СТРАТЕГИЯ ДОЗИРОВАНИЯ, УМЕНЬШАЮЩАЯ СИНДРОМ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ БИСПЕЦИФИЧНЫХ АНТИТЕЛ К CD3/C20 Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 A61K31/573 A61K39/00 A61P35/00 

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] В данную заявку посредством ссылки включен перечень последовательностей, представленный в машиночитаемой форме в виде файла 10496WO01-Sequence, созданного 30 августа 2019 года и имеющего размер 162944 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение принадлежит к области медицины и относится к стратегиям дозирования и схемам введения терапевтических антител (например, биспецифичных антител, нацеленных на Т-клетки), которые уменьшают частоту случаев и тяжесть синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции у пациентов, проходящих иммунотерапию.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Синдром высвобождения цитокинов (СВЦ) - это системная воспалительная реакция, которая может быть вызвана множеством факторов, включая некоторые лекарственные средства. Виды иммунотерапии рака, активирующие Т-клетки, сопряжены с особенно высоким риском СВЦ, что обычно связано с воздействиями на мишень, индуцируемыми связыванием биспецифичного антитела или Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR) с их антигеном и последующей активацией сторонних иммунных клеток и неиммунных клеток, таких как эндотелиальные клетки. Активация сторонних клеток приводит к массовому высвобождению ряда цитокинов. IL-6, IL-10 и интерферон (IFN)-ɣ входят в число основных цитокинов, уровень которых постоянно повышен в сыворотке пациентов с СВЦ. При использовании терапевтических средств, активирующих Т-клетки, направленных против опухолевых клеток, СВЦ запускается массовым высвобождением IFN-ɣ активированными Т-клетками или самими опухолевыми клетками. Секретируемый IFN-ɣ индуцирует активацию других иммунных клеток, в первую очередь макрофагов, которые, в свою очередь, продуцируют избыточные количества дополнительных цитокинов, таких как IL-6, TNF-α и IL-10. IL-6, в частности, вносит вклад во многие ключевые симптомы СВЦ, включая транссудацию и активацию каскада комплемента и коагуляции, вызывающего синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Кроме того, IL-6, вероятно, вносит вклад в развитие кардиомиопатии, вызывая нарушение функции миокарда. Shimabukaro-Vornhagen et al., Journal for Immunotherapy of Cancer, 6:56, стр. 1-14, 2018. В некоторых случаях симптомы, связанные с СВЦ, называются инфузионной реакцией (ИР), если они проявляются менее чем через шесть часов после начала инфузии, и СВЦ, если они проявляются через шесть часов и более после начала инфузии.

[0004] Контроль токсичных свойств иммунотерапии рака является сложной клинической задачей. Уменьшение СВЦ или ИР является ключевой особенностью применения определенных видов терапии, например, CAR Т-клеток и биспецифичных антител, нацеленных на Т-клетки. СВЦ легкой степени обычно лечится симптоматически с помощью антигистаминных препаратов, жаропонижающих средств и жидкостей. Тяжелый СВЦ может представлять собой опасное для жизни нежелательное явление, требующее быстрого и интенсивного лечения. Снижение опухолевой нагрузки, ограничение дозы проводимой терапии и премедикация стероидами снижают частоту развития тяжелого СВЦ, равно как и использование антицитокиновых препаратов. Тоцилизумаб, антитело к IL-6, стало стандартом начального лечения тяжелого СВЦ в некоторых условиях. Однако использование ограничений по дозе и терапии для минимизации активности цитокинов может иметь пагубные последствия для эффективности иммунотерапии. Таким образом, сохраняется потребность в альтернативных стратегиях для уменьшения потенциально опасных для жизни проявлений СВЦ без отрицательного воздействия на терапевтические полезные эффекты иммунотерапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для уменьшения нежелательных эффектов синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции, включающему: (i) введение частей первичной дозы (D1) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 10 мг указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D1; (ii) введение частей вторичной дозы (D2) указанного терапевтического белка на неделе 2 схемы дозирования, где указанная вторичная доза составляет не более половины максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, и F2D2 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D2 на неделе 2 схемы дозирования; и (iii) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

[0006] В некоторых случаях F2D1 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D1. В некоторых случаях F2D1 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D1. В некоторых случаях F2D2 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D2. В некоторых случаях F2D2 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D2. В некоторых случаях указанная последующая неделя является неделей 3 схемы дозирования. В некоторых случаях указанная последующая неделя является неделей 4 схемы дозирования. В некоторых случаях указанная последующая неделя является неделей 14 схемы дозирования. В некоторых случаях указанная последующая неделя является любой из недель 4-36 схемы дозирования.

[0007] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает: (i) введение частей третичной дозы (D3) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная третичная доза составляет не менее половины указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка и не более указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D3) составляет от 40% до 60% суммарной третичной дозы, вторая часть дозы (F2D3) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной третичной дозы, и F2D3 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D3 на неделе 1 схемы дозирования; и (ii) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

[0008] В некоторых случаях F2D3 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D3. В некоторых случаях F2D3 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D3.

[0009] В некоторых случаях указанная последующая неделя является неделей 4 схемы дозирования. В некоторых случаях указанная последующая неделя является неделей 14 схемы дозирования. В некоторых случаях указанная последующая неделя является любой из недель 4-36 схемы дозирования. В различных вариантах осуществления третичную дозу вводят в виде разовой дозы на неделях 4-12 схемы дозирования.

[0010] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для уменьшения нежелательных эффектов синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции, включающему: (i) введение частей первичной дозы (D1) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 10 мг указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D1; (ii) введение частей вторичной дозы (D2) указанного терапевтического белка на неделе 2 схемы дозирования, где указанная вторичная доза равна максимальной недельной дозе указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет 50% суммарной вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет 50% суммарной вторичной дозы, и F2D2 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D2 на неделе 2 схемы дозирования; и (iii) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

[0011] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для уменьшения нежелательных эффектов синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции, включающему: (i) введение частей первичной дозы (D1) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 10 мг указанного терапевтического белка, где D1 вводят субъекту несколькими частями дозы (например, F1D1, F2D1, F3D1, F4D1, F5D1) в последовательные дни в течение недели 1; (ii) введение частей вторичной дозы (D2) указанного терапевтического белка на неделе 2 схемы дозирования, где указанная вторичная доза равна или меньше максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка и ее вводят субъекту несколькими частями (например, F1D2, F2D2, F3D2, F4D2, F5D2) в последовательные дни на неделе 2; и (iii) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы (MD) указанного терапевтического белка в виде нескольких частей MD или в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

[0012] В некоторых вариантах осуществления вторую часть дозы (F2) вводят субъекту через 12-96 (например, 24-72) часов после введения первой части дозы (F1), необязательно, третью часть дозы (F3) вводят субъекту не менее чем через 24 часа после введения второй части дозы (F2), необязательно, четвертую часть дозы (F4) вводят субъекту не менее чем через 24 часа после введения третьей части дозы (F3), и, необязательно, пятую часть дозы (F5) вводят субъекту не менее чем через 24 часа после введения четвертой части дозы (F4) на неделе 1, 2 или 3 схемы дозирования.

[0013] В некоторых вариантах осуществления способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают введение одной или более «поддерживающих» доз на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы. В некоторых случаях каждую поддерживающую дозу вводят через 2, 3 или 4 недели после непосредственно предшествующей дозы. В одном из вариантов осуществления поддерживающая доза представляет собой максимальную недельную дозу терапевтического белка, вводимую в виде разовой дозы.

[0014] В некоторых случаях максимальную недельную дозу (MD) терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы в течение от 1 до 8 недель, от 1 до 12 недель или от 1 до 16 недель на протяжении еженедельной фазы схемы дозирования. В некоторых случаях максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы один раз в две недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования. В некоторых случаях максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы один раз в три недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования. В некоторых случаях максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы один раз в четыре недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет до 86 недель. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет до 87 недель. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет до 88 недель. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет более 86 недель, более 100 недель, более 150 недель, более 200 недель или более 250 недель. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет по меньшей мере 24 недели. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая фаза составляет 24 недели.

[0015] В различных вариантах осуществления первичная доза составляет 1 мг. В различных вариантах осуществления вторичная доза составляет 20 мг. В различных вариантах осуществления третичная доза составляет 40 мг. В различных вариантах осуществления третичная доза составляет 80 мг. В различных вариантах осуществления третичная доза составляет 160 мг. В различных вариантах осуществления третичная доза составляет 320 мг.

[0016] В различных вариантах осуществления F1D1 составляет 50% суммарной первичной дозы, и F2D1 составляет 50% суммарной первичной дозы. В различных вариантах осуществления F1D2 составляет 50% суммарной вторичной дозы, и F2D2 составляет 50% суммарной вторичной дозы. В различных вариантах осуществления F1D3 составляет 50% суммарной третичной дозы, и F2D3 составляет 50% суммарной третичной дозы.

[0017] В некоторых случаях максимальная недельная доза (MD) терапевтического белка составляет от 5 мг до 320 мг. В различных вариантах осуществления максимальная недельная доза терапевтического белка составляет 6-320 мг, 10-320 мг, 5-40 мг, 5-80 мг, 5-160 мг, 12-40 мг, 18-80 мг, 40-80 мг, 80-160 мг, 160-320 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 12 мг, 18 мг, 27 мг, 40 мг, 80 мг, 160 мг или 320 мг. В некоторых вариантах осуществления максимальная недельная доза составляет 80 мг. В некоторых вариантах осуществления максимальная недельная доза составляет 160 мг. В некоторых вариантах осуществления максимальная недельная доза составляет 320 мг.

В некоторых случаях поддерживающая доза терапевтического белка составляет от 5 мг до 320 мг. В различных вариантах осуществления поддерживающая доза терапевтического белка составляет 6-320 мг, 10-320 мг, 5-40 мг, 5-80 мг, 5-160 мг, 12-40 мг, 18-80 мг, 40-80 мг, 80-160 мг, 160-320 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 12 мг, 18 мг, 27 мг, 40 мг, 80 мг, 160 мг или 320 мг. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза составляет 80 мг. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза составляет 160 мг. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза составляет 320 мг.

[0018] В некоторых случаях каждую дозу или часть дозы вводят субъекту в течение периода от 1 до 6 часов.

[0019] В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирован рак. В некоторых случаях рак представляет собой B-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях B-клеточное злокачественное новообразование представляет собой CD20+ B-клеточное злокачественное новообразование. В некоторых случаях рак представляет собой неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому маргинальной зоны, макроглобулинемию Вальденстрема, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, лимфобластную лимфому или лимфому Беркитта. В некоторых случаях рак выбран из карциномы поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака предстательной железы, злокачественных глиом, остеосаркомы, колоректального рака, рака желудка, злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичника, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, синовиальной саркомы, рака щитовидной железы, рака молочной железы, меланомы, глиомы, рака молочной железы, плоскоклеточной карциномы, рака пищевода, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, онкоцитомы, переходно-клеточной карциномы, уротелиальной карциномы, аденокарциномы мочевого пузыря или мелкоклеточной карциномы мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирована фолликулярная лимфома (ФЛ). В некоторых случаях ФЛ имеет степень 1-3a. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирована диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ). В одном из вариантов осуществления у субъекта диагностирована рецидивирующая/рефрактерная ДВККЛ. В некоторых случаях у субъекта с диагнозом ДВККЛ была неэффективной предшествующая CAR-T терапия. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирована мантийноклеточная лимфома (МКЛ). В некоторых случаях у субъекта с диагнозом МКЛ была неэффективной предшествующая терапия ингибитором тирозинкиназы Брутона (BTK). В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирована лимфома маргинальной зоны (ЛМЗ).

[0020] В некоторых случаях субъектом является человек, взрослый человек или ребенок (возрастом менее восемнадцати лет).

[0021] В различных вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых случаях антитело представляет собой полностью человеческое антитело. В некоторых случаях антитело представляет собой биспецифичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит первое антигенсвязывающее плечо, которое связывается с Т-клеточным антигеном. В некоторых случаях Т-клеточный антиген представляет собой CD3. В некоторых случаях Т-клеточный антиген представляет собой CD28. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит второе антигенсвязывающее плечо, которое связывается с антигеном опухолевой клетки. В некоторых случаях антиген опухолевой клетки выбран из группы, состоящей из AFP, ALK, белков BAGE, BCMA, BIRC5 (сурвивин), BIRC7, β-катенина, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, карбоангидразы IX, каспазы-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD40, CD70, CDK4, CEA, циклина B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, белков GAGE (например, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, глипикана-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, белков MAGE (например, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 и -12), MART-1, мезотелина, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), белков RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, STEAP1, STEAP2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, антигена Thompson-nouvelle (Tn), TRP-1, TRP-2, тирозиназы и уроплакина-3.

[0022] В некоторых вариантах осуществления антиген опухолевой клетки представляет собой CD20. В некоторых случаях биспецифичное антитело представляет собой анти-CD20 x анти-CD3 антитело. В некоторых случаях анти-CD20 x анти-CD3 антитело представляет собой REGN1979.

[0023] В некоторых вариантах осуществления антиген опухолевой клетки представляет собой BCMA. В некоторых случаях биспецифичное антитело представляет собой анти-BCMA x анти-CD3 антитело.

[0024] В некоторых вариантах осуществления антиген опухолевой клетки представляет собой PSMA. В некоторых случаях биспецифичное антитело представляет собой анти-PSMA x анти-CD3 антитело.

[0025] В некоторых вариантах осуществления антиген опухолевой клетки представляет собой MUC16. В некоторых случаях биспецифичное антитело представляет собой анти-MUC16 x анти-CD3 антитело.

[0026] В некоторых вариантах осуществления антиген опухолевой клетки представляет собой STEAP2. В некоторых случаях биспецифичное антитело представляет собой анти-STEAP2 x анти-CD3 антитело.

[0027] В различных вариантах осуществления сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне приблизительно 2000 микрограмм/литр (мкг/л) или выше после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования. В некоторых случаях сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне приблизительно 2600 мкг/л или выше после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования. В некоторых вариантах осуществления сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне приблизительно 3700 мкг/л или выше после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

[0028] В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок вводят субъекту в комбинации со вторым агентом, выбранным из стероида, антигистаминного препарата, ацетаминофена, нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП), антагониста IL-6 или антагониста IL-6R. В некоторых случаях стероид представляет собой дексаметазон. В некоторых случаях НПВП представляет собой индометацин. В некоторых случаях антагонист IL-6 представляет собой антитело к IL-6, или антагонист IL-6R представляет собой антитело к IL-6R. В некоторых вариантах осуществления антитело к IL-6R представляет собой сарилумаб. В различных вариантах осуществления введение второго агента прекращают после первого введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования. В других вариантах осуществления второй агент вводят до введения терапевтического белка (например, приблизительно за один-три часа до F1D1, F2D1, F1D2, F2D2, F1D3 и/или F2D3). В других вариантах осуществления терапевтический белок вводят путем инфузии в течение некоторого периода времени, такого как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более часов.

[0029] В различных вариантах осуществления терапевтический белок вводят субъекту в комбинации со вторым терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент включает по меньшей мере один из ритуксимаба, обинутузумаба, циклофосфамида, доксорубицина, винкристина, преднизона, преднизолона, бендамустина, леналидомида, хлорамбуцила, ибритумомаба тиуксетана, иделалисиба, копанлисиба, дувелисиба, этопозида, метилпреднизолона, цитарабина, цисплатина, месны, ифосфамида, митоксантрона и прокарбазина. В некоторых случаях второй терапевтический агент включает комбинацию циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизона. В некоторых случаях второй терапевтический агент включает комбинацию ифосфамида, цисплатина и этопозида. В некоторых случаях второй терапевтический агент включает комбинацию гемцитабина и оксалиплатина. В некоторых случаях второй терапевтический агент включает комбинацию леналидомида и ритуксимаба. В некоторых случаях второй терапевтический агент представляет собой леналидомид.

[0030] В одном аспекте настоящее изобретение включает способ лечения B-клеточного рака у субъекта, включающий: (a) выбор субъекта, у которого диагностирован B-клеточный рак; и (b) введение указанному субъекту терапевтического белка в соответствии с любым из способов, обсуждаемых выше или в настоящем документе, с использованием схемы дозирования для уменьшения нежелательных эффектов синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции. В некоторых вариантах осуществления субъект ранее получал лечение анти-CD20 антителом. В некоторых вариантах осуществления субъект ранее получал терапию с использованием CAR-T. В некоторых случаях В-клеточный рак выбран из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы и лимфомы маргинальной зоны.

[0031] В любом из вариантов осуществления, обсуждаемых выше или в настоящем документе, частота развития СВЦ 3 степени и ИР составляет менее 10%. В некоторых случаях частота развития СВЦ 3 степени и ИР составляет менее 7,5% или менее 7%. В некоторых вариантах осуществления максимальная недельная доза составляет 80 мг или более, когда частота развития СВЦ и ИР составляет менее 10%, менее 9%, менее 8%, менее 7,5% или менее 7%. В любом из вариантов осуществления любая доза, вводимая в виде разовой дозы, может быть введена не более чем за 1 час.

[0032] В различных вариантах осуществления любые из признаков или компонентов любых вариантов осуществления, обсуждаемых выше или в настоящем документе, могут быть скомбинированы, и такие комбинации входят в объем настоящего изобретения. Любое конкретное значение, обсуждаемое выше или в настоящем документе, может быть скомбинировано с другим связанным значением, обсуждаемым выше или в настоящем документе, обозначая диапазон, в котором указанные значения представляют собой верхний и нижний пределы диапазона, и такие диапазоны входят в объем настоящего изобретения. Терапевтический белок для применения в любом из способов, обсуждаемых в настоящем документе, или применение терапевтического белка для изготовления лекарственного средства для применения в любом из способов, обсуждаемых в настоящем документе, также входят в объем данного изобретения.

[0033] Другие варианты осуществления станут очевидными из обзора последующего подробного описания изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0034] На фиг. 1 показана частота развития СВЦ/ИР в течение первых пяти недель терапии REGN1979 при различных уровнях доз.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0035] Перед прочтением описания настоящего изобретения следует понимать, что данное изобретение не ограничивается определенными описанными методами и экспериментальными условиями, поскольку такие методы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания частных вариантов осуществления и не имеет ограничительного характера, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

[0036] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Термин «приблизительно» применительно к конкретному приведенному числовому значению означает, что указанное значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, выражение «приблизительно 100» включает 99 и 101, а также все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

[0037] Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, предпочтительные методы и материалы описаны далее. Все патенты, заявки и непатентные публикации, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

[0038] Выражение «CD3» относится к антигену, экспрессируемому на Т-клетках как часть мультимолекулярного Т-клеточного рецептора (TCR) и состоящему из гомодимера или гетеродимера, образованного при ассоциации двух из четырех цепей рецептора: CD3-эпсилон, CD3-дельта, CD3-дзета и CD3-гамма. Человеческий CD3-эпсилон содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; человеческий CD3-дельта содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; человеческий CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и CD3-гамма содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

[0039] Все ссылки на белки, полипептиды и фрагменты белков в настоящем документе подразумевают ссылки на человеческую версию соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если явно не указано, что они принадлежат виду, отличному от человека. Таким образом, выражение «CD3» означает человеческий CD3, если не указано, что он принадлежит виду, отличному от человека, например, «мышиный CD3», «обезьяний CD3» и т.д.

[0040] «Антигенсвязывающий домен, связывающий CD3», «антитело, связывающее CD3» или «антитело к CD3» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают одну субъединицу CD3 (например, эпсилон, дельта, гамма или дзета), а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают димерный комплекс из двух субъединиц CD3 (например, димеры CD3 гамма/эпсилон, дельта/эпсилон и дзета/дзета). Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут связывать растворимый CD3 и/или CD3, экспрессируемый на клеточной поверхности. Растворимый CD3 включает природные белки CD3, а также рекомбинантные варианты белков CD3, такие как, например, мономерные и димерные конструкции CD3, лишенные трансмембранного домена или по иной причине не связаны с клеточной мембраной.

[0041] Выражение «CD20» относится к негликозилированному фосфопротеину, экспрессируемому на клеточных мембранах зрелых В-клеток. CD20 считается антигеном, ассоциированным с В-клеточными опухолями, поскольку он экспрессируется более чем 95% В-клеточных неходжкинских лимфом (НХЛ) и других В-клеточных злокачественных новообразований, но отсутствует на предшественниках В-клеток, дендритных клетках и плазматических клетках. Человеческий белок CD20 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0042] «Антигенсвязывающий домен, связывающий CD20», «антитело, связывающее CD20» или «антитело к CD20» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают CD20.

[0043] Выражение «ВСМА» относится к антигену созревания В-клеток. BCMA (также известный как TNFRSF17 и CD269) представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый на злокачественных плазматических клетках, и играет ключевую роль в регулировании созревания и дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцирующие иммуноглобулины. Аминокислотная последовательность человеческого BCMA представлена в SEQ ID NO: 6.

[0044] «Антигенсвязывающий домен, связывающий BCMA», «антитело, связывающее BCMA» или «антитело к BCMA» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают BCMA.

[0045] Выражение «PSMA» относится к простатоспецифическому мембранному антигену, также известному как фолатгидролаза 1 (FOLH1). PSMA представляет собой интегральный не подвергающийся шеддингу гликопротеин, который на высоких уровнях экспрессируется в эпителиальных клетках предстательной железы и является поверхностным маркером рака предстательной железы. Аминокислотная последовательность человеческого PSMA представлена в SEQ ID NO: 7.

[0046] «Антигенсвязывающий домен, связывающий PSMA», «антитело, связывающее PSMA» или «антитело к PSMA» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают PSMA.

[0047] Выражение «MUC16» относится к муцину 16. MUC16 представляет собой высокогликозилированный интегральный мембранный гликопротеин с одним трансмембранным доменом, который на высоких уровнях экспрессируется при раке яичника. Аминокислотная последовательность человеческого MUC16 представлена в SEQ ID NO: 8.

[0048] «Антигенсвязывающий домен, связывающий MUC16», «антитело, связывающее MUC16» или «антитело к MUC16» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают MUC16.

[0049] Выражение «STEAP2» относится к шестидоменному трансмембранному эпителиальному антигену предстательной железы 2. STEAP2 представляет собой интегральный шестиспиральный трансмембранный белок, который на высоких уровнях экспрессируется в эпителиальных клетках предстательной железы и является поверхностным маркером клеток рака предстательной железы. STEAP2 представляет собой белок длиной 490 аминокислот, кодируемый геном STEAP2, у людей локализованным в хромосомной области 7q21. Аминокислотная последовательность человеческого STEAP2 представлена в SEQ ID NO: 9.

[0050] «Антигенсвязывающий домен, связывающий STEAP2», «антитело, связывающее STEAP2» или «антитело к STEAP2» включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают STEAP2.

[0051] Термин «терапевтический белок» включает любой полипептид, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также биспецифичные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые используются для предупреждения, лечения или облегчения любого состояния, заболевания или расстройства у субъекта.

[0052] Термин «антигенсвязывающая молекула» включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, включая, например, биспецифичные антитела.

[0053] Термин «антитело» означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащий по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфично связывается или взаимодействует с определенным антигеном (например, CD20, BCMA, PSMA, MUC16, STEAP2 или CD3). Термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидных цепи - две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи - соединенные дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Термин «антитело» также включает молекулы иммуноглобулина, состоящие из четырех полипептидных цепей - двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей - соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как HCVR или V_H) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как LCVR или V_L) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (C_L1). Области V_H и V_L могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления изобретения FR антитела (или его антигенсвязывающей части) могут быть идентичны последовательностям зародышевой линии человека, или могут быть модифицированы естественным или искусственным образом. Консенсусная аминокислотная последовательность может быть определена на основе сравнительного анализа двух или более CDR. Термин «антитело» включает «биспецифичное антитело», если не указано иное.

[0054] Термин «антитело» также включает антигенсвязывающие фрагменты полноразмерных молекул антител. Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т.п. включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или генетически модифицированный полипептид или гликопротеин, который специфично связывает антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из полноразмерных молекул антител с использованием любых подходящей стандартной методики, такой как протеолитическое расщепление или рекомбинантные методы генной инженерии, включающие модификацию и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и, необязательно, константные домены антител. Такая ДНК известна и/или легко доступна из, например, коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, фаговые библиотеки антител), или может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована и модифицирована химически или с помощью методов молекулярной биологии, например, для размещения одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, добавления или удаления аминокислот и т.д.

[0055] Выражение «биспецифичная антигенсвязывающая молекула» относится к белку, полипептиду или молекулярному комплексу, содержащему по меньшей мере первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен. Каждый антигенсвязывающий домен в биспецифичной антигенсвязывающей молекуле содержит по меньшей мере одну CDR, которая сама по себе или в комбинации с одной или более дополнительными CDR и/или FR специфично связывается с определенным антигеном. Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы включают биспецифичные антитела.

[0056] Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')2; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), например, пептид CDR3), или пептид c ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4. Другие генетически модифицированные молекулы, такие как домен-специфичное антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и акульи вариабельные домены IgNAR также охватываются выражением «антигенсвязывающий фрагмент».

[0057] Антигенсвязывающий фрагмент антитела в типичном случае содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и, как правило, содержит по меньшей мере одну CDR, которая непосредственно прилегает к одной или более каркасным последовательностям или находится в рамке считывания с ними. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен V_H, ассоциированный с доменом V_L, домены V_H и V_L могут быть расположены друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен V_H или V_L.

[0058] В отдельных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут содержаться в антигенсвязывающем фрагменте антитела согласно настоящему изобретению, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть или непосредственно связаны друг с другом, или могут быть связаны полной или частичной шарнирной или линкерной областью. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, которые приводят к гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными и/или константными доменами в одной молекуле полипептида. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) в любой из конфигураций вариабельного и константного доменов, перечисленных выше, в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или более мономерными доменами V_H или V_L (например, с помощью дисульфидной(ых) связи(ей)).

[0059] Как и в случае с полноразмерными молекулами антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичный антигенсвязывающий фрагмент антитела в типичном случае содержит по меньшей мере два разных вариабельных домена, при этом каждый из них способен специфично связываться со своим антигеном или с другим эпитопом на том же самом антигене. Любой формат мультиспецифичного антитела, включая иллюстративные форматы биспецифичных антител, раскрытые в настоящем документе, может быть адаптирован для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела согласно настоящему изобретению с использованием стандартных методов, доступных в данной области техники.

[0060] Антитела согласно настоящему изобретению могут выполнять свою функцию посредством комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ). «Комплементзависимая цитотоксичность» (КЗЦ) относится к лизису антиген-экспрессирующих клеток посредством антитела согласно изобретению в присутствии комплемента. «Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» (АЗКЦ) относится к клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифичное цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и тем самым приводят к ее лизису. КЗЦ и АЗКЦ могут быть измерены с использованием анализов, которые хорошо известны и доступны в данной области техники. (См., например, патенты США № 5500362 и 5821337, и Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652- 656). Константная область антитела важна для способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать клеточнозависимую цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основании того, желательно ли для данного антитела опосредовать цитотоксичность. Антитела согласно настоящему изобретению могут включать тяжелую цепь человеческого IgG. В различных вариантах осуществления тяжелая цепь может иметь изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

[0061] В отдельных вариантах осуществления изобретения антитела или биспецифичные антитела представляют собой человеческие антитела. Подразумевается, что термин «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин «человеческое антитело» не подразумевает включение антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на человеческие каркасные последовательности.

[0062] Антитела согласно изобретению могут, в некоторых вариантах осуществления, представлять собой рекомбинантные человеческие антитела. Подразумевается, что термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описаны ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител (дополнительно описаны ниже), антитела, выделенные у животного (например, мыши), трансгенного по генам человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает в себя сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с получением других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в отдельных вариантах осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, в случае использования трансгенного по последовательностям человеческого Ig животного, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей V_H и V_L зародышевой линии человека и родственны им, в естественных условиях не могут существовать в репертуаре зародышевой линии человеческого антитела in vivo.

[0063] Человеческие антитела могут существовать в двух формах, которые связаны с различиями шарнира. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию массой приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе межцепочечной дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями, и образуется молекула массой приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Эти формы чрезвычайно трудно разделить, даже после аффинной очистки.

