять вариабельных доменов, соединенных друг за другом

Единица диатела состоит из пары двух вариабельных доменов, соединенных друг за другом так, что эти домены не могут образовывать внутримолекулярную структуру функциональной Fv-единицы, т.е. V_H/V_L-антигенсвязывающий сайт, а вместо этого ассоциируют с еще одной парой двух вариабельных доменов, соединенных друг за другом, с образованием двухвалентного димера, т.е. диатела, обеспечивая два антигенсвязывающих сайта. Соединение пары вариабельных доменов легкой цепи (V_L-V_L) друг за другом и пары вариабельных доменов тяжелой цепи (V_H-V_H) друг за другом предотвращает внутримолекулярное спаривание доменов в пределах каждой пары за счет доменов одного типа, т.е. V_H-V_H или V_L-V_L. Жесткая и компактная структура единицы диатела облегчает получение, правильный фолдинг (сворачивание) мультивалентного антитела, и повышает стабильность антитела. Такая единица диатела образует два V_H/V_L-антигенсвязывающих сайта в пределах молекулы антитела за счет двух ковалентно связанных V_H- и V_L-доменов, что выгодно для стабильности молекулы антитела, поскольку приводит к образованию более компактной молекулы. В некоторых вариантах реализации пара из двух вариабельных доменов соединена коротким линкером.

В некоторых случаях два одноцепочечных Fv-фрагмента (scFv-фрагмента) дистально соединены с единицей диатела, образуя два дополнительных V_H/V_L-антигенсвязывающих сайта (фиг. 1 и 2). Таким образом, такая молекула мультивалентного антитела является по меньшей мере четырехвалентной, поскольку содержит по меньшей мере четыре антигенсвязывающих сайта - два за счет единицы диатела и два за счет двух scFv-единиц. Каждый из дистально расположенных scFv-фрагментов можно расположить в полипептиде в порядке V_H-V_L или V_L-V_H.

Такие четырехвалентные молекулы антител выгодны для образования четырехвалентных, пятивалентных или шестивалентных триспецифичных антител. Эти новые триспецифичные антитела можно применять, например, для рекрутинга эффекторных клеток иммунной системы для уничтожения клеток-мишеней, например, опухолевых клеток или клеток, инфицированных вирусом. Поскольку такие триспецифичные антитела согласно настоящему изобретению являются по меньшей мере четырехвалентными, они обладают усиленной функциональной активностью по сравнению с трехвалентными и триспецифичными одноцепочечными фрагментами. Триспецифичные и четырехвалентные антитела согласно настоящему изобретению двухвалентно связываются посредством двух из четырех связывающих сайтов как с клеткой-мишенью, так и с эффекторными клетками иммунной системы. Например, двухвалентное связывание с клеткой-мишенью повышает не только авидность, но и специфичность адресного воздействия, если две из трех антигенных специфичностей направлены на два различных антигена, например, два различных опухолевых антигена на поверхности клетки-мишени. С другой стороны, можно модулировать, в частности, увеличивать цитотоксическую эффективность рекрутированной эффекторной клетки иммунной системы при двухвалентном связывании антитела с эффекторной клеткой иммунной системы. В других случаях такое триспецифичное антитело может иметь две специфичности к двум различным антигенам на эффекторных клетках, и третью специфичность для антигену на опухолевой клетке, нейроне или клетке, инфицированной вирусом, или связываться с и в конечном итоге нейтрализовать растворимый белок, например, фактор роста, цитокины или другие лиганды, не связанные с клетками.

В некоторых случаях вариабельные домены единицы диатела, соединенные коротким линкером, предотвращающим внутримолекулярное спаривание, представляют собой вариабельные домены легкой цепи (V_L-V_L) или вариабельные домены тяжелой цепи (V_H-V_H) (фиг. 1 и 2). Обнаружено, что данное конкретное расположение доменов облегчает правильный фолдинг молекул мультиспецифичных и мультивалентных антител согласно настоящему изобретению. В частности, для молекул четырехвалентных триспецифичных или тетраспецифичных Fv-антител можно принять эти меры для правильной ассоциации молекулы Fv-антитела, содержащей вариабельные домены для трех или более различных специфичностей, и для предотвращения неправильной ассоциации в пределах одиночного полипептида (мономера) или гомодимеризации между двумя идентичными Fv-полипептидами вместо правильной гетеродимеризации первого и второго полипептида (пример 2). Авторы настоящего изобретения получили правильную ассоциацию между вариабельными доменами для получения трех специфичностей и двух различных полипептидов, содержащих вариабельные домены, путем объединения в молекулу триспецифичного антитела, например, единицы диатела, образованной первой парой двух вариабельных доменов тяжелой цепи, связанных коротким линкером, ассоциированной со второй парой двух соответствующих вариабельных доменов легкой цепи, связанных коротким линкером. Таким образом, такая аранжировка вариабельных доменов в единице диатела, т.е. V_L-V_L в первом полипептиде вариабельных доменов и V_H-V_H во втором полипептиде вариабельных доменов, обеспечивает правильную ассоциацию и фолдинг четырехвалентного и триспецифичного или тетраспецифичного Fv-антитела. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что такое расположение V_L-V_L/ V_H-V_H в составе единицы диатела или единицы одноцепочечного диатела стимулирует правильный фолдинг длинного полипептида, содержащего более шести вариабельных доменов, соединенных друг за другом с образованием молекулы Fv-антитела (например, фиг. 1), или правильный фолдинг и гетеродимеризацию двух полипептидов различной длины с образованием функциональной молекулы димерного Fv-антитела (например, фиг. 2, 5, 6а, 6b).

В дополнительных вариантах реализации по меньшей мере одна единица одноцепочечного диатела (scDb) дистально соединена с единицей диатела, образуя по меньшей мере один дополнительный антигенсвязывающий сайт. Таким образом, по меньшей мере один полипептид единицы диатела содержит одну пару вариабельных доменов единицы диатела, связанную с по меньшей мере одним scDb в полипептиде. Например, две scDb-единицы дистально соединены с единицей диатела, содержащей дополнительные два антигенсвязывающих сайта на каждую единицу одноцепочечного диатела (фиг. 4 и 5). Таким образом, такая мультивалентная молекула антитела является по меньшей мере четырехвалентной, поскольку она содержит по меньшей мере четыре антигенсвязывающих сайта. Такое мультивалентное антитело является по меньшей мере шестивалентным в вариантах реализации, где по меньшей мере две scDb-единицы соединены с единицей диатела, поскольку две дистально ориентированные scDb-единицы содержат четыре антигенсвязывающих сайта, а два антигенсвязывающих сайта находятся в единице диатела. Вариабельные домены в каждой из дистальных scDb-единиц можно расположить в порядке V_H-V_L-V_H-V_L, V_L-V_H-V_L-V_H, V_L-V_L-V_H-V_H или V_H-V_H-V_L-V_L в полипептиде.

В некоторых вариантах реализации единица диатела состоит из двух пар вариабельных доменов, расположенных на двух полипептидах, ассоциирующих друг с другом с образованием двух антигенсвязывающих сайтов, причем каждый из этих двух полипептидов содержит по меньшей мере один другой одноцепочечный фрагмент и/или фрагмент одноцепочечного диатела, расположенный дистально по отношению к каждой из двух пар вариабельных доменов единицы диатела. (Фиг. 6А, 6b, 7, 8а и 8b). Таким образом, такая молекула мультивалентного антитела является по меньшей мере семивалентной, поскольку она содержит по меньшей мере пять антигенсвязывающих сайтов - два связывающих сайта в единице диатела, по меньшей мере два связывающих сайта в двух scFv-единицах или scDb-единицах со стороны N-конца и С-конца от первой пары вариабельных доменов единицы диатела и по меньшей мере один связывающий сайт со стороны N-конца и С-конца от другой пары вариабельных доменов единицы диатела другого полипептида единицы диатела.

В некоторых случаях настоящее изобретение относится к молекуле мультивалентного антитела, содержащей полипептид, содержащий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом, причем единица диатела, содержащая первые два вариабельных домена из указанных по меньшей мере шести вариабельных доменов, встроена в указанный полипептид, и указанные первые два вариабельных домена единицы диатела ассоциированы с другими двумя вариабельными доменами единицы диатела, т.е. вторыми двумя вариабельными доменами, с образованием двух антигенсвязывающих сайтов. Указанные вторые два вариабельных домена могут быть расположены в том же полипептиде, что и первые два вариабельных домена, или в отдельном втором полипептиде, ассоциированном с первым полипептидом. Два антигенсвязывающих сайта, содержащиеся в единице диатела, образованы между первым и вторым вариабельными доменами, причем каждый вариабельный домен первой пары вариабельных доменов образует антигенсвязывающий сайт с другим вариабельным доменом второй пары вариабельных доменов. Соответственно, единица диатела образована указанным первым и вторым двумя вариабельными доменами, причем эти два вариабельных домена соединены коротким пептидным линкером в первом, а также втором двух вариабельных доменах для предотвращения внутримолекулярного спаривания.

Так, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к молекуле мультивалентного антитела, содержащей полипептид, содержащий, т.е. включающий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом, причем два вариабельных домена данного полипептида связаны пептидным линкером, предотвращающим внутримолекулярное спаривание, и указанные два вариабельных домена ассоциированы с другими двумя соответствующими вариабельными доменами, связанными пептидным линкером, предотвращающим внутримолекулярное спаривание, причем указанные четыре вариабельных домена образуют два антигенсвязывающих сайта между указанными четырьмя вариабельными доменами. Например, такое антитело представляет собой Fv-антитело, в частности, четырехвалентное и триспецифичное Fv-антитело.

Эта молекула антитела является мультивалентной, т.е. содержит более одного антигенсвязывающего сайта. Она является четырехвалентной, если содержит четыре антигенсвязывающих сайта; пятивалентной, если содержит пять антигенсвязывающих сайтов, и шестивалентной, если содержит шесть антигенсвязывающих сайтов. Термин «четырехвалентное» относится к молекуле антитела, содержащей, в частности, состоящей из четырех антигенсвязывающих Fv-сайтов, где каждый из антигенсвязывающих Fv-сайтов содержит пару V_H/V_L, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) одной и той же антигенной специфичности, ассоциированные друг с другом. Таким образом, такая четырехвалентная молекула антитела содержит по меньшей мере восемь вариабельных доменов антитела, а именно четыре вариабельных домена тяжелой цепи (V_H) и четыре вариабельных домена легкой цепи (V_L). Поскольку четырехвалентная антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере восемь вариабельных доменов антитела, ее молекулярная масса составляет более 100 Да, что приводит к увеличению периода полужизни такой молекулы по сравнению с трехвалентными и триспецифичными одноцепочечными Fv-молекулами.

В некоторых случаях молекула антитела является мультиспецифичной, т.е. обладает специфичностью в отношении различных эпитопов антигенов. В некоторых случаях молекула антитела является триспецифичной.

Триспецифичная и четырехвалентная молекула антитела содержит антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью по отношению к первому эпитопу антигена, антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью по отношению ко второму эпитопу антигена, и два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью по отношению к третьему эпитопу антигена. Таким образом, такая триспецифичная и четырехвалентная молекула антитела имеет, т.е. включает различные специфичности в отношении трех различных эпитопов антигенов. Например, такая антигенсвязывающая молекула содержит первый антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к первому эпитопу антигена, второй антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью ко второму эпитопу антигена, третий и четвертый антигенсвязывающие сайты, обладающие специфичностью к третьему эпитопу антигена. Пятивалентная и триспецифичная молекула антитела содержит два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью к первому эпитопу антигена, два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью ко второму эпитопу антигена, и один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к третьему эпитопу антигена. В качестве альтернативы, пятивалентная и триспецифичная молекула антитела может содержать три антигенсвязывающих сайта против первого эпитопа антигена и по одному антигенсвязывающему сайту для второго и третьего эпитопов антигенов. Шестивалентная и триспецифичная молекула антитела в некоторых вариантах реализации содержит по два антигенсвязывающих сайта для каждого из трех эпитопов антигенов, или, в качестве альтернативы, от одного до трех антигенсвязывающих сайтов для каждого из трех эпитопов антигенов.

В некоторых случаях молекула антитела является молекулой Fv-антитела. "Fv-антитело" относится к Fv-производному иммуноглобулина, содержащему только вариабельные (V) домены антитела, но не содержащему константных областей антитела или их фрагментов. Каждый вариабельный домен легкой цепи (V_L) ассоциирован с соответствующим вариабельным доменом тяжелой цепи (V_H), образуя антигенсвязывающий Fv-сайт (VH/V_L-антигенсвязывающий сайт). Вариабельные домены антитела соединены друг за другом в гибридном полипептиде посредством пептидного линкера или пептидной связи. Fv-антитело, т.е. антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению может являться мономером одиночного полипептида или мультимерным полипептидом. Мультимерная антигенсвязывающая молекула, т.е. Fv-антитело, в частности, мультивалентное Fv-антитело, может представлять собой, например, димер, содержащий два полипептида, тример, содержащий три полипептида, или тетрамер, содержащий четыре полипептида. Димер является гетеродимерным, если он состоит из двух полипептидов различного аминокислотного состава, или гомодимерным, если он состоит из двух идентичных полипептидов.

Термин "полипептид" относится к полимеру из аминокислотных остатков, соединенных амидными связями. Предпочтительно полипептид является одноцепочечным гибридным неразветвленным белком. Вариабельные (Fv) домены антитела в полипептиде соединены друг за другом. Термин «Fv-полипептид» обозначает гибридный полипептид, в котором вариабельные (Fv) домены антитела соединены друг за другом. Полипептид может содержать смежные аминокислотные остатки в дополнение к N-концу и/или С-концу. Например, полипептид может содержать маркерную последовательность, предпочтительно на С-конце, которую можно использовать при очистке, а также обнаружении полипептида. Примером маркерной последовательности являются маркер His, например, маркер His, состоящий из шести остатков His, маркер FLAG, например, октапептид DYKDDDDK (SEQ ID NO:38), или маркер STREP® II, например, октапептид WSHPQFEK (SEQ ID NO:39), или С-маркер, например, тетрапептид EPEA (SEQ ID NO:40). В мультимерных антигенсвязывающих молекулах для различных полипептидов можно использовать различные маркерные последовательности, например, His-маркер для первого полипептида и FLAG-маркер для второго полипептида димерной молекулы. В некоторых вариантах реализации полипептид может содержать вариабельные домены, обеспечивающие получение антигенсвязывающих сайтов, а также константные домены антитела, например, C_L, C_H и/или Fc-домены. Например, такие варианты реализации могут включать Fv-полипептид или Fv-антитело, объединенное с по меньшей мере одним константным доменом антитела, например, Fc-доменом. В дополнительных вариантах реализации полипептид, содержащий вариабельные домены, можно соединить с другим агентом, например, токсином, иммуномодулятором или агентом, генерирующим сигнал.

Термин «линкер» относится к пептиду, соединяющему два расположенных рядом вариабельных домена в полипептиде между С-концом одного домена и N-концом другого расположенного рядом домена или наоборот. С точки зрения аминокислотного состава выбирают пептид, не мешающий образованию Fv-, т.е. VH/VL-антигенсвязывающих сайтов, а также не мешающий мультимеризации, например, димеризации мультиспецифичных, например, триспецифичных молекул. Например, линкер, содержащий остатки глицина и серина, обычно обеспечивает устойчивость к протеазам. В некоторых вариантах реализации используют пептидные линкеры (G₂S)x, в которых, например, х=1-20, например, используют пептидные линкеры (G₂S), (G₂S)₂, (G₂S)₃, (G₂S)₄, (G₂S)₅, (G₂S)₆, (G₂S)₇ или (G₂S)₈ или (G₃S)x, в которых, например, х=1-15, или используют пептидные линкеры (G₄S)x, в которых, например, х=1-10, предпочтительно 1-6. Аминокислотную последовательность линкера можно оптимизировать с целью улучшения связывания антигена и выхода продукции полипептида, например, с помощью способов фагового дисплея.

