МЕТОДЫ ПРЕДСКАЗАНИЯ, ОБНАРУЖЕНИЯ И УМЕНЬШЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ БЕЛКОВ В СПОСОБАХ АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДИНОЧНЫХ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/18 C07K16/28 C07K16/42 A61P37/04 

Настоящее изобретение имеет отношение к области одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов.

В общем, одиночный вариабельный домен иммуноглобулина или “ISV” определен в этом документе как аминокислотная последовательность, которая:

- имеет характерную для иммуноглобулинов укладку цепи, или которая в подходящих условиях (например, физиологических условиях) способна образовывать характерную для иммуноглобулинов укладку цепи (т.е., путем фолдинга (сворачивания)) для того, чтобы сформировать вариабельный домен иммуноглобулина (такой как, например, VH, VL или VHH-домен);

и которая

- образует (или в подходящих условиях способна образовать) вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий функциональный антигенсвязывающий участок (в том смысле, что это не требует взаимодействия с другим вариабельным доменом иммуноглобулина (такого, как VH-VL взаимодействие) для образования функционального антигенсвязывающего участка).

Некоторые примеры одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов, известные в настоящее время в данной области техники, представляют собой VHH и/или (другие) Нанотела, dAb и (одно)доменные антитела. Из них, по состоянию на момент подачи настоящей заявки, несколько Нанотел находятся на фазе I и фазе II клинических испытаний. Важно располагать доступными надежными способами анализа для исследования биологических образцов, полученных от людей, которые проходят лечение ISV (например, участников клинических исследований, а после выхода таких ISV на рынок пациентов, которые проходят лечение такими ISV).

Это важно не только в целях регулирования, но также для лечения пациентов биологическими препаратами, поскольку назначающие лечение клиницисты также хотели бы иметь надежные доступные способы анализа для контроля различных аспектов лечения.

Например, при клинических исследованиях молекул биологических лекарственных средств важно оценить их иммуногенный потенциал, и, в частности, уровень, до которого они способны выявлять так называемые “антитела к лекарственным средствам (антилекарственные антитела)” или “ADA”. Это определяется при помощи так называемого “анализа антилекарственных антител” или “ADA (иммуно)анализа” (смотри, например, обзор Shankar et al., Journal of Pharmaceutical и Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; а также Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical и Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; и Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28. Такой ADA-анализ и способы его проведения известны в области фармакологии и являются стандартными, и обычно они используются в ходе клинических испытаний биологических лекарственных средств (а также требуются многими регуляторными органами по всему миру).

Например, как описано на страницах 3 и 4 статьи Mire-Sluis и как, например, также схематично проиллюстрировано с помощью Фигур в статье Peng, известно довольно много различных видов ADA-анализа, таких как мостиковый ELISA, метод прямой иммунофлуоресценции (прямой ELISA), непрямой формат ELISA, радиоиммунопреципитационный анализ (RIP), поверхностный плазмонный резонанс и электрохемилюминисцентный мостиковый анализ. Другие форматы проведения ADA- иммуноанализа будут понятны специалисту.

Было доказано, что ряд различных коммерчески доступных технологических платформ, также хорошо знакомых специалисту, является подходящим для подготовки и проведения ADA-aнализа. Они включают, но не ограничиваются этим, MSD платформу (Mesoscale), Gyrolab (Gyros) и октетную платформу (Fortebio).

Кроме того, некоторые неограничивающие примеры видов ADA-анализа схематично показаны на Фигурах 1A - 1C.

В целом, следует отметить, что в таком ADA-анализе для обнаружения или измерения ADA к ISV, ISV используется в качестве “аналитического агента” (т.е., в качестве соединения, используемого для обнаружения присутствия каких-либо ADA в исследуемом образце), и ADA представляют собой “антиген” (т.е., соединение, которое должно быть обнаружено в тестируемом образце). Таким образом, в этих анализах ISV как правило/часто связывается с носителем (таким как ELISA-планшет), тогда как ADA (если таковые имеются) присутствуют в образце, подвергаемом анализу.

Чтобы лучше понять описанное в этом документе изобретение, сначала необходимо отметить, что в способах, используемых в этом описании для предсказания, будет ли ISV вызывать интерференцию белков, ISV обычно будет использоваться в качестве “антигена” (т.е., в качестве соединения, которое должно быть обнаружено), а aнтитело (описанное далее в этом документе) используется в качестве “аналитического агента” (т.е., в качестве средства для обнаружения, связывается ли данный ISV или нет, соответственно; и таким образом, имеется ли высокий или повышенный риск возникновения интерференции белков или нет, соответственно). Таким образом, в этом способе согласно изобретению антитело, используемое в качестве аналитического агента (которое также называется в этом документе “aналитическое антитело”), как правило, будет связано с носителем (т.е., с ELISA-планшетом) и ISV будет находиться в исследуемом образце. Однако, следует отметить, что изобретение не ограничивается методами анализа, в которых “аналитическое антитело” связано с носителем. Например, в альтернативном способе осуществления анализа в соответствии с изобретением (как показано, например, на Фигуре 1 и описано в Примерах) аналитическое антитело наоборот используется в качестве мостикообразующего агента и, таким образом, будет находиться в растворе, а не будет связанным с планшетом (хотя косвенно оно является связанным с планшетом через ISV, которым покрыт планшет). В то же время, в специфическом мостиковом способе анализа, описанном в Примерах (который является конкурентным способом анализа), аналитическое антитело все-таки используется в качестве аналитического агента (т.е., для установления, связывается ли представляющий интерес ISV или нет, соответственно; и, таким образом, имеется ли высокий или повышенный риск возникновения интерференции белков или нет, соответственно). Также, исходя из дальнейшего раскрытия, в этом документе предусматривается, что специалист сможет разработать другие виды анализа, в которых аналитическое антитело может использоваться в качестве аналитического агента для того, чтобы определить, может ли данный ISV связываться или нет, соответственно; и таким образом, имеет высокий или повышенный риск возникновения интерференции белков или нет).

В результате исследований в области одноцепочечных Fv или "ScFv" (которые представляют собой конструкции, содержащие одиночные вариабельные домены иммуноглобулинов, которые, аналогично ISV, не связаны с константными доменами), в данной области техники было описано, что С-конец вариабельного домена иммуноглобулина образует гидрофобный участок, который в антителе «погружен» в область взаимодействия (контакта) между вариабельным доменом и константным доменом, но который становится доступным растворителю, когда вариабельный домен не связан с константным доменом (Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). Также было описано, что доступный C-конец может образовывать B-клеточные эпитопы, которые могут обуславливать взаимодействие и/или взаимодействовать с (возникающими и/или уже существующими) антителами к лекарственным средствам (WO 11/07586), присутствие которых затем может быть выявлено при помощи вышеупомянутого ADA-анализа. По этой причине, было предложено вносить мутации некоторых аминокислотных остатков, образующих часть С-конца вариабельных доменов, для уменьшения указанной гидрофобности и/или удаления указанных эпитопов. Например, Nieba et al. предлагают мутировать положения 11, 14, 41, 84, 87 и/или 89 VH-участка (нумерация в соответствии с Kabat), тогда как в WO 11/07586 предлагается мутировать положения 99, 101 и/или 148 (AHo нумерация) VL-домена или положения 12, 97, 98, 99, 103 и/или 144 VH-домена (снова AHo нумерация – эти положения соответствуют положениям 11, 83, 84, 85, 89 и 103 согласно Kabat).

Однако ни один из этих источников не приходит к выводу, что определенные белки, присутствующие в крови или сыворотке субъекта, могут создавать помехи для ADA-aнализа с использованием ISV, и, следовательно, эти источники не направлены на решение проблемы, как избежать aспецифической интерференции белков при таких ADA-aнализах с тем, чтобы сделать возможным использование ADA-aнализа для выявления действительного наличия/степени (появляющихся или уже существующих) антилекарственных антител в образце, предназначенном для исследования.

В отличие от этого, настоящее изобретение предоставляет методы и способы анализа, которые позволяют специалисту без труда предсказать, будет или нет одиночный вариабельный домен иммуноглобулина обладать склонностью подвергаться аспецифической интерференции белков при ADA-aнализе. Кроме того, описанные в этом документе методы и способы анализа дают возможность специалисту, когда обнаружено, что вариабельный домен может иметь склонность или риск подвергаться такой интерференции белков при ADA-анализе, легко проверить (предположительные) модификации вариабельного домена, для того, чтобы предсказать, уменьшат ли такие (предположительные) модификации или практически полностью предотвратят такую интерференцию белков.

Настоящее изобретение также описывает ряд модификаций, которые могут быть внесены в вариабельные домены для уменьшения или фактически предотвращения такой интерференции белков. В соответствии с одним неограничивающим аспектом, эта модификация подразумевает введение ограниченного количества (как далее описано в этом документе) аминокислотных остатков (как далее описано в этом документе) к С-концу вариабельного домена. Неожиданно было обнаружено, что для множества различных вариабельных доменов или основанных на них конструкций, добавление даже единичного аминокислотного остатка на С-конец (например, единичного остатка аланина) может в значительной степени или даже практически полностью устранить проблему интерференции белков при ADA-анализе, даже несмотря на то, что само добавление одной такой аминокислоты не является достаточным для "прикрывания" или "утапливания" гидрофобного участка, который, в соответствии с Nieba et al., присутствует на С-конце ISV. Аналогично, но без желания каким-либо образом ограничить изобретение каким-либо механизмом или объяснением, также допускается, что добавление одной такой аминокислоты не будет достаточным для "прикрывания" или "утапливания" любых B-клеточных эпитопов, которые, в соответствии с WO 11/07586, могут присутствовать на С-конце вариабельного домена. Также необходимо отметить, несмотря на то, что в соответствии с этим специфическим аспектом настоящего изобретения добавление ограниченного числа или даже единичной аминокислоты на С-конец вариабельного домена (т.е. без каких-либо замещений в пределах самого С-концевого участка, как предлагается Nieba et al и WO 11/07586) может, и во многих случаях будет, значительно уменьшать или даже практически устранять проблему аспецифической интерференции белков, в рамках этого аспекта изобретения также находится то, что такие добавления на С-конец сочетаются с мутациями в С-концевом участке. В этом отношении, однако, также необходимо отметить, что изобретение не ограничивается собственно логическим обоснованием создания таких мутаций. Например, хорошо известно внесение мутаций в аминокислотные остатки в пределах C-конца (включая те положения, которые ясно указаны Nieba et al. и в WO 11/07586) для того, чтобы гуманизировать вариабельный домен (включая, без ограничения, V_HH домен) или для того, чтобы "верблюдизировать (camelize)" V_H домен (например, можно сослаться на WO 08/020079 и некоторые другие заявки Ablynx N.V., упомянутые в этом описании).

Предусматривается, что методы, способы анализа и модификации, предложенные в этом документе, могут применяться к любому вариабельному домену, который не связывается с или иным способом взаимодействует с константным доменом (или с другой группой или пептидным фрагментом, который функционирует, "экранируя", "прикрывая" или "утапливая" С-концевой участок вариабельного домена) и, в более общем смысле, к любому вариабельному домену, который имеет С-концевые участки, являющиеся доступными для растворителя. Однако, согласно одному предпочтительному, но неограничивающему аспекту изобретения, методы, способы анализа и модификации могут, в частности, применяться к вариабельным доменам тяжелой цепи (V_H доменам), и согласно одному отдельному аспекту изобретения, к V_HH доменам.

Также предусматривается, что методы, способы анализа и модификации, описанные в этом документе, могут соответственно применяться к белковым конструкциям, содержащим один или более вариабельных доменов, и, в частности, к таким конструкциям, в которых вариабельный домен образует С-концевую часть конструкции или, в случае описанных в этом документе методов и способов анализа, в которых С-концевой участок вариабельного домена по иным причинам доступен растворителю. Кроме того, в соответствии с одним предпочтительным, но неограничивающим аспектом изобретения, методы, способы анализа и модификации применяются к конструкциям, в которых V_H домен (и в частности, V_HH домен) образует С-концевую часть конструкции или, в случае методов и способов анализа данного изобретения, по иным причинам доступен растворителю.

Некоторые неограничивающие примеры таких конструкций представляют собой мультивалентные, мультиспецифичные (например, биспецифичные) или мультипаратопные (такие как бипаратопные) конструкции, которые содержат два или более ISV, связанных напрямую или посредством одного или более подходящих линкеров (и снова в соответствии с одним специфическим аспектом, V_H или V_HH доменом), образующих С-концевую часть такой конструкции. Например, и без ограничения, такая конструкция может полностью состоять из V_H доменов, и, в частности, из Нанотел (т.е. V_HH доменов, гуманизированных V_HH доменов или верблюдизированных V_H доменов), опять же связанных напрямую или посредством одного или более подходящих линкеров. В отношении некоторых неограничивающих примеров таких конструкций и общей идеи о том, как такие конструкции могут быть созданы (в частности, на основе Нанотел), можно сослаться на Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001) а также на обзорную статью Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).

Вместе с тем, также предусматривается, что изобретение может применяться к другим конструкциям, которые имеют доступный растворителю вариабельный домен и, в частности, имеют вариабельный домен на их С-конце, таким как, например, одноцепочечные Fv, и, в частности, ScFv, которые имеют вариабельный домен тяжелой цепи на С-конце.

В настоящем подробном описании и формуле изобретения термины, подобные “ISV”, “aналитический агент” и “интерференция белков”, имеют установленные ниже значения.

В частности, описанный в этом документе ISV может представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.e. отличный от Нанотела), который является VH-доменом или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Также, любой белок или полипептид, содержащий ISV (такой, как основанное на ISV лекарственное средство) предпочтительно имеет указанный (или, по меньшей мере, один) такой ISV на своем С-конце. Далее, указанный ISV может, в частности, представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.e. отличный от Нанотела), который является VH-доменом или содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Изобретение, описанное в этом документе, в частности, предназначается и пригодно для применения ISV, которые содержат, основаны на и/или получены из вариабельных доменов тяжелой цепи, таких как VH-домены (включая человеческие VH-домены), и Нанотела, такие как VHH-домены (включая гуманизированные и VHH-домены с оптимизированной последовательностью) или верблюдизированные VH-домены. Они могут быть синтетическими (например, полученными из синтезированной библиотеки и/или на основе фиксированных каркасных участков), полусинтетическими (например, гуманизированными, верблюдизированными или с оптимизированной последовательностью, или полученными путем «созревания аффинности» или пересадки CDR, начиная с природного VH или VHH домена) или VH или VHH доменами полностью природного происхождения. Изобретение, таким образом, будет в дальнейшем описано в этом документе в отношении ISV, которые представляют собой, основаны на и/или получены из VH или VHH доменов.

При разработке настоящего изобретения было обнаружено, что при использовании некоторых способов анализа (таких как, например, ADA-иммуноанализ) для исследования биологических образцов (таких как образцы крови, включая цельную кровь, сыворотку и плазму, внутриглазную жидкость, бронхоальвеолярную жидкость/BALF, спинномозговую жидкость или другие образцы биологических жидкостей) может наблюдаться белковая интерференция, и что такая белковая интерференция может порождать неспецифический сигнал в некоторых из этих способов анализа и/или в некоторых из этих образцов. Также было обнаружено, что такая белковая интерференция может иметь место не только в образцах, которые были получены от субъектов, которых лечили ISV (и в частности, Нанотелами; или белками, полипептидами или другими биологическими препаратами, которые содержат, по меньшей мере, один такой ISV или Нанотело) и/или которым вводили ISV (например, пациенты или участники клинических исследований), но также в образцах субъектов, никогда не получавших ISV (что показывает, что такая интерференция происходит, вероятно, вследствие неспецифических белок-белковых взаимодействий с уже имеющимися белками, а не какими-либо новыми только появившимися ADA).

Несмотря на то, что было обнаружено, что такая белковая интерференция и/или такой сигнал в таких способах анализа не связан с каким-либо изменением или ослаблением фармакологических свойств (таких как фармакокинетические/PK или фармакодинамические/PD свойства) ISV, было бы желательно иметь методы, пригодные для предсказания, обнаружения, уменьшения и/или, если возможно, избегания такой неспецифической белковой интерференции. Это является основной целью настоящего изобретения.

В частности, изобретение предоставляет и, в некоторых определенных, но неограничивающих aспектах, имеет отношение к:

- способам анализа, которые могут использоваться для предсказания, будет ли данный ISV подвержен такой белковой интерференции и/или приведет ли к возникновению такого (неспецифического) сигнала при таком анализе (таком как, например, ADA-иммуноанализ). Такие предсказательные способы анализа могут использоваться, например, для проверки, имеет ли данный ISV склонность порождать такую белковую интерференцию и/или такой сигнал; для выбора ISV, которые не подвержены или менее подвержены такой белковой интерференции или подаче такого сигнала; как способ анализа или тест, который может использоваться для проверки, будет ли определенная модификация(и) ISV (полностью или частично) уменьшать его склонность к порождению такой интерференции или такого сигнала; и/или как способ анализа или тест, который может использоваться для направления модификации или улучшения ISV таким образом, чтобы уменьшить его склонность к порождению такой белковой интерференции или сигнала;

- способам модификации и/или улучшения ISV в отношении устранения или уменьшения их склонности к порождению такой интерференции или такого сигнала;

- модифицированным или улучшенным ISV, которые не имеют или имеют уменьшенную склонность к порождению такой белковой интерференции или такого сигнала;

- ISV, которые были специфически отобраны таким образом (например, с помощью способа(ов) анализа, описанных в этом документе), чтобы они не имели или имели более низкую/пониженную склонность к порождению такой белковой интерференции или такого сигнала;

- модифицированным и/или улучшенным ISV, которые не имеют или имеют низкую(более низкую)/уменьшенную склонность к порождению такой белковой интерференции или такого сигнала.

Например, в первом неограничивающем aспекте изобретение имеет отношение к способу, который может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать (или иметь высокий или повышенный риск порождения) белковую интерференцию при иммуноанализе (т.е., после введения субъекту получают образец биологической жидкости от указанного субъекта, а указанный образец подвергается иммуноанализу, описанному далее в этом документе), при этом указанный способ включает проведение иммуноанализа, который, по меньшей мере, содержит этапы:

(i) контактирования указанного ISV или Нанотела (или лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела) с антителом, которое было получено от человека и которое было отобрано, создано и/или выделено, исходя из его способности распознавать и/или связываться с С-концом ISV или Нанотела (“аналитическое антитело”); и

(ii) определения, связывается ли указанный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) указанным антителом при указанном иммуноанализе.

В этом способе, когда ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела связывается указанным аналитическим антителом, можно ожидать, что указанный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела будет порождать (или иметь высокий или повышенный риск порождения) такую белковую интерференцию (как определено далее в этом документе). На основании этого, например, указанный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела могут быть модифицированы или улучшены таким образом, чтобы уменьшить или устранить их склонность к порождению такой белковой интерференции (которая опять же может быть определена при помощи вышеупомянутого способа анализа), и в этом документе будут описаны некoторые стратегии, которые могут использоваться для модификации указанного ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела (которые включают, например, присоединение небольшого количества аминокислотных остатков с С-концу и/или введение одной или более специфических аминокислотных замен).

Таким образом, в широком смысле изобретение делает доступными для специалиста способы анализа и методики, которые могут использоваться для предсказания склонности ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела порождать белковую интерференцию и/или в качестве инструмента для улучшения ISV таким образом, чтобы уменьшить или избежать их склонности к порождению белковой интерференции. С этой целью изобретение также предоставляет специалисту средства для выбора ISV, Нанотел, лекарственных средств на основе ISV или лекарственных средств на основе Нанотел, исходя из их низкой или уменьшенной способности (или отсутствия способности) порождать белковую интерференцию. Таким образом, изобретение предоставляет специалисту важный способ анализа и инструмент, который может использоваться при оптимизации и разработке ISV, Нанотел, лекарственных средств на основе ISV или лекарственных средств на основе Нанотел.

Также, как описано далее в этом документе, изобретение предоставляет специалисту ряд способов, с помощью которых ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела может быть модифицировано или улучшено таким образом, чтобы уменьшить или избежать его склонности к порождению белковой интерференции. Таким образом, изобретение в общем смысле делает доступными модифицированные и/или улучшенные ISV, Нанотела, лекарственные средства на основе ISV или лекарственные средства на основе Нанотел с уменьшенной, низкой и без какой-либо склонности к порождению белковой интерференции.

Как описано далее в этом документе, изобретение может, в частности, использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе, и в частности, при ADA-aнализе. Например, указанный ADA-aнализ может являться ADA-анализом, предназначенным для обнаружения или измерения ADA против ISV в общем смысле, и в частности, может являться ADA-анализом, предназначенным для выявления или измерения ADA против ISV, использованного на стадиях (i) и (ii) выше.

