ОДНОВРЕМЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ И ИНДУКЦИЯ ГАПЛОИДОВ Российский патент 2023 года по МПК C12N9/22 C12N15/09 C12N15/63 A01H1/00 A01H1/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к сельскохозяйственной биотехнологии и редактированию генов, а также к селекции растений. Раскрытый в данном документе объект изобретения относится к применению индуцирующей гаплоиды линии (или существующей, или созданной) и трансформации индуцирующей гаплоиды линии с тем, чтобы она содержала ДНК, кодирующую клеточный механизм, способный к редактированию генов.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка сопровождается перечнем последовательностей под названием 81189_ST25.txt, созданным 4 декабря 2017 г., размером примерно 334 килобайта. Этот перечень последовательностей включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Этот перечень последовательностей подается вместе с настоящей заявкой посредством EFS-Web и соответствует 1.824(а)(2)-(6) и (b) разделу 37 C.F.R.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целенаправленный мутагенез (также известный как "редактирование генов") является очень важной технологией для селекции сельскохозяйственных культур. В настоящее время существует множество способов редактирования конкретных генов-мишеней, в том числе CRISPR, TALEN, мегануклеазы и "цинковые пальцы". Одним из способов введения редактирующего механизма в растения является использование Agrobacterium или биолистической трансформации растительной ткани. При трансформации ДНК, кодирующую редактирующий механизм (например, CAS9 и направляющую РНК), вводят в каллюс растения, семя или эмбриональную ткань. Затем стабильно трансформированные растения ("трансгенные объекты") регенерируют, в ряде случаев с помощью селектируемого маркера. Но поскольку тканевая культура является генотип-зависимой, то этот способ не будет функционировать со всеми сельскохозяйственными культурами или даже со всеми сортами сельскохозяйственных культур, с которыми он работает. Они известны как неподдающиеся трансформации сельскохозяйственные культуры или сорта. Эти сельскохозяйственные культуры или сорта могут быть оценены за их эффективность, однако для биотехнологии проблема заключается в том, что они не могут быть трансформированы, а следовательно, не могут быть непосредственно отредактированы посредством трансформации. Для неподатливых сортов можно использовать один из двух альтернативных подходов для введения требуемых мутаций. Во-первых, можно внести изменения посредством интрогрессии признака. Этот способ дорогой, трудоемкий и времязатратный. Это также означает загрязненность конечного продукта из-за генетической связи, т.е. будет связанный блок, окружающий интрогрессированные изменения, содержащий гены и аллели из трансформируемой донорной линии. Эта связь может представлять проблему, если какой-либо из этих генов или аллелей влияет на эффективность неподдающейся трансформации линии (может также называться "элитной линией"). Во-вторых, можно временно ввести редактирующий механизм в растущее растение без тканевой культуры, как, например, погружение цветочных почек для трансформации Arabidopsis. Задача состоит в том, чтобы обеспечить внесение изменений в клетки, которые обеспечивают образование зародышевых линий, чтобы они передавались семенам потомков. Существует несколько общепринятых или рутинных способов проведения этого в сельскохозяйственных культурах.

В данном документе представлен новый способ временного введения редактирующего механизма во время индукции гаплоидов. Индукция гаплоидов ("HI") представляет собой класс явлений у растений, характеризующихся потерей одного родительского набора хромосом (хромосом от родительского растения, являющегося индуктором гаплоидов) из зародыша в какой-либо период времени в ходе или после оплодотворения, часто в ходе раннего развития зародыша. Индукция гаплоидов также известна под название гиногенез, если линия-индуктор используется в качестве мужской при скрещивании, или андрогенез, если линия-индуктор используется в качестве женской при скрещивании. Индукция гаплоидов наблюдалась у многих видов растений, таких как сорго, ячмень, пшеница, маис, Arabidopsis, и у многих других видов.

Как правило, в ходе индукции гаплоидов обе родительские линии, используемые в индуцирующем скрещивании, являются диплоидами, поэтому их гаметы (яйцеклетки и спермии) являются гаплоидами. Индукция гаплоидов часто является признаком средней или низкой проницаемости линии-индуктора, поэтому полученные в результате потомки, в зависимости от вида или ситуации, могут быть или диплоидным (если потеря генома не происходит), или гаплоидным (если потеря генома в действительности происходит). Если родительская линия, которую скрещивают с индуктором гаплоидов, не является диплоидной, а скорее тетраплоидной, гексаплоидной или другим растением с более высокой плоидностью, то термин "индукция гаплоидов" является в некоторой степени неверным, потому что полученное "гаплоидное" потомство будет иметь гаметическое число хромосом, а значит, в действительности они будут не гаплоидами, а диплоидами (если родительский набор тетраплоидный) или триплоидами (если родительский набор гексаплоидный) и т.д. Следовательно, используемые в данном документе "гаплоиды" обладают половиной количества хромосом из любого родительского набора; таким образом, гаплоиды диплоидных организмов (например, маиса) проявляют моноплоидию; гаплоиды тетраплоидных организмов (например, райграса) проявляют диплоидию; гаплоиды гексаплоидных организмов (например, пшеницы) проявляют триплоидию.

Индукция гаплоидов может происходить во время самоопыления или взаимного скрещивания двух линий в пределах одного и того же вида, или она может происходить во время широких скрещиваний, где ее можно рассматривать как барьер гибридизации, предотвращающий образование межвидовых гибридов. У маиса наиболее часто используемым способом индуцирования гаплоидов является использование линии мужских растений, являющейся внутривидовым индуктором гаплоидов, которая в основном вызывается перестройками, мутациями и/или рекомбинациями, вставками или делециями в участке хромосомы 1, в частности гена MATRILINEAL (MATL), также известного под названием NOT LIKE DAD1 (NLD1) и PHOSPHOLIPASE A1 (PLA1) (c заметным исключением индукции гаплоидов ig-типа, которая является результатом мутации в гене INDETERMINATE GAMETOPHYTEI на хромосоме 3). У пшеницы наиболее часто используемым способом индукции гаплоидов является широкое скрещивание с пыльцой маиса, независимо от родительского генотипа или происхождения, причем он работает практически с любой пшеницей, скрещенной почти с любой пыльцой маиса.

Линии маиса HI содержат локус количественного признака ("QTL") на хромосоме 1, отвечающей за по меньшей мере 66% вариации индукции гаплоидов. QTL вызывает индукцию гаплоидов на различных уровнях в том случае, если он интрогрессирован в различные окружения. Все линии-индукторы гаплоидов маиса, используемые в промышленном семеноводстве, являются производными основополагающей линии HI, известной как Stock6, и все имеют мутацию QTL хромосомы 1, являющейся индуктором гаплоидов.

У маиса гаплоидное семя или зародыши, в частности, получают путем скрещивания мужского растения, являющегося индуктором гаплоидов (т.е. "пыльца, являющаяся индуктором гаплоидов") и практически любого выбранного початка, при этом початок может быть из любой инбредной, гибридной или другой зародышевой плазмы. Гаплоиды образуются в том случае, если ДНК пыльцы, являющейся индуктором гаплоидов, не полностью передается и/или сохраняется на протяжении первых клеточных делений зародышей. Полученный в результате фенотип не является полностью пенетрантным, при этом некоторые семязачатки содержат гаплоидные зародыши, а другие содержат диплоидные зародыши, анеуплоидные зародыши, химерные зародыши или недоразвитые зародыши. Гаплоидные ядра имеют зародыши, которые содержат только ДНК материнского растения плюс нормальный триплоидный эндосперм. После индукции гаплоидов гаплоидные зародыши или семя, как правило, отделяют от диплоидных и анеуплоидных сибсов с использованием скрининга по фенотипическому или генетическому маркерам и выращивают или культивируют в гаплоидные растения. Эти растения затем превращают либо естественным путем, либо посредством химической манипуляции (например, с использованием средства, ингибирующего образование микротрубочек, такого как колхицин) в гаплоидные ("DH") растения с удвоенным числом хромосом, которые затем продуцируют инбредные семена.

Селекция растений облегчается посредством использования гаплоидных (DH) растений с удвоенным числом хромосом. Получение DH-растений позволяет селекционерам-растениеводам получать инбредные линии без инбридинга в нескольких поколениях, сокращая таким образом время, необходимое для получения гомозиготных растений. DH-растения обеспечивают бесценный инструмент для селекционеров-растениеводов, в частности для получения инбредных линий, картирования QTL, цитоплазматических превращений, интрогрессии признаков и скрининга F2 в отношении высокопроизводительного улучшения признаков. Экономится большое количество времени, поскольку гомозиготные линии, по сути, образуются в одном поколении, исключая необходимость в одном семени кукурузы для нескольких поколений (общепринятый инбридинг). В частности, поскольку DH-растения являются полностью гомозиготными, то они хорошо поддаются количественным генетическим исследованиям. Получение гаплоидных семян является критически важным для процесса селекции гаплоидов с удвоенным числом хромосом. Гаплоидное семя получают на зародышевой плазме генома материнского растения при оплодотворении пыльцой от гиногенетического индуктора, такого как Stock6 и Stock6-производные линии.

В данном документе авторы изобретения описывают новый способ, в котором процесс индукции гаплоидов in vivo можно использовать для временного введения редактирующего механизма в любую зародышевую плазму путем включения его в родительское растение, являющееся индуктором гаплоидов, или стабильно интегрированный в виде трансгена, или временно экспрессируемый. Одновременное редактирование и индукцию гаплоидов можно осуществлять практически с любой сельскохозяйственной культурой посредством широкого скрещивания или индукции гаплоидов de novo, например, с помощью мутации CENH3 (т.е. CENH3-модифицированный индуктор гаплоидов; см., например, WO 2017/004375, полностью включенный в данный документ посредством ссылки) или посредством липидного спрея (см. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Авторы данного изобретения демонстрируют примеры HI у маиса, как полевой кукурузы, так и сладкой кукурузы, с использованием мужского растения, являющегося индуктором гаплоидов в качестве редактирующей донорской линии. Кроме того, авторы настоящего изобретения демонстрируют примеры HI у Arabidopsis с использованием линий CENH3-модифицированного индуктора гаплоидов.

Авторы настоящего изобретения также демонстрируют примеры HI в пшенице с использованием пыльцы маиса в качестве редактирующей донорной линии в широком скрещивании. У пшеницы, риса, ячменя, капусты и других сельскохозяйственных культур путь к индукции гаплоидов будет заключаться в использовании донора пыльцы, который индуцирует гаплоиды посредством широкого скрещивания. Например, можно использовать пыльцу кукурузы на пшенице, пыльцу проса на пшенице, пыльцу ячменя на других видах ячменя или любой другой способ широкого скрещивания. В таких случаях гиногенетической индукции гаплоидов было бы предпочтительно, чтобы линия мужских растений содержала редактирующий механизм, потому что именно ДНК мужских растений (полученная из пыльцы) удаляется в процессе индукции гаплоидов. В случаях андрогенной индукции гаплоидов, например, в системе ig1 у маиса или посредством измененного CENH3 в любой сельскохозяйственной культуре (которая может работать как у мужских, так и у женских растений), редактирующий механизм мог бы оптимально присутствовать у родительского женского растения, поскольку женские хромосомы удаляются в процессе индукции гаплоидов.

При одновременном редактировании и индукции гаплоидов целью является быстрое и экономически эффективное редактирование сельскохозяйственных культур и элитных линий ("редактирование линий назначения") без использования тканевой культуры. Линия, которая получает изменения, может представлять собой элитную зародышевую плазму, а сам редактирующий механизм может быть удален в процессе индукции гаплоидов. В то же время получают отредактированные гаплоидные линии с удвоенным числом хромосом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Неподатливость тканевых культур является главной проблемой для быстрого редактирования элитных линий в разных сельскохозяйственных культурах. Использование индуцирующих гаплоиды линий для доставки целевого механизма мутагенеза элитным линиям и одновременной индукции гаплоидов представляет собой преодоление этого главного препятствия. От этого процесса могут зависеть программы выращивания следующего поколения.

Редактирующий механизм обеспечивается за счет линии-индуктора. Редактирующий механизм чаще всего представляет собой ДНК-связывающие белки, объединенные в некоторых случаях с РНК, а в некоторых случаях также с ДНК. ДНК, РНК и белки, которые составляют редактирующий механизм, кодируются и присутствуют в линии-индукторе, потому что они стабильно встроены в индуктор, например, посредством бомбардировки или опосредованной агробактериями трансформации. В других примерах редактирующий механизм временно вводится (посредством экзогенного применения) или временно экспрессируется в гаметофите до оплодотворения. После оплодотворения редактирования осуществляются с помощью редактирующего механизма в генах-мишенях, не являющихся индукторами, до или во время удаления хромосом-индукторов. Результатом является гаплоидный зародыш, или растение, или семя, которые содержат набор хромосом только от родительского растения, не являющегося индуктором, где такой набор хромосом содержит последовательности ДНК, которые были отредактированы. Эти отредактированные гаплоиды могут быть идентифицированы, выращены, а число их хромосом удвоено предпочтительно с помощью колхицина или другого ингибитора митоза. Эта линия может затем непосредственно использоваться в последующих программах селекции.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растения. Это осуществляется путем взятия первого растения, которое представляет собой индуцирующее гаплоиды растение, и в котором в его ДНК также закодирован механизм, необходимый для осуществления редактирования (например, фермент Cas9 и направляющая РНК), и использования пыльцы этого первого растения для опыления второго растения. Второе растение представляет собой растение, подлежащее редактированию. В результате этого опыления получают трансгенный объект, потомков (например, зародыши или семена); причем по меньшей мере одно из них будет гаплоидным семенем. Это гаплоидное семя будет содержать только хромосомы второго растения; при этом хромосомы первого растения устраняются (были удалены, утрачены или разрушены), но перед этим хромосомам первого растения дали возможность осуществить экспрессирование механизма для редактирования генов. В качестве альтернативы и не вдаваясь в теорию, первое растение доставляет уже экспрессированный редактирующий механизм после опыления через пыльцевую трубку. Или в том случае, если линия-индуктор гаплоидов представляет собой женское растение при скрещивании, яйцеклетка индуцирующего гаплоиды растения содержит редактирующий механизм, который присутствует, а возможно, уже экспрессируется после оплодотворения пыльцевым зерном "дикого типа" или пыльцевым зерном, не индуцирующим гаплоиды. За счет любого из этих путей у гаплоидных потомков, полученных с помощью скрещивания, также будет отредактирован их геном.

В одном аспекте редактирующий механизм представляет собой любой фермент для модификации ДНК, но предпочтительно представляет собой сайт-направленную нуклеазу. Сайт-направленная нуклеаза предпочтительно основана на CRISPR, но также может представлять собой мегануклеазу, эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или нуклеазу типа "цинковых пальцев". Нуклеаза, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой Cas9, Cfp1, dCas9-FokI, химерную FEN1-FokI. В одном аспекте фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленный фермент для редактирования оснований, такой как Cas9-цитидиндезаминаза или Cas9-адениндезаминаза, где Cas9 может обладать одной или обеими своими инактивированными нуклеазными активностями, т.е. представлять собой химерную никазу Cas9 (nCas9) или инактивированную Cas9 (dCas9), слитые с цитидиндезаминазой или адениндезаминазой. Необязательная направляющая РНК нацеливается на геном в конкретном сайте, подлежащем редактированию. В одном аспекте необязательная направляющая РНК содержит 18-21 нуклеотидную последовательность с гомологией к любой из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33.

После получения отредактированного гаплоидного потомка число его хромосом может быть удвоено с помощью средства для удвоения числа хромосом (например, колхицина, пронамида, дитипира, трифлуралина или другого известного средства, ингибирующего образование микротрубочек).

В одном варианте осуществления первое растение является однодольным растением или двудольным растением. Аспекты первого растения включают маис, пшеницу, рис, ячмень, овес, тритикале, сорго, жемчужное просо, теосинте, бамбук, сахарный тростник, спаржу, лук и чеснок. В одном варианте осуществления второе растение является однодольным растением или двудольным растением. Аспекты второго растения включают маис, пшеницу, рис, ячмень, овес, тритикале, сорго, жемчужное просо, теосинте, бамбук, сахарный тростник, спаржу, лук и чеснок. В одном варианте осуществления первое растение представляет собой однодольное растение или двудольное растение другого вида в отличие от второго растения. Например, в одном аспекте первое растение представляет собой маис, а второе растение представляет собой пшеницу. В другом аспекте первое растение представляет собой пшеницу, а второе растение представляет собой маис. В другом варианте осуществления первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl или из любой из нескольких других известных линий HI. В еще одном варианте осуществления первое растение содержит мутацию в гене CENH3, гене ig1, или другую мутацию, обеспечивающую получение систем, индуцирующих гаплоиды, которые содержат геном отцовского растения. В другом варианте осуществления первое растение представляет собой растение риса с модифицированным или нокаутным геном MATL, что делает его линией-индуктором гаплоидов.

В другом варианте осуществления первое растение необязательно представляет собой индуктор гаплоидов, хотя первое растение содержит гены, требующиеся для кодирования редактирующего механизма генов. В данном варианте осуществления индукцию гаплоидов получают путем введения соединения во время, непосредственно перед или непосредственно после опыления. В одном аспекте композиция содержит липид или ингибитор фосфолипазы. В другом аспекте композиция содержит метил-альфа-линоленоилфторфосфонат (MALFP), сложный этиловый эфир линолевой кислоты (LLAEE), линолевую кислоту (LLA), кукурузное масло, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), метиларахидонилфторфосфонат (MAFP), пальмитилтрифторметилкетон (PACOCF3), арахидонилтрифторметилкетон (AACOCF3), маноалид, сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный метиловый эфир олеиновой кислоты (ОАМЕ), сложный этиловый эфир олеиновой кислоты (ОАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитиновой кислоты (РАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (PLAEE), льняное масло, кукурузное масло, альфа-линоленовую кислоту (aLNA), гамма-линоленовую кислоту (gLNA), олеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, стеариновую кислоту, 9(Z)-11(Е)-конъюгированную линолевую кислоту или 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23396.

SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность gRNA, предназначенную для редактирования VLHP1 у маиса.

SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23399.

SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность gRNA для редактирования GW2-2 у маиса.

SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 22808, содержащего конструкцию TALEN.

SEQ ID NO: 6 представляет собой целевую последовательность для TALEN 22808.

SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23123, содержащего конструкцию Cas9.

SEQ ID NO: 8 представляет собой gRNA для редактирования MATL у маиса.

SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в NP2222.

SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в Stock6.

SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350333-3 аллеля 1.

SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350333-3 аллеля 2.

SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350344-2 аллеля 1.

SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350344-2 аллеля 2.

SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350343-1 аллеля 1.

SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350328-1 аллеля 1.

SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350337-2 аллеля 1.

SEQ ID NO: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность для соответствующей части MATL в USR01350337-2 аллеля 2.

SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность кДНК дикого типа MATL.

SEQ ID NO: 20 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23397.

SEQ ID NO: 21 представляет собой последовательность gRNA для редактирования VLHP2 у маиса.

SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23398.

SEQ ID NO: 23 представляет собой последовательность gRNA для редактирования GW2-1 у маиса.

SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23763.

SEQ ID NO: 25 представляет собой последовательность gRNA для VLHP1 у пшеницы.

SEQ ID NO: 26 представляет собой целевую последовательность VLHP пшеницы для TaVLHP2.

SEQ ID NO: 27 представляет собой целевую последовательность VLHP пшеницы для TaVLHP3.

SEQ ID NO: 28 представляет собой целевую последовательность в ZmVLHP2-03 для редактирования.

SEQ ID NO: 29 представляет собой отредактированную последовательность в ZmVLHP2-03.

SEQ ID NO: 30 представляет собой восстановленную донорную матричную последовательность для создания мутации E149L в ZmPYL-D.

SEQ ID NO: 31 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 23136.

SEQ ID NO: 32 представляет собой gRNA вектора 23136.

SEQ ID NO: 33 представляет собой нуклеотидную последовательность гена Os03g27610PLA риса.

SEQ ID NO: 34 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24038.

SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24039.

SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24079.

SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24091.

SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24094.

SEQ ID NO: 39-97 представляют собой праймеры и зонды, используемые в анализах Taqman для выявления с помощью ПЦР.

SEQ ID NO: 98 представляет собой нуклеотидную последовательность для вектора 24075.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350334-3: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).

На фигуре 2 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350333-3: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).

На фигуре 3 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350333-10: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).

На фигуре 4 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350344-2: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).

На фигуре 5 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350343-1: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).

На фигуре 6 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350341-1: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).

На фигуре 7 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350328-1: ГАПЛОИД (основной пик при 100, вторичный пик при 200).

На фигуре 8 показаны данные анализа плоидности (проточная цитометрия) для USR01350321-3: ДИПЛОИД (основной пик при 200, вторичный пик при 400).

На фигуре 9 представлено схематическое изображение вектора 23396 (SEQ ID NO: 1), используемого для Agrobacterium-опосредованной трансформации незрелых зародышей маиса для создания целевых мутаций в генах ZmVLHP1. xZmVLHP-01: последовательность направляющей РНК (gRNA) (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2); rsgRNAZmVLHP-01: одиночная направляющая РНК (sgRNA), содержащая последовательности терминации gRNA, tracRNA и PolIII. cPMI: селектируемый маркерный ген PMI; cCas9: ген нуклеазы Cas9; RB: правая граница Т-ДНК; LB: левая граница Т-ДНК; tNOS: терминатор нопалинсинтетазы; cSpec: ген устойчивости к спектиномицину.

На фигуре 10 представлено схематическое изображение вектора 23399 (SEQ ID NO: 3), используемого для Agrobacterium-опосредованной трансформации незрелых зародышей маиса для создания целевых мутаций в генах ZmGW2. xZmGW2-02: последовательность направляющей РНК (gRNA) (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4); rsgRNAZmGW2-02: одиночная направляющая РНК (sgRNA), содержащая последовательности терминации gRNA, tracrRNA и PolIII. cPMI-09: селектируемый маркерный ген PMI; cCas9-01: ген нуклеазы Cas9; RB: правая граница Т-ДНК; LB: левая граница Т-ДНК; tNOS: терминатор нопалинсинтетазы; cSpec: ген устойчивости к спектиномицину.

На фигуре 11 показан анализ плоидности отредактированной гаплоидной линии сладкой кукурузы JSER82A056, и на фигуре 12 показано то же самое для отредактированной гаплоидной линии сладкой кукурузы JSER82A063. Эти линии были получены путем скрещивания с линией индукции гаплоидов RWKS, несущей трансгенный локус CRISPR-Cas9 вектора экспрессии 23399.

На фигуре 13 показано подтверждение последовательности редактирования сайта-мишени GW2-02 в линии гаплоидной сладкой кукурузы JSER82A063. Одно основание С рядом с предсказанным сайтом расщепления Cas9 было подвергнуто делеции.

На фигуре 14 показан анализ плоидности контроля дикого типа, и на фигуре 15 показан анализ плоидности отредактированной гаплоидной линии пшеницы JSWER30A22.

На фигуре 16 показано подтверждение с помощью секвенирования последовательности для редактирования сайта-мишени TaVLHP1-4B в линии гаплоидной пшеницы JSWER30A22. Нижняя панель, показывающая 97 п.о. последовательности TaVLHP1-4B, была подвергнута делеции непосредственно ниже предсказанного сайта расщепления Cas9. Подвергнутые делеции последовательности размером 97 п.о. были отмечены 2 стрелками.

На фигуре 17 показана экспрессия в пыльце, измеренная по пыльце, собранной от трансгенных растений T0 маиса, несущих T-DNA векторов 24038, 24039, 24079, 24091 и 24094, которые использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. Экспрессия в пыльце была высокой, в среднем в приблизительно 100 раз выше, у растений, несущих T-DNA векторов 24038, 24039 и 24079, по сравнению с промотором убиквитина сахарного тростника, используемым во многих примерах с кукурузой и пшеницей. Экспрессия также была выше в пыльце растений, содержащих векторы 24038, 24039 и 24079, по сравнению с пыльцой, несущей конструкции на основе промотора MATRILINEAL (24094 и 24091).

На фигуре 18 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01424135). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На фигуре 19 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01431603). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На фигуре 20 показана гистограмма анализа плоидности диплоидного контроля (родительское растение USR01431609). Первый пик расположен в положении "2" на логарифмической оси X. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На фигуре 21 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1033, лунка C3 (USR01424135 X Ler-427). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На фигуре 22 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1033, лунка Е4 (USR01424135 X Ler-437). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На фигуре 23 показана гистограмма анализа плоидности отредактированного гаплоида из чашки 1046, лунка Н12 (USR01431609 X Ler-123). Первый пик расположен в положении "1" на логарифмической оси X, указывая на то, что это гаплоид. Поскольку это ткань листьев из Arabidopsis, то видно множество пиков, указывающих на нормальный уровень эндоредупликации.

На рисунке 24 показаны мутации в последовательности сайта-мишени GL1 в родительском #USR01424135 и все секвенированные отредактированные гаплоиды от скрещиваний особей из разных линий с помощью пыльцы Landsberg erecta. Ясно, что точное редактирование отличается в разных гаплоидах.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Хотя предполагается, что следующие термины хорошо понятны специалисту в данной области техники, следующие определения приведены для облегчения пояснения раскрытого в данном документе объекта изобретения.

Все используемые в данном документе технические и научные термины, если ниже не указано иначе, предполагаются как имеющие такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники. Ссылки на используемые в данном документе методики предполагаются как относящиеся к методикам, общепринятым в данной области техники, в том числе к изменениям этих методик и/или заменам на эквивалентные методики, которые будут очевидны специалистам в данной области техники. Хотя предполагается, что следующие термины хорошо понятны специалисту в данной области техники, следующие определения приведены для облегчения пояснения раскрытого в данном документе объекта изобретения.

Следуя устоявшемуся договору в патентном праве, формы существительного в единственном числе относятся к "одному или нескольким" при использовании в настоящей заявке, включая формулу изобретения. Например, фраза "клетка" относится к одной или нескольким клеткам и в некоторых вариантах осуществления может относиться к ткани и/или органу. Аналогичным образом, фраза "по меньшей мере один" при использовании в данном документе для обозначения объекта относится, например, к 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 или большему количеству этих объектов, включая без ограничения все целочисленные значения от 1 до 100, а также целые числа больше 100.

Если не указано иное, то все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., используемые в настоящем описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью термина "приблизительно". Термин "приблизительно", используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как величина массы, веса, времени, объема, концентрации или процентного значения, предназначен для охвата изменений, составляющих в некоторых вариантах осуществления ±20%, в некоторых вариантах осуществления ±10%, в некоторых вариантах осуществления ±5%, в некоторых вариантах осуществления ±1%, в некоторых вариантах осуществления ±0,5% и в некоторых вариантах осуществления ±0,1%, от указанного количества, поскольку такие изменения подходят для осуществления раскрытых способов и/или использования раскрытых композиций, нуклеиновых кислот, полипептидов и т.д. Соответственно, если не указано обратное, числовые параметры, изложенные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными величинами, которые могут варьироваться в зависимости от требуемых свойств, которых стремятся достичь посредством раскрытого в данном документе объекта изобретения.

Используемый в данном документе термин "аллель" относится к варианту или альтернативной форме последовательности в генетическом локусе. У диплоидов отдельный аллель наследуется индивидуумом-потомком от каждой родительской особи отдельно в каждом локусе. Два аллеля данного локуса, присутствующие в диплоидном организме, занимают соответствующие места в паре гомологичных хромосом, хотя специалист в данной области техники понимает, что аллели в любом конкретном индивидууме необязательно представляют все аллели, которые присутствуют у данного вида.

Применяемый в данном документе термин "и/или", при использовании применительно к перечню объектов, относится к объектам, присутствующим в отдельности или в комбинации. Таким образом, например, фраза "А, В, С и/или D" включает А, В, С и D по отдельности, но также включает все возможные комбинации и подкомбинации А, В, С и D (например, AB, AC, AD, BC, BD, CD, ABC, ABD и BCD). В некоторых вариантах осуществления один или несколько элементов, к которым относится "и/или", могут также отдельно присутствовать в одном или множестве случаев в комбинации (комбинациях) и/или подкомбинации (комбинациях).

Используемая в данном документе фраза "ассоциированный с" относится к распознаваемой и/или анализируемой взаимосвязи между двумя объектами. Например, фраза "ассоциированный с HI" относится к признаку, локусу, гену, аллелю, маркеру, фенотипу и т.д. или их экспрессии, присутствие или отсутствие которых может влиять на меру и/или степень, в которой растение или его потомок проявляют HI. Соответственно, маркер является "связанным с" признаком в том случае, если он сцеплен с ним, и в том случае, если присутствие маркера является индикатором того, будет ли и/или в какой степени будет встречаться требуемый признак или форма признака у растения/в зародышевой плазме, содержащих маркер. Аналогичным образом, маркер является "ассоциированным с" аллелем в том случае, если он сцеплен с ним, и в том случае, если присутствие маркера является индикатором присутствия аллеля у растения/в зародышевой плазме, содержащих маркер. Например, "маркер, ассоциированный с HI", относится к маркеру, присутствие или отсутствие которого можно использовать для предсказания того, будет ли и/или в какой степени растение будет проявлять индукцию гаплоидов.

Термин "содержащий", который является синонимичным для "включающий", "вмещающий" и "характеризующийся", является включающим или открытым и не исключает дополнительных, не упомянутых элементов и/или стадий способа. "Содержащий" представляет собой термин из уровня техники, который означает, что названные элементы и/или стадии присутствуют, но могут быть добавлены другие элементы и/или стадии, которые при этом по-прежнему находятся в пределах объема соответствующего объекта изобретения.

Используемая в данном документе фраза "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, конкретно не упомянутые. В том случае, если фраза "состоит из" появляется в основной части пункта формулы изобретения, а не сразу после ограничительной части, то она ограничивает только элемент, изложенный в данной части; при этом другие элементы не исключаются из пункта формулы изобретения в целом.

Используемая в данном документе фраза "по сути состоящий из" ограничивает объем связанного раскрытия или пункта формулы изобретения указанными материалами и/или стадиями, а также материалами и/или стадиями, которые существенно не влияют на основную (основные) и новую (новые) характеристику (характеристики) раскрытого и/или заявленного объекта изобретения.

Что касается терминов "содержащий", "по сути состоящий" и "состоящий из" в том случае, если в данном документе используется один из этих трех терминов, то раскрытый в данном документе и заявленный объект изобретения может включать в некоторых вариантах осуществления использование любого из двух других терминов. Например, справедливо, если объект изобретения относится в некоторых вариантах осуществления к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 95% идентичны SEQ ID NO: 9 или 19. Таким образом, следует понимать, что раскрываемый объект изобретения также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые в некоторых вариантах осуществления по сути состоят из аминокислотных последовательностей, которые на по меньшей мере 95% идентичны этим SEQ ID NO: 9 или 19, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые в некоторых вариантах осуществления состоят из аминокислотных последовательностей, на по меньшей мере 95% идентичных этим SEQ ID NO: 9 или 19. Аналогичным образом, также следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому объекту изобретения включают стадии, раскрытые в данном документе, в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому в данном документе объекту изобретения по сути состоят из раскрываемых стадий, и в некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрываемому в данном документе объекту изобретения состоят из стадий, которые раскрываются в данном документе.

Используемый в данном документе термин "de novo индукция гаплоидов" относится к инициации индукции гаплоидов посредством введения средства, спонтанно индуцирующего гаплоиды. Такое введение можно осуществлять посредством местного опрыскивания, опыления ручным способом, мутагенеза или трансгенных способов. Термины "индукция гаплоидов de novo", "HI de novo" и "de novo индукция гаплоидов" используются взаимозаменяемо по всему настоящему описанию.

Используемый в данном документе термин "ген" относится к единице наследственности, содержащей последовательность ДНК, которая занимает конкретное местоположение в хромосоме и которая содержит генетическую инструкцию для определенной характеристики или признака, свойственных организму.

"Генетическая карта" представляет собой описание взаимосвязей при генетическом сцеплении между локусами на одной или нескольких хромосомах у данного вида, обычно изображаемое в форме схемы или таблицы.

Используемое в данном документе растение, называемое "гаплоидным", имеет уменьшенное количество хромосом (n) в гаплоидном растении, и его набор хромосом равен таковому набору у гаметы. В гаплоидном организме присутствует только половина от нормального числа хромосом. Таким образом, гаплоиды диплоидных организмов (например, маиса) проявляют моноплоидию; гаплоиды тетраплоидных организмов (например, райграссов) проявляют диплоидию; гаплоиды гексаплоидных организмов (например, пшеницы) проявляют триплоидию и т.д. Используемое в данном документе растение, называемое "гаплоидом с удвоенным числом хромосом", получают путем удвоения гаплоидного набора хромосом. Растение или семя, которые получают из гаплоидного растения с удвоенным числом хромосом, самооплодотворямое в течение любого количества поколений, все еще можно идентифицировать как двойное гаплоидное растение. Гаплоидное растение с удвоенным числом хромосом считается гомозиготным растением. Растение считается гаплоидным с удвоенным числом хромосом, если оно является фертильным, даже если целая вегетативная часть растения не состоит из клеток с удвоенным набором хромосом; то есть растение будет считаться гаплоидным с удвоенным числом хромосом, если оно содержит жизнеспособные гаметы, даже если оно является химерным в вегетативных тканях.

Используемый в данном документе термин "индуцированная человеком мутация" относится к любой мутации, появляющейся в результате непосредственного или опосредованного человеком действия. Данный термин включает без ограничения мутации, получаемые посредством любого способа направленного мутагенеза.

Используемый в данном документе "введенный" означает доставляемый, экспрессируемый, применяемый, транспортируемый, переносимый, проникающий или другой подобный термин для обозначения доставки, будь то нуклеиновой кислоты или белка или их комбинации требуемого объекта к объекту. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие сайт-направленную нуклеазу и необязательно по меньшей мере одну направляющую РНК, могут быть введены в гаплоидный зародыш после индукции гаплоидов. Аналогично существующий редактирующий механизм (содержащий сайт-направленный нуклеазный белок и необязательно по меньшей мере одну направляющую РНК) может быть введен в гаплоидный зародыш путем применения соответствующих проникающих в клетку пептидов.

Используемые в данном документе термины "маркерный зонд" и "зонд" относятся к нуклеотидной последовательности или молекуле нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для выявления присутствия или отсутствия последовательности в пределах большей последовательности посредством гибридизации нуклеиновых кислот, например, к зонду на основе нуклеиновой кислоты, комплементарному всему маркеру или маркерному локусу или его части. Для гибридизации нуклеиновых кислот можно использовать маркерные зонды, содержащие приблизительно 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше смежных нуклеотидов.

Используемый в данном документе термин "молекулярный маркер" можно использовать для обозначения генетического маркера, определенного выше, или кодируемого им продукта (например, белка), применяемого в качестве исходной точки при идентификации присутствия/отсутствия HI-ассоциированного локуса. Молекулярный маркер может быть получен из геномных нуклеотидных последовательностей или из экспрессируемых нуклеотидных последовательностей (например, из РНК, кДНК и т.д.). Данный термин также относится к нуклеотидным последовательностям, комплементарным маркерным последовательностям или фланкирующим их, таким как нуклеотидные последовательности, используемые в качестве зондов и/или праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность. Нуклеотидные последовательности являются "комплементарными" в том случае, если они специфически гибридизируются в растворе (например, согласно правилам спаривания оснований Уотсона-Крика). Данный термин также относится к генетическим маркерам, которые указывают на признак по отсутствию нуклеотидных последовательностей, комплементарных маркерным последовательностям или фланкирующих их, таких как нуклеотидные последовательности, используемые в качестве зондов и/или праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность.

Используемые в данном документе термины "нуклеотидная последовательность", "полинуклеотид", "последовательность нуклеиновой кислоты", "молекула нуклеиновой кислоты" и "фрагмент нуклеиновой кислоты" относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухнитевым, необязательно содержащему синтетические, неприродные и/или измененные нуклеотидные основания. "Нуклеотид" представляет собой мономерную единицу, из которой сконструированы полимеры ДНК или РНК и которая состоит из пуринового или пиримидинового основания, пентозы и группы фосфорной кислоты. Нуклеотиды (обычно находящиеся в их форме 5'-монофосфата) называют их однобуквенным обозначением следующим образом: "А" в случае аденилата или дезоксиаденилата (соответственно в случае РНК или ДНК), "С" в случае цитидилата или дезоксицитидилата, "G" в случае гуанилата или дезоксигуанилата, "U" в случае уридилата, "Т" в случае дезокситимидилата, "R" в случае пуринов (А или G), "Y" в случае пиримидинов (С или Т), "K" в случае G или Т, "H" в случае А или С или Т, "I" в случае инозина и "N" в случае любого нуклеотида.

В контексте данного документа термин "идентичность нуклеотидной последовательности" относится к присутствию идентичных нуклеотидов в соответствующих положениях двух полинуклеотидов. Полинуклеотиды имеют "идентичные" последовательности в том случае, если последовательность нуклеотидов в двух полинуклеотидах является одной и той же при выравнивании для максимального соответствия (например, в окне сравнения). Сравнение последовательностей двух или более нуклеотидов обычно осуществляют путем сравнения частей двух последовательностей в окне сравнения для выявления и сравнения локальных участков сходства последовательностей. Как правило, окно сравнения составляет от приблизительно 20 до 200 смежных нуклеотидов. "Процентное значение идентичности последовательности" для полинуклеотидов, как, например, приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100 процентная идентичность последовательности, можно определять с помощью сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать дополнения или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. В некоторых вариантах осуществления процентное значение рассчитывают с помощью (а) определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты встречается в обеих последовательностях; (b) деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и (с) умножения результата на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно также проводить с помощью компьютерных реализаций известных алгоритмов или путем визуального осмотра. Общедоступными алгоритмами сравнения последовательности и множественного выравнивания последовательностей являются соответственно программы Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) и ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega, доступные в сети Интернет (например, на веб-сайте EMBL-EBI). Другие подходящие программы включают без ограничения GAP, BestFit, Plot Similarity и FASTA, которые являются частью пакета программ Accelrys GCG Package, доступного от Accelrys, Inc. Сан-Диего, Калифорния, Соединенные Штаты Америки. См. также Smith & Waterman, 1981; Needleman & Wunsch, 1970; Pearson & Lipman, 1988; Ausubel et al., 1988 и Sambrook & Russell, 2001.

Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентного значения идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et al., 1990. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности последовательности относится к идентичности последовательности по всей длине одной из сравниваемых последовательностей gDNA, кДНК или прогнозируемого белка в самой большой ORF в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления расчет с целью определения процента идентичности последовательности нуклеиновой кислоты не включает в расчет любые положения нуклеотидов, в которых каждая из сравниваемых нуклеиновых кислот включает "N" (т.е. где любой нуклеотид может находиться в данном положении).

Термин "открытая рамка считывания" (ORF) относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления ORF содержит кодон инициации трансляции (т.е. стартовый кодон), кодон терминации трансляции (т.е. стоп-кодон) и последовательность нуклеиновой кислоты между ними, которая кодирует аминокислоты, присутствующие в полипептиде. Термины "инициирующий кодон" и "кодон терминации" относятся к единице из трех смежных нуклеотидов (т.е. кодону) в кодирующей последовательности, которая определяет соответственно инициацию и терминацию цепи в синтезе белка (трансляция мРНК).

Пататин-подобная фосфолипаза А2α также известна под названием PLA, pPLA, pPLAIIA, pPLAIIα, PLA2альфа или PLA2 или другие аналогичные вариации. Пататин-подобную фосфолипазу AIIα также называют MATRILINEAL (MATL). Данные термины везде используются взаимозаменяемо. Ген MATRILINEAL, содержащий мутацию со сдвигом рамки считывания из четырех пар оснований, называется матрилинейным (matl).

