Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма "РВ-97" вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству аттенуированной культуральной антирабической вакцины, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

Бешенство является крайне опасным, смертельным, острым вирусным заболеванием, поражающее почти все виды млекопитающих, включая человека [1]. Смертность от данного заболевания составляет почти 100%. Возбудителем бешенства является нейротропный вирус, принадлежащий к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. За подавляющее большинство случаев ответственен вирус бешенства генетической группы RabV [2].

Геном возбудителя этого особо опасного заболевания представлен несегментированной одноцепочечной молекулой РНК отрицательной полярности длиной около 11800-12000 н.о. Нуклеиновая кислота кодирует 5 основных белков, расположенных в строго консервативном линейном порядке: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок). Между G- и L-цистронами располагается ψ-псевдоген. Вирион вируса бешенства имеет пулевидную форму длиной 130-250 нм и диаметром 60-100 нм и состоит из следующих функциональных структур: рибонуклеопротеин, расположенный внутри вириона, и внешняя белково-липидная составляющая [3-5].

Бешенство приводит к огромным экономическим потерям, которые связаны с гибелью животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением лабораторных исследований при постановке диагноза. Система мер для борьбы с бешенством и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [3].

При изготовлении аттенуированной культуральной антирабической вакцины вируссодержащее сырье исследуют для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства для анализа его активности в клетках чувствительных линий. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество культурально-клеточных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток (ККИД₅₀), что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК возбудителя бешенства генотипа RabV [6].

Традиционно для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства используют монослойную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [3]. Существенными недостатками данного способа являются: 1) длительная процедура анализа (не менее 3 суток); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.

В настоящее время существует «Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (наиболее близкий прототип) [7], однако данный способ имеет ряд ограничений в применении, а именно: 1) анализ длится 4 ч, что в условиях крупномасштабного производства вакцины критично; 2) требует проведение большого количества этапов анализа и дополнительного оборудования, в частности, дорогостоящий спектрофотометр с высокой аналитической точностью, а также ферментов для обратной транскрипции и реакции амплификации в высокой концентрации, а именно AMV-ревертазы - 10 е.а., Taq-ДНК-зависимая ДНК-полимеразы - 10 е.а.; 3) аналитическая чувствительность составляет не менее 10 ККИД₅₀/см³, что не дает возможности проводить анализ вируссодержащих суспензий с меньшими значениями титра инфекционной активности вируса; 4) анализ проводится с применением значения порогового цикла амплификации, что не позволяет проводить нормировку (выравнивания) коэффициента альфа и полностью вычитать фоновую составляющую процессов флуоресценции. Исходя из этого, могут возникать ошибки и расхождения при анализе результатов, получаемых с помощью данного способа, и данных стандартов.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для аттенуированной культуральной антирабической вакцины для увеличения аналитической чувствительности и экспрессности, упрощения проводимого исследования и повышения корреляции результатов разработанного и классического методов.

Предложенный способ является высокочувствительным и специфичным, объективным, экспрессным, более дешевым (стоимость одного исследования на 29% ниже по сравнению с наиболее близким прототипом), иными словами, способ отличается экономической выгодой по временному показателю и материальным затратам. Разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверностью, с возможностью вычитания фоновых показаний, опосредованно определять титр инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного и относительно дешевого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины до 2,5 ч; 2) снизить стоимость одного исследования на 29,0%; 3) повысить аналитическую чувствительность до 0,2 lg ККИД₅₀/см³ или 1,58 ККИД₅₀/см³ благодаря разработке оригинальных высокоспецифичных праймеров и применения интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины (T_{RabV РВ-97}) и циклом количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen), представленной в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9977) и эффективностью амплификации 99,77%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины с помощью разработанного способа.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность разработанных высокоспецифичных оригинальных прямого и обратного праймеров для кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства. Примечание: А - дизайн прямого праймера, Б - дизайн обратного праймера.

Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства (T_{RabV РВ-97}) и цикла количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen), выверенная на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen (n=32, р<0,001).

