Штамм "Юнити" вируса Canine mastadenovirus A аденовирусной инфекции собак 2 серотипа для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак 2 серотипа Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак 2 серотипа и контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против данного заболевания.

Известно два серотипа аденовирусной инфекции собак: аденовирусная инфекция собак 1 серотипа (CAV-1), поражающая большинство основных органов, вызывая, среди прочих заболеваний, гепатит, и аденовирусная инфекция собак 2 серотипа (CAV-2), вызывающая респираторные и кишечные заболевания [1, 2].

Вирус аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2) вызывает транзиторную и бессимптомную или легкую форму респираторного заболевания и остается ограниченным верхними дыхательными путями, вызывая ларинготрахеит, в присутствии других патогенов или у животного с ослабленным иммунитетом. Также CAV-2 может вызвать тяжелый некротизирующий бронхит и интерстициальную пневмонию [3]; связан с летальными случаями диареи [4] и неврологическими заболеваниями у собак [5].

Случаи заболевания CAV-2 спорадические, но отличаются регулярностью, несмотря на профилактическую вакцинацию животных, содержащихся в личном владении. Особенно часто случаи заболевания отмечаются после контакта собак на игровых площадках, выставках, соревнованиях [2, 6].

В настоящий момент семейство Adenoviridae подразделяется на следующие рода: Atadenovirus (аденовирусы со смещенным геномом в сторону высокого содержания А+Т, поражают различных жвачных, птиц и рептилий, а также сумчатых), Aviadenovirus (аденовирусы птиц), Ichtadenovirus (аденовирус рыб), Mastadenovirus (аденовирусы млекопитающих), Siadenovirus (аденовирусы, выделенные от птиц и лягушек), Testadenovirus (аденовирус рептилий, а именно черепах) [7].

В род Mastadenovirus включен пятьдесят один вид: Мастаденовирус летучих мышей А, В, С, D, Е, F, G, Н, I, J, Мастаденовирус крупного рогатого скота А, В, С, Мастаденовирус собак А, Мастаденовирус оленей В, Мастаденовирус дельфинов А, В, Мастаденовирус лошадей А, В, Мастаденовирус морских свинок А, Мастаденовирус человека А, В, С, D, Е, F, G, Мастаденовирус мышей А, В, С, Мастаденовирус овец А, В, С, Мастаденовирус широконосых обезьян А, Мастаденовирус полярных медведей А, Мастаденовирус свиней А, В, С, Мастаденовирус морских львов А, Мастаденовирус обезьян А, В, С, D, Е, F, G, Н, I, Мастаденовирус скунсов А, Мастаденовирус белок А, Мастаденовирус тупайи А [8].

Вид Canine mastadenovirus имеет один подвид А и два серотипа: 1 (вызывает аденовирусную инфекцию собак 1 серотипа, называемую «инфекционный гепатит собак») и 2 (вызывает аденовирусную инфекцию собак 2 серотипа, называемую «инфекционный ларинготрахеит собак»). Следует отметить, что наименование болезни «инфекционный ларинготрахеит собак» употребляется для обозначения комплекса респираторных болезней собак, в группу которых, помимо аденовирусной инфекции 2 серотипа, входят также Bordetella bronchiseptica (Bb), вирус собачьей чумы (CDV), собачий вирус герпеса (CHV) и вирус парагриппа собак (CPiV), вирус гриппа собак (CIV), респираторный коронавирус собак (CRCoV), пневмовирус собак (CnPnV), Mycoplasma cynos и подвид Streptococcus equi.

Штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа относится к сфере Varidnaviria, царству Bamfordvirae, типу Preplasmiviricota, классу Tectiliviricetes, отряду Rowavirales, семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine mastadenovirus А, серотипу 2.

Вирус попадает в организм различными путями: через органы дыхания, слизистые оболочки, поврежденные кожные покровы, а также вместе с частицами корма и питья. Распространителем инфекции являются не только больные животные, но и носители вируса, не имеющие внешних признаков заболевания (как домашние, так и дикие животные). Механизмы передачи инфекции следующие: аэрогенный, контактный, фекально-оральный. Наиболее восприимчивы к аденовирусной инфекции щенки, однако заболевание может развиться и у взрослых животных [9].