Используемые в данном документе термины "фенотип", "фенотипический признак" или "признак" относятся к одному или нескольким признакам растения или растительной клетки. Фенотип можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью любых других средств оценки, известных из уровня техники, например, с помощью микроскопии, биохимического анализа или электромеханического анализа. В некоторых случаях фенотип непосредственно контролируется одним геном или генетическим локусом (т.е. соответствует "признаку, определенному одним геном"). В случае индукции гаплоидов использование маркеров цвета, таких как R-Navajo, и других маркеров, в том числе трансгенов, визуально определяемых по присутствию или отсутствию цвета в семени, свидетельствует о том, является ли семя индуцированным гаплоидным семенем. Использование R-Navajo в качестве маркера цвета и использование трансгенов хорошо известно из уровня техники в качестве способов выявления индукции гаплоидного семени на женском растении. В других случаях фенотип является результатом взаимодействий между несколькими генами, и в некоторых вариантах осуществления он также является результатом взаимодействия растения и/или растительной клетки с их окружающей средой.

Используемый в данном документе термин "растение" может относится к целому растению, любой его части или культуре клеток или тканей, полученным из растения. Таким образом, термин "растение" может относиться к любому из целых растений, компонентов или органов растения (например, листьям, стеблям, корням и т.д.), растительных тканей, семян и/или растительных клеток.

Растительная клетка представляет собой клетку растения, взятую из растения или полученную посредством культивирования из клетки, взятой из растения. Таким образом, термин "растительная клетка" включает без ограничения клетки в семенах, суспензионных культурах, зародышах, участках меристемы, каллюсной ткани, листьях, побегах, гаметофитах, спорофитах, пыльце и микроспорах. Фраза "часть растения" относится к части растения, в том числе к отдельным клеткам и клеточным тканям, таким как растительные клетки, которые являются интактными в растениях, скоплениям клеток и тканевым культурам, из которых можно регенерировать растения. Примеры частей растения включают без ограничения отдельные клетки и ткани из пыльцы, семязачатков, листьев, зародышей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков, плодов, стеблей, побегов и семян; а также привоев, подвоев, протопластов, каллюсов и т.п.

Используемый в данном документе термин "праймер" относится к олигонуклеотиду, который способен отжигаться с целевой нуклеиновой кислотой (в некоторых вариантах осуществления отжигаться специфически с целевой нуклеиновой кислотой), обеспечивая присоединение к ней ДНК-полимеразы и/или обратной транскриптазы, выступая таким образом в качестве точки начала синтеза ДНК, будучи помещенным в условия, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера (например, в присутствии нуклеотидов и средства для полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и при подходящих температуре и показателе рН). В некоторых вариантах осуществления для амплификации нуклеиновых кислот растения используют одну или несколько совокупностей праймеров (например, с помощью полимеразной цепной реакции; ПЦР).

Используемый в данном документе термин "зонд" относится к нуклеиновой кислоте (например, однонитевой нуклеиновой кислоте или нити двухнитевой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты более высокого порядка или их подпоследовательности), которая может образовывать стабилизированный водородными связями дуплекс с комплементарной последовательностью в целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Как правило, зонд имеет достаточную длину для образования стабильной и специфической в отношении последовательности дуплексной молекулы с ее комплементарной последовательностью, а следовательно, может применяться в некоторых вариантах осуществления для выявления представляющей интерес последовательности, присутствующей во множестве нуклеиновых кислот.

Используемые в данном документе термины "потомок" и "растение-потомок" относятся к растению, полученному путем вегетативного или полового размножения от одного или нескольких родительских растений. При гиногенез-опосредованной индукции гаплоидов гаплоидный зародыш в женском родительском растении содержит женские хромосомы, исключая мужские хромосомы; таким образом, он не является потомком мужской линии, индуцирующей гаплоиды. Гаплоидное семя кукурузы обычно имеет нормальный триплоидный эндосперм, который содержит геном мужского растения. Отредактированные гаплоидные потомки, и в дальнейшем подвергаемые редактированию растения, являющиеся удвоенным гаплоидом, и будущее семя не являются единственными требуемыми потомками. Существует также семя из собственно линии-индуктора гаплоидов, часто несущее трансген Cas9, и будущее растение и потомство семян индуцирующего гаплоиды растения. Как гаплоидное семя, так и семя-индуктор гаплоидов (полученные самоопылением) могут быть потомком. Растение-потомок может быть получено путем клонирования или самооплодотворения одного родительского растения или путем скрещивания двух или более родительских растений. Например, растение-потомок может быть получено путем клонирования или самооплодотворения одного родительского растения или путем скрещивания двух родительских растений, и оно включает продукты самооплодотворения, а также F₁ или F₂ или более далекие поколения. F₁ представляет собой потомка первого поколения, полученного от родительских особей, по меньшей мере одно из которых впервые используют в качестве донора признака, тогда как потомство второго поколения (F₂) или последующих поколений (F₃, F₄ и т.п.) представляет собой образцы, полученные в результате самооплодотворений, перекрестных опылений, возвратных скрещиваний и/или других скрещиваний F₁, F₂ и т.п. Таким образом, F₁ может представлять собой (и в некоторых вариантах осуществления представляет собой) гибрид, полученный в результате скрещивания двух родительских особей из чистых линий (т.е. каждая из родительских особей из чистых линий является гомозиготной по признаку, представляющему интерес, или его аллелю), тогда как F₂ может представлять собой (и в некоторых вариантах осуществления представляет собой) потомка, полученного в результате самоопыления гибридов F₁.

Используемая в данном документе фраза "рекомбинация" относится к обмену фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или хроматидами парных хромосом ("кроссинговер") в участке сходства или идентичности нуклеотидных последовательностей. "Событие рекомбинации" в данном документе понимают как относящееся в некоторых вариантах осуществления к мейотическому кроссинговеру.

Используемый в данном документе термин "эталонная последовательность" относится к определенной нуклеотидной последовательности, используемой в качестве основы для сравнения нуклеотидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления любая из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33 могут выступать в качестве эталонной последовательности для сравнения с другими последовательностями, полученными из растений.

Используемый в данном документе термин "регенерировать" и его грамматические варианты относятся к получению растения из тканевой культуры.

Используемая в данном документе фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых полинуклеотид гибридизируется со своей подпоследовательностью-мишенью, как правило, в сложной смеси нуклеиновых кислот, но по сути не осуществляет этого с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и могут различаться при разных обстоятельствах.

Как правило, более длинные последовательности специфически гибридизируются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Sambrook & Russell, 2001. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была на приблизительно 5-10°С ниже температуры точки плавления (T_m) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и показателе рН. Tm представляет собой температуру (при определенных ионной силе, показателе рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с целевой последовательностью в равновесном состоянии (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, то при Tm в равновесном состоянии занято 50% зондов). Иллюстративные жесткие условия являются такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,0 М ионов натрия, как правило, концентрация ионов натрия (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов).

Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Дополнительные иллюстративные жесткие условия гибридизации включают инкубирование в 50% формамиде, 5х SSC и 1% SDS при 42°С или инкубирование в SSC, 1% SDS при 65°С; с одной или несколькими стадиями отмывки в 0,2х SSC и 0,1% SDS при 65°С. Для ПЦР температура, составляющая приблизительно 36°С, является типичной для амплификации в условиях низкой жесткости, хотя температуры отжига могут варьироваться от приблизительно 32°С до 48°С (или выше) в зависимости от длины праймера. Дополнительные руководства для определения параметров гибридизации представлены в многочисленных ссылках (см., например, Ausubel et al., 1999).

Используемый в данном документе термин "признак" относится к фенотипу, представляющему интерес, гену, который вносит вклад в фенотип, представляющий интерес, а также к последовательности нуклеиновой кислоты, ассоциированной с геном, который вносит вклад в фенотип, представляющий интерес. Например, "признак HI" относится к фенотипу индукции гаплоидов, а также к гену (например, matl в маисе или Os03g27610 в рисе), который вносит вклад в индукцию гаплоидов, и к последовательности нуклеиновой кислоты (например, HI-ассоциированному продукту гена), что связано с присутствием или отсутствием фенотипа индукции гаплоидов.

Используемый в данном документе термин "трансген" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, введенной в организм или один или несколько его предков, с помощью определенной формы методики искусственного переноса. Таким образом, с помощью методики искусственного переноса создают "трансгенный организм" или "трансгенную клетку". Следует понимать, что методика искусственного переноса может осуществляться в организме-предке (или в его клетке и/или клетке, из которой может развиваться организм-предок), и при этом любой индивидуум-потомок, который содержит искусственно перенесенную молекулу нуклеиновой кислоты или ее фрагмент, все еще считается трансгенным, даже если в результате одного или нескольких природных и/или принудительных скрещиваний искусственно перенесенная молекула нуклеиновой кислоты присутствует в индивидууме-потомке.

Используемый в данном документе термин "направленный мутагенез" или "стратегия мутагенеза" относится к любому способу мутагенеза, который приводит в результате к преднамеренному мутагенезу выбранного гена. Направленный мутагенез включает способы с использованием CRISPR, TILLING, TALEN и другие способы, которые еще не разработаны, но которые можно использовать для достижения такого же результата.

Используемый в данном документе термин "уровень индукции гаплоидов" ("HIR") означает количество выживших гаплоидных зерен по сравнению с общим количеством зерен после опыления початка пыльцой, являющейся индуктором гаплоидов.

Конкретными проблемами, сопровождающими эту индукцию гаплоидов, являются увеличенные уровни недозрелости зародышей и увеличенные частоты неудачного оплодотворения (пониженные уровни завязывания семян). В силу описанных причин существует потребность в успешном определении причины HI и использовании этого знания для определения способов создания гаплоидных растений в стабильном или увеличивающемся объеме при одновременном снижении частоты неудачного оплодотворения и недоразвитости зародышей.

В частности, предполагается, что промотор можно подвергнуть мутагенезу, чтобы потенциально улучшить пригодность элементов для экспрессии трансгенов у растений. Мутагенез этих элементов можно осуществлять случайным образом, и подвергнутые мутагенезу промоторные последовательности можно подвергать скринингу в отношении активности по методу проб и ошибок. В качестве альтернативы можно идентифицировать определенные последовательности, которые придают промотору требуемые характеристики экспрессии или придают промотору активность усиления экспрессии, и эти или сходные последовательности можно вводить в промотор посредством мутации. Дополнительно предполагается, что эти последовательности можно подвергнуть мутагенезу для усиления экспрессии трансгенов с их помощью у определенного вида. Способы осуществления мутагенеза сегмента ДНК, кодирующего промоторную последовательность по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники. Как указано выше, модификации промотора или другого регуляторного элемента можно осуществлять посредством процедур случайного или сайт-специфического мутагенеза. Промотор и другой регуляторный элемент можно модифицировать путем изменения их структуры посредством добавления или делеции одного или нескольких нуклеотидов из последовательности, которая кодирует соответствующие немодифицированные последовательности.

Мутагенез можно осуществлять в соответствии с любыми методиками, известными из уровня техники, такими как без ограничения синтез олигонуклеотида, имеющего одну или несколько мутаций в пределах последовательности в конкретной регуляторной последовательности. В частности, сайт-специфический мутагенез представляет собой методику, применимую в получении мутантных промоторов посредством специфического мутагенеза лежащей в их основе ДНК. Также можно использовать РНК-направляемые эндонуклеазы ("RGEN", например CRISPR/Cas9). Данная методика дополнительно обеспечивает легкодоступную возможность получения и тестирования вариантов последовательностей, например, с учетом одного или нескольких из вышеуказанных соображений, посредством введения одного или нескольких изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-специфический мутагенез обеспечивает получение мутантных форм посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с требуемой мутацией, а также достаточного количества смежных нуклеотидов, для обеспечения получения последовательности праймера, имеющей достаточные размер и сложность последовательности для образования стабильного дуплекса по обе стороны от пересекаемой границы делеции. Как правило, предпочтительным является праймер, длина которого составляет от приблизительно 17 до приблизительно 75 нуклеотидов или больше, содержащий от приблизительно 10 до приблизительно 25 или больше остатков по обе стороны от границы в последовательности, подлежащей изменению.

В том случае, если клон, содержащий промотор, был выделен в соответствии с настоящим изобретением, то при желании можно определить границы ключевых участков промотора в пределах клона. Один эффективный направленный способ получения подвергнутых мутагенезу промоторов основан на идентификации предполагаемых регуляторных элементов в пределах промоторной последовательности. Ее можно начать со сравнения с промоторными последовательностями, которые, как известно, характеризуются сходными тканеспецифическими или уникальными для стадии развития профилями экспрессии. Последовательности, которые являются общими среди промоторов со сходными профилями экспрессии, являются перспективными кандидатами для связывания с факторами транскрипции и, таким образом, являются предполагаемыми элементами, обеспечивающими профили экспрессии. Подтверждение этих предполагаемых регуляторных элементов можно осуществлять посредством делеционного анализа каждой предполагаемой регуляторной последовательности с последующим функциональным анализом каждой делеционной конструкции посредством анализа репортерного гена, функционально присоединенного к каждой конструкции. Таким образом, после получения исходной промоторной последовательности можно легко получить любую из ряда различных делеционных мутантных форм исходного промотора.

В настоящем изобретении, раскрываемом в данном документе, предусматриваются молекулы полинуклеотида, содержащие фрагменты регуляторных элементов, которые можно применять в конструировании новых химерных регуляторных элементов. Новые комбинации, содержащие фрагменты этих молекул полинуклеотидов и по меньшей мере один другой регуляторный элемент или фрагмент, можно конструировать и тестировать у растений, при этом они считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения. Таким образом, разработка, конструирование и использование химерных регуляторных элементов составляют один вариант осуществления настоящего изобретения. Промоторы по настоящему изобретению включают гомологи цис-элементов, которые известны тем, что влияют на регуляцию гена, которые демонстрируют гомологию с промоторными последовательностями по настоящему изобретению.

Функциональные эквивалентные фрагменты одной из нуклеиновых кислот, регулирующих транскрипцию, которые описаны в данном документе, содержат по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 пар оснований нуклеиновой кислоты, регулирующей транскрипцию. Из эквивалентных фрагментов регулирующих транскрипцию нуклеиновых кислот, которые получают посредством делеции участка, кодирующего 5'-нетранслируемый участок мРНК, можно затем получить только (нетранскрибируемый) промоторный участок. 5'-Нетранслируемый участок можно легко определить с помощью способов, известных из уровня техники (таких как анализ 5'-RACE). Соответственно, некоторые из нуклеиновых кислот, регулирующих транскрипцию, которые описаны в данном документе, являются эквивалентными фрагментами других последовательностей.

Как указано выше, также можно случайным образом получать, а затем анализировать делеционные мутантные формы промотора по настоящему изобретению. Следуя этой стратегии, получают серию конструкций, каждая из которых содержит отличную от других часть промотора (субклон), а затем эти конструкции подвергают скринингу в отношении активности. Подходящими способами для осуществления скрининга в отношении активности являются присоединение делетированной конструкции промотора или интрона, которая содержит делетированный сегмент, к селектируемому или подвергаемому скринингу маркеру, и выделение только тех клеток, которые экспрессируют маркерный ген. Таким образом идентифицируют несколько различных делетированных конструкций промотора, которые все еще сохраняют требуемую или даже улучшенную активность. Таким образом, посредством сравнения выбранных конструкций, идентифицируют наименьший сегмент, необходимый для активности. Затем этот сегмент можно использовать для конструирования векторов для экспрессии экзогенных генов.

Кассета экспрессии, описанная в данном документе, может содержать дополнительные регуляторные элементы. Этот термин в данном контексте следует понимать в широком значении, включающем все последовательности, которые могут влиять на конструкцию или функцию кассеты экспрессии. Регуляторные элементы могут, например, модифицировать транскрипцию и/или трансляцию у прокариотических или эукариотических организмов. Описанная в данном документе кассета экспрессии может находиться ниже (в 3'-направлении) последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии, и необязательно может содержать дополнительные регуляторные элементы, такие как транскрипционные или трансляционные энхансеры. Каждый дополнительный регуляторный элемент может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии (или регулирующей транскрипцию нуклеотидной последовательностью). Дополнительные регуляторные элементы могут предусматривать дополнительные промоторы, минимальные промоторы, промоторные элементы или транспозонные элементы, которые могут модифицировать или усиливать свойства, регулирующие экспрессию. Кассета экспрессии может также содержать один или несколько интронов, один или несколько экзонов и один или несколько терминаторов.

Кроме того, предполагается, что применимыми могут являться промоторы, объединяющие элементы из более чем одного промотора. Например, в патенте США №5491288 раскрыто объединение промотора вируса мозаики цветной капусты с гистоновым промотором. Таким образом, элементы из промоторов, раскрытых в данном документе, можно объединять с элементами из других промоторов. Промоторы, используемые для экспрессии трансгенов у растений, включают индуцируемые, вирусные, синтетические, конститутивные (Odell Nature 313: 810-812 (1985)), регулируемые во времени, регулируемые в пространстве, тканеспецифические и регулируемые в пространстве и времени промоторы. Используя регуляторные элементы, описанные в данном документе, можно экспрессировать множество агрономически значимых генов в трансформированных растениях. Более конкретно, растения можно создавать с помощью методик генной инженерии для экспрессии различных фенотипов, представляющих агрономический интерес.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В одном вариант осуществления настоящего изобретения предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где первое растение представляет собой линию-индуктор гаплоидов растения, и где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательную направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) опыление второго растения пыльцой от первого растения и (iv) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (с), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.

В одном аспекте способа фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленную нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из мегануклеаз (MN), нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), нуклеазы Cas9, нуклеазы Cfp1, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, химерной Cas9-цитидиндеазминазы, химерной Cas9-адениндезаминазы, химерной FEN1-FokI и Mega-TAL, никазы Cas9 (nCas9), химерной нуклеазы dCas9, не содержащей FokI, и нуклеазы dCpf1, не содержащей FokI; и кроме того, где направляющая нуклеиновая кислота представляет собой направляющую РНК.

В другом аспекте способа отредактированного гаплоидного потомка обрабатывают с применением средства для удвоения числа хромосом, за счет чего получают отредактированного потомка, являющегося удвоенным гаплоидом. Например, средство для удвоения числа хромосом представляет собой колхицин, пронамид, дитипир, трифлуралин или другое средство, оказывающее воздействие на микротрубочки.

В другом аспекте способа первое растение является однодольным растением или двудольным растением. Например, первое растение является однодольным растением, выбранным из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока. В другом аспекте второе растение является однодольным растением или двудольным растением. Например, второе растение является однодольным растением, выбранным из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.

В другом аспекте способа необязательная направляющая РНК представляет собой последовательность из 18-21 нуклеотида и является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33. В другом аспекте в первом растении экспрессируется маркерный ген. Например, маркерный ген выбран из группы, состоящей из GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, антоциановых пигментов и любого другого маркерного гена.

В другом аспекте способа первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-malt или из любой из нескольких других известных линий HI.

В одном варианте осуществления первое растение и второе растение принадлежат к разным видам. В одном аспекте первое растение представляет собой растение пшеницы, а второе растение представляет собой растение маиса. В другом аспекте первое растение представляет собой растение маиса, а второе растение представляет собой растение пшеницы.

Один объект изобретения представляет собой растение с отредактированными генами, полученное с помощью предусмотренного способа.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательную направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) опыление второго растения пыльцой от первого растения; (iv) применение композиции, содержащей липид или ингибитор фосфолипазы, непосредственно до, в ходе или после опыления согласно стадии (iii) и (v) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (iii), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленной первым растением. В одном аспекте композиция содержит метил-альфа-линоленоилфторфосфонат (MALFP), сложный этиловый эфир линолевой кислоты (LLAEE), линолевую кислоту (LLA), кукурузное масло, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), метиларахидонилфторфосфонат (MAFP), пальмитилтрифторметилкетон (PACOCF3), арахидонилтрифторметилкетон (AACOCF3), маноалид, сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный метиловый эфир олеиновой кислоты (ОАМЕ), сложный этиловый эфир олеиновой кислоты (ОАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитиновой кислоты (РАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (PLAEE), льняное масло, кукурузное масло, альфа-линоленовую кислоту (aLNA), гамма-линоленовую кислоту (gLNA), олеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, стеариновую кислоту, 9(Z)-11(Е)-конъюгированную линолевую кислоту или 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ редактирования геномной ДНК растений, предусматривающий: (i) получение первого растения, где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательно направляющую нуклеиновую кислоту; (ii) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию; (iii) скрещивание первого растения со вторым растением и (iv) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного путем скрещивания на стадии (iii), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленной первым растением. В одном аспекте первое растение действует в качестве женского родительского растения в скрещивании на стадии (iii). В другом аспекте первое растение содержит мутацию в гене CENH3, гене ig1 или другую мутацию, обеспечивающую получение систем, индуцирующих гаплоиды, которые содержат геном отцовского растения.

ПРИМЕРЫ

I. Получение новых линий-индукторов гаплоидов, содержащих редактирующий механизм

Проводили трансформацию поддающейся трансформации линии маиса под названием NP2222 с помощью конструкции TALEN, и отдельно трансформировали эту линию с помощью Cas9 и конструкции направляющей РНК. Конструкцию TALEN (pBSC22808 (SEQ ID NO: 5) с TALEN, осуществляющими целенаправленное расщепление в пределах последовательности-мишени 5'-TCCAGGGTCAACGTGGAGACAGGGAGGTACGAACCGGTGACTGGCGAAGGAAGCA-3', SEQ ID NO: 6; последовательность для распознавания TALEN подчеркнута) и конструкцию Cas9 (pBSC23123 (SEQ ID NO: 7) с последовательностью направляющей РНК xZmPLAIIA, 5'-GGGTCAACGTGGAGACAGGG-3', SEQ ID NO: 8) сконструировали для введения целевых мутаций в четвертый экзон гена маиса под названием MATRILINEAL (MATL; GRAMENE ID: GRMZM2G471240). В том случае, если этот ген подвергают мутации в сайте-мишени с помощью TALEN или с помощью Cas9 и направляющей РНК, он нокаутируется, что приводит к потере функции белкового продукта. Ранее установили, что линии, которые являются гомозиготными по мутациям с потерей функции в MATL, представляют собой линии-индукторы гаплоидов, а это означает, что если их используют в качестве доноров пыльцы при скрещивании, то они индуцируют образование гаплоидов на полученных початках (см. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, поданную 17 ноября 2016 г., включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

Получали несколько трансгенных объектов и осуществляли их самоопыление с тем, чтобы получить семена Т1. Выращивали отдельные растения Т1 из трансгенного объекта MZET152408A042A. Обнаружили, что пять потомков Т1, которые сохранили две копии Cas9 и редактирующий механизм в виде направляющей РНК, были стабильно трансформированными, а также являлись гомозиготными мутантами по гену MATL. См. таблицу 1.

Мутации в MATL выявляли с использованием анализа TaqMan, в ходе которого амплифицируют копию MATL дикого типа (называемую в данном документе MATL или wt-MATL; причем эти термины используются взаимозаменяемо по всему данному документу). В том случае, если обе копии MATL мутировали, тогда этот анализ считают отрицательным (то есть "-"). Редактирующий механизм на основе Cas9 и направляющей РНК были стабильно встроены посредством конструкции 23123 (SEQ ID NO: 7). Проводили секвенирование на предмет мутаций в MATL посредством ПЦР и субклонирования. Проводили секвенирование четырех колоний каждого ПЦР-продукта, и при этом все колонии для данного отдельного растения имели одинаковую последовательность, что указывало на то, что все эти растения являлись гомозиготными мутантами по аллелю MATL (также упоминаемому в данном документе под названием matl при ссылке на вставку 4 пар оснований в MATRILINEAL, выявленную в Stock6 и других линиях, производных от Stock6, или μMATL при ссылке на любую другую индуцированную человеком мутацию в MATRILINEAL). У двух растений имелись делеции размером 8 п.о., а у трех растений делеции размером 13 п.о.

II. Использование новых линий HI в качестве мужского родительского растения и анализ потомков

Проводили скрещивание вышеуказанных новых растений HI в качестве доноров мужской пыльцы с контрольной линией женских растений, которая содержала рецессивный маркер цвета, но представляла собой дикий тип по гену MATL. Линии-индукторы гаплоидов, являющиеся мужскими растениями, представляли собой гомозиготный дикий тип в отношении того же маркера цвета. Таким образом, эта линия женских растений представляла собой негаплоидный индуктор и была гомозиготной по дикому типу в отношении гена MATL, но гомозиготным мутантом по маркеру цвета. Собирали семена, полученные в результате скрещиваний, и проростки, проросшие из них.

С проростками-потомками проводили несколько анализов. Проростки-потомки оценивали как диплоиды, если они не проявляли маркера цвета (потому что рецессивный маркер комплементировался индукторной ДНК мужского растения). Проростки-потомки оценивали как предполагаемые гаплоиды, если они действительно проявляли маркер цвета, потому что рецессивный маркер не комплементировался. Из 2656 высаженных семян авторы данного изобретения использовали анализ цвета и идентифицировали 90 проростков в качестве предполагаемых гаплоидов.

Дополнительно провели анализ 90 предполагаемых гаплоидов на присутствие гена MATL дикого типа с использованием маркерного анализа Taqman. Из них 82 были положительными по MATL, что означало то, что они не подверглись редактированию за счет редактирующего механизма, обеспечиваемым мужским родительским растением. Оставшиеся 8 предполагаемых гаплоидных проростков были отрицательными по MATL дикого типа при использовании маркера Taqman, что указывало на то, что они могли редактироваться за счет редактирующего механизма, обеспечиваемого мужским родительским растением.

Проводили анализ плоидности с помощью проточной цитометрии на этих 8 предполагаемых подвергнутых редактированию гаплоидных проростках с использованием ткани листьев в анализаторе плоидности. См. фигуры 1-8. Обнаружили, что четыре из них были истинными гаплоидами, тогда как остальные были в действительности диплоидами. Как обсуждается ниже, проводили ПЦР и секвенирование на присутствие мутаций в гене MATL в этих четырех истинных гаплоидах, а также в случае растения USR01350337-2, которое, согласно анализу Taqman MATL, не подверглось редактированию за счет механизма для редактирования генома.

Выявление того, что среди 90 предполагаемых гаплоидов были четыре диплоида, не было неожиданным, поскольку анализ проростков не является оптимальным и иногда дает ложнопозитивные результаты. Проводили проверку 90 гаплоидов на присутствие конструкции Cas9 (конструкции 23123) и обнаружили, что она отсутствовала у 86 из 90, включая четырех истинных гаплоидов, упомянутых выше. Напротив, у всех четырех отредактированных диплоидов, которые выявили в ходе анализа плоидности, присутствовала конструкция Cas9, что подтверждало их статус гибридных диплоидов, которые были ошибочно идентифицированы с помощью анализа гаплоидных проростков как являющиеся гаплоидами.

Затем использовали ткань листьев для выделения геномной ДНК и осуществляли реакцию ПЦР для секвенирования гена MATL у этих четырех истинных гаплоидных, предположительно отредактированных индивидуумов, уделив основное внимание последовательности, фланкирующей сайт для целевого мутагенеза направляющей РНК. Это должно было определить природу изменений, которые могли или не могли произойти в том участке. Проводили субклонирование фрагмента ПЦР с использованием коммерчески-доступного набора ТОРО Blunt IV и секвенировали по меньшей мере четыре колонии каждого (прямое и обратное секвенирование). См. таблицу 2 ниже для сравнения отредактированных аллелей и эталонного аллеля wt-MATL.

Отдельный USR01350333-3 давал отредактированный аллель MATL со вставкой аланина в пару оснований 1143 в последовательности кДНК (подчеркнута в таблице 2). Этого было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. То, что ранее считали отредактированным аллелем №2 USR01350333-3 (делеция 13 пар оснований из GACAAGGGAGGTAC), в действительности являлось результатом контаминации реакционной смеси для ПЦР. После повторного секвенирования подтвердили, что это растение имеет только один отредактированный аллель, и он был выявлен у 6 из 6 колоний.

Этот аллель являлся новым в том смысле, что он отсутствовал и в мужских, и в женских родительских растениях этого индивидуума. ID мужского родительского растения для этого индивидуума был USR01283391, и было выявлено, что данное растение является гомозиготным по делеции размером 8 п.о.

Отдельный USR01350344-2 предусматривает делецию А (делеция пары оснований 1143 в последовательности кДНК дикого типа). Этой мутации было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. После повторного секвенирования и выявления контаминации реакционной смеси для ПЦР авторы настоящего изобретения подтвердили, что это было обнаружено в 6 из 6 колоний. Идентифицированный ранее как отредактированный аллель №2 USR01350344-2 впоследствии это было идентифицировано как контаминация реакционной смеси для ПЦР.

Отдельный USR01350343-1 предусматривает вставку А в пару оснований 1143 последовательности кДНК. Этого было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. Это было обнаружено у 4 из 4 колоний.

Отдельный USR01350328-1 предусматривает делецию А (делеция пары оснований 1143 из последовательности кДНК дикого типа). Этой мутации было бы достаточно, чтобы вызвать сдвиг рамки в кодирующей последовательности, что привело бы к преждевременному СТОП-кодону. Это было обнаружено у 4 из 4 колоний.

Отдельный USR01350337-2 не имел изменений: его последовательность была на 100% идентична последовательности wt-MATL.

В итоге обнаружили, что 4 из 86 подтвержденных гаплоидов содержали мутации в гене MATL. Подтвердили, что эти растения являлись гаплоидами и не содержали ДНК Cas9. Совершенно очевидно, что трансген Cas9 был удален вместе с остальной частью ДНК, происходящей из мужского растения, в ходе эмбриогенеза, и что в процессе эмбриогенеза произошли изменения в геноме женского растения (происходящем из яйцеклетки).

Авторам настоящего изобретения известно, что изменения являются новыми и произошли в геноме женского растения в процессе эмбриогенеза, потому что линия-индуктор гаплоидов обычно производит гаплоиды материнского растения, и авторы подтвердили, что это были действительно гаплоиды. Можно было бы предположить существование вероятности того, что в действительности это отцовские гаплоиды и что изменения, которые авторы настоящего изобретения выявили, на самом деле представляли собой изменения, которые уже присутствовали в ДНК отцовского растения. Однако авторы данного изобретения смогли доказать, что дело обстоит иначе. Во-первых, мутации не совпадают с мутациями отцовского родительского растения. Это можно четко увидеть в таблицах 3 и 4 (показаны ниже). Отредактированное гаплоидное растение USR01350343-1 было гомозиготным по вставке одного нуклеотида ("А"), но мужское родительское растение имело делецию из 13 нуклеотидов. Аналогично растение USR01350328-1 было гомозиготным по делеции А, но мужское родительское растение имело делецию из 13 нуклеотидов. Эти примеры, взятые вместе, доказывают, что в процессе индукции гаплоидов возможно осуществление редактирования генома материнского растения, что приводит к образованию отредактированных гаплоидов материнского растения. В соответствии с этим и на основании анализа, определяющего присутствие MATL, и подтверждения посредством анализа плоидности, и с использованием трансгена Cas9 на стороне мужского растения под контролем промотора убиквитина маиса, показатель редактирования в ходе процесса индукции гаплоидов составлял приблизительно 4/86 или 4,65%.

Кроме того, показатель редактирования в ходе индукции гаплоидов может сильно отличаться в случае использования различных линий-индукторов гаплоидов или использования широких скрещиваний. Очевидно, что и индукция гаплоида у маиса с использованием мутантных линий MATL, и широкие скрещивания у ячменя, пшеницы или других культур действуют посредством схожих механизмов: оплодотворение сопровождается удалением генома. Очевидно также, что промежуток времени между оплодотворением и удалением генома был достаточно длинным для того, чтобы редактирующий механизм мог осуществить редактирование целевого гена в геноме линии, с которой гибридизировалась линия-индуктор (целевая гермоплазма). Следует отметить, что выбор промотора, управляющего экспрессией стабильно трансформированной системы белков редактирования, может оказывать большое влияние на показатель редактирования в гаплоидах. Использовали конститутивный промотор сахарного тростника (prSoUbi4), однако другие промоторы, вызывающие высокую или специфическую экспрессию в зародышевом мешке, яйцеклетке, пыльце или спермиях, могут быть более эффективными, особенно в случае широких скрещиваний, при которых ДНК самцов удаляется гораздо более надежно и быстро, чем во внутривидовых системах с использованием индуктора гаплоидов, таких как система с использованием индуктора гаплоидов маиса или система с использованием индуктора гаплоидов типа CENH3. Другими словами, в ходе широкого скрещивания, например, при скрещивании пыльцы маиса на колосках пшеницы, которое осуществляется для того, чтобы индуцировать гаплоиды материнского растения, лучше всего редактирующий механизм функционирует в пыльце маиса под управлением промотора, который характеризуется сильной экспрессией в пыльце или спермиях, возможно, дополнительно к экспрессии в зиготе, в результате чего присутствующий в избытке редактирующий механизм (РНК и белок) доставляется и присутствует в клетке зиготы и на последующих двух-, четырех- или восьмиклеточных стадиях развития зародыша, даже если ДНК мужского растения удаляется или утрачивается очень быстро.

III. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов в элитных инбредных линиях маиса

Трансформируемую линию-индуктор гаплоидов, NP2222-HI, RWK, RWS или UH400 или Stock6 или любую другую линию-индуктор гаплоидов, у всех из которых уже имелись мутантные версии MATL, стабильно трансформировали с помощью конструкции, экспрессирующей систему модификации генома, такой как Cas9 + направляющая РНК (Cong, L. et al. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823), dCas9-FokI + направляющая РНК (Tsai, S. Q. et al. 2014, Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnol. 32, 569-576), TALEN (Li et al., 2012, High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nature Biotech. 30, 390-392), сконструированная мегануклеаза (Gao et al., 2010, Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. Plant Journal. 61: 176-187), нуклеаза типа "цинковых пальцев" (Shukla et al. 2009. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 459, 437-441), dCas9-цитидиндезаминаза (Komor et al. 2016, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946) или любая другая система модификации генома. Затем трансгенную линию-индуктор гаплоидов, также экспрессирующую редактирующий механизм, используют в качестве донора пыльцы для создания мутаций и гаплоидов в целевых линиях посредством ауткроссинга. Гаплоидные зародыши или семена затем извлекают, идентифицируют как гаплоиды и тестируют в отношении изменений в сайте-мишени (какой бы целевой сайт не был выбран посредством разработки конструкции TALEN или разработки направляющей РНК Cas9). В гаплоидах, содержащих требуемые изменения, удваивали число хромосом с использованием стандартных процедур, с использованием стандартных средств, таких как колхицин, трифлуралин или другое средство для удвоения числа хромосом. Идентификацию индуцированных гаплоидов можно упростить с помощью маркера цвета, как это обычно проводят при получении гаплоидов кукурузы с удвоенным числом хромосом - этот маркер цвета может проявляться в полученных зародышах, семенах, проростках или во взрослом растении. Присутствие мутаций в сайте-мишени можно проверить с помощью анализа последовательностей (секвенирования ДНК), с помощью анализа маркеров или по фенотипу. Поскольку существует только одна копия ДНК для мутации в гаплоидных растениях, то рецессивные фенотипы должны отображаться так, чтобы это могло представлять собой другой способ идентификации гаплоидов, которые были отредактированы.

А. Мутагенез мишеней VLHP в элитной инбредной линии маиса с трансгенным локусом редактирования, созданным непосредственно в линии-индукторе гаплоидов.

VLHP1 и VLHP2 являются гомеобоксными генами гомеодомена-лейциновой застежки I класса и представителями класса белков, которые являются уникальными для растений. Домен HD вовлечен в связывание ДНК, тогда как домен Zip вовлечен в гомо- и гетеродимеризацию белка. Белки HD-Zip I обычно вовлечены в реакции, связанные с абиотическим стрессом, абсцизовой кислотой (ABA), синим светом, деэтиоляцией и эмбриогенезом (Elhiti and Stasolla, 2009. Structure and function of homodomain-leucine zipper (HD-Zip) proteins. Plant Signal Behav. 4: 86-88). VLHP1 и VLHP2 принадлежат к тому же семейству генов, что и Grassy Tillers1 (GT1). GT1 способствует покою боковых почек и супрессирует удлинение боковых ветвей початков у маиса.

В данном примере вектор 23396 (SEQ ID NO: 1; см. также фигуру 9) для экспрессии Cas9 и одиночной направляющей РНК (sgRNA) был создан для нацеливания на VLHP1 маиса (GRMZM2G104204) и его гомологичный ген VLHP2 (GRMZM2G062244). Вектор 23396 экспрессирует sgRNA с 20-нуклеотидной нацеливающей последовательностью xZmVLHP-01 (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2). xZmVLHP-01 нацеливается на оба гена VLHP1 и VLHP2 во втором экзоне. Вектор 23396 вводили в трансформируемую линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI с использованием Agrobacterium-опосредованной трансформации с отбором по утилизации маннозы. NP2222-HI получали в результате скрещивания трансформируемой инбредной линии NP2222 маиса с производной от Stock6 линией RWKS для интрогрессии в локус индукции гаплоидов (HI). NP2222-HI характеризовался средним показателем индукции гаплоидов, составляющим приблизительно 9,2%.

Трансформанты NP2222-HI из вектора 23396 анализировали в отношении модификации геномных целевых последовательностей VLHP (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCA/GCG-3'; SEQ ID NO: 2). Наклонная черта ("/") представляет положение расщепления Cas9. Активность редактирования целевого локуса определяли с использованием способа количественной ПЦР Taqman, как описано ранее (WO 2016106121, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Трансгенные линии с высокими уровнями активностями модификации сайта-мишени, т.е. были модифицированы оба гена VLHP1 и VLHP2, и предпочтительно содержащие одну копию трансгена, отбирали для дальнейших исследований и использовали для скрещивания или получения потомков.

Пыльцу от трансформантов 23396 T0 использовали непосредственно для опыления початков элитной инбредной линии ID5829 или других линий маиса, в том числе линий сладкой кукурузы, для индукции получения гаплоидных зародышей. В качестве альтернативы трансформанты 23396 T0 на фоне NP2222-HI самоопылялись с получением линий потомков, несущих гомозиготный трансген, и при этом пыльцу от растений-потомков использовали для опыления других линий кукурузы, чтобы индуцировать образование гаплоидных зародышей. Индуцированные гаплоидные зародыши извлекали из ядер и помещали в среду для спасения зародышей для непосредственного прорастания или оставляли для созревания с образованием семян. Ткани из индуцированных гаплоидных эмбрионов и полученных в результате растений анализировали с тем, чтобы определить, происходило ли редактирование в целевых последовательностях VLHP. Если индуцированные гаплоидные зародыши или растения содержали требуемые мутации, то задействовали обработку для удвоения числа хромосом, чтобы получить из них линии, являющиеся двойным гаплоидом. Например, с использованием способа спасения зародышей зародыши извлекали из початков элитной линии ID5829, опыленных трансгенной линией-индуктором гаплоидов, несущей локус редактирования 23396, через 18-22 дня после опыления ("DAP", теоретически возможно извлечение между 10-25 DAP). ДНК выделяли из проросших гаплоидных проростков и использовали для анализа. Для удвоения числа хромосом по отношению к проростку использовали обработку колхицином. В качестве альтернативы средство для удвоения числа хромосом можно наносить на выделенные зародыши в ходе прорастания. ДНК извлекали из проросших проростков и использовали чтобы определить, произошла ли мутация в целевой последовательности xZmVLHP-01.

Доступны альтернативные способы. Можно предоставить возможность семени созреть и отобрать гаплоиды позже по другому фенотипу. Можно было бы дать возможность семени высохнуть и в более поздние сроки прорастить семена, чтобы определить гаплоиды без маркера (например, с использованием размера растения, а не гена, обеспечивающего маркер цвета), после чего можно будет проверить присутствие изменений и применять средства для удвоения числа хромосом в том случае, если это необходимо. Этот способ может иметь свои преимущества, заключающиеся в исключении скрининга и/или спасения зародышей.

