Способ опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма "ВГНКИ" с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против аденовируса собак, а именно к способу опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

Возбудитель аденовируса собак Canine Mastadenovirus (CAdV) распознает эндотелиальные клетки сосудов, паренхиматозные клетки печени и почек в качестве мишеней для репликации вируса [1, 2]. Заболевание более тяжело протекает у молодых животных. Передача происходит через контакт от животного к животному или опосредованно через контакт с инфекционной слюной, фекалиями, мочой или выделениями из дыхательных путей [2].

Диаметр возбудителя аденовируса собак составляет около 70-90 нм. Линейная двухцепочечная ДНК обернута белковой оболочкой. Нуклеиновая кислота вируса представлена молекулой двухцепочечной ДНК размером около 30500 п. н., которая кодирует белки orf 1 - orf 30 [3]. Важным для проведения молекулярно-биологического анализа является ген large T-antigen, который расположен в пределах генома 1888…222 п. н. и кодирует белок Е1 В с молекулярным весом 55 kDa.

Система мер для борьбы с аденовирусной инфекцией собак и ее профилактики предусматривает иммунизацию животных [4, 5]. Для этой цели применяют вакцинные препараты с использованием штамма «ВГНКИ». При их изготовлении вируссодержащее сырье исследуют на определение количества инфекционных единиц аденовируса собак для оценки его активности в клетках.

В 1,0 см³ суспензии вируса определяют вирусных частиц, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию вирионов, содержащих ДНК аденовируса собак [6-10].

Для определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки собаки породы Майдин-Дэрби (MDCK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [11]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) продолжительная процедура титрования, связанная с репродукцией вируса в клетках монослойной клеточной линии (не менее 72 ч); 2) субъективность при оценке результатов исследования относительно наличия специфического цитопатического действия вируса или неспецифических дегенеративных процессов клеток, не связанных в размножением вирусных частиц; 3) высокая стоимость клеточной линии MDCK как тест-системы и затраты на ее поддержание (применяется данная клеточная линия в течение ограниченного количества пассажей, пока имеет высокую чувствительность по отношению к аденовирусу собак); 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток MDCK микоплазмами, что может негативно влиять на оценку результатов исследования искомого показателя.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма ВГНКИ в вируссодержащих суспензиях в течение 2 часов, не требует использования дорогостоящих клеточных линий для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, исключает фактор субъективной оценки результатов исследования.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного и объективного экспресс-способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large Т-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

Разработанный способ дает возможность: 1) проводить анализ вируссодержащих суспензий для определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма ВГНКИ в течение 2 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для гена large T-antigen CAdV; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между количеством инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» (Vq CAdV, Virus quantification) и циклом количественной оценки (C_q), представленной в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9988) и эффективностью амплификации 99,45%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма ВГНКИ в сырье для вакцин с помощью разработанного способа (фиг. 1).

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Зависимость количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» (Vq CAdV, Virus quantification) и цикла количественной оценки (C_q) с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 (n=5, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки).

Фиг. 2 - Нуклеотидная последовательность прямого и обратного праймеров для ДНК CAdV.

SEQ ID NO:1 представляет нуклеотидную последовательность прямого праймера F-CAdV-Vq;

SEQ ID NO:2 представляет нуклеотидную последовательность прямого праймера R-CAdV-Vq.

Штамм «ВГНКИ» вируса аденовирусной инфекции собак депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №29 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

Заявляемый способ основан на: 1) выделении молекул ДНК CAdV с применением набора «ДНК-сорб» (РФ, ООО «Интерлабсервис»); 2) проведении амплификации специфического фрагмента гена large T-antigen CAdV с применение олигонуклеотидных праймеров F-CAdV-Vq и R-CAdV-Vq, а также флуоресцентного интеркалирующего красителя Pico 488; 3) проведение реакции амплификации с выявлением ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде логистической кривой; 4) определении количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9988) и эффективностью амплификации 99,45%.

В настоящее время метод амплификации двехцепочечной ДНК различных агентов применяют для индикации нуклеиновых кислот и проведения филогенетического анализа возбудителей различных инфекционных заболеваний, в том числе аденовируса собак [12, 13]. Для опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» ранее данный метод с применением разработанной системы олигонуклеотидных праймеров и красителя Pico 488 не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и позволяет выполнять анализ в 36 раз быстрее по сравнению с культуральным методом, что важно для сложного процесса производства вакцин против аденовирусной инфекции собак (вместо 72 ч для культурального метода - 2 ч с помощью разработанного способа).

