Применение цитотоксических средств на основе замещенных 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R1-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатов калия в терапии меланомы легких Российский патент 2023 года по МПК A61K31/381 A61P35/00 C07D333/66 

Изобретение относятся к области органической и медицинской химии, а именно к применению биологически активных веществ класса замещенных 1,6-диоксо-6-арил-2-циано-4-аминогекса-2,4-диен-3-олата калия, а именно к замещенным 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатам калия 1 а-в общей формулы:

и их применения в медицине в качестве лекарственного средства с цитотоксической активностью и низкой токсичностью.

Эталоном сравнения биологической активности был выбран Вемурафениб формулы:

который был одобрен FDA для лечения метастатической меланомы и является аналогом по действию [Geoffrey K. FDA approval summary: vemurafenib for treatment of unresectable or metastatic melanoma with the BRAFV600E mutation / K. Geoffrey // Clin Cancer Res. - 2014. - Vol. 20(19). - P. 4994-5000. - [Electronical resource]. - URL: DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-14-0776], [HIGHLIGHTS OF PRESCRIBING INFORMATION // ZELBORAF® (vemurafenib) tablet for oral use Initial U.S. Approval: 2011. - [Electronical resource]. - URL: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2017/202429s012lbl.pdf]

Из уровня техники известны структурные формулы соединений 1 а-в [Recyclization of 3-(Thiophen-2-yl)imino-3H-furan-2-ones under the Action of Cyanoacetic Acid Derivatives // S.A. Shipilovskikh, A.E. Rubtsov / Russian journal of general chemistry. - 2019. - 90 (5). - P. 809-814. - DOI: 10.1134/S1070363220050084]. Осуществлен способ получения соединений 1 а-в взаимодействием замещенных производных 3-тиофенилимино-3Н-фуран-2-онов с амидом цианоуксусной кислоты в присутствии t-BuOK в среде безводного диоксана при 50°С с последующим выделением целевых продуктов известными методами по схеме:

Однако из патентной и научно-технической литературы не выявлено применение соединений 1 а-в в качестве средств с цитотоксическими свойствами в терапии меланомы легких.

В качестве аналогов для лечения меланомы легких выявлены следующие изобретения:

1) Синергические смеси интерферонов и фактора некроза опухоли [EP 0170843, опубл. 1984-06-23], которое показывает ингибирование пролиферации линии клеток мышиной меланомы В16.

2) Аналоги сафрамицина как терапевтические агенты в лечении рака [WO 2005/118584, опубл. 2005-05-26], где рак представляет собой саркому мягких тканей, рак предстательной железы, рак молочной железы, меланому легких и т.д. Однако в патенте не приводится данных о противораковой активности.

3) Химерные белки, нацеленные на Pd-11, и их применение для лечения или профилактики рака, где в качестве одного из видов рака выбрана меланома легких [EP 4034565, опубл. 2020-09-25].

4) Производные тетрагидрохинолина и бензоморфолина или их соли, способ получения и применение производных тетрагидрохинолина и бензоморфолина или их солей в лечении разных видов рака, в том числе меланомы и метастатической меланомы [CN 114436955, опубл. 2020-11-05]. В рамках данного патента на активность было протестировано 40 соединений, подпадающих под структурную формулу.

Задачей изобретения является расширение арсенала цитотоксических средств в терапии онкологических заболеваний, в частности разработка средств, обладающих выраженной противораковой активностью по отношению к меланоме легких и низкой токсичностью в отношении здоровых тканей.

Поставленная задача достигается применением замещенных 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатов калия, которые обладают противораковой активностью и низкой токсичностью в отношении здоровых тканей.

Технический результат: возможность применения замещенных 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатов калия, в качестве противоракового средства в терапии меланомы легких, обладающего низкой токсичностью в отношении здоровых тканей.

Изобретение иллюстрируется примерами исследования фармакологических свойств.

Пример 1. Получение соединения 1а.