В. Мутагенез мишеней GW2 в элитной инбредной линии маиса с трансгенным локусом редактирования, введенным непосредственно в линию-индуктор гаплоидов.

Мутация в DA2, гене E3-убиквитинлигазы, у риса приводила к получению более крупных семян (Song et al., 2007). У риса DA2 имелись 2 гомолога маиса, GW2-1 (GRMZM2G170088) и GW2-2 (GRMZM2G007288). Гены маиса на 94% идентичны на уровне белка и на 90% идентичны на уровне ДНК. GRMZM2G170088 содержал большую вставку размером 177 п.о. (59 аа) по сравнению с GRMZM2G007288.

В данном примере вектор 23399 (SEQ ID NO: 3, см. также фигуру 10) был создан для экспрессии Cas9 и sgRNA для нацеливания как на гены маиса GW2-1 (GRMZM2G170088), так и на их гомолог GW2-2 (GRMZM2G007288). Оба гена GW2-1 и GW2-2 содержали целевую последовательность xZmGW2-02 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4) в экзоне 1, и эту последовательность использовали для конструирования sgRNA, экспрессируемой из вектора 23399. Бинарный вектор 23399 экспрессировал одиночную направляющую РНК (sgRNA) с 20-нуклеотидной нацеливающей последовательностью xZmGW2-02, слитой с одиночной направляющей каркасной РНК, содержащей crRNA, и из tracrRNA. Вектор 23399 вводили в трансформируемую линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI с использованием Agrobacterim-опосредованной трансформации с отбором по утилизации маннозы. NP2222-HI получали в результате скрещивания трансформируемой инбредной линии NP2222 маиса с производной от Stock6 линией RWKS для интрогрессии в локус индукции гаплоидов (HI).

Трансформанты NP2222-HI из вектора 23399 анализировали в отношении модификации геномных целевых последовательностей GW2-2 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTA/CCC-3', SEQ ID NO: 4; наклонная черта ("/") указывает на положение расщепления Cas9). Активность редактирования целевой последовательности определяли с использованием способа количественной ПЦР Taqman, как описано ранее (WO 2016106121). Трансгенные линии с высокими уровнями активностями модификации сайта-мишени, т.е. были модифицированы оба гена GW2-1 и GW2-2, и предпочтительно содержащие одну копию трансгена, отбирали для дальнейших исследований и использовали для скрещивания или получения потомков.

Пыльцу от трансформантов 23399 T0 использовали непосредственно для опыления початков элитной инбредной линии ID5829 или другой линии маиса, в том числе линий сладкой кукурузы, для индукции получения гаплоидных зародышей. В качестве альтернативы трансформанты 23399 T0 на фоне NP2222-HI самоопылялись с получением линий потомков, несущих гомозиготный трансген, и при этом пыльцу от растений-потомков использовали для опыления других линий кукурузы, чтобы индуцировать образование гаплоидных зародышей. Индуцированные гаплоидные зародыши извлекали из ядер и помещали в среду для спасения зародышей для непосредственного прорастания или оставляли для созревания с образованием семян. Ткани из индуцированных гаплоидных эмбрионов и полученных в результате растений анализировали с тем, чтобы определить, происходило ли редактирование в целевых последовательностях GW2 маиса. Если индуцированные гаплоидные зародыши или растения содержали требуемые мутации, то задействовали обработку для удвоения числа хромосом, чтобы получить из них линии, являющиеся двойным гаплоидом. Например, с использованием способа спасения зародышей зародыши извлекали из початков элитной линии ID5829, опыленных трансгенной линией-индуктором гаплоидов, несущей локус редактирования 23396, через 18-22 дня после опыления. ДНК выделяли из проросших гаплоидных проростков и использовали для анализа. Для удвоения числа хромосом по отношению к проростку использовали обработку колхицином. В качестве альтернативы средство для удвоения числа хромосом можно наносить на выделенные зародыши в ходе прорастания. ДНК извлекали из проросших проростков и использовали, чтобы определить, произошла ли мутация в целевой последовательности xZmGW2-02. В качестве альтернативы можно предоставить возможность семени созреть и отбирать гаплоиды позже по другому фенотипу. Семени даже можно предоставить возможность высохнуть, и в более поздние сроки прорастить семена, чтобы определить гаплоиды без маркера (например, с использованием размера растения, а не гена, обеспечивающего маркер цвета), после чего можно будет проверить присутствие изменений и применять средства для удвоения числа хромосом в том случае, если это необходимо. Этот способ может иметь свои преимущества, заключающиеся в исключении скрининга и/или спасения зародышей.

IV. Одновременная индукция гаплоидов и редактирование в кукурузе, рисе, подсолнечнике или любой другой сельскохозяйственной культуре посредством индукции гаплоидов на основе химических методик

Любая линия кукурузы, риса, пшеницы, томата, подсолнечника, ячменя или любой другой сельскохозяйственной культуры может быть трансформирована с помощью конструкции для редактирования (Cas9 с направляющими РНК, сконструированные для введения мутации в конкретный целевой сайт), и кроме того, необязательно можно сделать конструкцию для редактирования гетерозиготной или гомозиготной (посредством самоопыления трансформированного трансгенного объекта), а дальнейшее использование липидов или масел, наносимых в ходе ауткроссинга (опыление на целевые линии), индуцирует гаплоиды de novo и одновременно редактирует сайты-мишени в целевых геномах. Эти наносимые липиды обладали способностью индуцировать гаплоиды в случае применения по отношению к пыльце, кистям нитей рыльца, цветкам или кистям любого растения независимо от мужского родительского растения. В частности, от мужского родительского растения не требуется присутствия каких-либо мутаций в гене MATL (т.е. это может быть гомозиготный дикий тип для гена MATRILINEAL). Эти наносимые липиды индуцировали гаплоиды de novo без каких-либо генетических требований со стороны любого из родительских растений. См. заявку согласно РСТ на выдачу патента США №PCT/US2016/62548, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Механизм индукции гаплоидов de novo посредством липидного спрея, по-видимому, функционировал так же, как и в мутантных линиях matl (генетический индуктор гаплоидов): посредством удаления хромосом после оплодотворения. Гаплоидных потомков отделяли и проверяли на присутствие индуцированных мутаций (вызванных посредством процесса редактирования), а затем удваивали для получения отредактированных растений, являющихся удвоенным гаплоидом.

V. Мутагенез целевых последовательностей в элитной полевой кукурузе и инбредных линиях сладкой кукурузы с трансгенным локусом редактирования, интрогрессированным в линию-индуктор гаплоидов

Механизм для редактирования генома, экспрессирующего трансгенный локус, также может быть создан в обычной трансформируемой линии маиса без индуцирующей гаплоиды активности, как, например, А188, Hi-II или NP2222, а затем интрогрессирован в линию-индуктор гаплоидов, такую как NP2222-HI, RWK, RWKS, RWS, или UH400, или Stock6, или любую другую линия-индуктор гаплоидов.

В данном примере инбредная линия маиса NP2222 трансформирована векторами Cas9-sgRNA VLHP (23396 и 23397) и векторами Cas9-sgRNA GW2 (23398 и 23399). Векторы 23396 и 23399 описали в предыдущих примерах (пример IIIA и пример IIIB). Вектор 23397 (SEQ ID NO: 20) идентичен 23396 за исключением того, что gRNA-кодирующая последовательность xZmVLHP-01 (5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', SEQ ID NO: 2) заменена на xZmVLHP-02 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21). Вектор 23398 (SEQ ID NO: 23) идентичен 23399 за исключением того, что gRNA-кодирующая последовательность xZmGW2-02 (5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', SEQ ID NO: 4) в 23399 заменена на xZmGW2-01 (5'-GAGCGGTTCACGCGGCCGCA-3', SEQ ID NO: 23). Эти векторы были введены в штамм LBA4404 (pVGW7) Agrobacterium. Полученный в результате штамм Agrobacterium, содержащий векторы 23396, 23397, 23398 или 23399, использовали для трансформации незрелых зародышей трансформируемой элитной инбредной линии NP2222. Каллюсы индуцировали из инфицированных незрелых зародышей и отбирали на маннозной среде для восстановления трансгенных каллюсов. Трансгенные каллюсы помещали в среду для регенерации и укоренения для восстановления трансгенных растений, экспрессирующих редактирующий механизм CRISPR-Cas9. Трансгенные растения анализировали в отношении количества копий трансгена и перемещали в теплицу для получения семян.

Трансформанты с одной копией вектора 23396 (MZET154902A004A, MZET154902B006A), 23397 (MZET154903B009A, MZET154903B012A), 23398 (MZET154904B005A, MZET154904B014A) и 23399 (MZET154905A002A, MZET154905A010A) идентифицировали и подвергали обратному скрещиванию с нетрансгенным NP2222. Початки растений трансгенных потомков, содержащие вставку Т-ДНК каждого из вышеуказанных векторов, опыляли пыльцой линии-индуктора гаплоидов RWKS с получением потомков F1. Потомки F1, содержащие трансгенный локус и локус индукции гаплоидов, идентифицировали с помощью анализов генотипирования и подвергали самоопылению с получением семян потомства F2. Высаживали семена потомков F2, и с помощью анализов qPCR Taqman анализировали прорастающие растения с целью идентификации растений, гомозиготных по трансгенному локусу Cas9-sgRNA (анализ №2540) и по локусу индукции гаплоидов (анализ №2827).

Линии, гомозиготные по локусу индукции гаплоидов, и предпочтительно гомозиготные трансгенные локусы редактирования 23396, 23397, 23398 и 23399 Cas9-sgRNA, использовали для опыления початков целевой элитной линии полевой кукурузы ID5829 и линий сладкой кукурузы (SWC726 или SWC412F) с целью индукции гаплоидов. Индуцированные гаплоидные зародыши выделяли из опыленных початков ID5829, SWC412F, SWC726 и выращивали на средах для спасения зародышей. В качестве альтернативы опыленным початкам давали созреть и проращивали ядра с гаплоидными зародышами. Образцы листьев отбирали и анализировали с помощью анализа Taqman для идентификации растений, содержащих мутации в генах VLHP и GW2, однако отсутствовали генетические компоненты из линии индукции, такие как трансгенная Cas9-sgRNA или другие нетрансгенные последовательности маркерного гена. Идентифицированные гаплоидные растения с целевыми мутациями генов GW2 или VLHP обрабатывали колхицином для удвоения числа хромосом, чтобы восстановить гаплоидные растения с удвоенным числом хромосом для получения семян. В качестве альтернативы извлеченные гаплоидные зародыши можно обрабатывать средством для удвоения числа хромосом, таким как колхицин, и полученные растения анализировали в отношении уровня плоидности и присутствия целевых мутаций в генах GW2 или VLHP. Растения с целевыми мутациями генов GW2 и VLHP выращивали до зрелого состояния с целью получения семян и дальнейшей оценки потомков.

Например, отредактированные гаплоидные линии (JSER82A056 и JSER82A063) идентифицировали из скрещиваний между початками линии сладкой кукурузы SWC412F, опыленными гаплоидным индуктором, содержащим трансген Cas9-sgRNA 23399. Линия JSER82A056 содержала оба мутированных целевых гена: и GW2-01, и GW2-02, тогда как линия JSER82A063 содержала только мутированный ген GW2-02 (см. таблицу 5). Ни одна из этих линий не содержит трансген Cas9 (анализ №2540 для Cas9 или №1750 для селектируемого маркерного гена PMI) или ген индуктора гаплоидов (анализ №2827), поскольку геном мужского растения был удален из гаплоидов. Анализ уровня плоидности подтвердил, что обе линии являлись гаплоидами (фигуры 11 и 12). Обратите внимание, что гены дикого типа ("WT") в гаплоидах имеют номер копии "2", а мутант будет иметь "0", поскольку обозначение копии относится к количеству копий эндогенного гена ADH. Следовательно, гаплоидные линии, несущие неотредактированные гены GW2-01 или GW2-02 WT, будут иметь обозначение копии "2". Локус индуктора гаплоидов WT будет иметь обозначение копии "2" для анализа №2826 и "0" в случае анализа №2827 (вариант индуктора гаплоидов). Если линия растения кукурузы является диплоидом между сладкой кукурузой и трансгенным индуктором, то она будет гетерозиготной по гену индуктора гаплоидов и таким образом будет иметь обозначение копии "1" в случае анализа №2826 и анализа №2827.

Для дополнительного подтверждения специфического для мишени редактирования в этих гаплоидных линиях целевой участок GW2-02 амплифицировали из JSER82A063 с помощью ПЦР и проводили секвенирование ПЦР-продукта. Одно основание С было удалено в JSER82A063 по сравнению с последовательностью WT именно в сайте для расщепления с помощью Cas9 (фигура 13). Эти результаты четко продемонстрировали, что редактирующий механизм, внесенный в яйцеклетку от гаметофита мужского растения, способен редактировать геном женского растения до того, как геном мужского растения будет удален после двойного оплодотворения с образованием гаплоидного зародыша. Кандидатные отредактированные гаплоидные линии без трансгена обрабатывали путем введения 0,125% колхицина в 0,5% DMSO или пропитывания проростков в 0,06% растворе колхицина (Eder and Chalyk, 2002, In vivo haploid induction in maize. Theor. Appl. Genetics 104: 703-708). Обработанные линии высаживали в почву и выращивали в теплице для получения семян потомков.

VI. Одновременные индукция гаплоидов и редактирование у пшеницы и других однодольных растений посредством широкого скрещивания

Индукции гаплоидов также достигали с использованием межвидовых или межродовых широких скрещиваний (Kasha and Kao, 1970, High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225: 874-886). Например, гаплоиды пшеницы можно получать с помощью опыления с использованием различных межродовых скрещиваний с маисом (Suenaga и Nakajima 1989), жемчужным просом (Inagaki и Mujeeb-Kazi 1995), теосинте (Ushiyama et al. 1991), Н. bulbosum (Barclay 1975) и сорго (Ohkawa et al. 1992). Гаплоиды ячменя получали с помощью опыления пыльцой Hordeum bulbosum. Гаплоиды табака можно получать путем скрещивания с пыльцой N. africana. В других культурах существуют многие другие примеры.

Подобно примерам, приведенным выше, при введении трансгенного локуса редактирования в линию индукции Stock6 в эти линии можно вводить трансгенный локус редактирования, используемый для широких скрещиваний, с целью индуцирования гаплоидов и мутации целевой последовательности. Трансгенные линии, экспрессирующие редактирующие механизмы, могут быть получены в любой линии кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, жемчужного проса, риса, капусты, салата, помидора или любой другой сельскохозяйственной культуры с помощью непосредственной трансформации или ауткроссинга. Предпочтительно трансгенный локус делали гомозиготным, а затем эту линию использовали в качестве донора пыльцы при широком скрещивании с другими совместимыми реципиентными сельскохозяйственными культурами, чтобы индуцировать гаплоиды для получения требуемых изменений. Процесс удаления генома после оплодотворения при широких скрещиваниях в основном такой же, как и в мутантной системе MATL маиса, хотя в некоторых случаях чужеродная ДНК, полученная из пыльцы, и редактирующий механизм могут быть удалены чуть раньше в ходе развития зародышей, поэтому данный способ предпочтительно применять на практике с использованием промотора, который управляет экспрессией редактирующего механизма в пыльце, спермиях и/или зиготной клетке, в результате чего присутствуют редактирующая РНК и белок, которые способны редактировать целевой геном, даже если ДНК мужского растения удалена достаточно быстро после оплодотворения.

Для демонстрации возможности осуществления одновременной индукции и редактирования гаплоидов посредством широких скрещиваний получали трансгенные линии маиса, экспрессирующие Cas9 и sgRNA, которые целенаправленно воздействуют на последовательности генов VLHP. Вектор 23763 (SEQ ID NO: 24) содержит кассеты экспрессии для Cas9 и sgRNA, содержащие протоспейсерную последовательность xTaVLHP1 (5'-GACGAGCAGGCGCAGTTCC-3', SEQ ID NO: 25) для направления Cas9-опосредованного расщепления сайтов-мишеней TaVLHP1 в пшенице. Геном пшеницы всего содержал три мишени xTaVLHP1 (TaVLHP1-4А, TaVLHP1-4 В и TaVLHP1-4D), каждая из которых имела три субгенома. Направляющая последовательность в 23397 (SEQ ID NO: 20), xZmVLHP (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21) также будет направлять расщепление целевых последовательностей VLHP пшеницы xTaVLHP2-1A (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 26) или xTaVLHP2-1B (5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 27). В геноме китайской яровой пшеницы имеется три гена VLHP2A, содержащие xTaVLHP2-1A, и 3 гена VLHP2B, которые содержат последовательности xTaVLHP2-1B. Векторы 23397 и 23763 трансформировали в инбредную линию маиса NP2222 с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации с целью получения трансгенных линий, экспрессирующих Cas9 и sgRNA. Линии трансгенного маиса выращивали в теплице и высаживали для получения растений Т1.

Пыльцу, собранную от растений трансгенного маиса Т0 или потомков Т1, несущих Т-ДНК вектора 23397 или 23763, использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. За один-два дня до периода цветения цветки пшеницы подвергали кастрации, а через два дня опыляли свежей пыльцой маиса, несущей редактирующий механизм. Для удобства, колоски из элитной линии пшеницы (16A300292) Syngenta с цитоплазматической стерильностью мужских растений ("CMS") также непосредственно использовали в качестве женских растений-доноров для индуцирования образования гаплоидных зародышей с помощью трансгенной пыльцы маиса, экспрессирующей Cas9-sgRNA 23397 или 23763. Зародыши извлекали из опыленных цветков через 14-20 дней после опыления для спасения зародышей, чтобы восстановить гаплоидные проростки из системы индукции гаплоидов пшеницы и маиса. Вырезанные зародыши культивировали либо на концентрированной MS (Murashige and Skoog 1962), либо на MS или базальной среде В5, содержащей различные органические добавки в различных модификациях, и выращивали in vitro в течение 3-5 недель при 20-25°С и продолжительности дня 16 часов.

Например, пыльцу потомков Т1 от трансгенной линии маиса MZET164902A044A, содержащую вектор 23763, использовали для опыления колосков линии 16А300292 CMS для индукции гаплоидов пшеницы. Гаплоидные зародыши подвергали процедуре спасения, и полученный в результате гаплоидный проросток пшеницы отбирали для qPCR-анализа с целью определения количества копий целевых последовательностей VLHP (см. таблицу 6). Было выявлено, что одна из гаплоидных линий (JSWER30A22) содержала мутацию в гене TaVLHP1-4B, но не в его ортологах TaVLHP1-4A и TaVLHP1-4D в субгеномах А и D. Анализ уровня плоидности подтвердил, что JSWER30A22 являлся истинным гаплоидом (см. фигуры 14 и 15). Мутацию в целевом участке TaVLHP1-4B дополнительно характеризовали с помощью секвенирования, и было обнаружено, что в ней имелась делеция размером 97 п.о., начиная с предсказанного сайта расщепления для Cas9 (фигура 16). Также идентифицировали еще одну линию JSW16A07 с копией "0" в гене TaVLHP1-4A (анализ №3252), что подтвердило нацеленное редактирование в целевой последовательности. Однако делеция в этом гене-мишени, вероятно, была довольно большой при удалении сайта(сайтов) связывания праймеров, поскольку авторы изобретения не смогли восстановить ПЦР-продукт для секвенирования. Гаплоидные проростки с отредактированным сайтом-мишенью были пересажены в почву через 3-5 недель выращивания в культуре in vitro. Пересаженные проростки адаптировали в течение одной недели в ростовой камере при том же режиме условий окружающей среды. После образования побегов добавляли колхицин. Однако обработка, приводящая к удвоению хромосом, может быть выполнена раньше при спасении зародышей на стадии культивирования in vitro или позже после пересадки. В том случае, если сеянцы цельной пшеницы обрабатывают для удвоения числа хромосом, корни гаплоидного проростка обрезают, оставляя зону размером 2-3 см, а затем погружают в 0,1% раствор колхицина с 2% диметилсульфоксидом (DMSO) и прибл. 0,05% Tween-20 при 20°С на 5 часов. После этой обработки корни промывают для удаления остатков колхицина и высаживают в торфяную почву. Образцы растительных тканей могут быть удалены из гаплоидных проростков с целью выявления мутаций, чтобы идентифицировать растения, содержащие мутации в последовательностях генов-мишеней TaVLHP, но с полностью устраненными хромосомами маиса, включая последовательности, кодирующие трансгенный редактирующий механизм. Поскольку JSWER30A22 относится к линии CMS, то растение опыляют восстановителем для получения семян потомков.

Для дополнительной демонстрации возможности осуществления одновременной индукции и редактирования гаплоидов посредством широких скрещиваний создавали трансгенные линии кукурузы, экспрессирующие Cas9 из пяти промоторов, которые характеризовались высокой и/или специфической экспрессией в пыльце, вместе с sgRNA, целенаправленно воздействующими на последовательности гена VLHP пшеницы. Этими пятью векторами были 24038 (SEQ ID NO: 34), 24039 (SEQ ID NO: 35), 24079 (SEQ ID NO: 36), 24091 (SEQ ID NO: 37) и 24094 (SEQ ID NO: 38). Во всех пяти из этих векторов использовали одну и ту же sgRNA, содержащую протоспейсерную последовательность xTaVLHP2 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 21) для направления Cas9-опосредованного расщепления сайтов-мишеней TaVLHP2 в пшенице. Геном пшеницы всего содержал три мишени xTaVLHP2 (TaVLHP2-2A, TaVLHP2-2B и TaVLHP2-2D), каждая из которых имела три субгенома. Направляющая последовательность в этих пяти конструкциях также направляет расщепление целевых последовательностей VLHP пшеницы, xTaVLHP2 (5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 26) или xTaVLHP3 (5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3', SEQ ID NO: 27). В геноме китайской яровой пшеницы имеется три гена TaVLHP2, содержащие xTaVLHP2, и 3 гена TaVLHP3, которые содержат последовательности xTaVLHP2-1B.

Вектор 24038 (SEQ ID NO: 34) содержит кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM5G876285 и терминатора tZmGRMZM5G876285 из гена prf3 (гомолог 3 профилина) маиса, который характеризуется чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует о высокой экспрессии в спермиях.

Вектор 24039 (SEQ ID NO: 35) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM2G020852 и терминатора tZmGRMZM2G020852 из гена ЕХРВ2 (БЕТА-ЭКСПАНСИН 2) маиса, который характеризовался чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует об экспрессии в спермиях.

Вектор 24079 (SEQ ID NO: 36) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы высокоэкспрессирующегося промотора prZmGRMZM2G146551 и терминатора tZmGRMZM2G146551 из гена ЕХРВ1 (БЕТА-ЭКСПАНСИН 1) маиса, который характеризовался чрезвычайно высокой нативной экспрессией на уровне РНК и белка в пыльце, что свидетельствует об экспрессии в спермиях.

Вектор 24091 (SEQ ID NO: 37) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы промотора prZmGRMZM2G471240 и терминатора tZmGMRMZM2G471240 из гена MATL (MATRILINEAL) маиса, который демонстрировал экспрессию на уровне РНК и белка в пыльце и, возможно, спермиях.

Вектор 24094 (SEQ ID NO: 38) содержал кассеты экспрессии для Cas9 под контролем предпочтительного для пыльцы промотора prZmGRMZM2G471240 и терминатора tZmGMRMZM2G471240 из гена MATL (MATRILINEAL) маиса, который демонстрировал экспрессию на уровне РНК и белка в пыльце и, возможно, спермиях. Эта конструкция дополнительно содержала N-концевое слияние флуоресцентного белка AmCyan на молекуле Cas9 для отображения и визуального контроля локализации Cas9 в пыльце.

Этими пятью векторами (24038, 24039, 24079, 24091 и 24094) трансформировали инбредную линию маиса NP2222 с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации для образования трансгенных линий, экспрессирующих Cas9 и sgRNA.

Линии трансгенного маиса выращивали в теплице, и при этом трансгенные растения с одной и двумя копиями подвергали ауткроссингу с яровой пшеницей и линией пшеницы CMS. Пыльцу, собранную от трансгенных растений маиса Т0, несущих Т-ДНК одного из векторов 24038, 24039, 24079, 24091 и 24094, использовали для опыления линии яровой пшеницы AC-Nanda с удаленными несозревшими пестиками. Пыльцу также использовали для эксперимента qRT, в котором экспрессию Cas9 измеряли на уровне РНК и сравнивали с экспрессией Cas9 в образцах листьев в том случае, если Cas9 был под контролем промотора убиквитина сахарного тростника, используемого во многих примерах с кукурузой и пшеницей, приведенных выше. На фигуре 17 видно, что экспрессия была высокой в пыльце, в среднем в приблизительно 100 раз выше у растений, несущих векторы Т-ДНК 24038, 24039 и 24079, по сравнению с промотором убиквитина. Экспрессия также была выше в пыльце растений, содержащих векторы 24038, 24039 и 24079, по сравнению с пыльцой, несущей конструкции промотора MATRILINEAL (24094 и 24091), который, как известно, характеризуется более низкой экспрессией нативного гена. Все пять из этих промоторов имели паттерны экспрессии, которые ограничивались пыльцой. Признаком того, что указанные промоторы функционировали надлежащим образом, было отсутствие какой-либо наблюдаемой экспрессии Cas9 T0 в листьях проростков каллюса и отсутствие какого-либо редактирования сайтов-мишеней VLHP в листьях маиса Т0 (не вдаваясь в теорию, редактирование могло происходить в сайтах-мишенях маиса, по всей вероятности, на стадии зрелой пыльцы, когда Cas9 экспрессировался в первый раз).

За один-два дня до периода цветения из цветков пшеницы удаляли несозревшие пестики линии CMS и линии AC Nanda. Через два дня цветки опыляли свежей пыльцой маиса, несущей редактирующий механизм Cas9-sgRNA из любой конструкции 24038, 24039, 24091 или 24094 (у растений Т0, трансформированных конструкцией 24079, созревание было замедленным, и таким образом они не скрещивались с пшеницей). Зародыши пшеницы извлекали из опыленных цветков через 14-20 дней после опыления для спасения зародышей, чтобы восстановить гаплоидные проростки из системы индукции гаплоидов пшеницы и маиса. Вырезанные зародыши культивировали либо на концентрированной MS (Murashige and Skoog 1962), либо на 1/2 MS или базальной среде В5, содержащей органические добавки в различных модификациях, и выращивали in vitro в течение 1-5 недель при 20-25°С и продолжительности дня 16 часов. Например, пыльцу потомков Т0 от трансгенной линии маиса MZKE172601A100A, содержащую вектор 24039, использовали для опыления колосков линии 16А300292 CMS для индукции гаплоидов пшеницы. Гаплоидные зародыши подвергали процедуре спасения, и полученные в результате гаплоидные проростки пшеницы отбирали для qPCR-анализа с целью определения количества копий целевых последовательностей VLHP (таблица 7). В этом анализе проводили тестирование в отношении трансгена Cas9 с использованием анализа №2540. Все подвергнутые спасению и тестированию зародыши пшеницы не содержали этого трансгена и имели баллы "0" по Cas9, поскольку не имели ДНК кукурузы в развивающемся зародыше, а следовательно, не имели трансген. ДНК кукурузы полностью удалялась, выводилась или не доставлялась полностью прежде всего в ходе процесса индукции гаплоидов, который происходил во время и/или после оплодотворения. Помимо Cas9, проводили тестирование для анализов №3332 и №3333, которые дали неспецифическую амплификацию обоих аллелей VLHP2-2A и -2D. Эти анализы обычно интерпретируются как "2" или ">2" в гаплоидной пшенице, и при этом большинство гаплоидов, которые получили с использованием пыльцы трансгенного маиса, оценивали как 2 или >2 для этих анализов. Эти анализы использовали для поиска предполагаемых отредактированных гаплоидов, осуществляя поиск в отношении баллов 0 или 1. Обозначение "1" может указывать на то, что один из двух аллелей, VLHP2-2A или -2D, был отредактирован. И наконец, проводили тестирование для анализа 3255 на гаплоидах AC Nanda, который специфически выявлял VLHP2-2B. Линия CMS не усиливала этот анализ, даже если она дикого типа, поэтому ее не использовали для гаплоидов CMS. Не отредактированные гаплоиды давали балл "2", тогда как обнаруживались предполагаемые отредактированные гаплоиды, потому что они имеют балл "0". Балл "1" мог бы указывать на ошибочное чтение или химерный частично отредактированный образец.

Например, обнаружили, что одно из гаплоидных растений AC Nanda 440-А5 содержало мутацию в гене TaVLHP2-2B, но не в его ортологах TaVLHP2-2A и TaVLHP2-2D в субгеномах А и D (таблица 7). Данные согласно Taqman также продемонстрировали, что в нем отсутствовал трансген Cas9. Мутацию в пределах целевого участка TaVLHP2-2B дополнительно характеризовали с помощью секвенирования, однако, хотя авторы настоящего изобретения смогли амплифицировать аллели А и D, при этом они уже не смогли амплифицировать аллель В, что свидетельствовало о присутствии редактирования в гораздо большем объеме, очевидно, о большой делеции, приводящей к тому, что ПЦР-продукт уже не амплифицировался.

В качестве другого примера выявили, что одно из гаплоидных растений 450-D11 CMS содержало мутацию либо в гомологе TaVLHP2-2D, либо в гомологе -2А в соответствии с баллом "1" для обоих анализов 3332 и 3333 (Таблица 7). Данные согласно Taqman продемонстрировали, что в растении отсутствовал трансген Cas9. Целевые участки TaVLHP2-2A, -2 В и -2D. дополнительно охарактеризовали с помощью секвенирования, однако, хотя авторы настоящего изобретения смогли амплифицировать аллели А и В, при этом они уже не могли амплифицировать аллель D, что свидетельствовало о присутствии редактирования в гораздо большем объеме, которое привело к ошибке в ходе ПЦР.

При анализе гаплоидов пшеницы 2295, полученных в результате скрещиваний с пыльцой маиса, несущей одну из следующих пяти предпочтительных для пыльцы экспрессионных конструкций (24038, 24039, 24091 и 24094), выявили 15 гаплоидов, для которых получили данные в ходе анализа Taqman, указывающие на возможное редактирование в любом из сайтов-мишеней VLHP2-2A, VLHP2-2D или VLHP2-2B. После секвенирования было выявлено, что семь из этих гаплоидов содержали последовательности дикого типа в сайтах-мишенях и были названы ложно положительными из-за ошибки Taqman. Полагают, что эти ошибки связаны либо с тем фактом, что анализы №3332 и №3333 дали неспецифическую амплификацию обоих аллелей VLHP-2A и -2D, что привело к некоторым пропущенным сигналам, либо с небольшим количеством ДНК.

Среди остальных 8 предполагаемых отредактированных гаплоидов шесть представляли собой AC Nanda (440-B3, 440-D3, 440-A5, 447-G8, 456-G9, 459-A2), где трансген для редактирования был из конструкции 24038. Четыре из них (440-B3, 440-D3, 440-A5 и 456-G9) содержали изменения в VLHP2-2B. Они были выявлены, поскольку согласно анализу Taqman их балл был равен "0" в случае анализа 3255. У этих растений отсутствовал Cas9 (балл "0"), но им присвоили баллы "2" дикого типа в отношении VLHP2-2A или VLHP2-2D (анализы №3332 и №3333), что указывало на то, что по этим сайтам они не были отредактированы. С помощью анализа плоидности эти шесть растений были подтверждены как гаплоиды. Предприняли попытку секвенировать отредактированные аллели, однако, хотя реакции ПЦР и секвенирования работали надлежащим образом в случае с 2А и 2D, авторы настоящего изобретения не смогли получить ПЦР-продукт для 2 В. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомологи 2 В из этих гаплоидных растений. Это может указывать на то, что редактирование вызвало значительное изменение в гене 2 В у этих растений, что может привести к удалению сайта отжига праймера. Предполагали, что многие из растений CMS также имели изменения в сайте-мишени VLHP2-2B, но у авторов настоящего изобретения отсутствовала возможность проведения анализа для выявления аллеля VLHP2-2B из линии CMS.

При анализе только AC Nanda рассчитали, что общий показатель редактирования в этом аллеле составил 0,7% для всех конструкций, но в случае конструкции 24038 он был особенно высоким и составил 1,4%.

В дополнение к этим четырем отредактированным гаплоидам с баллами "0" для 3255 нескольким другим растениям присвоили баллы "0 или 1" или "1" в случае 3255, что указывало на возможный химеризм (частичное редактирование в определенных линиях клеток зародыша или ростка), однако в дальнейшем наблюдения за этими растениями не проводили. В случае гомолога VLHP2-2A AC Nanda растение 447-G8 содержало изменение, которое также не смогли секвенировать из-за ошибки в реакции ПЦР, хотя 2В и 2D действительно амплифицировались и содержали последовательность дикого типа. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2А. Как и в случае с VLHP2-2D, растение 459-А2 содержало изменение, которое не смогли секвенировать из-за ошибки в реакции ПЦР. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2D. Также выявили предполагаемые изменения в 447-Н12 и 440-G6, однако после секвенирования обнаружили, что эти результаты были ложноположительными.

В случае гаплоидов CMS растению 450-D11 присвоили баллы "1" в случае обоих анализов №3332 и 3333 (таблица 7). В ходе секвенирования выявили, что гомолог 2А содержал последовательность дикого типа, однако гомолог 2D не смогли амплифицировать с помощью ПЦР, что свидетельствовало о том, что произошло большое редактирование. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2D. В случае растения 452-В11 согласно анализу Taqman составил "0" для №3332 (VLHP2-2A), и при этом данный аллель не смогли амплифицировать для секвенирования, хотя ПЦР-продукты и последовательности 2D и 2 В были нормальными. ПЦР повторяли несколько раз с использованием диапазона условий реакции, но при этом не смогли амплифицировать гомолог 2А. Также выявили пять растений, у которых имелись предполагаемые изменения в соответствии с данными Taqman для анализов 3332 и 3333, однако ПЦР-секвенирование показало, что эти результаты были ложноположительными; при этом данная последовательность была дикого типа (неотредактированная).

В общей сложности авторы изобретения выявили два отредактированных гаплоида CMS и шесть отредактированных гаплоидов AC Nanda. Могло быть значительное большее количество отредактированных гаплоидов, которые не смогли выявить, поскольку отсутствовала возможность проведения анализов и в отношении гена 2В в случае растений CMS, и в отношении сайтов-мишеней в гене VLHP3 для направляющей РНК в этих пяти конструкциях.

Данные секвенирования для этих отредактированных гаплоидов согласуются с концепцией большой делеции, инверсии или перестройки вблизи сайта-мишени для направляющей РНК и простираются достаточно далеко, чтобы, возможно, включить удаление одного из сайтов связывания для праймера. Такой тип существенных изменений не редкость при редактировании с использованием Cas9, особенно в тех тканях, где репарация ДНК посредством негомологичного соединения концов происходит медленнее или подавляется, что может быть иметь место в случае только что оплодотворенной зиготы или раннего гаплоидного зародыша пшеницы.

Таким образом, обнаружили, что частота редактирования (количество идентифицированных отредактированных гаплоидов, деленное на общее количество гаплоидов) для конструкции 24038 составляла 0,79%; для конструкции 24039 составляла 0%; для конструкции 24091 составляла 0% и для конструкции 24094 составляла 0,75%. Тем не менее, эта скорость редактирования, безусловно, являлась заниженной, поскольку отсутствовала возможность проведения анализов для выявления изменений во многих целевых сайтах-мишенях для направляющей РНК. Кроме того, поскольку использовали пыльцу Т0, которая представляла собой либо копию 1, либо 2, то было известно, что при использовании пыльцы с копией 1 только 50% оплодотворяющих пыльцевых зерен будут содержать Cas9, и поэтому возможность редактирования существовала лишь для половины эмбрионов; аналогично для родительских растений копии 2, принимая во внимание случайную сегрегацию трансгенов при мейозе в мужском растении, можно было ожидать, что приблизительно 75% пыльцы содержали Cas9, поэтому 25% эмбрионов невозможно было отредактировать. Разумно предположить, что при попытке использования этой технологии одновременного редактирования с индукцией гаплоидов с помощью редактирующего механизма, переносимого пыльцой, в некоторых случаях более оптимальным может быть использование промотора, который экспрессируется специфически или на высоком уровне в пыльце и в спермиях, чтобы Cas9 мог экспрессироваться на более высоком уровне. В тех случаях, когда ген-мишень может воздействовать на развитие растения-индуктора гаплоидов, полезным может быть использование предпочтительного для пыльцы или спермиев промотора, который не экспрессируется в листьях, поскольку это позволило бы избежать редактирования гена-мишени в растении-индукторе гаплоидов в ходе развития скажем, в первый раз осуществлять редактирование в пыльце.

Поскольку спермии оплодотворяют яйцеклетку, то они способны доставлять РНК и белок Cas9 (а также саму трансгенную ДНК, интегрированную в одну из мужских хромосом, которые будут удалены). В работе с широким скрещиванием в данном примере было продемонстрировано, что может быть эффективным, чтобы Cas9 и/или направляющая РНК находились под контролем промотора, который специфически или на высоком уровне экспрессируется в пыльце и, в частности, в спермиях в случае использования индуктора гаплоидов в качестве мужского растения для редактирования элитных линий. Точно не было известно, экспрессируются ли MATRILINEAL, ЕХРВ1, ЕХРВ2 и PRF3 в вегетативном ядре, спермиях или обоих, и может ли иметь место какая-либо экспрессия в типе зиготных клеток, однако они были выбраны, поскольку предположительно они экспрессировались на высоком уровне и/или специфично в пыльце. Промотор PRF3 содержал мотив связывания DUO1 в промоторе, что могло указывать на то, что он экспрессируется в спермиях. Это согласуется с тем, что данный промотор имел более высокую частоту редактирования. Тот факт, что обнаружили много отредактированных гаплоидов пшеницы после широкого скрещивания, ясно дает понять, что при высокой экспрессии Cas9 в пыльце с использованием этих или любых других промоторов такая экспрессия может привести к редактированию в зародышах пшеницы после широкого скрещивания. Существует большая вероятность того, что эти промоторы, а также другие промоторы, которые управляют экспрессией в пыльце или, в частности, в спермиях, могут повысить эффективность процесса редактирования в ходе индукции гаплоидов кукурузы или индукции гаплоидов риса.

Аналогично в следующем примере ниже продемонстрировали редактирование гаплоидов у двудольного растения с использованием CENH3-модифицированной линии-индуктора гаплоидов, и при этом использовали конститутивный промотор для управления Cas9. Однако в попытке повысить эффективность редактирования гаплоидов авторы настоящего изобретения могут предпочесть промотор, который управляет высокой и/или специфической экспрессией в яйцеклетках, как, например, промотор гена EGG APPARATUS1 ("prEA1") (см., например, Gray-Mitsumune, М. and Matton, D.P., The Egg apparatus 1 gene from maize is a member of a large gene family found in both monocots and dicots, PLANTA 223(3): 618-625 (Feb. 2006)) или EGG CELL1 (EC1) (см., например, Sprunck S, et al., Egg cell-secreted EC1 triggers sperm cell activation during double fertilization. Science 2012; 338: 1093-97; PMID: 23180860; http://dx.doi.org/10.1126/science.1223944).

В качестве примера этого можно использовать промотор, экспрессируемый в спермиях, как, например, специфичный для спермиев Arabidopsis промотор DUO1 (см., например, Engel, et al., Green Sperm. Identification of Male Gamete Promoters in Arabidopsis, PLANT PHYSIOLOGY Aug 2005, 138 (4) 2124-2133; DOI: 10.1104/pp.104.054213) или гомологи DUO1 из других видов (например, оба гена маиса GRMZM2G105137 и GRMZM2G046443 являются гомологами DUO1, которые имеют сходный специфический в отношении пыльцы профиль экспрессии). Если использовать любой из них для управления экспрессией Cas9 в спермиях линии-индуктора гаплоидов, такой как RWK, NP2222-HI или мутантный matl, то он может создавать высокоэффективную линию-редактор гаплоидов для использования в редактировании разнообразной идиоплазмы элитной маиса или пшеницы посредством соответственно внутривидового или широкого скрещиваний.