В отличие от прототипа разработанный способ включает этапы выделения ДНК CAdV; проведения амплификации специфического фрагмента участка гена large T-antigen CAdV с применение праймеров F-CAdV-Vq и R-CAdV-Vq, а также флуоресцентного интеркалирующего красителя Pico 488; определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма ВГНКИ с помощью логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9988) и эффективностью амплификации 99,45%.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» до 2 ч (в 36 раз быстрее по сравнению с прототипом); исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применить предложенный способ для опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки реакции амплификации ДНК CAdV с помощью олигонуклеотидных праймеров, анализа флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Pico 488 и расчет количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с использованием разработанной логарифмической модели, представленной выше.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе анализа результатов реакции амплификации участка гена large T-antigen и применения разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» для опосредованного определения искомого показателя данного вируса в сырье для вакцин.

Технический результат изобретения заключается в применении способа на основе реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 для опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ», который является чувствительным и специфичным за счет применения олигонуклеотидных праймеров F-CAdV-Vq и R-CAdV-Vq, а также флуоресцентного интеркалирующего красителя Pico 488.

С целью определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» подготавливают контрольную панель стандартов аденовируса собак, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 lg ТЦД₅₀/мл, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и содержания вирусных частиц. В качестве отрицательного контроля применяют суспензию клеток линии MDCK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательного контроля, а также тестируемых проб выделяют ДНК с использованием набора «ДНК-сорб» (РФ, ООО «Интерлабсервис»).

На следующем этапе проводят реакцию амплификации участка гена large T-antigen для исследования контрольных образцов и проб. Рецептура реакционной смеси представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидных праймеров отражены в таблице 2.

Расчет дизайна специфических для CAdV праймеров проводили на основании нуклеотидных последовательностей гена large T-antigen CAdV для 19 штаммов и изолятов, опубликованных в базах данных GenBank [3].

В качестве гомологичных участку гена large T-antigen CAdV олигонуклеотидов используют:

F-CAdV-Vq-праймер (5'-TGATTGCAGGAGTACCACAGC-3'), R-CAdV-Vq-праймер (5'-CACAGCATGTGTGGACCGGA-3') (фиг. 2) в концентрации 6 пМ на реакцию. Для синтеза ампликонов применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,25 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 3,5 мМ. В качестве фермента реакции применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (3 ед.). Элюаты ДНК CAdV каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для ДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan. Длины F-CAdV-Vq-, R-CAdV-Vq-праймеров составляют 21 и 20 н.о. каждый, что соответствует требованиям. Праймеры очищены в полиакриламидном геле. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (Т_m) для олигонуклеотидных праймеров, что важно при подборе олигонуклеотидных праймеров для разработанного способа ДНК CAdV. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрации ионов К⁺и диметилсульфооксида (DMSO).

Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 169,6 ккал/моль, 27,3 ккал/моль, 442,8 кал/(К×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 171,6 ккал/моль, 28,0 ккал/моль, 447,2 кал/(К×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления, представленных олигонуклеотидов. Т_m для прямого и обратного праймеров составили 61,2 и 62,5°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 60°С. Для проведения реакции амплификации было решено проводить гибридизацию праймеров с участком гена large T-antigen при температуре 60°С.

Последовательности олигонуклеотидных праймеров проверяли на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот аденовируса собак. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для представленных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Перед проведением реакции амплификации осуществляют прогрев смеси при температуре 98°С в течение 3 мин. для предварительной денатурации.

Реакция амплификации включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг праймеров и элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 98°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию проводят в совмещенном режиме при температуре 60°С в течение 35 с, что оптимизирует реакцию по времени анализа.

Результаты реакции амплификации анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f(C_q). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической двухцепочечной ДНК-матрицы CAdV кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которым соответствуют логистической кривой, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует логистическая кривая в виде графика, приближенного к экспоненте.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и количеством инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма ВГНКИ в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции.

На основе разработанной модели рассчитывают количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцины и цикла количественной оценки в виде логарифмической функции.

Для выявления зависимости количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцины и цикла количественной оценки подготавливали контрольную панель стандартов аденовируса собак, в качестве которых использовали лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 lg ТЦД₅₀/мл, которые разводили 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и содержания вирусных частиц. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток линии MDCK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательного контроля, а также тестируемых проб выделяли ДНК с использованием набора «ДНК-сорб» (РФ, ООО «Интерлабсервис»).