Длина линкеров влияет на гибкость антигенсвязывающего полипептидного димера. Желательная гибкость антигенсвязывающего полипептидного димера зависит от плотности антигена-мишени и доступности антигена-мишени, т.е. эпитопов антигена-мишени. Более длинные линкеры позволяют получать более гибкие антигенсвязывающие полипептиды с более гибкими антигенсвязывающими сайтами. Влияние длины линкеров на образование димерных антигенсвязывающих полипептидов описан, например, в Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods 248:47-66; Perisic et al., 1994 Structure 2:1217-1226; Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366 и WO 94/13804.

Единицу диатела встраивают в полипептид молекулы антитела. Термин "единица диатела" обозначает двухвалентную Fv-молекулу, состоящую из двух пар вариабельных доменов - первой пары и второй пары, которые ассоциируют с образованием двух VL/VH-антигенсвязывающих сайтов. Каждая пара вариабельных доменов соединена друг за другом в полипептиде. В некоторых вариантах реализации двухвалентный Fv-модуль состоит из первой и второй пар двух вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, причем в каждой паре два вариабельных домена соединены коротким пептидным линкером, предотвращающим внутримолекулярную ассоциацию между вариабельными доменами, соединенными коротким линкером. Первая пара вариабельных доменов вынужденно ассоциировать со второй парой вариабельных доменов, образуя два антигенсвязывающих Fv-сайта с двумя парами вариабельных доменов. Соответственно, каждый из двух антигенсвязывающих Fv-сайтов образован одним вариабельным доменом первой пары вариабельных доменов и одним вариабельным доменом второй пары вариабельных доменов. Таким образом, такая единица диатела содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт из двух вариабельных доменов, непрямым образом соединенных коротким пептидным линкером 3, 3а (фиг. 1 и 2). Две пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, располагаются на двух отдельных полипептидах с образованием димерной единицы диатела (фиг. (2, 3, 5, 8), или две пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, располагаются на одном и том же полипептиде с образованием единицы одноцепочечного диатела (фиг.1, 4). В каждой паре вариабельных доменов короткий линкер 3, 3а соединяет С-конец одного вариабельного домена и N-концом другого вариабельного домена или наоборот. В каждой паре вариабельные домены могут быть ориентированы от N- к С-концу, например, V_L-V_H, V_H-V_L, V_H-V_H или V_L-V_L, причем два вариабельных домена пары имеют специфичности против различных эпитопов антигенов или специфичности против одного и того же эпитопа антигена. В некоторых случаях два вариабельных домена непосредственно связаны пептидной связью между N-концом одного вариабельного домена и С-концом другого вариабельного домена пары. Длина короткого пептидного линкера, соединяющего два вариабельных домена в каждой из первой и второй пары вариабельных доменов единицы диатела, является такой, которая позволяет предотвратить внутримолекулярную ассоциацию между вариабельными доменами, соединенными линкером. Такой линкер является «коротким», т.е. состоит из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или приблизительно 12 аминокислотных остатков. В случае 0 аминокислотных остатков линкер представляет собой пептидную связь. Такой короткий линкер благоприятствует правильной димеризации между двумя парами вариабельных доменов и образованию двух антигенсвязывающих Fv-сайтов. Укорачивание линкера до приблизительно 12 или менее аминокислотных остатков обычно предотвращает взаимодействие смежных областей одной и той же полипептидной цепи друг с другом. В одном варианте реализации настоящего изобретения эти линкеры состоят из от приблизительно 3 до приблизительно 12, например, от 5 до 10, в частности, от 7 до 9 смежных аминокислотных остатков. Длину линкера можно корректировать с целью получения конкретной ориентации доменов в единице диатела. Например, линкер (G₂S)₂ можно использовать для пары V_H-V_L или для пары V_L-V_H, а линкер (G₂S)₃ можно использовать для пары V_H-V_H или для пары V_L-V_L, или линкер (G₂S)₂ можно использовать для пары V_H-V_H и линкер (G₂S)₃ можно использовать для пары V_L-V_L единицы диатела (или наоборот). Между прочим, в принципе возможно, что два полипептида, содержащие линкер из более чем 12 аминокислотных остатков между вариабельными доменами антитела пары, правильно димеризуются друг с другом (см., например, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366).

В некоторых вариантах реализации единица диатела представляет собой единицу одноцепочечного диатела (фиг. 1). «Единица одноцепочечного диатела» состоит из первой пары вариабельных доменов, соединенной со второй парой вариабельных доменов длинным линкером, допускающим внутримолекулярную ассоциацию первой и второй пар вариабельных доменов, в соответствии с «длинным линкером», используемым в scFv-единицах и описанным в следующем абзаце. Например, такой длинный линкер может состоять из более чем 12, в частности, от приблизительно 15 до приблизительно 50, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 35, в частности, от приблизительно 15 до приблизительно 25 смежных (последовательных) аминокислотных остатков.

В некоторых вариантах реализации домены одноцепочечного диатела в полипептиде, соединенные друг за другом, можно расположить в порядке V_L-V_H-V_L-V_H, V_L-V_L-V_H-V_H, V_H-V_H-V_L-V_L или V_H-V_L-V_H-V_L от N-конца к С-концу единицы одноцепочечного диатела.

В некоторых вариантах реализации молекула антитела согласно настоящему изобретению состоит из одиночного полипептида, содержащего единицу одноцепочечного диатела (фиг. 1, 4). В конкретных вариантах реализации молекула антитела содержит по меньшей мере три единицы одноцепочечного диатела, соединенные друг за другом в полипептиде (фиг. 4). В других вариантах реализации молекула антитела согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну единицу одноцепочечного диатела, дистально соединенную с единицей диатела (фиг. 5).

«Единица одноцепочечного Fv (scFv)» обозначает антигенсвязывающий Fv-сайт, образованный фрагментом одноцепочечного полипептида, состоящим из вариабельного домена легкой цепи (V_L) и вариабельного домена тяжелой цепи (V_H). Вариабельные домены можно ориентировать в виде V_L-V_H или V_H-V_L от N-конца к С-концу единицы scFv. Вариабельные домены соединены пептидным линкером между С-концом одного вариабельного домена и N-концом другого вариабельного домена или наоборот. Пептидный линкер является длинным и гибким (в общем случае состоит из приблизительно 12 или более аминокислотных остатков) для внутримолекулярного фолдинга и образования антигенсвязывающего Fv-сайта. Дополнительные аминокислотные остатки обеспечивают дополнительную гибкость. Например, такой длинный линкер может состоять из более чем 12, в частности, от приблизительно 15 до приблизительно 50, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 35, в частности, от приблизительно 15 до приблизительно 25 смежных аминокислотных остатков. Длину линкера можно корректировать для конкретной ориентации доменов от N-конца к С-концу единицы scFv. Например, линкер (G₂S)₆ можно использовать для единицы scFv V_H-V_L, а линкер (G₂S)₇ можно использовать для единицы scFv V_L-V_H.

Единица scFv связана с единицей диатела пептидным линкером между вариабельным доменом единицы scFv и вариабельным доменом единицы диатела. Выбирают длину пептидного линкера, позволяющую избегать стерических помех между расположенными рядом друг с другом вариабельными доменами и поддерживать стабильность молекулы; эта длина может составлять, например, от 5 до 50, в частности, от 5 до 35, предпочтительно по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 смежных аминокислотных остатков.

В некоторых случаях единица диатела расположена в центре молекулы антитела для облегчения фолдинга и улучшения стабильности молекулы антитела. В таких случаях единица диатела соединена по N-концу и С-концу с дополнительным дистальным вариабельным доменом. В некоторых вариантах реализации единица диатела соединена с двумя (фиг. 1, 2, 8а, 8b), тремя (фиг. 6а, 6b) или четырьмя (фиг. 7) единицами scFv. В некоторых случаях молекула антитела, в частности, молекула триспецифичного Fv-антитела, содержит полипептид, содержащий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, причем указанный полипептид содержит единицу scFv на N-конце, единицу scFv на С-конце и первую пару двух вариабельных доменов единицы диатела между двумя единицами scFv (фиг. 1 и 2). Эта первая пара двух вариабельных доменов единицы диатела не ассоциирует с образованием антигенсвязывающего Fv-сайта. Например, если единица диатела является димерной единицей диатела, каждый из двух вариабельных доменов первой пары расположенных рядом друг с другом вариабельных доменов соединен с дополнительным вариабельным доменом. В частности, каждый из двух вариабельных доменов первой пары расположенных рядом друг с другом вариабельных доменов соединен с дополнительным вариабельным доменом единицы scFv (фиг. 2). В других случаях один или оба вариабельных домена второй пары расположенных рядом друг с другом вариабельных доменов можно дополнительно соединить с дополнительным вариабельным доменом (фиг. 6а, 6b, 7). Если единица диатела представляет собой единицу одноцепочечного диатела, первая пара вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, соединена по N-концу с дополнительным вариабельным доменом, а вторая пара вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, соединена по С-концу с дополнительным вариабельным доменом. В частности, первая пара расположенных рядом друг с другом вариабельных доменов соединена по N-концу с дополнительным вариабельным доменом единицы scFv, а вторая пара расположенных рядом друге другом вариабельных доменов соединена по С-концу с дополнительным вариабельным доменом еще одной единицы scFv (фиг. 1). В других вариантах реализации первая пара вариабельных доменов первой единицы одноцепочечного диатела соединена по N-концу с дополнительным вариабельным доменом второй единицы одноцепочечного диатела, а вторая пара вариабельных доменов первого одноцепочечного диатела соединена по С-концу с дополнительным вариабельным доменом третьей единицы одноцепочечного диатела в полипептиде, содержащем три единицы одноцепочечного диатела, соединенные друг за другом (фиг. 4) В других случаях между первой и второй парами вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, может располагаться по меньшей мере один дополнительный вариабельный домен.

В некоторых случаях, если единица диатела представляет собой единицу одноцепочечного диатела, мультивалентное антитело состоит из одиночного полипептида, содержащего два вариабельных домена, расположенных рядом друг с другом, т.е. первую пару вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, ассоциированных с двумя другими вариабельными доменами этого полипептида, расположенными рядом друг с другом, т.е. второй парой вариабельных доменов (фиг. 1). Такая структура антитела благоприятствует получению мультиспецифичных, в частности, би-, три- или тетраспецифичных антител. В некоторых вариантах реализации такое мультивалентное, в частности, триспецифичное Fv-антитело содержит по меньшей мере восемь вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца к С-концу, причем первый и второй вариабельные домены образуют единицу scFv на N-конце, и указанная единица scFv на N-конце соединена по С-концу с третьиму вариабельным доменом первой пары вариабельных доменов единицы диатела, содержащей третий вариабельный домен и четвертый вариабельный домен, причем указанный четвертый вариабельный домен соединен по С-концу с пятым вариабельным доменом второй пары вариабельных доменов единицы диатела, содержащей пятый и шестой вариабельные домены, причем указанный шестой вариабельный домен соединен по С-концу с седьмым вариабельным доменом единицы scFv на С-конце, и указанная единица scFv образована седьмым и восьмым вариабельными доменами (фиг. 1). Вариабельные домены могут быть расположены, например, в одной из следующих ориентации от N-конца к С-концу полипептида: V_H-V_L-V_L-V_H-V_L-V_H-V_L-V_H, V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_L-V_L-V_H, V_L-V_H-V_L-V_H-V_L-V_H-V_H-V_L или V_H-V_L-V_L-V_L-V_H-V_H-V_L-V_H. В конкретном варианте реализации ориентация одной пары вариабельных доменов единицы диатела представляет собой V_H-V_H, а ориентация другой пары вариабельных доменов единицы диатела - V_L-V_L (фиг. 1).

Четырехвалентные варианты реализации молекулы антитела, состоящей из одиночного полипептида, содержащего восемь вариабельных доменов, описанных выше, благоприятствуют получению триспецифичных антител. Например, такие триспецифичные антитела могут иметь первую и вторую специфичности в отношении антигена на клетке-мишени, например, опухолевой клетке, а третью специфичность - в отношении эффекторной клетки иммунной системы, например, Т- или NK-клетки. В других случаях такое триспецифичное антитело может иметь две специфичности для различных антигенов на эффекторных клетках, и третью специфичность в отношении антигена на опухолевой клетке. В некоторых вариантах реализации две дистальные единицы scFv могут иметь первую и вторую специфичности в отношении клетки-мишени, а единица диатела, расположенная между этими двумя единицами scFv, может иметь специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; т.е., от N-конца к С-концу, первый и второй вариабельные домены имеют первую специфичность в отношении клетки-мишени; третий и пятый вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, четвертый и шестой вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а седьмой и восьмой вариабельные домены имеют вторую специфичность в отношении клетки-мишени (фиг. 1). В других вариантах реализации две дистальные единицы scFv могут иметь специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а два антигенсвязывающих сайта, образованные единицей диатела, могут иметь две специфичности для клетки-мишени; т.е., от N-конца к С-концу, первый и второй, а также седьмой и восьмой вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; третий и пятый вариабельные домены имеют первую специфичность в отношении клетки-мишени, а четвертый и шестой вариабельные домены имеют вторую специфичность в отношении клетки-мишени. В дополнительных альтернативных вариантах реализации одиночный полипептид может содержать более восьми, например, 10, 12 или более вариабельных доменов, и содержать более двух единиц scFv и/или более одной единицы диатела.

В дополнительных вариантах реализации мультивалентная молекула антитела, состоящая из одного полипептида, содержит три единицы одноцепочечного диатела, соединенные друг за другом (фиг. 4). Такая молекула антитела содержит по меньшей мере 12 вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца к С-концу. В конкретном варианте реализации ориентация одной пары вариабельных доменов второй единицы одноцепочечного диатела представляет собой V_H-V_H, а ориентация другой пары вариабельных доменов второй единицы одноцепочечного диатела - V_L-V_L (Fig. 4). Такая молекула антитела является шестивалентной и может содержать антигенсвязывающие сайты для от одной до шести различных антигенных специфичностей, в частности, двух или трех различных антигенных специфичностей.

В некоторых случаях молекула антитела, в частности, Fv-антитела содержит единицу диатела в формате димерной единицы диатела. В таких случаях молекула антитела представляет собой димер двух полипептидов, причем первая пара двух вариабельных доменов единицы диатела, расположенных рядом друг с другом, встроена в первый полипептид, содержащий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом, и указанная первая пара вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, ассоциирована с еще одной второй парой двух вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом во втором полипептиде. Первый и второй полипептиды предпочтительно нековалентно связаны (фиг. 2, 3, 5, 6а, 6b, 7, 8а и 8b8b). Однако в некоторых случаях первый и второй полипептиды могут быть ковалентно связаны, например, дисульфидной связью или химическим линкером.