Кроме того, как упоминалось выше, описанный здесь ISV может, в частности, представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.е. отличный от Нанотела), который является VH-доменом или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Также, любой белок или полипептид, содержащий ISV (такой, как лекарственное средство на основе ISV), предпочтительно имеет указанный (или, по меньшей мере, один) такой ISV на своем С-конце. Кроме того, указанный ISV может, в частности, являться или Нанотелом или (другим) ISV (т.е. отличным от Нанотела), который представляет собой VH-домен или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Образец, тестируемый с помощью указанного способа анализа или ADA-анализа, также называется в этом документе “исследуемый образец” или “aнализируемый образец”. Во избежание путаницы “исследуемый образец” или “aнализируемый образец” не следует путать с биологическим образцом, который используется здесь в качестве исходного материала для получения (поликлонального или моноклонального) “аналитического антитела”, применяемого в изобретении.

В одном конкретном предпочтительном, но неограничивающем аспекте изобретение может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе (и, в частности, при ADA-aнализе), который подразумевает использование такого ISV. Также, указанный ADA-анализ может, например, являться, ADA-анализом, предназначенным для выявления или измерения ADA против ISV в широком смысле, и может, в частности, являться ADA-анализом для выявления или измерения ADA против ISV, использованного на стадиях (i) и (ii) выше.

В еще более конкретном, но неограничивающем аспекте изобретение может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе (и, в частности, при ADA-анализе), который предназначается для обнаружения или измерения содержания в образце каких-либо ADA к ISV. Например, такой иммуноанализ может являться одним из известных видов ADA-aнализа (в отношении которых в описании дается ссылка на предшествующий уровень техники ADA-анализов), который проводится для выявления или измерения «присутствия» каких-либо ADA к указанному ISV в “исследуемом образце”, где указанный «исследуемый образец» представляет собой образец биологической жидкости (как описано здесь), полученный от субъекта, которому был введен указанный ISV (как описано далее в этом документе).

Как описано далее в этом документе, во всех этих аспектах (и описанных здесь дополнительных аспектах изобретения), изобретение также может использоваться для выбора ISV, которые не предрасположены или менее предрасположены к такой белковой интерференции при таком иммуноанализе или ADA-анализе; в качестве способа анализа или теста, который может использоваться для проверки того, будет ли определенная модификация(и) ISV (полностью или частично) уменьшать его склонность порождать такую интерференцию при таком иммуноанализе или ADA-aнализе; и/или в качестве способа анализа или теста, который может использоваться для направления модификации или улучшения ISV таким образом, чтобы уменьшить его склонность порождать белковую интерференцию при таком иммуноанализе или ADA-анализе.

Другие аспекты, варианты осуществления, преимущества и виды применения изобретения станут понятны из дальнейшего описания.

В настоящем подробном описании, во всех случаях, когда используется термин “ISV”, необходимо понимать, что:

- такой ISV предпочтительно представляет собой Нанотело, где термин “Нанотело” в большинстве случаев представляет собой, как определено в WO 08/020079 или WO 09/138519, а в конкретном аспекте, как правило, обозначает VHH, гуманизированный VHH или верблюдизированный VH (такой, как верблюдизированный человеческий VH) или в большинстве случаев VHH с оптимизированной последовательностью (например, оптимизированной для химической стабильности и/или растворимости, максимального перекрытия с известными человеческими каркасными участками и максимальной экспрессии). Следует отметить, что термины Нанотело или Нанотела являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V. и, таким образом, могут также называться Нанотело® и/или Нанотела®);

- термин “ISV” в своем самом широком смысле также включает “биологические препараты на основе ISV ” а, в тех случаях, когда ISV представляет собой Нанотело, “биологические препараты на основе Нанотел”. “Биологический препарат на основе ISV” определяется в этом описании как белок, полипептид или другое биологическое лекарственное средство, которое содержит или фактически состоит, по меньшей мере, из одного (например, одного, двух или трех) ISV. Аналогично, “биологический препарат на основе Нанотела” определяется как белок, полипептид или другое биологическое лекарственное средство, которое содержит или фактически состоит, по меньшей мере, из одного (например, одного, двух или трех) Нанотел. Как и в случае термина “ISV”, во всех случаях, когда используется термин “биологический препарат на основе ISV”, необходимо понимать, что такой основанный на ISV биологический препарат предпочтительно является основанным на Нанотеле биологическим препаратом. В контексте настоящего изобретения как “биологический препарат на основе ISV”, так и “биологический препарат на основе Нанотела” может, например, быть моновалентным, бивалентным (или мультивалентным), биспецифическим (или мультиспецифическим) и бипаратопним (или мультипаратопным) ISV-конструкцией или Нанотело-конструкцией, соответственно. Кроме того, любой основанный на ISV или основанный на Нанотелах биологический препарат может, например, в дополнение к одному или более (например, одному, двум или трем) ISV или Нанотелам необязательно дополнительно содержать один или более (например, один или два) других дополнительных терапевтических агента и/или oдин или более (например, oдин или два) других агента, влияющих на фармакокинетические или фармакодинамические свойства биологического препарата на основе ISV или на основе Нанотела (такие как, время полужизни). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других агентов известны специалисту, и в большинстве случаев могут включать, например, какой-либо терапевтически активный белок, полипептид или другой связывающий домен или связывающую единицу, а также модификации, например, описанные на страницах 149 - 152 WO 09/138159. Биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела предпочтительно является терапевтическим или предназначается для использования в качестве терапевтического средства (что включает профилактику и диагностику) и с этой целью предпочтительно содержит, по меньшей мере, oдин ISV к терапевтически важной мишени (такой как, например, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины и т.д.). В качестве отдельных, но неограничивающих примеров таких биологических препаратов на основе ISV или на основе Нанотел можно привести различные заявки Ablynx N.V. (такие как, например, и без ограничения WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), а также, например (и без ограничения) такие заявки, как WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 и WO 07/085814. Кроме того, в настоящем подробном описании, если в этом документе ясно не указано иное, все упомянутые здесь термины имеют значение, данное в WO 09/138519 (или на предшествующем уровне техники, приведенном в WO 09/138519) или WO 08/020079 (или на предшествующем уровне техники, приведенном в WO 08/020079). Также, в тех случаях, когда способ или методика не описаны в этом документе подробно, их можно осуществить, как описано в WO 09/138519 (или на предшествующем уровне техники, приведенном в WO 09/138519) или WO 08/020079 (или на предшествующем уровне техники, приведенном в WO 08/020079).

В частности, следующие термины имеют свои первоначальные значения и/или в тех случаях, когда это применимо, могут быть определены в форме, описанной на страницах 62-75 WO 09/138519: “aгонист”, “aнтагонист”, “обратный агонист”, “неполярный незаряженный остаток аминокислоты”, “полярный незаряженный остаток аминокислоты”, “полярный заряженный остаток аминокислоты”, “идентичность последовательностей”, “абсолютно одинаковый” и “различие аминокислот” (при упоминании сравнения последовательностей двух аминокислотных последовательностей), “в основном (в) изолированной (форме)”, “домен”, “связывающий домен”, “aнтигенная детерминанта”, “эпитоп”, “к” или “направленный против” (антигена),“специфичность” и “время полужизни”. Кроме того, термины “модулирование” и “модулировать”, “сайт (участок) взаимодействия”, “специфичный к”, “перекрестно-блокировать”, “перекрестно-блокированный” и “перекрестное блокирование” и “в основном независимый от pH” имеют значения согласно определению на (и/или могут быть определены как описано на) страницах 74-79 WO 10/130832 заявителя. Также, при упоминании конструкции, coединения, белка или полипептида изобретения, термины подобные “одновалентный”, “двухвалентный” (или “мультивалентный”), “биспецифический” (или “мультиспецифический”), и “бипаратопный” (или “мультипаратопный”) могут иметь значение, данное в WO 09/138.519, WO 10/130832 или WO 08/020079.

Термин “время полужизни”, использованный в описании в отношении ISV, Нанотела, биологического препарата на основе ISV, биологического препарата на основе Нанотела или любой другой аминокислотной последовательности, соединения или полипептида, может в большинстве случаев быть определен как описано в параграфе o) на странице 57 WO 08/020079, и как там указано, относится ко времени, необходимом для уменьшения сывороточной концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида на 50% in vivo, например, вследствие деградации последовательности или соединения и/или выведения или секвестрации последовательности или соединения за счет естественных механизмов. Время полужизни in vivo аминокислотной последовательности, соединения или полипептида изобретения может быть установлено любым известным способом, например, с помощью фармакокинетического анализа. Специалисту в данной области техники будут очевидны подходящие методики, и в большинстве случаев они могут быть такими, как описано в параграфе o) на странице 57 WO 08/020079. Кроме того, как указано в параграфе o) на странице 57 WO 08/020079, время полужизни может выражаться при помощи таких параметров, как t1/2-aльфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). В этом отношении необходимо отметить, что использованный здесь термин “время полужизни”, в частности, относится к t1/2-бета или конечному времени полужизни (где t1/2-aльфа и/или AUC или оба могут не приниматься во внимание). Например, можно сослаться на Экспериментальную часть ниже, а также стандартные руководства, такие как Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Также можно сослаться на "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Аналогично, термины “увеличение времени полужизни” или “увеличенное время полужизни”, которые также определены в параграфе o) на странице 57 WO 08/020079, относятся, в частности, к увеличению t1/2-бета, вместе с или без увеличения t1/2-aльфа и/или AUC или и того и другого.

В том случае, когда термин не определяется специально в этом описании, он имеет значение, общепринятое для данной области техники, и понятное специалисту. Можно сослаться на стандартные руководства, такие как Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing и Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также на приведенный в документе общий предшествующий уровень техники.

Также в этом описании аминокислотные остатки Нанотела пронумерованы в соответствии с общепринятой нумерацией VH-доменов, данной Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применительно к VHH-доменам семейства Верблюдовых (Camelids) в статье Riechmann и Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; или в упомянутых в данном описании. В соответствии с этой нумерацией FR1 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 Нанотела содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, и FR4 Нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В этом отношении следует отметить, что (как хорошо известно в данной области техники для VH-доменов и для VHH-доменов) общее количество аминокислотных остатков в каждом CDR может варьировать и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, указанных в нумерации Kabat (имеется в виду, что одно или более положений в соответствии с нумерацией Kabat может быть не занято в имеющейся в наличии (в данной) последовательности или данная последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допускаемое нумерацией Kabat). Как правило, это означает, что нумерация в соответствии с Kabat может соответствовать или не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в данной последовательности. Однако, в большинстве случаев можно утверждать, что, согласно нумерации Kabat и независимо от числа аминокислотных остатков в CDR, положение 1 в соответствии с нумерацией Kabat coответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 в соответствии с нумерацией Kabat coответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 в соответствии с нумерацией Kabat coответствует началу FR3 и наоборот, и положение 103 в соответствии с нумерацией Kabat coответствует началу FR4 и наоборот].

Aльтернативными способами нумерации аминокислотных остатков VH-доменов, которые также могут применяться к VHH-доменам семейства верблюдовых (Camelids) и к Нанотелам, являются способы, описанные Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое “AbM определение” и так называемое “контактное определение”. Однако, в настоящем описании, аспектах и фигурах, если не указано иное, будет использоваться нумерация согласно Kabat применительно к VHH доменам в соответствии с Riechmann и Muyldermans.

Также следует отметить, что Фигуры, любые Перечни последовательностей и Экспериментальная Часть/Примеры предоставлены, чтобы дополнительно проиллюстрировать изобретение, и не должны интерпретироваться или рассматриваться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения каким-либо образом, если в этом документе ясно не указано иное.

Дополнительно следует отметить, что настоящее изобретение специально не ограничивается какой-либо причинно-следственной связью, объяснением, гипотезой или механизмом белковой интерференции (и/или возникающих при иммуноанализе сигналов), которая наблюдается в, и которая может быть снижена согласно настоящему изобретению. Однако, допускается, что кровь или сыворотка (или другие биологические жидкости, упомянутые в этом документе) некоторых индивидуумов или групп индивидуумов может содержать отдельные (предсуществующие) белки, которые в определенных условиях могут (неспецифически) связываться с ISV, что приводит к интерферирующему сигналу в некоторых способах анализа, используемых для исследования образцов крови или сыворотки, полученных от таких индивидуумов. Это основывается на сделанном при разработке настоящего изобретения наблюдении, что неспецифическая белковая интерференция, которая рассматривается настоящим изобретением, происходит не только при анализе образцов, полученных от субъектов, которым ранее были введены ISV, но также при анализе образцов, полученных от субъектов, которые ранее не получали ISV.

В частности, на основе наблюдений, сделанных при разработке настоящего изобретения, и хотя изобретение не ограничивается ими, считается, что такие предсуществующие белки могут, в частности, (способны) связываться с С-концом таких ISV (которые, в полноразмерном обычном 4-цепочечном моноклональном антителе, а также в aнтителах “только с тяжелыми цепями”, обнаруженных в семействе Верблюдовых (Camelidae), связаны с остальной частью антитела, т.е. с CH1 участком в обычных моноклональных антителах и шарнирным участком в тяжелой цепи антител Camelidae, соответственно - и таким образом в подобных полноразмерных антителах могут быть защищены от подобной белковой интерференции).

Это подтверждается данными, полученными настоящими изобретателями при разработке настоящего изобретения (которые описаны далее в этом документе), о том, что определенные (простые) модификации ISV на их C-конце могут значительно уменьшить или фактически предотвратить белковую интерференцию. Соответственно, способы модификации ISV подобным образом, а также ISV, которые были модифицированы подобным образом, составляют дополнительные аспекты изобретения, как описано далее в этом документе.

В частности, настоящее изобретение может использоваться для уменьшения или избегания белковой интерференции и/или сигналов вследствие неспецифического связывания при иммуноанализах, которые проводятся на биологических образцах (таких, как образцы крови или сыворотки), полученных от субъекта, которому вводилось (биологическое) лекарственное средство (и в этом случае такие образцы называются здесь “исследуемые образцы” или “aнализируемые образцы”). Примерами являются иммуноанализы, используемые для определения параметров распределения лекарственного средства и образования антител после введения биологического препарата субъекту, например, упомянутые в “Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacokinetics Therapeutic Proteins” (документ CHMP/EWP/89249/2004, датированный 27 января 2007), изданном Комитетом по лекарственным препаратам для применения у человека (CHMP) Европейского агентства по лекарственным средствам (EMEA). Как указано на страницах 4 и 5 этого документа:

“Было установлено несколько возможных недостатков, которые могут приводить к ошибочному определению параметров распределения лекарственного средства и образования антител. Следует рассмотреть следующие вопросы […]:

Иммуноанализ

Анализ лекарственного средства:

[…]

(iii) Интерференция с эндогенными субстанциями.

(iv) Интерференция с компонентами плазмы или антилекарственными антителами, связывающимися с исследуемым веществом и ингибирующими комплементарное связывание с иммобилизованным антителом.”

В частности, изобретение может использоваться для предсказания, уменьшения или предотвращения этого типа интерференции при иммуноанализах, которые используются при анализе исследуемых образцов/анализируемых образцов биологических жидкостей, взятых у субъектов, которым вводились ISV (и, в частности, Нанотела; или биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотел, как определено далее в этом документе).

Изобретение может, в частности, использоваться для предсказания, уменьшения или предотвращения этого типа (неспецифической) белковой интерференции при иммуноанализах, которые используются для определения параметров распределения лекарственного средства и/или для определения образования каких-либо ADA (антилекарственных) антител. В этом отношении следует отметить, что в большинстве случаев в данном подробном описании и в прилагаемой формуле изобретения при использовании формулировки “предсказание, уменьшение или предотвращение белковой интерференции” включается не только предсказание, уменьшение или предотвращение такой белковой интерференции как таковое, но также предсказание, уменьшение или предотвращение появления неспецифических сигналов при иммуноанализах (таких, в которых могут иметь место (неспецифические) сигналы, связанные с белковой интерференцией, например, при ADA-анализах), и, в частности, предсказание, уменьшение или предотвращение при таких иммуноанализах появления неспецифических сигналов, которые в том случае, когда они наблюдаются в таком анализе, как правило, объясняются, связываются с и/или считаются признаком (неспецифической) белковой интерференции. В этом отношении следует отметить, и как указано в этом документе, настоящее изобретение не ограничивается какой-либо причинно-следственной связью, объяснением, гипотезой или механизмом.

В одном специфическом, но неограничивающем аспекте изобретение может использоваться для предсказания, предотвращения или уменьшения белковой интерференции при анализе “антилекарственных антител ” или “ADA”, который проводится на образцах (т.е., “исследуемых образцах”) биологических жидкостей, взятых у субъектов, которым были введены ISV (и, в частности, Нанотела; или биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотел).

В другом специфическом, но неограничивающем аспекте изобретение может использоваться для предсказания, предотвращения или уменьшения белковой интерференции (и/или неспецифических сигналов, как правило, связанных с тем же самым) при анализе “антилекарственных антител” или “ADA”, который используется для обнаружения, измерения и/или описания присутствия (каких-либо) антилекарственных антител к одному или более ISV (и, в частности, к Нанотелам; или биологическому препарату на основе ISV или биологическому препарату на основе Нанотел, как определено далее в этом документе). В частности, изобретение может использоваться для предсказания, предотвращения или уменьшения такой белковой интерференции при анализе “антилекарственных антител” или “ADA”, который проводится на образцах (т.е., “исследуемых образцах”) биологических жидкостей, и конкретнее на образцах биологических жидкостей, полученных от субъектов, которым был введен один или более таких ISV или Нанотел (биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела, как определено далее в этом документе). Например, изобретение может использоваться для предсказания, предотвращения или уменьшения белковой интерференции при таком анализе “антилекарственных антител” или “ADA”, который используется для выявления, измерения и/или описания присутствия (каких-либо) антилекарственных антител к ISV или Нанотелу (или биологическому препарату на основе ISV или биологическому препарату на основе Нанотела, как определено далее в этом документе), которые вводились субъекту, от которого был получен образец (или в рамках клинического исследования или в ходе терапии).

Таким образом, в одном отдельном, но неограничивающем, aспекте изобретение может использоваться для предсказания, предотвращения или уменьшения белковой интерференции (и/или неспецифических сигналов, обычно связанных с тем же самым) в биологических образцах (т.е., “исследуемых образцах”), полученных от субъекта, которому вводился один или более таких ISV или Нанотел (или биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела, как определено далее в этом документе), при этом указанные образцы пригодны для и/или предназначены для использования при иммунологическом анализе, таком как ADA-aнализ. Как указано, такой биологический образец может представлять собой кровь (включая цельную кровь, сыворотку или плазму), внутриглазную жидкость, бронхоальвеолярную жидкость/BALF, спинномозговую жидкость или любую другую подходящую биологическую жидкость или образец, подходящий для использования при иммуноанализе, и, в частности, ADA-aнализе.

В одном конкретном, но неограничивающем aспекте такой исследуемый образец может быть получен от субъекта, который подвергался многократным введениям (например, по меньшей мере, от 1 дo 3 отдельных введений в течение периода, по меньшей мере, 10 дней, такого как, по меньшей мере, oдин месяц или более) и/или длительному лечению (т.е. лечению в течение, по меньшей мере, 10 дней, такому как, по меньшей мере, один месяц) ISV, Нанотела, биологического препарата на основе ISV (как определено далее в этом документе) или биологического препарата на основе Нанотела (как определено далее в этом документе). Такой ISV, Нанотело, биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела может вводиться указанному субъекту, например, в рамках терапии или в рамках клинического исследования.

В одном конкретном, но неограничивающем aспекте исследуемый образец может быть получен от субъекта, которому вводится ISV, Нанотело, биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела, который имеет (и/или обеспечен) увеличенное время полужизни (как указано в этом документе, и по сравнению с одновалентным ISV), например, время полужизни, по меньшей мере, 1 день, предпочтительно, по меньшей мере, 3 дня, более предпочтительно, по меньшей мере, 7 дней, например, по меньшей мере, 10 дней, у субъекта, которому вводится/вводилось то же самое.

Например, и без ограничения, такой ISV, Нанотело, биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела может приобрести увеличенное время полужизни путем функционализации и/или путем включения в конструкцию фрагмента или связывающей единицы, которая увеличивает время полужизни конструкции. Примеры такой функционализации, фрагменты или связывающие единицы понятны специалисту и могут включать пегилирование, слияние с сывороточным альбумином или слияние с пептидом или связывающей единицей, которая может связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин. Такой связывающий сывороточный альбумин пептид или связывающий домен может представлять собой любой подходящий связывающий сывороточный альбумин пептид или связывающий домен, способный увеличивать время полужизни конструкции (по сравнению с аналогичным конструкцией без связывающего сывороточный альбумин пептида или связывающего домена), и может, в частности, являться связывающим сывороточный альбумин пептидом, как описано заявителем в WO 2008/068280 (и, в частности, WO 2009/127691 и в неопубликованной предварительной заявке США 61/301,819), или связывающим сывороточный альбумин ISV (таким как связывающее сывороточный альбумин Нанотело; например Alb-1 или гуманизированный вариант Alb-1, например, Alb-8, который упоминается в WO 06/122787).

Таким образом, в одном конкретном, но неограничивающем aспекте такой биологический образец может быть получен от субъекта, которому был введен ISV, Нанотело, биологический препарат на основе ISV или биологический препарат на основе Нанотела, содержавший (человеческий) связывающий сывороточный альбумин пептид или связывающий домен.