[0064] Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG обусловлена, не ограничиваясь перечисленным, структурными различиями, связанными с изотипом шарнирной области антитела. Одна аминокислотная замена в шарнирной области шарнира человеческого IgG4 может значительно уменьшить частоту появления второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира человеческого IgG1. Данное изобретение охватывает антитела, имеющие одну или более мутаций в областях шарнира, C_H2 или C_H3, которые могут быть желательны, например, при производстве, для улучшения выхода желаемой формы антитела.

[0065] Антитела согласно изобретению могут представлять собой выделенные антитела. «Выделенное антитело» в контексте настоящего документа означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из по меньшей мере одного компонента его естественной среды. Например, антитело, которое было отделено или извлечено из по меньшей мере одного компонента организма, или из ткани или клетки, в которых это антитело существует в природе или продуцируется естественным путем, является «выделенным антителом» в контексте настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела представляют собой антитела, которые были подвергнуты по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно отдельным вариантам осуществления выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

[0066] Антитела, обсуждаемые в настоящем документе, могут содержать одну или более аминокислотных замен, инсерций и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены эти антитела. Такие мутации могут быть легко установлены путем сравнения раскрытых в настоящем документе аминокислотных последовательностей с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, полученные из любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, в которых одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или областях CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности в совокупности называются в настоящем документе «мутациями зародышевой линии»). Специалист в данной области техники, начиная с раскрытых в настоящем документе последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, содержащих одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В отдельных вариантах осуществления все каркасные остатки и/или остатки CDR в доменах V_H и/или V_L мутированы обратно в остатки, содержащиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело. В других вариантах осуществления только некоторые остатки мутированы обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, содержащиеся в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутированные остатки, содержащиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более каркасных остатков и/или остатков CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой было первоначально получено антитело). Кроме того, антитела согласно настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасных областей и/или областей CDR, например, при которых некоторые отдельные остатки мутированы в соответствующий остаток определенной последовательности зародышевой линии, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохранены или мутированы в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко проверены на наличие одного или нескольких желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в соответствующих случаях), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные таким общим образом, охватываются настоящим изобретением.

[0067] Настоящее изобретение также включает антитела, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR с, например, 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, представленных в настоящем документе, антитела к CD3, раскрытые в WO 2014/047231 или WO 2017/053856, биспецифичные анти-CD20 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2014/047231, анти-PSMA или анти-PSMA x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2017/023761, анти-MUC16 или анти-MUC16 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2018/067331, анти-STEAP2 или анти-STEAP2 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2018/058001, или анти-BCMA или анти-BCMA x анти-CD3 антитела, раскрытые в US 62/700596 (подана 19 июля 2018 г.), каждый из указанных источников включен в настоящий документ посредством ссылки.

[0068] Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с определенным антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут оказывать различные биологические действия. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образован сближенными в пространстве аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных обстоятельствах эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп на антигене.

[0069] Термин «по существу идентичность» или «по существу идентичный» применительно к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту означает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) имеет место идентичность нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, составляющая по меньшей мере приблизительно 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98% или 99%, при измерении с помощью любого хорошо известного алгоритма определения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, как обсуждается ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, по существу идентичная референсной молекуле нуклеиновой кислоты, в определенных случаях может кодировать полипептид, имеющий такую же или по существу схожую аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.

[0070] Применительно к полипептидам термин «по существу сходство» или «по существу схожий» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за открытие гэпа по умолчанию, обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом консервативная аминокислотная замена по существу не приводит к изменению функциональных свойств белка. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности или степень сходства последовательностей могут быть скорректированы в большую сторону, чтобы внести поправку на консервативный характер замены. Средства для осуществления этой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, включенный в настоящий документ посредством ссылки. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают: (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) серосодержащие боковые цепи - цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия PAM250, раскрытой в источнике Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, включенном в настоящий документ посредством ссылки. «Умеренно консервативной» заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия PAM250.

[0071] Сходство последовательностей для полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков подбирает схожие последовательности, применяя меры сходства, присвоенные различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию для определения гомологии или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами - программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и процент идентичности последовательностей областей наилучшего перекрытия между заданной и найденной последовательностями (см. Pearson (2000) выше). Еще одним предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от разных организмов, является компьютерная программа BLAST, в особенности BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, источники Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.

Стратегии дозирования и схемы введения

[0072] Были созданы стратегии дозирования, которые обеспечивают схемы введения для уменьшения частоты случаев или тяжести, или и того, и другого, синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ) или инфузионной реакции (ИР), путем введения пациенту терапевтического белка для различных видов терапии. Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения эти стратегии включают многократные дозы терапевтического белка или антигенсвязывающей молекулы (например, антитела или биспецифичного антитела), которые могут быть введены субъекту в течение определенного периода времени, тем самым обеспечивая схему. Способы согласно этому аспекту изобретения включают последовательное введение субъекту многократных доз терапевтического белка согласно изобретению. «Последовательное введение» означает, что каждую дозу терапевтического белка вводят субъекту в отдельный момент времени, например, в разные дни с заранее заданным интервалом (например, несколькими часами, днями, неделями или месяцами). Настоящее изобретение включает способы, включающие последовательное введение пациенту дробной первичной дозы терапевтического белка с последующей дробной вторичной дозой терапевтического белка, необязательно с последующей дробной третичной дозой терапевтического белка, с последующими разовыми дозами максимальной недельной дозы терапевтического белка. Настоящие схемы введения допускают более высокие дозы терапевтического белка, которые желательны для усиления терапевтической эффективности, но без отрицательных эффектов, связанных с СВЦ или ИР. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что настоящие схемы введения обеспечивают примирование иммунного ответа к введению терапевтического белка, сводя к минимуму частоту развития и тяжесть СВЦ и ИР на начальных этапах схемы лечения, что затем позволяет осуществлять введение более высоких доз терапевтических белков на последующих этапах схемы лечения без значимых нежелательных явлений, связанных с СВЦ или ИР.

[0073] Иллюстративная схема введения включает: (i) введение частей первичной дозы терапевтического белка на неделе 1 (W1) схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 1 мг терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет 50% первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет 50% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту не позднее чем через 96 часов после введения F1D1; (ii) введение частей вторичной дозы терапевтического белка на неделе 2 (W2) схемы дозирования, где указанная вторичная доза составляет не более половины максимальной недельной дозы терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет 50% вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет 50% вторичной дозы, и F1D2 и F2D2 вводят субъекту с интервалом в 96 часов на неделе 2 схемы дозирования; и (iii) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка в виде разовой дозы на последующей неделе (Ws) схемы дозирования.

[0074] Еще одна иллюстративная схема введения включает: (i) введение частей первичной дозы терапевтического белка на неделе 1 (W1) схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 1 мг терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет 50% первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет 50% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту не позднее чем через 96 часов после введения F1D1; (ii) введение частей вторичной дозы терапевтического белка на неделе 2 (W2) схемы дозирования, где указанная вторичная доза составляет не более половины максимальной недельной дозы терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет 50% вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет 50% вторичной дозы, и F1D2 и F2D2 вводят субъекту с интервалом в 96 часов на неделе 2 схемы дозирования; (iii) введение частей третичной дозы терапевтического белка на неделе 1 (W3) схемы дозирования, где указанная третичная доза составляет не менее половины указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка и не более указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка, первая часть дозы (F1D3) составляет 50% третичной дозы, вторая часть дозы (F2D3) составляет 50% третичной дозы, и F1D3 и F2D3 вводят субъекту с интервалом 96 часов между ними на неделе 1 схемы дозирования; и (iv) введение субъекту указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка в виде разовой дозы на последующей неделе (Ws) схемы дозирования.

[0075] В различных вариантах осуществления первичная доза терапевтического белка может составлять от 0,1 мг до 10 мг или более. В некоторых случаях первичная доза терапевтического белка составляет от 0,5 мг до 10 мг, 1-10 мг, 2-5 мг или 5-10 мг. В некоторых случаях первичная доза терапевтического белка составляет 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг. В различных вариантах осуществления первичная доза терапевтического белка включает диапазон, включающий любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 1-5 мг).

[0076] В различных вариантах осуществления максимальная недельная доза терапевтического белка составляет от 5 мг до 320 мг. В некоторых вариантах осуществления максимальная недельная доза терапевтического белка составляет от более 5 мг вплоть до 320 мг. В некоторых случаях максимальная недельная доза терапевтического белка составляет 6-320 мг, 10-320 мг, 5-40 мг, 5-80 мг, 5-160 мг, 12-40 мг, 18-80 мг, 40-80 мг, 80-160 мг, 160-320 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 12 мг, 18 мг, 27 мг, 40 мг, 80 мг, 160 мг или 320 мг. В некоторых случаях максимальная недельная доза терапевтического белка составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315 или 320 мг. В различных вариантах осуществления максимальная недельная доза терапевтического белка включает диапазон, включающий любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 200-300 мг).

[0077] В различных вариантах осуществления вторичная доза составляет 50% от максимальной недельной дозы терапевтического белка. В некоторых случаях вторичная доза составляет 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% или 10% от максимальной недельной дозы терапевтического белка. В некоторых случаях вторичная доза терапевтического белка включает диапазон в процентах от максимальной недельной дозы, включающий любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 35-50%).

[0078] В различных вариантах осуществления третичная доза составляет 50% от максимальной недельной дозы терапевтического белка. В некоторых случаях третичная доза составляет 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% от максимальной недельной дозы терапевтического белка. В некоторых случаях третичная доза терапевтического белка включает диапазон в процентах от максимальной недельной дозы, включающий любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 50-75%).

[0079] В различных вариантах осуществления каждая из первой части дозы и второй части дозы первичной, вторичной и/или третичной доз составляет 50% дозы. В некоторых случаях первая часть дозы и вторая часть дозы первичной, вторичной и/или третичной доз составляют разные процентные доли (в сумме дающие 100%) суммарной дозы. Например, первая часть дозы может составлять 45% дозы, а вторая часть дозы может составлять 55% дозы. В качестве альтернативы, первая часть дозы может составлять 55% дозы, а вторая часть дозы может составлять 45% дозы. В различных вариантах осуществления первая и вторая части дозы могут включать 10%/90%, 15%/85%, 20%/80%, 25%/75%, 30%/70%, 35%/65%, 40%/60%, 46%/54%, 47%/53%, 48%/52%, 49%/51%, или наоборот, суммарной первичной, вторичной или третичной дозы, соответственно.

[0080] В различных вариантах осуществления первичная, вторичная и/или третичная дозы (D1, D2 и/или D3) могут быть разделены на две или более частей. Выше рассмотрены различные варианты разделения доз на две части. Однако в некоторых случаях дозы делят на 3, 4 или 5 частей. Например, первичная доза может быть разделена на 5 частей, каждая из которых составляет 20% суммарной первичной дозы, и каждая часть дозы (F1D1, F2D1, F3D1, F4D1 и F5D1) может быть введена субъекту в течение пяти дней подряд на первой неделе схемы введения. В других случаях для каждой части дозы процентная доля суммарной дозы (например, первичной дозы) может отличаться. Например, если первичная доза разделена на 3 части, первая часть дозы (F1D1) может включать 30% суммарной первичной дозы, вторая часть дозы (F2D1) может включать 30% суммарной первичной дозы, и третья часть дозы (F3D1) может включать оставшиеся 40% суммарной первичной дозы. Другие комбинации процентных долей и количества дробных доз, в сумме дающих 100% суммарной дозы, прямо предусмотрены в настоящем документе.

[0081] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 6 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 3 мг, третичная доза составляет 12 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 6 мг, и максимальная недельная доза составляет 12 мг терапевтического белка.

[0082] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 9 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 4,5 мг, третичная доза составляет 18 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 9 мг, и максимальная недельная доза составляет 18 мг терапевтического белка.

[0083] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 13,5 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 6,75 мг, третичная доза составляет 27 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 13,5 мг, и максимальная недельная доза составляет 27 мг терапевтического белка.

[0084] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 40 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 20 мг, и максимальная недельная доза составляет 40 мг терапевтического белка.

[0085] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 60 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 30 мг, и максимальная недельная доза составляет 80 мг терапевтического белка.

[0086] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 80 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 40 мг, и максимальная недельная доза составляет 160 мг терапевтического белка.

[0087] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 120 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 60 мг, и максимальная недельная доза составляет 240 мг терапевтического белка.

[0088] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 160 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 80 мг, и максимальная недельная доза составляет 320 мг терапевтического белка.

[0089] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза (D1) составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D2) первичной дозы составляет 500 мкг, вторичная доза (D2) составляет 3 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) вторичной дозы составляет 1,5 мг, и максимальная недельная доза составляет 3 мг терапевтического белка.

[0090] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза (D1) составляет 3 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D2) первичной дозы составляет 1,5 мг, вторичная доза (D2) составляет 9 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) вторичной дозы составляет 4,5 мг, и максимальная недельная доза составляет 9 мг терапевтического белка.

[0091] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза (D1) составляет 5 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D2) первичной дозы составляет 2,5 мг, вторичная доза (D2) составляет 15 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) вторичной дозы составляет 7,5 мг, и максимальная недельная доза составляет 15 мг терапевтического белка.

[0092] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза (D1) составляет 10 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D2) первичной дозы составляет 5 мг, вторичная доза (D2) составляет 30 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) вторичной дозы составляет 15 мг, и максимальная недельная доза составляет 30 мг терапевтического белка.

[0093] В различных вариантах осуществления терапевтический белок вводят в дозе, обеспечивающей поддержание сывороточной концентрации на уровне по меньшей мере приблизительно 2000 мкг/л после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования. В некоторых случаях терапевтический белок вводят в дозе, обеспечивающей поддержание сывороточной концентрации на уровне по меньшей мере приблизительно 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400 или 3500 мкг/л после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

[0094] В различных вариантах осуществления терапевтический белок вводят в дозе, обеспечивающей поддержание средней сывороточной концентрации на уровне по меньшей мере приблизительно 2600 мкг/л после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования. В некоторых случаях терапевтический белок вводят в дозе, обеспечивающей поддержание средней сывороточной концентрации на уровне по меньшей мере приблизительно 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900 или 4000 мкг/л после введения максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

[0095] В различных вариантах осуществления последующая неделя (Ws) схемы дозирования представляет собой неделю 3 (W3), неделю 4 (W4), неделю 5 (W5), неделю 6 (W6), неделю 7 (W7), неделю 8 (W8), неделю 9 (W9), неделю 10 (W10), неделю 11 (W11), неделю 12 (W12), неделю 13 (W13), неделю 14 (W14), неделю 15 (W15), неделю 16 (W16), неделю 17 (W17), неделю 18 (W18), неделю 19 (W19), неделю 20 (W20), неделю 21 (W21), неделю 22 (W22), неделю 23 (W23), неделю 24 (W24), неделю 25 (W25), неделю 26 (W26), неделю 27 (W27), неделю 28 (W29), неделю 30 (W30), неделю 31 (31), неделю 32 (32), неделю 33 (33), неделю 35 (W34), неделю 35 (W35) или неделю 36 (W36).

[0096] В различных вариантах осуществления вторую дробную дозу на любой отдельно взятой неделе схемы дозирования вводят не позднее чем через 24, 36, 48, 60, 72, 84 или 96 часов после введения первой дробной дозы.

[0097] В различных вариантах осуществления максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы в течение от 1 до 8 недель или в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или более недель на протяжении еженедельной фазы схемы дозирования. В некоторых случаях максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы в течение количества недель в диапазоне, включающем любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 1-12 недель).

[0098] В различных вариантах осуществления максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы (поддерживающей дозы) один раз в две недели в течение вплоть до 24 недель или вплоть до 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 или более недель, на протяжении фазы с введением два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю (поддерживающей фазы) схемы дозирования, которая может следовать после завершения еженедельной фазы схемы дозирования (т.е. либо еженедельного дозирования максимальной недельной дозы, либо дробного дозирования первичной, вторичной и (необязательно) третичной доз). В некоторых случаях максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы (поддерживающей дозы) один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели в течение количества недель в диапазоне, включающем любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 24-86 недель).

[0099] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 80 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 40 мг, и максимальная недельная доза составляет 160 мг терапевтического белка, где третичную дозу вводят в виде разовой дозы (т.е. 80 мг) еженедельно (1р/нед) в течение недель с 4 по 12 схемы дозирования, и максимальную недельную дозу вводят в виде разовой дозы (т.е. 160 мг) один раз в две недели (1р/2нед), начиная с недели 14 схемы дозирования.

[0100] В некоторых случаях указанная выше схема дозирования предназначена для применения в способах лечения агрессивной лимфомы (например, мантийноклеточной лимфомы или лимфомы маргинальной зоны).

[0101] В одном иллюстративном варианте осуществления схемы дозирования первичная доза составляет 1 мг, каждая из первой части дозы (F1D1) и второй части дозы (F2D1) составляет 500 мкг, вторичная доза составляет 20 мг, каждая из первой части дозы (F1D2) и второй части дозы (F2D2) составляет 10 мг, третичная доза составляет 160 мг, каждая из первой части дозы (F1D3) и второй части дозы (F2D3) составляет 80 мг, и максимальная недельная доза составляет 320 мг терапевтического белка, где третичную дозу вводят в виде разовой дозы (т.е. 160 мг) еженедельно (1р/нед) в течение недель с 4 по 12 схемы дозирования, и максимальную недельную дозу вводят в виде разовой дозы (т.е. 320 мг) один раз в две недели (1р/2нед), начиная с недели 14 схемы дозирования.

[0102] В некоторых случаях указанная выше схема дозирования предназначена для применения в способах лечения агрессивной лимфомы (например, мантийноклеточной лимфомы или лимфомы маргинальной зоны). В некоторых случаях указанная выше схема дозирования предназначена для применения в способах лечения фолликулярной лимфомы (например, стадии 1-3a). В некоторых случаях указанная выше схема дозирования предназначена для лечения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (включая рецидивирующую или рефрактерную ДВККЛ, например, у пациентов, у которых была неэффективной предшествующая CAR-T терапия).

[0103] В различных вариантах осуществления каждую дозу или дробную дозу терапевтического белка вводят субъекту в течение 1-4, 1-5 или 1-6 часов (например, посредством инфузии). В некоторых случаях дозу или дробную дозу вводят в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, или более часов. В некоторых случаях каждую дозу или дробную дозу терапевтического белка вводят субъекту в течение диапазона времени, включающего любое из указанных выше значений в качестве верхнего или нижнего предела диапазона (например, 1-8 часов). В различных вариантах осуществления каждую максимальную недельную дозу вводят в виде разовой инфузии.

[0104] В некоторых вариантах осуществления схем введения, обсуждаемых в настоящем документе, осуществляют введение второго агента в качестве предварительного лечения или в комбинации с терапевтическим белком. В некоторых случаях пациенту вводят стероид, такой как дексаметазон, в качестве предварительного лечения перед введением первичных дробных доз и вторичных дробных доз и, необязательно, перед третичными дробными дозами. В некоторых вариантах осуществления дексаметазон вводят пациенту приблизительно за один-три часа до первой части дозы (F1D1). В отдельных вариантах осуществления дозу дексаметазона вводят посредством внутривенной инфузии. В некоторых случаях вводят антагонист цитокина, такой антитело к IL-6 или антитело к IL-6R, в комбинации с терапевтическим белком во время первичного, вторичного и необязательно третичного введения доз. В некоторых случаях пациенту вводят моноспецифичное антитело к CD20 (например, ритуксимаб) в качестве предварительного лечения перед введением первичных дробных доз и, необязательно, вторичных дробных доз, и, необязательно, перед третичными дробными дозами. Эти введения второго агента в качестве предварительного лечения или в виде комбинации прекращают, в одном варианте осуществления, с введением максимальной недельной дозы в виде разовой дозы, которое начинают, например, на неделе 3, 4, 5 или 6 схемы дозирования, чтобы искусственно не заглушать активность цитокинов и не препятствовать тем самым терапевтическим эффектам терапевтического белка.

[0105] Термины «первичная доза», «вторичная доза» и «третичная доза» относятся к временной последовательности введения антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Так, «первичная доза» представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения; «вторичная доза» представляет собой дозу, которую вводят после первичной дозы (включая все части дозы для первичной дозы); и «третичные дозы» представляют собой дозы, которые вводят после вторичной дозы (включая все части дозы для вторичной дозы). Первичная, вторичная и третичная дозы (или части этих доз) могут содержать определенное количество терапевтического белка, как обсуждается в настоящем документе. В некоторых случаях «первичная доза» и «вторичная доза», а также необязательная «третичная доза» могут называться «нагрузочными дозами», тогда как последующие максимальные недельные дозы могут называться «поддерживающими дозами». В некоторых случаях «первичная доза» может называться «начальной дозой». В некоторых случаях «вторичная доза» может называться «промежуточной дозой». В некоторых случаях «третичная доза» может называться «повышающей дозой».

[0106] Фраза «непосредственно предшествующая доза» в последовательности из нескольких введений относится к дозе антигенсвязывающей молекулы, которую вводят пациенту до введения непосредственно следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.

Антигенсвязывающие молекулы

[0107] Антитела для применения согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичными, биспецифичными или мультиспецифичными. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными к разным эпитопам одного полипептида-мишени или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфичные к более чем одному полипептиду-мишени. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела и биспецифичные молекулы согласно настоящему изобретению могут быть связаны или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или более другими молекулярными структурами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, для получения биспецифичного или мультиспецифичного антитела со второй или дополнительной специфичностью связывания.

[0108] Настоящее изобретение включает антитела, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR антител, описанных в настоящем документе, антитела к CD3, раскрытые в WO 2014/047231 или WO 2017/053856, биспецифичные анти-CD20 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2014/047231, анти-PSMA или анти-PSMA x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2017/023761, анти-MUC16 или анти-MUC16 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2018/067331, анти-STEAP2 или анти-STEAP2 x анти-CD3 антитела, раскрытые в WO 2018/058001, или анти-BCMA или анти-BCMA x анти-CD3 антитела, раскрытые в US 62/700596 (подана 19 июля 2018 г.), каждый из указанных источников включен в настоящий документ посредством ссылки.

[0109] При использовании выражений «анти-CD3 антитело» (антитело к CD3), «анти-CD20 антитело», «анти-PSMA антитело», «анти-MUC16 антитело», «анти-STEAP2 антителоа», «анти-ВСМА антитело» и т.п. в настоящем документе подразумеваются как моноспецифичные антитела, так и биспецифичные антитела, содержащие соответствующее антигенсвязывающее плечо (например, CD3). Таким образом, настоящее изобретение включает биспецифичные антитела, в которых одно плечо иммуноглобулина связывает человеческий CD3, а другое плечо иммуноглобулина специфично к, например, человеческому CD20, человеческому PSMA, человеческому MUC16, человеческому STEAP2 или человеческому BCMA.

[0110] В отдельных вариантах осуществления CD3-связывающее плечо связывается с человеческим CD3 и индуцирует активацию человеческих Т-клеток. В отдельных вариантах осуществления CD3-связывающее плечо слабо связывается с человеческим CD3 и индуцирует активацию человеческих Т-клеток. В других вариантах осуществления CD3-связывающее плечо слабо связывается с человеческим CD3 и индуцирует уничтожение клеток, экспрессирующих опухолеассоциированный антиген, в контексте биспецифичного или мультиспецифичного антитела. В других вариантах осуществления CD3-связывающее плечо слабо связывается или ассоциирует с CD3 человека и яванского макака (обезьяны), однако связывающее взаимодействие не поддается обнаружению с помощью анализов in vitro, известных в данной области техники. В отдельных вариантах осуществления биспецифичные антитела или антигенсвязывающие фрагменты для применения в настоящем изобретении содержат антигенсвязывающее плечо, которое связывается с CD28, ICOS, HVEM, CD27, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, SLAM, CD2, 2B4, CD226, TIM1 или TIM2 для индукции активации Т-клеток.

[0111] В отдельных иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное антитело. Каждый антигенсвязывающий домен биспецифичного антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи (HCVR) и вариабельный домен легкой цепи (LCVR). В контексте биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, содержащей первый и второй антигенсвязывающий домены (например, биспецифичного антитела), CDR первого антигенсвязывающего домена могут быть обозначены префиксом «A1», а CDR второго антигенсвязывающего домена могут быть обозначены префиксом «A2». Таким образом, CDR первого антигенсвязывающего домена могут называться в настоящем документе A1-HCDR1, A1-HCDR2 и A1-HCDR3; а CDR второго антигенсвязывающего домена могут называться в настоящем документе A2-HCDR1, A2-HCDR2 и A2-HCDR3.

[0112] В одном варианте осуществления терапевтический белок представляет собой биспецифичное анти-CD20 x анти-CD3 антитело, известное как REGN1979. REGN1979 содержит связывающее плечо к CD20, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, связывающее плечо к CD3, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и общую легкую цепь (соответствующую обоим связывающим плечам к CD20 и к CD3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых случаях зрелая форма антитела может не включать C-концевые остатки лизина из SEQ ID NO: 10 и 11. Таким образом, в некоторых случаях связывающее плечо к CD20 REGN1979 содержит тяжелую цепь, содержащую остатки 1-452 из SEQ ID NO: 10, и связывающее плечо к CD3 REGN1979 содержит тяжелую цепь, содержащую остатки 1-448 из SEQ ID NO: 11. REGN1979 также содержит последовательности HCVR, LCVR и CDR, представленные в прилагаемом перечне последовательностей. HCVR к CD20 соответствует SEQ ID NO: 13, HCVR к CD3 соответствует SEQ ID NO: 14, и общая LCVR соответствует SEQ ID NO: 15. Домены к CD20 HCDR1-HCDR2-HCDR3 соответствуют SEQ ID NO: 16-17-18, соответственно. Домены к CD3 HCDR1-HCDR2-HCDR3 соответствуют SEQ ID NO: 19-20-21, соответственно. Общие домены LCDR1-LCDR2-LCDR3 соответствуют SEQ ID NO: 22-23-24, соответственно.

[0113] Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, обсуждаемые выше или в настоящем документе, могут представлять собой биспецифичные антитела. В некоторых случаях биспецифичное антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG. В некоторых случаях константная область тяжелой цепи человеческого IgG имеет изотип IgG1. В некоторых случаях константная область тяжелой цепи человеческого IgG имеет изотип IgG4. В различных вариантах осуществления биспецифичное антитело содержит химерный шарнир, который снижает связывание с Fcɣ рецептором по сравнению с шарниром дикого типа того же изотипа. В некоторых случаях биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат любой из форматов, обсуждаемых в источнике Brinkmann et al., MABS, 9(2):182-212, 2017, включенном в настоящий документ посредством ссылки.

[0114] Первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен могут быть непосредственно или опосредованно связаны друг с другом с образованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы, каждый из первого антигенсвязывающего домена и второго антигенсвязывающего домена может быть соединен с отдельным мультимеризирующим доменом. Ассоциация одного мультимеризующего домена с другим мультимеризующим доменом облегчает ассоциацию между двумя антигенсвязывающими доменами, тем самым обеспечивая образование биспецифичной антигенсвязывающей молекулы. «Мультимеризующий домен» означает любую макромолекулу, белок, полипептид, пептид или аминокислоту, обладающие способностью ассоциировать со вторым мультимеризующим доменом такой же или подобной структуры или состава. Например, мультимеризующий домен может представлять собой полипептид, содержащий домен C_H3 иммуноглобулина. Неограничивающим примером мультимеризующего компонента является Fc-часть иммуноглобулина (содержащая домен C_H2-C_H3), например, Fc-домен IgG, выбранного из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также любого аллотипа в группе каждого изотипа.

[0115] Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению в типичном случае содержат два мультимеризующих домена, например, два Fc-домена, каждый из которых в отдельности является частью отдельной тяжелой цепи антитела. Первый и второй мультимеризующие домены могут относиться к одному и тому же изотипу IgG, например, к IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. В качестве альтернативы, первый и второй мультимеризующие домены могут относиться к разным изотипам IgG, например, к IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 и т.д.