В некоторых вариантах реализации первый полипептид содержит по меньшей мере шесть вариабельных доменов, а второй полипептид содержит по меньшей мере два вариабельных домена (фиг. 2). В таких вариантах реализации второй полипептид входит в состав единицы диатела и, предпочтительно нековалентно, ассоциирован с другой парой двух вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, встроенной в первый полипептид. В вариантах реализации, где первая полипептидная цепь состоит из шести вариабельных доменов, а второй полипептид состоит из двух вариабельных доменов, эти вариабельные домены можно расположить от N-конца к С-концу полипептида, например, в следующей ориентации: V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_H (первый полипептид) и V_L-V_L (второй полипептид); V_L-V_H-V_H-V_H-V_H-V_L (первый полипептид) и V_L-V_L (второй полипептид); V_H-V_L-V_L-V_L-V_H-V_L (первый полипептид) и V_H-V_H (второй полипептид); V_L-V_H-V_L-V_L-V_H-V_L (первый полипептид) и V_H-V_H (второй полипептид) или V_H-V_L-V_L-V_L-V_L-V_H (первый полипептид) и V_H-V_H (второй полипептид). Единицы диател, содержащие одну пару двух вариабельных доменов в ориентации V_H-V_H и другую пару двух вариабельных доменов в ориентации V_L-V_L, благоприятствуют правильному фолдингу, в частности, мультиспецифичных, например, триспецифичных молекул антител.

Четырехвалентные варианты реализации молекулы антитела, содержащей первый полипептид, содержащий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, и второй полипептид, содержащий по меньшей мере двух вариабельных домена, как описано выше, благоприятствуют получению триспецифичных антител. Из-за различного размера первого и второго полипептидов эти полипептиды легко выделить из надосадочной жидкости по отдельности. Например, такие триспецифичные антитела могут иметь первую и вторую специфичности в отношении клетки-мишени, например, опухолевой клетки, а третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, например, Т- или NK-клетки. В других вариантах реализации молекулы триспецифичных антител имеют первую и вторую специфичности в отношении первого и второго вирусного антигена или эпитопа вирусного антигена, а третью специфичность в отношении эффекторной клетки, например, Т- или NK-клетки. В дополнительных вариантах реализации молекула триспецифичного антитела имеет первую специфичность в отношении вирусного антигена, вторую специфичность к антигену на клетке-мишени, а третью специфичность в отношении эффекторной клетки, например, Т- или NK-клетки. В других случаях такое триспецифичное антитело может содержать первую и вторую специфичность для эффекторных клеток, например, NK-клеток или Т-клеток, и третью специфичность в отношении клетки-мишени, например, опухолевого антигена на опухолевой клетке или вирусного антигена. Первая и вторая специфичности для эффекторной клетки могут соответствовать различным антигенам или эпитопам одного и того же антигена на эффекторных клетках одного и того же типа.

В некоторых вариантах реализации две дистальные единицы scFv, образованные в первом полипептиде, могут иметь первую и вторую специфичности в отношении клетки-мишени, а единица диатела, расположенная между этими двумя единицами scFv и образованная первым и вторым полипептидами, может иметь специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; т.е., от N-конца к С-концу в первом полипептиде, первый и второй вариабельные домены имеют первую специфичность в отношении клетки-мишени; третий и четвертый вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, пятый и шестой вариабельные домены имеют вторую специфичность в отношении клетки-мишени, а во втором полипептиде первый и второй вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы (фиг. 2). В других вариантах реализации две дистальные единицы scFv в первом полипептиде, содержащем шесть вариабельных доменов, могут иметь специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а два антигенсвязывающих сайта, образованные единицей диатела первого полипептида, а также два вариабельных домена второго полипептида могут иметь разные специфичности в отношении клетки-мишени; т.е. от N-конца к С-концу первого полипептида, первый и второй, а также пятый и шестой вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; третий вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени, четвертый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, а во втором полипептиде первый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, а второй вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени.

В дополнительных вариантах реализации первый полипептид содержит по меньшей мере шесть вариабельных доменов, а второй полипептид содержит по меньшей мере четыре (фиг. 6а, 6b) или шесть (фиг. 7) вариабельных доменов. В таких вариантах реализации первый полипептид содержит первую пару вариабельных доменов единицы диатела, а второй полипептид содержит вторую пару вариабельных доменов единицы диатела, которые, предпочтительно нековалентно, ассоциированы друг с другом, образуя два антигенсвязывающих сайта между первым и вторым полипептидами. В вариантах реализации, где первая полипептидная цепь состоит из шести вариабельных доменов, а второй полипептид состоит из четырех вариабельных доменов, пара вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом в единице диатела во втором полипептиде, соединена с единицей scFv, образуя дополнительный антигенсвязывающий сайт со стороны N-конца или С-конца второго полипептида (фиг. 6а, 6b). Такие варианты реализации являются пятивалентными и могут содержать антигенсвязывающие сайты для от одной до пяти различных антигенных специфичностей, в частности, двух или трех различных антигенных специфичностей. Единицы диател, содержащие одну пару двух вариабельных доменов в ориентации V_H-V_H в первом полипептиде и другую пару двух вариабельных доменов в ориентации V_L-V_L во втором полипептиде, благоприятствуют правильному фолдингу, в частности, мультиспецифичных, например, триспецифичных молекул антител.

В других вариантах реализации, где первая полипептидная цепь состоит из шести вариабельных доменов, а второй полипептид состоит из четырех вариабельных доменов, пара вариабельных доменов единицы диатела, расположенных рядом друг с другом во втором полипептиде, соединены по N-концу и С-концу с единицами scFv с образованием двух дополнительных антигенсвязывающих сайтов (фиг. 7). Такие варианты реализации являются шестивалентными и могут содержать антигенсвязывающие сайты для от одной до шести различных антигенных специфичностей, в частности, двух или трех различных антигенных специфичностей. В конкретных вариантах реализации единица диатела содержит одну пару вариабельных доменов в ориентации V_H-V_H в первом полипептиде и другую пару вариабельных доменов в ориентации V_L-V_L во втором полипептиде. В дополнительных альтернативных вариантах реализации мультивалентная, например, триспецифичная молекула Fv-антитела может содержать более одной димерной единицы диатела. В таких альтернативных вариантах реализации первый полипептид может содержать по меньшей мере шесть вариабельных доменов, а второй полипептид может содержать по меньшей мере четыре (фиг. 3) или шесть (фиг. 8а, 8b) вариабельных доменов. В вариантах реализации, где первый полипептид содержит по меньшей мере шесть вариабельных доменов, а второй полипептид содержит четыре вариабельных домена, четыре вариабельных домена второго полипептида, расположенные рядом друг с другом, ассоциированы с соответствующими четырьмя вариабельными доменами, расположенными рядом друге другом и встроенными в первый полипептид, тем самым образуя тандем из двух единиц диател, расположенных рядом друг с другом. Остальные по меньшей мере два дополнительных вариабельных домена первого полипептида расположены дистально по отношению к тандемным единицам диатела и образуют единицу scFv (фиг. 8а, 9b). В других вариантах реализации, где первый полипептид содержит шесть вариабельных доменов, а второй полипептид содержит шесть вариабельных доменов, шесть вариабельных доменов первого полипептида ассоциированы с соответствующими шестью вариабельными доменами второго полипептида, тем самым образуя триплет из единиц диател, расположенных рядом друге другом (фиг. 3). Последний вариант реализации, состоящий из первого и второго полипептида, где каждый полипептид содержит шесть вариабельных доменов, обладает преимуществом в том смысле, что он может позволить получить триспецифичное антитело в формате гомодимера, т.е. двух идентичных полипептидов, ассоциированных друг с другом и обеспечивающих двухвалентное связывание для каждой из трех антигенных специфичностей.

В некоторых случаях четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело представлено в виде тандемного диатела. Такая молекула триспецифичного Fv-антитела состоит из первого и второго полипептида, причем каждый полипептид содержит четыре вариабельных домена, соединенных друг с другом. В такой молекуле Fv-антитела длина линкера предотвращает внутримолекулярное спаривание вариабельных доменов, так что молекула не может укладываться сама на себя, но принудительно сопрягается, т.е. ассоциирует с комплементарными доменами другого полипептида. Домены располагаются таким образом, что соответствующие V_H- и V_L-домены ассоциируют друг с другом во время этой димеризации. Несмотря на отсутствие межмолекулярных ковалентных связей, этот димер отличается высокой стабильностью после образования, остается интактным и не переходит обратно в мономерную форму. В некоторых вариантах реализации молекула триспецифичного Fv-антитела содержит димерную единицу диатела, причем ориентация одной пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, представляет собой V_H-V_H, а ориентация другой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, представляет собой V_L-V_L. Такая ориентация вариабельных доменов в единице диатела облегчает правильную ассоциацию двух триспецифичных полипептидов. В частности, такая ориентация позволяет получить молекулы триспецифичных Fv-антител в формате тандемного диатела, поскольку оно является гетеродимером двух различных полипептидов. Соответственно, такая ориентация благоприятствует правильной гетеродимеризации триспецифичного тандемного диатела. Таким образом, в некоторых вариантах реализации молекула триспецифичного Fv-антитела представляет собой тандемное диатело (фиг. 3). В таких триспецифичных тандемных диателах вариабельные домены первого и второго полипептида можно расположить, например, в следующих ориентациях от N-конца к С-концу полипептида: V_L-V_H-V_H-V_L (первый полипептид) и V_H-V_L-V_L-V_H (второй полипептид) или наоборот (фиг. 3). Такие триспецифичные антитела в формате тандемного диатела могут иметь первую и вторую специфичности в отношении клетки-мишени, например, опухолевой клетки, и третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, например, Т- или NK-клетки. В других случаях такое триспецифичное антитело может иметь две специфичности для различных антигенов на эффекторных клетках, и третью специфичность в отношении антигена на опухолевой клетке. В некоторых вариантах реализации вариабельные домены, расположенные на внешних участках полипептидов, могут иметь первую и вторую специфичности в отношении клетки-мишени, а два вариабельных домена, расположенных в центральной части полипептида между вариабельными доменами, расположенными на внешних участках полипептидов, имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; т.е., от N-конца к С-концу в первом полипептиде, первый вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени; второй и третий вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, четвертый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, а во втором полипептиде первый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, второй и третий вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а четвертый вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени (фиг. 3). В других вариантах реализации вариабельные домены, расположенные на внешних участках полипептидов, могут содержать третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а два вариабельных домена, расположенных в центральной части полипептида между вариабельными доменами, расположенными на внешних участках полипептидов, иметь первую и вторую специфичности для клетки-мишени; т.е. от N-конца к С-концу первого полипептида, первый вариабельный домен имеет третью эпитопную специфичность для эффекторной клетки иммунной системы; второй вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени, третий вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, четвертый вариабельный домен содержит третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, а во втором полипептиде первый вариабельный домен содержит третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, второй вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, третий вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени, а четвертый вариабельный домен содержит третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы. В других вариантах реализации вариабельные домены, содержащие третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы, расположены в молекуле антитела латерально; т.е., от N-конца к С-концу первого полипептида, первый и второй вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы; третий вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени, четвертый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, а во втором полипептиде первый вариабельный домен имеет вторую специфичность в отношении клетки-мишени, второй вариабельный домен имеет первую специфичность в отношении клетки-мишени, а третий и четвертый вариабельные домены имеют третью специфичность в отношении эффекторной клетки иммунной системы.

В дополнительных вариантах реализации тандемное диатело конъюгировано с по меньшей мере одним дополнительным антигенсвязывающим доменом, в частности, с по меньшей мере одной единицей scFv со стороны N-конца или С-конца полипептида. В предпочтительных вариантах реализации тандемное диатело конъюгировано с по меньшей мере одной единицей scFv посредством пептидного линкера. В частности, такая молекула антитела состоит из первого и второго полипептида, причем оба полипептида состоят из шести вариабельных доменов, и каждый из первого полипептида и второго полипептида содержат единицу scFv со стороны N-конца каждого полипептида (фиг. 8b) или С-конца каждого полипептида (фиг. 8а). Такие молекулы антитела являются шестивалентными и могут содержать антигенсвязывающие сайты для от одной до шести различных антигенных специфичностей, в частности, двух или трех различных антигенных специфичностей. В конкретных вариантах реализации единица диатела, расположенная в центральной части молекулы антитела, содержит одну пару вариабельных доменов в ориентации V_H-V_H в первом полипептиде и другую пару вариабельных доменов в ориентации V_L-V_L во втором полипептиде. В некоторых случаях молекула мультивалентного антитела, в частности, молекула мультивалентного Fv-антитела, описанная в настоящем документе, является по меньшей мере триспецифичной и по меньшей мере четырехвалентной молекулой антитела. Такая молекула антитела содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью по отношению к одному и тому же эпитопу антигена. За счет этого повышается авидность, т.е. сила взаимодействия между эпитопом антигена и антигенсвязывающей молекулой. Авидность молекул триспецифичных антител можно дополнительно повысить за счет пятивалентных и шестивалентных вариантов реализации настоящего изобретения. Пятивалентные молекулы могут содержать по меньшей мере два связывающих сайта для двух или трех эпитопных специфичностей триспецифичного антитела, а шестивалентные варианты реализации могут содержать два антигенсвязывающих сайта для каждой из трех эпитопных специфичностей. В качестве альтернативы, полиспецифичность, т.е. количество специфичностей, можно увеличить за счет четырехвалентных, пятивалентных и шестивалентных вариантов реализации. Например, молекула антитела может являться тетраспецифичной. Преимущества повышенной авидности представляют собой повышенную стабильность взаимодействия и удерживания на мишени. Например, если мишенью является цитотоксическая эффекторная клетка иммунной системы, например, Т-клетка или NK-клетка, повышенная авидность может привести к повышенному цитотоксическому потенциалу молекулы антитела. В еще одном примере, если мишень является опухолевой клеткой, повышенная авидность улучшает время удерживания на мишени и снижает скорость диссоциации с мишени. В определенном варианте реализации настоящего изобретения молекула триспецифичного и четырехвалентного Fv-антитела содержит первый и второй антигенсвязывающие сайты, специфичные по отношению к двум различным эпитопам антигенов опухолевых клеток одного и того же типа, и третий и четвертый антигенсвязывающие сайты, специфичные по отношению к эпитопу антигена эффекторной клетки иммунной системы, например, Т-клетки или NK-клетки. Такая молекула антитела дает повышенную специфичность, а также авидность по отношению к опухолевой клетке определенного типа, а также повышенную авидность для активации или ингибирования рецептора на эффекторной клетке иммунной системы, что приводит к выгодно увеличенному специфичному цитотоксическому потенциалу антигенсвязывающей молекулы Связывание с двумя различными эпитопами опухолевого антигена приводит к увеличению специфичности адресного воздействия и расширению терапевтического окна путем снижения неспецифичной токсичности. Таким образом, в настоящем изобретении предложены молекулы мультиспецифичных антител, благоприятным образом повышающие авидность и/или биологическую активность вследствие наличия по меньшей мере двух антигенсвязывающих сайтов для по меньшей мере одной эпитопной специфичности, например, двух сайтов связывания для одной, двух или трех эпитопных специфичностей, другими словами, мишеней.

Важно отметить, что, несмотря на структурную сложность, такие мультиспецифичные, например, триспецифичные и мультивалентные, например, четырехвалентные молекулы антитела согласно настоящему изобретению являются стабильными.

В других случаях такое мультиспецифичное, например, триспецифичное антитело может иметь две специфичности для различных антигенов на эффекторной клетке, например, NK-клетке или Т-клетке, и третью специфичность в отношении антигена на опухолевой клетке.

Таким образом, молекулу антитела согласно настоящему изобретению можно применять различными способами для изменения мишеней цитотоксического потенциала эффекторных клеток иммунной системы для уничтожения опухолевых клеток или инфекционных агентов, например, клеток, инфицированных вирусами. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичная, например, триспецифичная молекула антитела может связываться с двумя различными эпитопами антигена на мишени. Например, эти два различных эпитопа могут находиться на одном и том же антигене для предотвращения появления «ускользающих» мутантов или повышения эффективности, или эти два эпитопа могут находиться на двух различных антигенах мишени. В некоторых вариантах реализации триспецифичная молекула антитела может связываться с двумя различными эпитопами антигена на эффекторных клетках иммунной системы. Например, первый антигенсвязывающий сайт обладает специфичностью к активирующему рецептору, например, CD16, CD16A или CD3, а второй антигенсвязывающий сайт обладает специфичностью к костимулирующему антигену, например, CD137, ОХ-40 или CD28. В другом примере первый антигенсвязывающий сайт обладает специфичностью к CD16 или CD16A, а второй антигенсвязывающий сайт специфичен к другому активирующему рецептору на NK-клетках, например, NKG2D, DNAM, NCR.

