Способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/686 C12Q1/6806 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против мастаденовируса собак, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Возбудитель мастаденовируса собак Canine Mastadenovirus (CAdV) распознает эндотелиальные клетки сосудов, паренхиматозные клетки печени и почек в качестве мишеней для репликации вируса [1].

Заражение мастаденовирусом собак было описано во всем мире у нескольких видов млекопитающих. Репликация вируса в эндотелиальных клетках сосудов и гепатоцитах приводит к развитию острого некрогеморрагического гепатита. Заболевание более тяжелое протекает у молодых животных [2]. Передача происходит через контакт от животного к животному или опосредованно через контакт с инфекционной слюной, фекалиями, мочой или выделениями из дыхательных путей.

Собаки, рыжие лисы, волки и койоты очень восприимчивы к данной инфекции. Данный вирус также обнаруживали у европейских рыжих лисиц (Vulpes vulpes) и островных лисиц (Urocyon littoralis) [1]. Антитела к CAdV были обнаружены у свободноживущих наземных хищников и морских млекопитающих на Аляске и в Канаде, включая черных медведей (Ursus americanus), белых медведей (Ursus maritimus), волков (Canis lupus), моржей (Odobenus rosmarus) и сивучей (Eumetopias jubatus) [2].

Диаметр возбудителя мастаденовируса собак составляет примерно около 70-90 нм, а форма - икосаэдрическая. Линейная двухцепочечная ДНК обернута белковой оболочкой. Капсид состоит из 252 звеньев оболочки, из них 240 гексонов, составляющих поверхность икосаэдра. Остальные 12 представляют собой пентонные основания, расположенные на вершине икосаэдра [3].

Нуклеиновая кислота вируса представлена молекулой двуцепочечной ДНК размером около 30 500 п.н., которая кодирует белки orf 1-orf 30 [3]. Карта генома CAdV показаны на фиг. 1. Инвертированные терминальные повторы (ITR) жизненно важны для репликации вируса. Трансформация клеток представляет собой многоэтапный процесс, регулируемый взаимодействием нескольких продуктов аденовирусных генов, закодированных в ранних областях 1 (Е1) и 4 (Е4). Е1 может участвовать в трансформации клеток и стимулировать/ингибировать экспрессию клеточных и вирусных генов. Е3 не является важной областью для репликации аденовируса, но продукты гена Е3 играют важную роль в ингибировании противовирусной иммунной защиты хозяина in vivo. Важным для проведения молекулярно-биологического анализа является ген hexon, который расположен в пределах генома 16757…19474 п.н.

Система мер для борьбы с мастаденовирозом собак и его профилактики предусматривает иммунизацию животных [4, 5]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности CAdV для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество тканевых цитопатических доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию вирионов, содержащих ДНК мастаденовируса собак [6-10].

Для определения титра инфекционной активности CAdV применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки собаки породы Майдин-Дэрби (MDCK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [11]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с поражением клеток возбудителем заболевания; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии MDCK как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток MDCK.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Предложенный способ является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности CAdV в вируссодержащих суспензиях в течение 2,5 часов, не требует использования культуры клеток для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, исключает фактор субъективной оценки результатов исследования.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, быстрого и объективного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CAdV до 2,5 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для hexon-гена CAdV; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности мастаденовируса собак (T_CAdV) и циклом количественной оценки (C_q), представленной в виде логарифмической функции:

lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9965) и эффективностью амплификации 99,33%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин с помощью разработанного способа (фиг. 2).

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Карта генома мастаденовируса собак (модель).

Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности мастаденовируса собак (T_CAdV) и цикла количественной оценки (C_q) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки).

Фиг. 3 - Нуклеотидная последовательность прямого, обратного праймеров и молекулярного зонда для ДНК CAdV.

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность hexon-гена ДНК мастаденовируса собак;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых hexon-геном мастаденовируса собак.