[0116] В отдельных вариантах осуществления мультимеризующий домен представляет собой Fc-фрагмент или аминокислотную последовательность длиной от 1 до приблизительно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один цистеиновый остаток. В других вариантах осуществления мультимеризующий домен представляет собой цистеиновый остаток или короткий цистеинсодержащий пептид. Другие мультимеризующие домены включают пептиды или полипептиды, содержащие или состоящие из лейциновой молнии, мотива спираль-петля или суперспирального мотива.

[0117] Для получения биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению может быть использован любой формат или технология биспецифичных антител. Например, антитело или его фрагмент, имеющие первую специфичность связывания с антигеном, могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или более другими молекулярными структурами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, имеющими вторую специфичность связывания с антигеном, для получения биспецифичной антигенсвязывающей молекулы. Конкретные иллюстративные биспецифичные форматы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, биспецифичные форматы на основе scFv или диател, слияния IgG-scFv, двойной вариабельный домен (DVD)-Ig, квадрогибридому, «выступы во впадины», общую легкую цепь (например, общую легкую цепь с взаимодействием по типу «выступы во впадины» и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, лейциновую молнию, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-lgG двойного действия и биспецифичные форматы Mab² (обзор вышеуказанных форматов см., например, в Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, и цитируемых в нем источниках).

[0118] В контексте биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению мультимеризующие домены, например, Fc-домены, могут содержать одно или более изменений аминокислот (например, инсерции, делеции или замены) по сравнению со встречающейся в природе версией Fc-домена дикого типа. Например, изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие одну или более модификаций в Fc-домене, приводящих к модифицированному Fc-домену, имеющему модифицированное связывающее взаимодействие (например, повышенное или пониженное) между Fc и FcRn. В одном из вариантов осуществления биспецифичная антигенсвязывающая молекула содержит модификацию в области C_H2 или C_H3, причем указанная модификация увеличивает аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где pH составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, E или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном из вариантов осуществления модификация включает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).

[0119] Настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие первый домен C_H3 и второй домен C_H3 Ig, причем первый и второй домены C_H3 Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и причем отличие по меньшей мере в одной аминокислоте снижает связывание биспецифичного антитела с белком А по сравнению с биспецифичным антителом, не имеющим отличия в аминокислоте. В одном из вариантов осуществления первый домен C_H3 Ig связывает белок A, а второй домен C_H3 Ig содержит мутацию, которая снижает или устраняет связывание белка A, такую как модификация H95R (согласно нумерации экзонов IMGT; H435R согласно нумерации EU). Второй C_H3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (согласно IMGT; согласно Y436F согласно EU). См., например, патент США № 8586713. Другие модификации, которые могут содержаться во втором C_H3, включают: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (согласно IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I согласно EU) в случае антител IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I согласно EU) в случае антител IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (согласно IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I согласно EU) в случае антител IgG4.

[0120] В отдельных вариантах осуществления Fc-домен может быть химерным и содержать комбинацию последовательностей Fc, полученных от более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, химерный Fc-домен может содержать часть или всю последовательность C_H2, полученную из области C_H2 человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, и часть или всю последовательность C_H3, полученную из человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. Химерный Fc-домен может также содержать химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать «верхнюю шарнирную» последовательность, полученную из шарнирной области человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, в комбинации с «нижней шарнирной» последовательностью, полученной из шарнирной области человеческого IgG1, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. Конкретный пример химерного Fc-домена, который может быть включен в любую из антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, содержит, от N- к C-концу: [IgG4 C_H1] - [IgG4 верхний шарнир] - [IgG2 нижний шарнир] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Еще один пример химерного Fc-домена, который может быть включен в любую из антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, содержит, от N- к C-концу: [IgG1 C_H1] - [IgG1 верхний шарнир] - [IgG2 нижний шарнир] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Эти и другие примеры химерных Fc-доменов, которые могут быть включены в любую из антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению, описаны в публикации заявки на патент США № 2014/0243504, опубликованной 28 августа 2014 г., включенной в настоящий документ во всей полноте. Химерные Fc-домены, имеющие эти общие структурные особенности, и их варианты могут обладать измененным связыванием с Fc-рецептором, которое, в свою очередь, влияет на эффекторную функцию Fc.

Связывающие свойства антигенсвязывающих молекул

[0121] Термин «связывание» в контексте связывания антитела, иммуноглобулина, связывающего фрагмента антитела, или Fc-содержащего белка с любым, например, заранее определенным антигеном, таким как белок клеточной поверхности или его фрагмент, обычно относится к взаимодействию или ассоциации между минимум двумя объектами или молекулярными структурами, такому как взаимодействие антитело-антиген.

[0122] Например, аффинность связывания обычно соответствует значению K_D приблизительно 10^-7 М или менее, например, приблизительно 10^-8 М или менее, например, приблизительно 10^-9 М или менее, при определении, например, с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore 3000 с использованием антигена в качестве лиганда и антитела, Ig, связывающего фрагмента антитела или Fc-содержащего белка в качестве аналита (или антилиганда). Также обычно используются стратегии связывания на основе клеток, такие как анализы связывания методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), и данные FACS хорошо коррелируют с другими методами, такими как конкурентное связывание радиолигандов и SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).

[0123] Соответственно, антитело или антигенсвязывающий белок согласно настоящему изобретению связывается с заранее определенным антигеном или молекулой (рецептором) клеточной поверхности с аффинностью, соответствующей значению K_D, которое по меньшей мере в десять раз меньше, чем его аффинность для связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеином). Согласно настоящему изобретению аффинность антитела, соответствующая значению K_D, равному или менее чем в десять раз меньшему, чем для неспецифичного антигена, может рассматриваться как не поддающееся обнаружению связывание, однако такое антитело может быть спарено со вторым антигенсвязывающим плечом с получением биспецифичного антитела согласно изобретению.

[0124] Термин «K_D» (M) относится к равновесной константе диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, или к равновесной константе диссоциации связывания антитела или связывающего фрагмента антитела с антигеном. Между K_D и аффинностью связывания существует обратная зависимость, поэтому чем меньше значение K_D, тем выше, то есть, сильнее, аффинность. Таким образом, термины «более высокая аффинность» или «более сильная аффинность» относятся к более высокой способности вступать во взаимодействие и, следовательно, к меньшему значению K_D, и, наоборот, термины «более низкая аффинность» или «более слабая аффинность» относятся к более низкой способности вступать во взаимодействие и, следовательно, большему значению K_D. В некоторых случаях более высокая аффинность связывания (или K_D) определенной молекулы (например, антитела) с ее молекулой-партнером по связыванию (например, антигеном X) по сравнению с аффинностью связывания этой молекулы (например, антитела) с другой молекулой-партнером по связыванию (например, антигеном Y) может быть выражена с помощью отношения связывания, определяемого делением большего значения K_D (более низкая или более слабая аффинность) на меньшее K_D (более высокая или более сильная аффинность), например, выраженного как 5-кратное или 10-кратное превышение аффинности связывания, в зависимости от конкретного случая.

[0125] Термин «k_d» (с-1 или 1/с) относится к константе скорости диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, или к константе скорости диссоциации антитела или связывающего фрагмента антитела. Указанное значение также называется значением k_off.

[0126] Термин «k_a» (M-1 x с-1 или 1/M) относится к константе скорости ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, или к константе скорости ассоциации антитела или связывающего фрагмента антитела.

[0127] Термин «K_A» (M-1 или 1/M) относится к равновесной константе ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, или равновесной константе ассоциации антитела или связывающего фрагмента антитела. Равновесную константу ассоциации получают делением k_a на k_d.

[0128] Термин «EC50» или «EC₅₀» относится к полумаксимальной эффективной концентрации, которая включает концентрацию антитела, индуцирующую ответ, равный половине между исходным значением и максимумом после указанного времени воздействия. ЕС₅₀ по существу представляет собой концентрацию антитела, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. В отдельных вариантах осуществления значение EC₅₀ равно концентрации антитела согласно изобретению, обеспечивающей половину от максимального связывания с клетками, экспрессирующими, например, CD3 или опухолеассоциированный антиген (например, CD20), при определении, например, с помощью анализа связывания методом FACS. Таким образом, сниженное или более слабое связывание наблюдается при повышенном значении EC₅₀ или полумаксимальной эффективной концентрации.

[0129] В одном варианте осуществления пониженное связывание может быть определено как повышенная концентрация EC₅₀ антитела, обеспечивающая связывание с половиной максимального количества клеток-мишеней.

[0130] В еще одном варианте осуществления значение EC₅₀ представляет собой концентрацию антитела согласно изобретению, которая вызывает полумаксимальное истощение клеток-мишеней за счет цитотоксической активности Т-клеток. Таким образом, повышенная цитотоксическая активность (например, опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток) наблюдается при пониженном значении EC₅₀ или полумаксимальной эффективной концентрации.

Варианты последовательностей

[0131] Антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более аминокислотных замен, инсерций и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены отдельные антигенсвязывающие домены. Такие мутации могут быть легко установлены путем сравнения раскрытых в настоящем документе аминокислотных последовательностей с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать антигенсвязывающие домены, полученные из любой из иллюстративных аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, в которых одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или областях CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности в совокупности называются в настоящем документе «мутациями зародышевой линии»). Специалист в данной области техники, начиная с раскрытых в настоящем документе последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, содержащих одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В отдельных вариантах осуществления все каркасные остатки и/или остатки CDR в доменах V_H и/или V_L мутированы обратно в остатки, содержащиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой был первоначально получен антигенсвязывающий домен. В других вариантах осуществления только некоторые остатки мутированы обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, содержащиеся в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутированные остатки, содержащиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более каркасных остатков и/или остатков CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой был первоначально получен антигенсвязывающий домен). Кроме того, антигенсвязывающие домены могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасных областей и/или областей CDR, например, при которых некоторые отдельные остатки мутированы в соответствующий остаток определенной последовательности зародышевой линии, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохранены или мутированы в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антигенсвязывающие домены, содержащие одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко проверены на наличие одного или нескольких желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в соответствующих случаях), сниженная иммуногенность и т.д. Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие один или более антигенсвязывающих доменов, полученных по этому общему принципу, охватываются настоящим изобретением.

pH-зависимое связывание

[0132] Настоящее изобретение включает антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы с pH-зависимыми характеристиками связывания. Например, антитело согласно настоящему изобретению может демонстрировать пониженное связывание с, например, опухолевым антигеном, таким как CD20, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. В качестве альтернативы, антитела согласно изобретению могут демонстрировать повышенное связывание с, например, опухолевым антигеном, таким как CD20, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Выражение «кислый pH» включает значения pH менее приблизительно 6,2, например, приблизительно 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 или менее. Выражение «нейтральный pH» означает pH от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,4. Выражение «нейтральный pH» включает значения pH, равные приблизительно 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 и 7,4.

[0133] В некоторых случаях «пониженное связывание ... при кислом pH по сравнению с нейтральным pH» выражается посредством отношения значения K_D связывания антитела с его антигеном при кислом pH к значению K_D связывания антитела с его антигеном при нейтральном pH (или наоборот). Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно рассматривать как демонстрирующие «пониженное связывание с, например, CD20, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH» в контексте настоящего изобретения, если указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрируют отношение кислой/нейтральной K_D, равное приблизительно 3,0 или более. В отдельных иллюстративных вариантах осуществления отношение кислой/нейтральной K_D для антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению может составлять приблизительно 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 или более.

[0134] Антитела с pH-зависимыми характеристиками связывания могут быть получены, например, путем скрининга популяции антител на предмет пониженного (или повышенного) связывания с определенным антигеном при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Кроме того, модификации антигенсвязывающего домена на аминокислотном уровне могут давать антитела с pH-зависимыми характеристиками. Например, путем замены одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающего домена (например, в CDR) остатком гистидина можно получить антитело с пониженным связыванием антигена при кислом pH по сравнению с нейтральным pH.

Антитела, содержащие варианты Fc

[0135] Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения предложены антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-домен, содержащий одну или более мутаций, которые повышают или понижают связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислом pH по сравнению с нейтральным рН. Например, настоящее изобретение включает антитела, содержащие мутацию в области C_H2 или C_H3 Fc-домена, где мутация(ии) увеличивает аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где pH составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к увеличению периода полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, E или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном из вариантов осуществления модификация включает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).

[0136] Например, настоящее изобретение включает антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-домен, содержащий одну или более пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из: 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254T и 256E (например, M252Y, S254T и T256E); 428L и 434S (например, M428L и N434S); и 433K и 434F (например, H433K и N434F). Все возможные комбинации вышеупомянутых мутаций Fc-домена и других мутаций в вариабельных доменах антитела, раскрытых в настоящем документе, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.

Получение антигенсвязывающих доменов и конструирование биспецифичных молекул

[0137] Антигенсвязывающие домены, специфичные к конкретным антигенам, могут быть получены с помощью любой технологии получения антител, известной в данной области техники. После получения два разных антигенсвязывающих домена, специфичные к двум разным антигенам (например, CD3 и CD20), можно соответствующим образом расположить друг относительно друга для получения биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению с использованием стандартных методов. (Обсуждение иллюстративных форматов биспецифичных антител, которые могут применяться для конструирования биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению, приведено в других местах в настоящем документе). В отдельных вариантах осуществления один или более отдельных компонентов (например, тяжелая и легкая цепи) мультиспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно изобретению получены из химерных, гуманизированных или полностью человеческих антител. Способы получения таких антител хорошо известны в данной области техники. Например, одна или более тяжелых и/или легких цепей биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием технологии VELOCIMMUNE™. Используя технологию VELOCIMMUNE™ (или любую другую технологию получения человеческих антител), первоначально выделяют химерные антитела с высокой аффинностью к определенному антигену (например, CD3 или CD20), имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Определяют характеристики антител и осуществляют их отбор по желаемым характеристикам, включая аффинность, селективность, эпитоп и т.д. Мышиные константные области заменяют желаемой человеческой константной областью для создания полностью человеческих тяжелых и/или легких цепей, которые могут быть включены в биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению.

[0138] Для получения человеческих биспецифичных антигенсвязывающих молекул могут быть использованы генетически модифицированные животные. Например, может быть использована генетически модифицированная мышь, неспособная к реаранжировке и экспрессии эндогенной последовательности вариабельной области легкой цепи мышиного иммуноглобулина, при этом мышь экспрессирует только один или два человеческих вариабельных домена легкой цепи, кодируемых последовательностями человеческого иммуноглобулина, функционально связанными с геном мышиной константной области каппа в эндогенном мышином каппа-локусе. Таких генетически модифицированных мышей можно использовать для получения полностью человеческих биспецифичных антигенсвязывающих молекул, содержащих две разные тяжелые цепи, ассоциированные с идентичной легкой цепью, содержащей вариабельный домен, полученный из одного из двух различных сегментов гена человеческой вариабельной области легкой цепи. (См., например, US 2011/0195454). Полностью человеческое относится к антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, или его иммуноглобулиновому домену, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую ДНК, полученной из человеческой последовательности, по всей длине каждого полипептида антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или его иммуноглобулинового домена. В некоторых случаях полностью человеческую последовательность получают из белка, эндогенного для человека. В других случаях полностью человеческий белок или последовательность белка содержит химерную последовательность, в которой последовательность каждого из компонентов получена из человеческой последовательности. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, химерные белки или химерные последовательности в целом конструируют так, чтобы минимизировать создание иммуногенных эпитопов в соединениях последовательностей компонентов, например, по сравнению с любыми областями или доменами человеческого иммуноглобулина дикого типа.

Биоэквиваленты

[0139] Настоящее изобретение охватывает антигенсвязывающие молекулы, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются от иллюстративных молекул, раскрытых в настоящем документе, но сохраняют способность связывать тот же антиген или антигены. Такие вариантные молекулы содержат одно или более добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но проявляют биологическую активность, которая по существу эквивалентна активности описанных антител или биспецифичных антигенсвязывающих молекул.

[0140] Настоящее изобретение включает антигенсвязывающие молекулы, биоэквивалентные любой из иллюстративных антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе. Два антигенсвязывающих белка или антитела считаются биоэквивалентными, если, например, они представляют собой фармацевтические эквиваленты или фармацевтические альтернативы, скорость и степень абсорбции которых не демонстрируют значимой разницы при введении в той же молярной дозе в аналогичных экспериментальных условиях, как в разовой дозе, так и в многократных дозах. Некоторые антигенсвязывающие белки будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и, тем не менее, могут считаться биоэквивалентными, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отражены в маркировке, не имеют существенного значения для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при хроническом применении, и считаются с медицинской точки зрения незначительными для конкретного исследуемого лекарственного препарата.

[0141] В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если не существует клинически значимых различий в их безопасности, чистоте и эффективности.

[0142] В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если пациент может один или несколько раз быть переведен с референсного продукта на биологический продукт и наоборот без ожидаемого увеличения риска нежелательных эффектов, в том числе клинически значимого изменения иммуногенности или уменьшения эффективности, по сравнению с непрерывной терапией без такого перевода.

[0143] В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если оба они действуют посредством одного и того же механизма или механизмов действия для условия или условий применения в той мере, в которой такие механизмы известны.

[0144] Биоэквивалентность может быть продемонстрирована с помощью способов in vivo и in vitro. Варианты оценки биоэквивалентности включают, например, (a) тест in vivo на людях или других млекопитающих, в котором измеряют динамику концентрации антитела или его метаболитов в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости; (b) тест in vitro, который был соотнесен с данными о биологической доступности у людей in vivo и позволяет в разумных пределах их прогнозировать; (c) тест in vivo на людях или других млекопитающих, в котором измеряют динамику соответствующего фармакологического действия разовой дозы антитела (или его мишени); и (d) в хорошо контролируемом клиническом исследовании, в котором устанавливается безопасность, эффективность или биодоступность или биоэквивалентность антигенсвязывающего белка.

[0145] Биоэквивалентные варианты иллюстративных антител и биспецифичных антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, могут быть сконструированы, например, с помощью различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не являются необходимыми для проявления биологической активности. Например, цистеиновые остатки, несущественные для биологической активности, могут быть подвергнуты делеции или заменены другими аминокислотами, чтобы предотвратить образование ненужных или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антигенсвязывающие белки могут включать варианты иллюстративных антител и биспецифичных антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, содержащие аминокислотные замены, которые модифицируют характеристики гликозилирования молекул, например, мутации, которые устраняют или убирают гликозилирование.

Терапевтический препарат и доставка

[0146] Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению. Фармацевтические композиции согласно изобретению составлены с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими агентами, которые обеспечивают улучшенный перенос, доставку, переносимость и тому подобное. Множество подходящих препаратов можно найти в справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти препараты включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), конъюгаты ДНК, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типа «масло в воде» и «вода в масле», эмульсии на основе карбовакса (полиэтиленгликоли с разной молекулярной массой), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0147] Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения фармацевтической композиции согласно изобретению, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, рецепторно-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают, не ограничиваясь перечисленным, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный способы. Композиция может быть введена любым удобным способом, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные покровы (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и может быть введена вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. В одном варианте осуществления терапевтические белки согласно изобретению вводят посредством внутривенной инфузии.

[0148] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, в случае подкожной доставки при доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению весьма подходящей является шприц-ручка. Такой шприц-ручка может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом шприце-ручке обычно используется сменный картридж, содержащий фармацевтическую композицию. После введения всей фармацевтической композиции из картриджа и его опустошения пустой картридж можно легко выбросить и заменить новым картриджем, содержащим фармацевтическую композицию. Затем шприц-ручка может быть использован повторно. В одноразовом шприце-ручке нет сменного картриджа. Напротив, одноразовый шприц-ручка приходит уже заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре внутри устройства. После освобождения резервуара от фармацевтической композиции устройство выбрасывают целиком.

[0149] Множество многоразовых шприцев-ручек и автоинжекторов подходит для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бургдорф, Швейцария), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин Лейкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Франкфурт, Германия), и другие. Примеры одноразовых шприцев-ручек, подходящих для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, шприц-ручку SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинжектор SURECLICK^TM (Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния), шприц-ручку PENLET^TM (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и HUMIRA^TM (Abbott Labs, Абботт Парк, Иллинойс), и другие.

[0150] В определенных ситуациях фармацевтическая композиция может быть доставлена в системе с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления может быть использован насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В еще одном варианте осуществления могут быть использованы полимерные материалы; см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от мишени композиции, в результате чего требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0151] Инъекционные формы могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных вливаний и т.д. Эти инъекционные формы могут быть получены с помощью общеизвестных способов. Например, инъекционные формы могут быть приготовлены, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, обычно используемой для инъекций. В качестве водной среды для инъекций существуют, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные агенты и т.д., которые могут быть использованы в сочетании с подходящим солюбилизирующим агентом, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, HCO-50 (аддукт полиоксиэтилена (50 моль) и гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используются, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые могут быть использованы в сочетании с солюбилизирующим агентом, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Приготовленной таким образом инъекцией предпочтительно наполняют подходящую ампулу.

Виды терапевтического применения антигенсвязывающих молекул

[0152] Настоящее изобретение включает способы, включающие введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтической композиции, содержащей терапевтический белок. Указанная терапевтическая композиция может содержать любое из антител или биспецифичных антигенсвязывающих молекул, как раскрыто в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Выражение «нуждающийся в этом субъект» означает человека или животное, не являющееся человеком, которые демонстрируют один или более симптомов или признаков рака (например, субъекта с признаками опухоли или страдающего любым из видов рака, упомянутых ниже в настоящем документе).

[0153] Антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению (и содержащие их терапевтические композиции) могут успешно применяться, среди прочего, для лечения любого заболевания или расстройства, при котором может оказать благоприятное действие стимуляция, активация и/или нацеливание иммунного ответа. В частности, антитела или биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения, предупреждения и/или облегчения любого заболевания или расстройства, связанного с или опосредованного экспрессией или активностью, например, CD20, PSMA, MUC16, STEAP2 или BCMA, или пролиферацией CD20+, PSMA+, MUC16+, STEAP2+ или BCMA+ клеток. Механизмы действия, на которых основываются методы терапии согласно изобретению, включают уничтожение клеток, экспрессирующих такие антигены, в присутствии эффекторных клеток, например, посредством КЗЦ, апоптоза, АЗКЦ, фагоцитоза, или комбинацией двух или более из этих механизмов.

[0154] Антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения, например, первичных и/или метастатических опухолей, возникающих в головном мозге и мозговых оболочках, голове и шее, ротоглотке, легком и бронхиальном дереве, желудочно-кишечном тракте, мужских и женских половых путях, мышцах, костях, коже и придатках, соединительной ткани, селезенке, иммунной системе, кроветворных клетках и костном мозге, печени и мочевыводящих путях, почке, мочевом пузыре и/или специальных органах чувств, таких как глаз. В отдельных вариантах осуществления антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению применяют для лечения одного или нескольких из следующих видов рака, но не ограничиваясь ими: карциномы поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака предстательной железы, злокачественных глиом, остеосаркомы, колоректального рака, рака желудка (например, рака желудка с амплификацией MET), злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичника, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, синовиальной саркомы, рака щитовидной железы, рака молочной железы, меланомы, глиомы, рака молочной железы (например, протоковой или внутрипротоковой карциномы молочной железы), плоскоклеточной карциномы, рака пищевода, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, онкоцитомы (почки), переходно-клеточной карциномы (почки), уротелиальной карциномы, аденокарциномы (мочевого пузыря) или мелкоклеточной карциномы (мочевого пузыря). Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения антитела или биспецифичные антитела могут успешно применяться для лечения пациента, страдающего рефрактерным или устойчивым к лечению раком, например, кастрационно-резистентным раком предстательной железы.

[0155] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное анти-CD3 x анти-CD20 антитело, которое может успешно применяться для лечения CD20-экспрессирующего рака, включая неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому маргинальной зоны, макроглобулинемию Вальденстрема, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, лимфобластную лимфому или лимфому Беркитта. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой фолликулярную лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой мантийноклеточную лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой лимфому маргинальной зоны. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой фолликулярную лимфому, и максимальная недельная доза биспецифичного антитела составляет 80 мг. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ДВККЛ, и максимальная недельная доза биспецифичного антитела составляет 80 мг. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ДВККЛ, и максимальная недельная доза биспецифичного антитела составляет 160 мг. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ДВККЛ, и максимальная недельная доза биспецифичного антитела составляет 320 мг. В любом из этих или других вариантов осуществления, обсуждаемых в настоящем документе, страдающий раком пациент может иметь историю предшествующей терапии моноспецифичным анти-CD20 антителом.

[0156] Неходжкинская лимфома (НХЛ) является самым распространенным гематологическим злокачественным новообразованием. Среди разнородной группы НХЛ 85-90% имеют B-клеточное происхождение и включают фолликулярную лимфому (ФЛ), диффузную B-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ), мантийноклеточную лимфому (МКЛ), лимфому маргинальной зоны (ЛМЗ) и несколько других B-НХЛ. Антитела к CD20 в сочетании с химиотерапией являются стандартом лечения B-НХЛ; однако, несмотря на первоначальный ответ, у многих пациентов наступает рецидив, часто со все меньшей длительностью ответа при последующих линиях терапии и неблагоприятными исходами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула является анти-CD3 x анти-CD20 биспецифичной, котора связывается с CD3+ T-клетками и CD20+ B-клетками, нацеленно воздействуя на CD20+ опухолевые клетки посредством цитотоксичности, опосредованной T-клетками. В некоторых случаях биспецифичное анти- CD3 x CD20 антитело предназначено для лечения В-клеточного рака (например, НХЛ) у субъекта, у которого была неэффективной предшествующая терапия моноспецифичным анти-CD20 антителом.

[0157] Для пациентов с менее, чем полным ответом на терапию с использованием CAR-T исходы, как правило, являются неблагоприятными, при этом не существует стандартных вариантов терапии. Таким образом, в некоторых случаях биспецифичное анти-CD3 x CD20 антитело согласно настоящему изобретению предназначено для лечения В-клеточного рака (например, НХЛ, такой как ДВККЛ) у субъекта, у которого была неэффективной предшествующая CAR-T терапия, или невосприимчивого к предшествующей CAR-T терапии (например, анти-CD19 CAR-T терапии).

[0158] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное анти-CD3 x анти-PSMA антитело, которое может успешно применяться для лечения PSMA-экспрессирующего рака, включая рак предстательной железы, рак почки, рак мочевого пузыря, колоректальный рак и рак желудка. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный рак предстательной железы).

[0159] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное анти-CD3 x анти-MUC16 антитело, которое может успешно применяться для лечения MUC16-экспрессирующего рака, включая рак яичника, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого, внутрипеченочную холангиокарциному в массивной форме, аденокарциному шейки матки и аденокарциному желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичника.

[0160] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное анти-CD3 x анти-STEAP2 антитело, которое может успешно применяться для лечения STEAP2-экспрессирующего рака, включая рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак легкого, рак ободочной кишки, рак почки, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак матки и рак яичника. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный рак предстательной железы).

[0161] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное анти-CD3 x анти-BCMA антитело, которое может успешно применяться для лечения BCMA-экспрессирующего рака, включая множественную миелому или другие В-клеточные раковые заболевания или раковые заболевания плазматических клеток, такие как макроглобулинемия Вальденстрема, лимфома Беркитта и диффузная B-крупноклеточная лимфома, неходжкинская лимфома, хронический лимфолейкоз, фолликулярная лимфома, мантийноклеточная лимфома, лимфома маргинальной зоны, лимфоплазмоцитарная лимфома и лимфома Ходжкина. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому.

