Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек FHV в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против инфекционного ринотрахеита кошек FHV, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Инфекционный ринотрахеит кошек - контагиозное вирусное заболевание, характеризующееся поражением верхних дыхательных путей, конъюнктивитами и кератитами [1].

Возбудителем инфекционного ринотрахеита кошек является вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alphaherpesvirus 1 (FHV-1 - Felid alphaherpesvirus-1) [2]. Нуклеиновая кислота вируса представлена двуцепочечной ДНК размером около 135 800 п.н. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности референтного штамма «С-27» вируса инфекционного ринотрахеита кошек представлена в GenBank под номером NC_013590.2 [3]. Важным для выявления генома возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек является thymidine-kinasa gene (TKG, ген тимидинкиназы), который располагается в диапазоне 66387…67419 п.н. и имеет размер 1033 п.н. [4].

Инфекционный ринотрахеит зарегистрируется у многих представителей семейства кошачьих, таких как европейских дикие кошки, песчаные кошки, леопардовые кошки, гепарды, горные львы, оцелоты и др. [1]. К инфекции восприимчивы как взрослые кошки всех пород, так и котята, но у молодых животных, зараженных FHV-1, нередок летальный исход в результате осложнения пневмонией. В литературе описаны также случаи развития менингоэнцефалита в результате заражения FHV-1 [5] После острой фазы заболевание часто переходит в латентную форму с пожизненным вирусоносительством. Исследователи из Австралии определили серопревалентность FHV-1 на уровне 11-17% у диких представителей семейства кошачьих и 37% у домашних кошек, однако, по другим оценкам около 90% кошек считаются серопозитивными по отношению к FHV-1, из них 45% выделяют вирус в течение всей жизни [1, 5].

Система мер для борьбы с инфекционным ринотрахеитом кошек и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [6]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении не инактивированное вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности вируса для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек в активном состоянии.

Традиционно для определения титра инфекционной активности данного вируса применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошки (CRFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [7]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с формированием цитопатического действия (ЦПД) в течение нескольких суток; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) наличие вероятности риска контаминации культуры клеток.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в вируссодержащих суспензиях в течение 2,5 часов, что в 28,8 раз быстрее по сравнению с прототипным вариантом [7], не требует использования клеточной линии для количественного анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, объективного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением ПЦР и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса до 2,5 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных thymidine-kinasa gene (TKG); 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и циклом количественной оценки (C_q), представленной в виде логарифмической функции lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Позиции гена тимидинкиназы в геноме вируса инфекционного ринотрахеита кошек. Примечание: А - общий вид, Б - позиции в соответствии с порядковыми номерами нуклеотидов в ДНК вируса.

Фиг. 2 - Точки начала (А) и конца (Б) ампликона, синтезированного во время проведения ПЦР для количественного анализа неинактивированного сырья для вакцин против инфекционного ринотрахеита.

Фиг. 3 - Изображение дизайна праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

Фиг. 4 - Зависимость титра инфекционной активности инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и цикла количественной оценки (C_q) с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени (n=8, отмечены точки, отображающие средние значения C_q).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет участок последовательности нуклеотидов гена TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек;

SEQ ID NO: 2 представляет участок последовательности аминокислот белка, соответствующего гену TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек.

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2; 2) амплификации специфического фрагмента гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су 5.5 new (λ_max флуоресценции=705 нм) и тушителем свечения BHQ-3 (λ_max гашения=620-730 нм); 3) проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; 4) определении титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%.

В настоящее время метод ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя ринотрахеита кошек. Для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса ринотрахеита кошек ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап экстрагирования ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2; амплификации специфического фрагмента гена TKG ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су 5.5 new и тушителем свечения BHQ-3; проведения реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; новый подход к методике опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек с применением модели зависимости порогового цикла амплификации для кривой флуоресценции и титра инфекционной активности вируса в виде логарифмической функции. Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности возбудителя ринотрахеита кошек до 2,5 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки логистических кривых ПЦР и расчет титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с использованием разработанной логарифмической модели зависимости C_q и титра инфекционной активности вируса.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на ген TKG, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины цикла количественной оценки (Cq) и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) (n=8) (фиг. 4).

С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят средой Игла до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2. К 100 мкл проб добавляют 500 мкл 5 М гуанидинизотиоцианата, нагретого до температуры 60°С, инкубируют 7 минут, наносят на стекловолокнистый фильтр, промывают с помощью 90%-ного раствора пропанола-2, внося его по 1000 мкл 3 раза. Элюируют полученную ДНК в стандартный буфер ТЕ в объеме 50 мкл.