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин с помощью ПЦР в режиме реального времени. Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании ДНК CAdV с применением 3М раствора гуанидинтиоцианата, 75% раствора этилового спирта и 80% раствора изопропилового спирта; 2) проведении амплификации специфического фрагмента hexon-гена CAdV с применение оригинальных специфических праймеров CAdV-T-F17638, CAdV-T-R17702, а также молекулярного зонда CAdV-T-P17667, меченого флуоресцентным красителем FAM (λ_max флуоресценции=520 нм) и тушителем свечения RTQ-1 (λ_maxпоглощения=520 нм); 3) проведение реакции амплификации с выявлением ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде логистической кривой; 4) определении титра инфекционной активности CAdV с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9965) и эффективностью амплификации 99,33%.

Молекулярные методы диагностики значительно улучшились за последние годы, что дает огромный потенциал для их применения в клинической диагностике, где требуется более быстрое и точное выявление инфекционных возбудителей [12].

В настоящее время метод ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот и проведения филогенетического анализа различных инфекционных агентов, в том числе мастаденовируса собак [12, 13]. Для опосредованного определения титра инфекционной активности CAdV ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этапы экстрагировании ДНК CAdV с применением 3М раствора гуанидинтиоцианата, 75% раствора этилового спирта и 80% раствора изопропилового спирта; проведения амплификации специфического фрагмента hexon-гена CAdV с применение оригинальных специфических праймеров CAdV-T-F17638, CAdV-T-R17702, а также молекулярного зонда CAdV-T-P17667, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1; осуществления ПЦР и определения титра инфекционной активности CAdV с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CAdV до 3 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки реакции амплификации ДНК CAdV в ПЦР режиме реального времени с помощью оригинальных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда и расчет титра инфекционной активности данного вируса с использованием разработанной логарифмической модели.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР в режиме реального времени, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок hexon-гена CAdV, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности мастаденовируса собак для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости титра инфекционной активности мастаденовируса собак (T_CAdV) и величины цикла количественной оценки (C_q) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки) (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности CAdV подготавливают контрольную панель стандартов мастаденовируса собак, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток MDCK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с использованием 3М раствора гуанидинтиоцианата (соотношение пробы и детергента=1/3) в процессе детергирования на стекловолокнистых фильтрах в течение 10 мин и последующим трехкратным промывании с использованием 75%-ного раствора этилового спирта и 80%-ного раствора изопропилового спирта (по 500 мкл на пробу).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2.

Расчет дизайна праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей hexon-гена CAdV для 17 штаммов и изолятов, опубликованных в базах данных GenBank [3].

В качестве гомологичных участку hexon-гена мастаденовируса собак олигонуклеотидов используют:

CAdV-T-F17638-праймер(5'-CAATAGTAATGGAAACCTAGG-3'),

CAdV-T-R17702-праймер(5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGCAA-3') и

CAdV-T-P17667-зонд(5'-FAM-CGGGTCAATCATCTCAAC-RTQ1-3') (фиг.3) в концентрации 5 nM на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,20 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 2,5 мМ. В качестве катализатора ПЦР в режиме реального времени применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты ДНК CAdV каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для ДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan. Длины CAdV-T-F17638, CAdV-T-R17702 и CAdV-T-P17667 составляют 21, 20, 18 н.о. каждый, что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 6487,3; 6080,0; 5443,6, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RTQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RTQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе олигонуклеотидных праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК CAdV. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO).

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 159,5 ккал/моль, 23,0 ккал/моль, 424,1 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 157,9 ккал/моль, 24,1 ккал/моль, 415,2 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного зонда - 146,0 ккал/моль, 21,8 ккал/моль, 384,4 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 55, 54, 54°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 60°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком hexon-гена CAdV при температуре 60°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот мастаденовируса. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 8 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы.

ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 96°С в течение 15 с, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию проводят в совмещенном режиме при температуре 60°С в течение 40 с, что оптимизирует реакцию по времени анализа (табл. 4).