К раствору 3.81 г (0.01 моль) этилового эфира (E)-2-[(2-оксо-5-фенилфуран-3(2Н)-илиден)амино]-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты в 15 мл безводного диоксана прибавляли 0.84 г (0.01 моль) амида цианоуксусной кислоты, затем к полученной смеси добавляли 1.12 г (0.01 моль) t-BuOK, полученный раствор нагревали до 50°С и выдерживали в течение 60 мин при интенсивном перемешивании. Смесь охлаждали до 20°С, выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали.

Выход 90 %, т. пл. 176-177°С (диоксан). ИК спектр, ν, см^-1: 1672 уш. (CONH₂, COOEt), 2187 (CN), 3174, 3401 (NH, NH₂). Спектр ЯМР ¹Н (DMSO-d₆), δ, м. д.: A форма (9%): 1.37 м (3H, CH₃), 1.73 м (4H, 2СН₂), 2.57 м (2H, СН₂), 2.72 м (2H, СН₂), 4.39 м (2Н, CH₂O), 5.94 с (1H, С=CH), 6.31 уш. с (1H, NH₂), 7.50 м (2H, Н_аром), 7.56 м (1H, Н_аром), 7.89 м (2H, Н_аром), 8.54 уш. с (1H, NH₂), 13.40 c (1H, NH); Б форма (91%): 1.37 т (3H, CH₃CH₂O, J_нн=7.1 Гц), 1.73 м (4H, 2СН₂), 2.57 м (2H, СН₂), 2.72 м (2H, СН₂), 4.39 кв (2H, CH₃CH₂O, J_нн=7.1 Гц), 6.06 с (1H, С=CH), 6.31 уш. с (1H, NH₂), 7.50 м (2H, Н_аром), 7.56 м (1H, Н_аром), 7.94 м (2H, Н_аром), 8.54 уш. с (1H, NH₂), 13.49 c (1H, NH). Спектр ЯМР ¹³C (DMSO-d₆), δ, м. д.: 14.2, 22.1, 22.4, 23.9, 26.0, 59.9, 79.5, 95.1, 113.0, 123.1, 126.3, 127.1, 128.5, 131.7, 131.9, 138.9, 148.2, 156.7, 163.2, 168.7, 178.8, 188.7. Найдено, %: C 57.20; H 4.43; N 8.32; S 6.40. C₂₄H₂₂KN₃O₅S. Вычислено, %: C 57.24; H 4.40; N 8.34; S 6.37. Полученное соединение 1а представляет собой желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде и ДМСО, малорастворимое в ацетонитриле и не растворимое в алканах. Соединение 1а получено по описанной ранее методике [Recyclization of 3-(Thiophen-2-yl)imino-3H-furan-2-ones under the Action of Cyanoacetic Acid Derivatives / S.A. Shipilovskikh, A.E. Rubtsov // Russian Journal of General Chemistry. - 2019. - 90 (5). - P. 809-814. - DOI: 10.1134/S1070363220050084]

Пример 2. Получение соединения 1б.

К раствору 3.95 г (0.01 моль) этилового эфира (E)-2-[(5-(4-метилфенил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)амино]-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты в 15 мл безводного диоксана прибавляли 0.84 г (0.01 моль) амида цианоуксусной кислоты, затем к полученной смеси добавляли 1.12 г (0.01 моль) t-BuOK, полученный раствор нагревали до 50°С и выдерживали в течение 60 мин при интенсивном перемешивании. Смесь охлаждали до 20°С, выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из ацетонитрила.