Другие подходящие промоторы, экспрессируемые в спермиях, для данной концепции управления высокой экспрессией Cas9 в спермиях включают гомологи DUO1 у пшеницы, риса, ячменя, томата, подсолнечника или других однодольных или двудольных растений. Другие подходящие промоторы для данной концепции показаны в таблице 8 ниже. Эти промоторы или их гомологи в видах сельскохозяйственных культур могут быть очень полезными для данной концепции. Принцип работы заключается в том, что экспрессия в клетках гамет редактирующего механизма может улучшать скорость или эффективность согласно настоящему изобретению, поскольку это означает присутствие в избыточном количестве редактирующего белка или РНК, присутствующих в зародыше или доставляемых в зародыш в ходе оплодотворения, поэтому редактирование может происходить быстро.

VII. Одновременная индукция гаплоидов и редактирование у двудольных растений посредством широкого скрещивания или посредством скрещивания с CENH3-измененными линиями или другими индуцирующими гаплоиды линиями

Индукция гаплоидов in vivo также может быть достигнута с использованием межвидовых или межродовых широких скрещиваний видов двудольных растений, например, у хлопчатника (Turcotte et al. 1969, Semigametic production of haploids in pima cotton. Crop Sci. 9: 653-655) и табака (Burke et al., 1979, Maternal haploids of Nicotiana tabacum L. Science 206: 585; Wernsman et al. 1989, Androgenetic vs. gynogenetic doubled haploids of tobacco. Crop Sci. 29: 1151-1155). Гаплоидные растения Arabidopsis можно получать путем скрещивания с пыльцой мутантного растения CENH3 или путем скрещивания указанных растений в качестве женских растений с пыльцой дикого типа (Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615-618). Другие кандидатные гены, которые можно модифицировать для создания индуктора гаплоидов и линии редактирования SEDHI, включают KNL2 и CENPC (оба из которых могут действовать за счет опосредованного центромерами удаления генома неродительского растения), а также MSI2 и PLA2 подсолнечника. В данном случае индуцирующий гаплоиды геном (или мужского или женского растения при скрещивании) также содержал редактирующий механизм, поэтому редактирование может быть осуществлено в ходе индукции гаплоидов, результатом чего является отредактированные гаплоидные потомки материнского или отцовского растений без изменения CENH3 или редактирования трансгенов. См., например, патент США №WO 2017/004375, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Трансгенный локус, экспрессирующий редактирующий механизм, может быть введен в любые двудольные сельскохозяйственные культуры или их диких родственников: Brassica, томат, перец, салат, баклажан, сою, подсолнечник, сахарную свеклу, хлопок, люцерну, табак и другие. Трансгенные линии, экспрессирующие редактирующий механизм, затем использовали в качестве доноров пыльцы или в случае CENH3, или доноров пыльцы, или акцепторов в межвидовых или межродовых широких скрещиваниях для индукции гаплоидов и одновременного редактирования генома. Например, трансгенные линии CRISPR-Cas9 N. africana, экспрессирующие sgRNA, нацеливающие на гиббереллин-20-оксидазу табака, создавали посредством опосредованной Agrobacterium трансформации и использовали для опыления цветков табака с удаленными несозревшими пестиками для индуцирования гаплоидных растений с их геномом, отредактированным в локусе гиббереллин-20-оксидазы. Предпочтительно легко трансформируемую линию с большим количеством пыльцы использовали в качестве донора пыльцы для индукции гаплоидов и для временного обеспечения редактирующего механизма. Растение-реципиент для получения гаплоидов имело цветки, в которые легко было кастрировать, или же они являлись мужскими бесплодными растениями. Более предпочтительно, чтобы в линии индукции присутствовал маркер цвета или другой визуальный маркер или он был включен в редактируемый локус, чтобы легко отдифференцировать гаплоидные зародыши или растения от диплоидов, полученных в результате нормального развития зиготы.

Это проиллюстрировали с помощью использования линии-индуктора гаплоидов Arabidopsis в экотипе Columbia и ее трансформации с помощью конструкции, кодирующей экспрессию Cas9, и одиночной направляющей РНК, нацеливающей на ген GLABROUS1 (GL1), который при нокауте давал фенотип без трихом. Скрещивали Т0 в виде женских растений с использованием пыльцы экотипа Landsberg Erecta (Ler) и получали отредактированных по gl1 гаплоидных потомков.

Материалы индуктора гаплоидов получали из лаборатории Comai в Калифорнийском университете в Дэвисе. Эти материалы обычно использовали в качестве линий-индукторов гаплоидов отцовских растений (вызывая андрогенез, когда скрещивали в виде женских растений с мужскими растениями дикого типа), однако они могли также выполнять функцию индукторов гаплоидов материнских растений (вызывая гиногенез, когда скрещивали в виде мужских растений с женскими растениями дикого типа). Эти линии были изменены с тем, чтобы они стали индукторами гаплоидов за счет замены нативного гена CENH3 на трансген CENH3 Zea Mays, о чем упоминают в (Maheshwari, et al, 2017, Centromere location in Arabidopsis is unaltered by extreme divergence in CENH3 protein sequence. Genome Research 27(3)).

В частности, обе копии нативного гена AtCENH3 были нокаутированы и комплементированы с за счет стабильно вставленного трансгена ZmCENH3, который не влиял на нормальное развитие растений и не продуцировал гаплоиды при самоопылении, но давал приблизительно 10% гаплоидов при ауткроссе. Это представляет собой модификацию первоначальной концепции CENH3-tailswap, подробно описанной в (Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615-618) и ряде следующих публикаций.

После того, как получили линии CENH3* от Калифорнийского университета в Дэвисе, их выращивали, подтверждали, что они содержали трансген ZmCENH3 и были "ноль" гомозиготными по нативному гену AtCENH3. Это осуществляли путем разработки анализа qPCR taqman для ZmCENH3 (анализ №2298) и с использованием ПЦР и гель-электрофореза для тестирования 183 проростков на зиготность генотипа AtCENH3, осуществляя ПЦР с использованием прямого и обратного праймеров Xbal (SEQ NO TKX и TKY), и смесь Reddy при температуре отжига 60°С, и разрезание рестриктазой Xbal в течение ночи при 37°С. Аллель дикого типа может быть разрезан этим ферментом и давать две полосы (189 п.о., 25 п.о.), тогда как остается на уровне 215 п.о. Эти тесты показали, что все семена, которые, полученные от Калифорнийский университета в Дэвисе, были гомозиготными по мутантному аллелю Atcenh3-1, и что присутствовало несколько копий трансгена ZmCENH3.

С уверенностью в том, что эти полученные семена в действительности были индукторами гаплоидов, сохранили 100 растений и инициировали трансформацию цветочной почки с помощью бинарного вектора 24075 (SEQ ID NO: 98), содержащего кассету sgRNA, нацеливающую на ген (GL1) Arabidopsis (AT3G27920) в двух сайтах-мишенях. Целевыми последовательностями являлись 5'-GGAAAAGTTGTAGACTGAGA-3' и 5'-GCAGTGATGAACAATGACGG-3' (комплементарная нить). Разрушение гена GL1 приводило к видимым фенотипам частично или полностью голых растений (у голых растений отсутствуют трихомы). Ген Cas9 (cCas9-05) в этом векторе находился под управлением промотора фактора элонгации Arabidopsis thaliana. Вектор также содержал две кассеты селектируемого маркера, обеспечивающие устойчивость к Kan и флуоресценцию AmCyan, управляемые соответственно промотором СМР-02 и промотором Glycine max UBI-01. Вектор переносили в штамм агробактерии ЕНА101, а затем цветочную почку трансформировали в индуктор гаплоидов растений Arabidopsis.

Протокол трансформации был следующим: утром RecA Agrobacterium 24075 ЕНА101, культивированные в планшетах, вносили в планшеты YPSpec100Kan50. Культивирование проводили в темноте при 28°С в течение 24 часов. Готовили инфильтрационную культуральную среду (4 л): соли XMS (8,66 г), 1X витамины Gamborg's В5 (4 мл), 5% (вес/об.) сахароза (200 г), 0,044 мкМ ВАР (12,5 мг - 12,5 мл DMSO) 40 мкл, с последующей стерилизацией фильтрацией. Затем добавляли 250 мкл 40 мг/мл AS (20 мг/л) и 25 мкл SIlwet L-77 (50 мкл/л) в 500 мл инфильтрационной культуральной среды. С помощью петли для сбора Agrobacterium и путем внесения в 50 мл пробирку с ~10 мл среды, стерилизованной фильтрацией, суспендировали Agrobacterium с получением 1 л с оптической плотностью, составляющей 0,54 при 600 нм. Цветоносный побег опускали в суспензионную среду на 20-30 секунд и использовали крышку, чтобы накрыть лоток. Во второй раз это повторяли с другой суспензией с OD, составляющей 0,552 при 600 нм.

Через приблизительно 4 недели после трансформации приблизительно 100000 самоопыленных семян собирали и инкубировали при 4°С в течение двух дней яровизации, а затем семена стерилизовали путем вымачивания в 70% этаноле в течение 1 минуты, а затем путем вымачивания в 50% (об./об.) отбеливателе с 0,05% (об./об.) тритоном Х-100 в течение дополнительных 10 минут, затем промывали семена в стерильной воде при четырех заменах. Затем семена помещали на чашки с канамицином (50 мкг/мл) для скрининга прорастания/отбора в помещении для растительных тканевых культур (день 23°С, ночь 24°С, освещение 16 часов). Путем отбора по устойчивости к канамицину идентифицировали 38 положительных трансформантов, и их выращивали в проростки перед переносом в почву, и отбирали пробы для тестирование на присутствие Т-ДНК Cas9 (анализ №3049), а также в отношении присутствия сайтов вырезания для двух направляющих РНК (анализы №3321 и №3322). Идентифицировали 10 однокопийных и 15 трансгенных объектов с 2 копиями, в которых имелись мутации обоих аллелей GL1 и которые характеризовались фенотипом без трихом. Согласно анализу qPCR эти растения ранжировали, поскольку они продемонстрировали доказательства активности Cas9 (по мутированному GL1 и неопушенному фенотипу), они имели трансген Cas9, и они имели трансген ZmCENH3. У этих растений инициировали цветение в течение длительного периода времени, поддерживая их в следующих условиях для роста: 16 часов свет, дневная температура 23°С, ночная температура 20°С, не >60% относительной влажности.

В то же время, поскольку эти гаплоидные растения-индукторы, которые трансформировали конструкцией Cas9, были идентифицированы, высевали и выращивали популяцию семян Landsberg Erecta (Ler), полученных из Центра биологических ресурсов Arabidopsis в Государственном университете Огайо (линия №CS20). Эти семена были дикого типа, а последовательность сайтов-мишеней для направляющей РНК GL1 в CS20 совпадала с последовательностью направляющей РНК в конструкции по настоящему изобретению. Обеим популяциям предоставили возможность расцвести и произвели приблизительно 2000 контролируемых скрещиваний с использованием растений Ler дикого типа в качестве мужского растения-донора пыльцы, скрещивая их с примерно 25 индукторами гаплоидов с конструкцией Cas9, которые использовали в качестве женского растения. Произвели до 100 скрещиваний на женское растение, маркируя скрещенные цветки черным маркером и удаляя цветки, которые не скрещивали, чтобы ограничить возможность сбора самоопыляемых стручков. В большинстве случаев перед опылением кастрировали цветки женских растений, удаляя пыльники щипцами, опять-таки, чтобы избежать контаминации самоопыляемыми семенами, однако в некоторых случаях это не являлось необходимостью, поскольку пыльники были молодыми или недоразвитыми.

Через приблизительно 15 дней собирали стручки, которые приобрели светло-коричневую окраску. Затем открывали стручки и высаживали семена в почву. Далее помещали их на 4 дня в ростовую камеру при температуре 6°С (день и свет), продолжительности дня 8 часов, при освещении 200 мкмоль/м²⋅с, при относительной влажности 60%. Затем их переносили на 7-10 дней в ростовую камеру: 16 часов света, дневная температура 23°С, ночная температура 20°С, не >60% влажности. Выявили высокую частоту абортированных семян почти во всех стручках, составившую в среднем приблизительно 40-50% от общего количества семян. Это количество абортированных зародышей в значительной степени согласовывалось с показателями для этого материала индуктора гаплоидов в опубликованных докладах. Не вдаваясь в теорию, предполагают, что причина абортирования семени, наиболее вероятно, заключалась в частичном или полном удалении генома в эндосперме, что приводило к дефициту и функциональной неспособности эндосперма. Это было природным явлением в линиях-индукторах гаплоидов типа CENH3 в ходе ауткроссинга и, вероятно, оно не связано с присутствием трансгена Cas9. Эти абортированные зародыши не прорастали. Из-за стабильного и достоверного уровня абортирования зародышей в каждом подвергнутом ауткроссингу стручке, в конечном итоге использовали отсутствие этого фенотипа для отбраковывания стручков, которые были результатом случайного самоопыления. Таким образом, проращивали стручки, которые были подвергнуты ауткроссингу.

В общей сложности выявили примерно 2000 проросших потомков, большинство из которых были подвергнуты ауткроссингу. Идентифицировали отредактированные гаплоиды с помощью комбинации анализа маркеров с помощью qPCR и/или фенотипического скрининга. Маркеры, которые авторы использовали для выявления отредактированных гаплоидов, были следующими.

Во-первых, проводили поиск в отношении "0" в случае теста ZmCENH3. Это указывало на то, что растение являлось гаплоидным, поскольку геном материнского растения был утрачен, и поэтому также был утрачен трансген ZmCENH3, который присутствовал в нескольких копиях материнского растения-индуктора гаплоидов. Диплоиды, напротив, будут представлять собой гибриды между геномами материнского и отцовского растений и будут иметь балл "1" или "2" или более высокий балл согласно Taqman для данного анализа, что зависит от количества копий материнского растения. Ключевым является то, что все диплоиды будут демонстрировать доказательства присутствия этого трансгена, однако гаплоиды отцовского растения, имеющие только геном Ler, не будут демонстрировать и таким образом будут иметь балл "0".

Во-вторых, проводили поиск в отношении балла "0" в случае анализа Cas9, который указывал на то, что оно не являлось трансгенным. Это также можно увидеть визуально с помощью флуоресцентного света и выявления флуоресцентного маркера CFP.

В-третьих, проводили поиск в отношении балла "0" для одного из анализов сайта-мишени GL1, что указывало на то, что растение было отредактировано. Диплоидные растения могли демонстрировать "0", "1" или "2" в случае этих анализов, однако гаплоиды продемонстрировали "2" или "0". Первая из двух направляющих РНК GL1, по-видимому, характеризовалась гораздо более высокой эффективностью редактирования, чем вторая, поскольку анализ 3321 имел высокое преимущество баллов "0" и "1" в индукторе гаплоидов T0, а 3322 имел в основном "2".

С использованием этих анализов смогли идентифицировать неотредактированные гаплоиды (которые имели балл "0" по ZmCENH3 и Cas9, однако имели баллы "2" по обоим целевым сайтам GL1), а также отредактированные гаплоиды (которые имели балл "0" по анализам ZmCENH3, Cas9 и GL1 (3321)). Также смогли идентифицировать диплоидные гибриды, которые содержали Cas9 (и часто редактировались в сайтах GL1), и диплоидные гибриды, которые не содержали Cas9 (и часто содержали одну отредактированную копию GL1 (от материнского родительского растения), но не другую и, таким образом, имели балл "1" в случае анализа GL1. Авторы также смогли идентифицировать несколько предполагаемых отредактированных гаплоидов, поскольку они имели балл "0" в случае анализа сайта-мишени (3321), ZmCENH3 (2298) и Cas9 (3049). См. таблицу 9 ниже для примера данных согласно Taqman для потомков от родительского USR01424136, содержащего три предполагаемых отредактированных гаплоида (растение 254 в лунке F2, растение 260 в лунке D3 и растение 261 в растении E3).

Путем лишь проращивания семян и отбора проб для анализа qPCR Taqman идентифицировали 8 предполагаемых отредактированных гаплоидов. Отредактированные гаплоиды также идентифицировали с помощью фенотипического визуального скрининга, а затем подтверждали с помощью анализа Taqman. Проводили скрининг отредактированных гаплоидов на присутствие растений без трихом или неопушенных растений, что указывало на то, что у них отсутствовали аллели дикого типа для гена GL1, и на отсутствие экспрессии голубого флуоресцентного белка ("CFP") в зародыше или корне проростка. Это указывало на то, что в них отсутствовала Т-ДНК Cas9. Выявили несколько таких растений и подвергли их анализу Taqman. У трех таких растений, которые идентифицировали фенотипически, с помощью анализов Taqman подтвердили, что они действительно являлись отредактированными гаплоидами. Также был известен тот факт, что возможно некоторые из этих неопушенных растений, у которых отсутствовал CFP, были ложноположительными, или по той причине, что CFP был молчащим, или из-за самоопыления полностью отредактированного материнского растения и получения нулевого сегреганта, полностью отредактированных (а следовательно, неопушенных) потомков. С помощью анализов Taqman это можно было выявить и отбраковать эти ложноположительные результаты, потому что с их помощью непосредственно тестировали на присутствие не только трансгена Cas9, но также аллеля ZmCENH3, который, несомненно, присутствовал бы в любом самоопыляющемся контаминирующем семени. Обнаружили несколько примеров самоопыляемых семян, которые все происходили из одного материнского растения. Протоколы опыления для данного материнского растения указывали на то, что пыльца была очень многочисленной, что могло привести к некоторому самоопылению. Этих потомков исключили из общего анализа.

Все предполагаемые отредактированные гаплоиды, идентифицированные с помощью анализа Taqman, подвергли секвенированию. Использовали ПЦР для амплификации отредактированных аллелей, а затем субклонировали и секвенировали по меньшей мере 8 колоний для каждого предполагаемого отредактированного аллеля. В таблице 10 приведены изменения в последовательности, которые обнаружили в отредактированных гаплоидах в первом сайте-мишени для направляющей РНК (анализ №3321), а также данные согласно Taqman по родительским растениям T0. В общей сложности обнаружили 19 предполагаемых отредактированных гаплоидов и подтвердили, что у 3321 сайтов-мишеней имелись мутации в 11 из 12 отредактированных гаплоидов, которые попытались секвенировать. Будут ли другие 7 также содержать мутации, будет подтверждено после секвенирования. См. выравнивание последовательностей для этих изменений на фигуре 24.

Кроме того, образцы листьев трех отредактированных гаплоидных растений проверяли посредством анализа плоидности наряду с использованием трех диплоидных контролей (ткани, отобранные у материнских родительских растений), которые продемонстрировали, что они были истинными гаплоидами (фигуры 18-23). Это служило подтверждением их статуса отредактированных гаплоидов.

В трех родительских линиях, в отношении которых была уверенность в том, что отсутствовала любая контаминация самоопылением, не проводили какой-либо фенотипический предварительный скрининг, а вместо этого отбирали всех проросших потомков для анализа Taqman (таблица 11). Тремя женскими родительскими растениями для этих потомков являлись USR01431603, USR01431609 и USR01431604. Обнаружили, что показатель индукции гаплоидов составлял приблизительно 9,7%, что рассчитывали путем деления количества потомков, у которых отсутствовали трансгены ZmCENH3 и Cas9 (59), на общее количество отобранных потомков (605). Обнаружили, что из 59 гаплоидов 10 были отредактированы. Это означало то, что в среднем 16,9% гаплоидов были отредактированы с помощью Cas9 материнского растения перед удалением генома материнского растения. Не ограничиваясь этим последним числом, это означало, что при использовании данной системы в качестве процента от общего потомства 9,7% * 16,9% = 1,64% от всего проросшего потомства представляли собой отредактированные гаплоиды.

Показатель редактирования гаплоидов типа CENH3* или редактирования гаплоидов другого отцовского растения (с использованием линии-индуктора гаплоидов материнского растения) может быть увеличен за счет использования промотора, который повышает экспрессию Cas9 и/или направляющей РНК до более высокого уровня в яйцеклетке до оплодотворения и/или в зиготе в ходе или после оплодотворения. Примером такого промотора может быть промотор для ЕА1 (EGG APPARATUS1) (GRMZM2G456746), хотя существует множество других примеров. Можно также экспрессировать Cas9 в контексте специфического для аппарата яйцеклетки энхансера (EASE), который представляет собой последовательность размером 77 п.о., стимулирующую экспрессию граничащих генов в яйцеклетке или в очень ранней зиготе (см., например, Yang, et al. An Egg Apparatus-Specific Enhancer of Arabidopsis, Identified by Enhancer Detection, PLANT PHYSIOLOGY Nov 2005, 139 (3) 1421-1432; DOI: https://doi.org/10.1104/pp.105.068262).

VIII. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов путем непосредственной модификации целевого основания в последовательности геномной ДНК

Целенаправленный мутагенез последовательности ДНК также может быть достигнут за счет непосредственного превращения одного основания ДНК в другое без необходимости двухнитевых разрывов (DSB). Например, цитидиндезаминаза АРОВЕС1, адениндезаминаза и другие усиливающие компоненты, такие как урацил-ДНК-гликозилаза (UDG), могут быть слиты с никазой Cas9 (А840Н) или с инактивированной нуклеазой "мертвой" Cas9 (dCa9) для непосредственного редактирования последовательности ДНК без введения двухнитевых разрывов в ДНК (Komor et al. 2016. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946; Gaudelli et al. 2017. Programmable base editing of A:T to G:C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature24644; Komor et al. 2017. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances, Vol.3, no. 8, eaao4774, DOI: 10.1126/sciadv.aao4774). Эта разновидность механизма редактирования оснований также может быть доставлена посредством линии индукции гаплоидов с тем, чтобы индуцировать редактирование оснований в целевых последовательностях непосредственно в других сортах. Например, последовательность направляющей РНК xZmVLHP-03 (5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3', SEQ ID NO: 28) сконструирована для нацеливания на цитидиндезаминазную систему редактирования оснований для преобразования геномной последовательности экзона 2 гена ZmVLHP 5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 28) в 5'-AGGCGTTGAGCAGCGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 29), с заменой таким образом аргининового кодона CGA на стоп-кодон (TGA) в кодирующей последовательности и инициацией преждевременной терминации последовательности белка и нокаута функционального гена. Мутация с заменой С на Т подчеркнута. Аналогично система редактирования оснований на основе химерной nCas9- или dCas9-адениндезаминазы может использоваться для мутации кодирующего участка, участка границы сплайсинга или промоторной последовательности ZmVLHP или других генов для создания вариантов, которые характеризуются измененной активностью генов. Как цитидиндезаминаза, так и адениндезаминаза являются особенно применимыми в изменении сайта сплайсинга транскрипта, поскольку канонический участок границы сплайсинга имеет последовательность 5'-…AG/GT…3' (или 5'-…АС/СТ…3' в противоположной нити).

IX. Одновременные индукция и редактирование гаплоидов путем замены аллеля с использованием матричной ДНК

In vivo систему индукции гаплоидов можно использовать не только для введения белка, РНК или ДНК с целью расщепления или преобразования целевой последовательности, но ее также можно использовать для доставки матричной ДНК с целью репарации путем гомологической рекомбинации для точной замены последовательности в целевом участке в форме трансгенной ДНК. Матричная ДНК может быть вставлена в геном линии-индуктора, несущей механизм для редактирования генома, такой как система CRISPR-Cas9, либо в том же трансгенном локусе, либо в другом локусе. В том случае, если в индуцированных гаплоидных зародышах присутствуют и Cas9-sgRNA, и матричная ДНК, то расщепление целевой последовательности приведет в результате к восстановлению хромосомного разрыва с помощью гомологичной трансгенной последовательности ДНК в качестве матрицы. Например, для создания мутации E149L в гене ZmPYL-D (GRMZM2G048733_P02) (см. WO 16033230, включенный в данное описание посредством ссылки) фрагмент ДНК, содержащий донорную последовательность (5'-CCTTGGTGTTGCCGTCGGGGACGTCGACGACGAATGACAGGATGACGAGCGTCCCTGGCCGGCCGTCGATGACCT-3', SEQ ID NO: 30), использовали в качестве донорной последовательности для репарации. Следует отметить, что дополнительные гомологичные последовательности могут быть добавлены для фланкирования этой основной донорной последовательности для репарации. Одну или несколько копий этой донорной последовательности для репарации встраивают в вектор экспрессии Cas9-sgRNA 23136 (SEQ ID NO: 31), который экспрессирует направляющую РНК 5'-GTCGGGGACGTCGACGACGA-3' (SEQ ID NO: 32), с получением вектора для модификации аллеля pBSC23136-AMD. Следует отметить, что потенциальный сайт РАМ был удален из донорных последовательностей ДНК, поэтому интегрированная донорная последовательность не будет расщепляться комплексом Cas9-sgRNA, экспрессируемым из pBSC23136-AMD. С использованием pBSC23136-AMD трансформировали линию-индуктор гаплоидов NP2222-HI для создания трансгенной редактирующей линии. Трансгенные редактирующие линии индукции гаплоидов самоопылялись с получением гомозиготных локусов редактирования линий потомства. Эти гомозиготные линии использовали для опыления целевых элитных инбредных линий маиса, чтобы индуцировать образование гаплоидов, а также для введения модификаций аллелей с помощью экспрессируемой Cas9-sgRNA с использованием донорной ДНК, временно присутствующей до того, как донорские хромосомы пыльцы будут удалены.

X. Индуцирование гаплоидов и одновременное редактирование генов у риса Получали линию HI риса. Например, ортолог риса MATL, Os03g27610 (SEQ ID NO: 33) подвергали мутации для создания новой линии HI риса. Эту линию трансформировали с использованием вектора, содержащего систему сайт-направленного мутагенеза для редактирования генома риса, например, систему CRISPR/Cas9.

Линию HI риса скрещивали с другой линией риса, предпочтительно элитной линией, для получения по меньшей мере одного гаплоидного зародыша-потомка. В ходе скрещивания для получения по меньшей мере одного гаплоидного зародыша-потомка родительское растение риса HI также инициирует механизм редактирования генома, например Cas9 с направляющей РНК, подлежащий доставке в эмбрион. На этом этапе редактирующий механизм осуществляет манипуляции по редактированию генома гаплоидного зародыша, за счет чего получают отредактированное гаплоидное растение-потомок.

XI. Анализы и условия согласно Taqman

Несколько анализов упоминаются по номеру или по названию мишени. Ниже приведена таблица вышеупомянутых анализов и последовательности соответствующих праймеров и зондов. Условия для ПЦР были стандартными для всех анализов, и они были следующими: денатурация при 98°С в течение 2 минут; затем 35 циклов (i) денатурации при 98°С в течение 30 секунд, (ii) отжиг при 60°С в течение 30 секунд, (iii) удлинение при 72°С в течение 1 минуты с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут с выдерживанием при 4°С до завершения. Анализы осуществляли при этих же условиях, если иное не указано ниже.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ

<120> ОДНОВРЕМЕННЫЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ И ИНДУКЦИЯ ГАПЛОИДОВ

<130> 81189-WO-REG-ORG-P-1

<150> US 62/429260

<151> 2016-12-02

<160> 98

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23396

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946)

<223> xZmVLHP 2

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7032)

<223> rsgRNAZmVLHP-01

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779)

<223> cRepA-01

<400> 1

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660 3

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520 4

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440 5

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300 6

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagcag gaggcgtcga gcagcggttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220 7

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080 8

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000 9

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860 10

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722 11

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность gRNA для редактирования VLHP1

<400> 2

gcaggaggcg tcgagcagcg 20

<210> 3

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23399

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946)

<223> xZmGW2 12

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7031)

<223> rsgRNAZmGW2-02

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13822)..(14226)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14904)..(15710)

<223> oCOLE-06

<400> 3

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360 13

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280 14

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140 15

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060 16

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcaaagc tcgcgccctg ctacccgttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920 17

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840 18

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700 19

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620 20

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480 21

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> для редактирования GW2-2

<400> 4

aagctcgcgc cctgctaccc 20

<210> 5

<211> 19617

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 22808

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2119)..(5193)

<223> cTNPLAIIAFw-01

<220>

<221> Терминатор

<222> (5200)..(5452)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (5486)..(7478)

<223> prUbi1-10

<220>

<221> ген

<222> (7492)..(10566)

<223> cTNPLAIIARv-01

<220> 22

<221> Терминатор

<222> (10573)..(10825)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (10844)..(12835)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (12852)..(14030)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (14053)..(14305)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (14349)..(14478)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (14758)..(15546)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (15641)..(15771)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (15846)..(16571)

<223> cVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (16601)..(17674)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (17717)..(18121)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (18799)..(19605)

<223> oCOLE-06

<400> 5

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240 23

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gcgccaccat gggaaaacct attcctaatc ctctgctggg cctggattct 2160 24

accggaggca tggcccctaa gaaaaagcgg aaggtggacg gcggagtgga cctgagaaca 2220

ctgggatatt ctcagcagca gcaggagaag atcaagccca aggtgagatc tacagtggcc 2280

cagcaccacg aagccctggt gggacacgga tttacacacg cccacattgt ggccctgtct 2340

cagcaccctg ccgccctggg aacagtggcc gtgaaatatc aggatatgat tgccgccctg 2400

cctgaggcca cacacgaagc cattgtggga gtgggaaaac agtggtctgg agccagagcc 2460

ctggaagccc tgctgacagt ggccggagaa ctgagaggac ctcctctgca gctggataca 2520

ggacagctgc tgaagattgc caaaaggggc ggagtgaccg cggtggaagc cgtgcacgcc 2580

tggagaaatg ccctgacagg agcccctctg aacctgaccc ccgaacaggt ggtggccatt 2640

gccagccacg acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 2700

tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctca cgacggagga 2760

aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 2820

actccagaac aggtggtggc tattgcttcc aatattgggg ggaaacaggc cctggaaact 2880

gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 2940

gccattgcca gcaacaacgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 3000

gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaacaac 3060

ggaggaaaac aggctctgga aacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 3120

ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaaca acggggggaa acaggccctg 3180

gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 3240

gtggtggcca ttgccagcaa cggcggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 3300

ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 3360

cacgacggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 3420

gctcacggct tgactccaga acaggtggtg gctattgctt ccaatattgg ggggaaacag 3480

gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca gtgctgtgcc aggctcacgg cctcactccc 3540

gaacaggtgg tggccattgc cagcaacatc ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag 3600

agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc 3660

gcctctcacg acggaggaaa acaggctctg gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg 3720

tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag gtggtggcta ttgcttccaa caacgggggg 3780

aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg ctgccagtgc tgtgccaggc tcacggactg 3840

acccccgaac aggtggtggc cattgccagc aacggcggcg gcaagcaggc cctggaaacc 3900

gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg 3960

gctatcgcct ctaacaacgg aggaaaacaa gcactcgaga cagtgcagcg gctgctgcct 4020 25

gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca gaacaggtgg tggctattgc ttccaacaac 4080

ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac 4140

gggctgaccc ccgaacaggt ggtggccatt gccagcaaca tcggcggcaa gcaggccctg 4200

gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg tgccaggccc atggcctgac acctgaacag 4260

gtggtggcta tcgcctctaa caacggagga aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg 4320

ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg actccacagc aggtcgtggc aattgctagc 4380

aatatcggcg gacggcccgc cctggagagc attgtggccc agctgtctag acctgatcct 4440

gccctggccg ccctgacaaa tgatcacctg gtggccctgg cctgtctggg aggcagacct 4500

gccctggatg ccgtgaaaaa aggactgcct cacgcccctg ccctgattaa aagaacaaat 4560

agaagaatcc ccgagcggac ctctcacaga gtggccggat cccagctggt gaaatctgag 4620

ctggaggaga agaagtctga gctgagacac aagctgaagt acgtgcctca cgagtacatc 4680

gagctgatcg agatcgccag aaatagcacc caggatagaa tcctggagat gaaggtgatg 4740

gagttcttca tgaaagtgta cggctacaga ggaaagcatc tgggaggaag cagaaaacct 4800

gacggagcca tttatacagt gggcagccct atcgattatg gcgtgatcgt ggatacaaag 4860

gcctacagcg gaggctacaa tctgcctatt ggacaggccg atgagatgca gagatacgtg 4920

gaggagaacc aaaccaggaa caagcatatc aaccctaacg agtggtggaa ggtgtaccct 4980

tctagcgtga ccgagttcaa gttcctgttt gtgagcggcc acttcaaggg caattataag 5040

gcccagctga ccaggctgaa ccacatcaca aattgtaatg gcgccgtgct gtctgtggag 5100

gaactgctga ttggaggaga gatgattaag gccggaacac tgacactgga ggaggtgaga 5160

agaaagttca acaacggcga gatcaacttc tgaaagcttg atcgttcaaa catttggcaa 5220

taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 5280

ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 5340

gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 5400

cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcttcgaacc 5460

ctagtcgaag acaaccggtg catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct 5520

agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac 5580

acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat 5640

aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt 5700

tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt 5760

ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc 5820

cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt 5880

tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta 5940 26

gtttttttat ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa 6000

caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 6060

atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc 6120

gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 6180

ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg 6240

cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc 6300

agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata 6360

aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca 6420

cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg 6480

tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc 6540

ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct 6600

gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 6660

agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt 6720

catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat 6780

atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg 6840

atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg 6900

tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga 6960

agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga 7020

tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt 7080

cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa 7140

ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa 7200

atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg 7260

gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa 7320

gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat 7380

atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt 7440

gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcagcg gccgcgccac catgggaaaa 7500

cctattccta atcctctgct gggcctggat tctaccggag gcatggcccc taagaaaaag 7560

cggaaggtgg acggcggagt ggacctgaga acactgggat attctcagca gcagcaggag 7620

aagatcaagc ccaaggtgag atctacagtg gcccagcacc acgaagccct ggtgggacac 7680

ggatttacac acgcccacat tgtggccctg tctcagcacc ctgccgccct gggaacagtg 7740

gccgtgaaat atcaggatat gattgccgcc ctgcctgagg ccacacacga agccattgtg 7800 27

ggagtgggaa aacagtggtc tggagccaga gccctggaag ccctgctgac agtggccgga 7860

gaactgagag gacctcctct gcagctggat acaggacagc tgctgaagat tgccaaaagg 7920

ggcggagtga ccgcggtgga agccgtgcac gcctggagaa atgccctgac aggagcccct 7980

ctgaacctga cccccgaaca ggtggtggcc attgccagca acaacggcgg caagcaggcc 8040

ctggaaaccg tgcagagact gctgcccgtg ctgtgccagg cccatggcct gacacctgaa 8100

caggtggtgg ctatcgcctc tcacgacgga ggaaaacagg ctctggaaac agtgcagcgg 8160

ctgctgcctg tgctgtgtca ggctcacggc ttgactccag aacaggtggt ggctattgct 8220

tccaacggcg gggggaaaca ggccctggaa actgtgcagc gcctgctgcc agtgctgtgc 8280

caggctcacg gactgacccc cgaacaggtg gtggccattg ccagcaacgg cggcggcaag 8340

caggccctgg aaaccgtgca gagactgctg cccgtgctgt gccaggccca tggcctgaca 8400

cctgaacagg tggtggctat cgcctctcac gacggaggaa aacaggctct ggaaacagtg 8460

cagcggctgc tgcctgtgct gtgtcaggct cacggcttga ctccagaaca ggtggtggct 8520

attgcttccc acgacggggg gaaacaggcc ctggaaactg tgcagcgcct gctgccagtg 8580

ctgtgccagg ctcacgggct gacccccgaa caggtggtgg ccattgccag caacggcggc 8640

ggcaagcagg ccctggaaac cgtgcagaga ctgctgcccg tgctgtgcca ggcccatggc 8700

ctgacacctg aacaggtggt ggctatcgcc tctaacggcg gaggaaaaca ggctctggaa 8760

acagtgcagc ggctgctgcc tgtgctgtgt caggctcacg gcttgactcc agaacaggtg 8820

gtggctattg cttcccacga cggggggaaa caggccctgg aaactgtgca gcgcctgctg 8880

ccagtgctgt gccaggctca cggcctcact cccgaacagg tggtggccat tgccagcaac 8940

aacggcggca agcaggccct ggaaaccgtg cagagactgc tgcccgtgct gtgccaggcc 9000

catggcctga cacctgaaca ggtggtggct atcgcctctc acgacggagg aaaacaggct 9060

ctggaaacag tgcagcggct gctgcctgtg ctgtgtcagg ctcacggctt gactccagaa 9120

caggtggtgg ctattgcttc ccacgacggg gggaaacagg ccctggaaac tgtgcagcgc 9180

ctgctgccag tgctgtgcca ggctcacgga ctgacccccg aacaggtggt ggccattgcc 9240

agcaacatcg gcggcaagca ggccctggaa accgtgcaga gactgctgcc cgtgctgtgc 9300

caggcccatg gcctgacacc tgaacaggtg gtggctatcg cctctaacaa cggaggaaaa 9360

caagcactcg agacagtgca gcggctgctg cctgtgctgt gtcaggctca cggcttgact 9420

ccagaacagg tggtggctat tgcttccaac ggcgggggga aacaggccct ggaaactgtg 9480

cagcgcctgc tgccagtgct gtgccaggct cacgggctga cccccgaaca ggtggtggcc 9540

attgccagcc acgacggcgg caagcaggcc ctggaaaccg tgcagagact gctgcccgtg 9600

ctgtgccagg cccatggcct gacacctgaa caggtggtgg ctatcgcctc taatatcgga 9660

ggaaaacagg ctctggaaac agtgcagcgg ctgctgcctg tgctgtgtca ggctcacggc 9720 28

ttgactccac agcaggtcgt ggcaattgct agccacgacg gcggacggcc cgccctggag 9780

agcattgtgg cccagctgtc tagacctgat cctgccctgg ccgccctgac aaatgatcac 9840

ctggtggccc tggcctgtct gggaggcaga cctgccctgg atgccgtgaa aaaaggactg 9900

cctcacgccc ctgccctgat taaaagaaca aatagaagaa tccccgagcg gacctctcac 9960

agagtggccg gatcccagct ggtgaaatct gagctggagg agaagaagtc tgagctgaga 10020

cacaagctga agtacgtgcc tcacgagtac atcgagctga tcgagatcgc cagaaatagc 10080

acccaggata gaatcctgga gatgaaggtg atggagttct tcatgaaagt gtacggctac 10140

agaggaaagc atctgggagg aagcagaaaa cctgacggag ccatttatac agtgggcagc 10200

cctatcgatt atggcgtgat cgtggataca aaggcctaca gcggaggcta caatctgcct 10260

attggacagg ccgatgagat gcagagatac gtggaggaga accaaaccag gaacaagcat 10320

atcaacccta acgagtggtg gaaggtgtac ccttctagcg tgaccgagtt caagttcctg 10380

tttgtgagcg gccacttcaa gggcaattat aaggcccagc tgaccaggct gaaccacatc 10440

acaaattgta atggcgccgt gctgtctgtg gaggaactgc tgattggagg agagatgatt 10500

aaggccggaa cactgacact ggaggaggtg agaagaaagt tcaacaacgg cgagatcaac 10560

ttctgaaagc ttgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 10620

gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 10680

aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 10740

tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 10800

gcggtgtcat ctatgttact agatcttcga agacggaccg cgcctgcagt gcagcgtgac 10860

ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc 10920

acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt 10980

aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga 11040

atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga 11100

ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca 11160

cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt 11220

tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa 11280

aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata 11340

aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt 11400

tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc 11460

aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt 11520

cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg 11580 29

catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc 11640

tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct 11700

tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt 11760

gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc 11820

ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 11880

cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt 11940

tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt 12000

ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc 12060

gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt 12120

ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt 12180

ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 12240

tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat 12300

tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 12360

gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg 12420

tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta 12480

cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga 12540

gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact 12600

gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta 12660

tctattataa taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg 12720

gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc 12780

ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggatc 12840

cggcagcagc catgcagaag ctgatcaaca gcgtgcagaa ctacgcctgg ggcagcaaga 12900

ccgccctgac cgagctgtac ggcatggaga accccagcag ccagcccatg gccgagctgt 12960

ggatgggcgc ccaccccaag agcagcagcc gcgtgcagaa cgccgccggc gacatcgtga 13020

gcctgcgcga cgtgatcgag agcgacaaga gcaccctgct gggcgaggcc gtggccaagc 13080

gcttcggcga gctgcccttc ctgttcaagg tgctgtgcgc cgcccagccc ctgagcatcc 13140

aggtgcaccc caacaagcac aacagcgaga tcggcttcgc caaggagaac gccgccggca 13200

tccccatgga cgccgccgag cgcaactaca aggaccccaa ccacaagccc gagctggtgt 13260

tcgccctgac ccccttcctg gccatgaacg ccttccgcga gttcagcgag atcgtgagcc 13320

tgctgcagcc cgtggccggc gcccaccccg ccatcgccca cttcctgcag cagcccgacg 13380

ccgagcgcct gagcgagctg ttcgccagcc tgctgaacat gcagggcgag gagaagagcc 13440

gcgccctggc catcctgaag agcgccctgg acagccagca gggcgagccc tggcagacca 13500 30

tccgcctgat cagcgagttc taccccgagg acagcggcct gttcagcccc ctgctgctga 13560

acgtggtgaa gctgaacccc ggcgaggcca tgttcctgtt cgccgagacc ccccacgcct 13620

acctgcaggg cgtggccctg gaggtgatgg ccaacagcga caacgtgctg cgcgccggcc 13680

tgacccccaa gtacatcgac atccccgagc tggtggccaa cgtgaagttc gaggccaagc 13740

ccgccaacca gctgctgacc cagcccgtga agcagggcgc cgagctggac ttccccatcc 13800

ccgtggacga cttcgccttc agcctgcacg acctgagcga caaggagacc accatcagcc 13860

agcagagcgc cgccatcctg ttctgcgtgg agggcgacgc caccctgtgg aagggcagcc 13920

agcagctgca gctgaagccc ggcgagagcg ccttcatcgc cgccaacgag agccccgtga 13980

ccgtgaaggg ccacggccgc ctggcccgcg tgtacaacaa gctgtgatag gagctcgatc 14040

cgtcgacctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 14100

gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 14160

aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 14220

tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 14280

gcggtgtcat ctatgttact agatcggcgc gccgcaattg aagtttgggc ggccagcatg 14340

gccgtatccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata 14400

tcctgccacc agccagccaa cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg 14460

atacaggcag cccatcagaa ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 14520

gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 14580

aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 14640

gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc 14700

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg 14760

agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag 14820

cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc 14880

ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca 14940

acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag 15000

attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat 15060

ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc 15120

ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat 15180

agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat 15240

ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc 15300

gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa 15360 31

atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag 15420

cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc 15480

gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc 15540

aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg gggatctggc tcgcggcgga cgcacgacgc 15600

cggggcgaga ccataggcga tctcctaaat caatagtagc tgtaacctcg aagcgtttca 15660

cttgtaacaa cgattgagaa tttttgtcat aaaattgaaa tacttggttc gcatttttgt 15720

catccgcggt cagccgcaat tctgacgaac tgcccattta gctggagatg attgtacatc 15780

cttcacgtga aaatttctca agcgctgtga acaagggttc agattttaga ttgaaaggtg 15840

agccgttgaa acacgttctt cttgtcgatg acgacgtcgc tatgcggcat cttattattg 15900

aataccttac gatccacgcc ttcaaagtga ccgcggtagc cgacagcacc cagttcacaa 15960

gagtactctc ttccgcgacg gtcgatgtcg tggttgttga tctagattta ggtcgtgaag 16020

atgggctcga gatcgttcgt aatctggcgg caaagtctga tattccaatc ataattatca 16080

gtggcgaccg ccttgaggag acggataaag ttgttgcact cgagctagga gcaagtgatt 16140

ttatcgctaa gccgttcagt atcagagagt ttctagcacg cattcgggtt gccttgcgcg 16200

tgcgccccaa cgttgtccgc tccaaagacc gacggtcttt ttgttttact gactggacac 16260

ttaatctcag gcaacgtcgc ttgatgtccg aagctggcgg tgaggtgaaa cttacggcag 16320

gtgagttcaa tcttctcctc gcgtttttag agaaaccccg cgacgttcta tcgcgcgagc 16380

aacttctcat tgccagtcga gtacgcgacg aggaggttta tgacaggagt atagatgttc 16440

tcattttgag gctgcgccgc aaacttgagg cagatccgtc aagccctcaa ctgataaaaa 16500

cagcaagagg tgccggttat ttctttgacg cggacgtgca ggtttcgcac ggggggacga 16560

tggcagcctg agccaattcc cagatccccg aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc 16620

cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc 16680

gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc 16740

ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat 16800

taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt 16860

gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga 16920

ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc 16980

agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca 17040

tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt 17100

ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa 17160

agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac 17220

gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg 17280 32

ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga 17340

ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga 17400

ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc 17460

aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg 17520

agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga 17580

gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa 17640

cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat 17700

tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg 17760

gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat 17820

tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc 17880

ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc 17940

tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct 18000

acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct 18060

acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg 18120

ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc 18180

atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt 18240

ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat 18300

ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc 18360

agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 18420

agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 18480

agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 18540

tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 18600

tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 18660

ggcaaaagct ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 18720

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 18780

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 18840

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 18900

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 18960

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 19020

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 19080

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 19140 33

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 19200

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 19260

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 19320

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 19380

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 19440

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 19500

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 19560

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttgatcc ggaatta 19617

<210> 6

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целевая последовательность для TALEN 22808

