Новый вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью и способ получения лейцина с его использованием Российский патент 2023 года по МПК C12N9/10 C12P13/06 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому варианту аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью и способу получения лейцина с его использованием.

Предшествующий уровень техники

Аминокислоты с разветвленной цепью относятся к трем типам аминокислот (т.е. валину, лейцину и изолейцину) и, как известно, метаболизируются главным образом в мышцах для использования в качестве источника энергии во время физической активности. Поскольку аминокислоты с разветвленной цепью играют важную роль в поддержании и увеличении мышечной массы во время физической активности, объем их использования увеличивается. В частности, лейцин является разновидностью незаменимых аминокислот и широко используется в лекарствах, пищевых продуктах, кормовых добавках, лекарственных средствах промышленного производства и т.д.

Между тем, получение лейцина с использованием микроорганизмов главным образом выполняется посредством микроорганизмов, принадлежащих к роду Escherichia или Corynebacterium (US 2020-0032305 А1), и известно, что они биосинтезируют 2-кетоизокапроат в качестве предшественника из пирувата посредством нескольких стадий. Однако поскольку ферменты, используемые в синтезе лейцина, в равной степени используются в биосинтезе аминокислот с разветвленной цепью, трудно производить серийно промышленным способом один тип аминокислот с разветвленной цепью посредством ферментации.

Описание изобретения Техническая задача

Авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для разработки способа получения лейцина с более высоким выходом по сравнению с уровнем техники, и в результате они обнаружили вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью (bcaT), который увеличивает продуктивность лейцина, тем самым завершая настоящее изобретение.

Техническое решение

Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором аминокислотный остаток валина (V) в положении 156 с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой; полинуклеотид, кодирующий указанный вариант; вектор, содержащий указанный полинуклеотид; и микроорганизм, содержащий указанный вектор.

Другая задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа получения лейцина, включающего культивирование микроорганизма в среде.

Преимущественные эффекты

Согласно настоящему изобретению, поскольку вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью увеличивает продуктивность по лейцина с сравнении с диким типом, указанный вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью может широко использоваться для более эффективного массового производства лейцина.

Лучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет подробно описано следующим образом. Между тем, каждое описание и вариант осуществления, раскрытые в настоящем документе, также могут быть применены к другим описаниям и вариантам изобретения. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем документе, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.

Кроме того, специалисты в данной области техники будут понимать или будут способны установить, используя не более чем рутинные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Кроме того, эти эквиваленты следует интерпретировать как охватываемые настоящим изобретением.

В одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором аминокислотный остаток валина (V) в положении 156 с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой.

В частности, в настоящем изобретении может быть предложен вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, содержащий одну или более замен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, где указанная аминокислотная замена может включать замену, в которой аминокислота в положении 156 от N-конца заменена другой аминокислотой, отличной от валина. "Другая аминокислота" не ограничена, лишь бы только аминокислота была из аминокислот, отличных от валина, который представляет собой аминокислоту в положении 156 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В частности, указанный вариант может представлять собой белок, в котором аминокислота в положении 156 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена неполярной аминокислотой, и, более конкретно, указанный вариант может представлять собой вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором валин в положении 156 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен на аланин, но этот вариант этим не ограничивается.

В настоящем документе термин "аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью (bcaT)" относится к ферменту, вовлеченному в биосинтез аминокислот с разветвленной цепью. В настоящем документе аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью может использоваться взаимозаменяемо с "bcaT", "трансаминазой В" или "ilvE". Кроме того, аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью может кодироваться геном ilvE, но не ограничивается этим.

Известно, что в микроорганизмах лейцин биосинтезируется из пирувата через получение ацетомолочной кислоты, дигидроксиизовалериановой кислоты, кетоизовалериановой кислоты, 2-изопропиляблочной кислоты, 3-изопропиляблочной кислоты и кетоизокапроновой кислоты. Кроме того, такой биосинтетический процесс катализируется и осуществляется ферментами, такими как синтетаза ацетогидроксикислот, изомероредуктаза ацетогидроксикислот, дегидратаза дигидроксикислот, синтаза изопропиляблочной кислоты, дегидратаза изопропиляблочной кислоты, дегидрогеназа изопропиляблочной кислоты и аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью.

Однако, поскольку аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью также вовлечена в биосинтез валина и изолейцина, как и лейцина, имеет место проблема, когда один тип аминокислот с разветвленной цепью изготавливают промышленным способом посредством ферментации за счет обработки ферментами.

В настоящем изобретении последовательность аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью может быть получена из известной базы данных GenBank (т.е. NCBI), но не ограничивается этим, и аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью может быть получена на основе различных способов, хорошо известных в данной области техники. Примеры этих способов включают технологию синтеза генов, включающую оптимизацию кодонов, для получения ферментов с высокой эффективностью из микроорганизмов видов Corynebacterium, которые обычно используются для экспрессии ферментов, или способ скрининга ресурсов полезных ферментов методами биоинформатики, основанными на массовой информации о геноме микроорганизмов, но не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении, аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью, подлежащая мутации, может представлять собой аминотрансферазу аминокислот с разветвленной цепью, полученную из микроорганизма видов Corynebacterium, и, в частности, может представлять собой полипептид/белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, но полипептиды/белки, имеющие эквивалентную активность, могут быть включены без ограничения. Ее пример может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии или идентичности с ней, но не ограничивается этим. В частности, аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью может включать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более гомологии или идентичности с SEQ ID NO: 1. Кроме того, если полипептид/белок, имеющий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, заменена или добавлена, также является полипептидом/белком, имеющим такую гомологию или идентичность и проявляющим активность аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, очевидно, что этот полипептид/белок включается в диапазон полипептида/белка, подлежащего мутации в настоящем изобретении.