Комбинированные терапии

[0162] Настоящее изобретение относится к способам лечения, включающим введение фармацевтической композиции, содержащей любые из иллюстративных антител и биспецифичных антигенсвязывающих молекул, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами. Иллюстративные дополнительные терапевтические агенты, которые можно применять в комбинации с или вводить в комбинации с антигенсвязывающей молекулой согласно настоящему изобретению включают, например, противоопухолевый агент (например, химиотерапевтические агенты, включающие мелфалан, винкристин (Oncovin), циклофосфамид (Cytoxan), этопозид (VP-16), доксорубицин (Adriamycin), липосомальный доксорубицин (Doxil), бендамустин (Treanda), или любые другие препараты, признанные эффективными при лечении опухолей из плазматических клеток у субъекта). В отдельных вариантах осуществления второй терапевтический агент представляет собой схему, включающую лучевую терапию или трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. В отдельных вариантах осуществления второй терапевтический агент может представлять собой иммуномодулятор. В отдельных вариантах осуществления второй терапевтический агент может представлять собой ингибитор протеасом, включая бортезомиб (Velcade), карфилзомиб (Kyprolis), иксазомиб (Ninlaro). В отдельных вариантах осуществления второй терапевтический агент может представлять собой ингибитор гистондеацетилазы, такой как панобиностат (Farydak). В отдельных вариантах осуществления второй терапевтический агент может представлять собой моноклональное антитело, конъюгат антитело-лекарственное средство, биспецифичное антитело, конъюгированное с противоопухолевым агентом, ингибитор иммунных контрольных точек или их комбинации. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению (например, фармацевтические композиции, содержащие биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, как раскрыто в настоящем документе) также могут быть введены в качестве части схемы лечения, включающей одну или более терапевтических комбинаций, выбранных из моноклонального антитела, отличного от описанных в настоящем документе, которое может взаимодействовать с другим антигеном на поверхности плазматических клеток, биспецифичного антитела, имеющего одно плечо, которое связывается с антигеном на поверхности опухолевых клеток, и другое плечо, которое связывается с антигеном на Т-клетке, конъюгата антитело-лекарственное средство, биспецифичного антитела, конъюгированного с противоопухолевым агентом, ингибитора контрольных точек, например, нацеленного на PD-1 или CTLA-4, или их комбинаций. В отдельных вариантах осуществления ингибиторы контрольных точек могут быть выбраны из ингибиторов PD-1, таких как пембролизумаб (Keytruda), ниволумаб (Opdivo) или цемиплимаб. В отдельных вариантах осуществления ингибиторы контрольных точек могут быть выбраны из ингибиторов PD-L1, таких как атезолизумаб (Tecentriq), авелумаб (Bavencio) или дурвалумаб (Imfinzi). В отдельных вариантах осуществления ингибиторы контрольных точек могут быть выбраны из ингибиторов CTLA-4, таких как ипилимумаб (Yervoy). Другие комбинации, которые могут применяться совместно с антителом согласно изобретению, описаны выше.

[0163] Настоящее изобретение также включает терапевтические комбинации, содержащие любую из антигенсвязывающих молекул, упомянутых в настоящем документе, и ингибитор одного или более из VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9 или уроплакина, где указанный ингибитор представляет собой аптамер, антисмысловую молекулу, рибозим, миРНК, пептитело, нанотело или фрагмент антитела (например, фрагмент Fab; фрагмент F(ab')₂; фрагмент Fd; фрагмент Fv; scFv; фрагмент dAb; или другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела, минитела и минимальные распознающие единицы). Антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению также могут быть введены и/или включены в состав комбинированного препарата с противовирусными препаратами, антибиотиками, анальгетиками и/или НПВП. Антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению также могут быть введены в качестве части схемы лечения, также включающей лучевую терапию и/или традиционную химиотерапию.

[0164] Дополнительный терапевтически активный компонент(ы) может быть введен непосредственно перед, одновременно с или вскоре после введения антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению (в контексте настоящего изобретения такие схемы введения рассматриваются как введение антигенсвязывающей молекулы «в комбинации с» дополнительным терапевтически активным компонентом).

[0165] Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению содержится в комбинации с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в других местах в настоящем документе.

ПРИМЕРЫ

[0166] Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как реализовывать и применять способы и композиции согласно изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы данного изобретения считают созданным ими изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температур и т.д.), но следует учитывать возможность некоторых погрешностей эксперимента и отклонений. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, и давление находится на уровне или около атмосферного.

Пример 1: Клиническая оценка и повышение дозы биспецифичного антитела

[0167] Описанное ниже клиническое исследование представляет собой открытое многоцентровое исследование фазы 1 для изучения безопасности и переносимости REGN1979, биспецифичного моноклонального анти-CD20 x анти-CD3 антитела, у пациентов с CD20+ B-клеточными злокачественными новообразованиями, ранее получавших лечение CD20-направленными антителами.

[0168] Цели: основными целями исследования были оценка безопасности, переносимости и дозолимитирующей токсичности (ДЛТ) REGN1979, вводимого внутривенно (в/в), и изучение противоопухолевой активности REGN1979 в расширенных когортах, включающих диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) после неэффективной терапии Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T), агрессивную лимфому (кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии), фолликулярную лимфому (ФЛ) степени 1-3a и хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). Дополнительными целями исследования были следующие: (1) охарактеризовать фармакокинетический (ФК) профиль REGN1979; (2) оценить иммуногенность REGN1979; (3) изучить предварительную противоопухолевую активность REGN1979, вводимого пациентам с CD20+ B-клеточными злокачественными новообразованиями (неходжкинской лимфомой [НХЛ], которую ранее лечили антителами к CD20, или хроническим лимфолейкозом [ХЛЛ]); и (4) изучить предварительную противоопухолевую активность REGN1979 в части исследования с повышением дозы. Оценку минимальной остаточной болезни (МОБ) проводили у пациентов с ХЛЛ. Поисковые цели исследования заключались в оценке биомаркеров, которые могут коррелировать с механизмом действия, наблюдаемой токсичностью и потенциальной противоопухолевой активностью, включая, помимо прочего: (1) профили цитокинов и оценку воспалительных маркеров (например, C-реактивного белка [СРБ]); (2) субпопуляции В-клеток и Т-клеток периферической крови и иммунное фенотипирование; и (3) изменения экспрессии генов в периферической крови.

[0169] Дизайн исследования: пациентов распределяли по когортам уровней доз (DL), которые состояли из начальной стартовой дозы и последующих более высоких повышающих доз для второго и последующих введений доз. Пациентов включали в исследование на основании заболевания (НХЛ или ХЛЛ). На каждом DL было по 2 когорты (по одной для каждого заболевания), включавших от 3 до 6 пациентов на когорту НХЛ и от 1 до 6 пациентов на когорту ХЛЛ. Пациенты с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой (МЛЛ) были включены в когорту ХЛЛ и проходили те же оценки, что и когорта НХЛ.

[0170] Пациенты, у которых изначально наблюдалось клиническое улучшение и которые впоследствии рецидивировали, прогрессировали или показали субоптимальный ответ на лечение, могли повторно проходить лечение с помощью REGN1979 на самом высоком DL, который считался переносимым на момент рецидива или прогрессирования.

[0171] Пациенты прошли процедуры скрининга для определения соответствия критериям включения за 28 дней до первоначального введения REGN1979. Пациентов включали последовательно на основании заболевания (НХЛ или ХЛЛ) в порядке подтверждения спонсором соответствия критериям включения до тех пор, пока каждая когорта не была заполнена согласно критериям протокола.

[0172] Были созданы отдельные независимые когорты повышения дозы для НХЛ и ХЛЛ при каждом DL. Каждый DL состоял из начальной дозы и второй и последующих доз, которые были выше стартовой дозы, при условии, что начальная доза переносилась.

[0173] Повышение дозы проводили по традиционной схеме повышения дозы 3+3 для пациентов с НХЛ. На каждую когорту было запланировано от трех до шести пациентов, исходя из наблюдаемой токсичности.

[0174] Повышение дозы проводили по модифицированной схеме 3+3 с компонентом ускоренного титрования дозы для пациентов с ХЛЛ. На основании наблюдаемой токсичности было запланировано от 1 до 6 пациентов на когорту.

[0175] По завершении фазы повышения дозы и после определения рекомендуемой дозы для дальнейшего исследования у пациентов с НХЛ должны были быть открыты три расширенные когорты для 1) пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии (20 пациентов), 2) агрессивной лимфомой (кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии) (40 пациентов; из которых по 20 пациентов должны были быть включены в когорту 1 [повышающая доза 160 мг]) и когорту 2 агрессивной лимфомы [повышающая доза 80 мг]), и 3) пациентов с рецидивирующей/рефрактерной фолликулярной лимфомой степени 1-3a (60 пациентов; из которых по 30 пациентов должны были быть включены в когорту 1 [повышающая доза 80 мг] и когорту 2 [повышающая доза 160 мг]). Еженедельная повышающая доза REGN1979 для каждой из этих расширенных когорт (за исключением когорты 2 агрессивной лимфомы и когорты 1 фолликулярной лимфомы) была установлена на уровне 160 мг в неделю, с последующим поддерживающим лечением 320 мг REGN1979 1р/2нед. В когорте 2 агрессивной лимфомы и когорте 1 фолликулярной лимфомы еженедельная повышающая доза REGN1979 составляла 80 мг, а поддерживающая доза REGN1979 1р/2нед составляла 160 мг. Пациенты, которым была назначена повышающая доза 80 мг, получали 80 мг еженедельно в течение 4-недельного индукционного периода после повышения начальной дозы с последующим введением дополнительных 8 еженедельных доз и лечения 160 мг 1р/2нед до прогрессирования, с возможностью прекращения лечения после демонстрации пациентом устойчивого ответа в течение как минимум 9 месяцев после первоначального достижения полного ответа. Пациенты, которым была назначена повышающая доза 160 мг, получали 160 мг еженедельно в течение 4-недельного индукционного периода после повышения начальной дозы с последующим введением дополнительных 8 еженедельных доз и лечения 320 мг 1р/2нед до прогрессирования, с возможностью прекращения лечения после демонстрации пациентом устойчивого ответа в течение как минимум 9 месяцев после первоначальной демонстрации ПО.

[0176] Целесообразность подготовительной дозы ритуксимаба до первого введения REGN1979 была изучена у пациентов с НХЛ, чтобы определить, может ли такое вмешательство снизить частоту развития и тяжесть инфузионной реакции (ИР) и синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ). В когорте подготовительной дозы ритуксимаба REGN1979 вводили с повышающей дозой 160 мг во время еженедельного лечения и 320 мг во время поддерживающего лечения 1р/2нед. Затем еще 24 пациента должны были получать лечение с использованием оптимальной схемы дозирования и дозы; вместе с 6 пациентами из группы подготовительной дозы ритуксимаба, получавшими лечение оптимальной дозой, в общей сложности 30 пациентов было исследовано на предмет безопасности и переносимости.

[0177] На первом DL для части с повышением дозы между первоначальными введениями исследуемого препарата для первых 3 пациентов с одним и тем же заболеванием соблюдали обязательный 48-часовой период ожидания. Последующие пациенты на первом DL не получали лечение в тот же день, независимо от заболевания. В последующих когортах, при условии, что в предшествующих когортах или в данной когорте не наблюдалось неожиданной токсичности, начальные инфузии для первых 3 пациентов вводили с интервалом не менее 24 часов.

[0178] После того, как каждая когорта пациентов была набрана, получила лечение и завершила период наблюдения ДЛТ, было принято решение об открытии последующих когорт DL для включения пациентов (или расширении текущей открытой когорты DL) после того, как данные о безопасности были изучены спонсором и исследователем(ями).

[0179] Период наблюдения ДЛТ был определен как первые 28 дней лечения, которые в этом исследовании соответствуют индукционному периоду. Во время индукции пациенты получали 4 еженедельных введения REGN1979.

[0180] Чтобы быть пригодным для оценки ДЛТ, отдельный пациент должен был получить по меньшей мере первые 2 введения REGN1979 (день 1 недели 1 [«начальная или первичная доза»] и день 1 недели 2 [«вторичная и последующая доза»]) или испытать ДЛТ. Пациенты, включенные на DL11 и выше, должны были получить по меньшей мере первые 3 введения REGN1979 (начальная доза на неделе 1, промежуточная или вторичная доза на неделе 2, и более высокая третичная или повышающая доза на неделе 1) или испытать ДЛТ. Кроме того, пациент должен был наблюдаться в течение как минимум 28 дней после первого введения и как минимум 21 дня после второго введения.

[0181] Повышение дозы и когорты пациентов с НХЛ и ХЛЛ представлены ниже в таблице 1.

Таблица 1. Повышение дозы и когорты

Уровень дозы Начальная доза (мкг) Промежуточная доза (мкг) Максимальная доза (повышающая доза) (мкг) НХЛ n ХЛЛ n DL1 30 - 100 Когорта 1 3-6 Когорта 1 1-6 DL2 100 - 300 Когорта 2 3-6 Когорта 2 1-6 DL3 300 - 1000 Когорта 3 3-6 Когорта 3 1-6 DL4 1000 - 2000 Когорта 4 3-6 Когорта 4 1-6 DL5 1000 - 3000 Когорта 5 3-6 Когорта 5 1-6 DL6 1000 - 4000 Когорта 6 3-6 Когорта 6 1-6 DL7 1000 - 5000 Когорта 7 3-6 Когорта 7 1-6 DL8 1000 - 6000 Когорта 8 3-6 Когорта 8 1-6 DL9 1000 - 7000 Когорта 9 3-6 Когорта 9 1-6 DL10 1000 - 8000 Когорта 10 3-6 Когорта 10 1-6 DL11 1000 6 000 12 000 Когорта 11 3-6 Когорта 11 1-6 DL12 1000 9 000 18 000 Когорта 12 3-6 Когорта 12 1-6 DL13 1000 13 500 27 000 Когорта 13 3-6 Когорта 13 1-6 DL14 1000 20 000 40 000 Когорта 14 3-6 Когорта 14 1-6 DL15 1000 20 000 80 000 Когорта 15 3-6 Когорта 15 1-6 DL16 1000 20 000 160 000 Когорта 16 3-6 Когорта 16 1-6 DL17 1000 20 000 320 000 Когорта 17 3-6 Когорта 17 1-6

[0182] В этом исследовании каждый уровень дозы включает начальную дозу REGN1979 с последующей повышающей дозой; для когорт DL11 и выше была добавлена вторичная доза до достижения повышающей дозы (см. таблицу 1). Каждая из начальной (первичной) дозы, промежуточной (вторичной) дозы (если применимо) и первого введения повышающей (третичной) дозы опционально может быть введено за несколько приемов в течение по меньшей мере 2 дней. Все пациенты в когортах с максимальной дозой DL7 и выше получали дробное дозирование (например, дозирование по частям) для начальной (первичной) и промежуточной (вторичной) доз. Пациенты в когортах с максимальной дозой DL11 и выше получали дробное дозирование (например, дозирование по частям) для начальной (первичной), промежуточной (вторичной) и первой повышающей (третичной) доз с последующими повышающими дозами (максимальная недельная доза).

[0183] Продолжительность исследования: период лечения составляет 9 месяцев. Пациенты получат до 24 доз REGN1979-4 еженедельные дозы в течение 4-недельного индукционного периода, затем дополнительные 8 еженедельных доз и 12 или более доз, вводимых дважды в месяц (1р/2нед) в течение поддерживающего периода до прогрессирования, с возможностью прекращения лечения через 9 месяцев после достижения пациентом полного ответа. За пациентами может проводиться последующее наблюдение на предмет эффективности и безопасности в течение вплоть до 15 месяцев после окончания лечения.

[0184] Популяция, вошедшая в исследование: исходя из предположения о включении пациентов в исследование вплоть до DL17 и полном наборе во все расширенные когорты, запланировано до 370 пациентов примерно в 15 центрах в США и Германии. До 204 пациентов будут включены в когорты повышения дозы вплоть до DL17 для обоих заболеваний (НХЛ и ХЛЛ) во время фазы повышения дозы. До 100 пациентов, включая 90 пациентов с НХЛ (20 пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, 40 пациентов с агрессивной лимфомой [кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии], 30 пациентов с ФЛ степени 1-3a) и 10 пациентов с ХЛЛ будут включены в расширенные когорты по заболеванию. Вплоть до 42 пациентов будут включены в когорту подготовительной дозы ритуксимаба для определения оптимальной схемы дозирования. После установления оптимальной схемы введения подготовительной дозы ритуксимаба еще 24 пациента будут включены в расширенную когорту подготовительной дозы ритуксимаба и будут объединены с 6 пациентами из вышеуказанной группы подготовительной дозы ритуксимаба, получившими оптимальную схему дозирования и дозу. Таким образом, в общей сложности 30 пациентов будет исследовано при оптимальной схеме введения подготовительной дозы ритуксимаба и дозе.

[0185] Пациенты должны иметь подтвержденное CD20+ B-клеточное злокачественное новообразование с активным заболеванием, невосприимчивым к предшествующей терапии, для которого не существует стандартных вариантов лечения и для которого может быть целесообразным лечение анти-CD20 антителом. Пациенты с НХЛ должны иметь историю терапии анти-CD20 антителом.

[0186] Критерии включения: пациент должен отвечать следующим критериям, чтобы подходить для участия в исследовании:

1. Иметь документально CD20+ B-клеточное злокачественное новообразование с активным заболеванием, невосприимчивым к предшествующей терапии, для которого не существует стандартных вариантов лечения и для которого может быть целесообразным лечение анти-CD20 антителом:

B-НХЛ подтверждена критериями рабочей группы NCI (Национальный институт онкологии), 2007 г. (Cheson 2007, Приложение 2); и

ХЛЛ подтвержден критериями рабочей группы Международного семинара по хроническому лимфолейкозу (IWCLL), 2008 г. (Hallek 2008, Приложение 3) − пациенты с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой (МЛЛ) будут включены в когорту ХЛЛ и будут проходить те же оценки, что и когорта НХЛ.

Примечание: пациент с CD20-отрицательной биопсией лимфатического узла (НХЛ), проведенной в качестве стандартного лечения непосредственно перед включением в исследование, тем не менее, пригоден для участия в исследовании при условии, что он имеет ранее подтвержденное CD20+ заболевание И ПРИ ЭТОМ он ранее получал лечение ритуксимабом или другой терапией анти-CD20 антителом в течение примерно 6 месяцев. Отдельные случаи могут обсуждаться с медицинским наблюдателем.

2. Пациенты с НХЛ должны иметь историю терапии анти-CD20 антителом. Пациенты с ХЛЛ не обязаны иметь историю терапии анти-CD20 антителом при условии, что у пациента была неэффективной терапия ингибитором BTK или ингибитором PI3K, и лечащий врач считает целесообразным включить пациента в исследование 1 фазы. Для включения в расширенную когорту ФЛ степени 1-3a пациенты должны получить по меньшей мере 2 предшествующие линии системной терапии, включая антитело к CD20 и алкилирующий агент. Для включения в расширенную когорту пациентов по заболеванию, включающую пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, пациент должен восстановиться после токсических эффектов лимфодеплетирующей терапии и инфузии CAR-T. Предшествующая CAR-T терапия не обязательно должна быть последней использованной линией терапии до включения в исследование.

3. Все пациенты (с В-клеточной НХЛ и ХЛЛ) должны иметь по меньшей мере одно измеримое в двух направлениях поражение размером ≥1,5 см), подтвержденное с помощью компьютерной томографии или МРТ, если компьютерная томография невозможна.

4. Пациенты с ХЛЛ должны иметь количество лейкоцитов (WBC) ≤200×109/л

5. Возраст ≥18 лет

6. Оценка функционального состояния по шкале Восточной объединенной группы онкологов (ECOG) ≤1

7. Ожидаемая продолжительность жизни не менее 6 месяцев

8. Приемлемая функция костного мозга, подтвержденная: a. Количеством тромбоцитов ≥75×109/л; b. Уровнем гемоглобина ≥9 г/дл; c. Абсолютным количеством нейтрофилов (АКН) ≥1×109/л

Примечание: пациенты с количеством клеток ниже пороговых значений, указанных выше, могут рассматриваться для включения в исследование, если, по мнению исследователя, причина заключается в инфильтрации костного мозга в результате основного заболевания. В таких случаях исследователь должен обсудить со спонсором пригодность для участия и получить письменное разрешение на включение в исследование.

9. Приемлемая функция органа, подтвержденная:

• Уровнями аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) ≤2,5 X ULN

• Общим билирубином ≤1,5 X ULN

Примечание: пациенты с синдромом Жильбера могут не соответствовать этому требованию при условии, что их общий билирубин не изменился по сравнению с исходным уровнем.

• Расчетный клиренс креатинина по формуле Кокрофта-Голта ≥50 мл/мин

Примечание: пациенты могут рассматриваться для включения в исследование, если, по мнению исследователя, отклонения результатов лабораторных исследований от нормы связаны с основным заболеванием. В таких случаях исследователь должен обсудить со спонсором пригодность для участия и получить письменное разрешение на включение в исследование.

Примечание: пациенты с пограничным клиренсом креатинина по формуле Кокрофта-Голта могут рассматриваться для включения в исследование, если измеренный клиренс креатинина (на основании суточной мочи или другого надежного метода) составляет ≥50 мл/мин.

10. Готовность пройти обязательную предварительную биопсию опухоли, если, по мнению исследователя, у пациента есть доступное поражение, из которого можно взять биопсию без значительного риска для пациента.

11. Желание и готовность соблюдать график посещений клиники и проходить процедуры, связанные с исследованием

12. Предоставление подписанного информированного согласия.

[0187] Критерии исключения: пациент, удовлетворяющий любому из следующих критериев, будет исключен из исследования:

1. Первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС) или известное или предполагаемое поражение ЦНС непервичной НХЛ ЦНС

2. Ранее перенесенная или текущая релевантная патология ЦНС, такая как

• Эпилепсия, судороги, парез, афазия, апоплексия, тяжелые травмы головного мозга, заболевание мозжечка, органический мозговой синдром, психоз или

• Признаки наличия воспалительных поражений и/или васкулита на МРТ головного мозга

3. Стандартная антинеопластическая химиотерапия (небиологическая) в течение 5-кратного периода полувыведения или в течение 28 дней, в зависимости от того, какой период короче, до первого введения исследуемого препарата.

4. Стандартная лучевая терапия в течение 14 дней до первого введения исследуемого препарата.

Примечание: паллиативная лучевая терапия симптоматического лимфатического узла/поражения разрешена при условии, что облучаемое поражение(ия) или узел (узлы) не приняты в качестве целевого поражения для оценки опухоли

5. Аллогенная трансплантация стволовых клеток

6. Лечение ритуксимабом, алемтузумабом или другим экспериментальным или коммерческим биологическим агентом в течение 12 недель до первого введения исследуемого препарата.

Примечание: для пациентов с агрессивной лимфомой, которым требуется немедленное лечение, период отмывки может быть сокращен до 28 дней. Это потребует обсуждения со спонсором и письменного утверждения им.

7. Иммуносупрессивная терапия (кроме биологической) в течение 28 дней до первого введения исследуемого препарата.

8. Лечение экспериментальным небиологическим агентом в течение 28 дней до первого введения исследуемого препарата.

9. История аллергических реакций, связанных с соединениями с химическим или биологическим составом, схожим с исследуемым препаратом.

10. История гиперчувствительности к любому соединению из группы антибиотиков тетрациклинового ряда.

11. Сопутствующее активное злокачественное новообразование, от которого пациент получает лечение.

12. Выявленная активная бактериальная, вирусная, грибковая, микобактериальная или другая инфекция, или любой серьезный эпизод инфекции, требующий госпитализации или лечения внутривенными антиинфекционными препаратами в течение 4 недель до первого введения.

13. Свидетельства значительного сопутствующего заболевания или патологического состояния, которое может помешать проведению исследования или подвергнуть пациента значительному риску, включая, не ограничиваясь перечисленным, серьезные сердечно-сосудистые заболевания (например, сердечно-сосудистые заболевания класса III или IV согласно Нью-Йоркской кардиологической ассоциации, инфаркт миокарда за предыдущие 6 месяцев, нестабильные аритмии или нестабильная стенокардия) и/или серьезное заболевание легких (например, обструктивная болезнь легких и история симптоматического бронхоспазма).

Примечание: пациенты с кардиологическим заболеванием в анамнезе должны быть обследованы с помощью эхокардиографии или радионуклидной вентрикулографии (MUGA) до первого введения REGN1979, чтобы убедиться в приемлемых сердечных резервах и функции.

14. Текущее лечение системными кортикостероидами, за исключением применения кортикостероидов по другим показаниям (не связанным с опухолями и иммуносупрессией), до максимальной дозы 10 мг/сут преднизона или его эквивалента.

15. Инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) или хроническая инфекция вирусом гепатита B (HBV) или вирусом гепатита C (HCV). Пациенты с гепатитом B (HepBsAg+), имеющие контролируемую инфекцию (уровень ДНК вируса гепатита B в сыворотке ниже предела обнаружения И ТАКЖЕ получение противовирусной терапии гепатита B), допускаются по результатам консультации с лечащим врачом, осуществляющим лечение инфекции.

16. Известная гиперчувствительность к обоим из аллопуринола и расбуриказы.

17. Беременные или кормящие женщины.

18. Женщины детородного возраста*, которые не желают применять высокоэффективную контрацепцию до начала лечения исследуемым препаратом, во время исследования и в течение по меньшей мере 6 месяцев после последней дозы. Меры высокоэффективной контрацепции включают регулярное применение комбинированной (содержащей эстроген и прогестаген) гормональной контрацепции (оральной, интравагинальной, трансдермальной) или только прогестагенной гормональной контрацепции (оральной, инъекционной, имплантируемой), связанной с ингибированием овуляции, начинаемой за 2 или более менструальных циклов до скрининга; внутриматочное средство; внутриматочную гормональную систему; двустороннюю перевязку маточных труб; проведенную вазэктомию партнера; и/или половое воздержание†, ‡.

*Женщины в постменопаузе должны иметь аменорею в течение не менее чем 12 месяцев, чтобы считаться неспособными к деторождению. Тестирование на беременность и контрацепция не требуются женщинам с подтвержденной гистероэктомией или перевязкой маточных труб.

† Половое воздержание считается высокоэффективным методом только в том случае, если оно определяется как воздержание от гетеросексуальных контактов в течение всего периода риска, связанного с исследуемым лечением. Надежность полового воздержания необходимо оценивать в зависимости от продолжительности клинического исследования и предпочтительного и обычного образа жизни пациента.

‡ Периодическое воздержание (календарный, симптотемпературный, постовуляционный методы), прерывание полового акта (прерываемый коитус), применение только спермицидов и метод лактационной аменореи (LAM) не являются приемлемыми методами контрацепции. Женский презерватив и мужской презерватив не должны использоваться вместе.

19. Введение живой вакцины в течение 28 дней до первого введения исследуемого препарата

20. Член исследовательской группы места проведения клинического исследования и/или его/ее ближайшие родственники, если только спонсор не дал предварительного разрешения.

[0188] Лечение: REGN1979 поставлялся в виде жидкости в стерильных одноразовых флаконах. Каждый флакон содержал REGN1979 в концентрации 2 мг/мл. Подробные инструкции по приготовлению и применению были предоставлены в места проведения клинического исследования в фармацевтическом руководстве. Для приготовления исследуемого препарата REGN1979 поставлялся разбавитель.

[0189] Пациенты получали REGN1979 еженедельно в течение 4-недельного индукционного периода с последующими 8 еженедельными дозами и дозами 1р/2нед до прогрессирования в дозе, соответствующей назначенной им когорте.

[0190] Только в когорте подготовительной дозы ритуксимаба и расширенной когорте вводили разовую доза ритуксимаба (375 мг/м²) за один день до первой дозы REGN1979 [т.е. в (-1) день исследования]. REGN1979 начинали в день 1 недели 1, и период лечения REGN1979 составил 9 месяцев. Пациенты получали до 24 доз REGN1979: 4 еженедельные дозы в течение 4-недельного индукционного периода, затем дополнительные 8 еженедельных доз и 12 или более доз, вводимых 1р/2нед в течение поддерживающего периода, до прогрессирования. В когорте подготовительной дозы ритуксимаба REGN1979 вводили с повышающей дозой 160 мг во время еженедельного лечения и 320 мг во время поддерживающего лечения 1р/2нед. Также могут быть оценены дозовые группы с повышающими дозами REGN1979 ниже 160 мг для еженедельного лечения и ниже 320 мг для поддерживающего лечения REGN1979 1р/2нед. Затем было оценено еще 24 пациента при оптимальной схеме дозирования и дозе; вместе с 6 пациентами из группы подготовительной дозы ритуксимаба, получавшими оптимальную схему дозирования и дозу, в общей сложности 30 пациентов было исследовано на предмет безопасности и переносимости.

[0191] Конечные точки

[0192] Первичные: первичными конечными точками были безопасность (в частности, нежелательные явления [НЯ] и ДЛТ) для определения максимальной переносимой дозы (МПД) и/или оптимальной биологической дозы (ОБД) в качестве рекомендованной дозы REGN1979 для фазы 2 (RP2D); и эффективность, измеряемая по частоте объективного ответа (ЧОО) в расширенной когорте пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, в расширенных когортах 1 и 2 агрессивной лимфомы (кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии), расширенной когорте ФЛ 1-3a степени и расширенной когорте ХЛЛ.