Как уже упоминалось выше, в одном неограничивающем aспекте изобретение в широком смысле имеет отношение к способу, который может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать (или имеет высокую или повышенную склонность к порождению) белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе (т.е. после введения указанного ISV субъекту получают образец биологической жидкости от указанного субъекта, и указанную биологическую жидкость подвергают иммуноанализу, как описано далее в этом документе), при этом указанный способ, включает проведение иммуноанализа, содержащего, по меньшей мере, стадии:

(i) контактирования указанного ISV или Нанотела (или лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела) с антителом, которое было получено от субъекта (человека) и было выбрано, создано и/или выделено, исходя из его способности распознавать и/или связываться с C-концом ISV или Нанотелом (“aналитическое антитело”); и

(ii) установления, связывается ли указанное ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) указанным антителом при указанном иммуноанализе.

И в этом случае, описанный в этом документе ISV может, в частности, являться Нанотелом или (другим) ISV (т.е. отличным от Нанотела), который представляет собой VH-домен или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Также, любой белок или полипептид, содержащий ISV (такой, как лекарственное средство на основе ISV), предпочтительно имеет указанный (или, по меньшей мере, oдин) такой ISV на своем C-конце. Кроме того, указанный ISV может, в частности, представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.е. отличный от Нанотела), который представляет собой VH-домен или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

В aльтернативном варианте осуществления, также описанном далее в этом документе, вместо вышеупомянутого антитела, полученного от человека, может использоваться моноклональное антитело, называемое в этом документе "21-4-3" (или "21-4" для краткости, смотри SEQ ID NO 35 и 36 для последовательностей VH и VL). 21-4 было создано при помощи гибридомной технологии, начиная с мыши, иммунизированной конструкцией Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825, как описано далее в Примере 7, а гибридомная клеточная линия (названная “ABH0015”), экспрессирующая 21-4 была депонирована 4 июня 2012 в коллекции микроорганизмов BCCM, Ghent, Бельгия, под учетным номером LMBP-9680-CB. Было показано, что мoноклональное 21-4 распознает C-конец конструкции Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825, C-конец которого cостоит из Нанотела (гуманизированного V_HH), полученного к фактору фон Виллебранда (vWF). Первоначально 21-4 было индуцировано как aналитический реагент для использования при выявлении белка Нанотел (в частности, конструкции Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825) в образцах (сыворотки); неожиданно, в настоящее время было обнаружено, что 21-4 может также использоваться для предсказания, имеет ли ISV склонность подвергаться неспецифической белковой интерференции (больше, чем некоторые другие сравнимые (мышиные) моноклональные антитела, полученные к конструкции Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825 или к другому Нанотелу).

В частности, было обнаружено, что если измерение связывания 21-4 с ISV (или с белком или полипептидом, содержащим ISV на своем C-конце, или аналогичным белком или полипептидом, как указано в этом документе) дает значение RU менее, чем 500 (после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной массы белка, в соответствии с формулой [измеренное RU]/[MW белка] x 10⁶) при определении согласно протоколу, изложенному в Примере 9, в этом случае указанный ISV или белок не будет, вероятно, иметь склонности подвергаться белковой интерференции (в пределах достоверности данных, изложенных в Примерах ниже). Для использования в вышеизложенной формуле MW (молекулярная масса) может быть вычислена как сумма всех MW всех аминокислотных остатков, присутствующих в ISV.

Соответственно, любой ISV, белок или полипептид, описанный в этом документе, предпочтительно имеет значение RU для связывания 21-4 менее, чем 500 (установленное в соответствии с протоколом, изложенным в Примере 9, и после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной масса использованного ISV или белка, в соответствии с изложенной выше формулой).

Таким образом, этот аспект изобретения в основном имеет отношение к способу, который может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать (или имеет ли высокую или повышенную склонность к порождению) белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе (т.е. после введения указанного ISV субъекту, от указанного субъекта получают образец биологической жидкости, а указанная биологическая жидкость подвергается иммуноанализу, как описано далее в этом документе), при этом указанный способ, включает проведение иммуноанализа, содержащего, по меньшей мере, стадии:

(i) контактирования указанного ISV или Нанотела (или лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела) с моноклональным антителом 21-4 (т.е. используемым в качестве “aналитического антитела”); и

(ii) установления, связывается ли указанное ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) моноклональным антителом 21-4 при указанном иммуноанализе.

Указанный способ может, в частности, осуществляться с использованием BiaCore или аналогичного технического оснащения, и конкретнее, с использованием протокола, изложенного в Примере 9. Как указано в этом документе, когда связывание ISV или лекарственного средства на основе ISV в этом протоколе показывает значение RU менее, чем 500 (после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной массы белка, в соответствии с формулой [измеренное RU]/[MW белка] x 10⁶), указанный ISV или основанный на ISV белок, вероятно, не будет связываться каким-либо фактором(ами) интерференции, присутствующими в крови или сыворотке человека, и/или вероятно не будет иметь склонности подвергаться неспецифической белковой интерференции при ADA-aнализе (т.е. в пределах степени достоверности, изложенных в экспериментальной части ниже).

И в этом случае, как указано в этом документе, описанный ISV может, в частности, представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.е. отличный от Нанотела), который является VH-доменом или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Также, любой белок или полипептид, содержащий ISV (такой, как лекарственное средство на основе ISV) предпочтительно имеет указанный (или, по меньшей мере, oдин) такой ISV на своем С-конце. Более того, указанный ISV может, в частности, представлять собой Нанотело или (другой) ISV (т.е. отличный от Нанотела), который является VH-доменом или который содержит VH-домен; и предпочтительно является Нанотелом.

Как уже указано в этом документе, вышеупомянутый способ с использованием 21-4 также может применяться для установления, связывается ли ISV или белок или полипептид, содержащий ISV, (или имеет склонность связываться) с фактором(ами) интерференции, которые присутствуют в крови или сыворотке человека.

Также, как указано в этом документе, предусматривается, что указанный способ с использованием 21-4 также может применяться для предсказания, будет ли какой-либо белок или полипептид (такой, как фрагмент антитела или ScFv), имеющий VH-домен на своем С-конце, связываться (или обладать склонностью связываться) с фактором(ами) интерференции, которые присутствуют в крови или сыворотке человека, и/или иметь склонность к белковой интерференции при ADA-aнализе.

В дополнение к 21-4 предусматривается, что антитело или фрагмент антитела (например, подходящий Fab-фрагмент), содержащий вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи 21-4 (смотри SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно), или даже только CDR-последовательности 21-4 (подходящим образом пересаженные в другие удобные VH и VK каркасы) также может использоваться в описанных здесь способах.

Как описано далее в этом документе, изобретение, в частности, может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе, который представляет собой ADA-aнализ. Указанный ADA-aнализ, например, может представлять собой ADA-aнализ для выявления или измерения ADA к ISV, и в частности, может представлять собой ADA-aнализ для обнаружения или измерения ADA к ISV, используемым на стадиях (i) и (ii) выше.

В одном отдельном предпочтительном, но неограничивающем aспекте изобретение может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее в этом документе) при иммуноанализе (и, в частности, при ADA-aнализе), который подразумевает использование такого ISV. И в этом случае указанный ADA-aнализ может, например, представлять собой ADA-aнализ для выявления или измерения ADA к ISV и может, в частности, являться ADA-aнализом для выявления или измерения ADA к ISV, используемым на стадиях (i) и (ii) выше.

В еще более конкретном, но неограничивающем aспекте изобретение может использоваться для предсказания, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать белковую интерференцию (как описано далее) при иммуноанализе (и, в частности, при ADA-aнализе), который подразумевает использование такого ISV. Например, такой иммуноанализ может являться ADA-aнализом (т.е. с участием ISV), который проводится для выявления или измерения присутствия каких-либо ADA к указанному ISV в тестируемом образце, где указанный образец представляет собой образец биологической жидкости (как описано в этом документе), который получен от субъекта, которому был введен указанный ISV (как описано далее в этом документе). Например, как указано далее в этом документе, указанный образец (т.е., “исследуемый образец”) может быть образцом жидкости (включая цельную кровь, сыворотку или плазму), внутриглазной жидкости, бронхоальвеолярной жидкости/BALF, спинномозговой жидкости или любой другой подходящей биологической жидкости, и может, в частности, представлять собой биологический образец, подходящий и/или предназначенный для использования при иммунологическом анализе, таком как ADA-aнализ.

Как описано далее в этом документе, во всех этих аспектах (и дополнительных аспектах изобретения, описанных в этом документе), изобретение также может использоваться для выбора ISV, которые не подвержены или менее подвержены белковой интерференции в таких иммуноанализах или ADA-анализах; в качестве анализа или теста, который может использоваться для проверки, будет ли определенная модификация(и) ISV (полностью или частично) уменьшать его склонность порождать такую интерференцию при иммуноанализах или ADA-aнализах; и/или в качестве анализа или теста, который может использоваться для направления модификации или улучшения ISV таким образом, чтобы уменьшить его склонность к порождению белковой интерференции при таких иммуноанализах или ADA-aнализах.

Как уже было указано, стадия (i) способа изобретения включает контактирование указанного ISV или Нанотела (или лекарственного средства на основе ISV или на основе Нанотела) с антителом, которое было получено от субъекта (человека) и которое было выделено, исходя из его способности распознавать и/или связываться с С-концом ISV или Нанотелом (как описано далее в этом документе). На указанной стадии (i) описанного в этом документе способа “указанный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела)” используется в качестве антигена в иммуноанализе (т.е. в качестве субстанции, предназначенной для обнаружения). Также, на указанной стадии (i), “антитело, которое было получено от субъекта (человека) и которое было выбрано/выделено на основе его способности распознавать и/или связываться с С-концом ISV или Нанотела”, используется в качестве аналитического реагента (т.е. тем же самым способом, как и другие антитела используются при иммуноанализе для выявления присутствия антигена, к которому они специфичны).

Как уже было указано, и для лучшего понимания описанного здесь изобретения, следует отметить, что, на стадии (i) ISV в большинстве случаев будет использоваться в качестве “aнтигена” (т.е., в качестве предназначенного для обнаружения соединения), и “аналитическое антитело” будет использоваться в качестве аналитического агента (т.е., в качестве средства для определения, связывается ли данный ISV или нет, соответственно; и таким образом имеет ли высокий или повышенный риск порождения белковой интерференции или нет, соответственно). Например, когда стадия (i) осуществляется в формате ELISA, “aнтитело/аналитический агент” как правило будет связываться с носителем (т.е., с планшетом для ELISA), а ISV будет находиться в исследуемом образце.

Следует отметить, что в отличие от этого при ADA-анализе для выявления или измерения ADA к ISV в качестве “аналитического агента” используется ISV (т.е., в качестве соединения, используемого для обнаружения присутствия каких-либо ADA), а ADA являются “aнтигеном” (т.е., предназначенным для обнаружения соединением). Таким образом, в таких анализах ISV будет обычно/часто связан с носителем (например, планшетом для ELISA), тогда как ADA (при наличии таковых) будут присутствовать в образце, подвергаемом анализу.

Однако, как уже было указано, необходимо в общих чертах отметить, что изобретение не ограничивается способами анализа, в которых “аналитическое антитело” связывается с носителем. Например, в альтернативном способе осуществления анализа в соответствии с изобретением (как показано в Примере 5) аналитическое антитело вместо этого используется в качестве мостикообразующего агента и таким образом не будет связано с планшетом, а будет находиться в растворе (хотя оно является косвенно связанным с планшетом посредством ISV, которым покрыт планшет). Однако, также в отдельном («мостиковом») способе анализа, описанном в Примере 5 (который представляет собой конкурентный анализ), аналитическое антитело по-прежнему используется в качестве аналитического агента (т.е. для определения, связывается ли представляющий интерес ISV или нет, соответственно; и, таким образом, имеет высокий или повышенный риск порождения белковой интерференции или нет, соответственно). Кроме того, предусматривается, что на основе дальнейшего раскрытия специалист сможет разработать другие форматы анализа, в которых аналитическое антитело может быть использовано в качестве аналитического агента для определения, сможет ли данный ISV связываться, и таким образом имеет ли он высокий или повышенный риск порождения белковой интерференции или нет).

Используемое на стадии (i) “аналитическое антитело” может являться поликлональным или моноклональным антителом.

В том случае, если аналитическое антитело является поликлональным антителом, оно может, например, являться поликлональным антителом (препаратом), которое было получено/очищено/выделено из биологического образца, полученного от субъекта (человека) (такого как кровь, плазма, B-клетки или другой подходящий биологический образец или жидкость, из которой поликлональные антитела могут быть выделены соответствующим образом). Это может быть, например, подходящий биологический образец, который получен от человека, которому был введен, по меньшей мере, oдин ISV (такой как ISV, используемый на стадии (i), однако это не является обязательным или необходимым), но также это может быть (и предпочтительно является) подходящий биологический образец, полученный от человека, который никогда не получал или которого никогда не лечили ISV. Более важным является то, что поликлональное антитело получают из указанного биологического образца способом, который включает, по меньшей мере, oдну аффинную стадию с использованием aффинной матрицы или колонки, несущей ISV в качестве аффинной группы (и oдну или более дополнительных стадий для получения/очистки/выделения поликлональных антител, известных per se). Например, поликлональное антитело может быть получено из такого биологического образца посредством аффинной хроматографии с использованием aффинной колонки, несущей ISV, как описано, например, в Примере 2. Например, это можно осуществить с помощью хорошо известных методов иммуноаффинной хроматографии для выделения антител из биологического образца с использованием aффинной матрицы, несущей ISV в качестве антигена. Как правило, такие методы известны в данной области техники, и их подходящие примеры будут понятны специалисту, исходя из раскрытия в этом документе.

В частности, такое поликлональное антитело (препарат) может представлять собой IgG (или фракцию IgG).

Например, это может быть поликлональное антитело, полученное методом, включающим (иммуно)аффинную хроматографию, проводимую на образце биологической жидкости, полученной от человека, с использованием в качестве антигена связанного с aффинной матрицей ISV (и, в частности, Нанотела, такого как VHH, гуманизированный VHH и/или VHH с оптимизированной последовательностью или верблюдизированный VH, такой как верблюдизированный человеческий VH), который не содержит C-концевого маркера (т.е., С-конец которого оканчивается аминокислотной последовательностью VTVSS (SEQ ID NO:33)). В частности, ISV, используемый в качестве антигена, связанного с аффинной матрицей, может являться гуманизированным VHH или VHH с оптимизированной последовательностью (или, альтернативно, соответствующим верблюдизированным человеческим VH), С-конец которого оканчивается аминокислотной последовательностью VTVSS (SEQ ID NO:33). В одном отдельном, но неограничивающем aспекте, используемый в качестве антигена связанный с аффинной матрицей ISV может являться гуманизированным VHH или VHH с оптимизированной последовательностью, который в результате такой гуманизации или оптимизации последовательности содержит остаток пролина (P) в положении 14, тогда как соответствующий интактный (“наивный”) VHH coдержит аланин (A) в положении 14 (другими словами, ISV, используемый в качестве антигена, представляет собой гуманизированный вариант VHH, который в естественном виде coдержит аланин в положении 14, при этом остаток аланина в результате гуманизации или оптимизации последовательности был замещен остатком пролина (P)). ISV, используемый в качестве антигена, также может содержать одну или более аминокислотных замен вследствие такой гуманизации или оптимизации последовательности, например, как в целом описано в WO 08/020079 или WO 09/138519.

Некоторые конкретные примеры ISV, которые можно использовать в качестве антигена для создания/выделения “аналитического антитела”, даны в SEQ ID NO: 1 и 2.

Далее, способ, используемый для получения поликлонального антитела, в дополнение к (иммуно)аффинным стадиям также может включать одну или более дополнительных стадий для выделения/очистки поликлонального антитела из биологического образца (осуществляемых до или после аффинных стадий). И в этом случае, такие стадии и методы их осуществления будут понятны специалисту.

Таким образом, в одном аспекте изобретение включает способ, который содержит описанные здесь стадии (i) и (ii), в котором “аналитическое антитело” (т.е., антитело, которое было получено от субъекта (человека) и которое было выбрано/выделено, исходя из его способности распознавать и/или связываться с C-концом ISV или Нанотела) было получено из биологического образца, полученного от человека, (при этом указанный биологический образец представляет собой образец, подходящий для использования в способе создания/выделения антитела из указанного образца) с использованием способа, содержащего, по меньшей мере, oдну аффинную стадию (такую, как стадия аффинной хроматографии, например, иммуноаффинной хроматографии), в которой ISV (и предпочтительно, Нанотело) используется в качестве aнтигена, и предпочтительно ISV используется в качестве aнтигена, который содержит аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) в качестве С-концевой последовательности, и более предпочтительно, гуманизированное Нанотело или Нанотело с оптимизированной последовательностью используется в качестве антигена, который содержит аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) в качестве С-концевой последовательности, и даже более предпочтительно, гуманизированное Нанотело или Нанотело с оптимизированной последовательностью используется в качестве антигена, который содержит аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) в качестве С-концевой последовательности, и который содержит остаток пролина в положении 14, такое как Нанотело, содержащее аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) в качестве С-концевой последовательности и содержащее остаток пролина в положении 14, который был введен в Нанотело в результате указанной гуманизации или оптимизации последовательности (например, для замещения остатка аланина, который естественным образом находится в указанном положении VHH, который был гуманизирован и/или последовательность которого была оптимизирована).

Вышеупомянутые ISV также могут использоваться в способах выделения моноклональных антител (снова начиная с полученного от человека подходящего биологического образца), которые подходят для использования в изобретении в качестве “аналитического антитела”.

Например, такое моноклональное антитело может быть получено из крови, B-клеток или другого подходящего образца или материала для выделения антител, может быть отобрано на основе его способности распознавать или связываться с (С-концом) ISV или Нанотелом (в котором ISV, используемый в качестве антигена в ходе скрининга и/или селекции, предпочтительно является таким, как описано в предыдущих абзацах, включая установленные для такого ISV/aнтигена предпочтения). Такой скрининг и селекция могут осуществляться любым удобным способом, например, с использованием B-клеточной селекции и/или методов размножения, в основном таких же или аналогичных методам B- клеточной селекции, описанным в EP 0 488 470, WO 92/02551, EP 1 633 787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 или WO 04/106377, или методами, аналогичными методике наноклонов (Nanoclone technique), описанной в WO 06/079372 (но с использованием человеческих B-клеток, а не B-клеток верблюда).

После того, как была установлена/выделена oдна или более B-клеток, экспрессирующих подходящее антитело, указанное антитело может быть выделено, экспрессировано и/или получено любым подходящим способом. Например, указанная B-клетка(и) может быть иммортализована как гибридома, производящая желаемое антитело/антитела (с использованием методик, хорошо известных per se, для создания гибридом, начиная с отобранных B-клеток), и указанное антитело/антитела затем могут быть выделены из (культурального супернатанта) указанной гибридомы(дом), снова с использованием подходящих методик, общепризнанных в данной области техники и описанных в различных руководствах, а также описанных и/или указанных патентных публикациях, упомянутых в предыдущем абзаце.

Альтернативно, указанная B-клетка(и) может быть размножена с использованием известных методов размножения B-клеток, и антитело/антитела могут быть выделены из (культурального супернатанта) указанной размноженной B-клетки(ок). И в этом случае, это можно осуществить с использованием подходящих методов, общепризнанных в данной области техники и описанных в различных руководствах, а также описанных и/или указанных в патентных публикациях, упомянутых в предыдущих абзацах.

В еще одном альтернативном случае, может быть получена ДНК, кодирующая представляющее интерес антитело/антитела (например, путем амплификации) из указанной B-клетки(ок) или других подходящих клеток, или непосредственно (например, с использованием подходящих методик ПЦР-клонирования единичных клеток) или после соответствующего размножения желательной B-клетки(ок). Указанную ДНК затем можно соответствующим образом экспрессировать в подходящей клетке-хозяине или организме-хозяине для обеспечения желаемого антитела/антител. И в этом случае, это можно осуществить с использованием подходящих методов, общепризнанных в данной области техники и описанных в различных руководствах, а также описанных и/или указанных в патентных публикациях, упомянутых в предыдущих абзацах.

Также возможно создание моноклональных антител, подходящих для использования в качестве “аналитического антитела”, способом, который подразумевает «репертуарное клонирование» (начиная с подходящего образца, полученного от субъекта (человека)) и отбор клонированного «репертуара» на предмет нахождения антител, которые связываются с ISV, использованным в качестве антигена (причем и в этом случае ISV(s), используемый в качестве антигена в ходе скрининга и/или селекции, предпочтительно представляет собой, как описано в предыдущих абзацах, включая предпочтения, установленные для такого ISV/aнтигена). Способы «репертуарного» клонирования и различные методы наглядного представления клонированных «репертуаров» для селекции и скрининга (такие как фаговый дисплей, рибосомальный дисплей и дрожжевой дисплей) понятны специалисту и описаны, например, в EP 0 589877, EP 0 774 511, WO 90/14430 и EP 0368 684), а также в различных руководствах по этому вопросу.