То есть даже если в настоящем изобретении раскрыт "белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с определенным порядковым номером" или "белок или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности с определенным порядковым номером", если белок или полипептид имеет такую же или соответствующую активность белка или полипептида, состоящих из аминокислотной последовательности соответствующего порядкового номера, очевидно, что белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, заменена, или добавлена также может быть использован в настоящем изобретении. Например, даже если часть последовательности "полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1" удалена, модифицирована или заменена, или полипептид содержит добавленную аминокислотную последовательность, если этот полипептид обладает той же или соответствующей активностью, что и "полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1", очевидно, что этот полипептид может относиться к "полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1".

В настоящем изобретении термин "вариант" относится к белку, в котором по меньшей мере одна аминокислота в консервативной замене и/или модификации отличается от аминокислоты указанной последовательности, но функции или свойства белка сохраняются. Вариант отличается от последовательности, идентифицированной несколькими аминокислотными заменами, удалениями или добавлениями. Такой вариант, как правило, может быть идентифицирован путем модификации одной из полипептидных последовательностей и путем оценки свойств модифицированного полипептида. То есть способность варианта может быть увеличена, не изменена или уменьшена по сравнению с таковой у его нативного белка. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более частей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых часть N-конца и/или С-конца зрелого белка удалена. В настоящем изобретении термин "консервативная замена" может означать замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства. Вариант может иметь, например, одну или несколько консервативных замен, сохраняя при этом одну или несколько биологических активностей. Такие аминокислотные замены обычно могут происходить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Как правило, консервативные замены могут оказывать незначительное влияние или вообще не оказывать никакого влияния на активность полипептида.

Кроме того, варианты могут включать удаление или добавление аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, вариант или модифицированный полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, участвующего в переносе совместно транслируемого или посттрансляционного белка. Кроме того, вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами для идентификации, очистки или синтеза полипептида.

Термин "вариант" также может использоваться взаимозаменяемо с "модификацией", "модифицированным белком", "модифицированным полипептидом", "мутантом", "мутеином", "дивергентом", "вариантом" и т.д., но используемый термин этим не ограничивается, и может быть использовать любой термин, при условии, что его используют в отношении мутировавшего. Для целей настоящего изобретения вариант может представлять собой вариант, в котором активность аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью изменяют для повышения продуктивности лейцина.

То есть, в настоящем изобретении, термин "вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью" включает одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности полипептида, обладающего аминотрансферазной активностью аминокислот с разветвленной цепью, и термин "вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью" может использоваться взаимозаменяемо с термином "полипептид, обладающий аминотрансферазной активностью аминокислот с разветвленной цепью". Кроме того, термин "вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью" может использоваться взаимозаменяемо с "модифицированным белком аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью", "модифицированным bcaT", "модифицированным белком bcaT", "вариантом bcaT", "модифицированным белком трансаминазы В", "модифицированной трансаминазой В", "вариантом трансаминазы В", "модифицированным белком ilvE", "модифицированным ilvE", "вариантом ilvE" и т.д., но не ограничивается этим, при условии, что он используется в смысле мутации, как описано выше.

Очевидно, что вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором аминокислотный остаток валина (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой, может включать вариант белка, в котором аминокислота, соответствующая положению 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменяется другой аминокислотой в аминокислотной последовательности полипептида, обладающего аминотрансферазной активностью аминокислот с разветвленной цепью. Например, вариант может быть вариантом, содержащим последовательность, в которой аминокислота, соответствующая положению 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена другой аминокислотой в последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% или более гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

"Другая аминокислота" может представлять собой аминокислоту, отличную от аминокислоты, соответствующей аминокислоте в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Конкретно, вариант может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена неполярной аминокислотой, имеющей структурные и/или химические свойства, сходные с аланином. Более конкретно, вариант может быть вариантом, в котором аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена аланином, но не ограничивается этим.

В настоящем изобретении, термин "соответствующее положение" относится к аминокислотному остатку в положении, указанном в белке или полипептиде, или аминокислотному остатку, подобному, идентичному или гомологичному остатку, указанному в белке или полипептиде. Используемый здесь термин "соответствующая область" обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или в референсном белке.

В настоящем изобретении, может быть использована специальная нумерация в положении аминокислотного остатка в белке, используемом в настоящем изобретении. Например, путем выравнивания полипептидной последовательности белка по настоящему изобретению с целевым белком, подлежащим сравнению, можно перенумеровать положение, соответствующее положению аминокислотного остатка белка по настоящему изобретению.

Вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению может обладать активностью повышения продуктивности по лейцину в микроорганизмах по сравнению с белком аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью дикого типа или не являющегося вариантом.

Вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью может представлять собой вариант, в котором аминокислотный остаток валина (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой, более конкретно заменен аланином. Кроме того, вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью может иметь 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, или 99% или более гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, более конкретно 90% или больше гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

В одном воплощении вариант может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, но не ограничивается этим. Дополнительно, в варианте аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью аминокислота, соответствующая положению 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 (то есть аминокислота в положении, соответствующем аминокислоте в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, представляет собой аланин, подобный аминокислоте в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3) зафиксирована и может включать аминокислотную последовательность, содержащую 70% или более, в частности 80%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более гомологии или идентичности с SEQ ID NO: 3, но не ограничивается этим. Кроме того, если вариант представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую такую гомологию или идентичность и проявляющую эффективность, соответствующую белку, в дополнение к аминокислотной последовательности в положении 156, очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, в которой часть последовательности удалена, модифицирована, заменена или добавлена, также входит в объем настоящего изобретения.

В настоящем изобретении термин "гомология" или "идентичность" относится к степени соответствия между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и он может быть выражен в процентах. Эти термины "гомология" и "идентичность" часто могут использоваться как взаимозаменяемые.