[0193] Вторичные: вторичные конечные точки представляли собой следующие:

• Фармакокинетика: концентрация REGN1979

• Иммуногенность: антитела к REGN1979

• Противоопухолевая активность:

− Частота объективного ответа (ЧОО)

• Оценка ответа опухоли в соответствии с Пересмотренными критериями оценки ответа злокачественных лимфом Международной рабочей группы NCI (NCI-WG)

• Оценка ответа опухоли в соответствии с Рекомендациями по диагностике и лечению ХЛЛ Международного семинара по хроническому лимфолейкозу

• Для пациентов, включенных в расширенные когорты с НХЛ, оценка ответа опухоли в соответствии с классификацией Лугано

− Выживаемость без прогрессирования (ВБП) и общая выживаемость (ОВ)

− Минимальная остаточная болезнь (МОБ) для пациентов с ХЛЛ

[0194] Поисковые конечные точки включают:

• Фармакодинамические (ФД) показатели, включая:

− Субпопуляции и фенотип В-клеток и Т-клеток

− Уровни циркулирующих в крови цитокинов

− CРБ

− Изменения экспрессии генов в периферической крови

[0195] Процедуры и оценки

[0196] Процедуры на исходном уровне: МРТ головного мозга, электрокардиограмма (ЭКГ), тестирование на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита С (ВГС) и вирус гепатита В (ВГВ), и коагулограмма.

Процедуры обеспечения безопасности: анамнез, физикальное обследование, оценка симптомов, оценка общего состояния, клинические лабораторные исследования, показатели жизненно важных функций, НЯ и сопутствующие лекарственные средства.

[0197] Процедуры для оценки эффективности: оценка опухолей, включая компьютерную томографию или МРТ, сканирование методом позитронно-эмиссионной томографии с введением 18F-фтордезоксиглюкозы (FDG-PET), аспират и биопсию костного мозга, биопсии лимфатических узлов и/или опухолей, и образцы периферической крови (только для пациентов с ХЛЛ).

Брали образцы крови для оценки ФК и антител к лекарственному препарату (ADA).

Брали образцы биомаркеров для отслеживания изменений в продукции цитокинов, сывороточных уровней провоспалительных цитокинов, а также изменений в субпопуляциях и статусе активации лимфоцитов. Кроме того, эти образцы позволили провести опухолевый или соматический генетический анализ вариаций, которые влияют на клиническое течение основного заболевания или модулируют побочные действия лечения.

[0198] План статистического анализа: дизайн исследования был основан на традиционном дизайне 3+3 с 3-6 пациентами на DL для пациентов с НХЛ, и модифицированном дизайне 3+3 с компонентом ускоренного титрования дозы с 1-6 пациентами на DL для пациентов с ХЛЛ. Точное количество включенных в исследование пациентов будет зависеть от количества наблюдаемых пациентов (с НХЛ и ХЛЛ) с определенными протоколом ДЛТ, и от связанной с лечением токсичности 2 или более высокой степени, при которой острые эффекты (за исключением связанных отклонений лабораторных показателей) разрешаются до ≤ степени 1 или исходного уровня в течение 72 часов (ХЛЛ во время компонента ускоренного титрования дозы), а также необходимости расширения определенных в настоящее время DL или открытия дополнительных когорт с более низкими DL.

[0199] Набор пациентов продолжается, и запланировано вплоть до 370 пациентов. До 204 пациентов будут включены в когорты повышения дозы вплоть до DL17 для обоих заболеваний (НХЛ и ХЛЛ) во время фазы повышения дозы. До 100 пациентов, включая 90 пациентов с НХЛ (20 пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, 40 пациентов с агрессивной лимфомой [кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии] и 30 пациентов с ФЛ степени 1-3a) и 10 пациентов с ХЛЛ будут включены в расширенные когорты по заболеваниям. Вплоть до 42 пациентов будут включены в когорту подготовительной дозы ритуксимаба для определения оптимальной схемы дозирования. Еще 24 пациента будут включены в расширенную когорту подготовительной дозы ритуксимаба и будут объединены с 6 пациентами из вышеуказанной когорты подготовительной дозы ритуксимаба, получившими оптимальную схему дозирования и дозу. Таким образом, в общей сложности 30 пациентов будет исследовано при оптимальной схеме введения подготовительной дозы ритуксимаба и дозе.

[0200] Данные обобщаются с использованием только описательной статистики. Обычно данные обобщаются по DL и по заболеванию (НХЛ или ХЛЛ). В пределах заболевания НХЛ данные также будут обобщены по подгруппам и дозе для ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, когорте 1 и 2 агрессивной лимфомы (кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии) и ФЛ 1-3a степени. В пределах заболевания НХЛ данные также обобщают по подгруппам индолентной и агрессивной НХЛ. Характеристики популяции пациентов и характеристики исходного уровня обобщают по группам с помощью описательной статистики.

[0201] Обобщения и анализы безопасности проводили на выборке для анализа безопасности (SAF). Первичный анализ безопасности был основан на НЯ, возникших в ходе лечения (НЯВЛ). На основе данных этого анализа были сделаны выводы относительно профиля безопасности REGN1979. Все НЯ, зарегистрированные в данном исследовании, были закодированы с использованием текущей доступной версии Медицинского словаря для нормативно-правовой деятельности (MedDRA®). Кодирование будет осуществляться терминами нижнего уровня. Была указан закодированный текст, предпочтительный термин (PT) и главный класс систем органов (SOC). Анализ эффективности и переменных исходного уровня выполняется с использованием выборки для анализа эффективности (FAS). Анализы эффективности для расширенных когорт, включающих ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, когорты 1 и 2 агрессивной лимфомы (кроме ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии), ФЛ степени 1-3a и ХЛЛ будут выполняться по отдельности, после того как все пациенты в соответствующей когорте совершат посещение на неделе 24 или прекратят участие в исследовании до этого времени.

[0202] Результаты: результаты для пациентов, которым вводили максимальную еженедельную дозу от 5 до 320 мг, указывают на низкую частоту развития СВЦ. Было обнаружено, что сывороточные концентрации REGN1979 у пациентов, получавших максимальную недельную дозу, равную всего лишь 12 мг, приближались к уровням сывороточных концентраций, продемонстрировавших эффективность в мышиных ксенотрансплантатных моделях опухоли Raji (данные не показаны), или превышали их. У пациентов, получавших максимальную недельную дозу, равную всего лишь 40 мг, поддерживалась сывороточная концентрация, превышающая минимальный уровень концентрации (2000 мкг/л), продемонстрировавший эффективность в мышиных ксенотрансплантатных моделях опухоли Raji (данные не показаны). Кроме того, у пациентов, получавших лечение на этих уровнях, также наблюдались неоднократные частичные и полные ответы, как показано ниже в таблицах 2-9. Совокупные данные по безопасности и ФК REGN1979 в течение периода оценки ДЛТ когорты 13N (27000 мкг REGN1979) демонстрируют, что алгоритм контроля СВЦ или ИР (т.е. поэтапное повышение дозы, дробное дозирование в течение первых недель введения REGN1979 и премедикация кортикостероидами) доказал свою эффективность в предупреждении тяжелых СВЦ или ИР, несмотря на нарастание дозы в каждой очередной дозовой когорте. Дробное дозирование обеспечило улучшение безопасности пациентов на неделях 1-4 (доступные данные), где наблюдалось меньшее совокупное количество случаев тяжелых СВЦ/ИР. В частности, обсуждаемая в настоящем документе стратегия дозирования обеспечила более безопасную стратегию повышения доз до уровней более 80 мг, даже 160 мг или более, с меньшим количеством тяжелых явлений на неделях 3 и 4, когда более высокие дозы обеспечивали достижение и превышение желаемых сывороточных концентраций, обсуждаемых выше. На фиг. 1 показана частота развития СВЦ/ИР у пациентов, получавших максимальную дозу, равную 320 мг. На сегодняшний день ни один из пациентов не выбыл из исследования из-за нежелательного явления СВЦ/ИР.

Таблица 2. Наблюдаемый ответ при фолликулярной лимфоме степени 1-3a

CD20xCD3^† <5 мг
(N=7) 5-12 мг
(N=5) 18-40 мг
(N=6) 160 мг
(N=1) Общая частота ответов, n (%) 1 (14,3) 5 (100) 5 (83,4) 1 (100) Полный ответ, n (%) 1 (14,3) 4 (80) 4 (66,7) 0 Частичный ответ, n (%) 0 1 (20) 1 (16,7) 1 (100) Стабильное заболевание, n (%) 4 (57,1) 0 1 (16,7) 0 Прогрессирующее заболевание, n (%) 2 (28,6) 0 0 0 Длительность ответа, медиана (95% ДИ), месяцев 5,3
Н/Д Н/Д (5,75 - не достигнуто) 11,8 (4,37-11,83) Н/Д

^†Ни один пациент не получал дозу 80 мг REGN1979

[0203] После прекращения сбора данных (таблица 2) еще два оцениваемых пациента показали полные ответы (ПО), один при 40 мг, а второй - при 320 мг.

Таблица 3. Наблюдаемый ответ при диффузной В-крупноклеточной лимфоме

CD20xCD3 <5 мг
(N=15) 5-12 мг
(N=11) 18-40 мг
(N=11) 80 мг
(N=3) 160 мг (N=3) 320 мг (N=2) Общая частота ответов, n (%) 2 (13,3) 2 (18,2) 6 (54,5) 3 (100) 1 (33,3) 1 (50,0) Полный ответ, n (%) 0 1 (9,1) 2 (18,2) 3 (100) 1 (33,3) 1 (50,0) Частичный ответ, n (%) 2 (13,3) 1 (9,1) 4 (36,4) 0 0 0 Стабильное заболевание, n (%) 4 (26,7) 4 (36,4) 3 (27,3) 0 1 (33,3) 1 (50,0) Прогрессирующее заболевание, n (%) 8 (53,3) 4 (36,4) 1 (9,1) 0 1 (33,3) 0 Отсутствует/невозможно оценить, n (%) 1 (6,7) 1 (9,1) 1 (9,1) 0 0 0 Длительность ответа, медиана (95% ДИ), месяцев 2,1 (1,5-2,6) Н/Д 4,4
(2,5-не достигнуто) Н/Д Н/Д Н/Д

[0204] У двух из трех пациентов, получавших 80 мг, продемонстрировавших ПО, была неэффективной CAR Т-клеточная терапия. Все полные ответы, указанные в таблице 3, были полными метаболическими ответами.

[0205] Все ПО при дозах 80 мг, 160 мг и 320 мг являются текущими ПО при получении исследуемого лечения, что указывает на устойчивость ответа.

Таблица 4. Наблюдаемый ответ при ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии

CD20xCD3 3 мг
(N=1) 27 мг
(N=1) 40 мг
(N=1) 80 мг
(N=3) 160 мг
(N=1) Общая частота ответов, n (%) 0 0 2 (66,7) Полный ответ, n (%) 0 0 2 (66,7) Частичный ответ, n (%) 0 0 0 Стабильное заболевание, n (%) 0 1 (100) 0 Прогрессирующее заболевание, n (%) 1 (100) 0 1 (100) 1 (33,3) 1 (100) Отсутствует/невозможно оценить, n (%) 0 0 0

Таблица 5. Наблюдаемый ответ при мантийноклеточной лимфоме

CD20xCD3 5-12 мг
(N=1) 18-40 мг
(N=1) 160 мг
(N=1) Объективный ответ (ПО/ЧО) 1 (100%) 1 (100%) 0 Полный ответ 0 1 (100%) 0 Частичный ответ 1 (100%) 0 0 Стабильное заболевание 0 0 0 Прогрессирующее заболевание 0 0 0 Отсутствует/невозможно оценить 0 0 1 (100%)

Таблица 6. Наблюдаемый ответ при лимфоме маргинальной зоны

CD20xCD3 5-12 мг
(N=1) 18-40 мг
(N=1) 80 мг
(N=3) Объективный ответ
(ПО/ЧО) 0 1 (100%) 2 (66,7%) Полный ответ 0 0 2 (66,7%) Частичный ответ 0 1 (100%) 0 Стабильное заболевание 0 0 0 Прогрессирующее заболевание 1 (100%) 0 1 (33,3%)

Таблица 7. Ответы у пациентов с МКЛ в зависимости от уровня дозы

CD20xCD3 0,3 мг
(N=1) 2 мг
(N=1) 4 мг
(N=1) 8 мг
(N=1) 27 мг
(N=1) 160 мг
(N=1) Объективный ответ (ПО/ЧО) 0 1 (100%) 0 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) Полный ответ 0 0 0 0 1 (100%) 1 (100%) Частичный ответ 0 1 (100%) 0 1 (100%) 0 0 Стабильное заболевание 0 0 0 0 0 0 Прогрессирующее заболевание 1 (100%) 0 1 (100%) 0 0 0 Отсутствует/невозможно оценить 0 0 0 0 0 0

Таблица 8. Ответы пациентов с ЛМЗ в зависимости от уровня дозы

CD20xCD3 4 мг
(N=1) 5 мг
(N=1) 27 мг
(N=1) 80 мг
(N=3) Объективный ответ (ПО/ЧО) 1 (100%) 0 1 (100%) 2 (66,7%) Полный ответ 0 0 0 2 (66,7%) Частичный ответ 1 (100%) 0 1 (100%) 0 Стабильное заболевание 0 0 0 0 Прогрессирующее заболевание 0 1 (100%) 0 1 (33,3%) Отсутствует/невозможно оценить 0 0 0 0

Таблица 9. Ответы у пациентов с другими НХЛ в зависимости от уровня дозы

CD20xCD3 4 мг
(N=1) 12 мг
(N=1) 18 мг
(N=1) 27 мг
(N=1) Подтип НХЛ ФЛ неизвестной степени Макроглобулинемия
Вальденстрема ФЛ степени 3b ФЛ неизвестной степени Объективный ответ (ПО/ЧО) 0 0 1 (100%) 0 Полный ответ 0 0 1 (100%) 0 Частичный ответ 0 0 0 0 Стабильное заболевание 1 (100%) 0 0 0 Прогрессирующее заболевание 0 0 0 0 Отсутствует/
невозможно оценить 0 1 (100%) 0 1 (100%)

[0206] В целом, активность широкого спектра, наблюдаемая у получавших интенсивное предшествующее лечение пациентов с рецидивирующей/рефрактерной B-НХЛ, которым проводили лечение с помощью REGN1979, включая некоторых пациентов с прогрессированием после предшествующей CAR Т-клеточной терапии, включала:

(i) ФЛ степени 1-3a: 12/13 (92,3%) ЧОО; 8/13 ПО (61,5%) при дозах ≥5 мг;

(ii) ДВККЛ: 4/6 (66,7%) ЧОО (все ПО) при дозах 80-160 мг, при этом у двух пациентов был достигнут ПО после неэффективной CAR Т-клеточной терапии, направленной на CD19;

(iii) МКЛ: 3/3 ответов при дозах ≥5 мг, включая один ПО;

(iv) ЛМЗ: 3/5 ответов при дозах ≥5 мг, включая два ПО;

(v) Переносимость у пациентов с B-НХЛ была продемонстрирована вплоть до доз величиной 320 мг в неделю, без каких-либо ДЛТ у пациентов с B-НХЛ;

(vi) Большинство нежелательных явлений характеризовалось степенью тяжести от легкой до умеренной;

(vii) Инфекции были зарегистрированы у 49,4% пациентов (14,8% 3-4 степени, с двумя летальными исходами (2,5%));

(viii) Ни один пациент не прекратил лечение из-за СВЦ или неврологических нежелательных явлений. Из 96 пациентов на начало исследования только у семи развился СВЦ 3 степени; и

(ix) Дексаметазон не подавлял цитотоксичность REGN1979, незначительно влиял на повышающую регуляцию активации Т-клеток и ингибировал высвобождение цитокинов.

Пример 2: Клиническая оценка биспецифичного антитела

[0207] Описанное ниже клиническое исследование представляет собой открытое многоцентровое исследование фазы 2 для оценки противоопухолевой активности и безопасности REGN1979, биспецифичного анти-CD20 x анти-CD3 антитела, у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной фолликулярной лимфомой.

[0208] Цели: основной целью этого исследования была оценка противоопухолевой активности REGN1979 в качестве монотерапии на основании частоты объективного ответа (ЧОО) в соответствии с классификацией Лугано ответа при злокачественной лимфоме (Cheson, 2014) с помощью независимой централизованной оценки у пациентов с фолликулярной лимфомой (ФЛ), рецидивировавшей после по меньшей мере двух предшествующих линий системной терапии, включая антитело к CD20 и алкилирующий агент, или рефрактерной к ним. Дополнительными целями в этом исследования были следующие: (1) оценить противоопухолевую активность REGN1979 в качестве монотерапии у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной ФЛ на основании (a) ЧОО в соответствии с классификацией Лугано (Cheson, 2014), по оценке местного исследователя, (b) частоты полного ответа (ПО) в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя, (c) выживаемости без прогрессирования (ВБП) в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя, (d) общей выживаемости (ОВ), (e) длительности ответа (ДО) в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя, (f) частоте контроля заболевания (ЧКЗ) в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя, (g) длительности контроля заболевания (ДКЗ) в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (2) оценить безопасность и переносимость REGN1979; (3) оценить фармакокинетику (ФК) REGN1979; (4) оценить иммуногенность REGN1979; и (5) оценить влияние REGN1979 на качество жизни, измеренное с помощью утвержденных средств: опросника для оценки качества жизни Европейской организации по исследованию и лечению рака (EORTC QLQ-C30) и Европейского опросника для оценки качества жизни по 5 показателям и 3 уровням (EQ-5D-3L).

[0209] Дизайн исследования: исследование состоит из периода скрининга продолжительностью до 28 дней, общего периода лечения продолжительностью до 98 недель, который включает 12 еженедельных (1р/нед) доз, с последующим введением доз один раз в 2 недели (1р/2нед) в течение до 86 недель, и периода последующего наблюдения продолжительностью 96 недель.

[0210] REGN1979 вводят в виде единственного агента внутривенно (в/в) в начальной (первичной) дозе 1 мг, затем следует промежуточная (вторичная) доза 20 мг, а затем - номинальная (третичная и максимальная недельная) доза 80 мг, по схеме дозирования из 12 введений 1р/нед с последующим дозированием 80 мг REGN1979 1р/2нед.

[0211] Набор проводится в соответствии с дизайном открытого несравнительного исследования.

[0212] Период скрининга начинается с подписания формы информированного согласия (ICF) и заканчивается при подтверждении соответствия пациента критериям включения в исследование и начале им лечения, или при установлении того, что пациент не соответствует критериям и был признан не прошедшим скрининг.

[0213] Период лечения начинается с первоначального введения REGN1979 и состоит из 12 инфузий REGN1979 1р/нед с последующим введением дозы 2р/нед в течение 86 недель, так что суммарный период лечения составляет 98 недель введения исследуемого препарата, если только пациент не прекратит лечение исследуемым препаратом из-за прогрессирования заболевания, начала последующей терапии лимфомы, нежелательного явления (НЯ) или любой другой причины.

[0214] Период последующего наблюдения будет составлять 96 недель после введения последней дозы исследуемого препарата. Каждые 12 недель будет осуществляться мониторинг всех пациентов для определения выживаемости до наступления смерти, утраты связи с пациентом, отзыва пациентом согласия на последующее наблюдение или прекращения исследования спонсором, в зависимости от того, что наступит раньше. Для пациентов, которые прекратили прием исследуемого препарата по любой причине, кроме прогрессирования заболевания, начала последующей терапии лимфомы или смерти, ответ заболевания будет оцениваться каждые 12 недель в течение периода последующего наблюдения до момента прогрессирования заболевания, смерти, начала последующей терапии лимфомы или отзыва пациентом согласия на последующее наблюдение, в зависимости от того, что наступит раньше.

[0215] Продолжительность исследования: Продолжительность исследования для каждого пациента, исключая период скрининга, будет составлять примерно 194 недели, если только пациент не продемонстрирует прогрессирования заболевания или не начнет последующую терапию, или до наступления смерти, утраты связи с пациентом, отзыва пациентом согласия на последующее наблюдение или прекращения исследования спонсором. Окончанием исследования считается последнее посещение последнего пациента.

[0216] Популяция, вошедшая в исследование: в исследование будет включено до 481 пациента во вплоть до 100 центрах. Вошедшая в исследование популяция будет состоять из пациентов в возрасте 18 лет и старше, ранее получавших лечение ФЛ степени от 1 до 3a, которая рецидивировала после по меньшей мере двух предшествующих линий системной терапии, включая антитело к CD20 и алкилирующий агент, или является рефрактерной к ним. Перед включением в исследование необходимо будет получить гистопатологическое подтверждение диагноза ФЛ с помощью централизованной оценки. Пациенты с ФЛ степени 3b не подходят для включения в исследование. Рефрактерное заболевание определено как отсутствие ответа на стандартную схему лечения или прогрессирование в пределах 6 месяцев после последнего лечения.

[0217] Критерии включения: каждый пациент должен соответствовать следующим критериям, чтобы иметь право на включение в исследование:

1. Возраст 18 лет и старше

2. Перед включением в исследование необходимо получить гистопатологическое подтверждение диагноза ФЛ степени от 1 до 3a с помощью централизованной оценки. Пациенты с ФЛ степени 3b не подходят для включения в исследование. Определение подтипов фолликулярной лимфомы основано на классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (Swerdlow, 2017).

3. Заболевание должно было рецидивировать или должно быть рефрактерным к ≥2 предшествующим линиям системной терапии, включая антитело к CD20 и алкилирующий агент. По мнению исследователя, пациенты должны нуждаться в терапии ФЛ на момент включения в исследование.

4. Измеримые проявления заболевания при кросс-секционной визуализации (определяется как по меньшей мере 1 измеримое в двух направлениях узловое поражение размером ≥1,5 см в наибольшем поперечном сечении (GTD), независимо от размера короткого сечения), подтвержденное с помощью диагностической визуализации (компьютерной томографии [КТ] или магнитной резонансной томографии [МРТ]).

5. Оценка функционального состояния по шкале Восточной объединенной группы онкологов, равная 0 или 1.

6. Приемлемая функция костного мозга, подтвержденная: (a) количеством тромбоцитов ≥50×10⁹/л. Чтобы соответствовать критерию приемлемости тромбоцитов, пациент не должен был получать переливание тромбоцитов в течение 7 дней до первой дозы REGN1979; (b) гемоглобином ≥9,0 г/дл; (c) абсолютным количеством нейтрофилов (АКН) ≥1,0×10⁹/л. Чтобы соответствовать критерию приемлемости АКН, пациент не должен был получать гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в течение 2 дней до первой дозы REGN1979.

7. Приемлемая функция печени: (a) общий билирубин ≤1,5 × верхней границы нормы (ULN) (≤3 × ULN, если это связано с лимфоидной инфильтрацией печени); (b) уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) ≤2,5 × ULN (≤5 × ULN, если это связано с лимфоидной инфильтрацией печени); (c) уровень щелочной фосфатазы (ЩФ) ≤2,5 × ULN (≤5 × ULN, если это связано с лимфоидной инфильтрацией печени); ПРИМЕЧАНИЯ: независимо от наличия лимфоидной инфильтрации лимфомы пациент с АСТ >2,5 × ULN и/или АЛТ >2,5 x ULN одновременно с общим билирубином >1,5 x ULN будет исключен, и пациенты с подтвержденным синдромом Жильбера могут не соответствовать этому требованию к общему билирубину при условии, что значение не изменилось по сравнению с исходным уровнем.

8. Сывороточный креатинин ≤1,5 × ULN, или расчетный клиренс креатинина по формуле Кокрофта-Голта ≥50 мл/мин; ПРИМЕЧАНИЕ: пациенты с расчетным клиренсом креатинина <50 мл/мин могут рассматриваться для включения в исследование, если измеренный клиренс креатинина (на основании суточной мочи или другого надежного метода) составляет ≥50 мл/мин.

9. Готовность пройти биопсию опухоли на исходном уровне. Если исследователь определил, что биопсия опухоли на исходном уровне не может быть проведена безопасно, спонсор может сделать исключение из требования о проведении биопсии только после обсуждения с медицинским наблюдателем и его одобрения.

10. Способность понимать цель и риски исследования и предоставить подписанное и датированное информированное согласие и разрешение на использование охраняемой медицинской информации (в соответствии с национальными и местными законами о конфиденциальности).

11. Желание и готовность соблюдать график посещений клиники и проходить процедуры, связанные с исследованием.

12. Предоставление информированного согласия, подписанного пациентом или законным представителем.

13. Способность понимать и заполнять опросники, связанные с исследованием.

[0218] Критерии исключения: пациент, который удовлетворяет любому из следующих критериев, будет исключен из исследования:

1. Первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС) или известное поражение ЦНС непервичной НХЛ ЦНС (при подозрении на лимфому ЦНС следует провести анализ люмбальной пункции согласно установленному порядку, помимо обязательной КТ или МРТ головы).

2. Лечение любой системной противолимфомной терапией в течение 5 периодов полувыведения или в течение 28 дней до первого введения исследуемого препарата, в зависимости от того, какой период короче.

3. История аллогенной трансплантации стволовых клеток.

4. Предшествующее лечение любой терапией Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T).

5. Непрерывное лечение системными кортикостероидами с введением более чем 10 мг преднизона или его противовоспалительного эквивалента в сутки в течение 72 часов до начала приема исследуемого препарата.

6. История нейродегенеративного заболевания или нарушения двигательной функции ЦНС. История неконтролируемого судорожного расстройства, определяемого как любой судорожный припадок в течение 12 месяцев до включения в исследование.

7. В течение 28 дней до первого введения исследуемого препарата вакцинация вектором, обладающим репликативным потенциалом.

8. Другое злокачественное новообразование помимо ФЛ за последние 5 лет, за исключением немеланомного рака кожи, который подвергся потенциально излечивающей терапии, или карциномы шейки матки in situ, или любой другой опухоли, которая была сочтена эффективно вылеченной радикальным локальным контролем и с целью излечения.

9. Свидетельства значительного сопутствующего заболевания или патологического состояния, которое может помешать проведению исследования или подвергнуть пациента значительному риску, включая, не ограничиваясь перечисленным, серьезные сердечно-сосудистые заболевания (например, сердечно-сосудистые заболевания класса III или IV согласно Нью-Йоркской кардиологической ассоциации, инфаркт миокарда за предыдущие 6 месяцев, нестабильные аритмии или нестабильная стенокардия) и/или серьезное заболевание легких (например, обструктивная болезнь легких и история симптоматического бронхоспазма).

10. Фракция выброса сердца <40% по данным эхокардиографии или радионуклидной вентрикулографии (MUGA).

11. Любая инфекция, требующая госпитализации или лечения внутривенными антиинфекционными препаратами в течение 2 недель до первого введения исследуемого препарата.

12. Неконтролируемая инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатита B или гепатита C; или другая неконтролируемая инфекция, за исключением следующего: (a) допускаются пациенты с ВИЧ, имеющие контролируемую инфекцию (не поддающаяся обнаружению вирусная нагрузка и количество CD4 выше 350 клеток/микролитр, либо самопроизвольно, либо на постоянной антивирусной схеме); (b) допускаются пациенты с гепатитом B (HepBsAg+), имеющие контролируемую инфекцию (уровень ДНК вируса гепатита B в сыворотке ниже предела обнаружения методом полимеразной цепной реакции [ПЦР], И ТАКЖЕ получение противовирусной терапии гепатита B); (c) допускаются пациенты с антителами к вирусу гепатита C (HCV Ab +), имеющие контролируемую инфекцию (РНК HCV, не поддающаяся обнаружению методом ПЦР, либо самопроизвольно, либо в ответ на успешный предшествующий курс терапии против HCV).

13. История тяжелой аллергической реакции, связанной с соединениями с химическим или биологическим составом, схожим с исследуемым препаратом или вспомогательным веществом. В этом контексте тяжелая аллергическая реакция определена как реакция, требующая госпитализации и/или лечения эпинефрином.

14. Известная гиперчувствительность к обоим из аллопуринола и расбуриказы.

15. Член исследовательской группы места проведения клинического исследования или его/ее ближайшие родственники, если только спонсор не дал предварительного разрешения.