В еще одном варианте реализации молекула триспецифичного, в частности, Fv-антитела содержит первый антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к эпитопу антигена на опухолевой клетке, второй антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к эпитопу антигена на эффекторной клетке иммунной системы, и третий антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к эпитопу антигена на растворимом белке, выбранном из группы факторов роста, цитокинов, хемокинов, митогенов и альбуминов. Примеры такого растворимого белка представляют собой ИЛ-6, BAFF, APRIL, ТФР-бета, ИЛ-10, VEGF-A, ТФР-альфа, ЭФР, HB-EGF, херегулины, ангиопоэтин-2 и человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).

В альтернативном варианте реализации молекула антитела содержит один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к эпитопу антигена, присутствующего на клетках одного типа, и три антигенсвязывающих сайта, обладающие специфичностью к эпитопам антигенов на клетках одного или более типов.

"Эффекторные клетки» представляют собой клетки иммунной системы, способные стимулировать или активировать цитотоксичность, фагоцитоз, презентацию антигена, высвобождение цитокинов. Такие эффекторные клетки являются, например, Т-клетками, естественными киллерами (NK-клетками), гамма-дельта (gd) Т-клетками, естественными киллерными Т-клетками (NKT), гранулоцитами, моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, врожденными лимфоидными клетками (ILC) и антиген-презентирующими клетками, но не ограничиваются ими. Примеры специфичностей для эффекторных клеток включают CD2, CD3 и субъединицы CD3, например, CD3s, CD5, CD28 и другие компоненты Т-клеточного рецептора (TCR) или CD134 (ОХ40) для Т-клеток; CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336 (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2A, NKG2C и NKG2D, DNAM, NCR для NK-клеток; CD18, CD64 и CD89 для гранулоцитов; CD18, CD32, CD47, CD64, CD89 и рецептор маннозы для моноцитов и макрофагов; CD64 и рецептор маннозы для дендритных клеток; а также CD35, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанные специфичности, т.е. молекулы клеточной поверхности эффекторных клеток, подходят для опосредования уничтожения клеток после связывания молекулы мультиспецифичного, например, триспецифичного антитела с такой молекулой клеточной поверхности, и, тем самым, индукции цитолиза или апоптоза.

Антиген CD3 представляет собой компонент комплекса Т-клеточного рецептора на Т-клетках. В случае, когда специфичность для эффекторной клетки представляет собой CD3, связывание антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению с CD3 вызывает цитотоксическую активность Т-клеток. Связывание молекулы антитела с CD3 и с клеткой-мишенью, например, опухолевой клеткой, может индуцировать лизис клетки-мишени.

Антиген CD16A (FcγRIMA) является рецептором, экспрессируемым на поверхности NK-клеток. NK-клетки обладают характерной цитолитической активностью, и связывание молекулы антитела согласно настоящему изобретению с CD16 или CD16A может запустить цитотоксическую активность NK-клетки по отношению к мишени.

«Мишень» является сайтом, на котором расположен эпитоп антигена, с которым должна связываться молекула антитела. Примерами мишеней являются растворимые агенты, антигены или клетки, инфекционные агенты, например, антигены вирусов или бактерий, например, происходящие от вируса денге, вируса простого герпеса, вируса гриппа, ВИЧ, ВГС, ЦМВ, или антигены на клетках, облегчающие проникновение вирусов и бактерий, или клетки, например, нейроны, экспонирующие антигены, или клетки, несущие аутоиммунные мишени, например, ИЛ-2/IL2R, аутоиммунный маркер или аутоиммунный антиген, или опухолевые клетки. В вариантах реализации, где по меньшей мере один из антигенсвязывающих сайтов обладает специфичностью к эффекторной клетке, мишень может представлять собой опухолевую клетку, по отношению к которой можно настроить активность эффекторной клетки с целью индукции или активации соответствующего биологического, например, иммунного ответа.

Подходящие специфичности в случае опухолевых клеток могут быть представлены опухолевыми антигенами и антигенами клеточной поверхности на соответствующей опухолевой клетке, Например, определенными опухолевыми маркерами. Термин "опухолевый антиген", используемый в настоящем документе, включает опухоль-ассоциированный антиген (ТАА) и опухольспецифичный антиген (TSA). Термин "опухоль-ассоциированный антиген" (ТАА), используемый в настоящем документе, относится к белку, присутствующему на опухолевых клетках, а также на нормальных клетках в течение эмбрионального периода (эмбриональные онкоантигены), и после родов в отдельных органах, однако в значительно более низкой концентрации, чем на опухолевых клетках. ТАА могут также присутствовать в строме в непосредственной близости от опухолевой клетки, однако в строме других частей тела они экспрессируются в низких количествах. В противоположность этому, термин "опухольспецифичный антиген" (TSA) относится к белку, экспрессируемому опухолевыми клетками. Термин "антиген клеточной поверхности" относится к молекуле любого антигена или его фрагмента, которая может распознаваться антителом на поверхности клетки.

Примеры специфичностей для опухолевых клеток включают CD19, CD20, CD26, CD29, CD30, CD33, CD52, CD200, CD267, EGFR, EGFR2, EGFR3, EGFRvIII, HER2, HER3, IGFR, IGF-1R, Ep-CAM, PLAP, антиген Томсона-Фриденрайха (TF), TNFRSF17, gpA33, MUC-1 (муцин), IGFR, CD5, ИЛ-4-R альфа, ИЛ13-R, FcεRI, комплексы МНС I класса/пептид и IgE, но не ограничиваются ими.

Молекулы антител согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность направлена к антигену CD19, можно применять для иммунотерапии В-клеточных злокачественных новообразований, поскольку антиген CD19 экспрессируется практически на всех злокачественных новообразованиях В-ряда от лимфобластного лейкоза (ALL, ОЛЛ) до неходжкинской лимфомы (NHL).

Молекулы антител согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность направлена против CD30, могут быть особенно полезны при лечении болезни Ходжкина и Т-клеточных лимфом.

Молекулы антитела согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность направлена против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) или мутантной формы EGFRvIII, можно применять при лечении глиом, опухолей молочной железы, яичников, предстательной железы, легких, головы и шеи; заболеваниях печени, например, гепатоцеллюлярном раке, циррозе печени или хроническом гепатите.

Для увеличения времени полужизни молекул антител согласно настоящему изобретению в организме молекулу антитела при желании можно объединить с альбумином, например, человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), или пэгилировать, сиалировать, пасилировать или гликозилировать (см., например, Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:7804-7812). В некоторых вариантах реализации молекула антитела является по меньшей мере триспецифичной и содержит по меньшей мере один, например, один или два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью по отношению к альбумину, например, ЧСА. Такая по меньшей мере триспецифичная молекула антител может являться, например, четырехвалентной, пятивалентной или шестивалентной молекулой антитела.

Вариабельные домены, обладающие специфичностью по отношению к эпитопам на клетках-мишенях или эффекторных клетках, можно получить путем отбора вариабельных фрагментов (Fv), специфичных по отношению к нужным антигенам. Эти процедуры можно выполнить, например, путем скрининга библиотек фагового дисплея одноцепочечных Fv или с использованием гибридомной технологии. Например, библиотеки фагового дисплея последовательностей scFv человека на основе IgM можно подвергать нескольким циклам отбора in vitro с целью обогащения связывающими агентами, специфичными по отношению к желательному антигену. Затем можно повысить сродство отобранных scFv путем созревания аффинности.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере один, предпочтительно все вариабельные домены антитела являются полностью человеческими, гуманизированными или химерными доменами. Гуманизированные антитела можно получить с помощью общепринятых способов, например, пересадки CDR (см., например, Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, NJ.). Таким образом, специалист в данной области техники легко может получить гуманизированный или полностью человеческий вариант антигенсвязывающей молекулы и вариабельных доменов из нечеловеческих источников, например, мыши или животных, не являющихся приматами, с помощью стандартных молекулярно-биологических методик, известных в данной области техники с целью снижения иммуногенности и улучшения эффективности указанной антигенсвязывающей молекулы в иммунной системе человека. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения все вариабельные домены антитела являются гуманизированными или полностью человеческими; наиболее предпочтительно, молекула антитела согласно настоящему изобретению является гуманизированной или полностью человеческой. Термин "полностью человеческий" в настоящем документе означает, что аминокислотные последовательности вариабельных доменов и пептидов, связывающих вариабельные домены в полипептиде, происходят или могут обнаруживаться в организме человека. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения вариабельные домены, но не пептиды, связывающие вариабельные домены, могут являться доменами человека или гуманизированными доменами антитела.

Специалист легко может сконструировать и получить молекулу антитела, описанную в настоящем документе, используя установленные методики и стандартные способы, известные в данной области техники, см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, edited by John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); или Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.); Antibody Engineering / edited by Roland E. Kontermann and Stefan Dubel, Springer Verlag Berlin Heidelberg (2010)).

Молекулу антитела по любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, можно получить путем экспрессии полинуклеотидов, кодирующих отдельные полипептидные цепи, образующие молекулу антитела. Таким образом, дополнительными вариантами реализации настоящего изобретения являются полинуклеотиды, например, ДНК или РНК, кодирующие полипептиды молекулы антитела, описанной выше в настоящем документе.

Указанные полинуклеотиды можно сконструировать с применением способов, известных специалистам, например, путем комбинирования генов, кодирующих вариабельные домены антитела, разделенные пептидными линкерами или непосредственно связанные между собой пептидными связями полипептидов, в генетическом конструкте, функционально связанном с подходящим промотором и, необязательно, подходящим терминатором транскрипции, и их экспрессии в бактерии или другой соответствующей системе экспрессии, например, клетках СНО. В зависимости от выбранных векторной системы и хозяина, можно использовать любой набор подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Промотор выбирают так, чтобы он управлял экспрессией полинуклеотидов в соответствующей клетке-хозяине.

Полинуклеотиды можно внедрить в векторы, предпочтительно экспрессирующие векторы, которые представляют собой дополнительный вариант реализации настоящего изобретения. Указанные рекомбинантные векторы можно сконструировать в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Для встраивания и экспрессии полинуклеотидов, кодирующих полипептидные цепи по настоящему изобретению, можно использовать множество систем экспрессирующих векторов/хозяев. Примеры экспрессирующих векторов для экспрессии в E.coli представляют собой pSKK (LeGalI et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27) или pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих.

Таким образом, молекулу антитела, описанную в настоящем документе, можно получить путем внедрения вектора, кодирующего полипептиды, описанные выше, в клетку-хозяина и культивирования указанной клетки-хозяина в условиях, при которых указанные полипептиды экспрессируются, их можно выделить и, необязательно, дополнительно очистить.

В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения предложены композиции, например, фармацевтические композиции, содержащие молекулу антитела, описанную выше, и по меньшей мере один дополнительный компонент.

В дополнительных вариантах реализации молекулы антител предназначены для применения в качестве медикамента или диагностического средства. В частности, молекулы антител предназначены для применения в иммунотерапии. Например, молекул антител предназначены для применения при лечении опухолевого, вирусного или нейродегенеративного заболевания. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно включает способ лечения индивида посредством иммунотерапии, в частности, индивида, страдающего заболеваниями, выбранными из опухолевых, вирусных или нейродегенеративных заболеваний, включающий этап введения молекулы антитела в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ, в котором молекулу антитела, в частности, композицию, содержащую молекулу антитела, описанную выше в настоящем документе, и по меньшей мере один дополнительный компонент, вводят в эффективной дозе субъекту, например, пациенту, для лечения рака (например, неходжкинской лимфомы; хронического лимфоцитарного лейкоза). Антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению может быть предназначена для применения в качестве медикамента.

Краткое описание чертежей:

На фигуре 1 показана четырехвалентная триспецифичная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из одиночного полипептида, содержащего восемь вариабельных доменов, соединенных друг за другом в ориентации V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_L-V_L-V_H от N-конца 7 к С-концу 8 полипептида. Такая ориентация доменов приведена лишь в качестве примера, возможны и другие аранжировки, описанные выше. Две одноцепочечные Fv (scFv) единицы 2 дистально соединены с единицей одноцепочечного диатела 1 пептидными линкерами 5, причем вариабельный домен легкой цепи (V_L) одной единицы scFv 2 соединен по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) первой пары вариабельных доменов единицы диатела 1. V_L единицы scFv 2 соединен по N-концу с V_H единицей scFv длинным пептидным линкером 4. V_H первой пары вариабельных доменов соединен коротким пептидным линкером 3 с еще одним доменом V_H первой пары вариабельных доменов. Первая пара вариабельных доменов соединена по С-концу длинным пептидным линкером 4 с N-концом второй пары вариабельных доменов диатела, оба из которых являются V_L-доменами. Два V_L-домена второй пары вариабельных доменов соединены коротким пептидным линкером 3. Вторая пара вариабельных доменов диатела присоединена по С-концу к N-концу V_L-домена еще одной единицы scFv 2, расположенной на С-конце полипептида. Единица scFv 2 на С-конце полипептида состоит из V_L-домена, соединенного длинным линкером 4 с V_H-доменом. Две единицы scFv 2 содержат антигенсвязывающие сайты с различными специфичностями, а единица диатела 1 содержит два антигенсвязывающих сайта, обладающих одинаковой специфичностью.

На фигуре 2 показана четырехвалентная триспецифичная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом в ориентации V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_H от N-конца 7 к С-концу 8 первого полипептида, и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена, соединенных друг за другом в ориентации V_L-V_L от N-конца 7а к С-концу 8а второго полипептида. Такая ориентация доменов приведена лишь в качестве примера, возможны и другие варианты расположения, описанные выше. Антигенсвязывающая Fv-молекула содержит димерную единицу диатела 1, образованную первой парой двух вариабельных доменов, встроенных в первый полипептид, ассоциированных со второй парой двух вариабельных доменов во втором полипептиде. Каждый из двух вариабельных доменов первой пары двух вариабельных доменов, встроенных в первый полипептид, соединен с единицей scFv 2. В каждой из единиц scFv 2 вариабельные домены соединены длинным пептидным линкером 4. N-концевая единица scFv 2 соединена по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом первой пары вариабельных доменов единицы диатела 1. Первая пара вариабельных доменов состоит из двух V_H-доменов, соединенных коротким пептидным линкером 3. Первая пара вариабельных доменов единицы диатела 1 соединена по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом единицы scFv 2, расположенной на С-конце первого полипептида. Две единицы scFv 2 содержат антигенсвязывающие сайты с различными специфичностями, а единица диатела 1 содержит два антигенсвязывающих сайта, обладающих одинаковой специфичностью.

На фигуре 3 показана четырехвалентная триспецифичная антигенсвязывающая Fv-молекула в формате триспецифичного тандемного диатела, состоящего из первого и второго полипептида, образующих нековалентно ассоциированный гетеродимер. Тандемное диатело содержит димерную единицу диатела 1, образованную парой доменов V_H-V_H, расположенных в центральной части первого полипептида, с парой доменов V_L-V_L, расположенных в центральной части второго полипептида. Вариабельные домены в первом и втором полипептиде соединены друг за другом короткими пептидными линкерами 3, 3а от N-конца 7 к С-концу 8 в ориентации V_L-V_H-V_H-V_L в первом полипептиде и от N-конца 7а к С-концу 8а в ориентации V_H-V_L-V_L-V_H во втором полипептиде. Вариабельные домены, расположенные на N-конце и С-конце, содержат антигенсвязывающие сайты с различными специфичностями по N-концу и С-концу, а единица диатела 1, расположенная в центральной части, содержит два антигенсвязывающих сайта, обладающих одинаковой специфичностью.