В современной литературе неоднократно упоминается, что штаммы вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа обладают перекрестной защитой к CAV-1 [2, 11]. Возможно использование инактивированного вируса CAV-2 при изготовлении вакцины, которая будет защищать и от CAV-1.

По данным ФГБУ «Центр ветеринарии» МСХ РФ за 2017-2021 гг., CAV-2 (инфекционный ларинготрахеит) занимает второе место по случаям заболеваемости собак в Российской Федерации (29,2%). CAV-2 распространен по всему миру и имеет тенденцию к изменению свойств и генных характеристик, поражает широкий спектр животных, включая собак, по всему миру [10, 11]. В связи с этим встает вопрос о необходимости разработки средств для вакцинопрофилактики, обеспечивающих надежную защиту от новых штаммов аденовирусной инфекции собак 1 и 2 серотипа.

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, которые применяются для производства средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «Mahattan LPV 3» [12, 13];

- штамм «V 197 серотип 2» [14];

- штамм «DK 13» [15];

- штамм «Ада» [16];

- штамм «CAV-2» [17].

Штамм «Ада» также входит в вакцины серии «Мультикан», производитель ООО «Ветбиохим», Россия [18]. Штаммы «Mahattan LPV 3», «V 197 серотип 2», «DK 13» и «CAV-2» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость и труднодоступны на данный момент.

Наиболее близким предполагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «Ада» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, который применяют для изготовления инактивированных вакцин и гипериммунных сывороток.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2), обладающих новыми биологическими и генетическими характеристиками, и пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики данного заболевания.

Указанная задача решена в результате депонирования нового штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, который может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак.

Изолят CAV-2, полученный из патологического материала №34, послуживший источником для получения штамма «Юнити», был выделен из образцов материала (соскоб из носа и ротоглотки), полученного от беспородной собаки, находящейся в частном владении в г. Владимир, в 2022 году.

Для получения штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали первично-трипсинизированную культуру клеток почки щенка. В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток и на перевиваемой культуре клеток почки собаки Мадина-Дерби (MDCK) из ранее выделенного изолята был получен штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, имеющий стабильные биотехнологические свойства и пригодный для изготовления диагностических препаратов и препаратов для специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток MDCK, что позволяет в промышленных масштабах получать вирусный материал штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа с титрами инфекционной активности от 3,75 до 5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Штамм «Юнити» депонирован во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №456 - деп / 23-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «Юнити» аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2) для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак.

При генетической идентификации полученного штамма «Юнити» аденовируса Canine mastadenovirus А и сравнительного анализа последовательности кДНК используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляют секвенирование.

Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3-параметрической классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X.

Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей Е3-гена к ДНК вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (822 н.о.) (Фиг. 2).

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Фотография вирионов штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа по данным электронной микроскопии;

Фиг. 2 - Филогенетическое древо для штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа;

Фиг. 3 - Состояние монослоя клеточной линии MDCK до (А) и после (Б1, Б2) репродукции штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов Е3-гена кДНК CAV-2 штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот Е3-гена кДНК CAV-2 штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа относится к типу Preplasmiviricota, классу Tectiliviricetes, отряду Rowavirales, семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine mastadenovirus А. Вирус безоболочечный, имеет икосаэдрическую форму, реплицируется в ядре. Диаметр составляет 70-90 нм. Капсид состоит из 252 зерен оболочки, из которых 240 являются гексонами, которые составляют поверхность икосаэдра. Остальные 12 - это пентоновые основания, которые расположены на вершине икосаэдра. Каждый из них имеет волокно, выходящее наружу, а в верхней части волокна имеется выпуклость [19]. Фотография вирионов штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа по данным электронной микроскопии представлена на фиг. 1. CAV-1 и CAV-2 имеют одинаковую структуру генома, диаметр, морфологические особенности и цитопатические особенности [20].

Антигенные свойства.