В целом, биологический образец, который используется в качестве отправной точки для получения (поликлонального или моноклонального) аналитического антитела, может являться любым подходящим образцом (т.е. подходящим в качестве исходного материала для получения поликлонального или моноклонального антитела, соответственно), полученным от любого подходящего субъекта (человека). Например, в одном отдельном, но неограничивающем aспекте такой образец может быть получен от женщины, и, в частности, женщины в постклимактерическом периоде. Таким образом, в одном отдельном, но неограничивающем aспекте аналитическое антитело, используемое на указанных выше стадиях (i) и (ii), было получено начиная с биологического образца, взятого/полученного от женщины в постклимактерическом периоде (или был получен из антитела, взятого/полученного от женщины в постклимактерическом периоде).

Также, биологический образец, используемый в качестве отправной точки для получения поликлонального или моноклонального аналитического антитела, может быть получен от субъекта, которому ранее был введен ISV (например, в рамках клинического исследования или с терапевтической целью), но предпочтительно его получают от субъекта, которому ранее не вводился ISV.

Однако, следует отметить, что изобретение не ограничивается, в частности, источником используемого аналитического антитела/антител, а в некоторых случаях с использованием описанных в этом документе методик доказана возможность получения (создания, выделения) других подходящих аналитических антител из других источников, включая коммерчески доступную кровь или плазму человека (и даже кровь, плазму или B-клетки других видов млекопитающих или приматов, таких как павиан или яванский макак).

Как уже было упомянуто выше, используемое на стадиях (i) и (ii) (поликлональное или моноклональное) аналитическое антитело должно быть способно распознавать или связываться с С-концом ISV или Нанотела и наиболее предпочтительно является выбранным и/или выделенным, исходя из его способности связываться с С-концом ISV или Нанотела.

Как видно из Фигуры 2, в том случае, когда ISV основан или получен из VH или VHH-домена, С-конец ISV coдержит аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33), и, соответственно, аналитическое антитело должно быть способно распознавать любой ISV, имеющий аминокислотную последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) на своем С-конце. Кроме того, как видно из Фигуры 2, (по меньшей мере, некоторые аминокислотные остатки в) последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) является частью предполагаемого эпитопа на ISV, который также включает, среди других остатков, аминокислотный остаток в положении 14 (и аминокислотные остатки, граничащие/близкие к такому же положению в аминокислотной последовательности, такие как положения 11, 13 и 15), и также может coдержать аминокислотный остаток в положении 83 (и аминокислотные остатки, граничащие/близкие к такому же положению в аминокислотной последовательности, такие как положения 82, 82a, 82b и 84) и/или аминокислотный остаток в положении 108 (и аминокислотные остатки, граничащие/близкие к такому же положению в аминокислотной последовательности, такие как положение 107). Например, положение 109 является первым V C-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33) последовательности, и было показано, что положение 110 также может влиять на белковую интерференцию). Кроме того, упоминаемый в этом документе в обобщенном смысле “C-концевой участок” подразумевает, что этот C-концевой участок, по меньшей мере, coдержит C-концевую последовательность VTVSS (SEQ ID NO:33) и аминокислотный остаток в положении 14, и также может coдержать аминокислотные остатки в положениях 83 и 108, и, возможно, также аминокислотные остатки в положениях 13, 15, 82b, 83, 84 и 107.

Без ограничения какой-либо гипотезой или объяснением и как уже было сказано, в полноразмерном 4-цепочечном антителе или в полноразмерном антителе, состоящем только из тяжелой цепи, таком как антитела представителей семейства Верблюдовых, C-конец VH или VHH-домена связан с остальной частью антитела (т.е. с CH1 участком обычного моноклонального антитела или шарнирным участком антител представителей семейства Верблюдовых, состоящих только из тяжелой цепи, соответственно), и таким образом, в таких полноразмерных антителах может быть защищен от белковой интерференции и/или «скрыт» взаимодействием VH/VL (в обычных 4-цепочечных антителах) так, что этот “C-концевой участок”, как правило, не является гидрофильным и/или доступным в качестве участка взаимодействия с белками, присутствующими в крови, сыворотке или организме субъекта, которому вводится такой ISV. Однако, если ISV или Нанотело используется в чистом виде (per se) (т.е. не будучи связанным с какой-либо другой частью антитела), или если используется лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела, которое несет ISV или Нанотело на своем С-конце, этот С-концевой эпитоп доступен для (неспецифического) взаимодействия с другими белками, и снова без ограничения какой-либо гипотезой или объяснением, допускается, что этот С-концевой участок может быть теперь доступным для (неспецифического) взаимодействия с одним или более белками, предсуществующими в “исследуемом образце” (например, oдним или более IgG), и что это может явиться причиной белковой интерференции и/или неспецифических сигналов при иммуноaнализе (и, в частности, при ADA-анализе).

Как указано, описанные в этом документе способы могут использоваться для предсказания, уменьшения или предотвращения белкового взаимодействия, а также могут использоваться в качестве инструмента для направления модификации ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела таким образом, чтобы обеспечить перечисленное вместе с (частично или, предпочтительно, практически полностью) уменьшенной склонностью к порождению белковой интерференции.

В частности, как видно из предыдущего абзаца и снова без ограничения какой-либо гипотезой или объяснением, предполагается (и является частью идеи настоящего изобретения), что (определенные) модификации “С-концевого участка” будут изменять (и, предпочтительно, уменьшать) склонность ISV к неспецифическому белковому взаимодействию, что также наблюдается экспериментально (смотри, например, экспериментальные результаты, представленные в Примерах 1C и 3 ниже).

На этом основании и cнова без ограничения какой-либо гипотезой или объяснением, настоящее изобретение также предлагает определенные модификации, которые могут быть введены для этой цели в С-концевой участок ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела ((потенциальная) эффективность которых может быть проанализирована с использованием описанных в этом документе способов). Также, на основании представленных в документе идей, предусматривается, что специалист сможет выбрать, создать или предложить другие (возможные) модификации С-концевого участка, которые могли бы быть введены для этой цели (и (потенциальная) эффективность которых и в этом случае может быть проанализирована с использованием описанных в этом документе способов).

Возвращаясь к аналитическому антителу, использованному в изобретении, предпочтительно оно представляет собой (поликлональное или моноклональное) aнтитело, которое распознает С-концевой участок (определенный выше) ISV, и, в частности, но без ограничения, С-концевой участок Нанотела.

Например, в одном отдельном, но неограничивающем aспекте “аналитическое антитело” может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело, которое распознает (и/или способно связываться с и, в частности, специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела, С-конец последовательности которого оканчивается VTVSS (SEQ ID NO:33), но не распознает (и/или не способно специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела (которое может являться другим ISV, но предпочтительно представляет собой тот же ISV) в том случае, когда имеется один или более дополнительных аминокислотных остатков (например, от 1 дo 5 аминокислотных остатков, или, альтернативно, небольшая пептидная последовательность или даже другой полипептид или белок), связанных с С-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33).

В другом, более конкретном, но по-прежнему неограничивающем aспекте, “аналитическое антитело” может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело, которое распознает (и/или способно связываться с и, в частности, специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела, С-конец последовательности которого оканчивается VTVSS (SEQ ID NO:33), и в котором положение 14 занимает аминокислота, которая не встречается в положении 14 в природе, и/или модифицирована по сравнению с аминокислотой, которая находится в положении 14 в природной последовательности (например, в результате гуманизирования, верблюдизирования и/или оптимизации последовательности), но которое не распознает (и/или не способно специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела (который может являться другим ISV, но предпочтительно представляет собой тот же самый ISV), в котором имеется один или более дополнительных аминокислотных остатков (например, от 1 дo 5 аминокислотных остатков или, альтернативно, небольшая пептидная последовательность или даже другой полипептид или белок), связанных с С-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33); и/или в котором положение 14 занято аминокислотой, которая в естественных условиях находится в положении 14 (например, аланином или, в том случае, когда ISV от природы содержит пролин в положении 14, пролином).

Например, “аналитическое антитело” также может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело, которое распознает (и/или способно связываться с и, в частности, специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела, С-конец последовательности которого оканчивается VTVSS (SEQ ID NO:33) и в котором положение 14 занимает пролин (и, в частности, в том случае, когда положение 14 было изменено на пролин, например, в результате гуманизирования, верблюдизирования и/или оптимизации последовательности), но не распознает С-концевой участок ISV или Нанотела (который может быть другим ISV, но предпочтительно представляет собой тот же самый ISV), в котором имеется один или более дополнительных аминокислотных остатков (например, от 1 дo 5 аминокислотных остатков или, альтернативно, небольшая пептидная последовательность или даже другой полипептид или белок), связанных с С-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33); и/или в котором положение 14 занято аланином.

“Аналитическое антитело” также может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело, которое распознает (и/или способно связываться с и, в частности, специфически связываться с) С-концевой участок ISV или Нанотела, С-конец последовательности которого оканчивается VTVSS (SEQ ID NO:33) и положение 14 которого занимает пролин (в частности, в том случае, если остаток пролина от природы находится в указанном положении в указанном ISV), но не распознает С-концевой участок ISV или Нанотела (которое может являться другим ISV, но предпочтительно представляет собой тот же самый ISV), в котором имеется один или более дополнительных аминокислотных остатков (например, от 1 дo 5 аминокислотных остатков или, альтернативно, небольшая пептидная последовательность или даже другой полипептид или белок), связанных с С-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33), в которой положение 14 по-прежнему занято (природным или немодифицированным) пролином.

“Аналитическое антитело” также может, например, представлять собой поликлональное или моноклональное антитело, которое распознает (С-концевой участок) последовательность ISV, называемого в этом документе “Nb 3.4” (SEQ ID NO: 5), но не распознает (С-концевой участок) последовательность ISV, называемого в этом документе “Nb 3.1” (SEQ ID NO: 3), и/или (предпочтительно, и) не распознает последовательность ISV, называемого в этом документе “Nb 3.2” (SEQ ID NO: 4).

Установить, распознает ли “аналитическое антитело” (или не распознает) ISV или Нанотело (и/или способно или не способно (специфически) связываться с ISV или Нанотелом) можно с использованием любого подходящего способа анализа связывания (такого как Biacore), а также с помощью описанного в Примере 3 анализа BIACORE или ADA-aнализа, такого как мостиковый/конкурентный ADA-анализ, описанный в Примере 5 (смотри также Фигуры 1A - 1C и Фигуру 1B, в частности).

Подходящие форматы/методы проведения такого анализа будут понятны специалисту на основании настоящего раскрытия, и включают, например, (без ограничения):

- Колориметрический анализ, такой как ELISA с использованием планшета, прямо или опосредованно покрытого аналитическим антителом, и детекцией (обнаружением) связанного ISV при помощи моноклонального или поликлонального анти-ISV-aнтитела. Другие удобные альтернативные методики включают, но не ограничиваются этим, электрохемилюминесценцию (MSD платформа), флуоресценцию (DELFIA, GYROS) и другие способы, основанные на вторичной детекции связанного ISV.

- Поверхностный плазмонный резонанс (такой как BIACORE) или другой способ с использованием биосенсора в режиме реального времени (т.е. отличный от такового с использованием SPR) с напрямую или опосредованно иммобилизованным аналитическим антителом и контролем связывания вводимого позднее ISV. Эти способы не требуют дальнейшего обнаружения связанного ISV. Типичный способ проведения анализа этого типа описан в Примере 3.

-Исследование конкурентного поведения ISV при мостиковом анализе (ADA-aнализе) с использованием аналитического антитела вместо ADA-содержащей биологической жидкости. Для мостикового анализа можно применять различные технологии, такие как ELISA, MSD-платформа. Типичные способы проведения анализа этого типа схематично показаны на Фигурах 1A - 1C, и один отдельный пример этой разновидности анализа также описан в Примере 5.

- Любой хроматографический способ, в котором аналитическое антитело иммобилизовано на хроматографической матрице, а специфический захват/выделение ISV происходит из раствора.

Когда подходящее аналитическое антитело получено с помощью oдного из описанных в этом документе или в одном из примеров способов (или способом, практически равноценным таковому), указанное аналитическое антитело может использоваться для определения, будет ли данный ISV или Нанотело (или лекарственное средство на основе ISV или на основе Нанотела) порождать (или иметь высокую или повышенную склонность к порождению) белковую интерференцию (как определено в этом документе), т.е. путем осуществления стадий (i) и (ii), описанных выше. Как уже было описано в этом документе, это, как правило, подразумевает контактирование указанного ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела с аналитическим антителом и определение, распознается ли указанный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела (и/или связывается и, в частности, специфически связывается) указанным аналитическим антителом (и, в частности, распознается ли С-концевой участок указанного ISV или Нанотела или любого ISV или Нанотела, образующего С-конец указанного лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела, указанным аналитическим антителом).

В большинстве случаев это можно осуществить с помощью любой подходящей методики, определяющей связывается ли антиген (в случае ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела) антителом, причем подходящие способы (иммуно)анализа известны специалисту. Некоторыми неограничивающими примерами являются подходящие методики ELISA (включая, например, сэндвич-ELISA); в которых, в зависимости от используемого формата ELISA (как понятно специалисту), планшет может быть покрыт или аналитическим антителом или ISV, и аналитическое антитело или ISV может быть помечено для обнаружения. Например, другие подходы касаются использования прибора BIAcore (при этом, аналитическое антитело или ISV может быть нанесен на чип, смотри, например, Пример 3). Другой альтернативой может являться конкурентный мостиковый анализ (как, например, проиллюстрировано в Примере 5), в котором исследуется способность ISV конкурировать с другим ISV, Нанотелом, лекарственным средством на основе ISV или лекарственным средством на основе Нанотела, которое, как известно, связывается аналитическим антителом (или наоборот). Эти и другие подходящие методики, определяющие связывается ли (специфически) или распознается ли данный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела аналитическим антителом, понятны специалисту, исходя из раскрытия в этом документе.

Кроме того, исходя из раскрытия понятно, что настоящее изобретение (и, в частности, используемое в настоящем изобретении аналитическое антитело) можно использовать для определения, содержит или нет данный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела сайт взаимодействия (такой, как сайт взаимодействия, присутствующий на или в пределах С-концевого участка, и/или часть которого образована С-концевым участком), способный подвергаться (неспецифическим) белковым взаимодействиям с одним или более белками или другими соединениями, которые могут присутствовать в биологическом образце (т.е., “исследуемом образце”), полученном от субъекта, который подвергают иммуноанализу, такому как ADA-aнализ (в частности, ADA-aнализу для установления присутствия каких-либо ADA к ISV, Нанотелу, лекарственному средству на основе ISV или лекарственному средству на основе Нанотеле). Таким образом, в том случае, когда ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела распознается аналитическим антителом, используемым в изобретении, весьма вероятно, что указанный ISV, Нанотело, лекарственное средство на основе ISV или лекарственное средство на основе Нанотела содержит такой (доступный или незащищенный) сайт взаимодействия и, таким образом, будет иметь склонность к порождению белковой интерференции (как определено в этом документе) при его использовании в таком иммуноaнализе или ADA-aнализе с целью тестирования исследуемого образца. Как понятно специалисту, этого следует избегать предпочтительно или путем выбора/использования другого ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела или путем модификации ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела, в результате чего его склонность к такой белковой интерференции будет в значительной степени уменьшена или практически устранена (и в этом случае это может быть протестировано с использованием способа и аналитического антитела, раскрытых в этом документе).

Как также понятно специалисту на основании раскрытия, такая модификация может, например, включать создание одной или более модификаций (таких, как аминокислотные вставки, добавления, делеции или замены) сайта взаимодействия на ISV, Нанотеле, лекарственном средстве на основе ISV или лекарственном средстве на основе Нанотела, в результате чего его способность подвергаться (неспецифическому) белковому взаимодействию с одним или более белками или другими соединениями, которые могут присутствовать в исследуемом образце, будет уменьшена или устранена. Далее, это можно осуществить с помощью ограниченного количества «проб и ошибок» путем введения одной или более модификаций, а затем проверки, была ли устранена эта способность или нет, и в этом случае с использованием способа и аналитического антитела, раскрытых в этом документе. Например, может быть введена одна или более таких модификаций, и затем способность модифицированного ISV связываться с аналитическим антителом может быть сравнена с таковой исходного/немодифицированного ISV. Альтернативно, способность модифицированного ISV по-прежнему конкурировать с исходным ISV за связывание с аналитическим антителом может быть установлена с помощью конкурентного мостикового формата (как, например, проиллюстрировано в Примере 5) или с использованием BIAcore (смотри, например, Пример 3).

Далее, и несмотря на то, что изобретение не ограничивается какой-либо гипотезой или объяснением, на основе экспериментальных доказательств, изложенных в примерах ниже, изобретатели обнаружили, что этот сайт взаимодействия, вероятно, располагается на/вблизи от С-концевого участка (как определено в этом документе) или указанный сайт взаимодействия образует часть С-концевого участка (или С-концевой участок образует часть сайта взаимодействия). Это основано, например, по меньшей мере, отчасти, на том наблюдении что, если ISV имеет склонность порождать белковую интерференцию и имеет VTVSS (SEQ ID NO:33) в качестве аминокислотных остатков на своем С-конце, то присоединение ограниченного числа аминокислотных остатков (например, от 1 дo 10, например от 1 дo 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5) или, альтернативно, метки или другого пептида, белка или другого фрагмента к этому С-концу, как правило, будет значительно уменьшать или практически устранять указанную склонность. В некоторых случаях было обнаружено, что даже добавление 1, 2 или 3 аминокислотных остатков к С-концевой VTVSS (SEQ ID NO:33) (который может являться любой подходящей аминокислотой(ами) или комбинацией аминокислот, каждая из которых может быть независимо выбрана из любых природных аминокислот, таких как перечисленные в Taблице A-2 на странице 64 WO 09/138519, например и без ограничения, из аланина, глицина, валина, лейцина и изолейцина) может уже значительно уменьшить или практически устранить указанную склонность. Это также отчасти основано на наблюдении, что в некоторых случаях, когда VHH от природы содержит остаток аланина в положении 14 (который, как указано, образует часть С-концевого участка; смотри Фигуру 2), VHH природного происхождения часто не имеет (или имеет низкую) склонность к порождению белковой интерференции, тогда как соответствующий VHH, в котором указанный аланин в положении 14 замещен на остаток пролина (например, с целью гуманизирования или оптимизации последовательности), может в результате иметь увеличенную склонность к порождению белковой интерференции (т.е., по сравнению с VHH с аланином в положении 14).

В одном аспекте изобретение имеет отношение к VHH, Нанотелу (указаному в этом документе, и в частности, гуманизированному VHH или верблюдизированному VH, такому как верблюдизированный человеческий VH) или другому ISV (или лекарственному средству на основе ISV или лекарственному средству на основе Нанотела с VHH, Нанотелом или другим ISV на его С-конце), который был модифицирован (например, путем введения одной или более аминокислотных замен, добавлений или делеций) и, в частности, модифицирован в С-концевых участках (например, путем одной или более аминокислотных замен или вставок в С-концевом участке) таким образом, что (i) это значительно уменьшило его склонность (например, по меньшей мере, статистически значимо уменьшило склонность) к порождению белковой интерференции (как определено в этом документе); и/или например, (ii) оно имеет в описанном в этом документе способе изобретения (например, как в отдельном способе анализа, описанном в Примере 3 или 5) значительно уменьшенную способность связываться описанным в этом документе аналитическим антителом (таким как, поликлональное антитело, описанное в Примере 2 и используемое в Примерах 3 и 5), в обоих случаях предпочтительно по сравнению с тем же VHH, Нанотелом или ISV, но без модификаций.

Таким образом, в одном аспекте, изобретение имеет отношение к VHH, Нанотелу (указанному в этом документе, и в частности, гуманизированному VHH или верблюдизированному VH, такому как верблюдизированный человеческий VH) или другому ISV (лекарственному средству на основе ISV или лекарственному средству на основе Нанотела с VHH, Нанотелом или другим ISV на его С-конце), который представляет собой VHH или VH-домен (т.е. ISV, который является VH-доменом или получен из VH-домена) и/или который был основан или получен из (аминокислотной последовательности) VHH или VH-домена, в при этом VHH, Нанотело или ISV coдержит аминокислотную последовательность VTVSS(X)_n (SEQ ID NO:34) на своем С-конце, где n представляет собой число от 1 дo 10, предпочтительно от 1 дo 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1), и где каждый X представляет собой (предпочтительно природный) аминокислотный остаток, который является независимо выбранным (и предпочтительно независимо выбранным из группы, состоящей из aланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I); однако, как видно из данных, представленных ниже, также могут использоваться другие (предпочтительно природные) аминокислотные остатки или комбинации вышеуказанных предпочтительных аминокислотных остатков с другими аминокислотными остатками (такими, как серин, пролин, треонин и/или лизин)). Предпочтительно, указанный VHH, Нанотело или ISV с аминокислотной последовательностью VTVSS(X)_n (SEQ ID NO:34) на своем С-конце является таким, который (i) обладает значительно уменьшенной склонностью (например, по меньшей мере, статистически значимой уменьшенной склонностью) к порождению белковой интерференции (как определено в этом документе); и/или (ii) обладает в способе изобретения, описанном в этом документе (таком, как специфический анализ, описанный в Примере 3 или 5), значительно уменьшенной способностью связываться описанным в этом документе аналитическим антителом (таким, как описанное в Примере 2 поликлональное антитело), в обоих случаях, предпочтительно, по сравнению с тем же VHH, Нанотелом или ISV, но с аминокислотной последовательностью VTVSS (SEQ ID NO:33) на своем С-конце. Например, можно сослаться на анализ и данные, представленные в Примере 3.