16. Женщины с положительным результатом теста на беременность по β-ХГЧ в сыворотке на скрининговом визите. Если результат положительный, беременность должна быть исключена с помощью УЗИ, чтобы пациентка могла принять участие в исследовании.

17. Пациенты, помещенные в лечебное учреждение на основании постановления судебных или административных органов.

18. Беременные или кормящие женщины.

19. Женщины детородного возраста* или мужчины, которые не желают применять высокоэффективную контрацепцию до получения начальной дозы/начала первого лечения, во время исследования и в течение по меньшей мере 6 месяцев после последней дозы. Меры высокоэффективной контрацепции включают: (a) регулярное применение комбинированной (содержащей эстроген и прогестаген) гормональной контрацепции (оральной, интравагинальной, трансдермальной) или только прогестагенной гормональной контрацепции (оральной, инъекционной, имплантируемой), связанной с ингибированием овуляции, начинаемой за 2 или более менструальных циклов до скрининга; (b) внутриматочное средство (ВМС); внутриматочную гормонвысвобождающую систему (ВГС); (c) двустороннюю перевязку маточных труб; (d) проведенную вазэктомию партнера; (e) и/или половое воздержание^†, ^‡.

*Женщины в постменопаузе должны иметь аменорею в течение не менее чем 12 месяцев, чтобы считаться неспособными к деторождению. Тестирование на беременность и контрацепция не требуются женщинам с подтвержденной гистероэктомией или перевязкой маточных труб.

^† Половое воздержание считается высокоэффективным методом только в том случае, если оно определяется как воздержание от гетеросексуальных контактов в течение всего периода риска, связанного с исследуемыми препаратами. Надежность полового воздержания необходимо оценивать в зависимости от продолжительности клинического исследования и предпочтительного и обычного образа жизни субъекта.

^‡ Периодическое воздержание (календарный, симптотемпературный, постовуляционный методы), прерывание полового акта (прерываемый коитус), применение только спермицидов и метод лактационной аменореи (LAM) не являются приемлемыми методами контрацепции. Женский презерватив и мужской презерватив не должны использоваться вместе.

[0219] Лечение: REGN1979 будет вводиться путем в/в инфузии в начальной дозе 1 мг в течение недели 1, промежуточной дозе 20 мг на неделе 2 и номинальной дозе 80 мг или 160 мг во время последующих введений. Для начальной дозы, промежуточной дозы и первой номинальной дозы (первичной, вторичной и третичной доз, соответственно), лечение будет разделено на 2 отдельные инфузии, каждая в течение 4 часов в каждый из 2 дней, которые предпочтительно идут подряд, но с интервалом не более 3 дней (например, день 1 недели 1 и день 2 недели 1). Последующее лечение (максимальные еженедельные дозы; например, 320 мг) может вводиться в виде разовой инфузии или в виде 2 отдельных инфузий, и может вводиться в течение от 1 до 4 часов в зависимости от переносимости. Исследуемое лечение включает 12 введений 1р/нед с последующим дозированием 1р/2нед в течение 86 недель, так что суммарный период введения исследуемого препарата составляет 98 недель.

[0220] Конечные точки: первичной конечной точкой исследования является ЧОО от первой дозы до 194 недель после первой дозы в соответствии с классификацией Лугано ответа при злокачественной лимфоме (Cheson, 2014) и согласно независимой централизованной оценке, у пациентов с ФЛ, рецидивировавшей после по меньшей мере двух предшествующих линий системной терапии, включая антитело к CD20 и алкилирующий агент, или рефрактерной к ним. Вторичные конечные точки представляют собой следующие: (1) ЧОО в соответствии с классификацией Лугано по оценке местного исследователя от первой дозы до 194 недель после первой дозы; (2) частота ПО от первой дозы до 194 недель после первой дозы, в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (3) ВБП от первой дозы до 194 недель после первой дозы, в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (4) ОВ от первой дозы до 194 недель после первой дозы; (5) ДО от первой дозы до 194 недель после первой дозы, в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (6) ЧКЗ от первой дозы до 194 недель после первой дозы, в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (7) ДКЗ от первой дозы до 194 недель после первой дозы, в соответствии с классификацией Лугано, по независимой централизованной оценке и оценке местного исследователя; (8) частота развития и тяжесть нежелательных явлений, возникших в ходе лечения (НЯВЛ), от первой дозы до 194 недель после первой дозы; и (9) изменения оценок результатов пациентами, от первой дозы до 194 недель после первой дозы, измеренные с помощью утвержденных средств: EORTC QLQ-C30 и EQ-5D-3L.

[0221] Процедуры и оценки: для всех пациентов заболевание будет оцениваться радиологически с помощью компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ), и с помощью визуализации методом позитронно-эмиссионной томографии с введением ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (FDG-PET). Ответ опухоли в соответствии с критериями классификации Лугано будет рассмотрен независимой централизованной радиологической экспертизой. Будут взяты аспират костного мозга, биопсия костного мозга и биопсия лимфатического узла и/или опухоли, и образцы будут оценены гистологически и могут быть использованы для других исследований, в том числе для иммуногистохимии. Безопасность будет оцениваться путем оценки показателей жизненно важных функций, физикального обследования, оценки функционального состояния по шкале Восточной объединенной группы онкологов (ECOG), электрокардиограммы (ЭКГ), частоты НЯ и предоставления информации о сопутствующих лекарственных средствах. Лабораторные исследования включают общий анализ крови с подсчетом форменных элементов, биохимические показатели крови, сывороточные иммуноглобулины G (IgG), сывороточные тесты на беременность (если применимо), ферритин и С-реактивный белок (CРБ). Будут взяты образцы крови для оценки ФК и антител к лекарственному препарату (ADA). Будут взяты образцы периферической крови для оценки изменений в биомаркерах (например, продукции цитокинов, сывороточных уровнях провоспалительных цитокинов, а также изменений в субпопуляциях и статусе активации лимфоцитов). Кроме того, эти образцы позволят провести опухолевый или соматический генетический анализ вариаций, которые влияют на клиническое течение основного заболевания или модулируют побочные действия лечения. Оценка качества жизни будет проводиться с использованием опросников EORTC QLQ-C30 и EQ-5D-3L для самостоятельного заполнения.

[0222] План статистического анализа: данное исследование разработано для оценки эффективности и безопасности REGN1979 для пациентов с ФЛ, рецидивировавшей после по меньшей мере двух предшествующих линий системной терапии, или рефрактерной к ним. Анализ первичной конечной точки эффективности будет выполняться после того, как все пациенты завершили 28-недельный период исследуемого лечения до оценок и прошли оценку ответов опухоли, или выбыли из исследования. Обоснование размера выборки: одностадийный точный биномиальный дизайн принят для первичной конечной точки ЧОО. Двусторонние 95% доверительные интервалы для наблюдаемых ЧОО были рассчитаны на основе размера выборки 100. Для 100 пациентов, если наблюдаемая ЧОО составляет по меньшей мере 60%, 66%, 70% и 75%, нижний предел 95% ДИ будет исключать ЧОО величиной 49%, 55%, 60% и 65%, соответственно; т.е. ЧОО значимо отличается от 49%, 55%, 60% и 65%, как показано ниже в таблице 10.

Таблица 10. Двусторонние 95% точные доверительные интервалы для наблюдаемой ЧОО при размере выборки в 100 пациентов

Количество ответивших Наблюдаемая ЧОО 95% ДИ - нижний 95% ДИ - верхний 60 0,60 0,497 0,697 66 0,66 0,558 0,752 70 0,70 0,6002 0,788 75 0,75 0,653 0,831

При размере выборки в 100 пациентов, если истинный эффект лечения REGN1979 составляет 64%, 70%, 75% или 80%, вероятность того, что наблюдаемая нижняя граница 95% ДИ будет исключать 49%, 55%, 60% или 65%, составляет соответственно 82%, 83%, 89% или 91%. Размер выборки будет дополнительно увеличен на 10% для учета пациентов, преждевременно выбывших из исследования. Таким образом, общий размер выборки составит 112 пациентов.

[0223] Статистические методы: характеристики популяции пациентов и характеристики исходного уровня будут обобщены с помощью описательной статистики. Первичной конечной точкой эффективности является ЧОО в соответствии с классификацией Лугано на основе независимой централизованной оценки. Будут обобщены ЧОО вместе с двусторонним 95% доверительным интервалом. Пациенты, не подлежащие оценке наилучшего общего ответа, будут считаться не отвечающими на лечение. Вторичные конечные точки эффективности ЧОО, определенные по оценке исследователя в соответствии с классификацией Лугано, а также частота ПО и ЧКЗ по оценке местного исследователя и независимой централизованной оценке в соответствии с классификацией Лугано, будут обобщены вместе с двусторонним 95% доверительным интервалом. Другие вторичные конечные точки эффективности, включая ДО, ДКЗ, ВБП и ОВ, будут суммированы с помощью медианы и ее 95% доверительного интервала с использованием метода Каплана-Мейера в соответствии с классификацией Лугано. Частота контроля заболевания будет обобщена вместе с двусторонним доверительным интервалом. Качество жизни, измеренное с помощью утвержденных средств: EORTC QLQ-C30 и EQ-5D-3L, будет обобщено с помощью описательной статистики. Наблюдения и меры безопасности, включая воздействие лекарственного препарата, НЯ, лабораторные данные, показатели жизненно важных функций и оценку функционального состояния по шкале ECOG, будут обобщены и представлены в таблицах и списках.

[0224] Промежуточный анализ: промежуточный анализ будет проведен после того, как первые 50 пациентов завершат оценку опухоли через 28 недель или выбудут из исследования раньше. Будут обобщены ЧОО и соответствующий 95% доверительный интервал. Поскольку основной целью этого промежуточного анализа является точечная оценка ЧОО и характеристика точности точечной оценки, с этим промежуточным анализом не проводится проверка гипотез. Таким образом, коррекция ошибок I типа неприменима для этого запланированного промежуточного анализа. Для других конечных точек эффективности также будет представлен двусторонний 95% доверительный интервал.

[0225] В настоящее исследование или в дополнительные исследования могут быть включены дополнительные исследования эффективности REGN1979, в том числе у (a) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a) в качестве терапии третьей или более (3L+) линии, (b) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), подходящих для полнодозовой химиотерапии, в качестве терапии второй или более (2L+) линии, (c) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), не подходящих для полнодозовой химиотерапии, в качестве терапии 2L+, (d) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), ранее не получавших лечения и подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, (e) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), ранее не получавших лечения и не подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, (f) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии первой линии (1L) вместо стандартного лечения, (g) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), не подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии 1L вместо стандартного лечения, (h) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии 2L+ вместо стандартного лечения, (i) пациентов с фолликулярной лимфомой (степени 1-3a), не подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии 2L+ вместо стандартного лечения, и/или (j) пациентов с фолликулярной лимфомой в комбинации со стандартным лечением.

[0226] В настоящее исследование или в дополнительные исследования могут быть включены дополнительные исследования эффективности REGN1979, в том числе у (a) пациентов с диффузной B-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ), первичной или трансформированной, в качестве терапии 3L+, (b) пациентов с ДВККЛ после неэффективной CAR-T терапии, (c) пациентов с ДВККЛ, подходящих для аутологичной ТГСК (трансплантации гемопоэтических стволовых клеток), в качестве терапии 2L+, (d) пациентов с ДВККЛ, не подходящих для ТГСК, в качестве терапии 2L+, (e) пациентов с ДВККЛ, ранее не получавших лечения, с плохими молекулярными прогностическими факторами (B-клетки вне зародышевого центра, «двойной удар» или «тройной удар») и подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, (f) пациентов с ДВККЛ, ранее не получавших лечения, с плохими молекулярными прогностическими факторами (B-клетки вне зародышевого центра, «двойной удар» или «тройной удар») и не подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, (g) пациентов с ДВККЛ, ранее не получавших терапию с использованием CAR-T, (h) пациентов с ДВККЛ при максимальной еженедельной дозе 320 мг, (i) пациентов с ДВККЛ в комбинации со стандартным лечением, (j) пациентов с ДВККЛ для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии 1L вместо стандартного лечения, (k) пациентов с ДВККЛ, не подходящих для полнодозовой химиоиммунотерапии, в качестве терапии 1L вместо стандартного лечения, (l) пациентов с ДВККЛ, подходящих для ауто-ТГСК, в качестве терапии 2L+ вместо стандартного лечения, и/или (m) пациентов с ДВККЛ, не подходящих для ауто-ТГСК, в качестве терапии 2L+ вместо стандартного лечения.

[0227] В настоящее исследование или в дополнительные исследования могут быть включены дополнительные исследования эффективности REGN1979, в том числе у (a) пациентов с мантийноклеточной лимфомой (МКЛ) после неэффективности лечения ингибитором BTK, в качестве терапии 2L+, (b) у пациентов с лимфомой маргинальной зоны (ЛМЗ), в качестве терапии 2L+, и/или (c) у пациентов с лимфобластной лимфомой, лимфоплазмоцитарной лимфомой, лимфомой Беркитта или другими подтипами B-НХЛ, в качестве терапии 2L+.

[0228] В настоящее исследование или в дополнительные исследования могут быть включены дополнительные исследования эффективности REGN1979, в том числе у (a) пациентов с CD20+ B-клеточным злокачественным новообразованием, получивших разовую дозу ритуксимаба за день до первой дозы REGN1979. Только в этой когорте подготовительной дозы ритуксимаба и расширенной когорте будет вводиться разовая доза ритуксимаба (375 мг/м²) за день до первой дозы REGN1979 [т.е. в (-1) день исследования]. REGN1979 будет начат в день 1 недели 1, и период лечения REGN1979 составит 9 месяцев. Пациенты получат до 24 доз REGN1979: 4 еженедельные дозы в течение 4-недельного индукционного периода, затем дополнительные 8 еженедельных доз и 12 доз, вводимых 1р/2нед, в течение 6-месячного поддерживающего периода. В первой части этой когорты подготовительной дозы ритуксимаба REGN1979 будет вводиться с повышающей дозой 80 мг. После определения оптимальной схемы дозирования одна дополнительная дозовая группа из 6 пациентов при повышающей дозе 320 мг REGN1979 будет оценена при оптимальной схеме дозирования. Также могут быть оценены дозовые группы с повышающими дозами REGN1979 от 80 до 320 мг. Затем еще 24 пациента будут оценены при этой оптимальной схеме дозирования и оптимальной дозе, и вместе с 6 пациентами из группы подготовительной дозы ритуксимаба, получавшими лечение оптимальной дозой, в общей сложности 30 пациентов будет исследовано на предмет безопасности и переносимости.

[0229] В любом из комбинированных исследований со стандартным лечением комбинация может включать REGN1979 плюс CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон), ICE (ифосфамид, карбоплатин и этопозид), Gem-Ox (гемцитабин и оксалиплатин), леналидомид, или леналидомид плюс ритуксимаб.

[0230] Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе будут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Подразумевается, что такие модификации охватываются прилагаемой формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> Стратегия дозирования, уменьшающая синдром высвобождения цитокинов

для биспецифичных антител к CD3/C20

<130> 10496WO01

<150> 62/726,137

<151> 2018-08-31

<150> 62/774,019

<151> 2018-11-30

<150> 62/861,100

<151> 2019-06-13

<160> 24

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 207

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок CD3 эпсилон (>NP_000724.1 предшественник

эпсилон-цепи Т-клеточного поверхностного гликопротеина CD3

<400> 1

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 2

<211> 171

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок CD3 дельта (>NP_000723.1

предшественник изоформы A дельта-цепи

Т-клеточного поверхностного гликопротеина CD3

<400> 2

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg

130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr

145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170

<210> 3

<211> 164

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок CD3 дзета (>NP_932170.1

предшественник изоформы 1 дзета-цепи

Т-клеточного поверхностного гликопротеина CD3

<400> 3

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 4

<211> 182

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок CD3 гамма (>NP_000064.1 предшественник

гамма-цепи Т-клеточного поверхностного гликопротеина CD3

<400> 4

Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys

20 25 30

Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp

65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro

85 90 95

Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala

100 105 110

Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val

115 120 125

Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

130 135 140

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

165 170 175

Asn Gln Leu Arg Arg Asn

180

<210> 5

<211> 297

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок CD20

<400> 5

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 6

<211> 184

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок BCMA (TNFRSF17) NP_001183.2

<400> 6

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile

65 70 75 80

Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 7

<211> 750

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок PSMA (FOLH1)

<400> 7

Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe

20 25 30

Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu

35 40 45

Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu

50 55 60

Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile

65 70 75 80

Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile

85 90 95

Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His

100 105 110

Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile

115 120 125

Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe

130 135 140

Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro

145 150 155 160

Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr

165 170 175

Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met

180 185 190

Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val

195 200 205

Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly

210 215 220

Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly

245 250 255

Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr

260 265 270

Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly

275 280 285

Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys

290 295 300

Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg

305 310 315 320

Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn

325 330 335

Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val

340 345 350

Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro

355 360 365

Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly

370 375 380

Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg

385 390 395 400

Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile

405 410 415

Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr

420 425 430

Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala

435 440 445

Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val

450 455 460

Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu

465 470 475 480

Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser

485 490 495

Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile

500 505 510

Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn

530 535 540

Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu

545 550 555 560

Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val

565 570 575

Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val

580 585 590

Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala

595 600 605

Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr

610 615 620

Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr

625 630 635 640

Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser

645 650 655

Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu

660 665 670

Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg

675 680 685

His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser

690 695 700

Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp

705 710 715 720

Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala

725 730 735

Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

740 745 750

<210> 8

<211> 14507

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий белок MUC16 (CA-125)

<400> 8

Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser

1 5 10 15

Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser

20 25 30

Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile

35 40 45

Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly

65 70 75 80

Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His

85 90 95

Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr

100 105 110

Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser

115 120 125

Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala

130 135 140

Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu

145 150 155 160

Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr

165 170 175

Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro

180 185 190

Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val

195 200 205

Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly

210 215 220

Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu

225 230 235 240

Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu

245 250 255

Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser

260 265 270

Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala

275 280 285

Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln

290 295 300

Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser

305 310 315 320

Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala

325 330 335

Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr

340 345 350

Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His

355 360 365

Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr

370 375 380

Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser

385 390 395 400

Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu

405 410 415

Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr

420 425 430

Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu

435 440 445

Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu

450 455 460

Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr

465 470 475 480

Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser

485 490 495

Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser

500 505 510

Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe

515 520 525

Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys

530 535 540

Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr

545 550 555 560

Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser

565 570 575

Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly

580 585 590

Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly

595 600 605

Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr

610 615 620

His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu

625 630 635 640

Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser

645 650 655

Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr

660 665 670

Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser

675 680 685

Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg

690 695 700

His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile

705 710 715 720

Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys

725 730 735

Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile

740 745 750

Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala

755 760 765

Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg

770 775 780

Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu

785 790 795 800

Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr

805 810 815

Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser

820 825 830

Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr

835 840 845

Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu

850 855 860

Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser

865 870 875 880

Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro

885 890 895

Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser

900 905 910

Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val

915 920 925

Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly

930 935 940

Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala

945 950 955 960

Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr

965 970 975

Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu

980 985 990

Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ser

995 1000 1005

Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Leu Thr

1010 1015 1020

Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala Ser Thr

1025 1030 1035

Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu Asp

1040 1045 1050

Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser

1055 1060 1065

Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser

1070 1075 1080

Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg

1085 1090 1095

Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu

1100 1105 1110

Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala

1115 1120 1125

Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro

1130 1135 1140

Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro

1145 1150 1155

Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr

1160 1165 1170

Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser

1175 1180 1185

Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro

1190 1195 1200

Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val

1205 1210 1215

Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu

1220 1225 1230

Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr

1235 1240 1245

Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser

1250 1255 1260

Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr

1265 1270 1275

Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser

1280 1285 1290

Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr

1295 1300 1305

Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr

1310 1315 1320

Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val

1325 1330 1335

Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His

1340 1345 1350

Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro

1355 1360 1365

Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala

1370 1375 1380

Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr

1385 1390 1395

Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala

1400 1405 1410

Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly

1415 1420 1425

Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu

1430 1435 1440

Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala

1445 1450 1455

Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp

1460 1465 1470

Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile

1475 1480 1485

Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu

1490 1495 1500

Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp

1505 1510 1515

Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr

1520 1525 1530

Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile

1535 1540 1545

Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser

1550 1555 1560

Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro

1565 1570 1575

Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu

1580 1585 1590

Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys

1595 1600 1605

Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr

1610 1615 1620

Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser

1625 1630 1635

Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly

1640 1645 1650

Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg

1655 1660 1665

Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu

1670 1675 1680

Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly

1685 1690 1695

Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr

1700 1705 1710

Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn

1715 1720 1725

Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser

1730 1735 1740

Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro

1745 1750 1755

Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val

1760 1765 1770

Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr

1775 1780 1785

Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr

1790 1795 1800

Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu

1805 1810 1815

Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu

1820 1825 1830

Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser

1835 1840 1845

His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg

1850 1855 1860

Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly

1865 1870 1875

Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His

1880 1885 1890

Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile

1895 1900 1905

His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu

1910 1915 1920

Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe

1925 1930 1935

Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser

1940 1945 1950

Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr

1955 1960 1965

Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser

1970 1975 1980

Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln

1985 1990 1995

Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser

2000 2005 2010

Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser

2015 2020 2025

Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser

2030 2035 2040

Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser

2045 2050 2055

Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu

2060 2065 2070

Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr

2075 2080 2085

Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln

2090 2095 2100

Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala

2105 2110 2115

Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu

2120 2125 2130

Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met

2135 2140 2145

Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser

2150 2155 2160

Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys

2165 2170 2175

Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser

2180 2185 2190

Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly

2195 2200 2205

Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser

2210 2215 2220

Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp

2225 2230 2235

Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser

2240 2245 2250

Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu

2255 2260 2265

Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu

2270 2275 2280

Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser

2285 2290 2295

Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu

2300 2305 2310

Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro

2315 2320 2325

Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu

2330 2335 2340

Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg

2345 2350 2355

Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu

2360 2365 2370

Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr

2375 2380 2385

Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser

2390 2395 2400

Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser

2405 2410 2415

Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn

2420 2425 2430

Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser

2435 2440 2445

Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser

2450 2455 2460

Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met

2465 2470 2475

Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn

2480 2485 2490

Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val

2495 2500 2505

Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser

2510 2515 2520

Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro

2525 2530 2535

Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly

2540 2545 2550

Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser

2555 2560 2565

Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser

2570 2575 2580

Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val

2585 2590 2595

Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val

2600 2605 2610

Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys

2615 2620 2625

Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu

2630 2635 2640

Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr

2645 2650 2655

Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile

2660 2665 2670

Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met

2675 2680 2685

Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser

2690 2695 2700

Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr

2705 2710 2715

Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val

2720 2725 2730

Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu

2735 2740 2745

Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln

2750 2755 2760

Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala

2765 2770 2775

Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln

2780 2785 2790

Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser

2795 2800 2805

Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro

2810 2815 2820

Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr

2825 2830 2835

Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr

2840 2845 2850

Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser

2855 2860 2865

Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp

2870 2875 2880

Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro

2885 2890 2895

Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser

2900 2905 2910

Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser

2915 2920 2925

Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr

2930 2935 2940

Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe

2945 2950 2955

Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His

2960 2965 2970

Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala

2975 2980 2985

Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala

2990 2995 3000

Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser

3005 3010 3015

Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser

3020 3025 3030

Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser

3035 3040 3045

Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg

3050 3055 3060

Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu

3065 3070 3075

Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu

3080 3085 3090

Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala

3095 3100 3105

Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser

3110 3115 3120

Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys

3125 3130 3135

Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys

3140 3145 3150

Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile

3155 3160 3165

Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala

3170 3175 3180

Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly

3185 3190 3195

Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu

3200 3205 3210

Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro

3215 3220 3225

Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu

3230 3235 3240

Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser

3245 3250 3255

Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro

3260 3265 3270

Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser

3275 3280 3285

Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly

3290 3295 3300

Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser

3305 3310 3315

Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro

3320 3325 3330

Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His

3335 3340 3345

Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser

3350 3355 3360

Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser

3365 3370 3375

Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp

3380 3385 3390

Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile

3395 3400 3405

Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr

3410 3415 3420

Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile

3425 3430 3435

Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr

3440 3445 3450

Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp

3455 3460 3465

Gln Gly Ile Thr Ser Leu Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Thr Ser

3470 3475 3480

Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu

3485 3490 3495

Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala

3500 3505 3510

Gly His Leu Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ala Glu Val Ser Ile Leu

3515 3520 3525

Asp Val Thr Thr Ala Pro Thr Pro Gly Ile Ser Thr Thr Ile Thr

3530 3535 3540

Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu

3545 3550 3555

Val Gly Met Ser Thr Met Asp Ser Thr Pro Ala Thr Glu Arg Arg

3560 3565 3570

Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala

3575 3580 3585

Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val

3590 3595 3600

Ala Arg Ser Pro Gly Thr Ile Ser Thr Met His Thr Thr Ser Phe

3605 3610 3615

Leu Ala Ser Ser Thr Glu Leu Asp Ser Met Ser Thr Pro His Gly

3620 3625 3630

Arg Ile Thr Val Ile Gly Thr Ser Leu Val Thr Pro Ser Ser Asp

3635 3640 3645

Ala Ser Ala Val Lys Thr Glu Thr Ser Thr Ser Glu Arg Thr Leu

3650 3655 3660

Ser Pro Ser Asp Thr Thr Ala Ser Thr Pro Ile Ser Thr Phe Ser

3665 3670 3675

Arg Val Gln Arg Met Ser Ile Ser Val Pro Asp Ile Leu Ser Thr

3680 3685 3690

Ser Trp Thr Pro Ser Ser Thr Glu Ala Glu Asp Val Pro Val Ser

3695 3700 3705

Met Val Ser Thr Asp His Ala Ser Thr Lys Thr Asp Pro Asn Thr

3710 3715 3720

Pro Leu Ser Thr Phe Leu Phe Asp Ser Leu Ser Thr Leu Asp Trp

3725 3730 3735

Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Ser Ala Thr Ala Thr Thr Ser Ala

3740 3745 3750

Pro Gln Gly Ala Thr Thr Pro Gln Glu Leu Thr Leu Glu Thr Met

3755 3760 3765

Ile Ser Pro Ala Thr Ser Gln Leu Pro Phe Ser Ile Gly His Ile

3770 3775 3780

Thr Ser Ala Val Thr Pro Ala Ala Met Ala Arg Ser Ser Gly Val

3785 3790 3795

Thr Phe Ser Arg Pro Asp Pro Thr Ser Lys Lys Ala Glu Gln Thr

3800 3805 3810

Ser Thr Gln Leu Pro Thr Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln Val

3815 3820 3825

Pro Arg Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Val Ile Pro His Thr Ala

3830 3835 3840

Lys Thr Pro Asp Ala Thr Phe Gln Arg Gln Gly Gln Thr Ala Leu

3845 3850 3855

Thr Thr Glu Ala Arg Ala Thr Ser Asp Ser Trp Asn Glu Lys Glu

3860 3865 3870

Lys Ser Thr Pro Ser Ala Pro Trp Ile Thr Glu Met Met Asn Ser

3875 3880 3885

Val Ser Glu Asp Thr Ile Lys Glu Val Thr Ser Ser Ser Ser Val

3890 3895 3900

Leu Arg Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu Glu Ser Gly Thr

3905 3910 3915

Thr Ser Ser Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Tyr Glu Arg Ile Ala

3920 3925 3930

Pro Ser Glu Ser Thr Thr Asp Lys Glu Ala Ile His Pro Ser Thr

3935 3940 3945

Asn Thr Val Glu Thr Thr Gly Trp Val Thr Ser Ser Glu His Ala

3950 3955 3960

Ser His Ser Thr Ile Pro Ala His Ser Ala Ser Ser Lys Leu Thr

3965 3970 3975

Ser Pro Val Val Thr Thr Ser Thr Arg Glu Gln Ala Ile Val Ser

3980 3985 3990

Met Ser Thr Thr Thr Trp Pro Glu Ser Thr Arg Ala Arg Thr Glu

3995 4000 4005

Pro Asn Ser Phe Leu Thr Ile Glu Leu Arg Asp Val Ser Pro Tyr

4010 4015 4020

Met Asp Thr Ser Ser Thr Thr Gln Thr Ser Ile Ile Ser Ser Pro

4025 4030 4035

Gly Ser Thr Ala Ile Thr Lys Gly Pro Arg Thr Glu Ile Thr Ser

4040 4045 4050

Ser Lys Arg Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Gln Ser Met Arg Ser