Результаты ПЦР в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f(C_q). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы CAdV кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которые соответствуют логистической кривой, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует логистическая кривая в виде графика, приближенного к экспоненте.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1),

где, k - угловой коэффициент в зависимости: C_q=-k×lg T_CAdV+b, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцины и цикла количественной оценки ПЦР в виде логарифмической функции.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин и цикла количественной оценки ПНР подготавливали контрольную панель стандартов CAdV, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса с титрами активности: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли ДНК в соответствии с методикой, представленной выше.

Проводили ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f(C_q). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524.

Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин с помощью разработанного способа.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин с использованием ПЦР в режиме реального времени.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального CAdV с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CAdV с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 7 повторностях. Этап элюирования ДНК и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше.

Средние значения циклов количественной оценки для проб №1-6 составляли 11,15±0,01, 10,30±0,01, 9,56±0,01, 8,72±0,01, 7,86±0,01, 6,98±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524, рассчитали средние значения титра инфекционной активности CAdV для проб №1-6, которые составили 6,51; 6,77; 6,99; 7,24; 7,50; 7,76 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение цикла количественной оценки составило 9,52±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности CAdV, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CAdV в данных образцах. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцины с помощью ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, разработанный способ позволяет рассчитывать титр инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 285 суспензий культурального CAdV с титрами инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CAdV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524, с получением значений T_CAdV для каждой из 285 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 9,52±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности CAdV, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CAdV в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с со значениями стандартов на 99,95-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=57), на 98,02-99,45% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=57), на 97,80-99,14% для 3,9-2,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=57), на 97,02-99,05% для 2,0-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=57), на 95,89-99,01% для 1,4-0,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=57). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин с помощью ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени подготавливали серию стандартов CAdV с титрами инфекционной активности, равными 1,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 4 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано выше. Выявлено, что с достоверностью 95,89-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности CAdV со значениями от 0,5 до 8,0 lg ТЦД₅₀/см³. При изготовлении вакцин применяют вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥4,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности CAdV составляла 98,02-100,00%.

Аналитическая чувствительность для способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 95,89%.

Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

При анализе специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, исследовали суспензии CAdV, а также вирусные суспензии штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства, штамма «Рич» возбудителя коронавирусного энтерита собак, штамма «Rockborn» возбудителя чумы плотоядных. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 4,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,004 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к мастаденовирусу собак и может быть использован для его количественного определения.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность исключить вероятность контаминации в ходе реакции и субъективность при учете результатов анализа; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцин до 2,5 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности мастаденовируса собак. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности мастаденовируса собак (T_CAdV) и циклом количественной оценки (C_q) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524, (R²=0,9965, Е=99,33%).

Разработанная логарифмическая модель дает возможность определять титр инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для производства вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности рассчитывать титр инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин на основе разработанного способа с применением оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для участка hexon-гена CAdV и разработанной логарифмической модели.

Примечание: объем вносимого элюата ДНК - 5 мкл,

объем реакционной смеси - 25 мкл.

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (рН) 7,0.

Примечание: * - на данном подэтапе регистрируют степень флуоресцентного сигнала на канале Green

Примечание: Т - титр инфекционной активности мастаденовируса собак.

Примечание: «+» - наличие экспоненциального графика (положительный образец),

«-» - отсутствие экспоненциального графика (отрицательный образец).

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени»:

1. Akerstedt J., Lillehaug A., Larsen I. L., Eide N. E., Arnemo J. M., Handeland K. (2010). Serosurvey for Canine Distemper Virus, Canine Adenovirus, Leptospira Interrogans, and Toxoplasma Gondii in Free-Ranging Canids in Scandinavia and Svalbard. J. Wildl. Dis. 46, 474-480. doi: 10.7589/0090-3558-46.2.474.