Вышеуказанные VHH, Нанотела или (другие) ISV предпочтительно имеют значение RU для связывания 21-4 меньше, чем 500 (определенное в соответствии с протоколом, изложенным в Примере 9, и после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной массы). Также следует отметить, что в любой момент, когда в описании или формуле изобретения делается ссылка на какую-либо С-концевую последовательность VTVSS(X)_n (включая любой из аспектов от (a) дo (p) ниже), что соответствует одному отдельному аспекту изобретения, ни одна из аминокислот X не является остатком цистеина.

Например, в некоторых предпочтительных аспектах, С-конец ISV или ISV-содержащего конструкции (в том случае, если этот С-конец является ISV, полученным из VH, VHH или Нанотела) может представлять собой:

- VTVSS(X)_n, где n = 1 и X = Ala;

- VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Ala;

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Ala;

- VTVSS(X)_n, где n = 2 и, по меньшей мере, один X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, oдин X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 1 и X = Gly;

- VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Gly;

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Gly;

- VTVSS(X)_n, где n = 2 и, по меньшей мере, один X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, один X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Ala или Gly;

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Ala или Gly;

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, oдин X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile); или

- VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

при этом аспекты (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) и (n) являются особенно предпочтительными, причем аспекты, где n =1 или 2, являются предпочтительными, а aспекты, где n = 1, являются особенно предпочтительными.

Также следует отметить, что в любой момент, когда в описании или формуле изобретения делается ссылка на какую-либо С-концевую последовательность VTVSS(X)_n (включая любой из аспектов от (a) дo (p) выше), что соответствует одному отдельному аспекту изобретения, ни одна из аминокислот X не является остатком цистеина.

Таким образом, в одном предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 1 и X = Ala (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Ala (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 2 и, по меньшей мере, oдин X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно являются независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH- последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, oдин X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно являются независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Ala (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно являются независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Ala (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 1 и X = Gly (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Gly (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Gly (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 2 и, по меньшей мере, oдин X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, oдин X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 2 и каждый X = Ala или Gly (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и каждый X = Ala или Gly (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, oдин X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 3 и, по меньшей мере, два X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile) (или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где n = 1, 2 или 3, где каждый X = Ala или Gly.

В другом предпочтительном аспекте изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет на С-конце последовательность VTVSS(X)_n, где:

- n = 1, 2 или 3, где каждый X = Ala или Gly; или

- n = 2 или 3, где все кроме одного X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile)

или белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце).

В другом предпочтительном аспекте, изобретение имеет отношение к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISV), который представляет собой Нанотело или (другой) ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности (при этом Нанотело является предпочтительным), который имеет С-конец последовательности VTVSS(X)_n, где:

- n = 1, 2 или 3, где каждый X = Ala или Gly; или

- n = 2 или 3, где, по меньшей мере, oдин X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

- n = 2 или 3, где все кроме одного X = Ala или Gly (при этом остальные аминокислотные остатки Х являются независимо выбранными из любых природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбранными из Val, Leu и/или Ile);

или a белок или полипептид, содержащий такой ISV (и, предпочтительно, такое Нанотело) на своем С-конце.

В перечисленных выше аспектах, в случае указанного (другого) “ISV, который содержит VH-последовательность или получен из VH-последовательности” подразумевается любой ISV, содержащий VH-последовательность или полученный из VH-последовательности и не являющийся Нанотелом (т.е. не являющийся VHH, гуманизированным VHH или верблюдизированным VH). Например, такой (другой) ISV может, например, быть основанным на VH (одно)доменным антителом, основанным на VH-dAb™ или основанным на VH микротелом (microbody) (смотри WO 00/29004).

И в этом случае следует отметить, что в любой момент времени какой-либо из ISV, упомянутых в описании, имеет С-концевую последовательность VTVSS(X)_n (включая, без ограничения, ISV, упомянутые в предыдущих аспектах), что соответствует одному отдельному аспекту изобретения, при этом ни один из аминокислотных остатков X в последовательности VTVSS(X)_n не является остатком цистеина.

Как далее описано в этом документе, любой такой белок или полипептид, например, может являться конструкцией, который содержит два или более ISV (например, два или более Нанотел), необязательно связанных посредством одного или более подходящих линкеров. Таким образом, такая конструкция может быть, например, двухвалентной, трехвалентной, четерехвалентной или пятивалентной конструкцией (таким как двухвалентная, трехвалентная, четырехвалентная или пятивалентнаяй конструкция Нанотела), и может, например, быть двухвалентной, трехвалентной, четерехвалентнойм или пятивалентной конструкцией (такая как двухвалентная, трехвалентная, четырехвалентная или пятивалентная конструкция Нанотела), которая является биспецифической, триспецифической или бипаратопной конструкцией (включая, например, моноспецифическую, биспецифическую или бипаратопную конструкции, которые также могут связываться с сывороточным альбумином (предпочтительно) или другим сывороточным белком для увеличения времени полужизни).

И в этом случае, Нанотела, ISV и белки/полипептиды в соответствии с каждым из описанных выше аспектов предпочтительно имеют значение RU для связывания 21-4 менее, чем 500 (определенное в соответствии с протоколом, изложенным, в Примере 9, и после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной массы ISV или белка, использованного в соответствии с вышеизложенной формулой).

Как указано в этом документе, также предусматривается, что изобретение также может применяться к другим белкам или полипептидам (и, в частности, фрагментам антител, таким как Fab-фрагменты или другим белкам или полипептидам, основанным на фрагментах антител, таких как ScFv), имеющим VH-домен на их С-конце. Таким образом, в другом аспекте изобретение имеет отношение к такому белку или полипептиду (такому, как ScFv), который имеет VH-домен на своем С-конце с аминокислотной последовательностью VTVSS(X)_n (SEQ ID NO:34) на С-конце, где n составляет от 1 дo 10, предпочтительно от 1 дo 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5, и где каждый X является (предпочтительно, природным) аминокислотным остатком, независимо выбранным (и, предпочтительно, независимо выбранным из группы, состоящей из аланина (A), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I). Далее, согласно некоторым отдельным аспектам, указанный С-конец может быть в соответствии с любым из (a) - (p) представленным выше, и предпочтительно, в соответствии с одним из (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) или (n), при этом n представляет собой 1, 2 или 3, и, предпочтительно, 1 или 2.

И в этом случае, такие белки или полипептиды, предпочтительно, имеют значение RU для связывания 21-4 менее, чем 500 (определенное в соответствии с протоколом, изложенным в Примере 9, и после корректировки измеренного значения RU с учетом молекулярной массы ISV или белка, использованного в соответствии с вышеизложенной формулой). Также, далее, в соответствии с одним отдельным аспектом изобретения ни один из аминокислотных остатков X в С-концевой последовательности VTVSS(X)_n не является остатком цистеина.

Изобретение дополнительно имеет отношение к фармацевтической композиции, содержащей ISV (и предпочтительно терапевтический ISV) или белок или полипептид, содержащий, по меньшей мере, один ISV (и предпочтительно, по меньшей мере, один терапевтический ISV), в которой указанный ISV, белок или полипептид представляет собой как было описано ранее (т.е. ISV, белком или полипептидом в соответствии с одним или более из аспектов, описанных в данном документе и, в частности, в соответствии с одним или более из аспектов, описанных на предыдущих страницах; и конкретнее ISV, белком или полипептидом, имеющим C-конец/последовательность, которая соответствует одному или более из описанных здесь аспектов), и, по меньшей мере, один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент (т.е. подходящий для фармацевтического использования), и необязательно одно или более дополнительных активных веществ. Такие композиции, носители, разбавители и эксципиенты, например, могут быть такими, как описанные в WO 08/020079 в отношении фармацевтических композиций, которые содержат Нанотело или белок или полипептид, который содержит, по меньшей мере, одно Нанотело (и как уже упоминалось, согласно настоящему изобретению, ISV также предпочтительно является Нанотелом).

Изобретение дополнительно имеет отношение к ISV или белку или полипептиду, содержащему, по меньшей мере, один ISV, для использования при лечении болезни у человека (например, пациента, нуждающегося в таком лечении), при этом указанный ISV, белок или полипептид представляет собой как было описано ранее (т.е. является ISV, белком или полипептидом в соответствии с одним или более из аспектов, описанных в данном документе и, в частности, в соответствии с одним или более из аспектов, описанных на предыдущих страницах; и конкретнее ISV, белком или полипептидом, имеющим C-конец/последовательность, которая соответствует одному или более из описанных здесь аспектов).

Изобретение дополнительно имеет отношение к использованию ISV или белка или полипептида, содержащего, по меньшей мере, один ISV, в приготовлении фармацевтической композиции, при этом указанный ISV, белок или полипептид представляет собой как было описано ранее (т.е. является ISV, белком или полипептидом в соответствии с одним или более из аспектов, описанных в данном документе и, в частности, в соответствии с одним или более из аспектов, описанных на предыдущих страницах; и конкретнее ISV, белком или полипептидом, имеющим C-конец/последовательность, которая соответствует одному или более из описанных здесь аспектов).

Изобретение дополнительно имеет отношение к способу лечения, включающему введение субъекту (человеку) (например, нуждающемуся в таком лечении пациенту) ISV или белка или полипептида, содержащего, по меньшей мере, oдин ISV в составе фармацевтической композиции, где указанный ISV, белок или полипептид представляет собой, как описано в этом документе (т.е. является ISV, белком или полипептидом в соответствии с одним или более из аспектов, описанных в данном документе и, в частности, в соответствии с одним или более из аспектов, описанных на предыдущих страницах; и конкретнее ISV, белком или полипептидом, имеющим C-конец/последовательность, которая соответствует одному или более из описанных здесь аспектов); или фармацевтической композиции (описанной выше), содержащей, по меньшей мере, oдин такой ISV, белок или полипептид.

В отношении вышесказанного понятно, что терапевтическое использование описанных в этом документе ISV, белков и полипептидов является очень важным аспектом изобретения, поскольку терапевтическое использование (или клинические исследования таких ISV, белков и полипептидов для терапевтического использования) может включать в себя применение ADA-анализа для определения, является ли указанный ISV, белок или полипептид иммуногенным (т.е. может ли он приводить к образованию ADA при введении человеку). В этом отношении, также понятно, что должны учитываться вопросы, касающиеся возможной иммуногенности, в частности, когда терапевтическое средство используется в течение более продолжительных периодов времени (в течение недель, месяцев или лет) и/или имеет время полужизни (предпочтительно выраженный как t1/2-бета) у человека, по меньшей мере, 3 дня, например, по меньшей мере, одну неделю, и до 10 дней или более.

Таким образом, в соответствии с oдним отдельным аспектом изобретения, ISV, белок, полипептид или фармацевтическая композиция, описанная в этом документе, предназначена для лечения хронического заболевания у человека, и/или такой ISV, белок, полипептид, описанный в этом документе, предназначен для присутствия в кровотоке субъекта (т.е. на фармакологически активном уровне), которому он вводится (т.е. в терапевтически активной дозе) в течение, по меньшей мере, одной недели, предпочтительно, по меньшей мере, двух недель, например, по меньшей мере, месяца; и/или такой ISV, белок, полипептид, описанный в этом документе, имеет время полужизни (предпочтительно, выраженный как t1/2-бета) у человека, по меньшей мере, 3 дня, например, по меньшей мере, oдну неделю, и до 10 дней или более; и/или такой ISV, белок, полипептид или фармацевтическая композиция, описанная в этом документе, предназначена для введения человеку в виде двух или более доз, которые вводятся в течение, по меньшей мере, 3 дней, например, по меньшей мере, oдной недели, например, по меньшей мере, двух недель или, по меньшей мере, oдного месяца или даже дольше (т.е., по меньшей мере, 3 месяца, по меньшей мере, 6 месяцев или, по меньшей мере, один год), или даже вводятся постоянно.

Изобретение дополнительно имеет отношение к способу для (значительного) уменьшения или по существу устранения склонности ISV, Нанотела или лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела к порождению белковой интерференции, указанный способ, по меньшей мере, включает стадии:

- необязательно определения склонности ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела к порождению белковой интерференции, с использованием способа, который, по меньшей мере, содержит стадии (i) и (ii), указанные в этом документе;

- модификации указанного ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела путем введения одной или более аминокислотных замен, добавлений или делеций в указанный ISV или Нанотело, или в С-конец ISV или Нанотело (при наличии) лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела; и, в частности, путем введения одной или более аминокислотных замен, вставок в С-концевой участок указанного ISV или Нанотела или в С-концевой участок С-концевого ISV или Нанотело (при наличии) лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела, например, путем добавления к С-концу последовательности от 1 дo 10, например, от 1 дo 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из любых природных аминокислот (таких, как перечисленные в Taблице A-2 на странице 64 WO 09/138519, например и без ограничения, из аланина, глицина, валина, лейцина или изолейцина);

- определение склонности модифицированного указанным образом ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела к порождению белковой интерференции с использованием способа, который, по меньшей мере, включает стадии (i) и (ii), указанные в этом документе; необязательно способом, который позволяет сравнить склонность модифицированного указанным образом ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела к порождению белковой интерференции со склонностью исходного ISV, Нанотела, лекарственного средства на основе ISV или лекарственного средства на основе Нанотела к порождению белковой интерференции (включая, без ограничения, их сравнение в конкурентном анализе в отношении связывания аналитическим антителом, как описано в этом документе). Альтернативно, может использоваться описанный в этом документе способ, предполагающий использование 21-4.

Далее изобретение будет описано с помощью следующих неограничивающих предпочтительных аспектов, примеров и Фигур, в которых:

- На фигурах 1A – 1C схематично показаны некоторые неограничивающие примеры форматов ADA-анализа. Некоторые типичные, но неограничивающие, протоколы для проведения этих анализов приведены в Примере 4.

- На фигуре 2 схематично показана типичная 3D-структура ISV, такого как Нанотело.

- На фигуре 3 показана кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание NB от 3.4 до 3.9 (SEQ ID NO’s. с 5 до 10) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигура 4 представлена кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание NB 3.4, 3.11, 3.12 и 3.13 (SEQ ID NO’s: 5, 12, 13 и 14) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигуре 5 представлена кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание of NB 3.4, 3.14 и 3.15 (SEQ ID NO: 5, 15 и 16) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигуре 6 представлена кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание NB 3.1, 3.2 и 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 и 5) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигуре 7 представлена кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание NB 4.1 и 4.2 (SEQ ID NO 17 и 18) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигуре 8 представлена кривая связывания (полученная с использованием описанного в Примере 3 анализа BIACORE), показывающая связывание NB 6.1, 6.2, 6.4 и 6.5 (SEQ ID NO с 19 до 22) с иммобилизованным поликлональным антителом, полученным в Примере 2.

- На фигура 9 приведена таблица, в которой показаны последовательности, использованные в Примере 8 (SEQ ID NO с 37 до 89), и соответствующая эталонная последовательность.

Указанные в настоящем описании и формуле изобретения последовательности перечислены в Taблице A ниже (SEQ ID NO: 1 до 37) и на Фигуре 9 (SEQ ID NO: 38 до 89).

Таблица A

Название SEQ ID NO: Последовательность ISV Ex. 1/2- 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIKSSGDSTRYAGSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKSRVSRTGLYTYDNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS Alt. ISV 2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS >Nb3.1 3 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTGEPRELVATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS >Nb3.2 4 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTGEPRELVATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHH >Nb3.4 5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS >Nb3.5 6 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSAA >Nb3.6 7 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA >Nb3.7 8 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSG >Nb3.8 9 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGG >Nb3.9 10 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGG >Nb3.10 11 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS >Nb3.11 12 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS >Nb3.12 13 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS >Nb3.13 14 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS >Nb3.14 15 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVQVSS >Nb3.15 16 HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS >Nb4.1 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSS >Nb4.2 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSRDWDFDVFGGGTPVGG >Nb6.1 19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGKEREFVARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSLKAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGTGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHH >Nb6.2 20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGKEREFVARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSLKAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGTGTQVTVSS >Nb6.4 21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGKGREFVSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHH >Nb6.5 22 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGKGREFVSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSS Пример 1C: дикий тип 23 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS Пример 1C: (A14P) 24 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS Пример 1C: (K83R) 25 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS Пример 1C: (Q108L) 26 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS Пример 1C: (A14P,K83R,Q108L) 27 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS Пример 1c: (A14P,R39Q,K83R,T91Y,Q108L) 28 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS Пример 1C: (A14P,R39Q,K83R,T91Y,Q108L)-1A 29 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSSA Пример 1C: (A14P,R39Q,K83R,T91Y,Q108L)-3A 30 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSSAAA Nb3.16 31 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS Nb3.17 32 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA C-концевая последова-тельность 33 VTVSS C-концевая последова-тельность 34 VTVSS(X)_n 21-4-3, IGH консенсус  35 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTAYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTVTGEPAYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKNEDTATYFCTRGLIHFYYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC 21-4-3-IGK консенсус 36 DIQMTQTPSSLSASLGGRVTITCKASQDIHNFISWYQHKPGKVPRLIIHDTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSITNLEPEDIATYYCLHYDNLLRSFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Экспериментальная часть:

Пример 1: Создание поликлонального аналитического антитела.

Поликлональное антитело (фракция IgG), которое может использоваться в качестве “аналитического антитела”, было получено, как указано ниже:

- Выявление образцов плазмы, подходящих для выделения поликлонального антитела

Двадцать образцов плазмы от здоровых индивидуумов, которые никогда не подвергались лечению ISV, оценивали на наличие антител к ISV, которые могут использоваться в качестве аналитических антител в изобретении.

В этом Примере исходно было использовано ISV SEQ ID NO: 1. Затем, для подтверждения того, что взаимодействие не является специфическим для этого отдельного ISV, но является неспецифическим белок-белковым взаимодействием, которое может происходить с целым рядом ISV, нижеприведенный анализ повторяли с другими ISV (смотри пункт C) ниже). В качестве альтернативы SEQ ID NO:1 также может использоваться, например, SEQ ID NO:2.

Использованный способ анализа представлял собой мостиковый анализ на основе ECL (электрохемилюминесценции) с использованием биотинилированного ISV (биотинилированный вариант SEQ ID NO:1) для захвата и меченого сульфо-группой ISV для выявления антилекарственных антител. Аналогичный формат также использовали для проведения ADA-анализа. Биотинилирование и сульфо-мечение ISV было проведено с помощью общепринятой химии связывания по первичным аминам с использованием Сульфо-NHS-LC-Биотина (Pierce) и Сульфо-метки NHS-Ester (MSD), соответственно согласно инструкциям изготовителя. Образцы плазмы разбавляли 1/5 в PBS/0,1% казеина и инкубировали в течение 30 минут при 37°C, 600 об/мин в 96-луночных полипропиленовых планшетах. Затем образцы (50 мкл) разводили 1/3 в 1:1 смеси (100 мкл) 2 мкг/мл биотинилированного и 2 мкг/мл меченого сульфогруппой ISV (SEQ ID NO:1) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (RT), 600 об/мин. MSD MA^®96-луночные стандартные стрептавидиновые планшеты блокировали 150 мкл/лунку Superblock^® T20 в течение 1 часа при RT, затем промывали 3 раза PBS/0,05%Твин20 (=промывочный буфер). Образец/1:1 смесь (биотинилированного и меченого сульфо-группой ISV (SEQ ID NO:1) (50,0 мкл) переносили из полипропиленового планшета в MSD планшет и инкубировали в течение 1 часа при RT, 600 об/мин. Планшеты промывали три раза перед добавлением 2 x буфера считывания (MSD) (150 мкл/лунку) и снимали показания в единицах ECL (ECLU) на приборе MSD (планшетный спектрофотометр Sector Imager 2400). Образцы сортировали как положительные или отрицательные с использованием сортирующей точки разделения, определенной в ходе валидации метода. Точка разделения была вычислена на основе фоновых значений 118 индивидуальных образцов плазмы от здоровых индивидуумов, которые никогда не подвергались лечению ISV, с использованием подходящего статистического анализа как рекомендовано в руководстве по разработке ADA-анализа (Shankar, 2008). Была использована непараметрическая оценка, а значение точки разделения было вычислено на основе 95^ого процентиля после исключения резко отклоняющихся значений.

Шесть образцов плазмы были отчетливо определены как положительные: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 и IHuP#002-001-ABL-20 (Taблица I).