В антигенном отношении CAV-2 родственен вирусу CAV-1 [20]. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции микронейтрализации (РМН). Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РМН в перевиваемой культуре клеток MDCK. Инокуляция в организм животного суспензии вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа штамм «Юнити» сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови в титре от 3,5 log₂ SN₅₀ до 8,0 log₂ SN₅₀ y кроликов и от 4,0 log₂ SN₅₀ до 7,25 log₂ SN₅₀ у хорьков. Сывороточные антитела присутствуют у вакцинированных животных.

Устойчивость к внешним факторам.

Устойчив во внешней среде. При температуре 17°С инактивируется за 22-30 дней, при температуре 0-2°С - за 168-184 дня и при 1-8°С - за 246-263 дня. При замораживании, высушивании и консервировании в 50%-ном растворе глицерина не теряет своих свойств 3-5 лет. При 55°С вирус теряет вирулентность за 40-50 минут, при 100°С - за 1 минуту. 1-3%-ные растворы формалина, щелочи, лизола, фенола инактивируют вирус в течение 30 минут. Резистентен к действию УФ-излучения, эфира, хлороформа, кислот. Инактивируется в течение 3 минут при 60°С.Чувствителен к фенолу, йодидам, гидроксиду натрия.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - умеренно патогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при заражении в переднюю камеру глаза, внутривенно, интраперитонеально и орально.

Безвреден для кроликов и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток MDCK.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Условия хранения.

При хранении штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа в нативном состоянии при температуре минус 70±5°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес, а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 10 лет.

Биотехнологические характеристики.

Штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа репродуцируется в перевиваемой культуре клеток MDCK, а также в первично-трипсинизированных культурах клеток селезенки щенка и почки щенка. Не чувствителен к первичным или перевиваемым клеткам других животных (кошки, обезьяны, свиньи). Репродукция вируса в культуре клеток MDCK сопровождается специфическим цитопатическим действием, которое начинает проявляться через 24 часа и достигает пика через 36-48 часов. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток MDCK и на естественно восприимчивых животных - 2-4 месячных щенках собак. При культивировании штамма «Юнити» вирус накапливается в титре не менее 3,75 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики.

Штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа является линейным двухцепочечным ДНК-содержащим вирусом размером 26-45 т.п.н.

Сиаловая кислота имеет сайт связывания в верхней части выпуклости. Линейные двухцепочечные молекулы ДНК имеют размер 26-45 т.п.н. Геном характеризуется инвертированным концевым повтором размером от 36 до более 200 п.н., а 5'-концы связаны с концевым белком (TP). Капсид отвечает за тканевой тропизм, модифицирован для изменения тканевого тропизма (от собак к человеку) по сравнению с аденовирусом человека HAdV-5 [21]. Гексон несет антиген реакции связывания комплемента, общий для группы аденовирусов млекопитающих, а основание пентона представляет собой полностью растворимый гемагглютинин.

Геномы аденовирусов состоят из центрального блока, ориентированных вправо поздних генов от 52К до волокна, прерываемых на той же цепи блоком ранних генов в области Е3, а на противоположной цепи - генами Е2 в форме ДНК-связывающего белка (DBP) в область Е2А и претерминального белка (рТР) и ДНК-полимеразы (pol) в области Е2В. Правая концевая область занята генами Е4, а левая концевая область ранними генами Е1А и Е2В плюс два промежуточных гена (IX и IVa2).