Гомология последовательностей или идентичность консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена с помощью стандартного алгоритма выравнивания, и штрафы за разрыв по умолчанию, установленные используемой программой, могут использоваться вместе. Фактически, гомологичные или идентичные последовательности обычно могут гибридизироваться друг с другом вдоль всей последовательности или, по меньшей мере, примерно 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% или более от всей длины при умеренных или очень жестких условиях. При гибридизации также рассматриваются полинуклеотиды, включающие вырожденный кодон вместо кодона.

Имеют ли какие-либо две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, сходство или идентичность, можно определять используя компьютерные алгоритмы, известные в данной области техники, например, программу "FASTA", используя параметры по умолчанию, введенные Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]. В качестве альтернативы можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), выполненный в программе Needleman Европейского набора открытого программного обеспечения для молекулярной биологии EMBOSS (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя версия) для определения того же (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.] Academic Press, San-Diego, 1994 и [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определять, используя BLAST, из базы данных Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.

Гомология, сходство или идентичность между полинуклеотидами или полипептидами могут быть определены, например, путем сравнения информации о заданной последовательности с использованием компьютерной программы GAP, такой как программа, представленная Needleman et al. (J Mol Biol. 48: 443 (1970)), как раскрыто Smith and Waterman (Adv. Appl. Math (1981) 2: 482). Вкратце, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как количество одинаковых выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), деленное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать в себя: (1) двоичную матрицу сравнения (включающую значение 1 для идентичности и значение 0 для неидентичности) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov, et al., (Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)), как описано Schwartz and Dayhoff", eds. (Atlas Of Protein Последовательности And Structure, National Biomedical Research Foundation pp.353-358 (1979) или матрицу замещения EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)); (2) штраф в размере 3,0 за каждый пропуск и дополнительный штраф в размере 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за открытие пропуска в размере 10 и штраф за расширение пропуска в размере 0,5); и (3) штраф за конечные пропуски отсутствует. Соответственно, термин "гомология" или "идентичность", используемый в настоящем изобретении, может представлять релевантность между последовательностями.

В другом аспекте настоящего изобретения может быть предложен полинуклеотид, кодирующий вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью.

Кроме того, в еще одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен вектор, содержащий указанный полинуклеотид.

При использовании в настоящем документе термин "полинуклеотид" относится к цепи ДНК или РНК, имеющей определенную длину, в виде нуклеотидного полимера, который представляет собой длинную цепь нуклеотидных мономеров, соединенных ковалентной связью, и более конкретно относится к полинуклеотидному фрагменту, кодирующему вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, описанный выше.

Полинуклеотид, кодирующий вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, по настоящему изобретению может быть включен без ограничений, при условии, что указанный полинуклеотид представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению. Полинуклеотид, кодирующий вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, может быть включен без ограничений, при условии, что указанный полинуклеотид представляет собой последовательность, кодирующую вариант, в котором аминокислота в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена другой аминокислотой. В частности, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант, в котором аминокислота в положении 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена аланином. Например, полинуклеотид, кодирующий вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению, может представлять собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, но не ограничивается этим. Более конкретно, полинуклеотид может состоять из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, но не ограничивается этим.

Учитывая вырождение кодонов или кодонов, предпочтительных в биологическом организме, в котором должен экспрессироваться белок, в кодирующей области полинуклеотида, кодирующего вариант белка по настоящему раскрытию, могут быть выполнены различные модификации в объеме, не изменяющем аминокислотную последовательность белка. Таким образом, будет очевидно, что также могут быть включены полинуклеотид, который может быть транслирован в полинуклеотид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или полипептид, имеющий гомологию или идентичность с ним посредством вырождения кодона.

Дополнительно, может быть включена без ограничений любая последовательность, которая кодирует вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором 156-я аминокислота SEQ ID NO: 1 заменена другой аминокислотой, путем гибридизации с любым зондом, который может быть получен из известных последовательностей генов (например, комплементарных последовательностей ко всей или части вышеуказанной базовой последовательности) при строгих условиях.

Термин "строгие условия" относится к условиям, которые обеспечивают возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия конкретно описаны в литературе (например, J Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Например, в литературе может указываться условия гибридизации между генами, имеющими высокую гомологию или идентичность, т.е. генами, имеющими гомологию или идентичность 80% или более, 85% или более, конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более и еще более конкретно 97% или более, и особенно конкретно 99% или более и на отсутствие гибридизации между генами, имеющими гомологию или идентичность ниже этого, или условия промывки общей Саузерн-гибридизации, при которых промывку проводят один раз, в частности, 2-3 раза при концентрации солей и температуре, соответствующим 60°С, 1 X SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1 X SSC, 0,1% SDS и, более конкретно 68°С, 0,1 X SSC, 0,1% SDS.

Гибридизация требует, чтобы две нуклеиновые кислоты включали комплементарные последовательности, однако, в зависимости от строгости гибридизации, возможны несоответствия между основаниями. Термин "комплементарный" используют для описания взаимосвязи между взаимно гибридизируемыми нуклеотидными основаниями. Например, что касается ДНК, аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, настоящее изобретение может также включать изолированные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные всей последовательности, а также по существу подобные последовательности нуклеиновых кислот.

В частности, для полинуклеотидов, имеющих гомологию или идентичность, можно использовать условия гибридизации, включающее гибридизацию при значении Tm 55°С, и можно обнаруживать с использованием вышеупомянутых условий. Кроме того, значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается этим, и значение Tm может быть надлежащим образом установлено специалистами в данной области техники согласно их целям.