Эти образцы далее были проанализированы в drug displacement set-up (модель вытеснения лекарственного средства) (подтверждающий анализ) для подтверждения специфичности положительного результата скрининга (Таблица II). Соответственно, образцы разводили 1/5 в PBS/0,1% казеина, содержащем 12,5 мкг/мл ISV (SEQ ID NO:1), и инкубировали в течение 30 минут при 37°C, 600 об/мин в 96-луночных полипропиленовых планшетах. Затем образцы (50 мкл) разводили 1/3 в 1:1 смеси (100 мкл) 2 мкг/мл биотинилированного и 2 мкг/мл сульфо-меченого ISV (SEQ ID NO:1) инкубировали в течение 1 часа при RT, 600 об/мин. Далее, образец/ 1: 1 смесь (биотинилированного и сульфо-меченого ISV) (50,0 мкл) переносили из полипропиленового планшета в блокированный MSD MA^®96-луночный стандартный стрептавидиновый планшет, как описано выше, для скринингового анализа и инкубировали в течение 1 часа при RT, 600 об/мин. Затем планшеты промывали 3 раза перед добавлением 2 x буфера считывания (MSD) (150 мкл/ лунку) и измеряли единицы ECL (ECLU) при помощи прибора MSD (планшетный спектрофотометр Sector Imager 2400). Образцы были подтверждены как действительно положительные с использованием подтверждающей разделяющей точки, определенной в ходе валидации метода, и были вычислены ECL-ответы 118 отдельных образцов плазмы от здоровых индивидуумов, никогда не подвергавшихся лечению ISV, которым вводили 50 мкг/мл ISV (SEQ ID NO:1), с использованием подходящего статистического анализа, как рекомендовано в руководстве по разработке ADA-анализа (Shankar, 2008). Минимальное 50% уменьшение сигнала было вычислено на основе 99% доверительного интервала.

Образцы, которые оказались положительными при мостиковом анализе на основе ECL и которые были подтверждены как положительные в drug displacement set-up анализе, были выбраны в качестве источника для создания поликлонального антитела с использованием aффинной хроматографии.

Таблица I: Результаты скрининга 20 образцов плазмы при ADA ISV aнализе

Образец ID ECLU скрининговый анализ IHuP#002-001-ABL-01 13081 IHuP#002-001-ABL-02 56 IHuP#002-001-ABL-03 272 IHuP#002-001-ABL-04 125 IHuP#002-001-ABL-05 70 IHuP#002-001-ABL-06 99 IHuP#002-001-ABL-07 170 IHuP#002-001-ABL-08 659358 IHuP#002-001-ABL-09 798 IHuP#002-001-ABL-10 1101 IHuP#002-001-ABL-11 83 IHuP#002-001-ABL-12 72 IHuP#002-001-ABL-13 403 IHuP#002-001-ABL-14 62 IHuP#002-001-ABL-15 1141 IHuP#002-001-ABL-16 159 IHuP#002-001-ABL-17 72 IHuP#002-001-ABL-18 170 IHuP#002-001-ABL-19 4503 IHuP#002-001-ABL-20 8243

Таблица II: Подтверждение образцов плазмы, отобранных как положительные, с помощью подтверждающего анализа. Для оценки результатов использовалась подтверждающая разделяющая точка 50%. Oдин образец не был подтвержден как истинно положительный образец

ID Образца Плазмы ECLU скрининговый анализ: плазма ECLU подтверждающий анализ: плазма % подавления сигнала IHuP#002-001-ABL-01 13081 685 95 IHuP#002-001-ABL-08 659358 169410 74 IHuP#002-001-ABL-10 1101 582 47 IHuP#002-001-ABL-15 1141 467 59 IHuP#002-001-ABL-19 4503 1531 66 IHuP#002-001-ABL-20 8243 1450 82

Еще три образца сыворотки от индивидуумов, которых никогда не лечили ISV, также были оценены с помощью описанного выше мостикового анализа на основе ECL и подтверждены с использованием drug displacement set-up анализа.

Два образца сыворотки были отчетливо определены как положительные при мостиковом анализе на основе ECL: IHUS#B09032311A3 и IHUS#B09032311A20 (Таблица III). 2 образца, отобранных как положительные, были далее проанализированы в drug displacement set-up анализе для подтверждения специфичности положительного результата скрининга.

Таблица III: Результаты скрининга и подтверждающего анализа 3 образцов сыворотки и соответствующей очищенной фракции IgG

ID Образца Плазмы ECL сигнал в скринин-говом анализе: сыворотка ECL сигнал в подтверждающем анализе: сыворотка % подавления сигнала ECL сигнал в скрининго-вом анализе: IgG ECL сигнал в подтверждаю-щем анализе: IgG % подав-ления сигнала IHUS#B09032311A3 2388 286 88% 3716 370 90% IHUS#B09032311A20 19272 915 95% 31309 1160 96% IHUS#B09032311A1 62

- Получение очищенной фракции поликлонального IgG.

Поликлональный IgG был очищен из образцов IHUS#B09032311A3 и IHUS#B09032311A20 (смотри выше) с использованием колонок Protein G HP Spin Trap (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями изготовителя. Коротко, после удаления из колонки раствора для хранения центрифугированием (30 с при 100x g), колонку уравновешивали добавлением связывающего буфера (20 мМ фосфата натрия, pH 7,0). После центрифугирования добавляли раствор, содержащий желаемое поликлональное антитело (максимально 1 мг в 600 мкл), и колонку инкубировали в течение 4 минут при осторожном перемешивании. Затем колонку центрифугировали и 2x промывали достаточным количеством связывающего буфера (600мкл). После добавления 400 мкл элюирующего буфера (0,1 M глицин-HCL, pH 2,7) и перемешивания переворачиванием, антитело элюировали с помощью центрифугирования с 30 мл нейтрализующего буфера (1M Трис-HCL, pH 9,0).

Для подтверждения того, что полученная таким образом фракция IgG была вовлечена в неспецифическое связывание с ISV(s), очищенное антитело IgG анализировали с помощью описанного выше мостикового анализа на основе ECL и подтверждали с использованием drug displacement set-up анализа, использованного в A) выше. Для обоих образцов (IHUS#B09032311A3 и IHUS#B09032311A20) было подтверждено участие очищенного антитела IgG в неспецифическом связывании, приводящем к положительному сигналу при анализе (Таблица III). Таким образом было подтверждено, что очищенное поликлональное IgG может использоваться в качестве “аналитического антитела”, и его использовали в данном качестве (при анализе) в Примерах 3 и 5.

- Неспецифическое связывание с другими ISV.

Для того чтобы установить, является ли наблюдаемая белковая интерференция специфической для отдельного ISV и/или специфической для индивидуального участка, эпитопа или антигенной детерминанты ISV и/или для определенных мутаций, введенных в ISV дикого типа (таких, как одна или более гуманизирующих мутаций), вышеуказанный мостиковый анализ на основе ECL и drug displacement set-up анализ (оба как описано в пункте A), при этом SEQ ID NO: 1 использовали в качестве меченого сульфо-группой ISV) повторяли с использованием образцов плазмы IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 и IHUS#B09032311A1. Поскольку эти образцы плазмы содержали поликлональное “аналитическое” антитело, выделенное в B) выше, это также предоставляло информацию в отношении специфичности, селективности и распознавания эпитопа поликлонального аналитического антитела.

Было протестировано 8 образцов ISV (SEQ ID NO 23-30, соответственно, смотри Таблицу A выше), из которых один образец был дикого типа VHH (SEQ ID NO: 23) и остальные 7 ISV являлись гуманизированными вариантами последовательности дикого типа с различными гуманизирующими заменами. Два ISV (SEQ ID NO’s: 29 и 30) также содержали дополнительные аминокислотные остатки на С-конце (1 и 3 дополнительные остатки аланина, соответственно).

Данные приведены в Таблице IV. Без ограничения каким-либо объяснением или гипотезой, можно видеть, что изменения в С-концевом участке (как указанно в этом документе), очевидно, могут сильно влиять на степень, с которой использованные образцы плазмы порождают белковую интерференцию. Например, можно видеть, что введение одного или трех аминокислотных остатков в C-конец может сильно уменьшать тенденцию к белковой интерференции (например, уменьшение только на 18 и 13% при ECLU анализе образца IHUS#B09032311A3 с SEQ ID NO: 29 и 30 по сравнению с уменьшением на 90% для SEQ ID NO: 28, соответствующей гуманизированному варианту без добавления каких-либо аминокислотных остатков на С-конец). Аналогично, введение остатка пролина в положение 14 последовательности дикого типа, очевидно, также может сильно влиять на степень, с которой образцы плазмы порождают белковую интерференцию (например, уменьшение только на 20% при ECLU анализе для образца IHUS#B09032311A3 последовательности дикого типа SEQ ID NO: 23, по сравнению с уменьшением на 91% для SEQ ID NO: 24, последовательности дикого типа с заменой A14P). K83R и Q108L, которые также являются заменами, расположенными близко к С-концевому участку, также приводят к некоторому возрастанию склонности к порождению белковой интерференции, но не такому сильному, как замена A14P, и общий суммарный эффект замен A14P+K83R+Q108L может быть нивелирован путем добавления одного или более аминокислотных остатков на C-конец (снова сравни данные для SEQ ID NO: 29 и 30 с данными для других гуманизированных вариантов).

На основании этих данных также было сделано заключение, что, очевидно, поликлональное аналитическое антитело в большинстве случаев распознавало С-концевой участок (как определено в этом документе) ISV. Как видно из Фигуры 2, положение 14 (и в меньшей степени положения 83 и 108) также образуют части С-концевого участка ISV (в том случае, когда принимается во внимание трехмерная третичная структура ISV).

Таблица IV: Оценка различных вариантов Нанотела в качестве конкурента при ADA-анализе ISV с использованием аналитического антитела

ID Образца Плазмы IHUS#B09032311A3 IHUS#B09032311A20 IHUS#B09032311A1 ECLU в скрининговом анализе (с использованием SEQ ID NO: 1) 2217 18494 62 Вариант Нанотела
(находящиеся справа столбцы обозначают сделанные
гуманизирующие замены и С-концевые добавления, по
сравнению с
последовательностью SEQ ID NO:23 дикого типа) ECLU подтверждающий анализ % уменьшения ECLU подтверждающий анализ % уменьшения ECLU подтверждающий анализ % уменьшения SEQ ID NO: 23 VHH дикого типа 1778 20 8682 53 60 4 SEQ ID NO: 24 VHH дикого типа +A14P 205 91 668 96 56 10 SEQ ID NO: 25 VHH дикого типа +K83R 1403 37 6912 63 62 1 SEQ ID NO: 26 VHH дикого типа +Q108L 1533 31 6991 62 59 5 ID Образца Плазмы IHUS#B09032311A3 IHUS#B09032311A20 IHUS#B09032311A1 ECLU в скрининговом анализе (с использованием SEQ ID NO: 1) 2217 18494 62 Вариант Нанотела (находящиеся справа столбцы обозначают сделанные гуманизирующие замены и С-концевые
добавления, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:23 дикого типа) ECLU подтверждающий анализ % уменьшения ECLU подтверждающий анализ % уменьшения ECLU подтверждающий анализ % уменьшения SEQ ID
NO: 27 VHH дикого типа +A14P+K83R+Q108L 156 93 628 97 57 8 SEQ ID
NO: 28 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L 228 90 570 97 58 6 SEQ ID
NO: 29 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 1
дополнительный A на С-конце (A114) 1814 18 15087 18 60 3 SEQ ID
NO: 30 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 3 A’s на С-конце (A114+A115+A116) 1933 13 15244 18 62 0

Пример 2: aффинная очистка аналитического антитела

Этот Пример описывает два способа, которые могут использоваться для выделения из биологической жидкости человека аналитического антитела, которое способно распознавать и/или связываться с С-концом ISV. Антитело выделяется из 4 различных образцов сыворотки, для которых было свойственно вызывать положительный сигнал при ADA-aнализе в соответствии с тестом, описанным выше в Примере 1.

Начиная с образцов сыворотки, каждый из этих протоколов предоставляет очищенный препарат фактора(ов) интерференции, который может использоваться в качестве аналитического антитела в описанных в этом документе способах. Эти способы также могут использоваться в более общем смысле для очистки фактора(ов) интерференции для других целей (например, фактор(ы) интерференции, очищенные с использованием описанных ниже протоколов также использовались в экспериментах в Примере 8 для того, чтобы показать, что связывание ISV или ISV-конструкции моноклонального антитела 21-4 является предсказывающим связывание того же ISV или ISV-конструкции факторами интерференции, и таким образом, склонности указанного ISV или ISV-конструкции претерпевать неспецифическую белковую интерференцию при ADA-aнализе).

Пример 2A: очистка с использованием белка A и aффинной хроматографии.

На первой стадии фракцию антитела IgG обогащали из образцов сыворотки при помощи aффинной хроматографии с использованием белка A. Типичные колонки, использованные для этого обогащения, содержали HiTrap MabselectSure и MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). Очистка антитела IgG из образцов сыворотки проводилась автоматизированным способом, одинаковым для всех экспериментов. Хроматографию проводили на очистительной системе AKTA (GE Healthcare), а показания регистрировали в реальном времени с использованием программного обеспечения UNICORN (GE Healthcare). Коротко, образец сыворотки разводили в соотношении 1:1 при помощи D-PBS (фосфатным буферным раствором Дульбекко) и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм перед нанесением на колонку с установленной скоростью 0,5 мл/мин. Колонку промывали для удаления неспецифически связавшихся компонентов 5 объемами колонки с использованием D-PBS при фиксированной скорости потока 0,5 мл/мин. Фракцию IgG элюировали при помощи кислотного элюирования с использованием буфера, содержавшего 100 мМ глицин pH 2,6, при скорости потока, равной 0,5 мл/мин. После элюирования фракции нейтрализовали с помощью 1,5 M Tris буфера pH 8,8. Для подтверждения выделения антитела IgG в элюат проводили SDS-PAGE.

На второй стадии интерферирующие IgGs были дополнительно обогащены при помощи очищенной белком А фракции IgG из 4 различных сывороток на аффинных колонках со связанным ISV. Конкретнее, интерферирующие IgGs далее обогащали путем связывания на колонке, содержащей ISV с последовательностью SEQ ID NO: 1. Для этого ISV ковалентно связывали с Sepharose 4 fast flow (GE Healthcare) с использованием метода связывания при помощи CNBr (бромистый циан) в соответствии с методикой изготовителя. Аффинную очистку проводили автоматизированным способом, одинаковым для всех экспериментов. Хроматографию проводили на очистительной системе AKTA, и результаты регистрировали при помощи UNICORN. Коротко, обогащенный IgG образец (загрузочный объем до 10мл) загружали на колонку при установленной скорости потока, равной 0,5 мл/мин. Колонку промывали для удаления неспецифически связавшихся компонентов 5 объемами колонки с использованием D-PBS при скорости потока 0,5 мл/мин. ISV-связывающие компоненты элюировали при помощи кислотного элюирования с использованием буфера, содержавшего 100 мМ глицин pH 2.6, при скорости потока 0,5 мл/мин. После элюирования фракции нейтрализовали при помощи 1.5 M Tris буфера, pH 8.8. Фракции анализировали с использованием SDS-PAGE, который подтвердил выделение IgG антител в элюат (данные не приведены).

Эти фракции были объединены и использовались для дальнейших анализов, таких, как описанные в Примере 3.

Пример 2B: очистка с использованием CaptureSelect™ хроматографии.

Альтернативно, фактор(ы) интерференции были получены из плазмы и очищены с использованием коммерчески доступной IgA-связывающей аффинной смолы CaptureSelect hIgA™ (BAC BV) на основе полученных от семейства верблюдовых вариабельных доменов только тяжелой цепи (VHH). Собранная ‘фракция IgA’, содержащая IgA вместе с интерферирующим IgG, была затем нанесена на колонку с белком A для удаления фракции IgA. Колонка с белком была обработана в соответствии с условиями очистки типичного IgG (буфер для промывки: PBS; буфер для элюировании: 100мМ глицин pH=2.7; нейтрализация после элюирования при помощи 1M Tris). Фактор интерференции был восстановлен из Prot A элюирования с выходом >95%.

В разновидности этого способа использовалась другая aффинная смола CaptureSelect (CaptureSelect Alpha-1 Antitrypsin смола, коммерчески доступная aффинная смола на основе VHH, не нацеленных на какие-либо имеющие отношение к антителам белки). Эта смола обеспечивает высокую эффективность связывания фактора интерференции и делает возможным селективное двухступенчатое элюирование: aнтитрипсина посредством элюирования при нейтральном pH с использованием 2.0 M MgCl₂, с последующим элюированием фактора интерференции посредством кислотной стадии (0,1 M глицин pH3.0, аналогично условиям элюирования для белка A/G; нейтрализация при помощи 1,5M Tris). Выход одностадийной очистки составлял до 15 мкг интерферирующего IgG1 на мл плазмы с высокой интерференцией, что составляет приблизительно 0,3% общего присутствующего IgG. Нейтрализованная интерферирующая фракция необязательно может быть обессолена и далее очищена с помощью эксклюзионной колонки, уравновешенной D-PBS.

Пример 3: Влияние различных замен на склонность ISV к порождению белковой интерференции

Как указано в описании выше, настоящее изобретение предоставляет определенные способы анализа и методики, которые делают возможной оценку, имеет ли данный ISV склонность к порождению белковой интерференции, или нет. Они включают мостиковый анализ на основе ECL и drug displacement set-up анализ, использованные в Примере 1, а также описанный в Примере 3 BIACORE-анализ и мостиковый/конкурентный ADA-анализ, описанный далее в Примерах ниже.

Как уже упоминалось ранее, эти анализы также могут использоваться для определения того, могут ли определенные изменения (например, аминокислотные делеции, замены или добавления) влиять (и предпочтительно, уменьшать) на склонность данного ISV к порождению белковой интерференции. Некоторые из этих изменений станут понятны специалисту на основании раскрытия и экспериментальных данных, представленных в Примере 1 и в данном Примере 3.

Как уже следует из полученных в Примере 1 данных, определенные мутации в или вблизи С-концевого участка (как определено в этом документе) ISV способны (сильно) влиять на его склонность к порождению белковой интерференции. Например, добавление нескольких аминокислотных остатков к С-концу (например, 1 или 3 остатков аланина), по-видимому, сильно уменьшает тенденцию ISV порождать белковую интерференцию, и, по-видимому, даже способно нивелировать наличие других замен (например, в или поблизости от С-концевого участка), которые, по-видимому, увеличивают склонность порождать белковую интерференцию (например, замена A14P).

В этом Примере 3, эффект других замен, а также эффект добавления дополнительных аминокислот к C-концу был исследован путем сравнения родственных ISV с различными заменами с использованием аналитического поликлонального антитела, полученного в Примере 2. Анализ проводился путем измерения кинетики взаимодействия между каждым из исследуемых ISV и аналитическим поликлональным антителом с помощью поверхностного плазмонного резнанса (SPR) с использованием биосенора Biacore^TM T100 GE Healthcare. В этом Примере 3 были протестированы ISV SEQ ID NO 3 - 22 (смотри Таблицу A выше и Таблицу V ниже).

В типичном эксперименте готовили 10 мкг/мл раствор поликлонального антитела в 10 мМ NaOAc pH5,0. Затем это поликлональное антитело иммобилизовали на CM5 сенсорном чипе с использованием соединения аминов (amine coupling) при помощи метода EDC/NHS (EDC=N-этил-N’-[3-диэтиламино-пропил]-карбодиимид; NHS=N-гидроксисукцинимид) в соответствии с методикой изготовителя. Иммобилизованное количество обеспечивало приблизительно 2700 единиц ответа (RU). Затем на поверхность вносили ISV в установленной концентрации 500 нM в течение 120 секунд при скорости потока 45 мкл в минуту. Поскольку не было выявлено эффективной регенерации буфера, время диссоциации было увеличено до 2400 секунд. Сигнал, полученный при внесении ISV в пустую проточную ячейку, вычитали из сигнала, полученного при внесении ISV в проточную ячейку со связанным поликлональным антителом. Пустую проточную ячейку активировали/деактивировали аналогичным образом, как и проточную ячейку для поликлонального антитела, но без добавления белка. Также вычитали результат «пустого» введения (HBS-EP + подвижный буфер (HBS = физраствор, забуференный Hepes: GE Healthcare) для корректировки возможного смещения базовой линии.

Для изучения эффекта добавления аминокислотных остатков на C-конец было исследовано влияние добавления 1 или 2 остатков aланина и 1, 2 или 3 остатков глицина путем сравнения связывания ISV с различными добавлениями с использованием аналитического поликлонального антитела, полученного как описано в Примере 2. Для этой цели были созданы и протестированы ISV, представляющие собой NB с 3.4 по 3.9 (SEQ ID NO: с 5 по 10).

Поскольку получены типичные примеры данных такого типа, Фигура 3 показывает связывание NB с 3.4 по 3.9 с иммобилизованным поликлональным антителом. Полученные результаты обобщены в Таблице V.

