Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.

Инфекционные респираторные болезни собак возникают преимущественно у животных, содержащихся группами, в том числе в приютах, питомниках и ветеринарных лечебницах. Несколько исследований по оценке естественных вспышек заболеваний продемонстрировали сложную этиологию и инфицирование различными вирусами и бактериями [1].

Аденовирусные инфекции собак проявляются в виде двух самостоятельных болезней: инфекционного гепатита, вызываемого аденовирусом собак серотипа 1 (CAV-1), и аденовироза, вызываемого аденовирусом собак серотипа 2 (CAV-2) [2].

Первым детально описал этиологию и симптомы CAV-1 шведский ученый Рубарт (1947), именем которого иногда и называют болезнь [3].

Инфекционный гепатит (CAV-1) (заразное воспаление печени собак, болезнь Рубарта, вирусный гепатит) - это остроконтагиозное заболевание, протекающее с явлениями лихорадки, воспалительных процессов слизистых оболочек глаз, носовой полости, желудочно-кишечного тракта, печени и желчного пузыря, сопровождающегося иногда нарушением деятельности центральной нервной системы. Вирус инфекционного гепатита собак относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine Mastadenovirus (CAV-1) [4].

Вирионы CAV-1, как и все аденовирусы, представляют собой изометрические частицы кубического типа симметрии с диаметром вириона 70-90 нм. На вершинах икосаэдра имеются отростки (фиберы). Капсид вириона включает 252 капсомера без супаркапсидной оболочки. Капсид содержит 12 структурных белков. Имеется также белок сердцевины, связанный с вирионной ДНК. Нуклеиновая кислота вириона представлена двуспиральной линейной молекулой ДНК размером около 30 500 п.н., которая кодирует белки orf 1-orf 30 [5, 6]. В геноме вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 выделяют различные консервативные области, в частности, ген, ответственный за синтез белка orf 16 (позиции в геноме 16757…19474 п.н.).

Антигенного родства вируса CAV-1 с аденовирусом человека не обнаружено. Штаммы вируса CAV-1, выделенные в разных регионах страны, антигенно-родственны. Вирус содержит преципитирующий, гемагтлютинирующий и комплементсвязывающий антигены и индуцирует образование соответствующих антител. Штаммы CAV-1 успешно репродуцируются в клеточных линиях почки щенков собак, песцов, лисиц [7, 8]. Из перевиваемых культур к этому вирусу высокочувствительна культура клеток почки собаки Мадина-Дарби MDCK (Madin Darbey canine kidney). При использовании данной клеточной линии цитопатическое действие достигает 95-100% через 48 ч и характеризуется округлением клеток, образованием конгломератов, напоминающих гроздья винограда. В клетках обнаруживаются внутриядерные тельца-включения. Большинство эпизоотических штаммов вируса CAV-1 обладают гемагглютинирующей активностью в отношении эритроцитов морской свинки и человека [9, 10, 11].

Система мер борьбы с инфекционным гепатитом собак генотипа CAV-1 и его профилактики предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [12, 13, 14].

Для иммунизации щенков применяют различные вакцины против инфекционного гепатита генотипа CAV-1 у собак [15, 16]. При изготовлении данных вакцин вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра инфекционной активности для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих ДНК в активном состоянии.

Традиционно для определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита генотипа CAV-1 применяют метод титрования в монослойной перевиваемой клеточной линии почки собаки Мадина-Дарби (MDCK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [10]. Данный метод имеет некоторые ограничения в применении, а именно: 1) длительная процедура анализа, связанная с развитием цитопатического действия; 2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа; 3) высокая стоимость клеточной линии MDCK как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток MDCK.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по циклу количественной оценки Cq.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, позволяет определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин в течение 3 часов, не требует использования клеточной линии для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральной вакцины методом ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового опосредованного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин при использовании метода ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса в сырье для вакцины до 3 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого материала; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для orf 16-гена вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (T_CAV-1) и циклом количественной оценки (Cq), представленной в виде логарифмической функции:

lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность прямого, обратного праймеров и молекулярного ДНК-зонда при выравнивании с ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. Примечание: используя выравнивания других изолятов и производственных штаммов получили тот же дизайн олигонуклеотидов.

Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (T_CAV-1) и величины цикла количественной оценки (Cq) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq (n=12, отмечены точки, отображающие средние значения Cq).

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Заявляемый способ основан на:

1) элюировании ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта;

2) амплификации специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM (λ_max флуоресценции = 520 нм) и тушителем свечения RTQ-1 (λ_max поглощения = 520 нм);

4) проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте;

5) определении титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%.