Надлежащая степень строгости гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области техники (см. Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

В настоящем документе, термин "вектор" может относиться к конструкции ДНК, включающей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой модифицированный белок, который функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, так что целевой модифицированный белок может экспрессироваться в подходящем хозяине. Управляющая последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для управления транскрипцией, последовательность, кодирующую соответствующий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность для управления терминацией транскрипции и трансляции. Вектор после трансформации в подходящую клетку-хозяина может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может быть интегрирован в сам геном.

Используемый в настоящем изобретении вектор специально не ограничивается и может представлять собой любой вектор, известный в данной области техники. Примеры вектора, обычно подлежащего использованию, могут включать плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги, которые находятся в нативном или рекомбинантном состоянии. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, АРП, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.п.; и в качестве плазмидного вектора можно использовать плазмиды на основе pBR, на основе pUC, на основе pBluescriptII, на основе pGEM., на основе pTZ, pCL и рЕТ. В частности, в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.п., но не ограничиваясь этими.

Например, полинуклеотид, кодирующий целевой модифицированный белок в хромосоме, может быть заменен мутировавшим полинуклеотидом с помощью вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена с использованием любого способа, известного в данной области техники (например, гомологичной рекомбинации), но способ вставки этим не ограничивается. Полинуклеотид может дополнительно включать маркер селекции для подтверждения успешной вставки его в хромосому. Маркер селекции используют для отбора клеток, трансформированных вектором, т.е. для подтверждения того, была ли введена молекула-мишень нуклеиновой кислоты, и могут быть использованы маркеры, которые придают отбираемые фенотипы (например, устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам, экспрессия поверхностно модифицированных белков и т.д.). В таких условиях, при обработке селективными агентами только клетки, способные экспрессировать маркеры селекции, могут выживать или экспрессировать другие фенотипические признаки, что позволяет легко отбирать трансформированные клетки.

В еще одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен микроорганизм, содержащий, по меньшей мере, одно из: варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью; полинуклеотида, кодирующего указанный вариант; и вектора, содержащего указанный полинуклеотид.

Конкретно, указанный микроорганизм может представлять собой микроорганизм, полученный путем трансформации указанным вектором, содержащим указанный полинуклеотид, кодирующий указанный вариант, но не ограничивается этим.

В настоящем документе термин "трансформация" означает, что белок, кодирующий полинуклеотид, может быть экспрессирован в клетке-хозяине путем включения вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяин. До тех пор, пока трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, все трансформированные полинуклеотиды могут быть введены независимо от того, вставлен ли трансформированный полинуклеотид и расположен в хромосоме клетки-хозяина или расположен вне хромосомы. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме до тех пор, пока полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме кассеты экспрессии, которая представляет собой геномную структуру, включающую все элементы, необходимые для самоэкспрессии. Кассета экспрессии обычно может включать промотор, который функционально связан с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Кассета экспрессии может представлять собой форму самовоспроизводимого вектора экспрессии. Кроме того, полинуклеотид также может быть введен в клетку-хозяина в своей собственной форме, будучи функционально связанным с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничивается этим.

Кроме того, термин "функционально связанный" выше может означать, что последовательность гена функционально связана с промоторной последовательностью, что инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего аминотрансферазу аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, который имеет продуктивность по лейцину и который содержит, по меньшей мере, одно из: варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью; полинуклеотида, кодирующего указанный вариант; и вектора, содержащего указанный полинуклеотид, но не ограничивается этим. Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, обладающий природной продуктивностью лейцина, или микроорганизм, обладающий продуктивностью лейцина, приданной родительскому штамму, который не обладает продуктивностью лейцина, но не ограничивается этим.

Для целей настоящего изобретения микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, способный продуцировать лейцин посредством экспрессии варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью.

При использовании в данном документе термин "белок, обладающий способностью экспрессироваться/подлежащий экспрессированию/экспрессируемый" может относиться к состоянию, в котором целевой белок вводится в микроорганизм или модифицируется для экспрессии в микроорганизме. Когда целевой белок представляет собой белок, присутствующий в микроорганизме, это может означать состояние, в котором его активность усиливается по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. Что касается объектов настоящего изобретения, "целевой белок" может представлять собой вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, описанный выше.

Конкретно, "введение белка" может означать, что микроорганизм проявляет активность конкретного белка, которой изначально не обладал, или проявляет усиленную активность по сравнению с эндогенной активностью соответствующего белка или активностью до модификации. Например, полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, может быть введен в хромосому микроорганизма, или вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, может быть введен в микроорганизм для проявления своей активности.

Кроме того, "усиление активности" может означать, что активность улучшается по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации конкретного белка, включенного в микроорганизм. "Эндогенная активность" может означать активность конкретного белка, которым первоначально обладал родительский штамм до трансформации, при которой микроорганизм трансформируют посредством генетической вариации, вызванной естественными или искусственными факторами. В одном воплощении усиление активности белка может быть достигнуто путем усиления экспрессии гена, кодирующего белок, но не ограничивается этим.

Конкретно, в настоящем изобретении усиление активности варианта белка может быть выполнено по меньшей мере посредством одного способа, выбранного из группы, состоящей из способа увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего вариант белка, способа введения мутации в регуляторную последовательность экспрессии гена, кодирующего вариант белка, способа замены регуляторной последовательности экспрессии гена, кодирующей вариант белка, последовательностью, обладающей сильной активностью, способа замены гена, кодирующего нативный белок, обладающий активностью аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в хромосоме геном, кодирующим вариант указанного белка, способа дополнительного введения мутации в ген, кодирующий вариант, чтобы усилить активность указанного варианта белка, а также способа введения варианта белка в микроорганизм, но не ограничивается этим.