На фигуре 4 показана шестивалентная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из одиночного полипептида, содержащего двенадцать вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца 7 к С-концу 8 полипептида. Ориентация домена приведена только для примера, возможны и другие аранжировки, указанные для каждой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом. Две единицы одноцепочечного диатела 1а, 1b дистально соединены с единицей одноцепочечного диатела 1с пептидными линкерами 5, причем вариабельный домен одной единицы одноцепочечного диатела 1а соединен по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом вариабельного домена первой пары вариабельных доменов единицы диатела 1с, а вариабельный домен единицы одноцепочечного диатела 1b соединен по N-концу линкером 5 с С-концом второй пары вариабельных доменов единицы одноцепочечного диатела 1с. Первая и вторая пары вариабельных доменов каждой из трех единиц одноцепочечного диатела 1а, 1b, 1с соединены друг с другом длинным пептидным линкером 4. В каждой из единиц одноцепочечного диатела 1а, 1b, 1с один из вариабельных доменов первой пары вариабельных доменов соединен коротким пептидным линкером 3 с другим вариабельным доменом первой пары вариабельных доменов, а два вариабельных домена второй пары вариабельных доменов соединены коротким пептидным линкером 3.

На фигуре 5 показана шестивалентная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из первого полипептида, содержащего 10 вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца 7 к С-концу 8 первого полипептида, и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена, соединенных друг за другом от N-конца 7а к С-концу 8а второго полипептида. Конкретная ориентация домена на данной фигуре приведена только для примера, возможны и другие аранжировки, указанные для каждой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом. Антигенсвязывающая Fv-молекула содержит димерную единицу диатела 10, образованную первой парой двух вариабельных доменов первого полипептида, ассоциированных со второй парой двух вариабельных доменов во втором полипептиде. Каждый из двух вариабельных доменов первой пары двух вариабельных доменов первого полипептида соединен к единицей одноцепочечного диатела 1а, 1b.

В каждой из единиц одноцепочечного диатела 1а, 1b две пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, соединены длинным пептидным линкером 4. N-концевая единица одноцепочечного диатела 1а соединена по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом первой пары вариабельных доменов единицы диатела 10. Первая пара вариабельных доменов состоит из двух V_H-доменов, соединенных коротким пептидным линкером 3. Первая пара вариабельных доменов единицы диатела 10 соединена по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом единицы одноцепочечного диатела 1b, расположенной на С-конце первого полипептида.

На фигуре 6 показана пятивалентная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца 7 к С-концу 8 первого полипептида, и второго полипептида, содержащего четыре вариабельных домена, соединенных друг за другом от N-конца 7а к С-концу 8а второго полипептида. Ориентация домена приведена только для примера, для каждой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, возможны и другие аранжировки, указанные на фигуре. Антигенсвязывающая Fv-молекула содержит димерную единицу диатела 10, образованную первой парой двух вариабельных доменов первого полипептида, ассоциированных со второй парой двух вариабельных доменов во втором полипептиде. Каждый из двух вариабельных доменов первой пары двух вариабельных доменов первого полипептида соединен с единицей scFv 2. В каждой из единиц scFv 2 вариабельные домены соединены длинным пептидным линкером 4. N-концевая единица scFv 2 присоединена по С-концу пептидным линкером 5 с N-концом первой пары вариабельных доменов единицы диатела 10. Первая пара вариабельных доменов состоит из двух вариабельных доменов, соединенных коротким пептидным линкером 3. Первая пара вариабельных доменов единицы диатела 10 соединена о С-концу пептидным линкером 5 с N-концом единицы scFv 2, расположенной на С-конце первого полипептида. А) второй полипептид, содержащий четыре вариабельных домена, состоит из второй пары вариабельных доменов единицы диатела 10, соединенных с единицей scFv 2 по С-концу, и В) второй полипептид, содержащий четыре вариабельных домена, состоит из второй пары вариабельных доменов единицы диатела 10, соединенных с единицей scFv 2 по N-концу.

На фигуре 7 показана шестивалентная антигенсвязывающая Fv-молекула, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца 7 к С-концу 8 первого полипептида, и второго полипептида, содержащего шесть вариабельных домена, соединенных друг за другом от N-конца 7а к С-концу 8а второго полипептида. Ориентация домена приведена только для примера, для каждой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, возможны и другие аранжировки, указанные на фигуре. Антигенсвязывающая Fv-молекула содержит димерную единицу диатела 10, образованную первой парой двух вариабельных доменов первого полипептида, ассоциированных со второй парой двух вариабельных доменов во втором полипептиде. Каждый из вариабельных доменов единицы диатела 10 соединен с единицей scFv 2 в первом и втором полипептиде. В каждой из единиц scFv 2 вариабельные домены соединены длинным пептидным линкером 4. Каждая из четырех единиц scFv 2 соединена пептидным линкером 5 с вариабельным доменом единицы диатела 10. Эта первая пара вариабельных доменов состоит из двух вариабельных доменов, соединенных коротким пептидным линкером 3, а вторая пара вариабельных доменов единицы диатела состоит из двух вариабельных доменов, соединенных коротким пептидным линкером 3а.

На фигуре 8 показана шестивалентная антигенсвязывающая Fv-молекула, содержащая единицу тандемного диатела, состоящего из первого и второго полипептида, образующих нековалентно ассоциированный димер. Тандемное диатело содержит димерную единицу диатела 10а, образованную парой доменов, расположенных в центральной части первого полипептида, с парой вариабельных доменов, расположенных в центральной части второго полипептида. Вариабельные домены в первом и втором полипептиде соединены друг за другом короткими пептидными линкерами 3, 3а от N-конца 7 к С-концу 8 в каждом полипептиде. Ориентация домена приведена только для примера, для каждой пары вариабельных доменов, расположенных рядом друг с другом, возможны и другие аранжировки, указанные на фигуре. Каждый из первого и второго полипептида содержит единицу scFv 2, соединенную линкером 5 с единицей тандемного диатела. А) единицы scFv 2 присоединены по С-концу первого и второго полипептида. В) единицы scFv 2 присоединены по N-концу первого и второго полипептида.

На фигуре 9 показан анализ продуктов aTriFlex посредством электрофореза в ДСН-ПААГ. Длинные и короткие полипептиды хорошо экспрессируются (стрелки), а) aTriFlex_140 и aTriFlex_142, b) aTriFlex_138 и с) aTriFlex_139.

На фигуре 10 показана IMAC-очистка продуктов aTriFlex: a) aTriFlex_140, b) aTriFlex_138 и с) и aTriFlex_142 и d) aTriFlex_139.

На фигуре 11 показан анализ продуктов aTriFlex посредством электрофореза в ДСН-ПААГ. Длинные и короткие полипептиды хорошо экспрессируются. A) aTriFlex_101, В) aTriFlex_102, С) aTriFlex_103 и D) aTriFlex_104.

На фигуре 12 показано связывание молекул триспецифичного антитела с однократно или дважды положительными линиями клеток. Однократно положительные клетки CD19+/CD30-Raji и CD19-/CD30+ KARPAS-299, а также дважды положительные клетки CD19+/CD30+ МЕС-1 окрашивали последовательными разведениями молекул триспецифичного антитела; антитела, связавшиеся с поверхностью клеток, обнаруживали мАт против His с последующей обработкой конъюгированными с FITC IgG козы против антител мыши. Средние значения интенсивности флуоресценции, определяемые проточной цитометрией, использовали для расчета значений K_D посредством нелинейной регрессии. Значения K_D для молекул триспецифичного антитела определяли в двух независимых экспериментах.

На фигуре 13 показана цитотоксическая активность молекул триспецифичного антитела по отношению к однократно или дважды положительным линиям клеток. Анализ цитотоксичности с высвобождением кальцеина в течение 4 ч выполняли для однократно положительных клеток CD19+/CD30- Raji и CD19-/CD30+ KARPAS-299, а также дважды положительных клеток-мишеней CD19+/CD30+ МЕС-1 с использованием обогащенных NK-клеток в качестве эффекторных клеток в присутствии последовательных разведений указанных молекул триспецифичных антител. Флуоресцирующий кальцеин, высвободившийся из лизированных клеток-мишеней, использовали для расчета антитело-опосредованного лизиса клеток-мишеней и моделирования сигмоидных кривых зависимости реакции от дозы с целью определения значений EC₅₀ посредством нелинейной регрессии. Значения EC₅₀ для конструктов aTriFlex определяли в двух независимых экспериментах и показывали на графике.

Примеры, приведенные ниже, дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение без ограничения рамок настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Клонирование экспрессирующих ДНК-конструктов, кодирующих триспецифичние антигенсвязывающие Fv-молекулы

Для экспрессии триспецифичных конструктов в клетках СНО кодирующие последовательности всех молекул клонировали в виде конструктов из одного или двух генов в системе экспрессии в клетках млекопитающих, модифицированной соответствующим образом и происходящей от вектора pcDNA5/FRT. Вектор с двумя промоторами использовали для клонирования и экспрессии конструктов из двух генов (гетеродимерных триспецифичных конструктов). Для триспецифичных конструктов из одного гена использовали обычный экспрессирующий вектор pcDNA5/FRT. Вкратце, последовательности генов, кодирующих домены V_H и V_L, разделенные различными линкерами (длинными и короткими линкерами) синтезировали с помощью Life Technologies GeneArt (Регенсбург, Германия) и субклонировали. Полученные конструкты расщепляли различными ферментами рестрикции (BamHI, HindIII, XhoI, EcoRV, PacI), или различные домены V_H/V_L, связывающиеся с эффекторами и мишенями, амплифицировали посредством ПЦР с соответствующими праймерами. После этого различные перекрывающиеся фрагменты ДНК и 2-промоторный вектор с линеаризованным каркасом или вектор pcDNA5/FRT соединяли друг с другом с помощью Gibson Assembly в одной изотермической реакции. Конструкция всех экспрессирующих конструктов содержала кодирующие последовательности N-концевого сигнального пептида и С-концевого гексагистидинового (6xHis) маркера для первой кассеты генов или С-концевой FLAG-маркер для второй кассеты генов в целях облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструктов подтверждали секвенированием ДНК в GATC (Констанц, Германия) с использованием пары праймеров 5'-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3' и 5'-TCATGTCTGGATCCGGCCTTG-3' для 1 кассеты генов или 5'-GCCTGGAGACGCCATCC-3' и 5'-GCAGAATTCCACCACACTGG-3' для 2 кассеты генов.

Культура клеток-хозяев

Клетки Flp-In СНО (Life Technologies), производные клеток яичника китайского хомячка CHO-KI (АТСС, CCL-61) (Kao and Puck, 1968), культивировали в питательной среде Хэма F-12 с добавлением L-глутамина, 10% ЭТС и 100 мкг/мл зеоцина. Адгезивные клетки отделяли с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА и субкультивировали в соответствии со стандартными протоколами культивирования клеток, предоставленными Life Technologies.

Для адаптации к росту в суспензии клетки отделяли от флаконов для тканевых культур и помещали в бессывороточную среду HyClone CDM4 СНО для последующего инкубации в качалочных колбах при 37°С, 5% СО₂ и 120 об/мин. Стандартная среда для культивирования адаптированных к суспензии клеток-хозяев Flp-In СНО представляла собой HyClone CDM4 СНО с добавлением L-глутамина, добавки НТ, пенициллина/стрептомицина и 100 мкг/мл зеоцина. Адаптированные к суспензии клетки консервировали с замораживанием в среде с 10% ДМСО и проверяли на предмет отрицательного результата анализа Mycoplasma с использованием набора MycoAlert для обнаружения Mycoplasma (Lonza).

Получение пулов стабильно трансфицированных клеток

Линии рекомбинантных клеток Flp-In СНО, стабильно экспрессирующих секретируемые триспецифичные антитела из одного или двух генов, получали путем трансфекции клеток-хозяев, адаптированных к суспензии. Для этого клетки помещали в стандартную среду без зеоцина за один день до совместной трансфекции экспрессирующими плазмидами (2,5 мкг), кодирующими нужный белок (pcDNA5/FRT), и рекомбиназу Flp (pOG44, Life Technologies) с использованием полиэтиленимина (ПЭИ). Вкратце, векторную ДНК и реагент для трансфекции смешивали в соотношении ДНК : ПЭИ 1:3 (мкг/мкг) в общем объеме среды OptiMEM I 100 мкл и инкубировали в течение 10 минут, а затем добавляли 2⋅10⁶ клеток Flp-In СНО, суспендированных в 1 мл среды CHO-S-SFMII (Life Technologies). Через 24 ч инкубации начинали отдор стабильно трансфицированных клеток путем добавления 500 мкг/мл гигромицина В после разбавления культур до плотности 0,1⋅10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среде CHO-S-SFMII и посева в флаконы для культивирования Т75. Рекомбиназа Flp опосредует инсерцию экспрессирующих конструктов в геном клеток Flp-In СНО по встроенному сайту FRT за счет сайт-специфичной рекомбинации ДНК (O'Gorman et al., 1991). При отборе измеряли плотность жизнеспособных клеток дваджы в неделю, клетки центрифугировали и ресуспендировали в свежей селективной среде при максимальной плотности 0,1⋅10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Пулы клеток, стабильно экспрессирующих рекомбинантные белковые продукты, выделяли после 2-3 недель отбора; в этот момент клетки переносили на стандартную культуральную среду в качалочные колбы. Экспрессию рекомбинантных секретируемых белков подтверждали гель-электрофорезом белков в надосадочной жидкости культур клеток с использованием технологии Criterion Stain-Free (Bio-Rad). Стабильные пулы клеток криоконсервировали в среде, содержащей 50% ProFreeze (Lonza) и 7,5% ДМСО.

Продукция рекомбинантного белка при периодическом культивировании клеток СНО в суспензии с добавлением субстрата

Рекомбинантные белки продуцировали при 10-дневном периодическом культивировании стабильно трансфицированных линий клеток СНО с добавлением субстрата путем секреции в надосадочную жидкость культуры клеток. Для этого пулы клеток, стабильно экспрессирующих триспецифичные антитела, высевали при начальной плотности 6⋅10⁵ клеток/мл в стандартную культуральную среду в поликарбонатные колбы Эрленмейера с газопроницаемыми крышками (Corning) и инкубировали при 37°С и 5% СО₂ с перемешиванием при 140 об/мин. При периодическом культивировании с добавлением субстрата в среду добавляли 40 мл/л ActiCHO Feed А и 4 мл/л ActiCHO Feed В (GE Healthcare) в 0 день (день начала культивирования) и двойное количество этих добавок в 3, 5 и 7 дни. Надосадочную жидкость культур клеток собирали через 10 суток культивирования при жизнеспособности культуры >75%. Отбор образцов продуцирующих культур выполняли через день до подпитки и оценивали плотность и жизнеспособность клеток. В день сбора надосадочную жидкость культур клеток просветляли центрифугированием и вакуумной фильтрацией (0,22 мкм) через мембранные фильтры Millipore Express PLUS (Millipore) перед дальнейшим использованием.