Сплайсинг участвует в экспрессии. Все члены массива поздних генов (которые в значительной степени участвуют в формировании и структуре вирионов), от 52К справа до pVIII, а также волокна, сплайсируются от тройного лидера. Аналогичным образом ранние гены и один промежуточный ген скрещиваются. К ним относятся: Е1А, DBP, который сплайсируется из лидера, состоящего из двух нетранслируемых экзонов, контролируемых промотором Е2 (экспрессия также происходит из отдельного позднего промотора). рТР и pol сплайсируются из лидера, состоящего из двух нетранслируемых и одного транслируемого экзонов, контролируемых промотором Е2. IVa2, промежуточный ген, сплайсируется из короткого кодирующего лидера в pol и группы генов Е3 и Е4, каждая из которых инициируется одним промотором, так что проксимальный ген не сплайсируется, тогда как другие экспрессируются путем сплайсинга из соответствующего нетранслируемого лидера. Транскрипция Е1А, Е1В, Е3 и Е4, и, в меньшей степени, других генов, более сложная, потенциально приводящая через альтернативный сплайсинг к большому разнообразию РНК и белков. Инициирующий кодон для рТР расположен в коротком экзоне между pIIIa и III. Этот инициирующий кодон также используется для экспрессии pol.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Биологические и вирусологические исследования штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса к культурам клеток: перевиваемая MDCK, первично-трипсинизированные почка щенка и селезенка щенка. Для выделения вируса вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой первично-трипсинизированной культуры клеток почки щенка и экспонировали в течение 60 мин при температуре (37,0±0,5)°С. Затем вносили поддерживающую среду ПСП (или Игла) с добавлением 5% фетальной сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³). Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 72 ч, затем замораживали при минус (45,0±5,0)°С, после размораживания центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. После проведения пассажа в первично-трипсинизированной культуре клеток почки щенка вируссодержащий материал вносили на освобожденный от ростовой среды монослой перевиваемой культуры клеток MDCK и инкубировали в течение 60 мин при температуре (37,0±0,5)°С. Затем вносили поддерживающую среду ПСП (или Игла) с добавлением 5% фетальной сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³).

Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 36-48 ч (культура клеток MDCK) или до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, приводящим к появлению отдельных округлившихся, рефрактильных клеток, которые постепенно отторгаются от стекла. По мере развития вируса число клеток, подвергшихся дегенерации, увеличивается и образуются большие пустоты в монослое. По краям сохранившихся островков пораженные клетки концентрируются, образуя большие конгломераты, напоминающие грозди винограда. В культуре клеток через 20-30 часов после заражения образовались характерные внутриядерные включения, которые хорошо обнаруживаются при окраске препаратов или методом иммунофлюоресценции. В отличие от CAV-1, CAV-2 тесно расположен в типичной кристаллической структуре в ядре инфицированных клеток [20]. Число данных клеток увеличивается и достиг максимума через 36-48 часов, когда развиваются четко выраженные цитопатические изменения. Клеточный монослой до действия вируса представлен на фиг. 3А, после формирования ЦПД - на фиг. 3 - Б1 и Б2. При поражении не менее 70-80% площади монослоя (округление, отслоение от стекла, образование симпластов) культуральные флаконы замораживали при температуре минус (45,0±5,0)°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения контаминации и определения инфекционной активности вируса методом титрования в культуре клеток MDCK. Титрование вируса проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по титрованию вируса аденовироза собак микрометодом» [22]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1. Инфекционная активность вируса в культуре клеток MDCK составила 3,58±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в первично-трипсинизированной культуре клеток почки щенка 4,83±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в первично-трипсинизированной культуре клеток селезенки щенка 3,33±0,38 lg ТЦД₅₀/см³. Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа (CAV-2) к данным клеточным культурам. Первое проявление ЦПД вируса в культуре клеток MDCK наблюдалось через 24 ч культивирования, в первично-трипсинизированных культурах клеток почки щенка и селезенки щенка через 16-18 ч. В культуре клеток MDCK через 72 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от субстрата, собиралась в агрегаты разного размера, часть клеток деградировала до детрита. В культурах клеток почки щенка и селезенки щенка большая часть клеток отслаивалась от субстрата и деградировала через 24 ч.

Пример 2. Контроль стабильности биологической активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Контроль стабильности биологической активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток MDCK, почки щенка и селезенки щенка (табл.2). В ходе проведенных исследований установлено, что штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток MDCK, почки щенка и селезенки щенка проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 3,57±0,15 lg ТДЦ₅₀/см³, 4,25±0,62 lg ТДЦ₅₀/см³ и 3,35±0,13 lg ТДЦ₅₀/см³ соответственно.