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов N-гена кДНК вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97».

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, которые кодируются N-гена кДНК вируса бешенства штамма «РВ-97».

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность праймера RabV-T-RV-97/F934 на N-ген вируса бешенства.

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность обратного праймера RabV-T-RV-97/R1070 N-ген вируса бешенства.

Сущность изобретения заключается в новом подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании РНК вируса бешенства с применением 4,5 М раствора гуанидинизотиоцианата и смеси 75% раствора этанола и 90% раствора пропанола-2 в соотношении 1:3; 2) проведении обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента N-гена вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства с применение разработанных оригинальных высокоспецифичных праймеров RabV-T-RV-97/F934 и RabV-T-RV-97/R1070, а также интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen; 3) построении кривых плавления высокого разрешения для ампликонов кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства; 4) определении титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины (T_{RabV РВ-97}) с применением логарифмической функции: с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9977) и эффективностью амплификации 99,77%.

Молекулярные методы диагностики значительно улучшились за последние годы, что дает огромный потенциал для их применения в клинической диагностике, где требуется более быстрое и точное выявление инфекционных возбудителей [8]. В настоящее время обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция применяются для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя бешенства [8-10].

Для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины ранее разработанный способ не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen по сравнению с наиболее близким прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, экспрессностью, снижением стоимости проведения исследования и повышением степени корреляции со стандартами.

В отличие от наиболее близкого прототипа разработанный способ включает этапы экстрагирования РНК вируса бешенства экстрагировании РНК вируса бешенства с применением 4,5 М раствора гуанидинизотиоцианата и смеси 75% раствора этанола и 90% раствора пропанола-2 в соотношении 1:3; проведения обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента N-гена вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства с применение разработанных оригинальных высокоспецифичных праймеров и интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen; построения кривых плавления высокого разрешения для ампликонов кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства; определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины с применением разработанной логарифмической функции.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 29,0%; повысить аналитическую чувствительность до 0,2 lg ККИД₅₀/см³ или 1,58 ККИД₅₀/см³; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины (T_{RabV РВ-97}) и циклом количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen) в виде разработанной логарифмической функции. Таким образом, актуально применять предложенный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений цикла количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen) кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства и расчет титра инфекционной активности возбудителя данного заболевания с использованием разработанной логарифмической функции.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении разработанных оригинальных высокоспецифичных праймеров и способа на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки-EvaGreen и титра инфекционной активности возбудителя бешенства вакцинного штамма «РВ-97».

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров RabV-T-RV-97/F934 и RabV-T-RV-97/R1070 на N-ген вируса бешенства [11], применении высокоэффективного интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen для проведения реакции амплификации и разработке логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки-EvaGreen и титра инфекционной активности возбудителя бешенства вакцинного штамма «РВ-97».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства (T_{RabV РВ-97}) и цикла количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen), выверенная на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen (n=32, р<0,001). (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины подготавливают контрольную панель стандартов данного штамма возбудителя бешенства, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ККИД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют РНК с использованием 4,3 М раствора гуанидинизотиоцианата (соотношение пробы и ГТЦ=1/4) в процессе детергирования на стекловолокнистых фильтрах в течение 12 мин и последующим трехкратным промывании с использованием смеси 70% раствора этилового спирта и 85%-ного раствора изопропилового спирта (1:1) (по 500 мкл на пробу).

На следующем этапе проводят обратную транскрипцию, реакцию амплификации с применением разработанных праймеров и интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн оригинальных праймеров отражены в таблице 2.