Очистка триспецифичных Fv-антител

Триспецифичные антитела выделяли из просветленной надосадочной жидкости культур клеток СНО в ходе двустадийной процедуры, включавшей IMAC и препаративную эксклюзионную хроматоргафию. При необходимости для дополнительной тонкой очистки использовали третий хроматографический этап (FLAG-аффинную хроматографию). Для IMAC просветленную непосадочную жидкость загружали на колонку HisTrap с сефарозой. После промывки трис/NaCl-буфером (рН 7,5) белок элюировали в трехстадийном градиенте с использованием 15 мМ, 125 мМ и 500 мМ имидазола, соответственно. Чистоту фракций анализировали с помощью эксклюзионной ВЭЖХ и электрофореза в ДСН-ПААГ. Фракции, демонстрировавшие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200. В некоторых случаях для дополнительной тонкой очистки использовали FLAG-аффинную хроматографию. Так, белок загружали на FLAG-аффинную колонку, промывали PBS и элюировали с использованием глицин/HCl-буфера при рН 3,5. Фракции элюата, содержавшие очищенные триспецифичные антитела, объединяли, диализовали против 10 мМ ацетата натрия (рН 5,0) и концентрировали ультрафильтрацией до типичной концентрации приблизительно 1 мг/мл. Чистоту и однородность (прибл. 90%) конечных образцов оценивали посредством электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с последующим иммуноблоттингом с использованием антител, специфичных по отношению к His-маркеру и FLAG-маркеру, а также аналитической эксклюзионной ВЭЖХ. Очищенные белки хранили в виде аликвот при -80°С до использования.

Примеры биофизических данных для молекул триспецифичных Fv-антител описаны в примере 3; aTriFlex_101 (пример 3а)), aTriFlex_102 (пример 3b)), aTriFlex_103 (пример 3с)) и aTriFlex_104 (пример 3d) показаны в таблице 1. Результаты электрофореза фракций в ДСН-ПААГ показаны на Фигуре 11: Все молекулы триспецифичных четырехвалентных Fv-антител экспрессировали с приемлемыми титрами, независимо от порядка доменов, например, V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_H (aTriFlex_101) or V_L-V_H-V_H-V_H-V_H-V_L (aTriFlex_102). Термическая стабильность и стабильность молекул триспецифичного четырехвалентного Fv-антитела были очень хорошими и сопоставимыми.

ПРИМЕР 2

Производство молекул триспецифичных антител с различным порядком доменов в единице диатела

Четыре различных молекулы Fv-антител в формате, соответствующем фигуре 2, сконструировали согласно описанию в примере 1; они характеризуются различным порядком доменов в двух парах вариабельных доменов в единице диатела (от N-конца к С-концу). Вариабельные домены единицы антитела показаны ниже в таблицах полужирным шрифтом:

aTriFlex_138: Единица антитела V_H-V_L/V_H-V_L:

aTriFlex_139: Единица диатела V_L-V_H/V_L-V_H:

aTriFlex_140: Единица диатела V_L-V_L/V_H-V_H:

aTriFlex_142: Единица диатела V_H-V_H/V_L-V_L:

Молекулы Fv-антитела экспрессировали в клетках СНО; анализ надосадочной жидкости культур продуцирующих клеток посредством электрофореза в ДСН-ПААГ показал, что длинные полипептиды 1 и короткие полипептиды 2 хорошо экспрессировались и позволяли получить отдельные полосы при электрофорезе в денатурирующих условиях (фиг. 9а, 9b, 9с).

После одноэтапной (IMAC) очистки, описанной в примере 1, достигалась 76% чистота для aTriFlex_140 (фиг. 10а) и 78% чистота для aTriFlex_142 (фиг. 10с). Соответственно, молекулы мультиспецифичных Fv-антител с единицей диатела V_L-V_L/V_H-V_H (aTriFlex_140) или единицей диатела V_H-V_H/V_L-V_L (aTriFlex_142) демонстрировали значимо высокую долю молекул Fv-антител, подвергшихся правильному фолдингу. Вместе с тем получили несколько перекрывающихся разновидностей молекул, и из aTriFlex_138 и aTriFlex_139, содержащих домены в единицах диател в чередующемся порядке V_H-V_L/V_H-V_L и V_L-V_H/V_L-V_H, соответственно, не было выделено гетеродимерных молекул антител (фиг. 10b, 10d). Соответственно, ориентация вариабельных доменов в единице диатела V_L-V_L/V_H-V_H стимулирует ассоциацию двух различных полипептидов 1 и 2 друг с другом и их гетеродимеризацию в четырехвалентную триспецифичную молекулу антитела.

ПРИМЕР 3

Получили следующие молекулы мультивалентных антител, содержащих вариабельные домены антител против CD16A, CD19 и CD30:

Линкеры:

В примерах использовали следующие пептидные линкеры:

Линкер (4) в единице scFv: (G₂S)₆for V_H-V_L и (G₂S)₇for V_L-V_H

Линкер (3, 3а) в единице диатела: (G₂S)₃

Линкер (5), соединяющий единицу scFv с единицей диатела: (G₂S)₃

а) Молекула четырехвалентного триспецифичного Fv-антитела (aTriFlex_101, показанная на фиг. 2), имеющая специфичности для CD30, CD19 и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_H-V_H в первом полипептиде и парой доменов V_L-V_L во втором полипептиде, что обеспечивает правильную гетеродимеризацию полипептида 1 и полипептида 2.

Аминокислотные последовательности:

Полипептид 1:

Полипептид 2:

b) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело (aTriFlex_102), имеющее специфичности для CD30, CD19 и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_H-V_H в первом полипептиде и парой доменов V_L-V_L во втором полипептиде.

Аминокислотные последовательности:

Полипептид 1:

Полипептид 2:

с) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело (aTriFlex_103), имеющее специфичности к CD30, CD19 и CD16A, состоящее из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой FLAG-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой His-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_H-V_H в первом полипептиде и парой доменов V_L-V_L во втором полипептиде.

Аминокислотные последовательности:

Полипептид 1:

Полипептид 2:

d) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело (aTriFlex_104), имеющее специфичности к CD30, CD19 и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой FLAG-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой His-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_H-V_H в первом полипептиде и парой доменов V_L-V_L во втором полипептиде.

Аминокислотные последовательности:

Полипептид 1:

Полипептид 2:

Несмотря на различный размер полипептида 1 (шесть вариабельных доменов) и полипептида 2 (два вариабельных домена), молекул антител а), b), с) и d) могли удовлетворительно экспрессироваться. Термическая стабильность и стабильность молекул очищенных антител a)-d) были очень хорошими. Все конструкты a)-d) связывались с линиями первичных NK-клеток Raji, Karpas-299 и МЕС-1 при проточной цитометрии.

е) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело (TeTrisAb_I), показанное на фиг. 3, имеющее специфичности к CD30, CD19 и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_H-V_H в первом полипептиде и парой доменов V_L-V_L во втором полипептиде; эта ориентация обеспечивает правильную гетеродимеризацию первого и второго полипептида.

Аминокислотные последовательности

Полипептид 1:

Полипептид 2:

f) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело (scTriFlex_2), показанное на фиг. 1, имеющее специфичности к CD30, CD19 и CD16A и состоящее из одного полипептида, содержащего восемь вариабельных доменов и His-маркер на С-конце. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована первой парой доменов V_H-V_H, ассоциированной со второй парой доменов V_L-V_L, расположенной рядом с ними в том же полипептиде. Пара V_H-V_H соединена с парой V_L-V_L линкером (G₂S)₆.

Аминокислотная последовательность:

g) Молекула четырехвалентного триспецифичного Fv-антитела (показанная на фиг. 2), имеющая специфичности κCD30, CD19 и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_L-V_L в первом полипептиде и парой доменов V_H-V_H во втором полипептиде, что обеспечивает правильную гетеродимеризацию полипептида 1 и полипептида 2.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

h) Молекула пятивалентного тетраспецифичного Fv-антитела (показанная на фиг. 6а), имеющая специфичности κCD30, CD19, EGFRvIII и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, содержащая два антигенсвязывающих сайта для CD16A, образована парой доменов V_L-V_L в первом полипептиде и парой доменов V_H-V_H во втором полипептиде, что обеспечивает правильную гетеродимеризацию полипептида 1 и полипептида 2.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

i) Молекула шестивалентного триспецифичного Fv-антитела (показанная на фиг. 5), имеющая специфичности κCD30, CD19 и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего десять вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего два вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы и содержащая два антигенсвязывающих сайта для CD16A, образована парой доменов V_L-V_L в первом полипептиде и парой доменов V_H-V_H во втором полипептиде, что обеспечивает правильную гетеродимеризацию полипептида 1 и полипептида 2.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

j) Молекула шестивалентного тетраспецифичного Fv-антитела (показанная на фиг. 7), имеющая специфичности κCD30, CD19, EGFRvIII и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой FLAG-маркер.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

k) Молекула пятивалентного триспецифичного Fv-антитела (показанная на фиг. 6b), имеющая специфичности κCD30, CD19 и CD16A, состоящая из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, содержащая два антигенсвязывающих сайта для CD16A, образована парой доменов V_L-V_L в первом полипептиде и парой доменов V_H-V_H во втором полипептиде, что обеспечивает правильную гетеродимеризацию полипептида 1 и полипептида 2.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

I) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело, показанное на фиг. 3, имеющее специфичности κCD30, CD19 и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего четыре вариабельных домена и С-концевой FLAG-маркер. Димерная единица диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована парой доменов V_L-V_L в первом полипептиде и парой доменов V_H-V_H во втором полипептиде; эта ориентация обеспечивает правильную гетеродимеризацию первого и второго полипептида.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

m) Шестивалентное тетраспецифичное Fv-антитело, показанное на фиг. 8а, имеющее специфичности κCD30, CD19, EGFRvIII и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой FLAG-маркер. Каждый из первого и второго полипептида содержит единицу scFv на С-конце.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

n) Шестивалентное тетраспецифичное Fv-антитело, показанное на фиг. 8b, имеющее специфичности κCD30, CD19, EGFRvIII и CD16A и состоящее из первого полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой His-маркер; и второго полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов и С-концевой FLAG-маркер. Каждый из первого и второго полипептида содержит единицу scFv на N-конце.

Полипептид 1:

Полипептид 2:

о) Четырехвалентное триспецифичное Fv-антитело, показанное на фиг. 1, имеющее специфичности κCD30, CD19 и CD16A и состоящее из одного полипептида, содержащего восемь вариабельных доменов и His-маркер на С-конце. Единица одноцепочечного диатела, расположенная в центральной части молекулы, образована первой парой доменов V_H-V_H, ассоциированной со второй парой доменов V_L-V_L, расположенной рядом с ними в том же полипептиде. Пара V_H-V_H соединена с парой V_L-V_L линкером (G₂S)₆.

Полипептид 1

р) Шестивалентное триспецифичное Fv-антитело, показанное на фиг. 4, имеющее специфичности κCD30, CD19 и CD16A и состоящее из одного полипептида, содержащего 12 вариабельных доменов и His-маркер на С-конце. Полипептид содержит три единицы одноцепочечного диатела, соединенные друг за другом.

Полипептид 1

ПРИМЕР 4

Оценка связывания клеток и цитотоксической активности, опосредованных молекулами триспецифичных антител

Процедуры исследования:

Клетки и культура клеток

Клетки CD19⁺/CD30⁺ МЕС-1 (DSMZ, № по каталогу: АСС 497), CD19⁺/CD30^- Raji (DSMZ, №по каталогу: АСС 319) и CD19^-/CD30⁺ KARPAS-299 (DSMZ, №по каталогу: АСС 31) культивировали при стандартных условиях в среде RPMI 1640 (№по каталогу: 21875-034) или IMDM (№ по каталогу: 12440-053) с добавлением 10% термически инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (№ по каталогу: 10270-106), 100 ед/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина (№ по каталогу: 1540-122) и 2 мМ L-глутамина (№ по каталогу: 25030-024; все реагенты приобретены в Invitrogen, Карлсруэ, Германия), в настоящем документе называемой полной средой RPMI, в соответствии с рекомендациями поставщика линий клеток.

МПК выделяли из лейкотромбоцитарного слоя крови здоровых добровольцев (German Red Cross, Мангейм, Германия) путем центрифугирования в градиенте плотности. Образцы лейкотромбоцитарного слоя разбавляли двух-трехкратным объемом PBS (Invitrogen, №по каталогу: 14190-169), наслаивали на Histopaque-1077 (Stemcell Technologies, №по каталогу: 07861) и центрифугировали при 800×g в течение 25 мин при комнатной температуре без использования торможения. МПК, расположенные на границе слоев, собирали и 3 раза промывали PBS перед использованием для обогащения NK-клеток. NK-клетки обогащали популяцией МПК с использованием набора для обогащения NK-клеток человека EasySep™ Human NK Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies, № по каталогу: 19055) для иммуномагнитного выделения интактных NK-клеток человека и Big Easy EasySep™ Magnet в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ связывания клеток и проточно-цитометрический анализ

Аликвоты указанных линий клеток инкубировали со 100 мкл последовательных разведений His-меченых антител в буфере для FACS (PBS, Invitrogen, № по каталогу: 14190-169), содержащем 2% термически активированную ЭТС (Invitrogen, №по каталогу: 10270-106), 0,1% азид натрия (Roth, Карлсруэ, Германия, №по каталогу: А1430.0100) в течение 45 мин на льду. Окрашивание NK-клеток выполняли в буфере для FACS с добавлением 1 мг/мл поликлональных антител человека (Gammanorm, Octapharma, Лангенфелд, Германия, № по каталогу: PZN-2451445) для блокирования связывания антител с Fc-рецепторами.

После повторной промывки буфером для FACS антитела, связанные с клетками, обнаруживали с использованием 10 мкг/мл мАт 13/45/31-2 против His (Dianova, Гамбург, Германия, № по каталогу: DIA910-1MG), а затем 15 мкг/мл конъюгированного с FITC антитела козы против антител мыши (Dianova, № по каталогу: 115-095-062). Затем клетки повторно промывали и ресуспендировали в 0,2 мл буфера для FACS, содержащего 2 мкг/мл иодида пропидия (PI) (Sigma, № по каталогу: Р4170) с целью исключения мертвых клеток. Флуоресценцию 2-5×10³ живых клеток измеряли с использованием проточного цитометра Beckman-Coulter FC500 MPL и программного обеспечения МХР (Beckman-Coulter, Крефельд, Германия) или проточного цитометра Millipore Guava EasyCyte (Merck Millipore, Швальбах, Германия). Среднюю интенсивность флуоресценции образцов клеток рассчитывали с использованием программного обеспечения СХР (Beckman-Coulter) или Incyte (Merck Millipore, Швальбах, Германия). После вычитания значений интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных только вторичными и третичными реагентами, значения использовали для анализа с использованием GraphPad Prism (GraphPad Prism версии 6.00 for Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Для расчета K_D использовали уравнение для одного сайта связывания (гиперболическое).

Анализ цитотоксичности

Для анализа цитотоксичности с высвобождением кальцеина клетки-мишени метили 10 мкМ кальцеина AM (Invitrogen, № по каталогу: С3100МР) в течение 30 мин в среде RPMI 1640 при 37°С, промывали и высевали 1×10⁴ клеток в отдельные лунки 96-луночного микропланшета вместе с эффекторными клетками в общем объеме 200 мкл при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (Е : Т) 5:1 в присутствии возрастающих концентраций антитела. После инкубации в течение указанных периодов времени при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО₂ измеряли флуоресценцию (F) кальцеина, высвобожденного в надосадочную жидкость, с помощью планшет-ридера при 520 нм (Victor 3, Perkin Elmer, Турку, Финляндия, № по каталогу: 1420-012). Удельный лизис клеток рассчитывали по формуле: [F(образец)-F(спонтанная)]/[F(максимальная)-F(спонтанная)]×100%. F(спонтанная) представляет собой флуоресценцию, высвобожденную из клеток-мишеней в отсутствие эффекторных клеток и антител, а F (максимальная) представляет собой полный лизис клеток, вызванный добавлением 1% тритона X 100 (Roth, Карлсруэ, Германия, № по каталогу: 3051.2). Кривые регрессии аппроксимировали для расчета ЕС₅₀ (GraphPad Prism версии 6.00 for Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США).