2. Choi J. W., Lee H. K., Kim S. H., Kim Y. H., Lee К. K., Lee M. H., et al. (2014). Canine Adenovirus Type 1 in a Fennec Fox (Vulpes Zerda). J. Zoo Wildl. Med. 45, 947-950. doi: 10.1638/2013-0286.1.

3. Bru Т., Salinas S., Kremer E. J. (2010). An Update on Canine Adenovirus Type 2 and its Vectors. Viruses 2, 2134-2153. doi: 10.3390/v2092134.

4. Balboni A., Mollace C, Giunti M., Dondi F., Prosperi S., Battilani M. (2014). Investigation of the Presence of Canine Adenovirus (CAdV) in Owned Dogs in Northern Italy. Res. Vet. Sci. 97, 631-636. doi: 10.1016/j.rvsc.2014.10.010.

5. Dowgier G., Lahoreau J., Lanave G., Losurdo M., Varello K., Lucente M. S., et al. (2018). Sequential Circulation of Canine Adenoviruses 1 and 2 in Captive Wild Carnivores, France. Vet. Microbiol. 221, 67-73. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.05.025.

6. Fishman В., Scarnell J. (1976). Persistence of Protection After Vaccination Against Infectious Canine Hepatitis Virus (CAV/1). Vet. Rec. 99, 509. doi: 10.1136/vr.99.25-26.509.

7. Balboni A., Musto C, Kaehler E., Verin R., Caniglia R., Fabbri E., et al.. (2019). Genetic Characterization of Canine Adenovirus Type 1 Detected by Real-Time Polymerase Chain Reaction in an Oral Sample of an Italian Wolf (Canis Lupus). J. Wildl. Dis. 55, 737-741. doi: 10.7589/2018-08-206.

8. Balboni A., Verin R., Morandi F., Poli A., Prosperi S., Battilani M. (2013). Molecular Epidemiology of Canine Adenovirus Type 1 and Type 2 in Free-Ranging Red Foxes (Vulpes Vulpes) in Italy. Vet. Microbiol. 162, 551-557. doi: 10.1016/j.vetmic.2012.11.015.

9. Bass E. P., Gill M. A., Beckenhauer W. H. (1980). Evaluation of a Canine Adenovirus Type 2 Strain as a Replacement for Infectious Canine Hepatitis Vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc. 177, 234-242.

10. Decaro N., Martella V., Buonavoglia C. (2008). Canine Adenoviruses and Herpesvirus. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 38, 799-814. doi: 10.1016/j.cvsm.2008.02.006.

11. Buonavoglia C, Martella V. (2007). Canine Respiratory Viruses. Vet. Res. 38, 355-373. doi: 10.1051/vetres:2006058.

12. Chaturvedi U., Tiwari A. K., Ratta В., Ravindra P. V., Rajawat Y. S., Paha S. K., et al. (2008). Detection of Canine Adenoviral Infections in Urine and Faeces by the Polymerase Chain Reaction. J. Virol. Methods 149, 260-263. doi: 10.1016/j.jviromet.2008.01.024

13. Balboni A., Dondi F., Prosperi S., Battilani M. (2015). Development of a SYBR Green Real-Time PCR Assay With Melting Curve Analysis for Simultaneous Detection and Differentiation of Canine Adenovirus Type 1 and Type 2. J. Virol. Methods 222, 34-40. doi: 10.1016/j.jviromet.2015.05.009.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CAdV titre.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-06-16">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-16</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>513</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-16</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для

вакцин методом ПЦР в режиме реального времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2715</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2715</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAdV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcaactccgtcgatgctgccacaatggtcttacatgcacattgctg