На следующем этапе проводят ПЦР с количественной гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек штаммов, опубликованных в базах данных GenBank [3].

В качестве гомологичных участку гена TKG возбудителя ринотрахеита кошек олигонуклеотидов используют:

FHV-TKG-T-F (5' - CGTGGTGAATTATCAGCTGA - 3'),

FHV-TKG-T-R (5' - CTGTTATTGTGGATAGTCTGG - 3') и

FHV-TKG-T-P (5' - Су 5.5 new - CAAGATTTGCCGCACCATACCT - BHQ-3 - 3') (фиг.1, 2, 3) в концентрации 10 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5×10^-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1,5%). В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 2,5 мМ. В качестве катализатора ПЦР Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (2 ед.). Элюаты ДНК возбудителя ринотрахеита кошек каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для ДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [8]. Длины FHV-TKG-T-F, FHV-TKG-T-R и FHV-TKG-T-P составляют 20, 21, 22 н.о., что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 6172,1; 6498,3; 6639,4, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор Су 5.5 new присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ-3 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени.

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрацию солей в буферном растворе и метод ближайших соседей [9].

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-F составили 158,2 ккал/моль, 24,6 ккал/моль, 414,7 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-R составили 160,6 ккал/моль, 24,0 ккал/моль, 424,5 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для FHV-TKG-T-P - 180,9 ккал/моль, 29,3 ккал/моль, 472,8 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 51, 49, 56°С, соответственно.

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) T_m для прямого, обратного праймеров и зонда составили 56, 57, 62°С.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 54°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком в гене TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек при температуре 54°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот возбудителя FHV. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы и инактивации MMLV-ревертазы.

ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 96°С в течение 15 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 54°С в течение 20 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 40 с (таблица 4).

Результаты ПЦР анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (C_q). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде логистической кривой). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:

Е=(10^-1/k-1),

где k - угловой коэффициент в зависимости C_q=-k×lg T_FHV+b,

а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин и цикла количественной оценки по результатам ПЦР в виде логарифмической функции.

С целью определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят средой Игла до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90% пропанола-2. К 100 мкл проб добавляют 500 мкл 5 М гуанидинизотиоцианата, нагретого до температуры 60°С, инкубируют 7 минут, наносят на стекловолокнистый фильтр, промывают с помощью 90%-ного раствора пропанола-2, внося его по 1000 мкл 3 раза. Элюируют полученную ДНК в стандартный буфер ТЕ в объеме 50 мкл.

Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки реакции амплификации C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (C_q). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные выражены в виде логарифмического уравнения:

lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9967) и эффективностью амплификации 99,43%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения ДНК, и постановку ПНР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1.

Средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 9,58±0,01, 8,76±0,02, 7,90±0,02, 7,10±0,01, 6,25±0,01, 5,42±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735, рассчитали средние значения титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек для проб №1-6, которые составили 6,50; 6,74; 7,00; 7,24; 7,50; 7,45 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,92±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.

Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=8). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности FHV в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.

Иными словами, разработанный способ позволяет оценивать титр инфекционной активности FHV в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Для анализа использовали 260 суспензий культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек с титром инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального FHV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CRFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено в примере 1. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией lg T_FHV=-0,2998×Cq+9,3735 (R²=0,9967, Е=99,43%) с получением значений T_FHV для каждой из 260 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,92±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии CRFK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток CRFK на 98,99-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=65), на 98,64-99,74% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=65), на 96,74-99,01% для 3,9-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=65), на 94,04-98,74% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=65). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

Иными словами, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в реальном времени.

Пример 4. Оценка аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

При определении аналитической чувствительности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя FHV подготавливали серию стандартов вируса разных штаммов с T_FHV. равными 1,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 4 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано в примере 1. Выявлено, что с достоверностью 98,99-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности FHV со значениями от 6,0 до 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, с достоверностью 98,64-99,74% - с титрами от 4,0 до 5,9 lg ТЦД₅₀/см³, с достоверностью 96,74-99,01% - с титрами от 2,0 до 3,9 lg ТЦД₅₀/см³, с достоверностью 96,74-98,96% - с титрами от 1,5 до 2,0 lg ТЦД₅₀/см³, с достоверностью 94,04-98,74% - с титрами от 1,0 до 1,4 lg ТЦД₅₀/см³. При изготовлении вакцин применяют не инактивированное вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥6,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности FHV составляла 98,99-100,00%.