Активность молекул триспецифичных антител

Связывание молекул триспецифичных антител aTriFlex_101, aTriFlex_102, aTriFlex_103 и aTriFlex_104, описанных в примере 3, представляющих молекулу триспецифичного антитела, показанную на фигуре 2, содержащую вариабельные домены того же антитела, расположенные в другой ориентации (см. пример 3а), 3b), 3с) и 3d)), продемонстрировали на однократно положительных клетках CD19+/CD30- Raji и CD19-/CD30+ KARPAS-299, а также дважды положительных клетках CD19+/CD30+ МЕС-1 с помощью проточной цитометрии. Константы диссоциации для CD19 находились в диапазоне от 6 до 64 нМ, а для CD30 - от 16 до 45 нМ (фигура 12). На дважды положительных клетках МЕС-1 наблюдали константы диссоциации в диапазоне от 9 до 47 нМ, что в целом подтверждало данные, полученные для однократно положительных клеток Raji и KARPAS-299, соответственно.

При анализах цитотоксичности наблюдали значения EC₅₀ в диапазоне 89-580 пМ на однократно положительных клетках CD30+/CD19- Raji и 155-952 пМ на клетках CD19-/CD30+ KARPAS-299. На дважды положительных клетках CD19+/CD30+ МЕС-1 наблюдали значения EC₅₀ в диапазоне 67-235 мкМ, что означало 11-кратное увеличение активности (фигура 13).

В целом молекулы триспецифичных антител демонстрировали аналогичную активность по отношению к линиям клеток, протестированным в данном исследовании; однако при использовании других пар антигенов плотность и геометрия антигена может оказывать более сильное влияние на активность конструктов, что приведет к более выраженному увеличению кажущегося сродства к дважды положительным клеткам по сравнению с однократно положительными клетками.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Affimed GmbH