Далее, модификация регуляторной последовательности экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида может быть, но не ограничивается этим, выполнена путем индуцирования модификации в полинуклеотидной последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, чтобы дополнительно усилить активность регуляторной последовательности экспрессии, или путем замены полинуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательностью с более сильной активностью. Регуляторная последовательность экспрессии может включать, но не ограничивается этим, промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую рибосом-связывающий домен, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, и т.д.

Сильный промотор вместо исходного промотора может быть связан с верхней частью единицы экспрессии полинуклеотида, но не ограничивается этим. Примеры известного сильного промотора включают промоторы cj1 - cj7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор O2 (US 10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА и т.д., но не ограничиваясь этим.

Кроме того, модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме не ограничивается конкретно, но может быть выполнена путем индуцирования мутации в регуляторной последовательности экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в последовательности нуклеиновой кислоты для дальнейшего усиления активности полинуклеотидной последовательности, или может быть выполнена путем замены на полинуклеотидную последовательность, улучшенную для обеспечения более сильной активности.

При введении и усилении активности белка активность или концентрация соответствующего белка обычно могут быть, увеличены по меньшей мере на 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, или 500%, не более чем на 1000% или 2000%, в зависимости от активности или концентрации белка в штамме микроорганизма дикого типа или немодифицированного штамма, но не ограничивается этим.

Микроорганизм может включать все микроорганизмы, способные к экспрессированию варианта, который трансформируют вектором, содержащим вариант белка или полинуклеотид, кодирующий вариант белка, или полинуклеотид, кодирующий вариант. Конкретные примеры микроорганизма могут включать штаммы микроорганизмов, таких как рода Escherichia, рода Serratia, рода Erwinia, рода Enterobacteria, рода Salmonella, рода Streptomyces, рода Pseudomonas, рода Brevibacterium или рода Corynebacterium, конкретно микроорганизмы рода Corynebacterium и более конкретно Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваются этим.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, продуцирующий лейцин.

В настоящем изобретении термин "микроорганизм, продуцирующий лейцин" может обозначать микроорганизмы, обладающие естественной продуктивностью по лейцину, или микроорганизмы, у которых продуктивность по лейцину придается родительскому штамму, который не обладает продуктивностью лейцина. Кроме того, микроорганизм, продуцирующий лейцин, может включать микроорганизм, генетически модифицированный посредством, по меньшей мере, одного из: варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, полинуклеотида, кодирующего указанный вариант, и вектора, содержащего указанный полинуклеотид; микроорганизм, модифицированный для экспрессии варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью или полинуклеотида, кодирующего указанный вариант; и рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант, но не ограничиваясь этим.

Микроорганизм, продуцирующий лейцин, представляет собой микроорганизм, который включает полинуклеотид, кодирующий вариант белка, или микроорганизм, который способен экспрессировать вариант, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант, и для целей настоящего изобретения микроорганизм может включать все микроорганизмы, способные продуцировать лейцин за счет содержания варианта ilvE. Конкретные примеры микроорганизма могут включать штаммы микроорганизмов, такие как рода Escherichia., рода Serratia, рода Erwinia, рода Enterobacteria, рода Salmonella, рода Streptomyces, рода Pseudomonas, рода Brevibacterium или рода Corynebacterium, конкретно микроорганизмы рода Corynebacterium и более конкретно Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении термин "микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий лейцин" может обозначать микроорганизмы рода Corynebacterium, обладающие продуктивностью по лейцину благодаря дикому типу или мутации. Известно, что микроорганизм рода Corynebacterium может в некоторой степени продуцировать лейцин, однако продуктивность лейцина чрезвычайно низка и трудно производить микроорганизм рода Corynebacterium промышленным способом. Таким образом, в настоящем изобретении микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью по лейцину, может означать микроорганизм рода Corynebacterium, у которого продуктивность по лейцину была улучшена за счет самого нативного микроорганизма или вставки гена, связанного с внешним механизмом производства лейцина, или усиления, ослабления или инактивации активности внутреннего гена. Для целей настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий лейцин, может представлять собой микроорганизм, отличающийся тем, что продуктивность по лейцину повышена посредством введения варианта аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью по настоящему изобретению. В одном воплощении микроорганизм может иметь повышенную продуктивность по лейцину по сравнению с микроорганизмом, который не содержит естественный штамм дикого типа, родительский штамм или вариант по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, термин "предварительно модифицированный штамм" или "предварительно модифицированный микроорганизм" не исключает штаммы, содержащие мутации, которые могут встречаться в природе в микроорганизмах, и может обозначать либо штамм дикого типа, либо штамм естественного типа сам по себе, либо штамм до изменения признака генетической мутацией, вызванной естественными или искусственными факторами. "Предварительно модифицированный штамм" или "предварительно модифицированный микроорганизм" могут использоваться взаимозаменяемо с "немутированным штаммом", "немодифицированным штаммом", "немутированным микроорганизм", "немодифицированным микроорганизмом" или "референсным микроорганизмом".

В одном воплощении микроорганизмы рода Corynebacterium могут представлять собой микроорганизмы рода Corynebacterium, которые имеют усиленную экспрессию гена, вовлеченного в путь биосинтеза лейцина, или ослабленную/инактивированную экспрессию гена, вовлеченного в путь разложения лейцина, и конкретно могут представлять собой микроорганизмы рода Corynebacterium, продуцирующие лейцин, у которых дополнительно была усилена активность изопропилмалатсинтазы, но не ограничиваются этим. Усиление активности белка происходит так, как описано выше.