Пример 3. Получение антигена штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Для приготовления антигена в двухсуточную культуру клеток MDCK, выращенную в культуральных флаконах с площадью рабочей поверхности 300 см², предварительно слив с них ростовую среду, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,01 ТЦД₅₀/кл. Флаконы помещали на 1 ч в термостат при температуре (37,0±0,5)°С для контакта культуры клеток с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСП (или среду Игла) с добавлением 5% сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³). Инфицированную культуру инкубировали при (37,0±0,5)°С до появления ЦПД вируса. При поражении площади монослоя не менее 70-80% культуральные флаконы подвергали замораживанию при температуре минус (45,0±0,5)°С. Стерильный инфицированный монослой дезагрегировали с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20±2)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляли с рабочей поверхности, затем, соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирали в общую емкость. Из собранного материала отбирали пробу для контроля. Контроль посевного материала штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа перед лиофилизацией осуществляли по показателю отсутствия контаминации грибами, бактериями и микоплазмами. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа проводили по ГОСТ 28085 [23]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [24]. Антиген в виде вируссодержащего материала с активностью не ниже 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ хранили при температуре не выше минус (20±2)°С и использовали для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Пример 4. Получение гипериммунной сыворотки против вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа штамма «Юнити».

Штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа использовали для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа. Для гипериммунизации животных применяли инактивированный штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, полученный по методике, указанной в примере 3.

Для инактивации штамма «Юнити» CAV-2 использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляли в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025% с экспозицией 24 часа при температуре (37,0±0,5)°С.

Кроликов разделили на группы по 3 головы и иммунизировали каждое животное в дозе 1,0 см³ внутримышечно по следующей схеме:

1) однократно, с обескровливанием через 35 дней после иммунизации;

2) двукратно с интервалом 21 день, отбор крови проводили на 21 сутки после второй иммунизации. Полученную сыворотку крови исследовали на наличие антител против вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа штамма «Юнити». Титр антител определяли в реакции микронейтрализации (РМН).

Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют, о том, что получены диагностические сыворотки со специфической активностью от 4,58±0,14 до 5,33±0,28 log₂ SN₅₀ в РМН после двукратной иммунизации.

Пример 5. Изучение антигенной активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа на кроликах и хорьках.

Для изучения антигенной активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа использовали вируссодержащий материал с биологической активностью, равной 4,0 lg ТЦД₅₀/см³, определенной до инактивации. Инактивацию проводили по методике, указанной в примере 4. Подопытным кроликам в количестве 5 голов вводили инактивированный материал в среднюю часть бедра в дозе 1,0 см³ двукратно с интервалом 21 сутки. Кроликов в количестве 5 голов оставили в качестве контроля. Титр антител к антигену CAV-2 в сыворотках крови кроликов определяли через 14 суток после второй иммунизации в РМН по общепринятой методике.

Подопытным хорькам в количестве 10 голов вводили инактивированный материал внутримышечно в среднюю часть бедра в дозе 1,0 см³ двукратно с интервалом 21 сутки. 5 голов хорьков оставили в качестве контроля. Титр антител к антигену CAV-2 в сыворотках крови хорьков определяли через 14 суток после второй иммунизации в РМН по общепринятой методике.

Результаты исследований антигенной активности штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа представлены в таблице 4, из которой следует, что средний титр антител у иммунизированных кроликов составил 4,91±0,38 log₂ SN₅₀, у хорьков - 5,80±0,46 log₂ SN₅₀.

Пример 6. Определение патогенности для собак штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Патогенность штамма «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа изучали на естественно восприимчивых животных (беспородные щенки в возрасте 2-3 мес). Животных разделили на две группы по 4 головы в каждой - подопытную и контрольную. Подопытным щенкам вводили внутривенно вируссодержащую культуральную жидкость в объеме 3,0 см³ с титром инфекционной активности 3,75 lg ТЦД₅₀/см³. Животным контрольной группы вводили внутривенно 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 3,0 см³. На 4 сутки после заражения у животных подопытной группы наблюдали характерные клинические признаки аденовирусной инфекции: снижение активности, отказ от корма, частый кашель, особенно при нажатии на трахею, при аускультации мелкопузырчатые хрипы в нижних долях легких. На 7 сутки гибели щенков не наблюдалось. Специфичность заболевания животных подтверждена исследованиями биоматериала посредством диагностического набора ИФА (производство Ingenasa, Испания).