4055 4060 4065

Ser Asp Ser Pro Ser Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Asn Phe Pro

4070 4075 4080

Ala Met Thr Glu Ser Gly Gly Met Ile Leu Ala Met Gln Thr Ser

4085 4090 4095

Pro Pro Gly Ala Thr Ser Leu Ser Ala Pro Thr Leu Asp Thr Ser

4100 4105 4110

Ala Thr Ala Ser Trp Thr Gly Thr Pro Leu Ala Thr Thr Gln Arg

4115 4120 4125

Phe Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe Ser Lys Gly Pro Glu

4130 4135 4140

Asp Thr Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser

4145 4150 4155

Ser Ser Ser Leu Val Pro Ile His Ala Thr Thr Ser Pro Ser Asn

4160 4165 4170

Ile Leu Leu Thr Ser Gln Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Pro Pro

4175 4180 4185

Val Thr Ser Val Phe Leu Ser Glu Thr Ser Gly Leu Gly Lys Thr

4190 4195 4200

Thr Asp Met Ser Arg Ile Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ser Leu Pro

4205 4210 4215

Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ala Gly Glu Ala Leu Ser Thr Tyr Glu

4220 4225 4230

Ala Ser Arg Asp Thr Lys Ala Ile His His Ser Ala Asp Thr Ala

4235 4240 4245

Val Thr Asn Met Glu Ala Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Pro Ile Pro

4250 4255 4260

Gly His Thr Lys Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Leu Val Thr Ser

4265 4270 4275

His Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser

4280 4285 4290

Ser Glu Thr Thr Glu Ile Glu Thr Val Ser Ser Val Asn Gln Gly

4295 4300 4305

Leu Gln Glu Arg Ser Thr Ser Gln Val Ala Ser Ser Ala Thr Glu

4310 4315 4320

Thr Ser Thr Val Ile Thr His Val Ser Ser Gly Asp Ala Thr Thr

4325 4330 4335

His Val Thr Lys Thr Gln Ala Thr Phe Ser Ser Gly Thr Ser Ile

4340 4345 4350

Ser Ser Pro His Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe Thr Asp

4355 4360 4365

Val Ser Thr Asn Pro Ser Thr Ser Leu Ile Met Thr Glu Ser Ser

4370 4375 4380

Gly Val Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro Thr Gly Ala Ala Thr

4385 4390 4395

Gln Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Met Pro Tyr Leu Thr

4400 4405 4410

Glu Thr Pro Leu Ala Val Thr Pro Asp Phe Met Gln Ser Glu Lys

4415 4420 4425

Thr Thr Leu Ile Ser Lys Gly Pro Lys Asp Val Ser Trp Thr Ser

4430 4435 4440

Pro Pro Ser Val Ala Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Pro

4445 4450 4455

Phe Leu Val Thr Thr Ile Pro Pro Ala Thr Ser Thr Leu Gln Gly

4460 4465 4470

Gln His Thr Ser Ser Pro Val Ser Ala Thr Ser Val Leu Thr Ser

4475 4480 4485

Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Asn Thr Ser Met Glu Pro

4490 4495 4500

Val Thr Asn Ser Pro Gln Asn Leu Asn Asn Pro Ser Asn Glu Ile

4505 4510 4515

Leu Ala Thr Leu Ala Ala Thr Thr Asp Ile Glu Thr Ile His Pro

4520 4525 4530

Ser Ile Asn Lys Ala Val Thr Asn Met Gly Thr Ala Ser Ser Ala

4535 4540 4545

His Val Leu His Ser Thr Leu Pro Val Ser Ser Glu Pro Ser Thr

4550 4555 4560

Ala Thr Ser Pro Met Val Pro Ala Ser Ser Met Gly Asp Ala Leu

4565 4570 4575

Ala Ser Ile Ser Ile Pro Gly Ser Glu Thr Thr Asp Ile Glu Gly

4580 4585 4590

Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Arg Lys Glu Asn Ser Thr

4595 4600 4605

Leu Gln Glu Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser Asn Ile Ile Leu Ser

4610 4615 4620

Asn Val Ser Val Gly Ala Ile Thr Glu Ala Thr Lys Met Glu Val

4625 4630 4635

Pro Ser Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Thr Pro Ala Gln Ser Thr

4640 4645 4650

Lys Phe Pro Asp Ile Phe Ser Val Ala Ser Ser Arg Leu Ser Asn

4655 4660 4665

Ser Pro Pro Met Thr Ile Ser Thr His Met Thr Thr Thr Gln Thr

4670 4675 4680

Gly Ser Ser Gly Ala Thr Ser Lys Ile Pro Leu Ala Leu Asp Thr

4685 4690 4695

Ser Thr Leu Glu Thr Ser Ala Gly Thr Pro Ser Val Val Thr Glu

4700 4705 4710

Gly Phe Ala His Ser Lys Ile Thr Thr Ala Met Asn Asn Asp Val

4715 4720 4725

Lys Asp Val Ser Gln Thr Asn Pro Pro Phe Gln Asp Glu Ala Ser

4730 4735 4740

Ser Pro Ser Ser Gln Ala Pro Val Leu Val Thr Thr Leu Pro Ser

4745 4750 4755

Ser Val Ala Phe Thr Pro Gln Trp His Ser Thr Ser Ser Pro Val

4760 4765 4770

Ser Met Ser Ser Val Leu Thr Ser Ser Leu Val Lys Thr Ala Gly

4775 4780 4785

Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gln Ser

4790 4795 4800

Met Ser Asn Thr Leu Asp Asp Ile Ser Val Thr Ser Ala Ala Thr

4805 4810 4815

Thr Asp Ile Glu Thr Thr His Pro Ser Ile Asn Thr Val Val Thr

4820 4825 4830

Asn Val Gly Thr Thr Gly Ser Ala Phe Glu Ser His Ser Thr Val

4835 4840 4845

Ser Ala Tyr Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Asn Val Thr

4850 4855 4860

Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ser Ile Pro Lys

4865 4870 4875

Ser Ser Lys Thr Thr Arg Thr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Ser Leu

4880 4885 4890

Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Glu Ile Thr Ser

4895 4900 4905

Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val Pro Tyr Lys Glu Leu Thr Gly Ala

4910 4915 4920

Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Asp Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr

4925 4930 4935

Ser Phe Pro Gly Pro Asp Gln Ser Thr Val Ser Leu Asp Ile Ser

4940 4945 4950

Thr Glu Thr Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu

4955 4960 4965

Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Pro His Gly Ala

4970 4975 4980

Thr Ser Gln Asp Thr Phe Thr Met Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro

4985 4990 4995

Gln Ala Gly Ile His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln Leu

5000 5005 5010

Asp Val Thr Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Gln Asp Val Ser Trp

5015 5020 5025

Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe

5030 5035 5040

Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr

5045 5050 5055

Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ser Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr

5060 5065 5070

Ser Gly Leu Val Lys Ile Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Leu Glu

5075 5080 5085

Pro Val Thr Ser Ser Leu Pro Asn Phe Ser Ser Thr Ser Asp Lys

5090 5095 5100

Ile Leu Ala Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asp Thr Lys Glu Ile Phe

5105 5110 5115

Pro Ser Ile Asn Thr Glu Glu Thr Asn Val Lys Ala Asn Asn Ser

5120 5125 5130

Gly His Glu Ser His Ser Pro Ala Leu Ala Asp Ser Glu Thr Pro

5135 5140 5145

Lys Ala Thr Thr Gln Met Val Ile Thr Thr Thr Val Gly Asp Pro

5150 5155 5160

Ala Pro Ser Thr Ser Met Pro Val His Gly Ser Ser Glu Thr Thr

5165 5170 5175

Asn Ile Lys Arg Glu Pro Thr Tyr Phe Leu Thr Pro Arg Leu Arg

5180 5185 5190

Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ser Ser Phe Pro Thr Asp Thr Ser

5195 5200 5205

Phe Leu Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Thr Ile Thr Glu Val Ser

5210 5215 5220

Ser Thr Gly Val Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Thr Pro Asp His

5225 5230 5235

Asp Lys Ser Thr Val Pro Pro Asp Thr Phe Thr Gly Glu Ile Pro

5240 5245 5250

Arg Val Phe Thr Ser Ser Ile Lys Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr

5255 5260 5265

Ile Thr Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Ser Ala Ser His Ser Thr

5270 5275 5280

Leu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Thr Leu Ser Gln Gly Gly Thr His

5285 5290 5295

Ser Thr Val Thr Gln Gly Phe Pro Tyr Ser Glu Val Thr Thr Leu

5300 5305 5310

Met Gly Met Gly Pro Gly Asn Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro

5315 5320 5325

Val Glu Glu Thr Ser Ser Val Ser Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala

5330 5335 5340

Met Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Gln Ser Ile

5345 5350 5355

Pro Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ala Leu Pro Thr Ser Val Leu

5360 5365 5370

Val Thr Thr Thr Asp Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Ser Val

5375 5380 5385

Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Ile Thr His Glu Arg Pro

5390 5395 5400

Ala Thr Tyr Lys Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Ala Met His His

5405 5410 5415

Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Ser Gly Ser Gly

5420 5425 5430

His Lys Ser Gln Ser Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Ser Lys

5435 5440 5445

Ala Thr Pro Leu Met Ser Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asp Thr Ser

5450 5455 5460

Val Ser Thr Ser Thr Pro Asn Ile Ser Gln Thr Asn Gln Ile Gln

5465 5470 5475

Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser

5480 5485 5490

Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe

5495 5500 5505

Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu

5510 5515 5520

Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr

5525 5530 5535

Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr

5540 5545 5550

Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln

5555 5560 5565

Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp

5570 5575 5580

Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser

5585 5590 5595

Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr

5600 5605 5610

Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr

5615 5620 5625

Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser

5630 5635 5640

Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu

5645 5650 5655

Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn

5660 5665 5670

Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro

5675 5680 5685

Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp

5690 5695 5700

Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr

5705 5710 5715

Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln

5720 5725 5730

Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro

5735 5740 5745

Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser

5750 5755 5760

Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser

5765 5770 5775

Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile

5780 5785 5790

Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr

5795 5800 5805

Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser

5810 5815 5820

Arg Thr Thr Ile Ser Gly Pro Asp His Ser Lys Met Ser Pro Tyr

5825 5830 5835

Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val

5840 5845 5850

Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile

5855 5860 5865

Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr

5870 5875 5880

Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro

5885 5890 5895

His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val

5900 5905 5910

Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser

5915 5920 5925

Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr

5930 5935 5940

Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr

5945 5950 5955

Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp

5960 5965 5970

Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser

5975 5980 5985

Phe Ser Gly Glu Ile Leu Thr Ser Glu Ala Ser Thr Asn Thr Glu

5990 5995 6000

Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr

6005 6010 6015

Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser

6020 6025 6030

Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met

6035 6040 6045

Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr

6050 6055 6060

Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu

6065 6070 6075

Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser

6080 6085 6090

Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val

6095 6100 6105

Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala

6110 6115 6120

Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser

6125 6130 6135

Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys

6140 6145 6150

Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly

6155 6160 6165

Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Ala Thr Ser Ala Gly Thr

6170 6175 6180

Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser

6185 6190 6195

Val Met Asn Asn Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Thr Ser Pro Phe

6200 6205 6210

Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu

6215 6220 6225

Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His

6230 6235 6240

Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr

6245 6250 6255

Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr

6260 6265 6270

Arg Ser Pro Gln Asn Leu Arg Asn Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ala

6275 6280 6285

Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val

6290 6295 6300

Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr

6305 6310 6315

Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val

6320 6325 6330

Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro

6335 6340 6345

Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser

6350 6355 6360

Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly

6365 6370 6375

Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala

6380 6385 6390

Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg

6395 6400 6405

Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr

6410 6415 6420

Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr

6425 6430 6435

Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg

6440 6445 6450

Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr

6455 6460 6465

Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln

6470 6475 6480

Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser

6485 6490 6495

Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser

6500 6505 6510

Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr

6515 6520 6525

Thr Leu Pro Glu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Val His Leu Thr Ser

6530 6535 6540

Leu Pro Thr Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Ala Ser

6545 6550 6555

Val Ala Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gly Ser Thr Ser His Lys Ile

6560 6565 6570

Pro Thr Thr Ser Glu Asp Ile Lys Asp Thr Glu Lys Met Tyr Pro

6575 6580 6585

Ser Thr Asn Ile Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Thr Ser Glu

6590 6595 6600

Lys Glu Ser Tyr Ser Ser Val Pro Ala Tyr Ser Glu Pro Pro Lys

6605 6610 6615

Val Thr Ser Pro Met Val Thr Ser Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ile

6620 6625 6630

Val Ser Thr Ser Met Pro Gly Ser Ser Glu Ile Thr Arg Ile Glu

6635 6640 6645

Met Glu Ser Thr Phe Ser Leu Ala His Gly Leu Lys Gly Thr Ser

6650 6655 6660

Thr Ser Gln Asp Pro Ile Val Ser Thr Glu Lys Ser Ala Val Leu

6665 6670 6675

His Lys Leu Thr Thr Gly Ala Thr Glu Thr Ser Arg Thr Glu Val

6680 6685 6690

Ala Ser Ser Arg Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Asp His Ser Thr

6695 6700 6705

Glu Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Pro Ser Leu Pro Ile

6710 6715 6720

Ser Leu Gly Ile Thr Glu Ser Ser Asn Met Thr Ile Ile Thr Arg

6725 6730 6735

Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu

6740 6745 6750

Asp Thr Pro Thr Thr Ser Ser Arg Ala Gly Thr His Ser Met Ala

6755 6760 6765

Thr Gln Glu Phe Pro His Ser Glu Met Thr Thr Val Met Asn Lys

6770 6775 6780

Asp Pro Glu Ile Leu Ser Trp Thr Ile Pro Pro Ser Ile Glu Lys

6785 6790 6795

Thr Ser Phe Ser Ser Ser Leu Met Pro Ser Pro Ala Met Thr Ser

6800 6805 6810

Pro Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Ile His Thr Thr Pro

6815 6820 6825

Ser Pro Met Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser Leu Val Met Thr Thr

6830 6835 6840

Asp Thr Leu Gly Thr Ser Pro Glu Pro Thr Thr Ser Ser Pro Pro

6845 6850 6855

Asn Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Ile Leu Thr Thr Asp Glu Asp

6860 6865 6870

Thr Thr Ala Ile Glu Ala Met His Pro Ser Thr Ser Thr Ala Ala

6875 6880 6885

Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser

6890 6895 6900

Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp

6905 6910 6915

Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser

6920 6925 6930

Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser

6935 6940 6945

Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser

6950 6955 6960

Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly

6965 6970 6975

Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg

6980 6985 6990

Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile

6995 7000 7005

Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr

7010 7015 7020

Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly

7025 7030 7035

Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys

7040 7045 7050

Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His

7055 7060 7065

Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser

7070 7075 7080

Trp Gln Ser Ser Pro Ser Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Pro Ser

7085 7090 7095

Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser

7100 7105 7110

Thr Leu Pro Val Thr Ile Ser Ser Ser Pro Leu Pro Val Thr Ser

7115 7120 7125

Leu Leu Thr Ser Ser Pro Val Thr Thr Thr Asp Met Leu His Thr

7130 7135 7140

Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr

7145 7150 7155

Ser Asp Glu Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asp Thr Thr Asn Thr Glu

7160 7165 7170

Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ile

7175 7180 7185

Pro Ser Ser Gly His Glu Ser Pro Ser Ser Ala Leu Ala Asp Ser

7190 7195 7200

Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro Met Phe Ile Thr Ser Thr Gln

7205 7210 7215

Glu Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr Pro His Phe Leu Glu Thr

7220 7225 7230

Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu

7235 7240 7245

Arg Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Ser Ser Ala Ile Glu Thr

7250 7255 7260

Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile

7265 7270 7275

Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Gly

7280 7285 7290

Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys

7295 7300 7305

Ile Ile Lys Phe Pro Thr Ser Pro Ile Leu Ala Glu Ser Ser Glu

7310 7315 7320

Met Thr Ile Lys Thr Gln Thr Ser Pro Pro Gly Ser Thr Ser Glu

7325 7330 7335

Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile

7340 7345 7350

Thr His Ser Thr Met Thr Gln Arg Leu Pro His Ser Glu Ile Thr

7355 7360 7365

Thr Leu Val Ser Arg Gly Ala Gly Asp Val Pro Arg Pro Ser Ser

7370 7375 7380

Leu Pro Val Glu Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Gln Leu Ser Leu

7385 7390 7395

Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala

7400 7405 7410

Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro

7415 7420 7425

Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro

7430 7435 7440

Glu Thr Ser Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile

7445 7450 7455

Leu Ala Thr Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro

7460 7465 7470

Phe Ser Asn Thr Ala Val Thr Lys Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly

7475 7480 7485

His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Pro Asp Ser Glu Thr Thr Lys

7490 7495 7500

Ala Thr Ser Ala Met Gly Thr Ile Ser Ile Met Gly Asp Thr Ser

7505 7510 7515

Val Ser Thr Leu Thr Pro Ala Leu Ser Asn Thr Arg Lys Ile Gln

7520 7525 7530

Ser Glu Pro Ala Ser Ser Leu Thr Thr Arg Leu Arg Glu Thr Ser

7535 7540 7545

Thr Ser Glu Glu Thr Ser Leu Ala Thr Glu Ala Asn Thr Val Leu

7550 7555 7560

Ser Lys Val Ser Thr Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu

7565 7570 7575

Ala Ile Ser Phe Ser Arg Thr Ser Met Ser Gly Pro Glu Gln Ser

7580 7585 7590

Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser

7595 7600 7605

Ala Ser Ser Val Leu Thr Glu Ser Ala Lys Met Thr Ile Thr Thr

7610 7615 7620

Gln Thr Gly Pro Ser Glu Ser Thr Leu Glu Ser Thr Leu Asn Leu

7625 7630 7635

Asn Thr Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val

7640 7645 7650

Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg

7655 7660 7665

Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu

7670 7675 7680

Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser

7685 7690 7695

Pro His Pro Val Ser Thr Thr Phe Leu Ala His Ile Pro Pro Ser

7700 7705 7710

Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr

7715 7720 7725

Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser

7730 7735 7740

Ser Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys

7745 7750 7755

Asp Thr Ala His Thr Glu Ala Val His Pro Ser Thr Asn Thr Gly

7760 7765 7770

Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser

7775 7780 7785

Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met

7790 7795 7800

Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr

7805 7810 7815

Arg Arg Ile Gln Thr Glu Leu Ala Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu

7820 7825 7830

Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met

7835 7840 7845

Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile

7850 7855 7860

Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr

7865 7870 7875

Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr

7880 7885 7890

Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His

7895 7900 7905

Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp

7910 7915 7920

Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser

7925 7930 7935

Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly

7940 7945 7950

Pro Glu Asp Val Ser Trp Met Ser Pro Pro Leu Leu Glu Lys Thr

7955 7960 7965

Arg Pro Ser Phe Ser Leu Met Ser Ser Pro Ala Thr Thr Ser Pro

7970 7975 7980

Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro

7985 7990 7995

Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ala Lys Thr Thr

8000 8005 8010

Asp Met Leu His Lys Ser Ser Glu Pro Val Thr Asn Ser Pro Ala

8015 8020 8025

Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Val

8030 8035 8040

Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val

8045 8050 8055

Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe

8060 8065 8070

Val Leu Ala Asp Ser Gln Thr Ser Lys Val Thr Ser Pro Met Val

8075 8080 8085

Ile Thr Ser Thr Met Glu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser Thr Pro

8090 8095 8100

Gly Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gln Thr Glu Pro Thr Ser Ser

8105 8110 8115

Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser

8120 8125 8130

Leu Ala Thr Glu Met Ser Thr Val Leu Ser Gly Val Pro Thr Gly

8135 8140 8145

Ala Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Ser Arg

8150 8155 8160

Thr Ser Ile Ser Gly Phe Ala Gln Leu Thr Val Ser Pro Glu Thr

8165 8170 8175

Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Pro Thr Ser Ser Ile Met Thr

8180 8185 8190

Glu Ser Ala Glu Met Met Ile Lys Thr Gln Thr Asp Pro Pro Gly

8195 8200 8205

Ser Thr Pro Glu Ser Thr His Thr Val Asp Ile Ser Thr Thr Pro

8210 8215 8220

Asn Trp Val Glu Thr His Ser Thr Val Thr Gln Arg Phe Ser His

8225 8230 8235

Ser Glu Met Thr Thr Leu Val Ser Arg Ser Pro Gly Asp Met Leu

8240 8245 8250

Trp Pro Ser Gln Ser Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser

8255 8260 8265

Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser

8270 8275 8280

Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser

8285 8290 8295

Leu Leu Asn Pro Gly Leu Val Ile Thr Thr Asp Arg Met Gly Ile

8300 8305 8310

Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Ser Thr

8315 8320 8325

Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr Val Asp Thr Glu

8330 8335 8340

Asp Met Gln Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr Asn Val Arg Thr

8345 8350 8355

Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln Ser Ser Val Leu Ser Asp Ser

8360 8365 8370

Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr Thr Tyr Thr Met

8375 8380 8385

Gly Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Ser Asp Phe Phe Glu Thr

8390 8395 8400

Ser Arg Ile Gln Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu

8405 8410 8415

Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser Ala Thr Glu Gly

8420 8425 8430

Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Thr Glu Val

8435 8440 8445

Ser Arg Thr Glu Val Ile Ser Ser Arg Gly Thr Ser Met Ser Gly

8450 8455 8460

Pro Asp Gln Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Glu Ala Ile

8465 8470 8475

Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ser

8480 8485 8490

Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Glu Gly

8495 8500 8505

Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr

8510 8515 8520

His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr

8525 8530 8535

Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Pro Ser Leu Pro

8540 8545 8550

Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Val Ser Ser Ser Leu Ser Ser Pro

8555 8560 8565

Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile

8570 8575 8580

Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro

8585 8590 8595

Val Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr

8600 8605 8610

Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala

8615 8620 8625

Thr Ser Glu Val Thr Lys Asp Arg Glu Lys Ile His Pro Ser Ser

8630 8635 8640

Asn Thr Pro Val Val Asn Val Gly Thr Val Ile Tyr Lys His Leu

8645 8650 8655

Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala Asp Leu Val Thr Thr Lys Pro Thr

8660 8665 8670

Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn Thr Ser Val Ser

8675 8680 8685

Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met Thr Gln Pro Thr

8690 8695 8700

Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu

8705 8710 8715

Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu Ser Gly Met Pro

8720 8725 8730

Thr Gly Ala Thr Thr Lys Val Ser Arg Thr Glu Ala Leu Ser Leu

8735 8740 8745

Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Ile Ser Pro

8750 8755 8760

Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr

8765 8770 8775

Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr Ile Thr Pro Lys Thr Gly His

8780 8785 8790

Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ser

8795 8800 8805

Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala Thr His Arg Ser

8810 8815 8820

Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp

8825 8830 8835

Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys Thr Ser Pro Pro

8840 8845 8850

Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu

8855 8860 8865

Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser Pro Leu Arg Val

8870 8875 8880

Thr Ser Leu Phe Thr Pro Val Met Met Lys Thr Thr Asp Met Leu

8885 8890 8895

Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro Pro Ser Met Asn

8900 8905 8910

Ile Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys Ala Thr Met Glu

8915 8920 8925

Thr Glu Ala Ile Gln Leu Ser Glu Asn Thr Ala Val Thr Gln Met

8930 8935 8940

Gly Thr Ile Ser Ala Arg Gln Glu Phe Tyr Ser Ser Tyr Pro Gly

8945 8950 8955

Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val Val Thr Ser Ser

8960 8965 8970

Thr Ile Lys Asp Ile Val Ser Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ser Glu

8975 8980 8985

Ile Thr Arg Ile Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Thr

8990 8995 9000

Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Glu Ile His Ser Ala Thr Lys

9005 9010 9015

Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser Ala Thr Ile Glu

9020 9025 9030

Asp Ser Met Thr Gln Val Met Ser Ser Ser Arg Gly Pro Ser Pro

9035 9040 9045

Asp Gln Ser Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Thr Glu Val Ile Thr

9050 9055 9060

Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr

9065 9070 9075

Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr

9080 9085 9090

Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser

9095 9100 9105

Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met

9110 9115 9120

Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val

9125 9130 9135

Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met

9140 9145 9150

Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His

9155 9160 9165

Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val

9170 9175 9180

Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser

9185 9190 9195

Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile

9200 9205 9210

Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val

9215 9220 9225

Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala

9230 9235 9240

Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr

9245 9250 9255

Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser

9260 9265 9270

Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro

9275 9280 9285

Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr

9290 9295 9300

Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr

9305 9310 9315

Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile

9320 9325 9330

Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu

9335 9340 9345

Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr

9350 9355 9360

Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser

9365 9370 9375

Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro

9380 9385 9390

Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gln Arg Phe Pro Gln Ser Val Val

9395 9400 9405

Thr Thr Pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser

9410 9415 9420

Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser

9425 9430 9435

Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser

9440 9445 9450

Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr

9455 9460 9465

Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu

9470 9475 9480

Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile Thr Ser Asp Glu

9485 9490 9495

Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His

9500 9505 9510

Val Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Val Glu Thr Thr Ser Ala

9515 9520 9525

Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe Ser Glu Pro Thr

9530 9535 9540

Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn

9545 9550 9555

Met Val Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly Ile Thr Arg Ile

9560 9565 9570

Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr

9575 9580 9585

Arg Thr Ser Gln Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu Thr Ser Thr Val

9590 9595 9600

Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu Val Ser Arg Thr

9605 9610 9615

Glu Val Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln

9620 9625 9630

Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Arg Leu

9635 9640 9645

Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Ile Thr

9650 9655 9660

Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Val Thr Leu Pro

9665 9670 9675

Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr His Ser Thr Met

9680 9685 9690

Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg

9695 9700 9705

Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg Phe Val Glu Thr

9710 9715 9720

Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Leu Thr Thr Ser

9725 9730 9735

Leu Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Leu Asp Ser Ser Pro Ser Ser

9740 9745 9750

Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Lys Thr

9755 9760 9765

Thr Glu Val Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Thr Ser Ser Ser

9770 9775 9780

Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Val Glu Ile Pro Ala Thr Ser Glu

9785 9790 9795

Ile Met Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro Ser Ser Asn Thr Ala

9800 9805 9810

Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser

9815 9820 9825

Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met

9830 9835 9840

Gly Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn

9845 9850 9855

Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe

9860 9865 9870

Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr Ser Glu Glu Thr

9875 9880 9885

Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Val Leu Tyr Gly Val Pro Thr

9890 9895 9900

Ser Ala Thr Thr Glu Val Ser Met Thr Glu Ile Met Ser Ser Asn

9905 9910 9915

Arg Ile His Ile Pro Asp Ser Asp Gln Ser Thr Met Ser Pro Asp

9920 9925 9930

Ile Ile Thr Glu Val Ile Thr Arg Leu Ser Ser Ser Ser Met Met

9935 9940 9945

Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro

9950 9955 9960

Gly Ala Thr Ala Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ala Thr Thr Thr Ala

9965 9970 9975

Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His

9980 9985 9990

Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser

9995 10000 10005

Trp Lys Ser Ser Leu Phe Val Glu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser

10010 10015 10020

Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr

10025 10030 10035

Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu

10040 10045 10050

Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro

10055 10060 10065

Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr Ser Val Glu Ile

10070 10075 10080

Leu Ala Ala Ser Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Ile His Pro

10085 10090 10095

Ser Ser Ser Met Ala Val Thr Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Gly

10100 10105 10110

His Glu Leu Tyr Ser Ser Val Ser Ile His Ser Glu Pro Ser Lys

10115 10120 10125

Ala Thr Tyr Pro Val Gly Thr Pro Ser Ser Met Ala Glu Thr Ser

10130 10135 10140

Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr Thr Gly Phe Glu

10145 10150 10155

Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Phe Arg Lys Thr Asn

10160 10165 10170

Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Val Thr Pro Thr Asn Thr Pro Ser