Таблица V

ID клона SEQ ID NO Положение
113⁽¹⁾ Положение
114⁽¹⁾ Положение
115⁽¹⁾ Положение
116⁽¹⁾ Связывание **
(RU) NB 3.4
NB 3.5
NB 3.6 5
6
7 S
S
S A
A A 75
9
8 NB 3.7
NB 3.8
NB 3.9 8
9
10 S
S
S G
G
G G
G G 31
13
13

**: сигнал связывания, полученный в конце введения ( = максимальный RU сигнал)

⁽¹⁾ в этой нумерации положение 113 является последним “S” С-концевого мотива VTVSS, и положения 114, 115 и 116 представляют собой положения, следующие непосредственно (по направлению к С-концу) за указанным положением 113.

Для изучения эффекта (других) замен в С-концевом участке, влияние различных замен было исследовано путем сравнения родственных ISV, содержащих эти замены, с использованием того же самого, описанного выше аналитического поликлонального антитела. Анализ проводили как описано выше.

ISV, содержащие указанные протестированные замены, представляют собой NB 3.1, 3.2 и 3.4 (SEQ ID NO 3, 4 и 5); NB 3.10 - 3.15 (SEQ ID NO с 11 по 16), которые сравнивали с NB 3.4; NB 4.1 и 4.2 (SEQ ID NO 17 и 18) и NB 6.1, 6.2, 6.4 и 6.5 (SEQ ID NO 19 - 22).

Получены типичные примеры данных такого типа:

- На фигуре 4 показано связывание NB 3.4, 3.11, 3.12 и 3.13 с иммобилизованным поликлональным антителом;

- На фигуре 5 показано связывание NB 3.4, 3.14 и 3.15 с иммобилизованным поликлональным антителом;

- На фигуре 6 показано связывание NB 3.1, 3.2 и 3.4 с иммобилизованным поликлональным антителом;

- На фигуре 7 показано связывание NB 4.1 и 4.2 с иммобилизованным поликлональным антителом;

- На фигуре 8 показано связывание NB 6.1, 6.2, 6.4 и 6.5 с иммобилизованным поликлональным антителом.

Полученные результаты обобщены в Таблицах VI, VII и VIII.

Таблица VI

ID клона SEQ ID NO Положение
14⁽¹⁾ Положение
83⁽¹⁾ Положение
108⁽¹⁾ Связывание **
(RU) NB 3.4
NB 3.10
NB 3.11
NB 3.12
NB 3.13 5
11
12
13
14 P
A
P
A
P R
R
K
R
R L
L
L
Q
Q 75
91
88
86
90

**: сигнал связывания, полученный в конце введения (= максимальный RU сигнал)

⁽¹⁾ нумерация в соответствии с Kabat.

Таблица VII

ID клона SEQ ID NO Положение
11⁽¹⁾ Положение 110⁽¹⁾ Связывание**
(RU) NB 3.4
NB 3.14
NB 3.15 5
15
16 L
L
S T
Q
T 75
79
22

**: сигнал связывания, полученный в конце введения (= максимальный RU сигнал)

⁽¹⁾ нумерация в соответствии с Kabat.

Таблица VIII

ID клона SEQ ID NO: Положение 14 Положение 83⁽¹⁾ Положение 108 ⁽²⁾ Метка* Связывание **
(RU) NB 3.1
NB 3.2
NB 3.4 3
4
5 A
A
P K
K
R Q
Q
L -
+
- 2
0
59 ID клона Положение 14 Положение 83 ⁽³⁾ Положение 108 ⁽⁴⁾ Метка * Связывание **
(RU) NB 4.1
NB 4.2 17
18 P
P R
R L
L -
+ 51
0 ID клона Положение 14 Положение 83 ⁽⁵⁾ Положение 108 ⁽⁶⁾ Метка * Связывание **
(RU) NB 6.1
NB 6.2
NB 6.4
NB 6.5 19
20
21
22 P
P
P
P K
K
R
R Q
Q
L
L +
-
+
- 0
39
0
66

*: в случае “+”, данный ISV содержит дополнительные аминокислоты на С-конце VTVSS

**: сигнал связывания, полученный в конце введения (= максимальный RU сигнал)

⁽¹⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 87 в SEQ ID NO с 3 по 5).

⁽²⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 123 в SEQ ID NO с 3 по 5).

⁽³⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 86 в SEQ ID NO 17 и 18).

⁽⁴⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 116 в SEQ ID NO 17 и 18).

⁽⁵⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 86 в SEQ ID NO с 19 по 22).

⁽⁶⁾: нумерация в соотв. с Kabat (соответствует a.a. в положении 112 в SEQ ID NO с 19 по 22).

Далее, без ограничения какой-либо конкретной гипотезой или объяснением, представленные выше данные показывают, что (различные) замены в С-концевом участке (как определено в этом документе) ISV могут изменять/улучшать его склонность к порождению белковой интерференции.

Пример 4: Типичные протоколы проведения ADA-анализов, приведенных на Фигуре 1

Этот Пример предоставляет некоторые типичные, но неограничивающие условия, которые могут использоваться для проведения конкурентных/мостиковых ADA-анализов, схематично показанных на Фигуре 1:

- ADA-анализ на Фигуре 1A в растворе: Образцы 100% матрица, 30’, 37°C, обработка кислотой с использованием уксусной кислоты в 10 матрице, 5’, RT, предварительная инкубация/нейтрализация образца кислотой: Сульфо-ISV (:Tris) 1:1:1 (1: 0,9:0,9: 0,1), 1ч, RT; на планшете 1 ч, RT; промывка 3x, буфер считывания 4X

- ADA-анализ на Фигуре 1B в растворе: Образцы 20% матрица, 30’, 37°C, предварительная инкубация образца: ISV- -Sulfo 1:1:1, 1ч, RT, на планшете 1 ч, RT, промывка 3x, буфер считывания 2x

- Последовательный ADA-анализ на Фигуре 1C: Захват ISV-Bio, 1 ч, RT, промывка 3X, Образцы 20% матрица, 15’, RT, на планшете 2 ч, RT, промывка 3X, обнаружение Сульфо-ALX-0141, 1ч, RT, промывка 3x, буфер считывания 4X

Пример 5: Предсказание чувствительности ISV к неспецифической белковой интерференции с использованием аналитического антитела

Этот пример описывает мостиковый/конкурентный ADA-анализ с использованием аналитического антитела, который может использоваться для предсказания чувствительности ISV к неспецифической белковой интерференции.

Тестируемый ISV разводили до концентрации 10 мкг/мл и инкубировали с 400 нг/мл аналитического антитела, очищенного в соответствии с Примером 2, и инкубировали при 37°C при 600 об/мин в 96-луночных полипропиленовых планшетах. Затем образец (50 мкл) разводили в соотношении 1/3 в смеси 1:1 (100 мкл) 2 мкг/мл биотинилированного и 2 мкг/мл меченого сульфо-группой ISV и инкубировали в течение 1 часа при RT, 600 об/мин. MSD MA^®96-луночные стандартные стрептавидиновые планшеты блокировали 150 мкл/лунку Superblock^® T20 в течение 1 часа при RT, затем промывали 3 раза PBS/0,05%Твин20 (= промывочный буфер). Образец и смесь 1:1 (биотинилированного и меченого сульфо-группой ISV) (50,0 мкл) переносили из полипропиленового планшета в MSD-планшет и инкубировали в течение 1 часа при RT, 600 об/мин. Планшеты промывали три раза перед добавлением 2 x буфера считывания (MSD) (150 мкл/лунку) и проводили считывание ECL единиц (ECLU) на приборе MSD (планшетный спектрофотометр Sector Imager 2400).

С помощью этого анализа было проведено тестирование и сравнение ISV SEQ ID NO 23 - 30. Данные показаны в Таблице IX. Эти данные не только показывают, что описанный в этом Примере способ анализа может использоваться для предсказания склонности ISV к порождению белковой интерференции, но также подтверждают данные из предыдущих Примеров по эффекту замен в С-концевом участке. Как видно, добавление 3 (и, в меньшей степени, 1) остатков аланина к С-концу полностью гуманизированного ISV устраняло его способность конкурировать со связыванием аналитическим антителом. Видоизменение положения 14 в варианте ISV дикого типа с аланина на пролин очевидно увеличивало его способность как конкурента при анализе (= делая ISV-вариант более склонным к неспецифической белковой интерференции), тогда как видоизменение положения 83 и 108 явно не влияло на чувствительность ISV к неспецифической белковой интерференции.

Таблица IX

ID аффинно-очищенного антитела IHuP#002-001-ABL-08 ECLU в скрининговом анализе (с использованием SEQ ID NO:1) 2919 Вариант Нанотела (находящиеся справа столбцы обозначают сделанные гуманизирующие замены и С-концевые добавления, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:23 дикого типа) ECLU подтверждаю-щий анализ % уменьшения SEQ ID NO: 23 VHH дикого типа 2706 7.3 SEQ ID NO: 24 VHH дикого типа +A14P 268 90.8 SEQ ID NO: 25 VHH дикого типа +K83R 2460 15.71 SEQ ID NO: 26 VHH дикого типа +Q108L 2533 13.23 SEQ ID NO: 27 VHH дикого типа +A14P+K83R+Q108L 319 89.1 SEQ ID NO: 28 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L 251 91.4 SEQ ID NO: 29 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 1 дополнительный A на С-конце (A114) 1207 58.64 SEQ ID NO: 30 VHH дикого типа + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 3 A на С-конце (A114+A115+A116) 3301 -13.09

Пример 6: Влияние добавления аминокислот к C-концу анти-OX40L Нанотел на их OX40L-блокирующую активность

Этот пример демонстрирует, что удлинение C-конца не влияет на активность или блокирующую активность Нанотел.

Активность in vitro оптимизированного трехвалентной биспецифической последовательностью анти-OX40L Нанотела Nb 3.16 (SEQ ID NO: 31) сравнили с активностью соответствующего Нанотела, содержащего один дополнительный Ala на его C-конце Nb 3.17 (SEQ ID NO: 32).

Первый анализ, исследование активации T-клеток, был проведен, как описано далее. PBMC выделяли из лейкоцитарных пленок (Red Cross, Ghent, Бельгия) здоровых доноров с использованием реагента Ficoll Paque Plus (GE Healthcare), промывали полной средой RPMI 1640 (RPMI1640 + GlutaMAX + 25 мM HEPES + 10% эмбриональной бычьей сыворотки + 1% пенициллин/стрептомицина, Invitrogen). PBMC (1x10⁵ клеток/лунку) стимулировали фитогемагглютинином (PHA-L; окончательная концентрация 0,6мкг/мл) перед добавлением 1x10⁴ hOX40L экспрессирующих CHO клеток (облученных гамма-сцинтиллятором при 3000 рад; UZ Gent, Бельгия) и серией разведений анти-OX40L Нанотел RPMI 1640 в полной среде и инкубировали в течение 22 часов при 37°C в CO₂ инкубаторе. Выработку IL2 клетками PBMC измеряли методом ELISA. Лунки планшета Maxisorp покрывали в течение ночи при 4°C анти-человек IL2 моноклональным анителом (BD Biosciences). После промывки и блокировки покрытых лунок, было добавлено разведение клеточного супернатанта ½. В качестве стандарта была включена ½ серия разведений рекомбинантного человеческого IL2 (BD Biosciences), начиная от 2000 пг/мл. Обнаружение проводили с помощью биотинилированного анти-человек IL2 моноклонального антитела (BD Biosciences) и HRP конъюгированного стрептавидина (Thermo Scientific) и esTMB (SDT Reagents). Реакцию останавливали с помощью 1N HCl и снимали показания OD при 450 нм. Как и ожидалось, активность оптимизированного трехвалентной биспецифической последовательностью Нанотела Nb 3.17 (IC50 = 0,13 нM, 95% CI = 0,098-0,17нM), была сравнима с активностью Nb 3.16 (IC50= 0,10нM, 95% CI = 0,071-0,15 нM).

Во втором конкурентном анализе на основе ELISA серию разведений (от 1,5мкM до 0,083 пM) Нанотел предварительно инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с 100нг/мл человеческого OX40/Fc (R&D Systems) и 10нг/мл биотинилированного человеческого OX40L (R&D Systems; биотинилированный «на месте», как описано в Примере 1) в PBS +0,1% BSA +0,01% Твин-20. Затем, образцы инкубировали в планшетах Maxisorp, покрытых 10мкг/мл анти-человек Fc Нанотелом (полученном «на месте») и блокировали с помощью PBS + 1% BSA +0,1% Твин-20. Связанные человеческие OX40/Fc обнаруживали с помощью HRP-конъюгированного стрептавидина (Thermo Scientific) и sTMB (SDT Reagents). Реакцию останавливали с помощью 1N HCl и снимали показания OD при 450 нм. В соответствии с клеточным анализом активность оптимизированного трехвалентной биспецифической последовательностью Нанотела Nb 3.17 (IC50= 0,178нM, 95% CI = 0,152-0,200нM) была сравнима с таковой Nb 3.16 (IC50 = 0,179нM, 95% CI = 0,149-0,215нM).

Пример 7: получение моноклонального антитела 21-4-3

Две группы мышей разных штаммов (BALB/c и NMRI – по три мыши в каждой) внутрибрюшинным путем иммунизировали конструкцией Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825, в эмульсии вода-в-масле из равных объемов антигена и полного или неполного адьюванта Фрейнда) в течение периода 39 дней, с ревакцинацией до того, как подходящие антисывороточные титры были получены.

После асфиксации стимулированных мышей в CO2, в стерильных условиях извлекали селезенку и готовили одноклеточную суспензию из объединенных селезенок. Клетки селезенки и миеломные клетки несколько раз промывали DMEM и объединяли в присутствии 1 мл 50% (вес/об) PEG 3350 (отношение клеток селезенки к SP2/0 3:1). Для слияния использовали линию клеток миеломы SP2/0-Ag14 из Коллекции микроорганизмов и клеточных культур Германии (DSMZ GmbH, Braunschweig). Эта линия клеток представляет собой гибрид между клетками селезенки BALB/c и линией клеток миеломы P3x63Ag8. Полученные таким образом гибридомы ресуспендировали в CGM, содержащей 20% FCS и аминоптерин (HAT среда) и высевали (140 мкл/лунку) в восемь 96-луночных плоскодонных планшетов для культур тканей (Corning-Costar), содержащих 140 мкл/лунку CGM (20% FCS) вместе с клетками перитонеального экссудата в качестве питающих клеток. Планшеты инкубировали в течение 10 дней в полной ростовой среде (CGM), содержащей DMEM с добавлением 2-меркаптоэтанола, L-глутамина, стабильного глутамина (Stable Glutamin), HT и неосновных аминокислот (в концентрациях, рекомендованных поставщиком) и FCS в разных концентрациях (10%, 15% или 20%). В течение этого периода в клетки два раза добавлялисреду HAT. Супернатанты (культуральная среда) от культур клеток гибридомы обычно содержали от 1 до 20 мкг/мл антитела, что было проверено в связывающем анализе ELISA для подтверждения связывания с конструкцией Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825.

Клетки из лунок, продуцирующих положительный IgG, перенесли в лунки 48-луночных планшетов и культивировали в течение 2-4 дней (в зависимости от показателей роста клеток). Проводили связывающий анализ ELISA на ALX081 и IgG человека/яванского макака для того, чтобы исключить неспецифические связывающие вещества. Клетки гибридомы, экспрессирующие связывающие вещества, специфические к конструкции Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825, клонировали дважды с использованием серийных разведений. После слияния и повторного скрининга были установлены 7 первичных культур, вырабатывающих антитела к ALX-081. Все эти первичные культуры продуцировали антитела, которые не давали перекрестной реакции с IgG человека или яванского макака. Первичные культуры переклонировали (дважды).

Клон 21-4 (один из клонов, который стабильно продуцировал антитела к ALX-081 после второго клонирования) был обозначен “ABH0015” и был размещен в Бельгийских скоординированных коллекциях микроорганизмов (BCCM) в Генте, Бельгия, 4 июня 2012 под инвентарным номером LMBP-9680-CB. Мышиное моноклональное продуцированное ABH0015 антитело было названо 21-4-3: изотип, установленный для 21-4-3 показал IgG1 тяжелую цепь и каппа-легкую цепь, которые были секвенированы (смотри SEQ ID NO: 35 и 36, соответственно). Было показано, что 21-4-3 связывается с C-концевым участком конструкции Нанотела SEQ ID NO:98 в WO 2006/122825 (данные не показаны).

Пример 8: Связывание 21-4 с ISV предсказывает склонность ISV подвергаться неспецифической белковой интерференции

Этот Пример вместе со следующим Примером 9 демонстрирует связывание моноклонального 21-4 с ISV, который используется для предсказания (в пределах точности, указанных в этом Примере) будет ли данный ISV обладать склонностью к неспецифической белковой интерференции (например, в ADA-анализе).

В частности, этот Пример 8 показывает, что 21-4 может использоваться для предсказания будут ли некоторые предложенные для данного ISV модификации (такие как добавление одной или более аминокислотных остатков к C-концу ISV и/или замена одной или более аминокислот в пределах C-концевого участка ISV) приводить к уменьшению склонности указанного ISV к неспецифической белковой интерференции.

Коротко, набор из 53 различных Нанотел или конструкций Нанотел (смотри Фигуру 9 и SEQ ID NO’s: 38 - 89) был проверен в отношении связывания моноклональным 21-4-3. Те же самые Нанотела и конструкции Нанотел также были проверены в отношении связывания очищенными препаратами фактора(ов) интерференции, полученными от трех различных людей-доноров (которые называются в документе “Донор 8”, “Донор 19” и “Донор 30”), чтобы посмотреть, есть ли корреляция между связыванием 21-4 и очищенными факторами интерференции.

Было установлено, что связывание ISV антителом 21-4 действительно может использоваться для предсказания связывания тех же самых ISV фактором(амии) интерференции (в пределах общей степени достоверности, предоставленной представленными в описании данными).

Для того, чтобы продемонстрировать это, как подробно описывают представленные ниже экспериментальные данные, связывание 53 Нанотел или конструкций Нанотел (как перечислено на Фигуре 9; смотри SEQ ID NO: 38 - 89) 21-4 было измерено с использованием Biacore T100 (согласно представленному ниже протоколу) и было сравнено со связыванием эталонного Нанотела или конструкции (также перечисленных на Фигуре 9), также измеренного на приборе Biacore и с использованием того же самого протокола. Результаты показаны в таблице X ниже.

Для каждого из испытываемых 53 Нанотел или конструкций Нанотел был выбран эталонный образец (эталон) для сравнения, тестируемые Нанотела или конструкции Нанотел имели один или более дополнительных аминокислотных остатков на C-конце (которые были добавлены для того, чтобы проверить воздействие такого добавления на белковую интерференцию, и в частности, для того, чтобы уменьшить указанную интерференцию) и/или одну или более мутаций в пределах C-концевого участка (например, вследствие гиманизации по сравнению с эталоном).

Результаты были выражены как процент уменьшения связывания (измеренного в RU единицах (условных единицах)) данного Нанотела против связывания эталона (также измеренного в RU единицах – например, если измеренный уровень связывания (RU) эталонного Нанотела составлял 276, и уровень связывания данного Нанотела (также в RU) составлял 9, тогда уменьшение уровня связывания происходило до уровня [9 RU/276 RU] x 100% = 3%), что означает уменьшение на 97% по сравнению с эталоном (100%).

Подобным образом, связывание очищенного фактора(ов) интерференции, полученного от каждого из трех доноров, с каждым из 53 Нанотел или конструкций Нанотел было измерено с помощью того же самого прибора Biacore и сравнено со связыванием очищенного фактора(ов) интерференции с тем же самым эталонным Нанотелом или конструкцией. Результаты были выражены в виде процента уменьшения связывания фактора интерференции с данным Нанотелом или конструкцией Нанотела против эталонного.

Было обнаружено, что фактически у всех Нанотел или конструкций Нанотел, у которых один или несколько аминокислотных остатков было добавлено к C-концу по сравнению с эталоном, наблюдалось существенное уменьшение связывания фактора(ов) интерференции. Это вновь подтверждает, что добавление одного или более остатков аминокислот к C-концу ISV (VTVSS) может уменьшить неспецифическую белковую интерференцию в ADA-анализе. Также было обнаружено, что в большинстве случаев только замена аминокислотных остатков в пределах C-концевого участка (т.е. без добавления одного или более остатков аминокислот к C-концу) по сравнению с эталоном не оказывает подобного существенного влияния на связывание фактора(ов) интерференции.

Затем результаты были дополнительно проанализированы, чтобы определить коррелировало ли каким-либо образом уменьшение связывания 21-4 с уменьшением связывания каждым из трех разных препаратов очищенного фактора интерференции по сравнению с эталоном. Такие корреляции были обнаружены.

Например, было обнаружено, что из 54 проверенных Нанотел или конструкций Нанотел 36 показали уменьшение связывания антителом 21-4 более, чем на 70%, по сравнению с их соответствующей эталонной последовательностью (при этом большинство из этих 36 имели один или более дополнительных аминокислотных остатков на C-конце, в некоторых случаях в комбинации с заменами в пределах C-концевого участка). Из этих 36, 32 также показали уменьшение связывания фактором(ами) интерференции по сравнению с эталоном более, чем на 50% (и в большом числе случаев, в частности, для Нанотел или конструкций Нанотел с добавлением одного или более аминокислотных остатков на C-конце, уменьшение составляло гораздо больше, чем 50%, например, больше, чем 70% или даже больше, чем 90%, смотри данные представленные в Таблице X). Это показывает, что в 32 из 36 случаев (т.е. 89%), уменьшение связывания 21-4 более, чем на 70% (по сравнению с эталоном = 100%) предсказывает уменьшение связывания факторами интерференции более, чем на 50% (по сравнению с тем же самым эталоном). Для ясности, в каждом случае уменьшение было вычислено как 100% - [процент, данный в таблицах ниже для уровня уменьшения, достигнутого при использовании тестированного Нанотела].