<400> 6

tccagggtca acgtggagac agggaggtac gaaccggtga ctggcgaagg aagca 55

<210> 7

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23123

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V 34

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946)

<223> xZmPLAIIA

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7031)

<223> rsgRNAZmPLAIIA02

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13822)..(14226)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14904)..(15710) 35

<223> oCOLE-06

<400> 7

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800 36

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720 37

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580 38

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagggt caacgtggag acaggggttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500 39

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360 40

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280 41

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140 42

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060 43

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> для редактирования MTL

<400> 8

gggtcaacgt ggagacaggg 20

<210> 9

<211> 41

<212> ДНК

<213> Zea mays

<400> 9

agggtcaacg tggagacagg gaggtacgaa ccggtgactg g 41

<210> 10

<211> 45

<212> ДНК

<213> Zea mays

<400> 10

agggtcaacg tggagacagg cgaggaggta cgaaccggtg actgg 45

<210> 11

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированный MTL 44

<400> 11

agggtcaacg tggagacaag ggaggtacga accggtgact gg 42

<210> 12

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 12

agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 13

agggtcaacg tggagacggg aggtacgaac cggtgactgg 40

<210> 14

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 14

agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28

<210> 15

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 15

agggtcaacg tggagacaag ggaggtacga accggtgact gg 42

<210> 16

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 16

agggtcaacg tggagacggg aggtacgaac cggtgactgg 40 45

<210> 17

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> немутированная часть MTL

<400> 17

agggtcaacg tggagacagg gaggtacgaa ccggtgactg g 41

<210> 18

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутированная часть MTL

<400> 18

agggtcaacg tggagaaccg gtgactgg 28

<210> 19

<211> 1371

<212> ДНК

<213> Zea mays

<400> 19

agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60

atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120

aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180

cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240

atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300

gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360

gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420

gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480

aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540

acgagggcca agagcacgcc tctgaagaac gctctgctct cggacgtgtg cattggcacg 600

tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660

gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720

atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780

gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840

gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900

aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960 46

atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020

gacaactcgc tccgtggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080

acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcacagaggg tgtccagggt caacgtggag 1140

acagggaggt acgaaccggt gactggcgaa ggaagcaatg ccgatgccct cggtgggctc 1200

gctaggcagc tctccgagga gaggagaaca aggctcgcgc gccgcgtgtc tgccatcaac 1260

ccaagaggct ctagatgtgc gtcgtacgat atctaagaca agtggcttta ctgtcagtca 1320

catgcttgta aataagtaga ctttatttta ataaaacata aaaatatata t 1371

<210> 20

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23397

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946) 47

<223> xZmVLHP

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7031)

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13822)..(14226)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14904)..(15710)

<223> oCOLE-06

<400> 20

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300 48

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220 49

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080 50

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000 51

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagctg gagctgagct tccggggttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860 52

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780 53

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640 54

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560 55

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420 56

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> для редактирования VLHP2

<400> 21

gctggagctg agcttccggg 20

<210> 22

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23398

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> другой_признак

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01 57

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946)

<223> xZmGW2

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7031)

<223> rsgRNAZmGW2-01

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13822)..(14226)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14904)..(15710)

<223> oCOLE-06

<400> 22

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60 58

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920 59

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840 60

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700 61

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagagc ggttcacgcg gccgcagttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620 62

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480 63

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400 64

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260 65

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180 66

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722

<210> 23

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> для редактирования GW2-1

<400> 23

gagcggttca cgcggccgca 20

<210> 24

<211> 15721

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23763

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V 67

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> другой_признак

<222> (6221)..(6283)

<223> xSV40NLS-03

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6945)

<223> xTaVLHP1

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7030)

<223> rsgRNA TaVLHP1-01

<220>

<221> промотор

<222> (7041)..(9032)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9049)..(10227)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10250)..(10502)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10546)..(10675)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10955)..(11743)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11838)..(11968)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12705)..(13778) 68

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13821)..(14225)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14903)..(15709)

<223> oCOLE-06

<400> 24

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500 69

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420 70

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280 71

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagacg agcaggcgca gttccgtttt agagctagaa 6960

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 7020

cttttttttt cggaccgcgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga 7080

taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg 7140

tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 7200 72

aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 7260

atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt 7320

gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 7380

tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta 7440

catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt 7500

tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat 7560

accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc 7620

agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc 7680

gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga 7740

gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag 7800

cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta 7860

cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag 7920

acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa 7980

ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc 8040

cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 8100

gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 8160

gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 8220

tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 8280

tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 8340

tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 8400

tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt 8460

tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga 8520

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata 8580

tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca 8640

ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg 8700

aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg 8760

atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat 8820

gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt 8880

tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg 8940

atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat 9000

gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc agggatccgg cagcagccat gcagaagctg 9060 73

atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg ccctgaccga gctgtacggc 9120

atggagaacc ccagcagcca gcccatggcc gagctgtgga tgggcgccca ccccaagagc 9180

agcagccgcg tgcagaacgc cgccggcgac atcgtgagcc tgcgcgacgt gatcgagagc 9240

gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct tcggcgagct gcccttcctg 9300

ttcaaggtgc tgtgcgccgc ccagcccctg agcatccagg tgcaccccaa caagcacaac 9360

agcgagatcg gcttcgccaa ggagaacgcc gccggcatcc ccatggacgc cgccgagcgc 9420

aactacaagg accccaacca caagcccgag ctggtgttcg ccctgacccc cttcctggcc 9480

atgaacgcct tccgcgagtt cagcgagatc gtgagcctgc tgcagcccgt ggccggcgcc 9540

caccccgcca tcgcccactt cctgcagcag cccgacgccg agcgcctgag cgagctgttc 9600

gccagcctgc tgaacatgca gggcgaggag aagagccgcg ccctggccat cctgaagagc 9660

gccctggaca gccagcaggg cgagccctgg cagaccatcc gcctgatcag cgagttctac 9720

cccgaggaca gcggcctgtt cagccccctg ctgctgaacg tggtgaagct gaaccccggc 9780

gaggccatgt tcctgttcgc cgagaccccc cacgcctacc tgcagggcgt ggccctggag 9840

gtgatggcca acagcgacaa cgtgctgcgc gccggcctga cccccaagta catcgacatc 9900

cccgagctgg tggccaacgt gaagttcgag gccaagcccg ccaaccagct gctgacccag 9960

cccgtgaagc agggcgccga gctggacttc cccatccccg tggacgactt cgccttcagc 10020

ctgcacgacc tgagcgacaa ggagaccacc atcagccagc agagcgccgc catcctgttc 10080

tgcgtggagg gcgacgccac cctgtggaag ggcagccagc agctgcagct gaagcccggc 10140

gagagcgcct tcatcgccgc caacgagagc cccgtgaccg tgaagggcca cggccgcctg 10200

gcccgcgtgt acaacaagct gtgataggag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa 10260

catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 10320

ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 10380

tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 10440

caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 10500

tcggcgcgcc gcaattgaag tttgggcggc cagcatggcc gtatccgcaa tgtgttatta 10560

agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag 10620

ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagaatta 10680

attctcatgt ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg 10740

cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg 10800

ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc 10860

aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg 10920

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatgagg gaagcgttga tcgccgaagt 10980 74

atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct 11040

ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg aagccacaca gtgatattga 11100

tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga 11160

ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac 11220

cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt 11280

tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat 11340

tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc gttgccttgg taggtccagc 11400

ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac 11460

cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 11520

gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg atgtcgctgc 11580

cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc gtcatacttg aagctaggca 11640

ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca gatcagttgg aagaatttgt 11700

tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaagt agtcggcaaa taaagctcta gtggatctcc 11760

gtacccgggg atctggctcg cggcggacgc acgacgccgg ggcgagacca taggcgatct 11820

cctaaatcaa tagtagctgt aacctcgaag cgtttcactt gtaacaacga ttgagaattt 11880

ttgtcataaa attgaaatac ttggttcgca tttttgtcat ccgcggtcag ccgcaattct 11940

gacgaactgc ccatttagct ggagatgatt gtacatcctt cacgtgaaaa tttctcaagc 12000

gctgtgaaca agggttcaga ttttagattg aaaggtgagc cgttgaaaca cgttcttctt 12060

gtcgatgacg acgtcgctat gcggcatctt attattgaat accttacgat ccacgccttc 12120

aaagtgaccg cggtagccga cagcacccag ttcacaagag tactctcttc cgcgacggtc 12180

gatgtcgtgg ttgttgatct agatttaggt cgtgaagatg ggctcgagct aggagcaagt 12240

gattttatcg ctaagccgtt cagtatcaga gagtttctag cacgcattcg ggttgccttg 12300

cgcgtgcgcc ccaacgttgt ccgctccaaa gaccgacggt ctttttgttt tactgactgg 12360

acacttaatc tcaggcaacg tcgcttgatg tccgaagctg gcggtgaggt gaaacttacg 12420

gcaggtgagt tcaatcttct cctcgcgttt ttagagaaac cccgcgacgt tctatcgcgc 12480

gagcaacttc tcattgccag tcgagtacgc gacgaggagg tttatgacag gagtatagat 12540

gttctcattt tgaggctgcg ccgcaaactt gaggcagatc cgtcaagccc tcaactgata 12600

aaaacagcaa gaggtgccgg ttatttcttt gacgcggacg tgcaggtttc gcacgggggg 12660

acgatggcag cctgagccaa ttcccagatc cccgaggaat cggcgtgagc ggtcgcaaac 12720

catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg 12780

ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc 12840 75

aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt 12900

cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg atgctctatg 12960

acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc 13020

gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt 13080

ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg atggcggttt 13140

cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg 13200

tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc 13260

agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc 13320

gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta 13380

gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag 13440

ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc 13500

ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg 13560

ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg 13620

ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc 13680

cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc 13740

gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag atgctagggc 13800

aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca 13860

ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt 13920

acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt 13980

ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc tgtgcataac 14040

tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg tcgctgcgct 14100

ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg 14160

gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc 14220

ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc 14280

catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc 14340

agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg 14400

tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca 14460

agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc 14520

atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg 14580

aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag 14640

atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc 14700

ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga 14760 76

gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 14820

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 14880

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 14940

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 15000

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 15060

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 15120

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 15180

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 15240

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 15300

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 15360

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 15420

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 15480

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 15540

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 15600

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 15660

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg atccggaatt 15720

a 15721

<210> 25

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> для редактирования VLHP1 у пшеницы

<400> 25

gacgagcagg cgcagttcc 19

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Triticum aestivum

<400> 26

gctggagctg agcttccggg 20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Triticum aestivum

<400> 27 77

tctggagctg agcttccggg 20

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Zea mays

<400> 28

aggcgtcgag cagcgaggtg 20

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> редактированная часть ZmVLHP-03

<400> 29

aggcgttgag cagcgaggtg 20

<210> 30

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> восстановленная донорная матричная последовательность для создания мутации

E149L в ZmPYL-D

<400> 30

ccttggtgtt gccgtcgggg acgtcgacga cgaatgacag gatgacgagc gtccctggcc 60

ggccgtcgat gacct 75

<210> 31

<211> 15722

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 23136

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (304)..(2100)

<223> prSoUbi4-04

<220>

<221> ген

<222> (2117)..(6286)

<223> cCas9-01 78

<220>

<221> мутация

<222> (5606)..(5608)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5651)..(5653)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6292)..(6544)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6551)..(6925)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(6946)

<223> xZmPYL-D

<220>

<221> другой_признак

<222> (6927)..(7031)

<223> rsgRBAZmPYLd-02

<220>

<221> промотор

<222> (7042)..(9033)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (9050)..(10228)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10251)..(10503)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10547)..(10676)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (10956)..(11744)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (11839)..(11969)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12706)..(13779) 79

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (13822)..(14226)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (14904)..(15710)

<223> oCOLE-06

<400> 31

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccattatg tggtctaggt aggttctata tataagaaaa cttgaaatgt tctaaaaaaa 360

aattcaagcc catgcatgat tgaagcaaac ggtatagcaa cggtgttaac ctgatctagt 420

gatctcttgc aatccttaac ggccacctac cgcaggtagc aaacggcgtc cccctcctcg 480

atatctccgc ggcgacctct ggctttttcc gcggaattgc gcggtgggga cggattccac 540

gagaccgcga cgcaaccgcc tctcgccgct gggccccaca ccgctcggtg ccgtagcctc 600

acgggactct ttctccctcc tcccccgtta taaattggct tcatcccctc cttgcctcat 660

ccatccaaat cccagtcccc aatcccatcc cttcgtagga gaaattcatc gaagctaagc 720

gaatcctcgc gatcctctca aggtactgcg agttttcgat ccccctctcg acccctcgta 780

tgtttgtgtt tgtcgtagcg tttgattagg tatgctttcc ctgtttgtgt tcgtcgtagc 840

gtttgattag gtatgctttc cctgttcgtg ttcatcgtag tgtttgatta ggtcgtgtga 900

ggcgatggcc tgctcgcgtc cttcgatctg tagtcgattt gcgggtcgtg gtgtagatct 960

gcgggctgtg atgaagttat ttggtgtgat ctgctcgcct gattctgcgg gttggctcga 1020

gtagatatga tggttggacc ggttggttcg tttaccgcgc tagggttggg ctgggatgat 1080

gttgcatgcg ccgttgcgcg tgatcccgca gcaggacttg cgtttgattg ccagatctcg 1140

ttacgattat gtgatttggt ttggactttt tagatctgta gcttctgctt atgtgccaga 1200

tgcgcctact gctcatatgc ctgatgataa tcataaatgg ctgtggaact aactagttga 1260

ttgcggagtc atgtatcagc tacaggtgta gggactagct acaggtgtag ggacttgcgt 1320

ctaattgttt ggtcctttac tcatgttgca attatgcaat ttagtttaga ttgtttgttc 1380

cactcatcta ggctgtaaaa gggacactgc ttagattgct gtttaatctt tttagtagat 1440

tatattatat tggtaactta ttacccctat tacatgccat acgtgacttc tgctcatgcc 1500 80

tgatgataat catagatcac tgtggaatta attagttgat tgttgaatca tgtttcatgt 1560

acataccacg gcacaattgc ttagttcctt aacaaatgca aattttactg atccatgtat 1620

gatttgcgtg gttctctaat gtgaaatact atagctactt gttagtaaga atcaggttcg 1680

tatgcttaat gctgtatgtg ccttctgctc atgcctgatg ataatcatat atcactggaa 1740

ttaattagtt gatcgtttaa tcatatatca agtacatacc atgccacaat ttttagtcac 1800

ttaacccatg cagattgaac tggtccctgc atgttttgct aaattgttct attctgatta 1860

gaccatatat catgtatttt tttttggtaa tggttctctt attttaaatg ctatatagtt 1920

ctggtacttg ttagaaagat ctgcttcata gtttagttgc ctatccctcg aattaggatg 1980

ctgagcagct gatcctatag ctttgtttca tgtatcaatt cttttgtgtt caacagtcag 2040

tttttgttag attcattgta acttatggtc gcttactctt ctggtcctca atgcttgcag 2100

gatcgcggcc gctcatatgg acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaacag 2160

cgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg agcaagaagt tcaaggtgct 2220

gggcaacacc gacaggcaca gcatcaagaa gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag 2280

cggcgagacc gccgaggcca ccaggctgaa gaggaccgcc aggaggaggt acaccaggag 2340

gaagaacagg atctgctacc tgcaggagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga 2400

cagcttcttc cacaggctgg aggagagctt cctggtggag gaggacaaga agcacgagag 2460

gcacccgatc ttcggcaaca tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat 2520

ctaccacctg aggaagaagc tggtggacag caccgacaag gccgacctga ggctgatcta 2580

cctggccctg gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa 2640

cccggacaac agcgacgtgg acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct 2700

gttcgaggag aacccgatca acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgagcgccag 2760

gctgagcaag agcaggaggc tggagaacct gatcgcccag ctgccgggcg agaagaagaa 2820

cggcctgttc ggcaacctga tcgccctgag cctgggcctg accccgaact tcaagagcaa 2880

cttcgacctg gccgaggacg ccaagctgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct 2940

ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca gtacgccgac ctgttcctgg ccgccaagaa 3000

cctgagcgac gccatcctgc tgagcgacat cctgagggtg aacaccgaga tcaccaaggc 3060

cccgctgagc gccagcatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct 3120

gaaggccctg gtgaggcagc agctgccgga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagag 3180

caagaacggc tacgccggct acatcgacgg cggcgccagc caggaggagt tctacaagtt 3240

catcaagccg atcctggaga agatggacgg caccgaggag ctgctggtga agctgaacag 3300

ggaggacctg ctgaggaagc agaggacctt cgacaacggc agcatcccgc accagatcca 3360

cctgggcgag ctgcacgcca tcctgaggag gcaggaggac ttctacccgt tcctgaagga 3420 81

caacagggag aagatcgaga agatcctgac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct 3480

ggccaggggc aacagcaggt tcgcctggat gaccaggaag agcgaggaga ccatcacccc 3540

gtggaacttc gaggaggtgg tggacaaggg cgccagcgcc cagagcttca tcgagaggat 3600

gaccaacttc gacaagaacc tgccgaacga gaaggtgctg ccgaagcaca gcctgctgta 3660

cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg agggcatgag 3720

gaagccggcc ttcctgagcg gcgagcagaa gaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac 3780

caacaggaag gtgaccgtga agcagctgaa ggaggactac ttcaagaaga tcgagtgctt 3840

cgacagcgtg gagatcagcg gcgtggagga caggttcaac gccagcctgg gcacctacca 3900

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaggaga acgaggacat 3960

cctggaggac atcgtgctga ccctgaccct gttcgaggac agggagatga tcgaggagag 4020

gctgaagacc tacgcccacc tgttcgacga caaggtgatg aagcagctga agaggaggag 4080

gtacaccggc tggggcaggc tgagcaggaa gctgatcaac ggcatcaggg acaagcagag 4140

cggcaagacc atcctggact tcctgaagag cgacggcttc gccaacagga acttcatgca 4200

gctgatccac gacgacagcc tgaccttcaa ggaggacatc cagaaggccc aggtgagcgg 4260

ccagggcgac agcctgcacg agcacatcgc caacctggcc ggcagcccgg ccatcaagaa 4320

gggcatcctg cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa 4380

gccggagaac atcgtgatcg agatggccag ggagaaccag accacccaga agggccagaa 4440

gaacagcagg gagaggatga agaggatcga ggagggcatc aaggagctgg gcagccagat 4500

cctgaaggag cacccggtgg agaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta 4560

cctgcagaac ggcagggaca tgtacgtgga ccaggagctg gacatcaaca ggctgagcga 4620

ctacgacgtg gaccacatcg tgccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 4680

ggtgctgacc aggagcgaca agaacagggg caagagcgac aacgtgccga gcgaggaggt 4740

ggtgaagaag atgaaaaact actggaggca gctgctgaac gccaagctga tcacccagag 4800

gaagttcgac aacctgacca aggccgagag gggcggcctg agcgagctgg acaaggccgg 4860

cttcattaaa aggcagctgg tggagaccag gcagatcacc aagcacgtgg cccagatcct 4920

ggacagcagg atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctgatcaggg aggtgaaggt 4980

gatcaccctg aagagcaagc tggtgagcga cttcaggaag gacttccagt tctacaaggt 5040

gagggagatc aataattacc accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tggtgggcac 5100

cgccctgatt aaaaagtacc cgaagctgga gagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt 5160

gtacgacgtg aggaagatga tcgccaagag cgagcaggag atcggcaagg ccaccgccaa 5220

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagacc gagatcaccc tggccaacgg 5280 82

cgagatcagg aagaggccgc tgatcgagac caacggcgag accggcgaga tcgtgtggga 5340

caagggcagg gacttcgcca ccgtgaggaa ggtgctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt 5400

gaagaagacc gaggtgcaga ccggcggctt cagcaaggag agcatcctgc cgaagaggaa 5460

cagcgacaag ctgatcgcca ggaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gcggcttcga 5520

cagcccgacc gtggcctaca gcgtgctggt ggtggccaag gtggagaagg gcaagagcaa 5580

gaagctgaag agcgtgaagg agctggtggg catcaccatc atggagagga gcagcttcga 5640

gaagaaccca gtggacttcc tggaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctgat 5700

cattaaactg ccgaagtaca gcctgttcga gctggagaac ggcaggaaga ggatgctggc 5760

cagcgccggc gagctgcaga agggcaacga gctggccctg ccgagcaagt acgtgaactt 5820

cctgtacctg gccagccact acgagaagct gaagggcagc ccggaggaca acgagcagaa 5880

gcagctgttc gtggagcagc acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga 5940

gttcagcaag agggtgatcc tggccgacgc caacctggac aaggtgctga gcgcctacaa 6000

caagcacagg gacaagccga tcagggagca ggccgagaac atcatccacc tgttcaccct 6060

gaccaacctg ggcgccccgg ccgccttcaa gtacttcgac accaccatcg acaggaagag 6120

gtacaccagc accaaggagg tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct 6180

gtacgagacc aggatcgacc tgagccagct gggcggcgac agcagcccgc cgaagaagaa 6240

gaggaaggtg agctggaagg acgccagcgg ctggagcagg atgtgaagct tgatcgttca 6300

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6360

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6420

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6480

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6540

gatcttcgaa gggatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact 6600

taaagttatc aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc 6660

acaggacagg cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt 6720

acgttggaaa ccacgtgatg tggagtaaga taaactgtag gagaaaagca tttcgtagtg 6780

ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac gcaattggac 6840

gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa gctggtttaa 6900

aagagttgtg cagatgatcc gtggcagtcg gggacgtcga cgacgagttt tagagctaga 6960

aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt 7020

gctttttttt tcggaccgcg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 7080

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 7140

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 7200 83

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 7260

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 7320

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 7380

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 7440

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 7500

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 7560

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 7620

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 7680

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 7740

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 7800

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 7860

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 7920

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 7980

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 8040

cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt 8100

agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 8160

cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 8220

ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 8280

ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 8340

gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 8400

gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat 8460

ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 8520

atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 8580

atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 8640

attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 8700

gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 8760

gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 8820

tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 8880

ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 8940

gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 9000

tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060 84

gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120

catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180

cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240

cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300

gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360

cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420

caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480

catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540

ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600

cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660

cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720

ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780

cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840

ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg cgccggcctg acccccaagt acatcgacat 9900

ccccgagctg gtggccaacg tgaagttcga ggccaagccc gccaaccagc tgctgaccca 9960

gcccgtgaag cagggcgccg agctggactt ccccatcccc gtggacgact tcgccttcag 10020

cctgcacgac ctgagcgaca aggagaccac catcagccag cagagcgccg ccatcctgtt 10080

ctgcgtggag ggcgacgcca ccctgtggaa gggcagccag cagctgcagc tgaagcccgg 10140

cgagagcgcc ttcatcgccg ccaacgagag ccccgtgacc gtgaagggcc acggccgcct 10200

ggcccgcgtg tacaacaagc tgtgatagga gctcgatccg tcgacctgca gatcgttcaa 10260

acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca 10320

tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat 10380

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa 10440

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag 10500

atcggcgcgc cgcaattgaa gtttgggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt 10560

aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca 10620

gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt 10680

aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740

gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800

gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860

caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980 85

tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040

tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100

atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160

accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220

ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280

ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340

ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400

cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460

ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520

cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580

ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640

aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700

ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760

cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820

tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880

tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940

tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000

cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060

tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120

caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180

cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240

tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300

gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360

gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420

ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480

cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540

tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600

aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660

gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720

ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780

gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840 86

caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080

tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140

tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 13200

gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 13260

cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 13320

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 13380

agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 13440

gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 13500

cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 13560

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 13620

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 13680

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 13740

cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 13800

caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 13860

attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 13920

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 13980

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 14040

ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 14100

tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 14160

ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 14220

cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc 14280

ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac 14340

cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc 14400

gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc 14460

aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact 14520

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 14580

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 14640

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 14700

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 14760 87

agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 14820

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 14880

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 14940

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 15000

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 15060

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 15120

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 15180

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 15240

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 15300

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 15360

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 15420

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 15480

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 15540

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 15600

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 15660

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 15720

ta 15722

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодирующая gRNA для вектора 23136

<400> 32

gtcggggacg tcgacgacga 20

<210> 33

<211> 1823

<212> ДНК

<213> Oryza sativa

<400> 33

acagtgacta gtgacaaacg atcgatcgat ccctccatcc acaaaccctc ctcgatctca 60

tcttccttcg tctcgtcaat ggcggcgagc tactcgtgcc ggcggacatg cgaggcgtgc 120

agcacgaggg cgatggccgg gtgcgtggtg ggcgagccgg cgtcggcgcc ggggcagcgg 180

gtgacgttgc tggcgatcga cggcggcggc atcaggggcc tcatcccggg caccatcctc 240

gccttcctcg aggccaggct gcaggagctg gatggccccg acgcgcgcct cgccgattac 300 88

ttcgactgca tcgccgggac cagcaccggc ggcctcatca ccgccatgct cgccgcgccc 360

ggcgaccacg gccgcccgct cttcgccgcc agcgacatca accgcttcta cctcgacaac 420

ggcccactca tcttcccaca aaagtaactg atcacctcga attcgatctc ctctcttcga 480

tctctgcatt atttgatttg attggggatt gtgggcggcg tggcgtggcg tccaggaggt 540

gcggcatggc ggcggccatg gcggcgctga cgaggccgag gtacaacggc aagtacctgc 600

aggggaagat caggaagatg ctgggcgaga cgagggtgcg cgacacgctg acgaacgtcg 660

tcatccccac gttcgacgtc aggctgctcc agccaaccat cttctccaca tacgacgtgc 720

gtgcgttgat tccatccgca ttggcgttgg aatcagctga ttgtttgatt gatcgaacaa 780

ttgatcggtt aaaattttgc aggcgaagag catgccgctc aagaacgcgc tcctctccga 840

catctgcatc agcacatccg cggcgccgac ctacctcccc gcgcactgct tccagaccac 900

cgacgacgcc accggcaagg tccgcgagtt cgacctcatc gacggcggcg tcgccgccaa 960

caacccggta actaatcaat caagcaatcc atcaaacgaa gatccacatg tgcattcctg 1020

tggtacaaat gctgatcgat cgatggatgg atcgattttc gcgagaacgt acagacgatg 1080

gtggccatga cgcagatcac caagaagata atggtgaagg acaaggagga gctgtacccg 1140

gtaaagccgt cggactgcgg taagttcctg gtgctgtccg tgggcaccgg gtcgacgtcg 1200

gaccagggga tgtacacggc gaggcagtgc tcgcggtggg ggatcgtccg gtggctgcgc 1260

aacaagggga tggcgcccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctccga cctcgtcgac 1320

atccacgccg ccgtcatgtt ccagtcgctg cacagcgacg gcgactacct ccgcatccag 1380

gacaacacgc tccacggcga cgccgccacg gtggacgccg ccaccaggga caacatgcgg 1440

gcgctcgtcg ggatcggcga gcggatgctg gcgcagcggg tgtcgagggt caacgtcgag 1500

accggcaggt acgtcgaggt gcccggcgcc ggcagcaacg ccgacgcgct gaggggcttc 1560

gccaggcagc tctccgagga gaggagggcg aggctaggtc ggcgaaacgc ctgcggcggc 1620

ggcggcgaag gagagcccag cggcgtggcg tgcaagcgtt agtaactgta cacgcatcat 1680

gctgacgcga tcttttttat ttttcttttt ttttttttac ctttctagcg gacatgggga 1740

ataacaagac gtgacagtag tgcaatcggt ttgtaacgtg cgtataccaa cattgatcca 1800

tttcttcatc acagtttcag ttc 1823

<210> 34

<211> 15921

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24038 89

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (313)..(1149)

<223> prZmGRMZM5G876285-01

<220>

<221> ген

<222> (1152)..(5412)

<223> cCas9-12

<220>

<221> Терминатор

<222> (5419)..(6736)

<223> tZmGRMZM5G876285-01

<220>

<221> промотор

<222> (6750)..(7124)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7126)..(7145)

<223> xZmVLHP2

<220>

<221> другой_признак

<222> (7126)..(7230)

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (7146)..(7157)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7146)..(7230)

<223> rsgRNAоснование-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7162)..(7230)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (7241)..(9232)

<223> prUbi-04

<220>

<221> ген

<222> (9249)..(10427)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (10450)..(10702) 90

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (10746)..(10875)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (11155)..(11943)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (12038)..(12168)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (12243)..(12875)

<223> cVirG-09

<220>

<221> ген

<222> (12905)..(13978)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (14021)..(14425)

<223> oVA1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (15103)..(15909)