Расчет дизайна праймеров проводили на основании нуклеотидных последовательностей N-гена вируса бешенства. В качестве гомологичных участку N-гена кДНК возбудителя бешенства в диапазоне 934…1090 п.н. применяют следующие олигонуклеотиды:

RabV-T-RV-97/F934-праймер с дизайном 5'- CTTCCGTTCCCTAGGCTTG-3', RabV-T-RV-97/R1070-праймер с дизайном 5'-AACAGACATCTCATGAGGAGC-3' (фиг. 1) в концентрации 8 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,20 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 2,8 мМ. В качестве катализатора ПЦР в режиме реального времени применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты РНК вируса каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [12]. Длины RabV-T-RV-97/F934 и RabV-T-RV-97/R1070 составляют 19 и 21 и.о. каждый, что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 5721,8 и 6448,3, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе олигонуклеотидных праймеров для ПЦР в режиме реального времени кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO).

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 158,1 ккал/моль, 25,5 ккал/моль, 412,2 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 162,6 ккал/моль, 25,7 ккал/моль, 425,2 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма учета концентрации солей для прямого и обратного праймеров составили по 60°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 62°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком N-гена вируса бешенства при температуре 62°С.

Последовательности разработанных праймеров проверяли на наличие нежелательных совпадений с последовательностями нуклеиновых кислот других возбудителей с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляют в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4. Обратную транскрипцию проводят при температуре 43°С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 3 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию проводят при температуре 62°С в течение 40 с.

Результаты реакции амплификации в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen), определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (C_q-EvaGreen). В случае присутствия в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы вируса бешенства кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя EvaGreen, входящего в состав реакционной смеси. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе наблюдается отсутствие логистической кривой в виде графика, приближенного к экспоненте.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки-EvaGreen и титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1),

где k - угловой коэффициент в зависимости: а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса бешенства в сырье для вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» возбудителя бешенства в сырье для вакцины и цикла количественной оценки-EvaGreen.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины и циклов количественной оценки-EvaGreen ПЦР подготавливали контрольную панель стандартов вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ККИД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли РНК в соответствии с методикой, представленной выше.

Проводили реакцию амплификации в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики, как указано выше. Установили зависимость между циклом количественной оценки-EvaGreen и титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9977) и эффективностью амплификации 99,77%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» возбудителя бешенства в сырье для антирабической вакцины с помощью разработанного способа.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса бешенства штамма «РВ-97» с титрами инфекционной активности 7,26, 7,79, 7,12, 7,56, 6,64, 7,50 lg ККИД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97» с титром инфекционной активности 7,00 lg ККИД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 10 повторностях. Этап элюирования РНК, постановку обратной транскрипции и реакцию амплификации в режиме реального времени проводили, как описано выше.

Средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 9,01±0,01, 7,21±0,01, 9,55±0,01, 8,04±0,01, 11,05±0,01, 8,28±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией:

рассчитали средние значения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства для проб №1-6, которые составили 7,26; 7,80; 7,10; 7,55; 6,65; 7,48 lg ККИД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 9,88±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса бешенства, равному 7,00 lg ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» возбудителя бешенства в сырье для вакцины с помощью разработанного способа.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 365 суспензий культурального вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97» с титрами инфекционной активности от 0,00 до 8,00 lg ККИД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97» с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ККИД₅₀/см³. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 12 повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот, постановку обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией, представленной выше, с получением значений T_{RabV РВ-97} для каждой из 365 проб. Для положительного контроля значение C_q-EvaGreen составило 9,88±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса, равному 7,00 lg ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей логистические кривые не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали в реакции амплификации с помощью разработанных праймеров и логарифмической функции. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со значениями стандартов на 99,87-100,00% для 8,0-6,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=73), на 99,19-99,95% для 5,9-4,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=73), на 98,99-99,68% для 3,9-1,0 lg ККИД₅₀/см³ (n=73), на 98,08-99,12% для 0,99-0,20 lg ККИДзо/см³ (n=73), на 94,23-96,03% для 0,00-0,19 lg ККИД₅₀/см³ (n=73). Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen подготавливали серию стандартов вакцинного штамма «РВ-97» с титрами инфекционной активности, равными 0,00-8,00 lg ККИД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ККИД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 7 повторностях. Этапы работы, как описано выше. Выявлено, что с достоверностью 98,05-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности вируса бешенства со значениями от 0,99 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³.

Аналитическая чувствительность разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen составляет не менее 0,2 lg ККИД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 98,05%.

Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen.

При анализе специфичности способа (предлагаемое изобретение), исследовали суспензии вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства, а также возбудителей парвовирусного энтерита собак, коронавирусного энтерита собак, аденовируса 1 серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составляло не менее 4,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 4,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 7 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю бешенства и может быть использован для определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» в сырье для антирабической вакцины.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения являются возможности сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 29,0%; повысить аналитическую чувствительность до 0,2 lg ККИД₅₀/см³ или 1,58 ККИД₅₀/см³ благодаря разработке оригинальных высокоспецифичных праймеров и применения интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины (T_{RabV РВ-97}) и циклом количественной оценки-EvaGreen (C_q-EvaGreen), представленной в виде логарифмической функции:

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9977) и эффективностью амплификации 99,77%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины с помощью разработанного способа. Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen»:

1. European Pharmacopoeia 7.0. (2012а). Monograph 0451: Rabies vaccine (live, oral) for foxes. European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare (EDQM), Council of Europe, Strasbourg, France.

2. ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses). URL: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?bhcp=1 (Дата обращения: 14.06.2023).

3. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris. - 2022. - Ch. 2.1.17.

4. World Health Organization (2007). Oral Vaccination of Dogs against Rabies. WHO, Geneva, Switzerland. WU X., SMITH T.G. & RUPPRECHT C.E. (2011). From brain passage to cell adaptation: the road of human rabies vaccine development. Exp.Rev. Vaccines, 10, 1597-1608.

5. Warner C.K., Whitfield S.G., Fekadu M. & Ho H. (1997). Procedures for reproducible detection of rabies virus antigen mRNA and genome in situ in formalin-fixed tissues. J. Virol. Methods, 67, 5-12.

6. Сухарьков Андрей Юрьевич. Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных: диссертация… кандидата биологических наук: 03.02.02 / Сухарьков Андрей Юрьевич. [Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»]. - Владимир, 2014. - 141 с.

7. Патент РФ №2761535, 02.11.2020 Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Заявка 2020136135, Бюл. №34 от 09 декабря 2021 г / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Борисов А.В.

8. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses / P.R. Heaton, P. Johnstone, L.M. McElhinney [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol.35. - P. 2762-2766.

9. Faye, M. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus / M. Faye, L. Dacheux, M. Weidmann // J. Virol. Methods. - 2017. - Vol. 243. - P. 120-130/

10. Correia Moreira B, Aparecida Pereira L, Lappas Gimenez AP, Minor Fernandes Inagaki J, Raboni SM. Development and validation of a real-time RT-PCR assay for the quantification of rabies virus as quality control of inactivated rabies vaccines. J Virol Methods. 2019 Aug; 270:46-51.

11. Rabies virus strain RV-97 glycoprotein (N) gene, complete cds. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF542830.l (Дата обращения 25.06.2023).

12. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol.20. - P. 163-179.

Перечень последовательностей.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="RabV EvaGreen 2024-06-03.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-06-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-18</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>525</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">

ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>

Federal State-Financed Institution Federal Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)

</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">

Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного

штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе

анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с

применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1350</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1350</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RabV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