Аналогично, было обнаружено, что из 53 проверенных Нанотел или конструкций Нанотел 33 показали уменьшение связывания антителом 21-4 более, чем на 90%, по сравнению с их соответствующей эталонной последовательностью (и в этом случае, большинство из этих 36 имели один или более дополнительных аминокислотных остатков на C-конце, в некоторых случаях в комбинации с заменами в пределах C-концевого участка). Из этих 33, 32 также показали уменьшение связывания фактором(ами) интерференции по сравнению с их соответствующей эталонной последовательностью более, чем на 50%. Это показывает, что в 32 из 33 случаев (т.е. 97%) уменьшение связывания антителом 21-4 более, чем на 90% (по сравнению с эталоном), предсказывает уменьшение связывания факторами интерференции более, чем на 50% (по сравнению с эталоном).

Следует отметить, что такое уменьшение связывания фактора(ов) интерференции более, чем на 50% (что подтверждено уменьшением связывания 21-4 более, чем на 70%) означает, что такой фактор(ы) интерференции фактически больше не препятствует ADA-анализу в отношении обсуждаемого ISV: экспериментальное подтверждение с использованием ADA-анализа показало, что когда связывание фактором(ами) интерференции уменьшается более, чем на 45%, тогда не наблюдается значительного влияния присутствия фактора(ов) интерференции на ADA-анализ. В этом отношении специалистам также должно быть понятно, что это будет тем более происходить в том случае, когда связывание фактором(амии) интерференции уменьшается в гораздо большей степени, чем на 50% (например, больше, чем на 70% или даже более, чем на90%), как наблюдается в некоторых случаях (смотри снова данные, представленные здесь).

Собственно, было обнаружено, что уменьшение более, чем на 45%, связывания 21-4 свидетельствует об уменьшении связывания факторами интерференции более, чем на 45%, что, как уже говорилось, означает, что фактор(ы) интерференции больше не препятствует ADA-анализу.

Более того, представленные здесь данные в отношении корреляции между (уменьшением) связыванием 21-4 и (уменьшением) связыванием фактором интерференции, также позволяют настоящим изобретателям установить абсолютное значение для связывания 21-4 ниже которого, как можно предполагать (в пределах достоверности, предоставленной данными, представленными в этом Примере 8), что ISV или конструкция на основе ISV не будет восприимчивым к связыванию фактором(ами) интерференции, чтобы препятствовать при этом ADA-анализу. Как установлено в следующем Примере 9, это значение составляет 500 RU (определено и вычислено, как установлено в Примере 9).

Моноклональное 21-4 было очищено из культуральной среды гибридомы, полученной в Примере 7 выше, как указано далее: Клетки гибридомы, секретирующие моноклональное антитело 21-4-3, культивировали во вращающихся колбах в бессывороточной среде (CD Hybridoma, Gibco, с добавлением 8мM L-глутамина (Invitrogen) и 1×холестерола (250× липидный концентрат холестерина, Gibco)) в объеме 100мл или 500мл. Очищенный супернатант фильтровали, а мышиный IgG1 захватывался на колонке ProteinA (HiTrap MabSelect SuRe, 5мл, GE Healthcare) при пониженной скорости потока 2мл/мин. Связанное антитело элюировали в 0,1M цитратном буфере pH 3.0, а фракции элюирования (5мл) непосредственно нейтрализовали 1мл 1M TRIS pH9. Чистота антитела была подтверждена восстанавливающим и невосстанавливающим SDS-PAGE-анализом.

Очищенные препараты фактора(ов) интерференции от Доноров 8 и 19 были получены из образцов сыворотки от указанных доноров посредством аффинной очистки, в основном как описано в Примере 2A. Фактор(ы) интерференции от Донора 30 были получены из образца сыворотки Донора 30, в принципе как описано в Примере 2B.

Для определения связывания 21-4 с каждым из Нанотел или конструкций Нанотел использовали протокол, описанный в Примере 9.

Связывание факторов интерференции от трех доноров с каждым из Нанотел или конструкций Нанотел было определено с помощью Biacore T100, в основном как описано в Примере 3, с использованием фактора интерференции от каждого из доноров 8, 19 и 30, непосредственно иммобилизованного на сенсорном чипе CM5.

Пример 9: Протокол предсказания, будет ли ISV иметь склонность подвергаться неспецифической белковой интерференции (с использованием моноклонального 21-4)

Измерение связывания проводили с помощью Biacore T100 с использованием сенсорного чипа CM5 T120416, с подвижным буфером HBS-EP+, 25°C. 21-4 захватывался посредством иммобилизованного кроличьего анти-мышиный IgG, так как было обнаружено, что поверхность непосредственно иммобилизорванного mAb 21-4-3 не могла быть эффективно регенерирована. Использованный анти-мышь IgG представлял собой поликлональные кроличьи анти-мышь IgG антитела, реагирующие со всеми подклассами IgG, IgA и IgM (GE Healthcare; Cat#BR-1008-38; Lot#10056316). Иммобилизацию анти-мышь IgG осуществляли с помощью соединения аминов (manual amine coupling), используя 7 минутное введение EDC/NHS для активации и 7 минутное введение 1M этаноламин HCl pH 8,5 для деактивации (Biacore, набор для связывания аминов). Условия связывания перечислены в Таблице XI. Исходя из уровня иммобилизации и MW белков, теоретическое значение R_max для mAb21-4-3 связывания с иммобилизованным анти-мышь IgG составляло ~13000RU (когда одна mAb21-4-3 молекула связывается с одной молекулой анти-мышь IgG).

Таблица XI

Белок Конц. (мкг/мл) Время контакта (сек) Скорость потока (мкл/мин) Буфер для иммоби-лизации Уровень иммоби-лизации Анти-мышь IgG 30 420 5 10мM ацетатный pH5 13028 Анти-мышь IgG 30 420
24 5 10мM ацетатный pH5 13318

Условия, использованные в экспериментах по связыванию (Biacore T100) с применением иммобилизованных 21-4, также представлены в Таблице XII. Поверхность анти-мышь IgG могла быть успешно регенерирована после захвата mAb21-4-3 и введения всех образцов (с ограниченным увеличением в отношении исходного уровня после каждой регенерации).

Таблица XII

Захват (улавливание) Путь потока 4 Скорость потока (мкл/мин) 10 Время контакта (сек) 180 Концентрация (мкг/мл) 10 Связывание и диссоциация Путь потока 3,4 Скорость потока (мкл/мин) 45 Время контакта образца (сек) 120 Концентрация образца (нM) 500 Время диссоциации (сек) 600 Регенерация 1 Путь потока 3,4 Скорость потока (мкл/мин) 10 Контактное время регенерации (сек) 180 Буфер для регенерации 10мM Глицин-HCl pH1,7 Время стабилизации (сек) 120 если …тогда…еще Если после регенерации 1 >20RU на Fc4 Другой цикл выхода Регенерация 2 Путь потока 3,4 Скорость потока (мкл/мин) 10 Контактное время регенерации (сек) 120 Буфер для регенерации 10мM Глицин-HCl pH1,7 Время стабилизации (s) 120

Приведенный выше протокол использовали для получения результатов связывания 21-4, представленных в Таблице X. Когда рассматривались абсолютные значения RU (после корректировки измеренного значения RU в соответствии с молекулярной массой ISV, белка или полипептида в соответствии с формулой ([RU измеренный]/[MW белка] x 10⁶), было обнаружено, что Нанотела и конструкции Нанотел, упомянутые в Таблице X, которые имели добавочный остаток аланина и которые показали >90% уменьшение связывания в отношении 21-4, а также в отношении факторов интерференции, как правило, предоставляли RU-значения между 30RU и 400RU (при этом соответствующие эталонные Нанотела или полипептиды – как перечислено на Фигуре 9 – имеют RU значения больше, чем 1000, обычно больше, чем 1500, и часто больше чем 2000).

Исходя из этого, полагают, что (скорректированное) RU значение меньше, чем 500, в этом способе анализа может со всей очевидностью показывать ISV (или белок или полипептид, содержащий, по меньшей мере, один IS, как описано здесь), который не будет (фактически) связываться факторами интерференции таким образом, чтобы препятствовать ADA-анализу.

Полное содержание всех ссылок (включая библиографию, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки), цитированных на всем протяжении данной заявки, явным образом включено в данный документ путем отсылки, в частности основополагающей ссылки, которая упоминается в описании.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ablynx N.V.

<120> TECHNIQUES FOR PREDICTING, DETECTING AND REDUCING ASPECIFIC

PROTEIN INTERFERENCE IN ASSAYS INVOLVING IMMUNOGLOBULIN SINGLE

VARIABLE DOMAINS

<130> P011-08-PCT

<160> 89

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 270

<212> PRT

<213> -

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Lys Ser Ser Gly Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Arg Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Thr Tyr Asp Asn Arg

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

130 135 140

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met

165 170 175

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

180 185 190

Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp

195 200 205

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

210 215 220

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu

245 250 255

Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> -

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

145 150 155 160

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

165 170 175

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp

180 185 190

Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

195 200 205

Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu

210 215 220

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser

225 230 235 240

Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

275 280 285

Ser Ser Tyr Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg

290 295 300

Glu Phe Val Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

325 330 335

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val

340 345 350

Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp

355 360 365

Tyr Arg Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

370 375 380

Ser

385

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> -

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 140

<212> PRT

<213> -

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

115 120 125

Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His

130 135 140

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> -

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 125

<212> PRT

<213> -

<400> 6

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 7

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 8

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

115 120

<210> 9

<211> 125

<212> PRT

<213> -

<400> 9

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

<210> 10

<211> 126

<212> PRT

<213> -

<400> 10

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 11

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 12

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 13

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 14

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 15

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 16

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 146

<212> PRT

<213> -

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Arg Asp Trp Asp Phe Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val

130 135 140

Gly Gly

145

<210> 19

<211> 151

<212> PRT

<213> -

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

130 135 140

Ala His His His His His His

145 150

<210> 20

<211> 128

<212> PRT

<213> -

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 21

<211> 151

<212> PRT

<213> -

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

130 135 140

Ala His His His His His His

145 150

<210> 22

<211> 128

<212> PRT

<213> -

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 23

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 23

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Gln Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 24

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 24

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Gln Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 25

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 25

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Gln Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 26

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 26

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 27

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 27

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 28

<211> 134

<212> PRT

<213> -

<400> 28

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 29

<211> 137

<212> PRT

<213> -

<400> 29

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

130 135

<210> 30

<211> 137

<212> PRT

<213> -

<400> 30

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser

50 55 60

Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

85 90 95

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

130 135

<210> 31

<211> 367

<212> PRT

<213> -

<400> 31

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met

145 150 155 160

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

165 170 175

Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile

210 215 220

Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

245 250 255

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

260 265 270

Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg

275 280 285

His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly

290 295 300

Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

325 330 335

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr

340 345 350

Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360 365

<210> 32

<211> 368

<212> PRT

<213> -

<400> 32

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met

145 150 155 160

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

165 170 175

Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile

210 215 220

Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

245 250 255

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

260 265 270

Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg

275 280 285

His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly

290 295 300

Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

325 330 335

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr

340 345 350

Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

355 360 365

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> -

<400> 33

Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 34

<211> 6

<212> PRT

<213> -

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X = a group (X)n, in which N = 1-10, preferably 1-5 and X is any

amino acid.

<400> 34

Val Thr Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 35

<211> 218

<212> PRT

<213> -

<400> 35

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Val Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Leu Ile His Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp

165 170 175

Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro

180 185 190

Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215

<210> 36

<211> 214

<212> PRT

<213> -

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Phe

20 25 30

Ile Ser Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Val Pro Arg Leu Ile Ile

35 40 45

His Asp Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Thr Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu His Tyr Asp Asn Leu Leu Arg

85 90 95

Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 37

<211> 122

<212> PRT

<213> -

<400> 37

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 38

<211> 271

<212> PRT

<213> -

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Lys Ser Ser Gly Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Arg Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Thr Tyr Asp Asn Arg

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

130 135 140

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met

165 170 175

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala

180 185 190

Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp

195 200 205

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

210 215 220

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu

245 250 255

Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

260 265 270

<210> 39

<211> 386

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanobody or Nanobody construct

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

145 150 155 160

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

165 170 175

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp

180 185 190

Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

195 200 205

Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu

210 215 220

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser

225 230 235 240

Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

275 280 285

Ser Ser Tyr Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg

290 295 300

Glu Phe Val Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

325 330 335

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val

340 345 350

Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp

355 360 365

Tyr Arg Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

370 375 380

Ser Ala

385

<210> 40

<211> 364

<212> PRT

<213> -

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

260 265 270

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala

275 280 285

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu

290 295 300

Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro

325 330 335

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn

340 345 350

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

355 360

<210> 41

<211> 246

<212> PRT

<213> -

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

130 135 140

Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

145 150 155 160

Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr

195 200 205

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala

245

<210> 42

<211> 260

<212> PRT

<213> -

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn

20 25 30

Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro

100 105 110

Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe

145 150 155 160

Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg

165 170 175

Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro

180 185 190

Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg

195 200 205

Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg

225 230 235 240

Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser Ala

260

<210> 43

<211> 250

<212> PRT

<213> -

<400> 43

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Ile Gly Leu Ser Ser Ser Cys Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

145 150 155 160

Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

165 170 175

Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

180 185 190

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

195 200 205

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

210 215 220

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

245 250

<210> 44

<211> 368

<212> PRT

<213> -

<400> 44

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met

145 150 155 160

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser

165 170 175

Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile

210 215 220

Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

245 250 255

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

260 265 270

Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg

275 280 285

His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly

290 295 300

Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

325 330 335

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr

340 345 350

Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

355 360 365

<210> 45

<211> 117

<212> PRT

<213> -

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 46

<211> 143

<212> PRT

<213> -

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala

115 120 125

Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

130 135 140

<210> 47

<211> 146

<212> PRT

<213> -

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Arg Asp Trp Asp Phe Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val

130 135 140

Gly Gly

145

<210> 48

<211> 151

<212> PRT

<213> -

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

130 135 140

Ala His His His His His His

145 150

<210> 49

<211> 151

<212> PRT

<213> -

<400> 49

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr

100 105 110

Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

130 135 140

Ala His His His His His His

145 150

<210> 50

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 50

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 51

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 52

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Ser

115 120

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 53

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> -

<400> 54

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly

115 120

<210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> -

<400> 55

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 56

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 56

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120

<210> 57

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 57

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120

<210> 58

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 58

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120

<210> 59

<211> 125

<212> PRT

<213> -

<400> 59

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

<210> 60

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 60

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro

115 120

<210> 61

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 61

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro

115 120

<210> 62

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 62

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr

115 120

<210> 63

<211> 122

<212> PRT

<213> -

<400> 63

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Trp

115 120

<210> 64

<211> 122

<212> PRT

<213> -

<400> 64

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu

115 120

<210> 65

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 65

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 66

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 67

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 68

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 69

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 70

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 71

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 71

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 72

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 72

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly

115 120

<210> 73

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 73

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly Gly

115 120

<210> 74

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 74

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

115 120

<210> 75

<211> 125

<212> PRT

<213> -

<400> 75

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

<210> 76

<211> 126

<212> PRT

<213> -

<400> 76

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

<210> 77

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 77

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 78

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 78

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 79

His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

1 5 10 15

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser

20 25 30

Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu

35 40 45

Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr

50 55 60

Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120

<210> 80

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 80

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly

115 120

<210> 81

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 81

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 82

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 82

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 83

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 83

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ala

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 84

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 84

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Ser

115 120

<210> 85

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 85

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly

115 120

<210> 86

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 86

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 87

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 87

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly

115 120

<210> 88

<211> 124

<212> PRT

<213> -

<400> 88

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 89

<211> 123

<212> PRT

<213> -

<400> 89

His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg

20 25 30

Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly

35 40 45

Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn

50 55 60

Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly

115 120

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новому способу снижения неспецифической белковой интерференции. Изобретение раскрывает одиночный вариабельный домен (ISV) тяжелой цепи иммуноглобулина, в С-концевую область аминокислотной последовательности которого был введен ряд аминокислотных замен с целью снижения склонности белка к неспецифической интерференции. Белки и белковые конструкции, содержащие такие модифицированные ISV с улучшенными свойствами, могут быть применимы в терапии и диагностике. 7 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 пр., 12 табл., 9 ил.

1. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина со сниженной склонностью к неспецифической интерференции белков для использования в терапии, где

тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина модифицирован на С-конце своей последовательности путем

(i) введения одной или более аминокислотных замен в С-концевой области, выбранных из

валина (V) в положении 11,

глутамина (Q) в положении 110,

глицина (G) в положении 112 и

глицина (G) в положении 113,

где аминокислотные остатки пронумерованы согласно Kabat; и

(ii) добавления к С-концу последовательности 1-10 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из любой природной аминокислоты.

2. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по п. 1, который был модифицирован на С-конце своей последовательности путем

(i) введения одной или более аминокислотных замен в С-концевой области, выбранных из

валина (V) в положении 11,

глутамина (Q) в положении 110,

глицина (G) в положении 112 и

глицина (G) в положении 113,

где аминокислотные остатки пронумерованы согласно Kabat; и

(ii) добавления к С-концевой последовательности 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из любой природной аминокислоты.

3. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1 или 2, где указанные природные аминокислоты независимо выбраны из аланина, глицина, валина, лейцина или изолейцина.

4. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-3, который имеет последовательность VTVSS(X)n на своем C-конце, где

a) n=1, 2 или 3, где каждый X=Ala или Gly; или

b) n=1, 2 или 3, где каждый X=Ala; или

c) n=1, 2 или 3, где каждый X=Gly; или

d) n=2 или 3, где по меньшей мере один X=Ala или Gly; или

e) n=2 или 3, где все кроме одного X=Ala или Gly.

5. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-4, который имеет последовательность VTVSS(X)n на своем С-конце, где:

- X является Ala и n равен 1, 2 или 3; или

- X является Gly и n равен 2 или 3.

6. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-5, который имеет последовательность VTVSS(X)n на своем С-конце, где X является Ala и n равен 1.

7. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-6, у которого была модифицирована С-концевая часть его последовательности путем введения остатка валина(V) в положение 11.

8. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-7, который имеет значительно сниженную склонность, как, например, по меньшей мере статистически значимо сниженную склонность, к порождению белковой интерференции, по сравнению с тем же одиночным вариабельным доменом иммуноглобулина, но без модификаций.

9. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-8, который имеет в анализе, описанном в примере 3, значительно меньшую склонность к связыванию с поликлональным антителом, описанным в примере 2, по сравнению с тем же одиночным вариабельным доменом иммуноглобулина, но без модификаций.

10. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-8, который имеет в анализе, описанном в примере 5, значительно меньшую склонность к связыванию с поликлональным антителом, описанным в примере 2, по сравнению с тем же одиночным вариабельным доменом иммуноглобулина, но без модификаций.

11. Тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-10, который является гуманизированным VHH или камелизированным VH, как, например, камелизированным VH человека.

12. Полипептид для использования в терапии, где полипептид содержит тяжелоцепочечный одиночный вариабельный домен иммуноглобулина согласно любому из пп. 1-11 на своем C-конце.

13. Полипептид согласно п. 12, который является бивалентной, мультивалентной, биспецифической, мультиспецифической, бипаратопной или мультипаратопной конструкцией тяжелоцепочечного одиночного вариабельного домена иммуноглобулина.

14. Полипептид для использования в терапии, содержащий один или более тяжелоцепочечных одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина по любому из пп. 1-11 на своем С-конце и дополнительно содержащий один или несколько других терапевтических агентов и/или один или несколько иных агентов, которые влияют на фармакокинетические или фармакодинамические свойства полипептида.

15. Полипептид по п. 14, где один или несколько других агентов влияют на период полужизни полипептида.

16. Полипептид по п. 15, где один или несколько других агентов увеличивают период полужизни полипептида.

17. Полипептид по любому из пп. 14-16, где один или несколько других агентов содержат одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий сывороточный альбумин.

18. Применение одиночного вариабельного домена иммуноглобулина по любому из пп. 1-11, в способе лечения.

19. Применение полипептида по любому из пп. 12-17, в способе лечения.

20. Фармацевтическая композиция, которая содержит

одиночный вариабельный домен иммуноглобулина по любому из пп. 1-11 или полипептид по любому из пп. 12-17 в терапевтически активной дозе и

по меньшей мере один подходящий носитель, разбавитель или эксципиент.

21. Биологическое лекарственное средство, такое как белок или полипептид, для использования в терапии, где это биологическое лекарственное средство содержит по меньшей мере один одиночный вариабельный домен иммуноглобулина согласно любому из пп. 1-11 на своем C-конце.