<223> oCOLE-06

<400> 34

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccgggacc ctaagtaatc ttgtgctaca aatttatttt tcagacagaa aaatctattt 360

agctaactaa ttaatacaaa ttaataccaa gcaacgatag atgaacatct agttgtctaa 420

ttagctaact aattaataca aattaagtag aatccttacc gtggggagat ggggcgcgac 480

gaagtgctcg agcttggggc gcggcgaccg gcgacgtgaa gcttgggggc gcgggggccg 540

gacggcgctg cgggcggcat ggcgggcggc tgcgggcggc ggcgcgggcg caggaaacaa 600

acgacgggag tgggaggaag gagaaagcgg cgcgccggtt tagtcctagc tcggcgccaa 660

gatctgtggc gccgagctag gtgccacgat ggccgccgcg tcagcaaagc tcggcgccaa 720

ggcatgttgc gccgagccgt gttagctcgg cgtcatagct catggtgccg agttttgggt 780 91

ctaaaattgc gtttaagtat tctagggatc taaacgcaaa tatttttcga aaatagggcc 840

gaaaaacaaa aaaaaatcgg tcgtttcgtc gagcacatcg tccagcctat cttgcatgtc 900

catcctctct atggttcgcg agccgcgcgc atggcgctcc aaaggagggg cgaggttgaa 960

tatagacaga tggaatgggt ggttctctat ttatagcgca tgcagtcgtc ccctggcaca 1020

cctatttata tgtgagcgtt cctggcacta gagagatcga tcgatcgagc ttaattgcgc 1080

cactgctcgt tatcctcctc ttgcattgca ttgcaggtcg tagttgagca gcagcaacca 1140

ctgcacaggc catggacaag aagtacagca tcggcctgga catcggcacc aacagcgtgg 1200

gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgataccaat ttgcatgatc cttgttcgtt 1260

ctagctcttg catgccgatc agttgaatca cgcggtttcc ttctgcgcat ttgcatccag 1320

gtgccgagca agaagttcaa ggtgctgggc aacaccgaca ggcacagcat caagaagaac 1380

ctgatcggcg ccctgctgtt cgacagcggc gagaccgccg aggccaccag gctgaagagg 1440

accgccagga ggaggtacac caggaggaag aacaggatct gctacctgca ggagatcttc 1500

agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca ggctggagga gagcttcctg 1560

gtggaggagg acaagaagca cgagaggcac ccgatcttcg gcaacatcgt ggacgaggtg 1620

gcctaccacg agaagtaccc gaccatctac cacctgagga agaagctggt ggacagcacc 1680

gacaaggccg acctgaggct gatctacctg gccctggccc acatgatcaa gttcaggggc 1740

cacttcctga tcgagggcga cctgaacccg gacaacagcg acgtggacaa gctgttcatc 1800

cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggagaacc cgatcaacgc cagcggcgtg 1860

gacgccaagg ccatcctgag cgccaggctg agcaagagca ggaggctgga gaacctgatc 1920

gcccagctgc cgggcgagaa gaagaacggc ctgttcggca acctgatcgc cctgagcctg 1980

ggcctgaccc cgaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggacgccaa gctgcagctg 2040

agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg cgaccagtac 2100

gccgacctgt tcctggccgc caagaacctg agcgacgcca tcctgctgag cgacatcctg 2160

agggtgaaca ccgagatcac caaggccccg ctgagcgcca gcatgatcaa gaggtacgac 2220

gagcaccacc aggacctgac cctgctgaag gccctggtga ggcagcagct gccggagaag 2280

tacaaggaga tcttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat cgacggcggc 2340

gccagccagg aggagttcta caagttcatc aagccgatcc tggagaagat ggacggcacc 2400

gaggagctgc tggtgaagct gaacagggag gacctgctga ggaagcagag gaccttcgac 2460

aacggcagca tcccgcacca gatccacctg ggcgagctgc acgccatcct gaggaggcag 2520

gaggacttct acccgttcct gaaggacaac agggagaaga tcgagaagat cctgaccttc 2580

cgcatcccgt actacgtggg cccgctggcc aggggcaaca gcaggttcgc ctggatgacc 2640 92

aggaagagcg aggagaccat caccccgtgg aacttcgagg aggtggtgga caagggcgcc 2700

agcgcccaga gcttcatcga gaggatgacc aacttcgaca agaacctgcc gaacgagaag 2760

gtgctgccga agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtacaacga gctgaccaag 2820

gtgaagtacg tgaccgaggg catgaggaag ccggccttcc tgagcggcga gcagaagaag 2880

gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac aggaaggtga ccgtgaagca gctgaaggag 2940

gactacttca agaagatcga gtgcttcgac agcgtggaga tcagcggcgt ggaggacagg 3000

ttcaacgcca gcctgggcac ctaccacgac ctgctgaaga tcatcaagga caaggacttc 3060

ctggacaacg aggagaacga ggacatcctg gaggacatcg tgctgaccct gaccctgttc 3120

gaggacaggg agatgatcga ggagaggctg aagacctacg cccacctgtt cgacgacaag 3180

gtgatgaagc agctgaagag gaggaggtac accggctggg gcaggctgag caggaagctg 3240

atcaacggca tcagggacaa gcagagcggc aagaccatcc tggacttcct gaagagcgac 3300

ggcttcgcca acaggaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac cttcaaggag 3360

gacatccaga aggcccaggt gagcggccag ggcgacagcc tgcacgagca catcgccaac 3420

ctggccggca gcccggccat caagaagggc atcctgcaga ccgtgaaggt ggtggacgag 3480

ctggtgaagg tgatgggcag gcacaagccg gagaacatcg tgatcgagat ggccagggag 3540

aaccagacca cccagaaggg ccagaagaac agcagggaga ggatgaagag gatcgaggag 3600

ggcatcaagg agctgggcag ccagatcctg aaggagcacc cggtggagaa cacccagctg 3660

cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta cgtggaccag 3720

gagctggaca tcaacaggct gagcgactac gacgtggacc acatcgtgcc gcagagcttc 3780

ctgaaggacg acagcatcga caacaaggtg ctgaccagga gcgacaagaa caggggcaag 3840

agcgacaacg tgccgagcga ggaggtggtg aagaagatga aaaactactg gaggcagctg 3900

ctgaacgcca agctgatcac ccagaggaag ttcgacaacc tgaccaaggc cgagaggggc 3960

ggcctgagcg agctggacaa ggccggcttc attaaaaggc agctggtgga gaccaggcag 4020

atcaccaagc acgtggccca gatcctggac agcaggatga acaccaagta cgacgagaac 4080

gacaagctga tcagggaggt gaaggtgatc accctgaaga gcaagctggt gagcgacttc 4140

aggaaggact tccagttcta caaggtgagg gagatcaata attaccacca cgcccacgac 4200

gcctacctga acgccgtggt gggcaccgcc ctgattaaaa agtacccgaa gctggagagc 4260

gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgagga agatgatcgc caagagcgag 4320

caggagatcg gcaaggccac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat gaacttcttc 4380

aagaccgaga tcaccctggc caacggcgag atcaggaaga ggccgctgat cgagaccaac 4440

ggcgagaccg gcgagatcgt gtgggacaag ggcagggact tcgccaccgt gaggaaggtg 4500

ctgtccatgc cgcaggtgaa catcgtgaag aagaccgagg tgcagaccgg cggcttcagc 4560 93

aaggagagca tcctgccgaa gaggaacagc gacaagctga tcgccaggaa gaaggactgg 4620

gacccgaaga agtacggcgg cttcgacagc ccgaccgtgg cctacagcgt gctggtggtg 4680

gccaaggtgg agaagggcaa gagcaagaag ctgaagagcg tgaaggagct ggtgggcatc 4740

accatcatgg agaggagcag cttcgagaag aacccagtgg acttcctgga ggccaagggc 4800

tacaaggagg tgaagaagga cctgatcatt aaactgccga agtacagcct gttcgagctg 4860

gagaacggca ggaagaggat gctggccagc gccggcgagc tgcagaaggg caacgagctg 4920

gccctgccga gcaagtacgt gaacttcctg tacctggcca gccactacga gaagctgaag 4980

ggcagcccgg aggacaacga gcagaagcag ctgttcgtgg agcagcacaa gcactacctg 5040

gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc agcaagaggg tgatcctggc cgacgccaac 5100

ctggacaagg tgctgagcgc ctacaacaag cacagggaca agccgatcag ggagcaggcc 5160

gagaacatca tccacctgtt caccctgacc aacctgggcg ccccggccgc cttcaagtac 5220

ttcgacacca ccatcgacag gaagaggtac accagcacca aggaggtgct ggacgccacc 5280

ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagaccagga tcgacctgag ccagctgggc 5340

ggcgacagca gcccgccgaa gaagaagagg aaggtgagct ggaaggacgc cagcggctgg 5400

agcaggatgt gagctctaat gcatccaaac aacgacacca acgccaacat taattaatta 5460

gtagtctcca tgccctggga ttgtgcgtgg ccgctccgtt gaacaccacc catccttcgt 5520

tcggcatttt ttcccccctt gtttatataa ttttattgta tcgttttggc aaataatttt 5580

gtgattcgac cccaaagcaa gtttggttgt cttacgattt gtaaacctgg aacaatatat 5640

aatgtgattg aactgctttg tctattcttt ttgtagtacg ataatatgta tatgtattcc 5700

atgcgatctc ttctagggcg acgactaatg tgcaagtgtg tgtttgcatg cgctgagcac 5760

ggagtttgta ttcaggggtc aatatctttc gattccttta tctaaaaagg tgttgcatat 5820

atctaaaaaa aagaaaaaaa aggcttacaa ctgttgaaaa aataagcatt tttagtttta 5880

atttaattca gaaaatcata gtgatatatg tgacgatatg catgtgcata tgtatcacta 5940

ctcacataaa cagtaaacaa cagtaaaata tgtataaata caaaaataac aaagtgtacc 6000

ctgcggaggg accgatgttc aaggcatctg tggctccatt cacacgagac atctcgtgtg 6060

tatgttcgat gtagtcatac gcagtcgagg cagtcagatg tacgcagtgc agtccctcga 6120

tcggcgccgg cgacgaggaa cttgatcagt gctggtcgag cggacgaagc gagcagtcgc 6180

gagtacgctc ccgaaaaaca tgatcgctcg cacacccatg caagtgtcgc tctgcggacg 6240

acgatttcgg aagcctacgc gtatgagaat gtttgtatgt gtgttctctc gtaaccagaa 6300

gcctcatctc ctccgtatat atacacgcgc agagggaggc caacagatag taacggtgga 6360

aggaatactc ggaccaaggt ccgatctacc atggccacgg cccggcctgg ccagcggcgc 6420 94

gtgcgtgtgg cagtccttca tccttttatc agcttatcaa tagatgcacc aaagatccac 6480

ctatttaagt tgattgaatt gtctcttgta cttccggtat gttactaaag taataataca 6540

ccgtagcatt aaattgggcc tttagcattg gctattattg aatattaatt tgagccagac 6600

ccaccaccag atgctaagtc acaccaaaat gctctcatca tctcaaacat ttcatatact 6660

ggtgtttcga tggagactat taagttgaac atccacctag aatctagatt acacttgacc 6720

acaactacat aatggacgga ccgttcgaag ggatctttaa acatacgaac agatcactta 6780

aagttcttct gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 6840

tgcagtcagg gaccatagca caggacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 6900

gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt ggagtaagat aaactgtagg 6960

agaaaagcat ttcgtagtgg gccatgaagc ctttcaggac atgtattgca gtatgggccg 7020

gcccattacg caattggacg acaacaaaga ctagtattag taccacctcg gctatccaca 7080

tagatcaaag ctggtttaaa agagttgtgc agatgatccg tggcagctgg agctgagctt 7140

ccggggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 7200

aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt cggaccgcgc ctgcagtgca gcgtgacccg 7260

gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca 7320

tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 7380

ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc 7440

atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc 7500

tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct 7560

atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt 7620

atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac 7680

taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa taaaataaag 7740

tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct 7800

tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 7860

cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc 7920

tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat 7980

ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc 8040

tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 8100

tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 8160

cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 8220

aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg 8280

tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt 8340 95

gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg 8400

attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca 8460

gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc 8520

ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg 8580

tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt 8640

ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca 8700

tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 8760

gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg 8820

tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 8880

ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt 8940

taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat 9000

gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct 9060

attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca 9120

tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg 9180

gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc agggatccgg 9240

cagcagccat gcagaagctg atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg 9300

ccctgaccga gctgtacggc atggagaacc ccagcagcca gcccatggcc gagctgtgga 9360

tgggcgccca ccccaagagc agcagccgcg tgcagaacgc cgccggcgac atcgtgagcc 9420

tgcgcgacgt gatcgagagc gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct 9480

tcggcgagct gcccttcctg ttcaaggtgc tgtgcgccgc ccagcccctg agcatccagg 9540

tgcaccccaa caagcacaac agcgagatcg gcttcgccaa ggagaacgcc gccggcatcc 9600

ccatggacgc cgccgagcgc aactacaagg accccaacca caagcccgag ctggtgttcg 9660

ccctgacccc cttcctggcc atgaacgcct tccgcgagtt cagcgagatc gtgagcctgc 9720

tgcagcccgt ggccggcgcc caccccgcca tcgcccactt cctgcagcag cccgacgccg 9780

agcgcctgag cgagctgttc gccagcctgc tgaacatgca gggcgaggag aagagccgcg 9840

ccctggccat cctgaagagc gccctggaca gccagcaggg cgagccctgg cagaccatcc 9900

gcctgatcag cgagttctac cccgaggaca gcggcctgtt cagccccctg ctgctgaacg 9960

tggtgaagct gaaccccggc gaggccatgt tcctgttcgc cgagaccccc cacgcctacc 10020

tgcagggcgt ggccctggag gtgatggcca acagcgacaa cgtgctgcgc gccggcctga 10080

cccccaagta catcgacatc cccgagctgg tggccaacgt gaagttcgag gccaagcccg 10140

ccaaccagct gctgacccag cccgtgaagc agggcgccga gctggacttc cccatccccg 10200 96

tggacgactt cgccttcagc ctgcacgacc tgagcgacaa ggagaccacc atcagccagc 10260

agagcgccgc catcctgttc tgcgtggagg gcgacgccac cctgtggaag ggcagccagc 10320

agctgcagct gaagcccggc gagagcgcct tcatcgccgc caacgagagc cccgtgaccg 10380

tgaagggcca cggccgcctg gcccgcgtgt acaacaagct gtgataggag ctcgatccgt 10440

cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 10500

ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 10560

atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 10620

atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 10680

gtgtcatcta tgttactaga tcggcgcgcc gcaattgaag tttgggcggc cagcatggcc 10740

gtatccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc 10800

tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata 10860

caggcagccc atcagaatta attctcatgt ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca 10920

ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa 10980

tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc 11040

gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatccggc 11100

tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatgagg 11160

gaagcgttga tcgccgaagt atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc 11220

catctcgaac cgacgttgct ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg 11280

aagccacaca gtgatattga tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg 11340

cggcgagctt tgatcaacga ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt 11400

ctccgcgctg tagaagtcac cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca 11460

gctaagcgcg aactgcaatt tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc 11520

gagccagcca cgatcgacat tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc 11580

gttgccttgg taggtccagc ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta 11640

tttgaggcgc taaatgaaac cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat 11700

gagcgaaatg tagtgcttac gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc 11760

gcgccgaagg atgtcgctgc cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc 11820

gtcatacttg aagctaggca ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca 11880

gatcagttgg aagaatttgt tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaagt agtcggcaaa 11940

taaagctcta gtggatctcc gtacccgggg atctggctcg cggcggacgc acgacgccgg 12000

ggcgagacca taggcgatct cctaaatcaa tagtagctgt aacctcgaag cgtttcactt 12060

gtaacaacga ttgagaattt ttgtcataaa attgaaatac ttggttcgca tttttgtcat 12120 97

ccgcggtcag ccgcaattct gacgaactgc ccatttagct ggagatgatt gtacatcctt 12180

cacgtgaaaa tttctcaagc gctgtgaaca agggttcaga ttttagattg aaaggtgagc 12240

cgttgaaaca cgttcttctt gtcgatgacg acgtcgctat gcggcatctt attattgaat 12300

accttacgat ccacgccttc aaagtgaccg cggtagccga cagcacccag ttcacaagag 12360

tactctcttc cgcgacggtc gatgtcgtgg ttgttgatct agatttaggt cgtgaagatg 12420

ggctcgagct aggagcaagt gattttatcg ctaagccgtt cagtatcaga gagtttctag 12480

cacgcattcg ggttgccttg cgcgtgcgcc ccaacgttgt ccgctccaaa gaccgacggt 12540

ctttttgttt tactgactgg acacttaatc tcaggcaacg tcgcttgatg tccgaagctg 12600

gcggtgaggt gaaacttacg gcaggtgagt tcaatcttct cctcgcgttt ttagagaaac 12660

cccgcgacgt tctatcgcgc gagcaacttc tcattgccag tcgagtacgc gacgaggagg 12720

tttatgacag gagtatagat gttctcattt tgaggctgcg ccgcaaactt gaggcagatc 12780

cgtcaagccc tcaactgata aaaacagcaa gaggtgccgg ttatttcttt gacgcggacg 12840

tgcaggtttc gcacgggggg acgatggcag cctgagccaa ttcccagatc cccgaggaat 12900

cggcgtgagc ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga 12960

cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc 13020

acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc 13080

gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt 13140

tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc 13200

cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc 13260

agacgggcac gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga 13320

cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa 13380

gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg 13440

gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac 13500

cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc 13560

cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga 13620

gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc 13680

ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct 13740

ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat 13800

ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct 13860

gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc 13920

gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg 13980 98

tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt 14040

tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta 14100

cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa 14160

agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac 14220

ccgcctggcc tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc 14280

tacccttcgg tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc 14340

tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc 14400

gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc 14460

ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag 14520

agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc 14580

tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca 14640

acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc 14700

aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga 14760

ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg 14820

cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca 14880

atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga 14940

gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agctctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 15000

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 15060

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 15120

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 15180

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 15240

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 15300

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 15360

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 15420

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 15480

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 15540

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 15600

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 15660

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 15720

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 15780

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 15840

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 15900 99

gatccttttg atccggaatt a 15921

<210> 35

<211> 17954

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24039

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (315)..(1729)

<223> prZmGRMZM2G020852-01

<220>

<221> ген

<222> (1731)..(5979)

<223> cCas9-13

<220>

<221> Терминатор

<222> (5989)..(8769)

<223> tZmGRMZM2G020852-01

<220>

<221> промотор

<222> (8783)..(9157)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (9159)..(9178)

<223> xZmVLHP2

<220>

<221> другой_признак

<222> (9159)..(9263)

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (9179)..(9190)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (9195)..(9263)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (9274)..(11265)

<223> prUbi1-04 100

<220>

<221> ген

<222> (11282)..(12460)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (12483)..(12735)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (12779)..(12908)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (13188)..(13976)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (14071)..(14201)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (14276)..(14908)

<223> cVirG-09

<220>

<221> ген

<222> (14938)..(16011)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (16054)..(16458)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (17136)..(17942)

<223> oCOLE-o6

<400> 35

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccggaccg ttataacagt gaatacaaaa atgacattcg tgttatttag cacaagttac 360

gatctatttc aggaacatgc cggaattttc gaacaccatt ctcacaaaac atgaccttga 420

acttgcgatc cagttgtttt aaaattatat aaaacaaaaa caaagtcaga aaatcatgaa 480

acttgtcgac atgtcatgat atcatatgta gagactctaa taaaaagttg agattgtttc 540 101

atgaaagttg tcacacacta tgtgtagaaa cttagcccgt ctacattgaa gttctatgat 600

ttcatgtgaa ggacacctag gcatcgatgt ttatgataat atcttatgtt tgtttggaca 660

aaatattaaa aacaaataaa aggggtccct gatcactttg acgagcattg cattcagcaa 720

agggtgcctt tgttgagtgc aatggtcata gaactcggta gaaaagacat acataaacat 780

cgggaaactt gctttaccgc acgctatggc caagacactc ggcaaactag gctcctttgt 840

tgagtgccat ctcaagcact cgacattgga actacgacta ggcctcacgg aagctttctt 900

tgccgagtgc cactaagcga ggaactcgga cactcagcaa cagctctgtc atcgtcacga 960

tgtcttttct ttgtcgtgta ccagttggca ctcggttaag actttactga gtgcccgata 1020

gaaagtactc ggcaaagaga ccgttgccga cgtttggttc actgagggct ctttgctgcc 1080

ttttggactt gacaaagaag tcatctccag tactgtctcc taggacgcag gatttatgtt 1140

ttttcccgga gctcgatctg tgggacatca cagatggtcc aatctggtga tctaaaatgg 1200

acggtttgcc aagcccacag agaagtcttt aagatcttcc acgatgcacg catgctttaa 1260

ggttagatag tgtttggtcc aaaaaagcgt caacaatcag gaaattagaa ctaaaattat 1320

taaaggacag atcaaaaggc atgcatgttc ttcttctata gtgtgtgttg agcctgagtt 1380

ttgattttag gctttattag gggactcgca gtctagctaa ggagttgtat tgatgttctg 1440

acaaatatta tgttcgatcg tcacagtggt cttgtgcgga tcgattaggc ccgatcatgg 1500

tgaaataaac taaccaccgg taagcccggg cagccctaga gcatgcagcg gcctacgtga 1560

agcccgcgtg tcgcatcgtc gtccgtcaga cgctaacggc aggccgctgc atgcgttgcc 1620

ggcgaactct ctcctgagcc actcgtcatc catataagta gacatcccat cactgtcgtc 1680

tatcaacaac acacagagcg acatttcgaa taacacagtt gagcgcgacc atggacaaga 1740

agtacagcat cggcctggac atcggcacca acagcgtggg ctgggccgtg atcaccgacg 1800

agtacaaggt acgagcggga tacatgttta tactcctcct gtaggtcgct ccttcatgta 1860

atgtgttgcg attaaaacgg tgcgcaggtg ccgagcaaga agttcaaggt gctgggcaac 1920

accgacaggc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc tgctgttcga cagcggcgag 1980

accgccgagg ccaccaggct gaagaggacc gccaggagga ggtacaccag gaggaagaac 2040

aggatctgct acctgcagga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc 2100

ttccacaggc tggaggagag cttcctggtg gaggaggaca agaagcacga gaggcacccg 2160

atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtacccgac catctaccac 2220

ctgaggaaga agctggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgaggctgat ctacctggcc 2280

ctggcccaca tgatcaagtt caggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaacccggac 2340

aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag 2400 102

gagaacccga tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgagcgc caggctgagc 2460

aagagcagga ggctggagaa cctgatcgcc cagctgccgg gcgagaagaa gaacggcctg 2520

ttcggcaacc tgatcgccct gagcctgggc ctgaccccga acttcaagag caacttcgac 2580

ctggccgagg acgccaagct gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac 2640

ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgttcc tggccgccaa gaacctgagc 2700

gacgccatcc tgctgagcga catcctgagg gtgaacaccg agatcaccaa ggccccgctg 2760

agcgccagca tgatcaagag gtacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaggcc 2820

ctggtgaggc agcagctgcc ggagaagtac aaggagatct tcttcgacca gagcaagaac 2880

ggctacgccg gctacatcga cggcggcgcc agccaggagg agttctacaa gttcatcaag 2940

ccgatcctgg agaagatgga cggcaccgag gagctgctgg tgaagctgaa cagggaggac 3000

ctgctgagga agcagaggac cttcgacaac ggcagcatcc cgcaccagat ccacctgggc 3060

gagctgcacg ccatcctgag gaggcaggag gacttctacc cgttcctgaa ggacaacagg 3120

gagaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccgtact acgtgggccc gctggccagg 3180

ggcaacagca ggttcgcctg gatgaccagg aagagcgagg agaccatcac cccgtggaac 3240

ttcgaggagg tggtggacaa gggcgccagc gcccagagct tcatcgagag gatgaccaac 3300

ttcgacaaga acctgccgaa cgagaaggtg ctgccgaagc acagcctgct gtacgagtac 3360

ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg aagtacgtga ccgagggcat gaggaagccg 3420

gccttcctga gcggcgagca gaagaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaacagg 3480

aaggtgaccg tgaagcagct gaaggaggac tacttcaaga agatcgagtg cttcgacagc 3540

gtggagatca gcggcgtgga ggacaggttc aacgccagcc tgggcaccta ccacgacctg 3600

ctgaagatca tcaaggacaa ggacttcctg gacaacgagg agaacgagga catcctggag 3660

gacatcgtgc tgaccctgac cctgttcgag gacagggaga tgatcgagga gaggctgaag 3720

acctacgccc acctgttcga cgacaaggtg atgaagcagc tgaagaggag gaggtacacc 3780

ggctggggca ggctgagcag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca gagcggcaag 3840

accatcctgg acttcctgaa gagcgacggc ttcgccaaca ggaacttcat gcagctgatc 3900

cacgacgaca gcctgacctt caaggaggac atccagaagg cccaggtgag cggccagggc 3960

gacagcctgc acgagcacat cgccaacctg gccggcagcc cggccatcaa gaagggcatc 4020

ctgcagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtga tgggcaggca caagccggag 4080

aacatcgtga tcgagatggc cagggagaac cagaccaccc agaagggcca gaagaacagc 4140

agggagagga tgaagaggat cgaggagggc atcaaggagc tgggcagcca gatcctgaag 4200

gagcacccgg tggagaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag 4260

aacggcaggg acatgtacgt ggaccaggag ctggacatca acaggctgag cgactacgac 4320 103

gtggaccaca tcgtgccgca gagcttcctg aaggacgaca gcatcgacaa caaggtgctg 4380

accaggagcg acaagaacag gggcaagagc gacaacgtgc cgagcgagga ggtggtgaag 4440

aagatgaaaa actactggag gcagctgctg aacgccaagc tgatcaccca gaggaagttc 4500

gacaacctga ccaaggccga gaggggcggc ctgagcgagc tggacaaggc cggcttcatt 4560

aaaaggcagc tggtggagac caggcagatc accaagcacg tggcccagat cctggacagc 4620

aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctgatca gggaggtgaa ggtgatcacc 4680

ctgaagagca agctggtgag cgacttcagg aaggacttcc agttctacaa ggtgagggag 4740

atcaataatt accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtggtggg caccgccctg 4800

attaaaaagt acccgaagct ggagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac 4860

gtgaggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gagatcggca aggccaccgc caagtacttc 4920

ttctacagca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctggccaa cggcgagatc 4980

aggaagaggc cgctgatcga gaccaacggc gagaccggcg agatcgtgtg ggacaagggc 5040

agggacttcg ccaccgtgag gaaggtgctg tccatgccgc aggtgaacat cgtgaagaag 5100

accgaggtgc agaccggcgg cttcagcaag gagagcatcc tgccgaagag gaacagcgac 5160

aagctgatcg ccaggaagaa ggactgggac ccgaagaagt acggcggctt cgacagcccg 5220

accgtggcct acagcgtgct ggtggtggcc aaggtggaga agggcaagag caagaagctg 5280

aagagcgtga aggagctggt gggcatcacc atcatggaga ggagcagctt cgagaagaac 5340

ccagtggact tcctggaggc caagggctac aaggaggtga agaaggacct gatcattaaa 5400

ctgccgaagt acagcctgtt cgagctggag aacggcagga agaggatgct ggccagcgcc 5460

ggcgagctgc agaagggcaa cgagctggcc ctgccgagca agtacgtgaa cttcctgtac 5520

ctggccagcc actacgagaa gctgaagggc agcccggagg acaacgagca gaagcagctg 5580

ttcgtggagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttcagc 5640

aagagggtga tcctggccga cgccaacctg gacaaggtgc tgagcgccta caacaagcac 5700

agggacaagc cgatcaggga gcaggccgag aacatcatcc acctgttcac cctgaccaac 5760

ctgggcgccc cggccgcctt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa gaggtacacc 5820

agcaccaagg aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag 5880

accaggatcg acctgagcca gctgggcggc gacagcagcc cgccgaagaa gaagaggaag 5940

gtgagctgga aggacgccag cggctggagc aggatgtgag ctcaattaac tttgaattcc 6000

cttcgattca tccggcgcgg tgggctatgg acctgcagca gcaagctaat taagtttata 6060

tatattgcat gagagagcat gcaccgctaa ccatatatac tactgagact tctgaattct 6120

agtatatgta atccttttgt ttgggtttag gaggcaattc taatcatgta tgccgaattc 6180 104

caaagagtgg aaaacaagca aaatgttaaa tatacatgcc attttcggag gcaatttttt 6240

tcatgagggc atgttgctat aattccgggg accttggact tcttggagca ccttcctgtg 6300

acttaggcat acatgattag attataatcc aattagttaa gtcatagaaa attacctcat 6360

tctcatctcc atctccattt ctctatttct tctcaatcaa ggaccaaaat agcacttttg 6420

ctaaaaaaca agttagattg caaaccaaag tgcacaatac atagtaaaag gtatatgcaa 6480

catatttgaa tactcaaacc tctcatactt acattttcca tcattttgtt ccatttagcc 6540

tgtttgagct cggggttgga ctccaaaacc tcatgtcaac ataacttgat ccttttagca 6600

aactatgagc tctaacacca tacaatggtc aacaagaact attccaaaca taggaatgac 6660

ccaaactaca agtcaaagta tacttagctc tttgggcact tacaggttct aactttgata 6720

attctgtact tcttgtgacc atgactctgc tcgagctagg atcttgagcc ttatgactta 6780

aacaattaaa ccacaaacat tacctcaatg gttgtaagcc acgtccatat atcacagact 6840

tcaatgcatt cagactattc acagcttgac caaccttgac ctcttgcaag aacctcttct 6900

tctttgtgac cttaggtact ttagtcttct tgaccttctc ccttgctctt cataccttga 6960

agtccttctt gccttcacct tagttcaatc agctatctcc aagtcatgca cattgagttc 7020

cacttagtca atgtccatcc ttcaacttga cttgtgatgt ccacaattca tagtcatctc 7080

agtctatggg tccatcatgc ttgactccat gtgatgaacc ttgtaaggtt ttcactaagt 7140

acatgctcag acctttaatt gtgttgccat ccaaaaaaac caaaacctag attggaccat 7200

tcattatatt catcaatcat tgtacttgca agagtgatca aggtcatatt atttctctca 7260

actactccat tttgttgagg ggtgtcagtt gtggagactt cttgtttgat cccaacctca 7320

tcacaatact catgaatata gttgttgtca aattcatttc cattgtcact tcttattttt 7380

cttgattttg caatcaaact cattttgtac tttcatggta aatttattca atgttgatgc 7440

aacttttgac ttttcttgaa gaaagaacac tcaattacat ctagagaaat catcaacaac 7500

gaccaaacaa tacaggtttc ccccaacact agcatattat gtaggaccaa ataaatccat 7560

gtgaagtaac tctagtggtc ttggtgttga cataaaagcg tttgtaggat gtgtattggc 7620

aacttgtttt ccagcttgac atgcactata aaagattttc ctttttcaaa cacaacatct 7680

ttcaaatctc taaccatttc tttctttgga agcttcttgt tggggaaatg atccccggac 7740

cctaggaccc accggtcaga gagcgcgagg aagagccccc ggtcgctggg acccgttggt 7800

ccgctggaaa atgtggttac gtcaaccctg aaagaacccg cccctggttg agccccgtgg 7860

caccgagcct agggtcgagc gcggtggaat ctgacaggag gggccagaca tgttggaggg 7920

gaaccactca agtggatccc gcgcctggcc ccagaatgac ccgtcattaa tacccaacca 7980

cattaaccat gcctggcacc gagccatagc acggacgtcg gtccacttcc cactcatgac 8040

ctacgaacca gttgggctgc atagcactca tgaccgatag gttgaaggct tggcttcgca 8100 105

gagtgaaagg cgctgcatac atgtgaaggc tcgacttctt tttcttttcc tttcttttct 8160

tttctatttt taggtttcca atttaaattc caattttttt gtggagttca tatttggatc 8220

aaatagacaa attcacctat cagtatgaat agatgcattt attttgttta tatctatttt 8280

cttcatattt atatagtatt tcccttattc tttatatcat tttcaatttg taattggtaa 8340

gtttggtctt aaattcccca tttgggcact aatatatttt tattaatatt attattatta 8400

ttattattat tatttataga tgcacaaaca cataaactcc gacatgatgc atagattatt 8460

ttagatgtca ctagttaatg gttcacttta aatatggtta ttcccatgtt ctaatgagta 8520

gagggcaaag catatattga ggtcaactct ttccttatta tttacaaatt ggggaaattc 8580

tattcataac tcttcttctc tctcccaagt agcttaatct tcaccatggt gatttcattg 8640

cactttgcac attttgatca ctttattcct tgtaacccga gtcaaagtgt caatgatctt 8700

gataggatac tccgtgcagg ttagatcacc ttgcacactg agttcttcca ttggtaactg 8760

ttcctctggc ggaccgttcg aagggatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct 8820

tctgaagcaa cttaaagtta tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc 8880

agggaccata gcacaggaca ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg 8940

ggaacactgg gtacgttgga aaccacgtga tgtggagtaa gataaactgt aggagaaaag 9000

catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt 9060

acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca 9120

aagctggttt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcagc tggagctgag cttccggggt 9180

tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 9240

caccgagtcg gtgctttttt tttcggaccg cgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 9300

ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 9360

tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 9420

ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9480

tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 9540

ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 9600

acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 9660

aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 9720

ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 9780

aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 9840

agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 9900

ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 9960 106

ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 10020

ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 10080

gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 10140

ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 10200

cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac 10260

gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg 10320

ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat 10380

ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta 10440

acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga 10500

tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt 10560

tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt 10620

tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac 10680

tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac 10740

gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt 10800

ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt 10860

gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat 10920

ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg 10980

gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata 11040

catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 11100

taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 11160

cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 11220

ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggatc cggcagcagc 11280

catgcagaag ctgatcaaca gcgtgcagaa ctacgcctgg ggcagcaaga ccgccctgac 11340

cgagctgtac ggcatggaga accccagcag ccagcccatg gccgagctgt ggatgggcgc 11400

ccaccccaag agcagcagcc gcgtgcagaa cgccgccggc gacatcgtga gcctgcgcga 11460

cgtgatcgag agcgacaaga gcaccctgct gggcgaggcc gtggccaagc gcttcggcga 11520

gctgcccttc ctgttcaagg tgctgtgcgc cgcccagccc ctgagcatcc aggtgcaccc 11580

caacaagcac aacagcgaga tcggcttcgc caaggagaac gccgccggca tccccatgga 11640

cgccgccgag cgcaactaca aggaccccaa ccacaagccc gagctggtgt tcgccctgac 11700

ccccttcctg gccatgaacg ccttccgcga gttcagcgag atcgtgagcc tgctgcagcc 11760

cgtggccggc gcccaccccg ccatcgccca cttcctgcag cagcccgacg ccgagcgcct 11820

gagcgagctg ttcgccagcc tgctgaacat gcagggcgag gagaagagcc gcgccctggc 11880 107

catcctgaag agcgccctgg acagccagca gggcgagccc tggcagacca tccgcctgat 11940

cagcgagttc taccccgagg acagcggcct gttcagcccc ctgctgctga acgtggtgaa 12000

gctgaacccc ggcgaggcca tgttcctgtt cgccgagacc ccccacgcct acctgcaggg 12060

cgtggccctg gaggtgatgg ccaacagcga caacgtgctg cgcgccggcc tgacccccaa 12120

gtacatcgac atccccgagc tggtggccaa cgtgaagttc gaggccaagc ccgccaacca 12180

gctgctgacc cagcccgtga agcagggcgc cgagctggac ttccccatcc ccgtggacga 12240

cttcgccttc agcctgcacg acctgagcga caaggagacc accatcagcc agcagagcgc 12300

cgccatcctg ttctgcgtgg agggcgacgc caccctgtgg aagggcagcc agcagctgca 12360

gctgaagccc ggcgagagcg ccttcatcgc cgccaacgag agccccgtga ccgtgaaggg 12420

ccacggccgc ctggcccgcg tgtacaacaa gctgtgatag gagctcgatc cgtcgacctg 12480

cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 12540

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 12600

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 12660

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 12720

ctatgttact agatcggcgc gccgcaattg aagtttgggc ggccagcatg gccgtatccg 12780

caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc 12840

agccagccaa cagctccccg accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag 12900

cccatcagaa ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc 12960

ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc 13020

ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca 13080

taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata 13140

atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt 13200

tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg 13260

aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac 13320

acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag 13380

ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg 13440

ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc 13500

gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag 13560

ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct 13620

tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg 13680

cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa 13740 108

atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga 13800

aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac 13860

ttgaagctag gcaggcttat cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt 13920

tggaagaatt tgttcactac gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct 13980

ctagtggatc tccgtacccg gggatctggc tcgcggcgga cgcacgacgc cggggcgaga 14040

ccataggcga tctcctaaat caatagtagc tgtaacctcg aagcgtttca cttgtaacaa 14100

cgattgagaa tttttgtcat aaaattgaaa tacttggttc gcatttttgt catccgcggt 14160

cagccgcaat tctgacgaac tgcccattta gctggagatg attgtacatc cttcacgtga 14220

aaatttctca agcgctgtga acaagggttc agattttaga ttgaaaggtg agccgttgaa 14280

acacgttctt cttgtcgatg acgacgtcgc tatgcggcat cttattattg aataccttac 14340

gatccacgcc ttcaaagtga ccgcggtagc cgacagcacc cagttcacaa gagtactctc 14400

ttccgcgacg gtcgatgtcg tggttgttga tctagattta ggtcgtgaag atgggctcga 14460

gctaggagca agtgatttta tcgctaagcc gttcagtatc agagagtttc tagcacgcat 14520

tcgggttgcc ttgcgcgtgc gccccaacgt tgtccgctcc aaagaccgac ggtctttttg 14580

ttttactgac tggacactta atctcaggca acgtcgcttg atgtccgaag ctggcggtga 14640

ggtgaaactt acggcaggtg agttcaatct tctcctcgcg tttttagaga aaccccgcga 14700

cgttctatcg cgcgagcaac ttctcattgc cagtcgagta cgcgacgagg aggtttatga 14760

caggagtata gatgttctca ttttgaggct gcgccgcaaa cttgaggcag atccgtcaag 14820

ccctcaactg ataaaaacag caagaggtgc cggttatttc tttgacgcgg acgtgcaggt 14880

ttcgcacggg gggacgatgg cagcctgagc caattcccag atccccgagg aatcggcgtg 14940

agcggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 15000

gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 15060

ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 15120

gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 15180

ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 15240

cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 15300

cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 15360

ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 15420

aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 15480

gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 15540

gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 15600

gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 15660 109

gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 15720

ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 15780

ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 15840

cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 15900

tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 15960

gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 16020

cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 16080

gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 16140

aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 16200

aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 16260

gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 16320

cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 16380

tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 16440

ccactcgacc gccggcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 16500

gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 16560

ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 16620

tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 16680

cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg 16740

attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa 16800

taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc 16860

ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac 16920

ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga 16980

ctgaatccgg tgagaatggc aaaagctctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 17040

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 17100

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 17160

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 17220

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 17280

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 17340

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 17400

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 17460

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 17520 110

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 17580

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 17640

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 17700

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 17760

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 17820

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 17880

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 17940

ttgatccgga atta 17954

<210> 36

<211> 17045

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24079

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<220>

<221> промотор

<222> (312)..(2356)

<223> prGRMZM2G146551-01

<220>

<221> ген

<222> (2358)..(6527)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5847)..(5849)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5892)..(5894)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6542)..(7860)

<223> tGRMZM2G146551-01

<220>

<221> промотор

<222> (7874)..(8248)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (8249)..(8354) 111

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (8250)..(8269)

<223> мишень ZmVLHP2

<220>

<221> другой_признак

<222> (8270)..(8281)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (8286)..(8354)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (8365)..(10356)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (10373)..(11551)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (11574)..(11826)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (11870)..(11999)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (12279)..(13067)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (13162)..(13292)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (13367)..(13999)

<223> cVirG-09

<220>

<221> ген

<222> (14029)..(15102)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (15145)..(15549)

<223> oVS1-02

<220> 112

<221> другой_признак

<222> (16227)..(17033)