gccaggacgccgccgaatacttgtctcccgccctggttcagtttgcccaagcaaccagttcttactttaa

gttggacaacaagttcagaaaccccactgtggcccccactcacgatgtaaccactgaaaggtctcagcgc

ttgcagttgcgctttgtgccagttatgcaagaagatggccagtacacttacaaaacccggttccaattgg

cagtgggagataacagggttctggacatggccagtacctactttgacattaggggcaccctagacagagg

cccctccttcaagccctacagtgggacggcttacaatgctctcgctcccagagctggggctaataactgc

ctatttaatggatcaggtgccaacattaacactttagcccaagtgccatttgcgggcgccattaccgtta

atggtcaagccgcagtcacagacaacacctaccagccagagccccagctgggccctgaaagttgggtgga

tggcaccttggcagacctaggagatgcgtctggccgcgccctgaaagcatcgaccccacgcatgccttgc

tacggttcttatgctccccccaccaatgaaaacggaggtcaagcaactggggccgtggaacgaagattct

ataaagtgaccaccaacaataataatgaagctgatgccctactatatacagaagatgtgaacctccaaac

cccagacacccacttggtgcatcaggtgtcagacgatcaggttacaggtgtacagggactggggcaacaa

gctgccccaaacaggccaaattacattggctttagagataactttataggtttaatgtattacaatagta

atggaaacctaggggtgctggcgggtcaatcgtctcaactaaatgccgtggtggacttgcaagacagaaa

cacagagctttcttatcagctgttgctagatgcccttacagacaggtctcgctacttttccatgtggaac

caggcagtagatagctatgaccaggatgtcaggattattgacaatcacggcgtggaagacgacatgccaa

actattgcttcccactgagcggcatgggaccattaactaacatgacagctatgaaggtcaataatcaaaa

ctttcaaacggacaacactaacgtgggtcccattcaaaagattggtttcggaaatgttgaggccatggag

ataaatctcaatgctaacctctttaaaggttttctctactccaatgtggccctatacctacctgatgcct

ataaatacacacctgataacattgtagctcctgctaatgcaaatacctatgcttacatgaatgtgagatt

gcccgctgctaaccttatagacacatttgtaaatattggcgccagatggtcacctgatgtaatggactct

gttaatccttttaaccaccacagaaatgcaggactccgctaccgatcacagctgcttggcaatggccgct

attgctcgttccatattcaggtccctcaaaaattttttgcaatcaaaaatcttctccttctaccgggtac

gtacacgtacgagtggtctttcaggaaggatgtaaacatgatccttcagagcagcttgggcaatgacctc

cgagtggatggagcctctatcaacattcaaagcatcaacctatatgccagctttttccccatggcacaca

acacagcctccactttggaagccatgctgcgcaatgatgtaaatgaccagtcctttgcagactacctgtc

tgccgccaacatgctttatccgatccctgccaacactacaaacctaccaatctccattcctgccagaaat

tgggccggattcagagggtggagctttaccagaattaagcagcgggaaactccagccctgggctcacctt

acgacccctactttacttactcgggtagcattccctacctggattcaactttctatcttagccacacctt

cagaagagtctccatcatgtttgactcttctgtatcttggccgggcaatgacaggctcctcactccaaat

gagtttgagattaaaaggtatgtggacggtgaaggctacaacgtggcccagtccaacatgacaaaagatt

ggtttctggttcaaatgctggctcattacaacattggctatcaaggctaccacttgcccgagagctacaa

agacagaatgtactcattcctcagaaattttgagcccatgtgcagacaattggtagatgtaactaactat

gctacctaccagtcagtcaccgtaggtcaccagcataacaattctggatatgctagcgccctttcaacct

ttaatccaagggagggtcacccctatccggcaaactggccttatcccctaatcggggtcaatgctgtgcc

tactgttacccaaaaaaagttcctttgtgacagaaccctatggcgcatccccttctcttccaactttatg

tctatgggcaccctcactgaccttggtcaaaacctgctgtactccaactccgctcacgcccttgacatga

ctttcgaggttgatgccatgaatgagcccactctgttgtacgttttgtttgaagtgttcgacgtggcacg

tgttcatcaaccccaccgaggggtgattgaagtagtgtacctcagaactcccttctccgccggcaacgcc

acgacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>905</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..905</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CAdV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MATPSMLPQWSYMHIAGQDAAEYLSPALVQFAQATSSYFKLDNKFRNPT