Выход 94 %, т. пл. 300-302°С (диоксан). ИК спектр, ν, см^-1: 1674 уш. (CONH₂, COOEt), 2187 (CN), 3280, 3493 (NH, NH₂). Спектр ЯМР ¹Н (DMSO-d₆), δ, м. д.: A форма (7%): 1.36 м (3H, CH₃), 1.73 м (4H, 2СН₂), 2.38 с (3H, CH₃), 2.57 м (2H, СН₂), 2.71 м (2H, СН₂), 4.39 м (2Н, CH₂O), 5.93 с (1H, С=CH), 6.29 уш. с (1H, NH₂), 7.31 м (2H, Н_аром), 7.85 м (2H, Н_аром), 8.54 уш. с (1H, NH₂), 13.47 c (1H, NH); Б форма (93%): 1.36 т (3H, CH₃CH₂O, J_нн=7.1 Гц), 1.73 м (4H, 2СН₂), 2.38 с (3H, CH₃), 2.57 м (2H, СН₂), 2.71 м (2H, СН₂), 4.39 кв (2H, CH₃CH₂O, J_нн=7.1 Гц), 6.04 с (1H, С=CH), 6.29 уш. с (1H, NH₂), 7.31 м (2H, Н_аром), 7.79 м (2H, Н_аром), 8.54 уш. с (1H, NH₂), 13.37 c (1H, NH). Спектр ЯМР ¹³C (DMSO-d₆), δ, м. д.: 14.2, 20.9, 22.1, 22.4, 23.9, 26.0, 59.9, 79.5, 95.1, 112.8, 123.1, 126.1, 127.2, 129.0, 131.9, 136.3, 141.8, 148.3, 156.4, 163.2, 168.7, 178.9, 188.5. Найдено, %: C 58.00; H 4.68; N 8.15; S 6.17. C₂₅H₂₄KN₃O₅S. Вычислено, %: C 58.01; H 4.67; N 8.12; S 6.19.

Полученное соединение 1б представляет собой желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде и ДМСО, малорастворимое в ацетонитриле и не растворимое в алканах. Соединение 1б получено по описанной ранее методике [Recyclization of 3-(Thiophen-2-yl)imino-3H-furan-2-ones under the Action of Cyanoacetic Acid Derivatives / S.A. Shipilovskikh, A.E. Rubtsov // Russian Journal of General Chemistry. - 2019. - 90 (5). - P. 809-814. - DOI: 10.1134/S1070363220050084]

Пример 3. Получение соединения 1в.

К раствору 3.95 г (0.01 моль) этилового эфира (E)-2-[(5-(4-метоксифенил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)амино]-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-3-карбоновой кислоты в 15 мл безводного диоксана прибавляли 0.84 г (0.01 моль) амида цианоуксусной кислоты, затем к полученной смеси добавляли 1.12 г (0.01 моль) t-BuOK, полученный раствор нагревали до 50°С и выдерживали в течение 60 мин при интенсивном перемешивании. Смесь охлаждали до 20°С, выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из ацетонитрила.

Выход 90 %, т. пл. 201-202°С (диоксан). ИК спектр, ν, см^-1: 1666 уш. (CONH₂, COOEt), 2190 (CN), 3266, 3452 (NH, NH₂). Спектр ЯМР ¹Н (DMSO-d₆), δ, м. д.: A форма (21%): 1.36 м (3H, CH₃), 1.72 м (4H, 2СН₂), 2.56 м (2H, СН₂), 2.70 м (2H, СН₂), 3.83 с (3Н, CH₃O), 4.32 м (2Н, CH₂O), 5.89 с (1H, С=CH), 6.34 уш. с (1H, NH₂), 7.00 м (2H, Н_аром), 7.87 м (2H, Н_аром), 8.55 уш. с (1H, NH₂), 13.35 c (1H, NH); Б форма (79%): 1.36 м (3H, CH₃), 1.72 м (4H, 2СН₂), 2.56 м (2H, СН₂), 2.70 м (2H, СН₂), 3.84 с (3Н, CH₃O), 4.39 кв (2H, CH₃CH₂O, J_нн=6.9 Гц), 6.03 с (1H, С=CH), 6.34 уш. с (1H, NH₂), 7.03 м (2H, Н_аром), 7.94 м (2H, Н_аром), 8.55 уш. с (1H, NH₂), 13.46 c (1H, NH). Найдено, %: C 56.02; H 4.86; N 7.87; S 6.00. C₂₅H₂₆KN₃O₆S. Вычислено, %: C 56.06; H 4.89; N 7.84; S 5.99.