<223> oCOLE-06

<400> 36

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

taccgggacc catgtagtat cacatgagtg agtcaaggac taagtattat gcattttgtt 360

tctcactcac ggattagctc gcaatcatca tagtgaaatc tagctactgg cactatcgaa 420

atctagctct ttgccgagtg cactttatcg agcactcgac aaagcattct ttatcgagtg 480

ccagtcttgg cgaaataaga ctctcgacaa agaccttgtt taccgaggga gaaacactcg 540

gcgtaaaaag acactcggca aagaagactt tgctgagtgt caaaccctca gcgaaatgcg 600

accctcggca aaggaccgtc agcagccatc tatagttgat ggctattaac ttcgcgagtg 660

tcaggcgttg acacacgaca aaatatcttt tttgtcgagt gtcactgggc aaacacttgg 720

taaacctatg ttttgccgag tgtctttcct tgacactcga caaagtatat ttgttttttc 780

tttttcccca aactttttgt ggtgtgtttc tacaatatat agacctattt gttcaatttt 840

ggcacaatta taaaagtgtt tgctataact atcagattta gtttgcttaa ttggatttct 900

ttggataatt cagatttgaa ctacaagcca cttgaaaaat ggaaaacagt gaatacaaaa 960

atgacattca tgttatttag cacaagttat gatctatttc aggaacatgc gagaattttc 1020

gaacaccatt ctcacaaaac atgattgcgg acttgtgatc aagttgtttt aaaattgtat 1080

aaaacaaaaa caaagtcaga aaatcatgaa acttgttgac atgtcatgat atcatatgta 1140

gagactctaa taaaaatttg agattgtttc atgaaagttg tcacgcgcta tgtgtagaaa 1200

cctagcccgt ctacattgag gttctatgat ttcatgtgaa ggacatctag gcatcaatgt 1260

ttatgataat atcttatgtt tgtttggacg aaatattaaa aacaaataaa aaggggtcct 1320

tgatcacttt gacgagcatt gcactcagca aagggtgcct ttgctgagtg caatggtcat 1380

agaactcggt agaaaaacat acatagacat agggaaactt gctttaccgc gtgctatggc 1440

caagacactc ggcaaactag gctcctttgt cgagttccat cccaagcact cgacattgga 1500

actgcgactg ggcctcacag aagctttctt tgccgagtgc cactaagcga ggaactcgga 1560

tgctcagcaa aggctctgtc atcgtcacga tgtcttttgt ttgtcgtgta ccagttggca 1620

ctcggtaaag actttactga gtgcccgata gaaagtactc gacaaagaga ccgttgccaa 1680

cgtttggttc actgagggct ctttgctgcc ttttggactt gacaaagaag ccgtctccag 1740 113

tagtgtctcc tgggaggcgg gatttatgtt ttttcccgga gctctgtggg acatcatgga 1800

cggtccagtc tggtgatcta aaatagacgg tttgccaagc tcacagagaa gtctttaaga 1860

tcttccacga tgcacgcatg ctttaaggtt agttagtgtt tggtctgaaa aagcgtcaac 1920

aattaggaaa caagaactaa aattattaaa ggacagatca ggaagcatgc atgttcttct 1980

tctatagtgt gtgttgagcc tgagtttggc cttttaggct ttattagggg gctcacagtc 2040

taactaagga gttgtattga tgtgctgaca aatattatgt tcgatcgtca cagtgttctt 2100

atgcggatcg attaggcccg atcatggtga aataaactaa ccaccggtaa gcccgggcag 2160

ccctagagca tgcagcggcc tacgtgaagc ccgcacatcg catcgtcgtc cgtcaggcgc 2220

taacggccgg ccgctgcatg cgtcgccggc gaactctctg ctgagccacc cgtcctccct 2280

ataagtagct atcccagcac cgtcgtctat caaccacaca cagagcggca tttcgaataa 2340

cacaggtgag cgcgaccatg gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaaca 2400

gcgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc gagcaagaag ttcaaggtgc 2460

tgggcaacac cgacaggcac agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca 2520

gcggcgagac cgccgaggcc accaggctga agaggaccgc caggaggagg tacaccagga 2580

ggaagaacag gatctgctac ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg 2640

acagcttctt ccacaggctg gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgaga 2700

ggcacccgat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag tacccgacca 2760

tctaccacct gaggaagaag ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg aggctgatct 2820

acctggccct ggcccacatg atcaagttca ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga 2880

acccggacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc 2940

tgttcgagga gaacccgatc aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgcca 3000

ggctgagcaa gagcaggagg ctggagaacc tgatcgccca gctgccgggc gagaagaaga 3060

acggcctgtt cggcaacctg atcgccctga gcctgggcct gaccccgaac ttcaagagca 3120

acttcgacct ggccgaggac gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc 3180

tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga 3240

acctgagcga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagggt gaacaccgag atcaccaagg 3300

ccccgctgag cgccagcatg atcaagaggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc 3360

tgaaggccct ggtgaggcag cagctgccgg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga 3420

gcaagaacgg ctacgccggc tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt 3480

tcatcaagcc gatcctggag aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaaca 3540

gggaggacct gctgaggaag cagaggacct tcgacaacgg cagcatcccg caccagatcc 3600

acctgggcga gctgcacgcc atcctgagga ggcaggagga cttctacccg ttcctgaagg 3660 114

acaacaggga gaagatcgag aagatcctga ccttccgcat cccgtactac gtgggcccgc 3720

tggccagggg caacagcagg ttcgcctgga tgaccaggaa gagcgaggag accatcaccc 3780

cgtggaactt cgaggaggtg gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagagga 3840

tgaccaactt cgacaagaac ctgccgaacg agaaggtgct gccgaagcac agcctgctgt 3900

acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatga 3960

ggaagccggc cttcctgagc ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga 4020

ccaacaggaa ggtgaccgtg aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct 4080

tcgacagcgt ggagatcagc ggcgtggagg acaggttcaa cgccagcctg ggcacctacc 4140

acgacctgct gaagatcatc aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca 4200

tcctggagga catcgtgctg accctgaccc tgttcgagga cagggagatg atcgaggaga 4260

ggctgaagac ctacgcccac ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagaggagga 4320

ggtacaccgg ctggggcagg ctgagcagga agctgatcaa cggcatcagg gacaagcaga 4380

gcggcaagac catcctggac ttcctgaaga gcgacggctt cgccaacagg aacttcatgc 4440

agctgatcca cgacgacagc ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg 4500

gccagggcga cagcctgcac gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccg gccatcaaga 4560

agggcatcct gcagaccgtg aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggcaggcaca 4620

agccggagaa catcgtgatc gagatggcca gggagaacca gaccacccag aagggccaga 4680

agaacagcag ggagaggatg aagaggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga 4740

tcctgaagga gcacccggtg gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact 4800

acctgcagaa cggcagggac atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac aggctgagcg 4860

actacgacgt ggaccacatc gtgccgcaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca 4920

aggtgctgac caggagcgac aagaacaggg gcaagagcga caacgtgccg agcgaggagg 4980

tggtgaagaa gatgaaaaac tactggaggc agctgctgaa cgccaagctg atcacccaga 5040

ggaagttcga caacctgacc aaggccgaga ggggcggcct gagcgagctg gacaaggccg 5100

gcttcattaa aaggcagctg gtggagacca ggcagatcac caagcacgtg gcccagatcc 5160

tggacagcag gatgaacacc aagtacgacg agaacgacaa gctgatcagg gaggtgaagg 5220

tgatcaccct gaagagcaag ctggtgagcg acttcaggaa ggacttccag ttctacaagg 5280

tgagggagat caataattac caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtggtgggca 5340

ccgccctgat taaaaagtac ccgaagctgg agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg 5400

tgtacgacgt gaggaagatg atcgccaaga gcgagcagga gatcggcaag gccaccgcca 5460

agtacttctt ctacagcaac atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctggccaacg 5520 115

gcgagatcag gaagaggccg ctgatcgaga ccaacggcga gaccggcgag atcgtgtggg 5580

acaagggcag ggacttcgcc accgtgagga aggtgctgtc catgccgcag gtgaacatcg 5640

tgaagaagac cgaggtgcag accggcggct tcagcaagga gagcatcctg ccgaagagga 5700

acagcgacaa gctgatcgcc aggaagaagg actgggaccc gaagaagtac ggcggcttcg 5760

acagcccgac cgtggcctac agcgtgctgg tggtggccaa ggtggagaag ggcaagagca 5820

agaagctgaa gagcgtgaag gagctggtgg gcatcaccat catggagagg agcagcttcg 5880

agaagaaccc agtggacttc ctggaggcca agggctacaa ggaggtgaag aaggacctga 5940

tcattaaact gccgaagtac agcctgttcg agctggagaa cggcaggaag aggatgctgg 6000

ccagcgccgg cgagctgcag aagggcaacg agctggccct gccgagcaag tacgtgaact 6060

tcctgtacct ggccagccac tacgagaagc tgaagggcag cccggaggac aacgagcaga 6120

agcagctgtt cgtggagcag cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg 6180

agttcagcaa gagggtgatc ctggccgacg ccaacctgga caaggtgctg agcgcctaca 6240

acaagcacag ggacaagccg atcagggagc aggccgagaa catcatccac ctgttcaccc 6300

tgaccaacct gggcgccccg gccgccttca agtacttcga caccaccatc gacaggaaga 6360

ggtacaccag caccaaggag gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc 6420

tgtacgagac caggatcgac ctgagccagc tgggcggcga cagcagcccg ccgaagaaga 6480

agaggaaggt gagctggaag gacgccagcg gctggagcag gatgtgacca tggagctcta 6540

aactttgaat tcccttcgat tcatccggca cagcgggcta tggaccttca gcagcaagct 6600

aattaagttg gcagcatgca ccgctaacct tatatactac tgagacttcc aaattctagt 6660

atatgtaatc cttttgttcg ggttcatgat cgaattccaa agagtggaaa acaagcaaaa 6720

ggttaaatat acatgccatt tttggaggca tttttttcat gagggcatgt ttcgatatat 6780

ggaccactaa atatacatat catttacttt cctacaaatt tgctacatcc ttggaaatgc 6840

atagtctgtc tccaagaaaa agatactctg attacatcac tagtacacac agcctctata 6900

gtggcggttc tagagacatt ttcactggcg cttttcagtg ccgccagtgt taggggccag 6960

tggaaatcgc catttccatt caataaccgc cagtggaaaa agcatttcca ctggcggttt 7020

tcttaagcaa ccgccagtgg aaatgtttcc cgtctttttt taaattttcg tactgaaatt 7080

tatatattta cacacacaaa catatatata tatatattga tattgataaa catgtagtat 7140

tgatactaaa agcaacatga aattaaattc tatcatacat ttatatacat caaagtcttg 7200

tttacaacca tgtatgcatc acacattata tacatcaaag ttttcactta agctctaata 7260

actatctcgg ctaagagata gtctactaat ttctgttagt attctaaact ctggcaaagc 7320

taatgttccg gaagcatcgt gatatttccc ttctgcggga atgacctctt tcaatatgaa 7380

tgtgcacagg tcctcaacta tgccatacaa tgcaccttca gtcaagttct ccgggcttcc 7440 116

tttttgaaat tgctgtaaag gaagtttata aacatcatct atttatactc aataataaca 7500

catttgcatc tttaatgaca taaatacata cgtgactatt actaataata ccttgccagg 7560

gttcgtgatg tatcgtccat tcattctcat aaactcgcac acgtagaacc cacataggac 7620

cgatccgggt ggttgcttgt ggcactacat aacgggagat tggttattta gttgcaacat 7680

tgtcctatgt acgtacatgt atgatatgta ttcataaatt cacatactta ctggccagtt 7740

ataatggatg tctagtggca cacctttttt ggacgtgtcg tactttccac catgtagctt 7800

ataaaaccta aatgccctgt gatctcaaat agaatcacca tgttattcta caattctcat 7860

gggacccttc gaagggatct ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca 7920

acttaaagtt atcaggcatg catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat 7980

agcacaggac aggcgtcttc tactggtgct accagcaaat gctggaagcc gggaacactg 8040

ggtacgttgg aaaccacgtg atgtggagta agataaactg taggagaaaa gcatttcgta 8100

gtgggccatg aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg gccggcccat tacgcaattg 8160

gacgacaaca aagactagta ttagtaccac ctcggctatc cacatagatc aaagctggtt 8220

taaaagagtt gtgcagatga tccgtggcag ctggagctga gcttccgggg ttttagagct 8280

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 8340

ggtgcttttt ttttcggacc gcgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta 8400

gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca 8460

cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata 8520

atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt 8580

agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt 8640

tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc 8700

attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt 8760

agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag 8820

tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac 8880

aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa 8940

tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg 9000

tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc 9060

tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc 9120

ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca 9180

gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa 9240

atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 9300 117

acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt 9360

cctccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc 9420

ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc 9480

tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag 9540

tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca 9600

tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat 9660

gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat 9720

gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 9780

gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 9840

atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 9900

catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 9960

ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 10020

ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 10080

atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 10140

atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 10200

atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 10260

gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 10320

cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccggcagcag ccatgcagaa 10380

gctgatcaac agcgtgcaga actacgcctg gggcagcaag accgccctga ccgagctgta 10440

cggcatggag aaccccagca gccagcccat ggccgagctg tggatgggcg cccaccccaa 10500

gagcagcagc cgcgtgcaga acgccgccgg cgacatcgtg agcctgcgcg acgtgatcga 10560

gagcgacaag agcaccctgc tgggcgaggc cgtggccaag cgcttcggcg agctgccctt 10620

cctgttcaag gtgctgtgcg ccgcccagcc cctgagcatc caggtgcacc ccaacaagca 10680

caacagcgag atcggcttcg ccaaggagaa cgccgccggc atccccatgg acgccgccga 10740

gcgcaactac aaggacccca accacaagcc cgagctggtg ttcgccctga cccccttcct 10800

ggccatgaac gccttccgcg agttcagcga gatcgtgagc ctgctgcagc ccgtggccgg 10860

cgcccacccc gccatcgccc acttcctgca gcagcccgac gccgagcgcc tgagcgagct 10920

gttcgccagc ctgctgaaca tgcagggcga ggagaagagc cgcgccctgg ccatcctgaa 10980

gagcgccctg gacagccagc agggcgagcc ctggcagacc atccgcctga tcagcgagtt 11040

ctaccccgag gacagcggcc tgttcagccc cctgctgctg aacgtggtga agctgaaccc 11100

cggcgaggcc atgttcctgt tcgccgagac cccccacgcc tacctgcagg gcgtggccct 11160

ggaggtgatg gccaacagcg acaacgtgct gcgcgccggc ctgaccccca agtacatcga 11220 118

catccccgag ctggtggcca acgtgaagtt cgaggccaag cccgccaacc agctgctgac 11280

ccagcccgtg aagcagggcg ccgagctgga cttccccatc cccgtggacg acttcgcctt 11340

cagcctgcac gacctgagcg acaaggagac caccatcagc cagcagagcg ccgccatcct 11400

gttctgcgtg gagggcgacg ccaccctgtg gaagggcagc cagcagctgc agctgaagcc 11460

cggcgagagc gccttcatcg ccgccaacga gagccccgtg accgtgaagg gccacggccg 11520

cctggcccgc gtgtacaaca agctgtgata ggagctcgat ccgtcgacct gcagatcgtt 11580

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 11640

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 11700

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 11760

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 11820

tagatcggcg cgccgcaatt gaagtttggg cggccagcat ggccgtatcc gcaatgtgtt 11880

attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac cagccagcca 11940

acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca gcccatcaga 12000

attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt 12060

caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt 12120

gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc 12180

tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga 12240

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg ttgatcgccg 12300

aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt 12360

tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata 12420

ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca 12480

acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag 12540

tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc 12600

aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg 12660

acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc 12720

cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg 12780

aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc 12840

ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg 12900

ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta 12960

ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 13020

ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc tctagtggat 13080 119

ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag accataggcg 13140

atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca acgattgaga 13200

atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg tcagccgcaa 13260

ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg aaaatttctc 13320

aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga aacacgttct 13380

tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta cgatccacgc 13440

cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct cttccgcgac 13500

ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg agctaggagc 13560

aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca ttcgggttgc 13620

cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt gttttactga 13680

ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg aggtgaaact 13740

tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg acgttctatc 13800

gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg acaggagtat 13860

agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa gccctcaact 13920

gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg tttcgcacgg 13980

ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt gagcggtcgc 14040

aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg 14100

aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg 14160

tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg 14220

ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc 14280

tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg 14340

aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag 14400

gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg 14460

gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc 14520

cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga 14580

aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg 14640

cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg 14700

attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag 14760

ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt 14820

caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc 14880

cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc 14940

agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac 15000 120

ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc 15060

taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta 15120

gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg 15180

tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag 15240

ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat 15300

ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca 15360

taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg 15420

cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg 15480

gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac 15540

cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc 15600

gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg 15660

gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga 15720

tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc 15780

gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa 15840

actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt 15900

tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg 15960

caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt 16020

tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg 16080

gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 16140

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 16200

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 16260

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 16320

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 16380

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 16440

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 16500

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 16560

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 16620

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 16680

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 16740

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 16800

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 16860 121

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 16920

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 16980

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttgatccgg 17040

aatta 17045

<210> 37

<211> 16776

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24091

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (330)..(2417)

<223> prZmGRMZM2G471240-01

<220>

<221> ген

<222> (2420)..(6589)

<223> cCas9-01

<220>

<221> мутация

<222> (5909)..(5911)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5954)..(5956)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (6596)..(7591)

<223> tZmGRMZM2G471240-01

<220>

<221> промотор

<222> (7605)..(7979)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7981)..(8085)

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (7981)..(8000)

<223> xZmVLHP2 122

<220>

<221> другой_признак

<222> (8001)..(8012)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (8017)..(8085)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (8096)..(10087)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (10104)..(11282)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (11305)..(11557)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (11601)..(11730)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (12010)..(12798)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (12893)..(13023)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (13098)..(13730)

<223> cVirG-09

<220>

<221> ген

<222> (13760)..(14833)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (14876)..(15280)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (15958)..(16764)

<223> oCOLE-06

<400> 37

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60 123

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

tacctcgcga atgcatctag atgggaccct atttgtactc attccatgtc tcataaactt 360

tgggcaccat ccatccaaca catccaatct aaacacacca aacgatgggg aatggaaaga 420

gcagtattcg attcaacaat ggcaaacaaa tatcactgaa ttagaccaag aataaaccta 480

attagacaac gacctcccaa ccatcattcg tcaggctgta aagaagataa agctgccttg 540

gggcatggat caagcagaac accagagatg aatccaaaca cacagaaaat cacgcgcgct 600

gtctacaatg acaacaagcc ccacatttca ttgcagtaca ctgggctaca aaggcacgta 660

caacaaagag ctagggaaac attgcggagg gcacgagaga gcagctaact tgacaatata 720

gcagactgag cttgcactgt tagcaggcga ggaagggaat catggggacg gagaatgggg 780

tccatgcccg cgaaggagaa ggcggacgcc gccacggtgg caccggcgca cgcgcacaca 840

gggaacccgc acaggcagcc aaggatgctg cctcgccatt gcgccggtcg tctctgccac 900

gctcctctct ctctcccgct gcatcgccgt ggatggggca agcagagagc agggactgcg 960

acgatctggg cggaggactc gccttggaga gcgcggacgc agacgggatt ctagggagag 1020

agcgaagacg gggcgcgcgc ggcgctcgcg cggcgtggtg gcggcgagat tagcgggggt 1080

ggggggaggg cggagccgtg gtgagggtgt ggacgccctc cttaccctct taagtagtag 1140

tagagatata atccgttcca aaatatccat ccgttcaatt tatatttcgt ttgatctttt 1200

taccctaaat ttgattgact catcttatta aaaaagttca taactattat taatctttat 1260

tgagatatca tttagcatat aatatacttt aagtgtggtt ttagattttt tttaaaaaaa 1320

aaaattcgca aaaattaaat gaaacgaccc aatcaaactt gaaaagtaaa actaattata 1380

aatttgaacg gaaggagtaa gaggatgttt gaatgtacta gagctaatag ttggttgctt 1440

taaaatttgc tagtagaatt agctagctaa taaatatcta gataactatt agctaatttg 1500

ctaaaacagc taatagttga actattagct agattgtttg gatgtattcg gctaatttta 1560

atggctaact attagctata gtacaatatt caaacacctc ctaattaaaa tggacaaata 1620

tctcttcttt tggtcccttg cgttagattt ttcatatctc cttatttagt ataaaagaat 1680

catcaaaaag tggacaaccc ctagtggaac accattttag tagtggttgc atgaaacctt 1740

tcgcgcacca gtttctatgt gtcactctaa aaatgggaca gcatgtacgt agtgcctata 1800

tatatacaag tcatctatcg ttgcctcctc agttcatcac taatcacact tattgtgccc 1860

tcgacgagta tctatagcta gctcattaat cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca 1920

ttggcgagct actcgtcgcg gcgtccaagc aatacctgta gcacgaaggc gatcgccggg 1980 124

agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 2040

ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 2100

gagctggacg caccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 2160

accggcggtc tcatcaccgc cttgctgacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctag 2220

gctgccaagg acatcaacca cttttacatc cataactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 2280

tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc atccatccag catcgtacgt acgtcctcta 2340

tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga 2400

gcaggcttgc gaaaacccca tggacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa 2460

cagcgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg ccgagcaaga agttcaaggt 2520

gctgggcaac accgacaggc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc tgctgttcga 2580

cagcggcgag accgccgagg ccaccaggct gaagaggacc gccaggagga ggtacaccag 2640

gaggaagaac aggatctgct acctgcagga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga 2700

cgacagcttc ttccacaggc tggaggagag cttcctggtg gaggaggaca agaagcacga 2760

gaggcacccg atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtacccgac 2820

catctaccac ctgaggaaga agctggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgaggctgat 2880

ctacctggcc ctggcccaca tgatcaagtt caggggccac ttcctgatcg agggcgacct 2940

gaacccggac aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca 3000

gctgttcgag gagaacccga tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgagcgc 3060

caggctgagc aagagcagga ggctggagaa cctgatcgcc cagctgccgg gcgagaagaa 3120

gaacggcctg ttcggcaacc tgatcgccct gagcctgggc ctgaccccga acttcaagag 3180

caacttcgac ctggccgagg acgccaagct gcagctgagc aaggacacct acgacgacga 3240

cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgttcc tggccgccaa 3300

gaacctgagc gacgccatcc tgctgagcga catcctgagg gtgaacaccg agatcaccaa 3360

ggccccgctg agcgccagca tgatcaagag gtacgacgag caccaccagg acctgaccct 3420

gctgaaggcc ctggtgaggc agcagctgcc ggagaagtac aaggagatct tcttcgacca 3480

gagcaagaac ggctacgccg gctacatcga cggcggcgcc agccaggagg agttctacaa 3540

gttcatcaag ccgatcctgg agaagatgga cggcaccgag gagctgctgg tgaagctgaa 3600

cagggaggac ctgctgagga agcagaggac cttcgacaac ggcagcatcc cgcaccagat 3660

ccacctgggc gagctgcacg ccatcctgag gaggcaggag gacttctacc cgttcctgaa 3720

ggacaacagg gagaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccgtact acgtgggccc 3780

gctggccagg ggcaacagca ggttcgcctg gatgaccagg aagagcgagg agaccatcac 3840 125

cccgtggaac ttcgaggagg tggtggacaa gggcgccagc gcccagagct tcatcgagag 3900

gatgaccaac ttcgacaaga acctgccgaa cgagaaggtg ctgccgaagc acagcctgct 3960

gtacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gaccaaggtg aagtacgtga ccgagggcat 4020

gaggaagccg gccttcctga gcggcgagca gaagaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa 4080

gaccaacagg aaggtgaccg tgaagcagct gaaggaggac tacttcaaga agatcgagtg 4140

cttcgacagc gtggagatca gcggcgtgga ggacaggttc aacgccagcc tgggcaccta 4200

ccacgacctg ctgaagatca tcaaggacaa ggacttcctg gacaacgagg agaacgagga 4260

catcctggag gacatcgtgc tgaccctgac cctgttcgag gacagggaga tgatcgagga 4320

gaggctgaag acctacgccc acctgttcga cgacaaggtg atgaagcagc tgaagaggag 4380

gaggtacacc ggctggggca ggctgagcag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca 4440

gagcggcaag accatcctgg acttcctgaa gagcgacggc ttcgccaaca ggaacttcat 4500

gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt caaggaggac atccagaagg cccaggtgag 4560

cggccagggc gacagcctgc acgagcacat cgccaacctg gccggcagcc cggccatcaa 4620

gaagggcatc ctgcagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtga tgggcaggca 4680

caagccggag aacatcgtga tcgagatggc cagggagaac cagaccaccc agaagggcca 4740

gaagaacagc agggagagga tgaagaggat cgaggagggc atcaaggagc tgggcagcca 4800

gatcctgaag gagcacccgg tggagaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta 4860

ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt ggaccaggag ctggacatca acaggctgag 4920

cgactacgac gtggaccaca tcgtgccgca gagcttcctg aaggacgaca gcatcgacaa 4980

caaggtgctg accaggagcg acaagaacag gggcaagagc gacaacgtgc cgagcgagga 5040

ggtggtgaag aagatgaaaa actactggag gcagctgctg aacgccaagc tgatcaccca 5100

gaggaagttc gacaacctga ccaaggccga gaggggcggc ctgagcgagc tggacaaggc 5160

cggcttcatt aaaaggcagc tggtggagac caggcagatc accaagcacg tggcccagat 5220

cctggacagc aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac aagctgatca gggaggtgaa 5280

ggtgatcacc ctgaagagca agctggtgag cgacttcagg aaggacttcc agttctacaa 5340

ggtgagggag atcaataatt accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtggtggg 5400

caccgccctg attaaaaagt acccgaagct ggagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa 5460

ggtgtacgac gtgaggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gagatcggca aggccaccgc 5520

caagtacttc ttctacagca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca ccctggccaa 5580

cggcgagatc aggaagaggc cgctgatcga gaccaacggc gagaccggcg agatcgtgtg 5640

ggacaagggc agggacttcg ccaccgtgag gaaggtgctg tccatgccgc aggtgaacat 5700

cgtgaagaag accgaggtgc agaccggcgg cttcagcaag gagagcatcc tgccgaagag 5760 126

gaacagcgac aagctgatcg ccaggaagaa ggactgggac ccgaagaagt acggcggctt 5820

cgacagcccg accgtggcct acagcgtgct ggtggtggcc aaggtggaga agggcaagag 5880

caagaagctg aagagcgtga aggagctggt gggcatcacc atcatggaga ggagcagctt 5940

cgagaagaac ccagtggact tcctggaggc caagggctac aaggaggtga agaaggacct 6000

gatcattaaa ctgccgaagt acagcctgtt cgagctggag aacggcagga agaggatgct 6060

ggccagcgcc ggcgagctgc agaagggcaa cgagctggcc ctgccgagca agtacgtgaa 6120

cttcctgtac ctggccagcc actacgagaa gctgaagggc agcccggagg acaacgagca 6180

gaagcagctg ttcgtggagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag 6240

cgagttcagc aagagggtga tcctggccga cgccaacctg gacaaggtgc tgagcgccta 6300

caacaagcac agggacaagc cgatcaggga gcaggccgag aacatcatcc acctgttcac 6360

cctgaccaac ctgggcgccc cggccgcctt caagtacttc gacaccacca tcgacaggaa 6420

gaggtacacc agcaccaagg aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg 6480

cctgtacgag accaggatcg acctgagcca gctgggcggc gacagcagcc cgccgaagaa 6540

gaagaggaag gtgagctgga aggacgccag cggctggagc aggatgtgac catgggacaa 6600

gtggctttac tgtcagtcac atgcttgtaa ataagtagac tttattttaa taaaacataa 6660

aaatatatat atgttcttga atataaaatt gataaccaaa ttaaaattcg aaccatcact 6720

tatacataat tttactttat tttttataaa acgtgaacgg gaaggactac cgtgaatgac 6780

tatagaacca atcatactag tataaaatat atgatgacac tacgggagag acaaactttg 6840

tctggcgcta aatattttgc cgagtgtgaa ttcacgggca ctaggcaaag atcttctttg 6900

ccgagtgtta cgctgggcaa agtaagacac taggtaaatc agtcatttgc cgagtgtccg 6960

ccactaggca aagcaaaaca ctggcaaatc aaaagtttac ctagtgccag acactaggca 7020

aaaaaaaaac gctcggcaaa tcggaagttt ccctagtgcc agacactaga caaagaaaaa 7080

cacttgataa actagcgtcg tcagctaaca ccatccacca accgttaacg ttgccgagta 7140

tctgacttcg acactcggca aagaaggtct ctttgcctag tgtcggtctg gaacactagg 7200

caaagaggca ctttacctag tgtcgtattt tgacactcag taaaataatt ttttttcttt 7260

ctgcttccaa actttttatg atgtgttcct atagcaccta gaactacatg tcaagttttg 7320

gtaaaatttt tgaagttttt gctatattta cttaatttat tttatttaat tgaatttctt 7380

ttgataattc aaatttgaac tcggcaaggt aagaagcgag ggtagcctgg aaacacactt 7440

tgcctagtgt tacactcggt acaggagcct cccctgccta gtgctgcact cgacaaaaga 7500

ttcgcctttg cctagcgctg cactcggcac aggagtcgcc tttgcctagt gctgcactag 7560

gcaaagcctc cgttaccgtg ccttccatcg tcggaccctt cgaagggatc tttaaacata 7620 127

cgaacagatc acttaaagtt cttctgaagc aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct 7680

tggaggaatc agatgtgcag tcagggacca tagcacagga caggcgtctt ctactggtgc 7740

taccagcaaa tgctggaagc cgggaacact gggtacgttg gaaaccacgt gatgtggagt 7800

aagataaact gtaggagaaa agcatttcgt agtgggccat gaagcctttc aggacatgta 7860

ttgcagtatg ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac aaagactagt attagtacca 7920

cctcggctat ccacatagat caaagctggt ttaaaagagt tgtgcagatg atccgtggca 7980

gctggagctg agcttccggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 8040

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttcggac cgcgcctgca 8100

gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 8160

taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 8220

atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 8280

gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 8340

ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 8400

caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 8460

gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 8520

ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 8580

tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 8640

aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 8700

ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 8760

cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 8820

ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 8880

gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 8940

ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 9000

caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt 9060

cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc cccccctctc taccttctct 9120

agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt 9180

tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac 9240

gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc 9300

tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt 9360

tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt 9420

tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc 9480

ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 9540 128

tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata 9600

ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg 9660

gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac 9720

tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct 9780

tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 9840

gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac 9900

cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat 9960

acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg 10020

ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact 10080

tctgcaggga tccggcagca gccatgcaga agctgatcaa cagcgtgcag aactacgcct 10140

ggggcagcaa gaccgccctg accgagctgt acggcatgga gaaccccagc agccagccca 10200

tggccgagct gtggatgggc gcccacccca agagcagcag ccgcgtgcag aacgccgccg 10260

gcgacatcgt gagcctgcgc gacgtgatcg agagcgacaa gagcaccctg ctgggcgagg 10320

ccgtggccaa gcgcttcggc gagctgccct tcctgttcaa ggtgctgtgc gccgcccagc 10380

ccctgagcat ccaggtgcac cccaacaagc acaacagcga gatcggcttc gccaaggaga 10440

acgccgccgg catccccatg gacgccgccg agcgcaacta caaggacccc aaccacaagc 10500

ccgagctggt gttcgccctg acccccttcc tggccatgaa cgccttccgc gagttcagcg 10560

agatcgtgag cctgctgcag cccgtggccg gcgcccaccc cgccatcgcc cacttcctgc 10620

agcagcccga cgccgagcgc ctgagcgagc tgttcgccag cctgctgaac atgcagggcg 10680

aggagaagag ccgcgccctg gccatcctga agagcgccct ggacagccag cagggcgagc 10740

cctggcagac catccgcctg atcagcgagt tctaccccga ggacagcggc ctgttcagcc 10800

ccctgctgct gaacgtggtg aagctgaacc ccggcgaggc catgttcctg ttcgccgaga 10860

ccccccacgc ctacctgcag ggcgtggccc tggaggtgat ggccaacagc gacaacgtgc 10920

tgcgcgccgg cctgaccccc aagtacatcg acatccccga gctggtggcc aacgtgaagt 10980

tcgaggccaa gcccgccaac cagctgctga cccagcccgt gaagcagggc gccgagctgg 11040

acttccccat ccccgtggac gacttcgcct tcagcctgca cgacctgagc gacaaggaga 11100

ccaccatcag ccagcagagc gccgccatcc tgttctgcgt ggagggcgac gccaccctgt 11160

ggaagggcag ccagcagctg cagctgaagc ccggcgagag cgccttcatc gccgccaacg 11220

agagccccgt gaccgtgaag ggccacggcc gcctggcccg cgtgtacaac aagctgtgat 11280

aggagctcga tccgtcgacc tgcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga 11340

ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag 11400 129

catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga 11460

gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat 11520

aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggc gcgccgcaat tgaagtttgg 11580

gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 11640

caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa 11700

aatcaccact cgatacaggc agcccatcag aattaattct catgtttgac agcttatcat 11760

cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 11820

tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 11880

aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac 11940

aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 12000

aaacagacca tgagggaagc gttgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt 12060

ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca 12120

gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg 12180

cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct 12240

ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt 12300

ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt 12360

cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa 12420

gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt 12480

cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc 12540

gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca 12600

gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg 12660

gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca agaagatcgc 12720

ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact acgtgaaagg cgagatcacc 12780

aaagtagtcg gcaaataaag ctctagtgga tctccgtacc cggggatctg gctcgcggcg 12840

gacgcacgac gccggggcga gaccataggc gatctcctaa atcaatagta gctgtaacct 12900

cgaagcgttt cacttgtaac aacgattgag aatttttgtc ataaaattga aatacttggt 12960

tcgcattttt gtcatccgcg gtcagccgca attctgacga actgcccatt tagctggaga 13020

tgattgtaca tccttcacgt gaaaatttct caagcgctgt gaacaagggt tcagatttta 13080

gattgaaagg tgagccgttg aaacacgttc ttcttgtcga tgacgacgtc gctatgcggc 13140

atcttattat tgaatacctt acgatccacg ccttcaaagt gaccgcggta gccgacagca 13200

cccagttcac aagagtactc tcttccgcga cggtcgatgt cgtggttgtt gatctagatt 13260

taggtcgtga agatgggctc gagctaggag caagtgattt tatcgctaag ccgttcagta 13320 130

tcagagagtt tctagcacgc attcgggttg ccttgcgcgt gcgccccaac gttgtccgct 13380

ccaaagaccg acggtctttt tgttttactg actggacact taatctcagg caacgtcgct 13440

tgatgtccga agctggcggt gaggtgaaac ttacggcagg tgagttcaat cttctcctcg 13500

cgtttttaga gaaaccccgc gacgttctat cgcgcgagca acttctcatt gccagtcgag 13560

tacgcgacga ggaggtttat gacaggagta tagatgttct cattttgagg ctgcgccgca 13620

aacttgaggc agatccgtca agccctcaac tgataaaaac agcaagaggt gccggttatt 13680

tctttgacgc ggacgtgcag gtttcgcacg gggggacgat ggcagcctga gccaattccc 13740

agatccccga ggaatcggcg tgagcggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc 13800

ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg 13860

catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa 13920

agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga 13980

cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag 14040

catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat 14100

ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag 14160

tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg 14220

ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt 14280

actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg 14340

cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg 14400

cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga 14460

aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac 14520

agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg 14580

catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg 14640

gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt 14700

caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc 14760

ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc 14820

cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg 14880

tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 14940

gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta 15000

agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat 15060

taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga 15120

gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg 15180 131

gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg 15240

gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 15300

aggtgttgct gactcatacc aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga 15360

gccacggttg atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt 15420

tgccacggaa cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa 15480

agttcgattt attcaacaaa gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt 15540

tacaaccaat taaccaattc tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat 15600

ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga 15660

gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg 15720

actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt 15780

gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctc tgcattaatg 15840

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 15900

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 15960

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 16020

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 16080

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 16140

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 16200

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 16260

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 16320

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 16380

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 16440

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 16500

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 16560

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 16620

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 16680

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 16740

aaggatcttc acctagatcc ttttgatccg gaatta 16776

<210> 38

<211> 17475

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24094 132

<220>

<221> другой_признак

<222> (4)..(259)

<223> bNRB-05

<220>

<221> промотор

<222> (330)..(2417)

<223> prZmGRMZM2G471240-01

<220>

<221> ген

<222> (2420)..(7288)

<223> cAmCyanCas9-01

<220>

<221> Терминатор

<222> (7295)..(8290)

<223> tZmGRMZM2G471240-01

<220>

<221> промотор

<222> (8304)..(8678)

<223> prOsU3-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (8679)..(8784)

<223> rsgRNAZmVLHP-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (8680)..(8699)

<223> мишень ZmVLHP2

<220>

<221> другой_признак

<222> (8700)..(8711)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (8716)..(8784)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (8795)..(10786)

<223> prUbi1-04

<220>

<221> ген

<222> (10803)..(11981)

<223> cPMI-09

<220>

<221> Терминатор

<222> (12004)..(12256)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> другой_признак 133

<222> (12300)..(12429)

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (12709)..(13497)

<223> cSpec-03

<220>

<221> промотор

<222> (13592)..(13722)

<223> prVirG-01

<220>

<221> ген

<222> (13797)..(14429)

<223> cVirG-09

<220>

<221> ген

<222> (14459)..(15532)

<223> cRepA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (15575)..(15979)

<223> oVS1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (16657)..(17463)

<223> oCOLE-06

<400> 38

attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60

taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120

tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180

attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240

aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa caaagcttgg 300

tacctcgcga atgcatctag atgggaccct atttgtactc attccatgtc tcataaactt 360

tgggcaccat ccatccaaca catccaatct aaacacacca aacgatgggg aatggaaaga 420

gcagtattcg attcaacaat ggcaaacaaa tatcactgaa ttagaccaag aataaaccta 480

attagacaac gacctcccaa ccatcattcg tcaggctgta aagaagataa agctgccttg 540

gggcatggat caagcagaac accagagatg aatccaaaca cacagaaaat cacgcgcgct 600

gtctacaatg acaacaagcc ccacatttca ttgcagtaca ctgggctaca aaggcacgta 660

caacaaagag ctagggaaac attgcggagg gcacgagaga gcagctaact tgacaatata 720

gcagactgag cttgcactgt tagcaggcga ggaagggaat catggggacg gagaatgggg 780

tccatgcccg cgaaggagaa ggcggacgcc gccacggtgg caccggcgca cgcgcacaca 840

gggaacccgc acaggcagcc aaggatgctg cctcgccatt gcgccggtcg tctctgccac 900 134

gctcctctct ctctcccgct gcatcgccgt ggatggggca agcagagagc agggactgcg 960

acgatctggg cggaggactc gccttggaga gcgcggacgc agacgggatt ctagggagag 1020

agcgaagacg gggcgcgcgc ggcgctcgcg cggcgtggtg gcggcgagat tagcgggggt 1080

ggggggaggg cggagccgtg gtgagggtgt ggacgccctc cttaccctct taagtagtag 1140

tagagatata atccgttcca aaatatccat ccgttcaatt tatatttcgt ttgatctttt 1200

taccctaaat ttgattgact catcttatta aaaaagttca taactattat taatctttat 1260

tgagatatca tttagcatat aatatacttt aagtgtggtt ttagattttt tttaaaaaaa 1320

aaaattcgca aaaattaaat gaaacgaccc aatcaaactt gaaaagtaaa actaattata 1380

aatttgaacg gaaggagtaa gaggatgttt gaatgtacta gagctaatag ttggttgctt 1440

taaaatttgc tagtagaatt agctagctaa taaatatcta gataactatt agctaatttg 1500

ctaaaacagc taatagttga actattagct agattgtttg gatgtattcg gctaatttta 1560

atggctaact attagctata gtacaatatt caaacacctc ctaattaaaa tggacaaata 1620

tctcttcttt tggtcccttg cgttagattt ttcatatctc cttatttagt ataaaagaat 1680

catcaaaaag tggacaaccc ctagtggaac accattttag tagtggttgc atgaaacctt 1740

tcgcgcacca gtttctatgt gtcactctaa aaatgggaca gcatgtacgt agtgcctata 1800

tatatacaag tcatctatcg ttgcctcctc agttcatcac taatcacact tattgtgccc 1860

tcgacgagta tctatagcta gctcattaat cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca 1920

ttggcgagct actcgtcgcg gcgtccaagc aatacctgta gcacgaaggc gatcgccggg 1980

agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc 2040

ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag 2100

gagctggacg caccggaggc gaggctggcg gactacttcg actacatcgc cggaaccagc 2160

accggcggtc tcatcaccgc cttgctgacc gcgcccggca aggacaagcg gcctctctag 2220

gctgccaagg acatcaacca cttttacatc cataactgcc cgcgcatctt tcctcagaag 2280

tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc atccatccag catcgtacgt acgtcctcta 2340

tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga 2400

gcaggcttgc gaaaacccca tggccctgtc caacaagttc atcggcgacg acatgaagat 2460

gacctaccac atggacggct gcgtgaacgg ccactacttc accgtgaagg gcgagggcag 2520

cggcaagccc tacgagggca cccagacctc caccttcaag gtgaccatgg ccaacggcgg 2580

ccccctggcc ttctccttcg acatcctgtc caccgtgttc atgtacggca accgctgctt 2640

caccgcctac cccaccagca tgcccgacta cttcaagcag gccttccccg acggcatgtc 2700

ctacgagaga accttcacct acgaggacgg cggcgtggcc accgccagct gggagatcag 2760 135

cctgaagggc aactgcttcg agcacaagtc caccttccac ggcgtgaact tccccgccga 2820

cggccccgtg atggccaaga agaccaccgg ctgggacccc tccttcgaga agatgaccgt 2880

gtgcgacggc atcttgaagg gcgacgtgac cgccttcctg atgctgcagg gcggcggcaa 2940

ctacagatgc cagttccaca cctcctacaa gaccaagaag cccgtgacca tgccccccaa 3000

ccacgtggtg gagcaccgca tcgccagaac cgacctggac aagggcggca acagcgtgca 3060

gctgaccgag cacgccgtgg cccacatcac ctccgtggtg cccttcggcg gcggcggatc 3120

cgacaagaag tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac agcgtgggct gggccgtgat 3180

caccgacgag tacaaggtgc cgagcaagaa gttcaaggtg ctgggcaaca ccgacaggca 3240

cagcatcaag aagaacctga tcggcgccct gctgttcgac agcggcgaga ccgccgaggc 3300

caccaggctg aagaggaccg ccaggaggag gtacaccagg aggaagaaca ggatctgcta 3360

cctgcaggag atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacaggct 3420

ggaggagagc ttcctggtgg aggaggacaa gaagcacgag aggcacccga tcttcggcaa 3480

catcgtggac gaggtggcct accacgagaa gtacccgacc atctaccacc tgaggaagaa 3540

gctggtggac agcaccgaca aggccgacct gaggctgatc tacctggccc tggcccacat 3600

gatcaagttc aggggccact tcctgatcga gggcgacctg aacccggaca acagcgacgt 3660

ggacaagctg ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg agaacccgat 3720

caacgccagc ggcgtggacg ccaaggccat cctgagcgcc aggctgagca agagcaggag 3780

gctggagaac ctgatcgccc agctgccggg cgagaagaag aacggcctgt tcggcaacct 3840

gatcgccctg agcctgggcc tgaccccgaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga 3900

cgccaagctg cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca 3960

gatcggcgac cagtacgccg acctgttcct ggccgccaag aacctgagcg acgccatcct 4020

gctgagcgac atcctgaggg tgaacaccga gatcaccaag gccccgctga gcgccagcat 4080

gatcaagagg tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaggccc tggtgaggca 4140

gcagctgccg gagaagtaca aggagatctt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg 4200

ctacatcgac ggcggcgcca gccaggagga gttctacaag ttcatcaagc cgatcctgga 4260

gaagatggac ggcaccgagg agctgctggt gaagctgaac agggaggacc tgctgaggaa 4320

gcagaggacc ttcgacaacg gcagcatccc gcaccagatc cacctgggcg agctgcacgc 4380

catcctgagg aggcaggagg acttctaccc gttcctgaag gacaacaggg agaagatcga 4440

gaagatcctg accttccgca tcccgtacta cgtgggcccg ctggccaggg gcaacagcag 4500

gttcgcctgg atgaccagga agagcgagga gaccatcacc ccgtggaact tcgaggaggt 4560

ggtggacaag ggcgccagcg cccagagctt catcgagagg atgaccaact tcgacaagaa 4620

cctgccgaac gagaaggtgc tgccgaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta 4680 136