В настоящее время ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя инфекционного гепатита собак. Для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины с помощью метода ПЦР в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап элюирования ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта; амплификацию специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1; проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; определение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CAV-1 до 3 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки Cq нуклеиновой кислоты вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в ПЦР режиме реального времени и расчет титра инфекционной активности данного вируса с использованием разработанной логарифмической модели зависимости цикла количественной оценки и титра.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок orf 16-гена, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины цикла количественной оценки (Cq) и титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (T_CAV-1) (n=12) (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности вируса инфекционнего гепатита собак генотипа CAV-1 подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии возбудителя инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток MDCK, не зараженную вирусом.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с использованием 5 М раствора гуанидинизотиоцианата (соотношение пробы и ГТЦ=1/5) в процессе детергирования на стекловолокнистых фильтрах в течение 10 мин и последующим трехкратным промывании с использованием 80%-ного раствора изопропилового спирта (по 500 мкл на пробу).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей гена orf 16 штаммов вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, опубликованных в базах данных GenBank и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

В качестве гомологичных участку гена orf 16 олигонуклеотидов используют:

CAV-1-T-F-праймер (5'-CGTAATGGAAACCTAGGGG-3'),

CAV-1-T-R-праймер (5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGG-3') и

CAV-1-Т-Pb-зонд (5'-FAM-CCAATCATCTCAACTAAATGCCGTG-RTQ1-3') (фиг. 1) в концентрации 5 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5×), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5×10^-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1,3%). В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 3 мМ. В качестве катализатора ПЦР в режиме реального времени применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты ДНК каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [14]. Длины CAV-1-T-F-праймер, CAV-1-T-R-праймер и CAV-1-Т-Pb-зонд составляют 19, 18 и 25 н.о., что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 59,01,9; 5493,6; 7570,0, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RTQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RTQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод учета концентрации солей в буферном растворе и метод ближайших соседей.

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 158,1 ккал/моль, 23,8 ккал/моль, 471 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 142,1 ккал/моль, 21,0 ккал/моль, 374,3 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного ДНК-зонда - 198,9 ккал/моль, 31,7 ккал/моль, 523,1 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 49, 49 и 57°С, соответственно.

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) T_m для прямого, обратного праймеров и зонда составили 57, 51 и 64°С.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 55°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком orf 16-гена ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 при температуре 55°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот CAV-1. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4. Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 55°С в течение 17 с, элонгацию - при температуре 60°С в течение 20 с (табл. 4). Количество циклов количественной оценки для амплификации процесса составило 40.

Данные ПЦР в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки Cq, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f(Cq). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1), где k - угловой коэффициент в зависимости C_t=-k×lg T_CAV-1+b, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин и цикла количественной оценки Cq.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины и цикла количественной оценки Cq подготавливали контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не содержащую посторонней микрофлоры.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли ДНК, как описано выше. Проводили ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки. Устанавливали зависимость между Cq и титром инфекционной активности вируса в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции:

lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 12 повторностях. Этапы выделения ДНК, и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше.

Средние значения циклов количественной оценки для проб №1-6 составляли 9,31±0,01, 8,48±0,02, 7,64±0,02, 6,81±0,01, 5,98±0,01, 5,14±0,02, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595, рассчитали средние значения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 для проб №1-6, которые составили 6,49; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,74 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,64±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в данных образцах.

Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии MDCK. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=12). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Таким образом, разработанный способ позволяет оценивать титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 210 суспензий культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595 с получением значений T_CAV-1 для каждой из 210 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,64±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в исследуемых пробах.

Анализируемые пробы и контроли также исследовали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии MDCK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со стандартными значениями на 99,57-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=42), на 98,13-99,56% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=42), на 95,41-98,14% для 3,9-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=84), на 94,21-97,56% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=42). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин.

Пример 4. Оценка аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.

При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq подготавливали серию стандартов вируса с T_CAV-1, равными 1,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано выше. Подтверждено, что достоверность проводимого анализа с помощью разработанного способа составляет 99,57-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³, на 98,13-99,56% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³, на 95,41-98,14% для 3,9-1,5 lg ТЦД₅₀/см³, на 94,21-97,56% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅₀/см³. При изготовлении вакцин применяют вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥6,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 составляла 99,57-100%. Аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 94,21%.

Пример 5. Оценка специфичности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.