Таким образом, штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, обладает высокой биологической и антигенной активностью, пригоден для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики и расширяет арсенал отечественных производственных штаммов CAV-2 - вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «Юнити» вируса Canine mastadenovirus А аденовирусной инфекции собак 2 серотипа для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак 2 серотипа»:

1. Шал дин Н.Н. Аденовирусная инфекция у собак. - URL: https://mosk-vet.ru/dis_ca/inf/art.php?ID=755, дата обращения 28.12.2022 г.).

2. G. Koptopoulos, Cornwell Н.J. / Аденовирусы собак: обзор // Вет. бюл. 51., 1981. С. - 135-142.

3. Alves CDBT, Granados OFO, Budaszewski RDF, Streck AF, Weber MN, Cibulski SP, Pinto LD, Ikuta N, Canal CW. Identification of enteric viruses circulating in a dog population with low vaccine coverage. Braz J Microbiol. 2018 Oct-Dec; 49(4): 790-794.

4. Pratelli A, Elia G, Martella A, et al.: 2002, M gene evolution of canine coronavirus in naturally infected dogs. Vet Rec 151: 758-761.

5. McElligott S, Collins PJ, Sleator RD, Martella V, Decaro N, Buonavoglia С, О'Shea H. Detection and genetic characterization of canine parvoviruses and coronaviruses in southern Ireland. Arch Virol. 2011 Mar; 156(3): 495-503.

6. Селиванов A.B., Уласов В.И. Инфекционный гепатит собак // Ветеринария - 1989, №5. - С. 69-71.

7. Genetic content and evolution of adenoviruses URL: https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/jgv/10.1099/vir.0.19497-0#tab2, дата обращения 11.01.2023 г.).

8. Taxon Details URL: https://ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=202102412, дата обращения 11.01.2023 г.).

9. Левтеров Дмитрий Евгеньевич. Патоморфология иммунных органов у собак при инфекционном гепатите: диссертация … кандидата ветеринарных наук: 16.00.02. - Санкт-Петербург, 2005. - 117 с.

10. ФГБУ «Центр ветеринарии» МСХ РФ за 2017-2021 гг., CAV-2 (инфекционный ларинготрахеит) - https://центр-ветеринарии.рф/о-nas/informatsiya/epizooticheskaya-obstanovka.

11. Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Мухин А.Н. и др. Диагностика и профилактика инфекционных болезней собак и кошек: руководство для практикующих ветеринарных врачей. Под ред. Т.И. Алипера. М.: ЗооВетКнига; 2017. 300 с.

12. Вангард Плюс 5 L4 CV. - URL: https://www.vidal.ru/veterinar/vangard-plyus-5-14-30427 (дата обращения 30.12.22 г.).

13. Нобивак DHPPi. - URL: https://www.vidal.ru/veterinar/nobivak-dhppi-29976, дата обращения 28.12.2022 г.).

14. Дюрамун Макс 5-CvK/4L. - URL: https://www.vidal.ru/veterinar/duramune-max-5-cvk-4l-28028 (дата обращения 30.12.22 г.).

15. Эурикан DHPPi2-LR URL: https://www.vidal.ru/veterinar/eurikan-dhppi2-lr-30230, дата обращения 12.11.2022 г.).

16. БИОВАК инструкция по применению. https://www.vidal.ru/veterinar/biovak-29738?ysclid=lgkgq2455s504720579.

17. Биокан DHPPi+LR. - URL: https://www.vidal.ru/veterinar/biokan-dhppilr-29742 (дата обращения 30.12.22 г.)

18. Вакцины серии «Мультикан» - https://areal-bio.com/upload/medialibrary/%D0%9C%D1%83%D0%BB%D1%8C%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D0%BD-%D1%80%D0%B5%D0%BA%D0%BB%D0%B0%D0%BC%D0%BD%D1%8B%D0%B9%20%D0%B1%D1%83%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82.