Полученное соединение 1в представляет собой желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде и ДМСО, малорастворимое в ацетонитриле и не растворимое в алканах. Соединение 1в получено по описанной ранее методике [Recyclization of 3-(Thiophen-2-yl)imino-3H-furan-2-ones under the Action of Cyanoacetic Acid Derivatives / S.A. Shipilovskikh, A.E. Rubtsov // Russian Journal of General Chemistry. - 2019. - 90 (5). - P. 809-814. - DOI: 10.1134/S1070363220050084]

Пример 4. Для оценки противоопухолевой активности соединений использовался стандартный тест с использованием резазурина [Lancaster MV, Fields RD (1996) Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poisoning agents. U.S. Patent No. 5,501,959]. Клеточная линия B16-F10 культивировалась с использованием среды αМЕМ (Биолот) + 10% ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (Биолот), линия MEF NF2 - ДМЕМ (Биолот) +10% ФБС при температуре 37°С в увлажненной атмосфере 5% CO₂ (СО₂ инкубатор с воздушной рубашкой Panasonic (Sanyo) MCO-18AC (MCO-18AC-PE)). Пассажировали дважды в неделю (при 80% конкуренции) при плотности 4×10⁴ клеток на см².

В 96 луночный планшет (TC-treated Culture Microplate, Corning) заносили клетки в размере 10 тыс. кл. на лунку + 100 мкл среды. Перед добавлением к клеточным культурам все тестируемые соединения растворяли в ДМСО (500 мкл - 10 мМ); затем разводили в клеточной среде (40 мкл в среде 960 мкл) и получали раствор 400 мкМ. После этого в лунки с клетками (B16-F10 и MEF NF2) добавляли несколько концентраций тестируемых соединений (5, 10, 15, 20 мкМ). Спустя 24 часа среду заменяли раствором среды + 10% резазурин (Resazurin sodium salt, Sigma-Aldrich) и инкубировали 4 часа. В качестве положительного контроля использовали лунки с клетками без внесения вещества. В качестве отрицательного контроля - лунки без клеток с добавлением среды с резазурином. После инкубации среду с резазурином из всех лунок переносили на чистый планшет и оценивали на спектрофотометре на длинах волн 570 нм и 600 нм. Жизнеспособность оценивали по стандартным формулам.

Пример 5. Острую токсичность (ЛД₅₀, мг/мл) соединений 1 а-в определяли по методу Г.Н. Першина [Методы экспериментальной химиотерапии : (Практ. руководство) / Под ред. проф. Г.Н. Першина. - М. : Медгиз, 1959. - 502 с.]. Соединения 1 а-в вводили внутрибрюшинно белым мышам массой 16-18 г в виде взвеси в 2% крахмальной слизи и наблюдали за поведением и гибелью животных в течение 10 суток. Для исследуемых соединений 1 а-в ЛД₅₀ составляет > 1500 мг/кг.

Согласно классификации токсичности препаратов соединения 1 а-в относятся к V классу практически нетоксичных препаратов [Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии: Справочник. - М., 1977. - с. 196]. Результаты испытаний представлены в таблице 1:

Таблица 1.
Противораковая активность соединений 1 а-в. Соединение ЛД₅₀ мг/кг Противораковая активность (μM) IC₅₀ (μM)
B16-F10 IC₅₀ (μM)
MEF NF2 1а >1500 14.14±5.2 >100 1б >1500 11.9±8.2 >100 1в >1500 2.41±0.3 >100 Вемурафениб >2500 14.32 -

Как видно из таблицы, заявляемые соединения 1 а, б проявляют выраженную противораковую активность на уровне препарата сравнения, используемого в медицинской практике, а соединение 1в превышает таковую у препарата сравнения по отношению к терапии меланомы легких. Таким образом, замещенные 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олаты калия 1 а-в проявляют выраженную противоопухолевую активность, что делает возможным их использование для создания новых лекарственных средств целенаправленного действия с низкой токсичностью.

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а именно к новому применению замещенных 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатов калия общей формулы 1 а-в, где R¹=Ph (а), 4-MeC₆H₅ (б), 4-MeOC₆H₅ (в), в качестве противораковых средств в терапии меланомы легких. Технический результат – лечение меланомы легких, обеспечиваемое противораковым низкотоксичным средством указанной структуры 1 а-в. 1 табл., 5 пр.

Применение замещённых 1-амино-1,6-диоксо-2-циано-1-этокси-6-R¹-4-[((3-этоксикарбонил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-2-ил)амино]гекса-2,4-диен-3-олатов калия общей формулы 1 а-в

в качестве противораковых средств в терапии меланомы легких.