Проводили реакцию амплификации для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(C_q). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и количеством инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг.1 и выражены в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9988) и эффективностью амплификации 99,45%.

Предложенная модель позволяет опосредованного определить количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью разработанного способа.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального CAdV штамма «ВГНКИ» с титрами инфекционной активности 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 lg ТЦЦ50/МЛ, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CAdV с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦЦ₅₀/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 5 повторностях. Этап элюирования ДНК и постановку реакции амплификации проводили, как описано выше.

Средние значения циклов количественной оценки для проб №1-6 составляли 19,58±0,01, 17,77±0,01, 16,03±0,01, 14,48±0,01, 12,77±0,01, 11,10±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией: lg Vq CAdV=-0,304×C_q+10,903, рассчитали средние значения количеств инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» для проб №1-6, которые составили 4,95; 5,50; 6,03; 6,50; 7,02; 7,53 lg ТЦЦ50/МЛ, соответственно. Для положительного контроля значение цикла количественной оценки составило 12,84±0,01, что соответствовало количеству инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ», равному 7,00 lg ТЦД₅₀/мл. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CAdV в данных образцах. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488. Таким образом, разработанный способ позволяет рассчитать количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 315 суспензий культурального CAdV штамма «ВГНКИ» с количествами инфекционных единиц от 1,00 до 8,00 lg ТЦД50/МЛ. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CAdV штамма «ВГНКИ» с количеством инфекционных единиц 7,00 lg ТПД₅₀/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку реакции амплификации проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией: lg Vq CAdV=-0,304×C_q+10,903, с получением значений T_СAdv для каждой из 315 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 12,84±0,01, что соответствовало количеству инфекционных единиц штамма «ВГНКИ» CAdV, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/мл. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CAdV в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали с помощью разработанного способа. Выявили, что полученные данные коррелировали с со значениями стандартов на 99,93-100,00% для 9,0-5,0 lg ТЦД₅₀/мл (n=63), на 98,02-99,92% для 4,9-4,0 lg ТЦД₅₀/мл (n=63), на 97,88-99,03% для 3,9-2,0 lg ТЦД₅₀/мл (n=63), на 97,09-98,87% для 2,0-1,5 lg ТЦД₅₀/мл (n=63), на 96,01-98,56%о для 1,4-0,5 lg ТЦД₅₀/мл (n=63). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности определять количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 подготавливали серию стандартов CAdV штамма «ВГНКИ» с количествами инфекционных единиц, равными 1,00-9,00 lg ТЦД₅₀/мл с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/мл. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы выделения ДНК и постановку реакции амплификации, как описано выше. Выявлено, что с достоверностью 96,01-100,00%) разработанным способом определены количества инфекционных частиц CAdV штамма «ВГНКИ» со значениями от 0,5 до 9,0 lg ТЦЦ₅₀/мл. При изготовлении вакцин применяют вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса≥4,00 lg ТЦД₅₀/мл. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности CAdV штамма «ВГНКИ» составляла 98,02-100,00%.

Аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488 составляет не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 96,01%.

Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large Т-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488.

При анализе специфичности способа опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488, исследовали суспензии CAdV, а также возбудителей ящура, бешенства, коронавирусного энтерита собак и чумы плотоядных. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 4,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (табл. 5). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к аденовирусу собак и может быть использован для его количественного определения в сырье для вакцин.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность исключить вероятность контаминации в ходе реакции и субъективность при учете результатов анализа; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцин в 36 раз по сравнению с прототипом (до 2 ч); увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ». В предлагаемом изобретении между количеством инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» (Vq CAdV) и циклами количественной оценки (C_q) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9988) и эффективностью амплификации 99,45%.

Разработанная логарифмическая модель дает возможность определять количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для производства вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности рассчитывать количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин на основе разработанного способа.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и детекции флуоресценции красителя Pico 488»:

1. Akerstedt J., Lillehaug A., Larsen I. L., Eide N. E., Arnemo J. M., Handeland K. (2010). Serosurvey for Canine Distemper Virus, Canine Adenovirus, Leptospira Interrogans, and Toxoplasma Gondii in Free-Ranging Canids in Scandinavia and Svalbard. J. Wildl. Dis. 46, 474^180. doi: 10.7589/0090-3558-46.2.474.