Термин "ослабление/инактивация активности белка" в настоящем изобретении может означать, что экспрессия фермента или белка совсем не экспрессируется по сравнению с естественным штаммом дикого типа, родительским штаммом или штаммом, в котором соответствующий белок не модифицирован, либо его активность отсутствует или уменьшилась, даже если экспрессия и происходит. В частности, снижение представляет собой концепцию, включающую случай, когда активность белка снижается по сравнению с активностью белка, которой первоначально обладал микроорганизм, вследствие мутации гена, кодирующего белок, модификации последовательности, регулирующей экспрессию, или делеции части или всего гена, случай, когда общая степень активности белка в клетках ниже таковой у нативного штамма или предварительно модифицированного штамма из-за ингибирования экспрессии или трансляции гена, кодирующего его, и их комбинацию. В настоящем изобретении, инактивация/ослабление может быть достигнуто посредством использования различных способов, хорошо известных в данной области техники. Варианты способа могут включать в себя: 1) способ удаления всего или части гена, кодирующего белок; 2) модификацию последовательности регуляции экспрессии для снижения экспрессии гена, кодирующего белок; 3) модификацию последовательности гена, кодирующего белок, таким образом, чтобы активность белка устранялась или ослаблялась; 4) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего белок; 5) способ отключения прикрепления рибосомы посредством формирования вторичной структуры с помощь добавления последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Далгарно, к передней части последовательности Шайна-Далгарно гена, кодирующего белок; 6) способ (инженерия обратной транскрипции, RTE) добавления промотора, транскрибируемого в противоположном направлении, к 3'-концу открытой рамки считывания (ОРС) полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, и т.д. Способ также может быть выполнен посредством их комбинаций, но конкретно этим не ограничивается. Способы инактивации/ослабления, известные в данной области техники, могут быть выбраны и применены соответствующим образом.

В еще одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен способ получения лейцина, включающий культивирование микроорганизма.

В таком способе культивирование микроорганизма конкретно не ограничено, но может быть выполнено посредством известного способа периодического культивирования, способа непрерывного культивирования, способа периодического культивирования с подпиткой или подобным. В частности, условия культивирования специально не ограничены, но аэробные условия могут поддерживаться путем регулирования соответствующего рН (например, рН 5-9, конкретно рН 6-8 и наиболее конкретно рН 6,8) с использованием основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты) и путем введения кислорода или кислородсодержащей газовой смеси в культуральную среду. Температура культивирования может поддерживаться на уровне от 20°С до 45°С, в частности от 25°С до 40°С, и микроорганизм может культивироваться в течение примерно от 10 часов до 160 часов, но не ограничивается этим. Лейцин, продуцируемый вышеуказанной культурой, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.

Кроме того, в используемой культуральной среде можно использовать, по отдельности или в комбинации, в качестве источника углерода сахар и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например, глицерин и этиловый спирт), органические кислоты (например, уксусную кислоту) и т.д., но источник углерода этим не ограничивается. В качестве источника азота можно использовать, по отдельности или в комбинации, азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, солодовый экстракт, кукурузный отвар, соевый шрот и мочевину), неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) или тому подобное, но источник азота этим не ограничивается. В качестве источника фосфора можно использовать, по отдельности или в комбинации, дигидрофосфат калия, гидрофосфат дикалия, соответствующие им натрийсодержащие соли и т.д., но источник фосфора этим не ограничивается. Кроме того, среда может содержать необходимые вещества, способствующие росту, такие как соли других металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.

Способ получения может дополнительно включать стадию извлечения лейцина из культивируемого микроорганизма или культуральной среды.

Способом выделения или извлечения лейцина можно получать требуемую аминокислоту из культуральной среды с использованием подходящего способа, известного в данной области техники в соответствии со способом культивирования. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.д., и можно получать требуемый лейцин из среды или микроорганизма с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

В еще одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен способ повышения продуктивности по лейцину, включающий модификацию микроорганизма таким образом, чтобы экспрессировать вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, в котором аминокислотный остаток валина (V) в положении 156 с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой.

В еще одном аспекте настоящего изобретения может быть предложен применение варианта белка для повышенного продуцирования лейцина. Вариант белка является таким, как описано выше.

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры и экспериментальные примеры. Однако эти примеры и экспериментальные примеры являются только иллюстрацией настоящего изобретения, и объем настоящего раскрытия не ограничивается этими примерами и экспериментальными примерами.

Пример 1: Обнаружение варианта ilvE

1-1. Получение вектора, содержащего ilvE

С целью получения библиотеку варианта ilvE, имеющего активность аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью, сначала получали рекомбинантный вектор, включающий часть ilvE. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность ilvE дикого типа были такими же, как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно. ПЦР выполняли с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы вместе с праймерами SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 и амплифицированный продукт клонировали в векторе Е. coli pCR2.1 с использованием набора для клонирования ТОРО (Invitrogen) с получением pCR-ilvE.

1- 2. Получение библиотеки варианта ilvE

Библиотеку варианта ilvE получали на основе вектора, полученного в Примере 1-1. Указанную библиотеку получали, используя набор для подверженной ошибкам ПЦР (набор для случайного мутагенеза на основе ПЦР clontech Diversify®). В условиях, когда может возникнуть вариант, выполняли ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. Конкретно, после предварительного нагревания при 94°С в течение 30 секунд при условии, что возникает 0-3 варианта на 1000 п. н. (пар нуклеотидов), процесс 30 секунд при 94°С и 1 минуту и 30 секунд при 68°С повторяли 25 раз. Продукт ПЦР, полученный к этому времени, обрабатывали с помощью DpnI, после процесс при 95°С в течение 50 секунд, 60°С в течение 50 секунд и 68°С в течение 12 минут повторяли 25 раз с помощью мегапраймера (от 500 нг до 125 нг), трансформировали в Е. coli DH5α, и наносили на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Затем 20 трансформированных колоний скринировали, получали плазмиду и анализировали полинуклеотидную последовательность, и в результате было подтверждено, что варианты были введены в разные позиции с частотой 2 мутации/кб (мутации/тысячу пар оснований). Для извлечения плазмиды, получившей название pTOPO-ilvE-библиотеки, было взято около 20000 трансформированных колоний Е. coli.