<120> МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ FV-АНТИТЕЛА

<130> A 3305PCT

<150> EP 15189665.1

<151> 13.10.2015

<160> 40

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 780

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

275 280 285

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

305 310 315 320

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

385 390 395 400

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

420 425 430

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

450 455 460

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

485 490 495

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala

515 520 525

Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser

530 535 540

Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

545 550 555 560

Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

565 570 575

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

580 585 590

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp

595 600 605

Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

610 615 620

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

625 630 635 640

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

645 650 655

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr

660 665 670

Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

675 680 685

Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met

690 695 700

Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser

705 710 715 720

Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

725 730 735

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr

740 745 750

Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

755 760 765

Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

770 775 780

<210> 2

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 2

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala

115 120 125

Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser

130 135 140

Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu

145 150 155 160

Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

165 170 175

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr

180 185 190

Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr

195 200 205

Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala

210 215 220

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

225 230

<210> 3

<211> 780

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 3

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His

85 90 95

Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

260 265 270

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

275 280 285

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

290 295 300

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser

305 310 315 320

Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp

325 330 335

Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu

340 345 350

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp

355 360 365

Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

385 390 395 400

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala

405 410 415

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala

420 425 430

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly

435 440 445

Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg

450 455 460

Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

465 470 475 480

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr

485 490 495

Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

515 520 525

Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys

530 535 540

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln

545 550 555 560

Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser

565 570 575

Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr

580 585 590

Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr

595 600 605

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly

610 615 620

Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

625 630 635 640

Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

645 650 655

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe

660 665 670

Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser

675 680 685

Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

690 695 700

Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val

705 710 715 720

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

725 730 735

Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln

740 745 750

Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

755 760 765

Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

770 775 780

<210> 4

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 4

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala

115 120 125

Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser

130 135 140

Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu

145 150 155 160

Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

165 170 175

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr

180 185 190

Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr

195 200 205

Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala

210 215 220

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

225 230

<210> 5

<211> 752

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 5

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His

85 90 95

Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser

260 265 270

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His

275 280 285

Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

290 295 300

Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile

305 310 315 320

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

325 330 335

Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

340 345 350

Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

355 360 365

Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln

370 375 380

Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys

385 390 395 400

Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg

405 410 415

Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro

420 425 430

Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

435 440 445

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

450 455 460

Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys

465 470 475 480

Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln

485 490 495

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

500 505 510

Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His

515 520 525

Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

530 535 540

Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys

545 550 555 560

Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu

565 570 575

Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg

580 585 590

Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

595 600 605

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

625 630 635 640

Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr

645 650 655

Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln

660 665 670

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg

675 680 685

Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

690 695 700

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr

705 710 715 720

Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr

725 730 735

Lys Leu Glu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

740 745 750

<210> 6

<211> 262

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr

245 250 255

Lys Asp Asp Asp Asp Lys

260

<210> 7

<211> 754

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

290 295 300

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

325 330 335

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

370 375 380

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

405 410 415

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

435 440 445

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

450 455 460

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

485 490 495

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn

500 505 510

Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

515 520 525

Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile

530 535 540

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

545 550 555 560

Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

565 570 575

Gly Thr Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

580 585 590

Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

595 600 605

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser

610 615 620

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys

625 630 635 640

Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln

645 650 655

Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp

660 665 670

Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser

675 680 685

Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys

690 695 700

Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr

705 710 715 720

Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

725 730 735

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

740 745 750

Asp Lys

<210> 8

<211> 260

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His

245 250 255

His His His His

260

<210> 9

<211> 494

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

115 120 125

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

130 135 140

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

145 150 155 160

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

165 170 175

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

180 185 190

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

195 200 205

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

210 215 220

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

245 250 255

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

260 265 270

Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

275 280 285

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser

290 295 300

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

305 310 315 320

Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

325 330 335

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala

340 345 350

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val

370 375 380

Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn

385 390 395 400

Ile Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

405 410 415

Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro

420 425 430

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile

435 440 445

Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly

450 455 460

Thr Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

465 470 475 480

Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

485 490

<210> 10

<211> 499

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

130 135 140

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

165 170 175

Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp

210 215 220

Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser

245 250 255

Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly

260 265 270

His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly

275 280 285

Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly

290 295 300

Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

305 310 315 320

Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

325 330 335

Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

340 345 350

Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

355 360 365

Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser

370 375 380

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val

385 390 395 400

Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro

405 410 415

Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr

420 425 430

Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser

435 440 445

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp

450 455 460

Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

465 470 475 480

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp

485 490 495

Asp Asp Lys

<210> 11

<211> 1019

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

275 280 285

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

305 310 315 320

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

385 390 395 400

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

420 425 430

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

450 455 460

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

485 490 495

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu

515 520 525

Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile

530 535 540

Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys

565 570 575

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

580 585 590

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp

595 600 605

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly

610 615 620

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

625 630 635 640

Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr

645 650 655

Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His

660 665 670

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln

675 680 685

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn

690 695 700

Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp

705 710 715 720

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe

725 730 735

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

740 745 750

Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro

755 760 765

Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys

770 775 780

Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val

785 790 795 800

Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

805 810 815

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu

820 825 830

Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser

835 840 845

Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

850 855 860

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

865 870 875 880

Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

885 890 895

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser

900 905 910

Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly

915 920 925

Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr

930 935 940

Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile

945 950 955 960

Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

965 970 975

Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr

980 985 990

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

995 1000 1005

Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

1010 1015

<210> 12

<211> 749

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

290 295 300

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

325 330 335

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

370 375 380

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

405 410 415

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

435 440 445

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

450 455 460

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

485 490 495

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

500 505 510

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro

515 520 525

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp

530 535 540

Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp

545 550 555 560

Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser

565 570 575

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

580 585 590

Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

595 600 605

Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

610 615 620

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

625 630 635 640

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

645 650 655

Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

660 665 670

Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

675 680 685

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

690 695 700

Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr

705 710 715 720

Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

725 730 735

Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

740 745

<210> 13

<211> 262

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr

245 250 255

Lys Asp Asp Asp Asp Lys

260

<210> 14

<211> 749

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

290 295 300

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

325 330 335

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

370 375 380

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

405 410 415

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

435 440 445

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

450 455 460

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

485 490 495

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

500 505 510

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro

515 520 525

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp

530 535 540

Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp

545 550 555 560

Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser

565 570 575

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

580 585 590

Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

595 600 605

Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

610 615 620

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

625 630 635 640

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

645 650 655

Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

660 665 670

Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

675 680 685

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

690 695 700

Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr

705 710 715 720

Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

725 730 735

Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

740 745

<210> 15

<211> 522

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro

260 265 270

Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln

275 280 285

Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val

290 295 300

Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

305 310 315 320

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

325 330 335

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly

340 345 350

Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

355 360 365

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

385 390 395 400

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser

405 410 415

Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly

420 425 430

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr

435 440 445

Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile

450 455 460

Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

465 470 475 480

Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe

485 490 495

Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

500 505 510

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

515 520

<210> 16

<211> 1264

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser

130 135 140

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

145 150 155 160

Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

165 170 175

Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp

180 185 190

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His

210 215 220

Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

260 265 270

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp

290 295 300

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr

305 310 315 320

Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

325 330 335

Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr

355 360 365

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

385 390 395 400

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys

405 410 415

Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro

420 425 430

Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

435 440 445

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

450 455 460

Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys

465 470 475 480

Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

485 490 495

Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu

500 505 510

Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile

515 520 525

Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln

530 535 540

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys

545 550 555 560

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

565 570 575

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp

580 585 590

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly

595 600 605

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

610 615 620

Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr

625 630 635 640

Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His

645 650 655

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln

660 665 670

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn

675 680 685

Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp

690 695 700

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe

705 710 715 720

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

725 730 735

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

740 745 750

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

755 760 765

Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

770 775 780

Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro

785 790 795 800

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr

805 810 815

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

820 825 830

Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala

835 840 845

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

850 855 860

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

865 870 875 880

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn

885 890 895

Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

900 905 910

Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile

915 920 925

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

930 935 940

Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

945 950 955 960

Gly Thr Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

965 970 975

Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

980 985 990

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser

995 1000 1005

Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys

1010 1015 1020

Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val

1025 1030 1035

Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp

1040 1045 1050

Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln

1055 1060 1065

Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

1070 1075 1080

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

1085 1090 1095

Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

1100 1105 1110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser

1115 1120 1125

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser

1130 1135 1140

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly

1145 1150 1155

Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

1160 1165 1170

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro

1175 1180 1185

Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr

1190 1195 1200

Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp

1205 1210 1215

Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val

1220 1225 1230

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser

1235 1240 1245

His His His His His His Ala Arg Thr Ile Phe Ile Cys Ile Ala

1250 1255 1260

Leu

<210> 17

<211> 262

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

180 185 190

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr

245 250 255

Lys Asp Asp Asp Asp Lys

260

<210> 18

<211> 749

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

290 295 300

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

325 330 335

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

370 375 380

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

405 410 415

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

435 440 445

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

450 455 460

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

485 490 495

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

500 505 510

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro

515 520 525

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp

530 535 540

Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp

545 550 555 560

Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser

565 570 575

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

580 585 590

Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

595 600 605

Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

610 615 620

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

625 630 635 640

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

645 650 655

Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

660 665 670

Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

675 680 685

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

690 695 700

Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr

705 710 715 720

Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

725 730 735

Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

740 745

<210> 19

<211> 778

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

275 280 285

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

305 310 315 320

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

385 390 395 400

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

420 425 430

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

450 455 460

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

485 490 495

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser

515 520 525

Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys

530 535 540

Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

545 550 555 560

Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

565 570 575

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val

580 585 590

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser

595 600 605

Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

610 615 620

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

625 630 635 640

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

645 650 655

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr

660 665 670

Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

675 680 685

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg

690 695 700

Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

705 710 715 720

Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

725 730 735

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala

740 745 750

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

755 760 765

Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

770 775

<210> 20

<211> 749

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile

290 295 300

Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

325 330 335

Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

370 375 380

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

385 390 395 400

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

405 410 415

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

420 425 430

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

435 440 445

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

450 455 460

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

485 490 495

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

500 505 510

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro

515 520 525

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp

530 535 540

Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp

545 550 555 560

Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser

565 570 575

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly

580 585 590

Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

595 600 605

Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

610 615 620

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

625 630 635 640

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

645 650 655

Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

660 665 670

Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

675 680 685

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

690 695 700

Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr

705 710 715 720

Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

725 730 735

Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

740 745

<210> 21

<211> 519

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

275 280 285

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

305 310 315 320

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

385 390 395 400

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

420 425 430

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

450 455 460

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

485 490 495

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp

500 505 510

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

515

<210> 22

<211> 497

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

130 135 140

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

145 150 155 160

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

195 200 205

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

210 215 220

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser

245 250 255

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His

260 265 270

Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

275 280 285

Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile

290 295 300

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

305 310 315 320

Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

325 330 335

Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

340 345 350

Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

355 360 365

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys

370 375 380

Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg

385 390 395 400

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly

405 410 415

Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile

420 425 430

Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu

435 440 445

Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr

450 455 460

Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

465 470 475 480

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His

485 490 495

His

<210> 23

<211> 493

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 23

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His

85 90 95

Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

130 135 140

Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

145 150 155 160

Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala

165 170 175

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr

210 215 220

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

245 250 255

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

260 265 270

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

275 280 285

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

290 295 300

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

305 310 315 320

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

325 330 335

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

340 345 350

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

355 360 365

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met

370 375 380

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

385 390 395 400

Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

405 410 415

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

420 425 430

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

435 440 445

Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

450 455 460

His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

465 470 475 480

Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

485 490

<210> 24

<211> 757

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

130 135 140

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

145 150 155 160

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

195 200 205

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

210 215 220

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser

245 250 255

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His

260 265 270

Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

275 280 285

Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile

290 295 300

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

305 310 315 320

Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

325 330 335

Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

340 345 350

Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

355 360 365

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys

370 375 380

Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg

385 390 395 400

Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly

405 410 415

Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile

420 425 430

Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu

435 440 445

Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr

450 455 460

Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

465 470 475 480

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

485 490 495

Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr

500 505 510

Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr

515 520 525

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys

530 535 540

Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser

545 550 555 560

Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp

565 570 575

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu

580 585 590

Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

625 630 635 640

Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser

645 650 655

Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

660 665 670

Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser

675 680 685

Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala

690 695 700

Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

705 710 715 720

Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp

725 730 735

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His

740 745 750

His His His His His

755

<210> 25

<211> 753

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 25

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His

85 90 95

Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

130 135 140

Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

145 150 155 160

Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala

165 170 175

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr

210 215 220

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

245 250 255

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

260 265 270

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

275 280 285

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

290 295 300

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

305 310 315 320

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

325 330 335

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

340 345 350

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

355 360 365

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met

370 375 380

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

385 390 395 400

Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

405 410 415

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

420 425 430

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

435 440 445

Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

450 455 460

His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

465 470 475 480

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro

485 490 495

Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser

500 505 510

Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

515 520 525

Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

530 535 540

Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr

545 550 555 560

Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

565 570 575

Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly

580 585 590

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

610 615 620

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser

625 630 635 640

Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val

645 650 655

Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro

660 665 670

Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr

675 680 685

Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser

690 695 700

Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Ser

705 710 715 720

Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

725 730 735

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

740 745 750

Lys

<210> 26

<211> 754

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr

130 135 140

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr

145 150 155 160

Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg

180 185 190

Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr

195 200 205

Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly

225 230 235 240

Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

260 265 270

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr

275 280 285

Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp

290 295 300

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn

305 310 315 320

Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala

325 330 335

Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala

355 360 365

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

385 390 395 400

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile

405 410 415

Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

420 425 430

Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

435 440 445

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

450 455 460

Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp

465 470 475 480

Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

485 490 495

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser

500 505 510

Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly

515 520 525

His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly

530 535 540

Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly

545 550 555 560

Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

565 570 575

Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

580 585 590

Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

595 600 605

Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

610 615 620

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser

625 630 635 640

Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val

645 650 655

Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro

660 665 670

Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr

675 680 685

Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser

690 695 700

Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr

705 710 715 720

Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

725 730 735

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His

740 745 750

His His

<210> 27

<211> 750

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr

130 135 140

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr

145 150 155 160

Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg

180 185 190

Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr

195 200 205

Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly

225 230 235 240

Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly

260 265 270

Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr

275 280 285

Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val

290 295 300

Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala

325 330 335

Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp

340 345 350

His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

370 375 380

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

385 390 395 400

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

405 410 415

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

420 425 430

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

435 440 445

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

450 455 460

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

465 470 475 480

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

500 505 510

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

515 520 525

Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

530 535 540

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

565 570 575

Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr

580 585 590

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala

595 600 605

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser

610 615 620

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe

625 630 635 640

Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser

645 650 655

Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

660 665 670

Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val

675 680 685

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

690 695 700

Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln

705 710 715 720

Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

725 730 735

Asn Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

740 745 750

<210> 28

<211> 1016

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

210 215 220

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

275 280 285

Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys

305 310 315 320

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly

355 360 365

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

385 390 395 400

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

420 425 430

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

450 455 460

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

465 470 475 480

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

485 490 495

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu

515 520 525

Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile

530 535 540

Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys

565 570 575

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

580 585 590

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp

595 600 605

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly

610 615 620

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

625 630 635 640

Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr

645 650 655

Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His

660 665 670

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln

675 680 685

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn

690 695 700

Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp

705 710 715 720

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe

725 730 735

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

740 745 750

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

755 760 765

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

770 775 780

Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

785 790 795 800

Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro

805 810 815

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr

820 825 830

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

835 840 845

Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala

850 855 860

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

865 870 875 880

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

885 890 895

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

900 905 910

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

915 920 925

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

930 935 940

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

945 950 955 960

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

965 970 975

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His

980 985 990

Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala

995 1000 1005

Gly Ser His His His His His His

1010 1015

<210> 29

<211> 1521

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser

130 135 140

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

145 150 155 160

Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

165 170 175

Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp

180 185 190

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His

210 215 220

Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

260 265 270

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp

290 295 300

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr

305 310 315 320

Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

325 330 335

Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr

355 360 365

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

385 390 395 400

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys

405 410 415

Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro

420 425 430

Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

435 440 445

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

450 455 460

Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys

465 470 475 480

Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

485 490 495

Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

500 505 510

Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val

515 520 525

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp

530 535 540

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn

545 550 555 560

Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val

565 570 575

Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser

580 585 590

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser

595 600 605

Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

610 615 620

Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln

625 630 635 640

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys

645 650 655

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

660 665 670

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile

675 680 685

Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg

690 695 700

Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

705 710 715 720

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

725 730 735

Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

740 745 750

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

755 760 765

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser

770 775 780

Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His

785 790 795 800

Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

805 810 815

Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile

820 825 830

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr

835 840 845

Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val

850 855 860

Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

865 870 875 880

Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln

885 890 895

Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys

900 905 910

Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg

915 920 925

Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro

930 935 940

Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

945 950 955 960

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

965 970 975

Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys

980 985 990

Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln

995 1000 1005

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu

1010 1015 1020

Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp

1025 1030 1035

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

1040 1045 1050

Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser

1055 1060 1065

Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr

1070 1075 1080

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met

1085 1090 1095

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr

1100 1105 1110

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1115 1120 1125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr

1130 1135 1140

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile

1145 1150 1155

Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr

1160 1165 1170

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp

1175 1180 1185

Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn

1190 1195 1200

Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

1205 1210 1215

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp

1220 1225 1230

His Leu Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

1235 1240 1245

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1250 1255 1260

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

1265 1270 1275

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

1280 1285 1290

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met

1295 1300 1305

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp

1310 1315 1320

Ser Asp Thr Met Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile

1325 1330 1335

Ser Ala Asp Glu Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser

1340 1345 1350

Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu

1355 1360 1365

Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

1370 1375 1380

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1385 1390 1395

Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val

1400 1405 1410

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile

1415 1420 1425

Gly Ser Lys Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

1430 1435 1440

Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile

1445 1450 1455

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

1460 1465 1470

Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

1475 1480 1485

Gln Val Gly Thr Asp Trp Ser Asp His Leu Gln Val Phe Gly Gly

1490 1495 1500

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly Ser His His His

1505 1510 1515

His His His

1520

<210> 30

<211> 767

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

130 135 140

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

165 170 175

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

210 215 220

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

260 265 270

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

275 280 285

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

290 295 300

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

305 310 315 320

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

370 375 380

Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

385 390 395 400

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro

405 410 415

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp

420 425 430

Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp

435 440 445

Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser

450 455 460

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn

465 470 475 480

Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

485 490 495

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

500 505 510

Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys

515 520 525

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln

530 535 540

Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser

545 550 555 560

Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr

565 570 575

Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr

580 585 590

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly

595 600 605

Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

610 615 620

Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

625 630 635 640

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser

645 650 655

Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys

660 665 670

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys

675 680 685

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr

690 695 700

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

705 710 715 720

Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe

725 730 735

Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

740 745 750

Leu Glu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

755 760 765

<210> 31

<211> 251

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 31

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro

85 90 95

Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

115 120 125

Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

130 135 140

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr

165 170 175

Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

180 185 190

Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

195 200 205

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe

210 215 220

Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

225 230 235 240

Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

245 250

<210> 32

<211> 769

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

130 135 140

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

165 170 175

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

210 215 220

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

260 265 270

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

290 295 300

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

305 310 315 320

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

325 330 335

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

355 360 365

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

385 390 395 400

Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu

405 410 415

Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

420 425 430

Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

435 440 445

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser

450 455 460

Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp

465 470 475 480

Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr

485 490 495

Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln

500 505 510

Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser

515 520 525

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val

530 535 540

Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro

545 550 555 560

Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr

565 570 575

Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser

580 585 590

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp

595 600 605

Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

610 615 620

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

625 630 635 640

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

645 650 655

Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val

660 665 670

Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln

675 680 685

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr

690 695 700

Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr

705 710 715 720

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu

725 730 735

Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

740 745 750

Thr Lys Leu Glu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His

755 760 765

His

<210> 33

<211> 249

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro

130 135 140

Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys

145 150 155 160

Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln

195 200 205

Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser

210 215 220

Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

245

<210> 34

<211> 781

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

130 135 140

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

165 170 175

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

210 215 220

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

260 265 270

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

275 280 285

Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

290 295 300

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr

305 310 315 320

Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr

325 330 335

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

340 345 350

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp

355 360 365

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

385 390 395 400

Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr

405 410 415

Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys

420 425 430

Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg

435 440 445

Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

450 455 460

Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr

465 470 475 480

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala

485 490 495

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

500 505 510

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala

515 520 525

Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

530 535 540

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro

545 550 555 560

Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr

565 570 575

Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp

580 585 590

Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu

595 600 605

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr

610 615 620

Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

625 630 635 640

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

645 650 655

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys

660 665 670

Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala

675 680 685

Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly

690 695 700

Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly

705 710 715 720

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

725 730 735

Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln

740 745 750

Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

755 760 765

Ile Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His

770 775 780

<210> 35

<211> 237

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 35

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro

85 90 95

Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val

115 120 125

Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn

130 135 140

Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro

165 170 175

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile

180 185 190

Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp

195 200 205

Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

210 215 220

Ala Ala Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

225 230 235

<210> 36

<211> 755

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

130 135 140

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

145 150 155 160

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

165 170 175

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile

180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

210 215 220

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val

260 265 270

Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly

275 280 285

Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val

290 295 300

Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

305 310 315 320

Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser

370 375 380

Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp

385 390 395 400

Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

405 410 415

Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile

420 425 430

Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr

435 440 445

Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser

450 455 460

Ala Asp Ser Ser Gly Thr Pro Leu Ile Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys

465 470 475 480

Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln

485 490 495

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

500 505 510

Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His

515 520 525

Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

530 535 540

Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys

545 550 555 560

Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu

565 570 575

Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg

580 585 590

Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

595 600 605

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

610 615 620

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Val

625 630 635 640

Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

645 650 655

Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

660 665 670

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ser Ala

675 680 685

Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

690 695 700

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu

705 710 715 720

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

725 730 735

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Ala Ala Ala Gly Ser His His His

740 745 750

His His His

755

<210> 37

<211> 263

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> полипептид Fv

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ser Ser Trp Thr Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln

180 185 190

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

195 200 205

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Asp

245 250 255

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

260

<210> 38

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> FLAG-маркер

<400> 38

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Маркер STREP II

<400> 39

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 40

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> C-маркер

<400> 40

Glu Pro Glu Ala

1

<---

Настоящее изобретение относится к биохимии и иммунологии, в частности к молекуле триспецифичного антитела, содержащего единицу диатела, встроенную в полипептидную цепь, содержащую по меньшей мере шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом. В некоторых случаях два одноцепочечных Fv-фрагмента соединены дистально с единицей диатела с образованием двух дополнительных антигенсвязывающих сайтов. Антигенсвязывающая молекула может являться мономером одиночного полипептида или мультимерным полипептидом. Изобретение может применяться для нацеленного воздействия на два различных опухолевых антигена, причем третья специфичность активирует цитотоксическое действие эффекторных клеток, либо связывать две эффекторные клетки и один опухолевый антиген. Изобретение можно применять различными способами для изменения мишеней цитотоксического потенциала эффекторных клеток иммунной системы для уничтожения опухолевых клеток или инфекционных агентов. 16 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Мультивалентное Fv-антитело для обеспечения по меньшей мере четырех антигенсвязывающих сайтов для связывания антигенов, содержащее единицу диатела,

состоящую из двух пар вариабельных доменов, причем одна пара представляет собой пару вариабельных доменов легкой цепи (VL-VL), соединенных друг за другом в полипептид пептидным линкером, состоящим из 12 или менее аминокислотных остатков, а другая пара представляет собой пару вариабельных доменов тяжелой цепи (VH-VH), соединенных друг за другом в полипептид пептидным линкером, состоящим из 12 или менее аминокислотных остатков, причем пара VL-VL и пара VH-VH ассоциируют в два антигенсвязывающих сайта, и по меньшей мере одна пара вариабельных доменов встроена в полипептид, содержащий по меньшей мере шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом, причем

I)

(а) указанная одна пара вариабельных доменов встроена в первый полипептид, содержащий шесть вариабельных доменов, причем указанный первый полипептид содержит на N-конце scFv-единицу, соединенную с указанной одной парой вариабельных доменов, и на C-конце scFv-единицу, соединенную с указанной одной парой вариабельных доменов, и указанная одна пара вариабельных доменов ассоциирует с указанной другой парой вариабельных доменов во втором полипептиде, который состоит из двух вариабельных доменов;

(b) указанная одна пара вариабельных доменов встроена в первый полипептид, содержащий десять вариабельных доменов, причем указанный первый полипептид содержит на N-конце единицу одноцепочечного диатела, соединенную с указанной одной парой вариабельных доменов, и единицу одноцепочечного диатела на C-конце, соединенную с указанной одной парой вариабельных доменов, и указанная одна пара вариабельных доменов ассоциирует с другой парой вариабельных доменов во втором полипептиде, который состоит из указанных двух вариабельных доменов;

(c) в первом полипептиде, содержащем шесть вариабельных доменов, scFv-единица соединена по N-концу и scFv-единица соединена по C-концу с указанной парой вариабельных доменов легкой цепи (VL-VL), и во втором полипептиде scFv-единица соединена по N-концу и scFv-единица соединена по C-концу с указанной парой вариабельных тяжелых цепей (VH-VH); или

(d) указанное Fv-антитело состоит из единственного полипептида, содержащего восемь вариабельных доменов, и указанная одна пара из двух вариабельных доменов встроена в полипептид, причем указанный полипептид содержит на N-конце scFv-единицу, соединенную с указанной одной парой вариабельных доменов, и на C-конце scFv-единицу, соединенную с указанной другой парой вариабельных доменов, причем указанная одна пара вариабельных доменов соединена по С-концу с указанной другой парой вариабельных доменов линкером из более чем 12 аминокислотных остатков, и указанная одна пара вариабельных доменов ассоциирует с другой парой из двух вариабельных доменов указанного полипептида, и при этом

II) указанное одноцепочечное диатело состоит из первой пары вариабельных доменов, соединенных линкером из более чем 12, предпочтительно от 15 до 50 аминокислотных остатков, и каждая пара вариабельных доменов соединена линкером из 12 или менее аминокислотных остатков;

scFv-единица состоит из вариабельного домена легкой цепи, и вариабельного домена тяжелой цепи, соединенных линкером из 12 или более, предпочтительно, от 15 до 50 аминокислотных остатков.

2. Мультивалентное Fv-антитело по п. 1, характеризующееся тем, что Fv-антитело является четырехвалентным.

3. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1 или 2, характеризующееся тем, что указанное антитело является триспецифичным.

4. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-3, характеризующееся тем, что указанные пептидные линкеры содержат остатки глицина и серина.

5. Мультивалентное Fv-антитело по п. 4, характеризующееся тем, что указанный пептидный линкер представляет собой линкер (G2S)X, где x=1-10.

6. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что в указанной единице одноцепочечного диатела вариабельные домены расположены в порядке VL-VH-VL-VH, VL-VL-VH-VH, VH-VH-VL-VL или VH-VL-VH-VL.

7. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что в scFv-единице вариабельные домены расположены как VL-VH или VH-VL.

8. Мультивалентное Fv-антитело по п. 1, характеризующееся тем, что указанный полипептид содержит шесть вариабельных доменов, соединенных друг за другом от N-конца до C-конца, причем первый и второй вариабельные домены образуют scFv-единицу на N-конце, где указанная scFv-единица на N-конце соединена по C-концу с третьим вариабельным доменом, указанный третий вариабельный домен соединен пептидным линкером, состоящим из 12 или менее аминокислотных остатков с четвертым вариабельным доменом, четвертый вариабельный домен соединен по C-концу с scFv-единицей на C-конце, и указанная scFv-единица образована пятым и шестым вариабельными доменами, причем вариабельные домены расположены от N-конца к С-концу в ориентации, выбранной из:

(a) VH-VL-VH-VH-VL-VH (первый полипептид) и VL-VL (второй полипептид);

(b) VL-VH-VH-VH-VH-VL (первый полипептид) и VL-VL (второй полипептид);

(c) VH-VL-VL-VL-VH-VL (первый полипептид) и VH-VH (второй полипептид);

(d) VL-VH-VL-VL-VH-VL (первый полипептид) и VH-VH (второй полипептид); или

(e) VH-VL-VL-VL-VL-VH (первый полипептид) и VH-VH (второй полипептид).

9. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-8, характеризующееся тем, что указанные вариабельные домены в указанной единице диатела имеют одну и ту же эпитопную специфичность или различные эпитопные специфичности.

10. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-9, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело обладает специфичностью к антигену, присутствующему на эффекторной клетке иммунной системы.

11. Мультивалентное Fv-антитело по п. 10, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело содержит два антигенсвязывающих сайта, обладающих специфичностью к одному и тому же типу эффекторной клетки иммунной системы.

12. Мультивалентное Fv-антитело по п. 11, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело является триспецифичным и двухвалентно связывается с эффекторной клеткой иммунной системы.

13. Мультивалентное Fv-антитело по п. любому из пп. 9-12, характеризующееся тем, что антиген выбран из CD3, CD16 и CD16A.

14. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-13, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело имеет по меньшей мере одну специфичность к опухолевому антигену.

15. Мультивалентное Fv-антитело по п. 14, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело имеет специфичности к двум опухолевым антигенам.

16. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 10-15, характеризующееся тем, что указанное Fv-антитело имеет по меньшей мере одну специфичность к вирусному антигену.

17. Мультивалентное Fv-антитело по любому из пп. 1-16 для применения в качестве медикамента.