Следовательно, аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя FHV в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 94,04%.

Пример 5. Оценка специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

При оценке специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени, исследовали суспензии вируса инфекционного ринотрахеита кошек, вируса бешенства, коронавируса кошек, калицивируса кошек и чумы плотоядных животных. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы элюирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано в примере 1. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (таблица 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю инфекционного ринотрахеита кошек и может быть использован для определения титра инфекционной активности данного вируса в неинактивированном сырье для вакцин.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа неинактивированного вируссодержащего сырья для вакцины до 2,5 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (T_FHV) и циклом количественной оценки (Cq) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 (R²=0,9967, Е=99,43%). Разработанная математическая модель дает возможность оценивать титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для производства вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени и разработанной логарифмической модели.

Источники информации

1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.

2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-l (Дата обращения: 14.04.2023).

3. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.04.2023).

4. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.

5. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.

6. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087. doi: 10.2460/ajvr.21.07.0087. PMID: 35930783.

7. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.

8. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus deteCqion-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.

9. Эверитт, Брайан С.; Ландау, Сабина; Лиз, Морвен; и Шталь, Дэниел (2011) "Разные методы кластеризации", в кластерном анализе, 5-е издание, John Wiley & Sons, Ltd., Чичестер, Великобритания.

Примечание: объем вносимого элюата ДНК - 5 мкл;

объем реакционной смеси - 25 мкл.

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (pH) 7,0.

Примечание: * - на данном подэтапе регистрируют степень флуоресцентного сигнала.

Примечание: CRFK - монослойная перевиваемая клеточная линия из почки кошки;

Т - титр инфекционной активности FHV.

Примечание: «+» - наличие экспоненциального графика (положительный образец);

«-» - отсутствие экспоненциального графика (отрицательный образец).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FHV Titre PCR.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-05-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>505</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-05-04</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита

кошек FHV в неинактивированном сырье для вакцин с применением

полимеразной цепной реакции и количественной

гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>267</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..267</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgacgtggtgaattatcagctgaagatgctacctatatcaccgcccact

atcaagcaagatttgcggcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaa

agttgtatgtgaggaacaccccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgt

ttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagtctaatggcaacacttc

cacgagaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>89</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..89</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RRGELSAEDATYITAHYQARFAAPYLLLHSRLSTITGYQKVVCEEHPDV

TLIIDRHPLASLVCFPLARYFVGDMTLGSVLSLMATLPRE</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против инфекционного ринотрахеита кошек FHV. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Способ включает следующие стадии: выделение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90%-ного пропанола-2; проведение полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидов:

FHV-TKG-T-F с дизайном 5'- CGTGGTGAATTATCAGCTGA -3', FHV-TKG-T-R с дизайном 5'- CTGTTATTGTGGATAGTCTGG -3' и FHV-TKG-T-P с дизайном 5'-Су 5.5 new - CAAGATTTGCCGCACCATACCT -BHQ-3-3', которые рассчитаны на участок гена TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек; расчет значений цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени; определение титра инфекционной активности культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин на основе разработанной логарифмической регрессионной функции: lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 с достоверностью аппроксимации 0,9967 и эффективностью амплификации 99,43%. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцины до 2,5 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности вируса инфекционного ринотрахеита кошек. Предлагаемое изобретение позволяет с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцины на основе ПЦР в режиме реального времени с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов для участка гена TKG ДНК вируса FHV и разработанной логарифмической модели. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек FHV в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, включающий следующие стадии:

- выделение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек с помощью 5 М гуанидинизотиоцианата и 90%-ного пропанола-2;

- проведение полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидов:

FHV-TKG-T-F с дизайном 5'- CGTGGTGAATTATCAGCTGA -3',

FHV-TKG-T-R с дизайном 5'- CTGTTATTGTGGATAGTCTGG -3' и

FHV-TKG-T-P с дизайном 5'-Су 5.5 new - CAAGATTTGCCGCACCATACCT -BHQ-3-3', которые рассчитаны на участок гена TKG ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек;

- расчет значений цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени;

- определение титра инфекционной активности культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек в неинактивированном сырье для вакцин на основе разработанной логарифмической регрессионной функции: lg T_FHV=-0,2998×C_q+9,3735 с достоверностью аппроксимации 0,9967 и эффективностью амплификации 99,43%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 2,5 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³.