Пример 2: Оценка библиотеки и скрининг варианта у продуцирующего лейцин штамма

В целом, даже если штамм дикого типа рода Corynebacterium продуцирует лейцин, вырабатывается лишь очень небольшое количество лейцина. Таким образом, получили продуцирующий лейцин штамм, полученный из АТСС 13032, и варианты были подвергнуты скринингу путем введения библиотечного вектора, полученного в примере 1-2.

2- 1. Получение продуцирующего лейцин штамма СА13-8100

Для получения продуцирующего лейцин штамма, полученного из Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа, вводили вариант изопропилмалатсинтазы (далее именуемой "IPMS") с получением штамма СА13-8100.

Конкретно, указанный вариант включал мутацию, в которой G, который представлял собой нуклеотид в положении 1673 гена leuA, кодирующего изопропилмалеатсинтазу, был заменен на А, и аргинин, который представлял собой аминокислоту в положении 558 белка IPMS, был заменен на гистидин, а также мутацию, в которой нуклеотиды в положениях 1682 и 1683 GC заменены на AT, и глицин, аминокислота в положении 561, была заменена на аспарагиновую кислоту (US 2020-0032305 A1).

Вектор pDC-leuA (R558H, G561D), содержащий указанную мутацию leuA, трансформировали в АТСС13032 дикого типа, и штамм, в котором вектор был вставлен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, подвергали скринингу в среде, содержащей 25 мг/л канамицина.

Скринированный первичный штамм снова подвергали вторичному кроссинговеру и отбирали штамм, в который была введена указанная мутация гена leuA. Наличие мутации в конечном трансформированном штамме подтверждали путем проведения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 с последующим анализом последовательности оснований. В результате было подтверждено, что мутация была введена в конечный трансформированный штамм.

Штамм АТСС 13032_leuA_(R558H, G561D), трансформированный вектором pDC-leuA(R558H, G561D), получил название СА13-8100.

2-2. Оценка библиотеки и скрининг варианта

Библиотеку pTOPO-ilvE, полученную в Примере 1-2, трансформировали в продуцирующий лейцин штамм СА13-8100, полученный в Примере 2-1, путем электропорации, и затем наносили на питательную среду, содержащую 25 мг/л канамицина, с получением 10000 колоний штамма, в который был введен мутантный ген, и каждой колонии дали название от CA13-8100/pTOPO_ilvE(mt)1 до СА13-8100/pTOPO_ilvE(mt)10000.

Чтобы идентифицировать колонии с повышенным продуцированием лейцина среди полученных 10000 колоний, для каждой колонии титр ферментации оценивали следующим способом.

- Питательная среда: глюкоза 10 г, мясной сок 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).

- Среда для продуцирования: глюкоза 50 г, сульфат аммония 20 г, кукурузный крахмал 20 г, дикалийфосфат 1 г, гептагидрат сульфата магния 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-НС1 1 мг, карбонат кальция 15 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды), рН 7,0.

Каждую колонию инокулировали в 250 мл колбу с угловой перегородкой, содержащую 25 мкг/мл канамицина в 25 мл автоклавированной среды для продуцирования с помощью платиновой петли, затем культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при 30°С в течение 60 часов. После завершения культивирования количество продуцируемого лейцина измеряли посредством способа с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, SHIMAZDU LC20A), и один штамм, имеющий наилучшую продуктивность по лейцину по сравнению со штаммом СА13-8100, подвергали скринингу. Концентрация лейцина, продуцированного отобранным в скрининге штаммом, показана в таблице 1 ниже.

2-3. Подтверждение мутаций в скринированном вариантном штамме

Для подтверждения генетической мутации штамма, скринированного в примере 2-2, выполняли ПЦР на штамме СА13-8100/рТОРО_ilvE(mt)3012 с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, выполняли секвенирование и сравнивали ген ilvE с ilvE из АТСС13032 дикого типа, и было подтверждено, что штамм содержит мутацию в гене ilvE.

Конкретно, было подтверждено, что в штамме СА13-8100/рТОРО_ilvE(mt)3012 Т (т.е. нуклеотид в позиции 503 гена ilvE) был заменен на С (SEQ ID NO: 4). Это мутация, при которой валин в положении 156 в аминокислотной последовательности ilvE заменяется на аланин (SEQ ID NO: 3). Поэтому в следующих примерах подтверждали, влияет ли мутация на количество продукции лейцина микроорганизмом рода Corynebacterium.

Пример 3: Подтверждение продуктивности по лейцину у варианта скрининга ilvE

3-1. Получение вектора для вставки, содержащего вариант ilvE

Для введения в штамм вариантов, отобранных в примере 2, был приготовлен вектор для вставки. Вектор для введения варианта ilvE (VI56A) был получен с использованием метода сайт-направленного мутагенеза. ПЦР проводили с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы вместе с парой праймеров SEQ ID NO: 11 и 12 и SEQ ID NO: 13 и 14. После денатурации при 94°С в течение 5 минут проводили ПЦР путем 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты 30 секунд, а затем проводили полимеризацию при 72°С в течение 5 минут. В результате полученные фрагменты генов были клонированы путем слияния гомологичной последовательности из 15 оснований на конце между фрагментами ДНК с использованием фермента In-Fusion с линейным вектором pDC, расщепленным ферментами рестрикции PstI и XbaI, с получением вектора pDC-ilvE (VI56A), заменяющего аминокислоту в положении 156, валин (Val), на аланин (Ala).