VAPTHDVTTERSQRLQLRFVPVMQEDGQYTYKTRFQLAVGDNRVLDMASTYFDIRGTLDRGPSFKPYSGT

AYNALAPRAGANNCLFNGSGANINTLAQVPFAGAITVNGQAAVTDNTYQPEPQLGPESWVDGTLADLGDA

SGRALKASTPRMPCYGSYAPPTNENGGQATGAVERRFYKVTTNNNNEADALLYTEDVNLQTPDTHLVHQV

SDDQVTGVQGLGQQAAPNRPNYIGFRDNFIGLMYYNSNGNLGVLAGQSSQLNAVVDLQDRNTELSYQLLL

DALTDRSRYFSMWNQAVDSYDQDVRIIDNHGVEDDMPNYCFPLSGMGPLTNMTAMKVNNQNFQTDNTNVG

PIQKIGFGNVEAMEINLNANLFKGFLYSNVALYLPDAYKYTPDNIVAPANANTYAYMNVRLPAANLIDTF

VNIGARWSPDVMDSVNPFNHHRNAGLRYRSQLLGNGRYCSFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGTYTYEWSFRK

DVNMILQSSLGNDLRVDGASINIQSINLYASFFPMAHNTASTLEAMLRNDVNDQSFADYLSAANMLYPIP

ANTTNLPISIPARNWAGFRGWSFTRIKQRETPALGSPYDPYFTYSGSIPYLDSTFYLSHTFRRVSIMFDS

SVSWPGNDRLLTPNEFEIKRYVDGEGYNVAQSNMTKDWFLVQMLAHYNIGYQGYHLPESYKDRMYSFLRN

FEPMCRQLVDVTNYATYQSVTVGHQHNNSGYASALSTFNPREGHPYPANWPYPLIGVNAVPTVTQKKFLC

DRTLWRIPFSSNFMSMGTLTDLGQNLLYSNSAHALDMTFEVDAMNEPTLLYVLFEVFDVARVHQPHRGVI

EVVYLRTPFSAGNATT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыт способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, включающий следующие этапы: выделение ДНК мастаденовируса собак с помощью 3М раствора гуанидинтиоцианата, 75% раствора этилового спирта и 80% раствора изопропилового спирта; проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией флуоресцентного сигнала логистических кривых для исследуемых образцов с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидов:

CAdV-T-F17638-праймер с дизайном 5'-GAAGCTACTATTATGAGACCA-3',

CAdV-T-R17702-праймер с дизайном 5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGCAA-3',

CAdV-Т-Р17667-зонд с дизайном 5'-FAM-CGGGTCAATCATCTCAAC-RTQ1-3',

определение цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени и расчет титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцины на основе разработанной логарифмической регрессионной функции. Изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности рассчитывать титр инфекционной активности CAdV в сырье для вакцин. 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 3 ил., 6 табл.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, включающий следующие этапы:

- выделение ДНК мастаденовируса собак с помощью 3М раствора гуанидинтиоцианата, 75% раствора этилового спирта и 80% раствора изопропилового спирта;

- проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией флуоресцентного сигнала логистических кривых для исследуемых образцов с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидов:

CAdV-T-F17638-праймер с дизайном 5'-GAAGCTACTATTATGAGACCA-3',

CAdV-T-R17702-праймер с дизайном 5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGCAA-3',

CAdV-Т-Р17667-зонд с дизайном 5'-FAM-CGGGTCAATCATCTCAAC-RTQ1-3',

которые рассчитаны на участок hexon-гена мастаденовируса собак в диапазоне 17638…17721 п.н.;

- определение цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени;

- расчет титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцины на основе разработанной логарифмической регрессионной функции: lg T_CAdV=-0,2996×C_q+9,8524 с достоверностью аппроксимации 0,9965 и эффективностью амплификации 99,33%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 2,5 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 0,5 lg ТЦД₅₀/см³.