10175 10180 10185

Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gln Ser Ser Lys Thr Asp Phe

10190 10195 10200

Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp Pro Pro Ala Ser

10205 10210 10215

Gln Tyr Thr Glu Ile Pro Val Asp Ile Ile Thr Pro Phe Asn Ala

10220 10225 10230

Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu

10235 10240 10245

Ser Arg Phe Thr Met Ser Val Thr Glu Ser Thr His His Leu Ser

10250 10255 10260

Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gly Thr Val

10265 10270 10275

Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe Ala Thr Thr Gly

10280 10285 10290

Val Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro Phe Ser Arg Thr

10295 10300 10305

Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr Ile Ala Glu Ser

10310 10315 10320

Leu Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ser Thr Phe Thr

10325 10330 10335

Thr Thr Asp Ser Ser Thr Ile Pro Ala Leu His Glu Ile Thr Ser

10340 10345 10350

Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser Leu Gly Thr Glu

10355 10360 10365

Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val Ser Thr Leu Asp

10370 10375 10380

Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Asp

10385 10390 10395

Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr Val Thr Ser Ala

10400 10405 10410

Tyr Gln Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr Arg Thr Asp Gly

10415 10420 10425

Ile Met Glu His Ile Thr Lys Ile Pro Asn Glu Ala Ala His Arg

10430 10435 10440

Gly Thr Ile Arg Pro Val Lys Gly Pro Gln Thr Ser Thr Ser Pro

10445 10450 10455

Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr Lys Arg Met Glu

10460 10465 10470

Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr

10475 10480 10485

Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr Thr Pro Thr Leu

10490 10495 10500

Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gln Met Ala Ser Thr

10505 10510 10515

Ile Pro Thr Glu Met Met Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Pro Asp

10520 10525 10530

Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu

10535 10540 10545

Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg

10550 10555 10560

Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu

10565 10570 10575

Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro

10580 10585 10590

Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val Ile His Pro Ala Glu Thr Ile Pro

10595 10600 10605

Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp

10610 10615 10620

Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala Asp Val Ser Ser

10625 10630 10635

Ala Ile Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu Asp Ala Leu Thr

10640 10645 10650

Pro Leu Val Thr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro

10655 10660 10665

Thr Leu Thr Lys Ser Pro His Glu Thr Glu Thr Arg Thr Thr Trp

10670 10675 10680

Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile Pro Arg Thr Ile

10685 10690 10695

Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr Pro Ser Ile Ala

10700 10705 10710

Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile Pro Ile Met Thr

10715 10720 10725

Val Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Val Thr Ser Gln Val Thr Ser

10730 10735 10740

Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser

10745 10750 10755

Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Val Thr His Pro Glu

10760 10765 10770

Ala Gln Thr Ser Ser Ala Ile Pro Thr Ser Thr Ile Ser Pro Ala

10775 10780 10785

Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys

10790 10795 10800

Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser Pro Gly Glu Pro

10805 10810 10815

Ala Thr Thr Val Ser Leu Val Thr His Pro Ala Gln Thr Ser Pro

10820 10825 10830

Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp

10835 10840 10845

Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala Glu Ser Ser Ser

10850 10855 10860

Ala Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Thr Glu Val Pro Gly Val Val

10865 10870 10875

Thr Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Ile Ser Thr Thr Ile

10880 10885 10890

Pro Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser

10895 10900 10905

Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ile Pro Thr

10910 10915 10920

Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val

10925 10930 10935

Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr

10940 10945 10950

Phe Ser Leu Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser

10955 10960 10965

His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr Val Leu Pro Glu

10970 10975 10980

Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val

10985 10990 10995

Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro

11000 11005 11010

Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser

11015 11020 11025

Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro Gly Val Val Thr

11030 11035 11040

Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser Thr Ser Ile Pro

11045 11050 11055

Thr Leu Ile Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr Thr Pro Ser Met

11060 11065 11070

Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala Val Pro Thr Pro

11075 11080 11085

Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr Pro Leu Val Thr

11090 11095 11100

Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu

11105 11110 11115

Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His

11120 11125 11130

Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val

11135 11140 11145

Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr

11150 11155 11160

Ser Thr Thr Ile Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Asp Glu Pro Glu

11165 11170 11175

Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala Lys Met Ile Ser

11180 11185 11190

Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val

11195 11200 11205

Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser

11210 11215 11220

Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr Ile Asp Ser Trp

11225 11230 11235

Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu

11240 11245 11250

Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn Ile Ser Leu Val Thr

11255 11260 11265

His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg

11270 11275 11280

Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser

11285 11290 11295

Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro

11300 11305 11310

Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg

11315 11320 11325

Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu

11330 11335 11340

Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser

11345 11350 11355

Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro

11360 11365 11370

Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr

11375 11380 11385

Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met

11390 11395 11400

Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr

11405 11410 11415

Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr

11420 11425 11430

Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro

11435 11440 11445

Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu

11450 11455 11460

Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu

11465 11470 11475

Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile

11480 11485 11490

His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys

11495 11500 11505

Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr

11510 11515 11520

Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile

11525 11530 11535

Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser

11540 11545 11550

Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro

11555 11560 11565

Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu

11570 11575 11580

Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg

11585 11590 11595

Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp

11600 11605 11610

Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro

11615 11620 11625

Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser

11630 11635 11640

Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr

11645 11650 11655

Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr

11660 11665 11670

Val Pro Ile Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro Asp Thr Met Ala

11675 11680 11685

Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gln Thr Ser Thr Pro Val Ser Arg

11690 11695 11700

Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val

11705 11710 11715

Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr

11720 11725 11730

Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr Ser Gln Ile Thr

11735 11740 11745

Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His

11750 11755 11760

Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu Ser Thr His Pro

11765 11770 11775

Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser Thr Val Phe Pro

11780 11785 11790

Gln Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Ala

11795 11800 11805

Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Phe

11810 11815 11820

Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Pro Thr

11825 11830 11835

Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro Leu Ser Thr His

11840 11845 11850

Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Ser Thr Leu Ser

11855 11860 11865

Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser

11870 11875 11880

Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr Val Ser Pro Ala

11885 11890 11895

Val Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr Asp Lys Pro Gln

11900 11905 11910

Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser

11915 11920 11925

Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met

11930 11935 11940

Thr Leu Ile Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro Lys Thr Ser His

11945 11950 11955

Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val

11960 11965 11970

Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser Pro Thr Val Ala

11975 11980 11985

Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr

11990 11995 12000

Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val

12005 12010 12015

Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr

12020 12025 12030

Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro

12035 12040 12045

Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro

12050 12055 12060

Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu

12065 12070 12075

Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His

12080 12085 12090

Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly

12095 12100 12105

Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr

12110 12115 12120

Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser

12125 12130 12135

Ala Thr Ala Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Glu

12140 12145 12150

Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn

12155 12160 12165

Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg

12170 12175 12180

Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro

12185 12190 12195

Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser

12200 12205 12210

Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu

12215 12220 12225

Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr

12230 12235 12240

Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met

12245 12250 12255

Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr

12260 12265 12270

Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg

12275 12280 12285

Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr

12290 12295 12300

His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu

12305 12310 12315

Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly

12320 12325 12330

Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr

12335 12340 12345

His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr

12350 12355 12360

Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro

12365 12370 12375

Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn

12380 12385 12390

Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Asp Met Gly His Pro

12395 12400 12405

Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu

12410 12415 12420

Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser

12425 12430 12435

Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala

12440 12445 12450

Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser

12455 12460 12465

Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu

12470 12475 12480

Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn

12485 12490 12495

Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr

12500 12505 12510

Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly

12515 12520 12525

Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu

12530 12535 12540

Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu

12545 12550 12555

Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu

12560 12565 12570

Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser

12575 12580 12585

Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser

12590 12595 12600

Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His

12605 12610 12615

Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr

12620 12625 12630

Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro

12635 12640 12645

Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His

12650 12655 12660

Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val

12665 12670 12675

Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr

12680 12685 12690

Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr

12695 12700 12705

Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys

12710 12715 12720

Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met

12725 12730 12735

Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu

12740 12745 12750

Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp

12755 12760 12765

Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp

12770 12775 12780

Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile

12785 12790 12795

Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val

12800 12805 12810

Asn Gly Phe Thr His Gln Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ser Thr Pro

12815 12820 12825

Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser

12830 12835 12840

Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr

12845 12850 12855

Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His

12860 12865 12870

His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln

12875 12880 12885

Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu

12890 12895 12900

Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly

12905 12910 12915

Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Ile Cys Ser His Arg Leu Asp Pro

12920 12925 12930

Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser

12935 12940 12945

Gln Leu Thr His Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp

12950 12955 12960

Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val

12965 12970 12975

Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr

12980 12985 12990

Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Val Pro

12995 13000 13005

Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln

13010 13015 13020

Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr

13025 13030 13035

Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro Leu Phe Lys Asn

13040 13045 13050

Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ile Ser Leu

13055 13060 13065

Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys

13070 13075 13080

Thr His His Leu Asn Pro Gln Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln

13085 13090 13095

Leu Tyr Trp Gln Leu Ser Gln Met Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu

13100 13105 13110

Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe

13115 13120 13125

Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr Ser Thr Pro Trp Thr Ser

13130 13135 13140

Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Pro Val Pro Ser

13145 13150 13155

Pro Thr Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe

13160 13165 13170

Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asn Met Gly His Pro Gly

13175 13180 13185

Ser Arg Lys Phe Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu

13190 13195 13200

Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly

13205 13210 13215

Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr

13220 13225 13230

Arg Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ile Pro

13235 13240 13245

Gly Leu Asp Arg Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr

13250 13255 13260

His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser

13265 13270 13275

Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr

13280 13285 13290

Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gln Pro Glu Thr Ser Glu Thr

13295 13300 13305

Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala Thr Gly Pro Val Leu Leu

13310 13315 13320

Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu

13325 13330 13335

Asp Met Arg Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg

13340 13345 13350

Val Leu Gln Gly Leu Leu Met Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val

13355 13360 13365

Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu

13370 13375 13380

Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp Ala Val Cys Thr His Arg

13385 13390 13395

Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp

13400 13405 13410

Lys Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr

13415 13420 13425

Thr Leu Asp Arg His Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln

13430 13435 13440

Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro Asp Thr Ser Thr Met His

13445 13450 13455

Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser Leu Ser Gly Pro Met Thr

13460 13465 13470

Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr Ile Thr

13475 13480 13485

Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg Lys

13490 13495 13500

Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val

13505 13510 13515

Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu

13520 13525 13530

Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp

13535 13540 13545

Ala Ile Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp

13550 13555 13560

Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile

13565 13570 13575

Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val

13580 13585 13590

Asn Gly Phe Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro

13595 13600 13605

Gly Thr Pro Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser

13610 13615 13620

Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr

13625 13630 13635

Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Gln

13640 13645 13650

His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln

13655 13660 13665

Gly Leu Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu

13670 13675 13680

Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly

13685 13690 13695

Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His His Pro Asp Pro

13700 13705 13710

Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser

13715 13720 13725

Gln Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ala Leu Asp

13730 13735 13740

Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val

13745 13750 13755

Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Pro Thr Val Tyr Leu Gly Ala

13760 13765 13770

Ser Lys Thr Pro Ala Ser Ile Phe Gly Pro Ser Ala Ala Ser His

13775 13780 13785

Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg

13790 13795 13800

Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr

13805 13810 13815

Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr

13820 13825 13830

Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg

13835 13840 13845

Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr

13850 13855 13860

His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu

13865 13870 13875

Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly

13880 13885 13890

Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr

13895 13900 13905

His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu

13910 13915 13920

Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met

13925 13930 13935

Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp

13940 13945 13950

Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser

13955 13960 13965

Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser

13970 13975 13980

Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr

13985 13990 13995

Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe

14000 14005 14010

His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro

14015 14020 14025

Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu

14030 14035 14040

Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr

14045 14050 14055

Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His

14060 14065 14070

Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr

14075 14080 14085

Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu

14090 14095 14100

Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser

14105 14110 14115

Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro

14120 14125 14130

Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr

14135 14140 14145

His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr

14150 14155 14160

Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe

14165 14170 14175

Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro

14180 14185 14190

Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile

14195 14200 14205

Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr

14210 14215 14220

Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr

14225 14230 14235

Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr

14240 14245 14250

Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val Thr Val Lys Ala Leu Phe

14255 14260 14265

Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp

14270 14275 14280

Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln

14285 14290 14295

Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln

14300 14305 14310

Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr

14315 14320 14325

Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr

14330 14335 14340

Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn

14345 14350 14355

Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys

14360 14365 14370

Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Arg His His Thr Gly

14375 14380 14385

Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp

14390 14395 14400

Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly

14405 14410 14415

Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val

14420 14425 14430

Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser

14435 14440 14445

Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu

14450 14455 14460

Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr

14465 14470 14475

Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys

14480 14485 14490

Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln

14495 14500 14505

<210> 9

<211> 490

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<220>

<223> человеческий белок STEAP2 (STAMP1)

<400> 9

Met Glu Ser Ile Ser Met Met Gly Ser Pro Lys Ser Leu Ser Glu Thr

1 5 10 15

Phe Leu Pro Asn Gly Ile Asn Gly Ile Lys Asp Ala Arg Lys Val Thr

20 25 30

Val Gly Val Ile Gly Ser Gly Asp Phe Ala Lys Ser Leu Thr Ile Arg

35 40 45

Leu Ile Arg Cys Gly Tyr His Val Val Ile Gly Ser Arg Asn Pro Lys

50 55 60

Phe Ala Ser Glu Phe Phe Pro His Val Val Asp Val Thr His His Glu

65 70 75 80

Asp Ala Leu Thr Lys Thr Asn Ile Ile Phe Val Ala Ile His Arg Glu

85 90 95

His Tyr Thr Ser Leu Trp Asp Leu Arg His Leu Leu Val Gly Lys Ile

100 105 110

Leu Ile Asp Val Ser Asn Asn Met Arg Ile Asn Gln Tyr Pro Glu Ser

115 120 125

Asn Ala Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Pro Asp Ser Leu Ile Val Lys

130 135 140

Gly Phe Asn Val Val Ser Ala Trp Ala Leu Gln Leu Gly Pro Lys Asp

145 150 155 160

Ala Ser Arg Gln Val Tyr Ile Cys Ser Asn Asn Ile Gln Ala Arg Gln

165 170 175

Gln Val Ile Glu Leu Ala Arg Gln Leu Asn Phe Ile Pro Ile Asp Leu

180 185 190

Gly Ser Leu Ser Ser Ala Arg Glu Ile Glu Asn Leu Pro Leu Arg Leu

195 200 205

Phe Thr Leu Trp Arg Gly Pro Val Val Val Ala Ile Ser Leu Ala Thr

210 215 220

Phe Phe Phe Leu Tyr Ser Phe Val Arg Asp Val Ile His Pro Tyr Ala

225 230 235 240

Arg Asn Gln Gln Ser Asp Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Glu Ile Val Asn

245 250 255

Lys Thr Leu Pro Ile Val Ala Ile Thr Leu Leu Ser Leu Val Tyr Leu

260 265 270

Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ala Tyr Gln Leu Tyr Tyr Gly Thr Lys Tyr

275 280 285

Arg Arg Phe Pro Pro Trp Leu Glu Thr Trp Leu Gln Cys Arg Lys Gln

290 295 300

Leu Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Met Val His Val Ala Tyr Ser

305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Met Arg Arg Ser Glu Arg Tyr Leu Phe Leu Asn Met

325 330 335

Ala Tyr Gln Gln Val His Ala Asn Ile Glu Asn Ser Trp Asn Glu Glu

340 345 350

Glu Val Trp Arg Ile Glu Met Tyr Ile Ser Phe Gly Ile Met Ser Leu

355 360 365

Gly Leu Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asn

370 375 380

Ala Leu Asn Trp Arg Glu Phe Ser Phe Ile Gln Ser Thr Leu Gly Tyr

385 390 395 400

Val Ala Leu Leu Ile Ser Thr Phe His Val Leu Ile Tyr Gly Trp Lys

405 410 415

Arg Ala Phe Glu Glu Glu Tyr Tyr Arg Phe Tyr Thr Pro Pro Asn Phe

420 425 430

Val Leu Ala Leu Val Leu Pro Ser Ile Val Ile Leu Gly Lys Ile Ile

435 440 445

Leu Phe Leu Pro Cys Ile Ser Arg Lys Leu Lys Arg Ile Lys Lys Gly

450 455 460

Trp Glu Lys Ser Gln Phe Leu Glu Glu Gly Met Gly Gly Thr Ile Pro

465 470 475 480

His Val Ser Pro Glu Arg Val Thr Val Met

485 490

<210> 10

<211> 453

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь REGN1979 к CD20

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220

Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

225 230 235 240

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 11

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь REGN1979 к CD3

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn Ser Gly Tyr Gly His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 12

<211> 214

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Общая легкая цепь REGN1979

<400> 12

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 127

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR REGN1979 к CD20

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 14

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR REGN1979 к CD3

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asn Ser Gly Tyr Gly His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser

115 120

<210> 15

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Общая LCVR REGN1979

<400> 15

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 16

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR1 REGN1979 к CD20

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR2 REGN1979 к CD20

<400> 17

Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ser Ile

1 5

<210> 18

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR3 REGN1979 к CD20

<400> 18

Ala Lys Asp Asn His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 19

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR1 REGN1979 к CD3

<400> 19

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR2 REGN1979 к CD3

<400> 20

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

1 5

<210> 21

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCDR3 REGN1979 к CD3

<400> 21

Ala Lys Asp Asn Ser Gly Tyr Gly His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 22

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Общая LCDR1 REGN1979

<400> 22

Gln Ser Val Ser Ser Asn

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Общая LCDR2 REGN1979

<400> 23

Gly Ala Ser

1

<210> 24

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Общая LCDR3 REGN1979

<400> 24

Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для снижения частоты развития или тяжести синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции при лечении CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы (варианты) и способ лечения CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы у субъекта. Изобретение расширяет арсенал способов лечения CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы. 3 н. и 81 з.п. ф-лы, 1 ил., 10 табл., 2 пр.

1. Способ введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для снижения частоты развития или тяжести синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции при лечении CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы, включающий:

введение частей первичной дозы (D1) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 10 мг указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной первичной дозы, и ее вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D1;

введение частей вторичной дозы (D2) указанного терапевтического белка на неделе 2 схемы дозирования, где указанная вторичная доза является более высокой, чем первичная доза, и составляет не более половины максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, и F2D2 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D2 на неделе 2 схемы дозирования; и

введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

2. Способ по п. 1, где F2D1 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D1.

3. Способ по п. 1, где F2D1 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D1.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где F2D2 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D2.

5. Способ по любому из пп. 1-3, где F2D2 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D2.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная последующая неделя является неделей 3 схемы дозирования.

7. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная последующая неделя является неделей 4 схемы дозирования.

8. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная последующая неделя является неделей 14 схемы дозирования.

9. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная последующая неделя является любой из недель 4-36 схемы дозирования.

10. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий:

введение частей третичной дозы (D3) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная третичная доза составляет не менее половины указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка и не более указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D3) составляет от 40% до 60% суммарной третичной дозы, вторая часть дозы (F2D3) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной третичной дозы, и F2D3 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D3 на неделе 1 схемы дозирования; и

введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

11. Способ по п. 10, где F2D3 вводят субъекту через 24-96 часов после введения F1D3.

12. Способ по п. 10, где F2D3 вводят субъекту через 18-72 часа после введения F1D3.

13. Способ по любому из пп. 10-12, где указанная последующая неделя является неделей 4 схемы дозирования.

14. Способ по любому из пп. 10-12, где указанная последующая неделя является неделей 14 схемы дозирования.

15. Способ по любому из пп. 10-12, где указанная последующая неделя является любой из недель 4-36 схемы дозирования.

16. Способ по любому из пп. 10-12, где третичную дозу вводят в виде разовой дозы на неделях 4-12 схемы дозирования.

17. Способ введения субъекту терапевтического белка согласно схеме дозирования для снижения частоты развития или тяжести синдрома высвобождения цитокинов или инфузионной реакции при лечении CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы, включающий:

введение частей первичной дозы (D1) указанного терапевтического белка на неделе 1 схемы дозирования, где указанная первичная доза составляет не более 10 мг указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D1) составляет от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту в день 1 недели 1, и вторая часть дозы (F2D1) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной первичной дозы и ее вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D1;

введение частей вторичной дозы (D2) указанного терапевтического белка на неделе 2 схемы дозирования, где указанная вторичная доза равна максимальной недельной дозе указанного терапевтического белка, первая часть дозы (F1D2) составляет от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, вторая часть дозы (F2D2) составляет оставшиеся от 40% до 60% суммарной вторичной дозы, и F2D2 вводят субъекту через 12-96 часов после введения F1D2 на неделе 2 схемы дозирования; и

введение субъекту указанной максимальной недельной дозы указанного терапевтического белка в виде разовой дозы на одной из последующих недель схемы дозирования.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где указанную максимальную недельную дозу терапевтического белка вводят субъекту в виде разовой дозы в течение от 1 до 8 недель, от 1 до 12 недель или от 1 до 16 недель на протяжении еженедельной фазы схемы дозирования.

19. Способ по любому из пп. 1-18, дополнительно включающий введение субъекту указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка в виде разовой дозы один раз в две недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования.

20. Способ по любому из пп. 1-18, дополнительно включающий введение субъекту указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка в виде разовой дозы один раз в три недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования.

21. Способ по любому из пп. 1-18, дополнительно включающий введение субъекту указанной максимальной недельной дозы терапевтического белка в виде разовой дозы один раз в четыре недели на протяжении поддерживающей фазы схемы дозирования, которая следует после завершения еженедельной фазы схемы дозирования.

22. Способ по любому из пп. 19-21, где поддерживающая фаза составляет по меньшей мере 24 недели.

23. Способ по п. 22, где поддерживающая фаза составляет 24 недели.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где указанная первичная доза (D1) составляет 1 мг.

25. Способ по любому из пп. 1-24, где указанная вторичная доза (D2) составляет 20 мг.

26. Способ по любому из пп. 10-16 или 18-25, где указанная третичная доза составляет 40 мг.

27. Способ по любому из пп. 10-16 или 18-25, где указанная третичная доза составляет 80 мг.

28. Способ по любому из пп. 10-16 или 18-25, где указанная третичная доза составляет 160 мг.

29. Способ по любому из пп. 10-16 или 18-25, где указанная третичная доза составляет 320 мг.

30. Способ по любому из пп. 1-29, где F1D1 составляет 50% суммарной первичной дозы, и F2D1 составляет 50% суммарной первичной дозы.

31. Способ по любому из пп. 1-30, где F1D2 составляет 50% суммарной вторичной дозы, и F2D2 составляет 50% суммарной вторичной дозы.

32. Способ по любому из пп. 10-16 или 18-31, где F1D3 составляет 50% суммарной третичной дозы, и F2D3 составляет 50% суммарной третичной дозы.

33. Способ по любому из пп. 1-32, где указанная максимальная недельная доза терапевтического белка составляет от 5 до 320 мг.

34. Способ по п. 33, где указанная максимальная недельная доза терапевтического белка составляет 6-320 мг, 10-320 мг, 5-40 мг, 5-80 мг, 5-160 мг, 12-40 мг, 18-80 мг, 40-80 мг, 80-160 мг, 160-320 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 12 мг, 18 мг, 27 мг, 40 мг, 80 мг, 160 мг, 320 мг, 480 мг или 640 мг.

35. Способ по п. 34, где указанная максимальная недельная доза составляет 80 мг.

36. Способ по п. 34, где указанная максимальная недельная доза составляет 160 мг.

37. Способ по п. 34, где указанная максимальная недельная доза составляет 320 мг.

38. Способ по любому из пп. 1-37, где каждую дозу или часть дозы вводят субъекту в течение периода от 1 до 6 часов.

39. Способ по любому из пп. 1-38, где CD20-экспрессирующая В-клеточная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, мантийноклеточную лимфому или лимфому маргинальной зоны, лимфому Беркитта, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому.

40. Способ по любому из пп. 1-38, где у субъекта диагностирована фолликулярная лимфома (ФЛ).

41. Способ по п. 40, где ФЛ имеет степень 1-3a.

42. Способ по любому из пп. 1-38, где у субъекта диагностирована диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ).

43. Способ по п. 42, где у субъекта была неэффективной предшествующая CAR-T терапия.

44. Способ по любому из пп. 1-38, где у субъекта диагностирована мантийноклеточная лимфома (МКЛ).

45. Способ по п. 44, где у субъекта была неэффективной предшествующая терапия ингибитором тирозинкиназы Брутона (BTK).

46. Способ по любому из пп. 1-38, где у субъекта диагностирована лимфома маргинальной зоны (ЛМЗ).

47. Способ по любому из пп. 1-46, где субъектом является взрослый человек.

48. Способ по любому из пп. 1-47, где терапевтический белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

49. Способ по п. 48, где антитело представляет собой полностью человеческое антитело.

50. Способ по п. 48 или 49, где антитело представляет собой биспецифичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

51. Способ по п. 50, где первое антигенсвязывающее плечо биспецифичного антитела или антигенсвязывающего фрагмента связывается с Т-клеточным антигеном.

52. Способ по п. 51, где Т-клеточный антиген представляет собой CD3.

53. Способ по п. 51, где Т-клеточный антиген представляет собой CD28.

54. Способ по любому из пп. 50-53, где второе антигенсвязывающее плечо биспецифичного антитела или антигенсвязывающего фрагмента связывается с CD20.

55. Способ по п. 54, где биспецифичное антитело представляет собой анти-CD20 x анти-CD3 антитело.

56. Способ по п. 55, где анти-CD20 x анти-CD3 антитело представляет собой антитело REGN1979 или антитело, содержащее области HCVR/LCVR REGN1979, или антитело, содержащее области CDR REGN1979.

57. Способ по любому из пп. 1-56, где сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне приблизительно 2000 мкг/л или выше после введения указанной максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

58. Способ по п. 57, где сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне приблизительно 2600 мкг/л или выше после введения указанной максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

59. Способ по п. 58, где среднюю сывороточную концентрацию терапевтического белка поддерживают на уровне по меньшей мере приблизительно 3700 мкг/л после введения указанной максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

60. Способ по любому из пп. 1-59, где терапевтический белок вводят субъекту в комбинации со вторым агентом, выбранным из стероида, антигистаминного препарата, ацетаминофена, нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП), антагониста IL-6 или антагониста IL-6R.

61. Способ по п. 60, где стероид представляет собой дексаметазон, или НПВП представляет собой индометацин.

62. Способ по п. 61, где дексаметазон вводят субъекту приблизительно за один-три часа до первой части дозы (F1D1).

63. Способ по п. 61, где дексаметазон вводят субъекту приблизительно за один-три часа до F1D1, F2D1, F1D2 и F2D2.

64. Способ по п. 61, где дексаметазон вводят субъекту приблизительно за один-три часа до F1D1, F2D1, F1D2, F2D2, F1D3 и F2D3.

65. Способ по п. 60, где антагонист IL-6 представляет собой антитело к IL-6, или антагонист IL-6R представляет собой антитело к IL-6R.

66. Способ по п. 65, где антитело к IL-6R представляет собой сарилумаб.

67. Способ по любому из пп. 60-66, где введение второго агента прекращают после первого введения указанной максимальной недельной дозы на протяжении схемы дозирования.

68. Способ по любому из пп. 1-67, где терапевтический белок вводят субъекту в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

69. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент включает по меньшей мере один из ритуксимаба, обинутузумаба, циклофосфамида, доксорубицина, винкристина, преднизона, преднизолона, бендамустина, леналидомида, хлорамбуцила, ибритумомаба тиуксетана, иделалисиба, копанлисиба, дувелисиба, этопозида, метилпреднизолона, цитарабина, цисплатина, месны, ифосфамида, митоксантрона и прокарбазина.

70. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент включает комбинацию циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизона.

71. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент включает комбинацию ифосфамида, цисплатина и этопозида.

72. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент включает комбинацию гемцитабина и оксалиплатина.

73. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент включает комбинацию леналидомида и ритуксимаба.

74. Способ по п. 68, где второй терапевтический агент представляет собой леналидомид.

75. Способ лечения CD20-экспрессирующей В-клеточной лимфомы у субъекта, включающий:

выбор субъекта, у которого диагностирована CD20-экспрессирующая В-клеточная лимфома; и

введение указанному субъекту терапевтического белка в соответствии со способом по любому из пп. 1-74.

76. Способ по п. 75, где субъект ранее получал противораковую терапию.

77. Способ по п. 75 или 76, где субъект является рефрактерным к предшествующему лечению или перенес рецидив после предшествующего лечения.

78. Способ по п. 75, где субъект ранее получал лечение анти-CD20 антителом.

79. Способ по любому из пп. 75-78, где субъект ранее получал терапию с использованием CAR-T.

80. Способ по любому из пп. 75-79, где В-клеточный рак выбран из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы и лимфомы маргинальной зоны.

81. Способ по любому из пп. 1-80, где частота развития СВЦ 3 степени и ИР составляет менее 10%.

82. Способ по п. 81, где частота развития СВЦ 3 степени и ИР составляет менее 7,5% или менее 7%.

83. Способ по п. 81 или 82, где указанная максимальная недельная доза составляет 80 мг или более.

84. Способ по любому из пп. 1-83, где любую дозу, вводимую в виде разовой дозы, вводят не более чем за 1 час.