При оценке специфичности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, исследовали суспензии вируса инфекционного гепатита собак генотипов CAV-1 и CAV-2, калицивируса FCV, вируса бешенства RabV, альфа-коронавируса собак CCoV. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,01 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к вирусу инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 и может быть использован для его количественного определения.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность исключить вероятность контаминации в ходе реакции; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцины до 3 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (T_CAV-1) и циклом количественной оценки (Cq) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq»:

1. Buonavoglia С, Martella V. Canine respiratory viruses. Vet Res 2007; 38: 355-373.

2. Erles K, Shiu KB, Brownlie J. Isolation and sequence analysis of canine respiratory coronavirus. Virus Res 2007; 124: 78-87.

3. Schoehn G, El Bakkouri M, Fabry CM et al Three-dimensional structure of canine adenovirus serotype 2 capsid. J Virol 2008; 82: 3192-203.

4. Carlton WW, McGavin MD. Thomson's Special Veterinary Pathology. St. Louis: Mosby, 1995; 125-195.

5. Damián M, Morales E, Salas G, Trigo FJ. Immunohistochemical detection of antigens of distemper, adenovirus and parainfluenza viruses in domestic dogs with pneumonia. J Comp Pathol 2005; 133: 289-293.

6. Benetka V, Weissenböck H, Kudielka I, Pallan C, Rothmüller G, Möstl K. Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec 2006; 158: 91-94.

7. Yoon SS, Park JW, Jean YH, Kim HJ, Han B, Han HR. Prevalence of lymphocyte nuclear pockets in Holstein-Friesian dairy cattle infected with bovine leukemia virus in Korea. Asian-Aust J Anim Sci 2005; 18: 879-883.

8. Hu RL, Huang G, Qiu W, Zhong ZH, Xia XZ, Yin Z. Detection and differentiation of CAV-1 and CAV-2 by polymerase chain reaction. Vet Res Commun 2001; 25: 77-84.

9. Ditchfield J, Macpherson LW, Zbitnew A. Association of Canine Adenovirus (Toronto A 26/61) with an Outbreak of Laryngotracheitis ("Kennel Cough"): A Preliminary Report. Can Vet J 1962; 3: 238-47.

10. Yoon KB, Kang MI, Park NY, Han DU. Seroepidemiological survey on canine distemper, canine parvovirus, canine coronavirus, canine adenovirus type 2, canine parainfluenzavirus of dogs by indirect immunofluorescent test. Korean J Vet Res 1995; 35: 75-85.

11. Chvala S, Benetka V, Möstl K, Zeugswetter F, Spergser J, Weissenböck H. Simultaneous canine distemper virus, canine adenovirus type 2, and Mycoplasma cynos infection in a dog with pneumonia. Vet Pathol 2007; 44: 508-12.

12. Ducatelle R, Thoonen H, Coussement W, Hoorens J. Pathology of natural canine adenovirus pneumonia. Res Vet Sci 1981; 31: 207-12.

13. Grad R, Sobonya RE, Witten ML et al Localization of inflammation and virions in canine adenovirus type 2 bronchiolitis. Am Rev Respir Dis 1990; 142: 691-699.

14. McCandlish IA, Thompson H, Cornwell HJ, Wright NG. A study of dogs with kennel cough. Vet Rec 1978; 102: 293-301.

15. Shahrabadi MS, Yamamoto T. Cytoplasmic inclusions in canine cells infected with infectious canine laryngotracheitis (ICL) adenovirus. Can J Microbiol 1975; 21: 1421-1427.

16. Chouinard L, Martineau D, Forget C, Girald C. Use of polymerase chain reaction and immunohistochemistry for detection of canine adenovirus type 1 in formalin fixed, paraffin embedded liver of dogs with chronic hepatitis or cirrhosis. J Vet Diagn Invest 1998; 10: 320-325.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Технический результат заключается в разработке высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральной вакцины методом ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq с целью устранения вышеуказанных недостатков. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, включающий следующие стадии:

- элюирование ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта;

- проведение амплификации специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1: CAV-1-T-F-праймер с дизайном 5'-CGTAATGGAAACCTAGGGG-3', CAV-1-T-R-праймер с дизайном 5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGG-3' и CAV-1-T-Pb-зонд с дизайном 5'-FAM-CCAATCATCTCAACTAAATGCCGTG-RTQ1-3';

- расчет цикла количественной оценки Cq по данным ПЦР в режиме реального времени;

- определение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg T_CAV-1=-0,2979×C_t+9,2595 с достоверностью аппроксимации 0,9941 и эффективностью амплификации 99,38%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 3 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³.