19. Yang, D., Kim, H., Lee, E., Yoo, J., Yoon, S., Park, J., et al. (2019a). Recharacterization of the Canine Adenovirus Type 1 Vaccine Strain Based on the Biological and Molecular Properties, jbv 49, 124-132.

20. Difference Analysis Between Canine Adenovirus Types 1 And 2 URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.854876/full, дата обращения 12.01.2023).

21. Seiradake, E., Henaff, D., Wodrich, H., Billet, O., Perreau, M., Hippert, C., et al. (2009a). The Cell Adhesion Molecule "CAR" and Sialic Acid on Human Erythrocytes Influence Adenovirus In Vivo Biodistribution. PloS Path. 5.

22. Методические рекомендации по титрованию вируса аденовироза собак микрометодом / А.А. Климова, А.А. Комарова, A.M. Киселев, Т.С. Галкина; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 11 с.

23. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

24. ГФ XIV, т. 2, с. 2997-3008 Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CAV-2 Uniti.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-02-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>485</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-02-21</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «Юнити» вируса аденовирусной

инфекции собак 2 серотипа для изготовления биопрепаратов для

диагностики и специфической профилактики вируса аденовирусной

инфекции собак 2 серотипа</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>822</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..822</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAV-2 </INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgctaccaaactgcaaatgagtctgcccacgggcctatttccaggccc

ctcaacgagatgcctcttcccaaaaaaaccataaatgcttccctcttctatcccgcctttctggagctgc

ccccacagtacagcaatgaccttagcaatgtgcgctggtataaagtagaccccagcggcttccaagccca

aaaaatctctaaagtcagaagcggaggcagaaaagagaacctgcatcccaactgggccttggttacctat

actggagaccttcttgtcttgcatgtctcgccaaacacccttggactgtggctggcagccgtgcagcatc

gcggggggcgcactaatttcattaccttcaacataactgtacccaactggcaacaaaatctagtaaccat

atttaatcaacacgagcccccaaaaaagggcgataattatgaggacagttttatggaatggactctgttt

aaaaagctcaaaaaagacttatttagagtaacttgcagagccaagtcaatattcccagagtgcaccctca

acatcacccgcgacggaactttcctgcttattggggatagcaagaagaccccctatgtcatcctgctgcc

cttttttgcaaaccccaaagaagacactccaattttaatggaaaaaagccattccatgcccgttgccata

cctgacactgcaatgcctgtatatatttccatcatgttttttattgtggccatgctagccaccctcagcc

ttctaatgggactaaacaacgaaaatcaggcccatgtagcttgtcaaataaacttacctaatttttgcta

agg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>272</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..272</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAV-2 </INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CYQTANESAHGPISRPLNEMPLPSVTINASLFYPAFLELPPQYSNDLSN

VRWYKVDPSGFQAQKISKVRSGGRKENLHPNWALVTYTGDLLVLHVSPNTLGLWLAAVQHRGGRTNFITF

NITVPNWQQNLVTIFNQHEPPKKGDNYEDSFMEWTLFKKLKKDLFRVTCRAKSIFPECTLNITRDGTFLL

IGDSKKTPYVILLPFFANPKEDTPILMALSHSMPVAIPDTAMPVYISIMFFIVAMLATLSLLMGLNNENQ

AHVACQINLPNFC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак 2 серотипа, семейства Adenoviridae, рода Mastadenovirus, вида Canine mastadenovirus А, серотипа 2, депонированного в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №456 - деп / 23-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки собаки Мадина-Дерби (MDCK). В перевиваемой культуре клеток MDCK в течение 72 часов инкубирования титр инфекционной активности вируса достигает значений 3,75±0,25 lg ТЦД₅₀/см³, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак 2 серотипа и для контроля антигенной активности вакцин против данного заболевания. 3 ил., 4 табл., 6 пр.

Штамм «Юнити» вируса аденовирусной инфекции собак Canine mastadenovirus А 2 серотипа семейства Adenoviridae рода Mastadenovirus, депонированный во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером №456 - деп / 23-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначен для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики аденовирусной инфекции собак 2 серотипа.