3-2. Введение варианта ilvE в штамм СА13-8100 и в АТСС 13032 и подтверждение продуктивности по лейцину

Продуцирующий лейцин штамм СА13-8100 трансформировали вектором pDC-ilvE (VI56A), полученным в примере 3-1, и штамм, в котором вектор был вставлен в хромосому путем рекомбинации гомологичной последовательности, подвергали скринингу в среде, содержащей 25 мг канамицина. Скринированный первичный штамм снова подвергали вторичному кроссинговеру и отбирали штаммы, в которые была введена мутация целевого гена. Наличие мутации гена ilvE в конечном трансформированном штамме подтверждали посредством выполнения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и затем анализом последовательности оснований. В результате было подтверждено, что мутация ilvE была введена в конечный трансформированный штамм. Полученный СА13-8100 ilvE V156A был назван СА13-8107.

Кроме того, Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 дикого типа был трансформирован вектором pDC-ilvE (V156A) тем же способом, и полученный штамм АТСС13032 ilvE V156A был назван СА13-8106.

Оценивали продуктивность по лейцину у полученных штаммов СА13-8106 и СА13-8107. Культивирование в колбе проводили таким же образом, как в примере 2-2, и после завершения культивирования количество продуцируемого лейцина измеряли методом, использующим ВЭЖХ, и результаты культивирования показаны в Таблице 2 ниже.

Как видно в Таблице 2, было подтверждено, что продуцирующий лейцин штамм Corynebacterium glutamicum СА 13-8100 имел значительно улучшенную продуктивность по лейцину по сравнению со своим родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС13032. Кроме того, было подтверждено, что штамм СА13-8107 с введенной мутацией ilvE V156A в штамм СА13-8100, улучшал продуктивность по лейцину до 120% по сравнению с родительским штаммом СА13-8100. Кроме того, было подтверждено, что штамм СА13-8106 с введенной мутацией на основе АТСС 13032 дикого типа, также увеличивал продукцию лейцина до 135% по сравнению с диким типом.

На примере приведенных выше результатов можно подтвердить, что аминокислота в положении 156 аминокислотной последовательности ilvE (т.е. аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью) является важным положением для активности фермента ilvE.

Штамм СА13-8107 был депонирован 15 ноября 2019 года в Корейский центр культуры микроорганизмов (KCCM), международный депозитарий в соответствии с Будапештским договором, и ему был присвоен номер депонирования KCCM12630P.

3-3. Введение варианта ilvE в штаммы Corynebacterium glutamicum KCCM11661P и KCCM11662P и подтверждение продуктивности по лейцину

Рекомбинантный вектор pDC-ilvE(V156A), полученный в примере 3-1, трансформировали в Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (US 10351859 В2) и Corynebacterium glutamicum KCCM11662P (US 10351859 B2), которые являются продуцирующими лейцин штаммами, путем гомологичной рекомбинации на хромосоме. Два штамма представляют собой варианты, обладающие продуктивностью по лейцину в результате обработки Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС 14067 и Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG). Было подтверждено, что мутант был введен в ген ilvE посредством выполнения ПЦР для конечных трансформированных штаммов с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 с последующим анализом последовательности оснований. Рекомбинантные штаммы были названы Corynebacterium glutamicum KCCM11661P_ilvE_V_156А и Corynebacterium glutamicum KCCM11662P_ilvE_V156A, соответственно. Для подтверждения продуктивности по лейцину у штамма, выполняли культивирование в колбе таким же образом, как в Примере 2-2, и после завершения культивирования измеряли количество продуцируемого лейцина посредством способа с использованием ВЭЖХ и измеренные концентрации лейцина показаны в Таблице 3 ниже.

На примере приведенных выше результатов можно подтвердить, что аминокислота в положении 156 аминокислотной последовательности ilvE (т.е. аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью) является важным условием для активности фермента ilvE. В частности, было подтверждено, что, когда аминокислота в указанном положении выше была заменена другой аминокислотой, продуктивность по лейцину была улучшена.

На основе приведенного выше описания специалисту в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в другой конкретной форме без изменения его технического характера или существенных характеристик. Таким образом, следует понимать, что приведенный выше вариант осуществления является не ограничивающим, а иллюстративным во всех аспектах. Объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим ей описанием, и поэтому предполагается, что все изменения и модификации, которые подпадают в пределы формулы изобретения или эквиваленты таких пределов, должны быть охвачены формулой изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид, вовлеченный в продуцирование L-лейцина, в котором аминокислота валин (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена другой аминокислотой. Изобретение касается также полипептида, вовлеченного в продуцирование L-лейцина, в котором аминокислота валин (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности, имеющей 90% или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой. Изобретение касается также способа получения лейцина, включающего культивирование микроорганизма, трансформированного вектором, содержащим полипептид согласно изобретению. Изобретение позволяет получать L-лейцин с высокой степенью эффективности. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Полипептид, вовлеченный в продуцирование L-лейцина, в котором аминокислота валин (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена другой аминокислотой.

2. Полипептид по п. 1, где валин в положении 156 заменен на аланин.

3. Полипептид, вовлеченный в продуцирование L-лейцина, в котором аминокислота валин (V) в положении 156 от N-конца аминокислотной последовательности, имеющей 90% или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

4. Полипептид по п. 1, где указанный полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

5. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-4.

6. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 5.

7. Микроорганизм рода Corynebacterium, для продуцирования лейцина, содержащий по меньшей мере одно из полипептида по любому из пп. 1-4; полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид; и вектора, содержащего указанный полинуклеотид.

8. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 7, где указанный микроорганизм рода Corynebacterium продуцирует лейцин.

9. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 7, где указанный микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

10. Способ получения лейцина, включающий культивирование микроорганизма по п. 7 в среде.

11. Способ получения лейцина по п. 10, дополнительно включающий выделение или извлечение лейцина из указанного культивируемого микроорганизма или указанной среды.