caacgagctg accaaggtga agtacgtgac cgagggcatg aggaagccgg ccttcctgag 4740

cggcgagcag aagaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagga aggtgaccgt 4800

gaagcagctg aaggaggact acttcaagaa gatcgagtgc ttcgacagcg tggagatcag 4860

cggcgtggag gacaggttca acgccagcct gggcacctac cacgacctgc tgaagatcat 4920

caaggacaag gacttcctgg acaacgagga gaacgaggac atcctggagg acatcgtgct 4980

gaccctgacc ctgttcgagg acagggagat gatcgaggag aggctgaaga cctacgccca 5040

cctgttcgac gacaaggtga tgaagcagct gaagaggagg aggtacaccg gctggggcag 5100

gctgagcagg aagctgatca acggcatcag ggacaagcag agcggcaaga ccatcctgga 5160

cttcctgaag agcgacggct tcgccaacag gaacttcatg cagctgatcc acgacgacag 5220

cctgaccttc aaggaggaca tccagaaggc ccaggtgagc ggccagggcg acagcctgca 5280

cgagcacatc gccaacctgg ccggcagccc ggccatcaag aagggcatcc tgcagaccgt 5340

gaaggtggtg gacgagctgg tgaaggtgat gggcaggcac aagccggaga acatcgtgat 5400

cgagatggcc agggagaacc agaccaccca gaagggccag aagaacagca gggagaggat 5460

gaagaggatc gaggagggca tcaaggagct gggcagccag atcctgaagg agcacccggt 5520

ggagaacacc cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga acggcaggga 5580

catgtacgtg gaccaggagc tggacatcaa caggctgagc gactacgacg tggaccacat 5640

cgtgccgcag agcttcctga aggacgacag catcgacaac aaggtgctga ccaggagcga 5700

caagaacagg ggcaagagcg acaacgtgcc gagcgaggag gtggtgaaga agatgaaaaa 5760

ctactggagg cagctgctga acgccaagct gatcacccag aggaagttcg acaacctgac 5820

caaggccgag aggggcggcc tgagcgagct ggacaaggcc ggcttcatta aaaggcagct 5880

ggtggagacc aggcagatca ccaagcacgt ggcccagatc ctggacagca ggatgaacac 5940

caagtacgac gagaacgaca agctgatcag ggaggtgaag gtgatcaccc tgaagagcaa 6000

gctggtgagc gacttcagga aggacttcca gttctacaag gtgagggaga tcaataatta 6060

ccaccacgcc cacgacgcct acctgaacgc cgtggtgggc accgccctga ttaaaaagta 6120

cccgaagctg gagagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgaggaagat 6180

gatcgccaag agcgagcagg agatcggcaa ggccaccgcc aagtacttct tctacagcaa 6240

catcatgaac ttcttcaaga ccgagatcac cctggccaac ggcgagatca ggaagaggcc 6300

gctgatcgag accaacggcg agaccggcga gatcgtgtgg gacaagggca gggacttcgc 6360

caccgtgagg aaggtgctgt ccatgccgca ggtgaacatc gtgaagaaga ccgaggtgca 6420

gaccggcggc ttcagcaagg agagcatcct gccgaagagg aacagcgaca agctgatcgc 6480

caggaagaag gactgggacc cgaagaagta cggcggcttc gacagcccga ccgtggccta 6540 137

cagcgtgctg gtggtggcca aggtggagaa gggcaagagc aagaagctga agagcgtgaa 6600

ggagctggtg ggcatcacca tcatggagag gagcagcttc gagaagaacc cagtggactt 6660

cctggaggcc aagggctaca aggaggtgaa gaaggacctg atcattaaac tgccgaagta 6720

cagcctgttc gagctggaga acggcaggaa gaggatgctg gccagcgccg gcgagctgca 6780

gaagggcaac gagctggccc tgccgagcaa gtacgtgaac ttcctgtacc tggccagcca 6840

ctacgagaag ctgaagggca gcccggagga caacgagcag aagcagctgt tcgtggagca 6900

gcacaagcac tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttcagca agagggtgat 6960

cctggccgac gccaacctgg acaaggtgct gagcgcctac aacaagcaca gggacaagcc 7020

gatcagggag caggccgaga acatcatcca cctgttcacc ctgaccaacc tgggcgcccc 7080

ggccgccttc aagtacttcg acaccaccat cgacaggaag aggtacacca gcaccaagga 7140

ggtgctggac gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga ccaggatcga 7200

cctgagccag ctgggcggcg acagcagccc gccgaagaag aagaggaagg tgagctggaa 7260

ggacgccagc ggctggagca ggatgtgacc atgggacaag tggctttact gtcagtcaca 7320

tgcttgtaaa taagtagact ttattttaat aaaacataaa aatatatata tgttcttgaa 7380

tataaaattg ataaccaaat taaaattcga accatcactt atacataatt ttactttatt 7440

ttttataaaa cgtgaacggg aaggactacc gtgaatgact atagaaccaa tcatactagt 7500

ataaaatata tgatgacact acgggagaga caaactttgt ctggcgctaa atattttgcc 7560

gagtgtgaat tcacgggcac taggcaaaga tcttctttgc cgagtgttac gctgggcaaa 7620

gtaagacact aggtaaatca gtcatttgcc gagtgtccgc cactaggcaa agcaaaacac 7680

tggcaaatca aaagtttacc tagtgccaga cactaggcaa aaaaaaaacg ctcggcaaat 7740

cggaagtttc cctagtgcca gacactagac aaagaaaaac acttgataaa ctagcgtcgt 7800

cagctaacac catccaccaa ccgttaacgt tgccgagtat ctgacttcga cactcggcaa 7860

agaaggtctc tttgcctagt gtcggtctgg aacactaggc aaagaggcac tttacctagt 7920

gtcgtatttt gacactcagt aaaataattt tttttctttc tgcttccaaa ctttttatga 7980

tgtgttccta tagcacctag aactacatgt caagttttgg taaaattttt gaagtttttg 8040

ctatatttac ttaatttatt ttatttaatt gaatttcttt tgataattca aatttgaact 8100

cggcaaggta agaagcgagg gtagcctgga aacacacttt gcctagtgtt acactcggta 8160

caggagcctc ccctgcctag tgctgcactc gacaaaagat tcgcctttgc ctagcgctgc 8220

actcggcaca ggagtcgcct ttgcctagtg ctgcactagg caaagcctcc gttaccgtgc 8280

cttccatcgt cggacccttc gaagggatct ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc 8340

ttctgaagca acttaaagtt atcaggcatg catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt 8400

cagggaccat agcacaggac aggcgtcttc tactggtgct accagcaaat gctggaagcc 8460 138

gggaacactg ggtacgttgg aaaccacgtg atgtggagta agataaactg taggagaaaa 8520

gcatttcgta gtgggccatg aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg gccggcccat 8580

tacgcaattg gacgacaaca aagactagta ttagtaccac ctcggctatc cacatagatc 8640

aaagctggtt taaaagagtt gtgcagatga tccgtggcag ctggagctga gcttccgggg 8700

ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 8760

gcaccgagtc ggtgcttttt ttttcggacc gcgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg 8820

cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt 8880

ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac 8940

tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa 9000

atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt 9060

tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa 9120

tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac 9180

taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac 9240

tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta 9300

aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc 9360

gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga 9420

accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc 9480

tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa 9540

attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac 9600

ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc 9660

gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc 9720

gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta 9780

cgccgctcgt cctccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg 9840

gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga 9900

tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct 9960

aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg 10020

atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat 10080

ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg 10140

ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa 10200

ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta 10260

cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt 10320 139

tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt 10380

tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta 10440

tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat 10500

ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat 10560

acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata 10620

ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca 10680

gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg 10740

tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccggcagcag 10800

ccatgcagaa gctgatcaac agcgtgcaga actacgcctg gggcagcaag accgccctga 10860

ccgagctgta cggcatggag aaccccagca gccagcccat ggccgagctg tggatgggcg 10920

cccaccccaa gagcagcagc cgcgtgcaga acgccgccgg cgacatcgtg agcctgcgcg 10980

acgtgatcga gagcgacaag agcaccctgc tgggcgaggc cgtggccaag cgcttcggcg 11040

agctgccctt cctgttcaag gtgctgtgcg ccgcccagcc cctgagcatc caggtgcacc 11100

ccaacaagca caacagcgag atcggcttcg ccaaggagaa cgccgccggc atccccatgg 11160

acgccgccga gcgcaactac aaggacccca accacaagcc cgagctggtg ttcgccctga 11220

cccccttcct ggccatgaac gccttccgcg agttcagcga gatcgtgagc ctgctgcagc 11280

ccgtggccgg cgcccacccc gccatcgccc acttcctgca gcagcccgac gccgagcgcc 11340

tgagcgagct gttcgccagc ctgctgaaca tgcagggcga ggagaagagc cgcgccctgg 11400

ccatcctgaa gagcgccctg gacagccagc agggcgagcc ctggcagacc atccgcctga 11460

tcagcgagtt ctaccccgag gacagcggcc tgttcagccc cctgctgctg aacgtggtga 11520

agctgaaccc cggcgaggcc atgttcctgt tcgccgagac cccccacgcc tacctgcagg 11580

gcgtggccct ggaggtgatg gccaacagcg acaacgtgct gcgcgccggc ctgaccccca 11640

agtacatcga catccccgag ctggtggcca acgtgaagtt cgaggccaag cccgccaacc 11700

agctgctgac ccagcccgtg aagcagggcg ccgagctgga cttccccatc cccgtggacg 11760

acttcgcctt cagcctgcac gacctgagcg acaaggagac caccatcagc cagcagagcg 11820

ccgccatcct gttctgcgtg gagggcgacg ccaccctgtg gaagggcagc cagcagctgc 11880

agctgaagcc cggcgagagc gccttcatcg ccgccaacga gagccccgtg accgtgaagg 11940

gccacggccg cctggcccgc gtgtacaaca agctgtgata ggagctcgat ccgtcgacct 12000

gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 12060

gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 12120

tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 12180

tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 12240 140

tctatgttac tagatcggcg cgccgcaatt gaagtttggg cggccagcat ggccgtatcc 12300

gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac 12360

cagccagcca acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca 12420

gcccatcaga attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg 12480

cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 12540

cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 12600

ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat 12660

aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg 12720

ttgatcgccg aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 12780

gaaccgacgt tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 12840

cacagtgata ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 12900

gctttgatca acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 12960

gctgtagaag tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 13020

cgcgaactgc aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 13080

gccacgatcg acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 13140

ttggtaggtc cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 13200

gcgctaaatg aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 13260

aatgtagtgc ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 13320

aaggatgtcg ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 13380

cttgaagcta ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 13440

ttggaagaat ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc 13500

tctagtggat ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag 13560

accataggcg atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca 13620

acgattgaga atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg 13680

tcagccgcaa ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg 13740

aaaatttctc aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga 13800

aacacgttct tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta 13860

cgatccacgc cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct 13920

cttccgcgac ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg 13980

agctaggagc aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca 14040

ttcgggttgc cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt 14100 141

gttttactga ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg 14160

aggtgaaact tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg 14220

acgttctatc gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg 14280

acaggagtat agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa 14340

gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg 14400

tttcgcacgg ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt 14460

gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 14520

ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc 14580

cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc 14640

agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt 14700

tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt 14760

ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg 14820

gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt 14880

actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga 14940

caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc 15000

cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca 15060

cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg 15120

tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat 15180

cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt 15240

gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg 15300

cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga 15360

acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg 15420

gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct 15480

agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga 15540

gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt 15600

ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg 15660

gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 15720

aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct 15780

ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 15840

tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 15900

ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 15960

gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca 16020 142

ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt 16080

gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt 16140

gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag 16200

ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct 16260

gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 16320

ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 16380

cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 16440

cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 16500

actgaatccg gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 16560

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 16620

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 16680

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 16740

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 16800

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 16860

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 16920

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 16980

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 17040

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 17100

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 17160

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 17220

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 17280

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 17340

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 17400

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 17460

tttgatccgg aatta 17475

<210> 39

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 39

ttgtgctgct ccacgaaca 19 143

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 40

gccagccact acgagaagct 20

<210> 41

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 41

ctgcttctgc tcgttgtcct ccgg 24

<210> 42

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> промотор

<400> 42

gcggatgctg gcacagc 17

<210> 43

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 43

ggcattgctt ccttctccg 19

<210> 44

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 44

cagggagcga ggtac 15

<210> 45

<211> 20 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 45

ctggtggcca acgtgaagtt 20

<210> 46

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 46

gcttcacggg ctgggtc 17

<210> 47

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 47

aggccaagcc cgccaaccag 20

<210> 48

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 48

gcggatgctg gcacaga 17

<210> 49

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 49

gcattgcttc cttcgcca 18

<210> 50

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность 145

<220>

<223> зонд

<400> 50

cagggaggta cgaacc 16

<210> 51

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 51

gcggcgaaga agcgaa 16

<210> 52

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 52

gcggcgtctc cagcttc 17

<210> 53

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 53

ccaggaactg cg 12

<210> 54

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 54

aagaaacgcc ggctgagt 18

<210> 55

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 146

<400> 55

accttgcggg gcgtt 15

<210> 56

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 56

ccaggaactg cg 12

<210> 57

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 57

aagaaacgcc ggctgagt 18

<210> 58

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 58

ccttgcgcgg cgtc 14

<210> 59

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 59

ccaggaactg cg 12

<210> 60

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 60

tgatcctcga ggccaagct 19 147

<210> 61

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 61

aggtcgaggt cccctcca 18

<210> 62

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 62

cctgctaccc gggc 14

<210> 63

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 63

cgcgccctgc taccc 15

<210> 64

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 64

gcgcgtgctt accagga 17

<210> 65

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 65

tcgaggagtg ccc 13

<210> 66

<211> 16 148

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 66

caccgatgag caggcg 16

<210> 67

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 67

agatacacct tccggccg 18

<210> 68

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 68

ttcctcccgg aagc 14

<210> 69

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 69

caccgatgag caggcg 16

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 70

agatacacct tccggccagt 20

<210> 71

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность 149

<220>

<223> зонд

<400> 71

ctcctcccgg aagc 14

<210> 72

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 72

caagtttctg gacaaggaga ttctc 25

<210> 73

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 73

aagaattccc ttcttaatag ctggaga 27

<210> 74

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 74

cacgagcaca ttgctaacct tgctgg 26

<210> 75

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 75

tcaccgatga gcaggca 17

<210> 76

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 150

<400> 76

atacaccttc cggccagc 18

<210> 77

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 77

ttcctcccgg aagc 14

<210> 78

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 78

gatagggcta aagagatgtg ggaa 24

<210> 79

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 79

ctttgttcac attagggctc aaataa 26

<210> 80

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 80

tagactgaga tggatg 16

<210> 81

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 81

aaaaccaccg gagaagacga 20 151

<210> 82

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 82

aggtgtggcg gcagtga 17

<210> 83

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 83

caccgtcatt gttc 14

<210> 84

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 84

caagtttctg gacaaggaga ttctc 25

<210> 85

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 85

aagaattccc ttcttaatag ctggaga 27

<210> 86

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 86

cacgagcaca ttgctaacct tgctgg 26

<210> 87

<211> 15 152

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 87

gcgacgccgg aaagg 15

<210> 88

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 88

tggcgtggtt tcgtcttctt a 21

<210> 89

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> зонд

<400> 89

aagagcggcg tctggaggtg actca 25

<210> 90

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 90

aaccgcatcg tcagaaaaac 20

<210> 91

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 91

tcaacttaac cggccaaatc 20

<210> 92

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность 153

<220>

<223> Праймер

<400> 92

catcccttct cttccctcct g 21

<210> 93

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 93

gccagtgtga gtgtgtatga gca 23

<210> 94

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 94

catcgttttc tcccctcctc a 21

<210> 95

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 95

actgatatgc acggcgcca 19

<210> 96

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 96

tgcagtagct tcattttcac cg 22

<210> 97

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 154

<400> 97

aggaattgat atgtacgccc gt 22

<210> 98

<211> 16279

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вектор 24075

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(517)

<223> bNRB-07

<220>

<221> промотор

<222> (538)..(1697)

<223> prAtEFaA1-02

<220>

<221> ген

<222> (1716)..(5885)

<223> cCas9-05

<220>

<221> мутация

<222> (5205)..(5207)

<223> мутация L на V

<220>

<221> мутация

<222> (5250)..(5252)

<223> мутация I на V

<220>

<221> Терминатор

<222> (5894)..(6146)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (6173)..(6620)

<223> prAtU6-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6621)..(6640)

<223> мишень 1 AtGL1

<220>

<221> другой_признак

<222> (6621)..(6725)

<223> rsgRNA AtGL1-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (6641)..(6652)

<223> rCrRNA-01 155

<220>

<221> другой_признак

<222> (6657)..(6725)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (6726)..(7173)

<223> prAtU6-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7174)..(7193)

<223> мишень 2 AtGl1

<220>

<221> другой_признак

<222> (7174)..(7278)

<223> rsgRNA AtGL1-02

<220>

<221> другой_признак

<222> (7194)..(7205)

<223> rCrRNA-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (7210)..(7278)

<223> rTracrRNA-01

<220>

<221> промотор

<222> (7295)..(7640)

<223> prCMP-02

<220>

<221> ген

<222> (7653)..(8447)

<223> cNpt2-10

<220>

<221> Терминатор

<222> (8476)..(8728)

<223> tNOS-05-01

<220>

<221> промотор

<222> (8755)..(10752)

<223> prGmUBI-01

<220>

<221> ген

<222> (10765)..(11454)

<223> cAmCyan-06

<220>

<221> Терминатор

<222> (11477)..(12119)

<223> tPsE9-01

<220>

<221> другой_признак

<222> (12193)..(12311) 156

<223> bNLB-03

<220>

<221> ген

<222> (12928)..(13716)

<223> cSpec-03

<220>

<221> ген

<222> (13751)..(14824)

<223> cRepA-08

<220>

<221> другой_признак

<222> (14867)..(15271)

<223> oVC1-04

<220>

<221> другой_признак

<222> (15441)..(16247)

<223> oCOLE-06

<400> 98

gccaggacgt cggccgaaag agcgacaagc agatcacgct tttcgacagc gtcggatttg 60

cgatcgagga tttttcggcg ctgcgctacg tccgcgaccg cgttgaggga tcaagccaca 120

gcagcccact cgaccttcta gccgacccag acgagccaag ggatcttttt ggaatgctgc 180

tccgtcgtca ggctttccga cgtttgggtg gttgaacaga agtcattatc gcacggaatg 240

ccaagcactc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata 300

aaccttttca cgccctttta aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt 360

ttacccgcca atatatcctg tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa 420

tctgatcatg agcggagaat taagggagtc acgttatgac ccccgccgat gacgcgggac 480

aagccgtttt acgtttggaa ctgacagaac cgcaacgttg aaggcgcgcc actcagcaag 540

cttgatatcg gaagtttctc tcttgaggga ggttgctcgt ggaatgggac acatatggtt 600

gttataataa accatttcca ttgtcatgag attttgaggt taatatatac tttacttgtt 660

cattatttta tttggtgttt gaataaatga tataaatggc tcttgataat ctgcattcat 720

tgagatatca aatatttact ctagagaaga gtgtcatata gattgatggt ccacaatcaa 780

tgaaattttt gggagacgaa catgtataac catttgcttg aataacctta attaaaaggt 840

gtgattaaat gatgtttgta acatgtagta ctaaacattc ataaaacaca accaacccaa 900

gaggtattga gtattcacgg ctaaacaggg gcataatggt aatttaaaga atgatattat 960

tttatgttaa accctaacat tggtttcgga ttcaacgcta taaataaaac cactctcgtt 1020

gctgattcca tttatcgttc ttattgaccc tagccgctac acacttttct gcgatatctc 1080

tgaggtaagc gttaacgtac ccttagatcg ttctttttct ttttcgtctg ctgatcgttg 1140

ctcatattat ttcgatgatt gttggattcg atgctctttg ttgattgatc gttctgaaaa 1200 157

ttctgatctg ttgtttagat tttatcgatt gttaatatca acgtttcact gcttctaaac 1260

gataatttat tcatgaaact attttcccat tctgatcgat cttgttttga gattttaatt 1320

tgttcgattg attgttggtt ggtggatcta tatacgagtg aacttgttga tttgcgtatt 1380

taagatgtat gtcgatttga attgtgattg ggtaattctg gagtagcata acaaatccag 1440

tgttcccttt ttctaagggt aattctcgga ttgtttgctt tatatctctt gaaattgccg 1500

atttgattga atttagctcg cttagctcag atgatagagc accacaattt ttgtggtaga 1560

aatcggtttg actccgatag cggcttttta ctatgattgt tttgtgttaa agatgatttt 1620

cataatggtt atatatgtct actgttttta ttgattcaat atttgattgt tctttttttt 1680

gcagatttgt tgaccaggga tccgcggccg ctaaaatgga taagaagtat tctattggac 1740

ttgatattgg aaccaactct gtgggatggg ctgttattac tgacgagtat aaggttccat 1800

ctaagaagtt caaggttctt ggaaacactg atagacactc tattaagaag aaccttattg 1860

gtgctcttct tttcgattct ggagagactg ctgaggctac tagacttaag agaactgcta 1920

gaagaagata tactagaaga aagaacagaa tttgctatct tcaagagatt ttctctaacg 1980

agatggctaa ggttgacgat tctttcttcc acagacttga ggagtctttc cttgttgagg 2040

aggataagaa gcacgagaga cacccaattt tcggaaacat tgttgacgag gttgcttatc 2100

acgagaagta tccaactatt tatcacctta gaaagaagct cgttgattct actgataagg 2160

ctgatcttag acttatttat cttgctcttg ctcacatgat taagttcaga ggacacttcc 2220

ttattgaggg agatcttaac ccagataact ctgacgttga taagctcttc attcaacttg 2280

ttcaaactta taaccaactt ttcgaggaga acccaattaa cgcttctgga gttgacgcta 2340

aggctattct ttctgctaga ctttctaagt ctagaaggct tgagaacctt attgctcaac 2400

ttccaggaga gaagaagaac ggacttttcg gaaaccttat tgctctttct cttggactta 2460

ctccaaactt caagtctaac ttcgatcttg ctgaggacgc taagctccaa ctttctaagg 2520

atacttacga cgatgatctt gataaccttc ttgctcaaat tggagatcaa tacgctgatc 2580

ttttccttgc tgctaagaac ctttctgacg ctattcttct ttctgatatt cttagagtta 2640

acactgagat tactaaggct ccactttctg cttctatgat taagagatac gacgagcacc 2700

accaagatct tactcttctt aaggctcttg ttagacaaca acttccagag aagtataagg 2760

agattttctt cgatcaatct aagaacggat acgctggata tattgacgga ggagcttctc 2820

aagaggagtt ctataagttc attaagccaa ttcttgagaa gatggacgga actgaggagc 2880

ttcttgttaa gctcaacaga gaggatcttc ttagaaagca aagaactttc gataacggat 2940

ctattccaca ccaaattcac cttggagagc ttcacgctat tcttagaagg caagaggatt 3000

tctatccatt ccttaaggat aacagagaga agattgagaa gattcttact ttccgtattc 3060

catattacgt tggaccactt gctagaggaa actctagatt cgcttggatg actagaaagt 3120 158

ctgaggagac tattactcct tggaacttcg aggaggttgt tgataaggga gcttctgctc 3180

aatctttcat tgagagaatg actaacttcg ataagaacct tccaaacgag aaggttcttc 3240

caaagcactc tcttctttac gagtatttca ctgtttataa cgagcttact aaggttaagt 3300

acgttactga gggaatgaga aagccagctt tcctttctgg agagcaaaag aaggctattg 3360

ttgatcttct tttcaagact aacagaaagg ttactgttaa gcaacttaag gaggattatt 3420

tcaagaagat tgagtgcttc gattctgttg agatttctgg agttgaggat agattcaacg 3480

cttctcttgg aacttatcac gatcttctta agattattaa ggataaggat ttccttgata 3540

acgaggagaa cgaggatatt cttgaggata ttgttcttac tcttactctt ttcgaggata 3600

gagagatgat tgaggagaga cttaagactt acgctcacct tttcgacgat aaggttatga 3660

agcaacttaa gagaagaaga tatactggat ggggtagact ttctagaaag ctcattaacg 3720

gaattagaga taagcaatct ggaaagacta ttcttgattt ccttaagtct gacggattcg 3780

ctaacagaaa cttcatgcaa cttattcacg acgattctct tactttcaag gaggatattc 3840

aaaaggctca agtttctgga caaggagatt ctcttcacga gcacattgct aaccttgctg 3900

gatctccagc tattaagaag ggaattcttc aaactgttaa ggttgttgac gagcttgtta 3960

aggttatggg tagacacaag ccagagaaca ttgttattga gatggctaga gagaaccaaa 4020

ctactcaaaa gggacaaaag aactctagag agagaatgaa gagaattgag gagggaatta 4080

aggagcttgg atctcaaatt cttaaggagc acccagttga gaacactcaa cttcaaaacg 4140

agaagctcta tctttattat cttcaaaacg gaagagatat gtacgttgat caagagcttg 4200

atattaacag actttctgat tacgacgttg atcacattgt tccacaatct ttccttaagg 4260

acgattctat tgataacaag gttcttacta gatctgataa gaacagagga aagtctgata 4320

acgttccatc tgaggaggtt gttaagaaga tgaagaacta ttggagacaa cttcttaacg 4380

ctaagctcat tactcaaaga aagttcgata accttactaa ggctgagaga ggaggacttt 4440

ctgagcttga taaggctgga ttcattaaga gacaacttgt tgagactaga caaattacta 4500

agcacgttgc tcaaattctt gattctagaa tgaacactaa gtacgacgag aacgataagc 4560

tcattagaga ggttaaggtt attactctta agtctaagct cgtttctgat ttcagaaagg 4620

atttccaatt ctataaggtt agagagatta acaactatca ccacgctcac gacgcttatc 4680

ttaacgctgt tgttggaact gctcttatta agaagtatcc aaaacttgag tctgagttcg 4740

tttacggaga ttataaggtt tacgacgtta gaaagatgat tgctaagtct gagcaagaga 4800

ttggaaaggc tactgctaag tatttcttct attctaacat tatgaacttc ttcaagactg 4860

agattactct tgctaacgga gagattagaa agaggccact tattgagact aacggagaga 4920

ctggagagat tgtttgggat aagggaagag atttcgctac tgttagaaag gttctttcta 4980 159

tgccacaagt taacattgtt aagaaaactg aggttcaaac tggaggattc tctaaggagt 5040

ctattcttcc aaagagaaac tctgataagc tcattgctag aaagaaggat tgggacccaa 5100

agaagtacgg aggattcgat tctccaactg ttgcttattc tgttcttgtt gttgctaagg 5160

ttgagaaggg aaagtctaag aagctcaagt ctgttaagga gcttgttgga attactatta 5220

tggagagatc ttctttcgag aagaacccag ttgatttcct tgaggctaag ggatataagg 5280

aggttaagaa ggatcttatt attaagctcc caaagtattc tcttttcgag cttgagaacg 5340

gaagaaagag aatgcttgct tctgctggag agcttcaaaa gggaaacgag cttgctcttc 5400

catctaagta cgttaacttc ctttatcttg cttctcacta cgagaagctc aagggatctc 5460

cagaggataa cgagcaaaag caacttttcg ttgagcaaca caagcactat cttgacgaga 5520

ttattgagca aatttctgag ttctctaaga gagttattct tgctgacgct aaccttgata 5580

aggttctttc tgcttataac aagcacagag ataagccaat tagagagcaa gctgagaaca 5640

ttattcacct tttcactctt actaaccttg gtgctccagc tgctttcaag tatttcgata 5700

ctactattga tagaaagaga tatacttcta ctaaggaggt tcttgacgct actcttattc 5760

accaatctat tactggactt tacgagacta gaattgatct ttctcaactt ggaggagatt 5820

cttctccacc aaagaagaag agaaaggttt cttggaagga cgcttctgga tggtctagaa 5880

tgtgacgtcg cgtgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 5940

tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 6000

taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 6060

atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 6120

cgcggtgtca tctatgttac tagatctgca gatcggaccc ctaattagct aaaagcttcg 6180

ttgaacaacg gaaactcgac ttgccttccg cacaatacat catttcttct tagctttttt 6240

tcttcttctt cgttcataca gttttttttt gtttatcagc ttacattttc ttgaaccgta 6300

gctttcgttt tcttcttttt aactttccat tcggagtttt tgtatcttgt ttcatagttt 6360

gtcccaggat tagaatgatt aggcatcgaa ccttcaagaa tttgattgaa taaaacatct 6420

tcattcttaa gatatgaaga taatcttcaa aaggcccctg ggaatctgaa agaagagaag 6480

caggcccatt tatatgggaa agaacaatag tatttcttat ataggcccat ttaagttgaa 6540

aacaatcttc aaaagtccca catcgcttag ataagaaaac gaagctgagt ttatatacag 6600

ctagagtcga agtagtgatt ggaaaagttg tagactgaga gttttagagc tagaaatagc 6660

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 6720

tttttaagct tcgttgaaca acggaaactc gacttgcctt ccgcacaata catcatttct 6780

tcttagcttt ttttcttctt cttcgttcat acagtttttt tttgtttatc agcttacatt 6840

ttcttgaacc gtagctttcg ttttcttctt tttaactttc cattcggagt ttttgtatct 6900 160

tgtttcatag tttgtcccag gattagaatg attaggcatc gaaccttcaa gaatttgatt 6960

gaataaaaca tcttcattct taagatatga agataatctt caaaaggccc ctgggaatct 7020

gaaagaagag aagcaggccc atttatatgg gaaagaacaa tagtatttct tatataggcc 7080

catttaagtt gaaaacaatc ttcaaaagtc ccacatcgct tagataagaa aacgaagctg 7140

agtttatata cagctagagt cgaagtagtg attgcagtga tgaacaatga cgggttttag 7200

agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 7260

agtcggtgct ttttttttgg cgcgcctaaa gcttctggca gacaaagtgg cagacatact 7320

gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa 7380

ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt 7440

gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc 7500

accatgtgaa ggcatcttca gactccaata atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat 7560

aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc 7620

cctcattgtt aagggagcaa ggatcctaaa ccatgattga acaagatgga ttgcacgcag 7680

gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 7740

gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 7800

agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 7860

tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 7920

actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 7980

ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 8040

cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 8100

ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 8160

tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 8220

atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 8280

gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 8340

aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 8400

attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgatga gagctctaga 8460

tccccgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct 8520

gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata 8580

attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa 8640

ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg 8700

cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattgggta ccctaattag ctaaattcca 8760 161

aaattttcag ttagtcctta ctaattatta aattatagta ttaatccaat gtgattgcgg 8820

ttacatcatg tacggaaaaa taattctaat ccttgattta aatttgatct tgactattta 8880

tttattcttt atttcatttt gtaaatcatt ttatgtatct cctggcaagc aattttatcc 8940

accttgcacc aacaccttcg ggttccataa tcaaaccacc ttaacttcac accatgctgt 9000

aactcacacc gcccagcatc tccaatgtga aagaagctaa aatttaataa acaatcatac 9060

gaagcagtga caaaatacca gatggtatta atgctttgat aaaattaatt ggaaagtata 9120

aaatggtaga aaataataaa ttataattaa tttaaataag ataaaaaata attaaaaact 9180

aaaatgttaa aattttaaaa aaattatttt aaataatatt taaaaacatt aaaaatcatt 9240

ttaaaaaatt tatttataga acaattaaat aaatatttca gctaataaaa aacaaaagct 9300

tacctagcct tagaagacaa cttgtccaac aattagatga tacccattgc ccttacgttt 9360

tctttaacat caattattgt ttttgtcaac aagctatctt ttagttttat tttattggta 9420

aaaaatatgt cgccttcaag ttgcatcatt taacacatct cgtcattaga aaaataaaac 9480

tcttccctaa acgattagta gaaaaaatca ttcgataata aataagaaag aaaaattaga 9540

aaaaaataac ttcattttaa aaaaatcatt aaggctatat tttttaaatg actaatttta 9600

tatagactgt aactaaaagt atacaattta ttatgctatg tatcttaaag aattacttat 9660

aaaaatctac ggaagaatat cttacaaagt gaaaaacaaa tgagaaagaa tttagtggga 9720

tgattatgat tttatttgaa aattgaaaaa ataattatta aagactttag tggagtaaga 9780

aagctttcct attagtcttt tcttatccat aaaaaaaaaa aaaaatctag cgtgacagct 9840

tttccataga ttttaataat gtaaaatact ggtagcagcc gaccgttcag gtaatggaca 9900

ctgtggtcct aacttgcaac gggtgcgggc ccaatttaat aacgccgtgg taacggataa 9960

agccaagcgt gaagcggtga aggtacatct ctgactccgt caagattacg aaaccgtcaa 10020

ctacgaagga ctccccgaaa tatcatctgt gtcataaaca ccaagtcaca ccatacatgg 10080

gcacgcgtca caatatgatt ggagaacggt tccaccgcat atgctataaa atgcccccac 10140

acccctcgac cctaatcgca cttcaattgc aatcaaatta gttcattctc tttgcgcagt 10200

tccctacctc tcctttcaag gttcgtagat ttcttctgtt tttttttctt cttctttatt 10260

gtttgttcta catcagcatg atgttgattt gattgtgttt tctatcgttt catcgattat 10320

aaattttcat aatcagaaga ttcagctttt attaatgcaa gaacgtcctt aattgatgat 10380

tttataaccg taaattaggt ctaattagag tttttttcat aaagattttc agatccgttt 10440

acaacaagcc ttaattgttg attctgtagt cgtagattaa ggtttttttc atgaactact 10500

tcagatccgt taaacaacag ccttatttgt tgatacttca gtcgtttttc aagaaattgt 10560

tcagatccgt tgataaaagc cttattcgtt gattctgtat ggtatttcaa gagatattgc 10620

tcaggtcctt tagcaactac cttatttgtt gattctgtgg ccatagatta ggattttttt 10680 162

tcacgaaatt gcttcttgaa attacgtgat ggattttgat tctgatttat cttgtgattg 10740

ttgactctac agagatctaa aaaaatggcc ctgtccaaca agttcatcgg cgacgacatg 10800

aagatgacct accacatgga cggctgcgtg aacggccact acttcaccgt gaagggcgag 10860

ggcagcggca agccctacga gggcacccag acctccacct tcaaggtgac gatggccaac 10920

ggcggccccc tggccttctc cttcgacatc ctgtccaccg tgttcatgta cggcaaccgc 10980

tgcttcaccg cctaccccac cagcatgccc gactacttca agcaggcctt ccccgacggc 11040

atgtcctacg agagaacctt cacctacgag gacggcggcg tggccaccgc cagctgggag 11100

atcagcctga agggcaactg cttcgagcac aagtccacct tccacggcgt gaacttcccc 11160

gccgacggcc ccgtgatggc caagaagacc accggctggg atccctcctt cgagaagatg 11220

accgtgtgcg acggcatctt gaagggcgac gtgaccgcct tcctgatgct gcagggcggc 11280

ggcaactaca gatgccagtt ccacacctcc tacaagacca agaagcccgt gaccatgccc 11340

cccaaccacg tggtggagca ccgcatcgcc agaaccgacc tggacaaggg cggcaacagc 11400

gtgcagctga ccgagcacgc cgtggcccac atcacctccg tggtgccctt ctgatgaact 11460

agtgaattcg agctcaagct ttcgttcgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc 11520

aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg agtttgagta ttatggcatt 11580

gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg 11640

gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 11700

ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 11760

tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 11820

cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtacc attatgctta 11880

ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct gcaaatgtta ctgaatacaa 11940

gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt tatgtaattt tccagaatcc 12000

ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac tcatggattt gtagttgagt 12060

atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg attgacaaca tgcatcaatc 12120

ggaccgttaa ctagctagac ggccaggatc gccgcgtgag cctttagcaa ctagctagat 12180

taattaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa 12240

tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca 12300

ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg 12360

cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg 12420

aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg 12480

cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt 12540 163

ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat aggaaatcgc 12600

tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa cgtcgactca 12660

tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat 12720

cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 12780

cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 12840

ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 12900

ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact 12960

caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta 13020

catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg 13080

gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg 13140

gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt 13200

gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa 13260

tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg 13320

gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag 13380

gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg 13440

ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc 13500

cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 13560

gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat 13620

cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 13680

gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg 13740

aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 13800

tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc 13860

agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg 13920

gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc 13980

agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga 14040

cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga 14100

gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga 14160

ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga 14220

agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt 14280

ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt 14340

aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac caagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac 14400

ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg 14460 164

gccggagtac atcgagatcg agctggctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa 14520

gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 14580

ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa 14640

gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg 14700

caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 14760

tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc 14820

ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 14880

actctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 14940

cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg acacacatgt aagtgactga 15000

tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 15060

taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa 15120

agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc 15180

ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca 15240

agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 15300

tgactcatac caggccatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 15360

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 15420

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 15480

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 15540

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 15600

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 15660

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 15720

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 15780

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 15840

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 15900

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 15960

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 16020

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 16080

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 16140

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 16200

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttgat ccggacaaac 16260

aaacaaatac agtaattta 16279

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу редактирования геномной ДНК растения. Изобретение позволяет эффективно трансформировать линии гаплоидов с тем, чтобы она кодировала клеточный механизм, способный редактировать гены. 17 з.п. ф-лы, 11 табл., 24 ил., 11 пр.

1. Способ редактирования геномной ДНК растения, предусматривающий:

a) получение первого растения, где первое растение, включающее MATL мутацию с потерей функции, представляет собой линию-индуктор гаплоидов растения, и где указанное первое растение экспрессирует фермент для модификации ДНК и по меньшей мере одну направляющую нуклеиновую кислоту;

b) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию;

c) опыление второго растения пыльцой от первого растения; и

d) отбор по меньшей мере одного редактируемого гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (c), где редактируемый гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и по меньшей мере одной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.

2. Способ по п. 1, где фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленную нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из нуклеазы Cas9, нуклеазы Cpf1, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, химерной Cas9-цитидиндезаминазы, химерной Cas9-адениндезаминазы, химерной FEN1-FokI, никазы Cas9 (nCas9), химерной нуклеазы dCas9, не содержащей FokI, и нуклеазы dCpf1, не содержащей FokI.

3. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна направляющая нуклеиновая кислота представляет собой направляющую РНК.

4. Способ по п. 1, где отредактированного гаплоидного потомка обрабатывают с помощью средства для удвоения числа хромосом, за счет чего получают потомка, являющегося удвоенным гаплоидом.

5. Способ по п. 4, где средство для удвоения числа хромосом представляет собой колхицин, пронамид, дитипир, трифлуралин или другое известное средство, ингибирующее образование микротрубочек.

6. Способ по п. 1, где первое растение является однодольным растением или двудольным растением.

7. Способ по п. 6, где первое растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.

8. Способ по п. 1, где второе растение является однодольным растением или двудольным растением.

9. Способ по п. 8, где второе растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.

10. Способ по п. 3, где второе растение представляет собой растение маиса.

11. Способ по п. 10, где направляющая РНК представляет собой последовательность из 18–21 нуклеотида, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21 и 23.

12. Способ по п. 1, где в первом растении экспрессируется маркерный ген.

13. Способ по п. 12, где маркерный ген выбран из группы, состоящей из GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, антоцианиновых пигментов и любого другого маркерного гена.

14. Способ по п. 1, где первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS или NP2222-matl.

15. Способ по п.1, где первое растение представляет собой растение маиса, и второе растение представляет собой растение маиса.

16. Способ по п. 1, где первое растение и второе растение относятся к разным видам.

17. Способ по п. 16, где первое растение представляет собой растение пшеницы, а второе растение представляет собой растение маиса.

18. Способ по п. 16, где первое растение представляет собой растение маиса, а второе растение представляет собой растение пшеницы.