atggataccgacaagattgtattcaaagttaataatcaggtggtctctttaaagcc

tgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaaaaa

gccctgtataaccctagggaaagcccccgacttgaacaaagcatacaaatcagtttt

atcaggcatgaatgctgccaaacttgatcccgatgatgtatgttcctacttggcagc

agcaatgcagttctttgaggggacgtgtccggaagactggaccagctacgggatctt

gattgcacggaaaggagacaagatcaccccaaattctctagtggaaataaagcgtac

tgatgtagaagggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagggaccccac

tgtccctgagcatgcatctttggtcggtcttctcctgagtctgtataggttgagcaa

aatatcaggacaaaacaccggtaactataaaacaaacattgcagataggatagagcag

gttttcgagacagccccttttattaaaatcgtggagcaccatactctaatgacaactc

acaaaatgtgtgctaattggagtactataccgaatttcaggtttttggccggaaccta

cgacatgtttttctcccggattgatcatctatattcagcaatcagagtgggcacagtt

gtcactgcttatgaagactgttcagggctggtatcgtttactgggtttgtaaagcaga

tcaatctcactgcaagagaagcaatactctacttcttccataagaactttgaggaaga

aataagaagaatgttcgagccagggcaggagacggctgttcctcactcttatttcattc

acttccgttccctaggcttgagtgggaagtctccttattcatcgaatgccgttggtcat

gtgttcaatctcattcactttgttggatgttatatgggtcaagtcagatccctaaatg

caacagttattgccgcatgtgctcctcatgagatgtctgttctagggggctatctagg

ggaggaattctttgggaaaggaacatttgagagaagattcttcagagatgagagagaa

cttcaagaatacgaggcagctgaactgacaaagaccgacgtggcattggcagatgacgg

aactgtcaactctgatgacgaggactacttctccggtgaaaccagaagtccagaagctg

tttatgctcgaatcatgatgaatggaggtcgactaaaaagatcgcatatacggagatat

gtctcagtcagttccaatcatcaagcccgtccaaactcattcgccgagtttctaaacaagacatattcgagtgactct

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>450</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..450</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>RabV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MDTDKIVFKVNNQVVSLKPEIIVDQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSGMNAA

KLDPDDVCSYLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGILIARKGDKITPNSLVEIKRTDVEGNWALTGGM

ELTRDPTVPEHASLVGLLLSLYRLSKISGQNTGNYKTNIADRIEQVFETAPFIKIVEHHTLMT

THKMCANWSTIPNFRFLAGTYDMFFSRIDHLYSAIRVGTVVTAYEDCSGLVSFTGFVKQINLT

AREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETAVPHSYFIHFRSLGLSGKSPYSSNAVGHVFNLIHFVG

CYMGQVRSLNATVIAACAPHEMSVLGGYLGEEFFGKGTFERRFFRDERELQEYEAAELTKTDVA

LADDGTVNSDDEDYFSGETRSPEAVYARIMMNGGRLKRSHIRRYVSVSSNHQARPNSFAEFLNKTYSSDS

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>rabies virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttccgttccctaggcttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>rabies virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aacagacatctcatgaggagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству аттенуированной культуральной антирабической вакцины. Раскрыт способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen. Основными преимуществами предлагаемого изобретения являются возможности сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 29,0%; повысить аналитическую чувствительность до 0,2 lg ККИД₅₀/см³ или 1,58 ККИД₅₀/см³ благодаря разработке оригинальных высокоспецифичных праймеров и применения интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины и циклом количественной оценки-EvaGreen, представленной в виде логарифмической функции с высокой достоверностью аппроксимации 0,9977 и эффективностью амплификации 99,77%. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения с применением интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen с применение олигонуклеотидных праймеров RabV-T-RV-97/F934 с дизайном 5'-CTTCCGTTCCCTAGGCTTG-3' и RabV-T-RV-97/R1070 с дизайном 5'-AACAGACATCTCATGAGGAGC-3' и использованием интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen, включающий следующие этапы:

- экстрагирование РНК вируса бешенства с применением 4,5 М раствора гуанидинизотиоцианата и смеси 75% раствора этанола и 90% раствора пропанола-2 в соотношении 1:3;

- проведение обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента N-гена вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства с применением олигонуклеотидных праймеров для амплификации участка длиной 157 п.н. и использованием интеркалирующего красителя третьего поколения EvaGreen;

- построение кривых плавления высокого разрешения для ампликонов кДНК вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства;

- определение титра инфекционной активности вакцинного штамма «РВ-97» вируса бешенства в сырье для вакцины с применением логарифмической функции: lg T_{RabV РВ-97}=-0,2998 × C_q-EvaGreen+9,962, с высокой достоверностью аппроксимации R²=0,9977, и эффективностью амплификации 99,77%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 2,5 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 0,2 lg ККИД₅₀/см³.