2. Choi J. W., Lee H. K., Kim S. H., Kim Y. H., Lee К. K., Lee M. H., et al.. (2014). Canine Adenovirus Type 1 in a Fennec Fox (Vulpes Zerda). J. Zoo Wildl. Med. 45, 947-950. doi: 10.1638/2013-0286.1.

3. GenBank. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/PP027962.l. (Дата обращения: 14.05.2024).

4. Balboni A., Mollace C., Giunti M., Dondi F., Prosperi S., Battilani M. (2014). Investigation of the Presence of Canine Adenovirus (CAdV) in Owned Dogs in Northern Italy. Res. Vet. Sci. 97, 631-636. doi: 10.1016/j.rvsc.2014.10.010.

5. Dowgier G., Lahoreau J., Lanave G., Losurdo M., Varello K., Lucente M. S., et al.. (2018). Sequential Circulation of Canine Adenoviruses 1 and 2 in Captive Wild Carnivores, France. Vet. Microbiol. 221, 67-73. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.05.025.

6. Fishman В., Scarnell J. (1976). Persistence of Protection After Vaccination Against Infectious Canine Hepatitis Virus (CAV/1). Vet. Rec. 99, 509. doi: 10.1136/vr.99.25-26.509.

7. Balboni A., Musto C, Kaehler E., Verin R., Caniglia R., Fabbri E., et al.. (2019). Genetic Characterization of Canine Adenovirus Type 1 Detected by Real-Time Polymerase Chain Reaction in an Oral Sample of an Italian Wolf (Canis Lupus). J. Wildl. Dis. 55, 737-741. doi: 10.7589/2018-08-206.

8. Balboni A., Verin R., Morandi F., Poli A., Prosperi S., Battilani M. (2013). Molecular Epidemiology of Canine Adenovirus Type 1 and Type 2 in Free-Ranging Red Foxes (Vulpes Vulpes) in Italy. Vet. Microbiol. 162, 551-557. doi: 10.1016/j.vetmic.2012.11.015.

9. Bass E. P., Gill M. A., Beckenhauer W. H. (1980). Evaluation of a Canine Adenovirus Type 2 Strain as a Replacement for Infectious Canine Hepatitis Vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc. 177, 234-242.

10. Decaro N., Martella V., Buonavoglia C. (2008). Canine Adenoviruses and Herpesvirus. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 38, 799-814. doi: 10.1016/j.cvsm.2008.02.006.

11. Buonavoglia C, Martella V. (2007). Canine Respiratory Viruses. Vet. Res. 38, 355-373. doi: 10.105l/vetres:2006058.

12. Chaturvedi U., Tiwari A. K., Ratta В., Ravindra P. V., Rajawat Y. S., Palia S. K., et al.. (2008). Detection of Canine Adenoviral Infections in Urine and Faeces by the Polymerase Chain Reaction. J. Virol. Methods 149, 260-263. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.01.024

13. Balboni A., Dondi F., Prosperi S., Battilani M. (2015). Development of a SYBR Green Real-Time PCR Assay With Melting Curve Analysis for Simultaneous Detection and Differentiation of Canine Adenovirus Type 1 and Type 2. J. Virol. Methods 222, 34^10. doi: 10.1016/j.jviromet.2015.05.009.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CAdV - Pico

488.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-06-06">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-06</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>574</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-06</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма

ВГНКИ с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen и

детекции флуоресценции красителя Pico 488</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAdV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgattgcaggagtaccacagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAdV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacagcatgtgtggaccgga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen с применением олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для участка гена large Т-antigen, и проведением детекции флуоресценции красителя Pico 488. Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности рассчитывать количество инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» в сырье для вакцин на основе разработанного способа с применением оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров для участка гена large T-antigen CAdV и разработанной логарифмической модели. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения количества инфекционных единиц аденовируса собак вакцинного штамма «ВГНКИ» с помощью реакции амплификации участка гена large T-antigen с применением олигонуклеотидных праймеров: F-CAdV-Vq-праймер с дизайном 5'-TGATTGCAGGAGTАССACAGC-3', R-CAdV-Vq-праймер с дизайном 5'-CACAGCATGTGTGGACCGGA-3', рассчитанных для участка гена large Т-antigen, и проведением детекции флуоресценции красителя Pico 488; с применением логарифмической функции: lg Vq CAdV=-0,304×C_q+10,903, с достоверностью аппроксимации, равной 0,9988, и эффективностью амплификации 99,45%.

2. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается до 2 ч и аналитическая чувствительность составляет не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/мл.