Система привлечения белка к месту разрыва ДНК для увеличения эффективности редактирования генома млекопитающего Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C07K19/00 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно, к генной инженерии. Данная система может быть использована в фундаментальных исследованиях клеточной биологии и терапии генетических заболеваний.

Основным методом бесшовного внесения интересующей ДНК последовательности в клеточный геном является метод направленной гомологичной репарации [Capecchi М.R., Altering the genome by homologous recombination. // Science (New York, N.Y.). 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92.]. В данном методе используются донорные конструкции, содержащие выбранную для вставки ДНК последовательность между плечами гомологии - последовательностями, которые идентичны участкам, фланкирующим участок генома, в который будет проводиться вставка. Такая методика позволяет проводить точные модификации с низкой частотой: успешное встраивание последовательности в геном происходит в одной из 10⁵-10⁷ клеток [Capecchi М.R., Altering the genome by homologous recombination. // Science (New York, N.Y.). 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92.]. Внесение двунитевого разрыва в выбранный для редактирования участок генома увеличивает эффективность вставки конструкции с плечами гомологии на несколько порядков [Bibikova М., Carroll D., Segal D.J., Trautman J.K., Smith J., Kim Y.-G., Chandrasegaran S., Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases // Molecular and Cellular Biology. 2001. T. 21. №1. C. 289-297.].

Наиболее популярной системой для внесения разрыва в геном является система CRISPR-Cas9, специфичность которой задается короткой последовательность гидовой РНК [Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.-S., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease // Nature Biotechnology. 2013. T. 31. №3. C. 230-232.; Cong L., Ran F. A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P. D., Wu X., Jiang W., Marraffini L. A., Zhang F., Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science (New York, N.Y.). 2013. T. 339. №6121. C. 819.; Jinek M., East A., Cheng A., Lin S., Ma E., Doudna J., RNA-programmed genome editing in human cells // eLife. 2013. T. 2. C. e00471.].

Репарация внесенного эндонуклеазой двунитевого разрыва ДНК может проходить по различным путям. Путь гомологичной репарации позволяет изменять интересующую последовательность ДНК в геноме с использованием донорной последовательности ДНК.

Эффективность редактирования по пути гомологичной репарации можно увеличить за счет привлечения к месту разрыва некоторых белков, участвующих в процессах репарации. Это было продемонстрировано для CtIP, Rad51, Mre11A, Rad52, Brex27 домена BRCA2 белка и N-концевой части ExoI белка [Sun W., Liu H., Yin W., Qiao J., Zhao X., Liu Y., Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems // The CRISPR Journal. 2022. T. 5. №1. C. 7-18.].

Другой путь увеличения эффективности редактирования - привлечение к месту разрыва белков, ингибирующих конкурирующие пути репарации. Для этого использовались FFR домен 53 ВР1 белка и RAD18 белок без SAP домена [Sun W., Liu Н., Yin W., Qiao J., Zhao X., Liu Y., Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems // The CRISPR Journal. 2022. T. 5. №1. C. 7-18.].

Еще один подход увеличения эффективности редактирования - привлечение к месту разрыва белков - участников гомологичной репарации из других организмов. Этот подход был проверен для RecT и N-концевой части UL12 белка [Sun W., Liu H., Yin W., Qiao J., Zhao X., Liu Y., Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems // The CRISPR Journal. 2022. T. 5. №1. C. 7-18.].

В большинстве работ привлечение белков к месту разрыва осуществляется за счет сшивки интересующего белка с spCas9 белком через короткий линкер. Эффективность редактирования в таком случае ограничивается привлечением к месту разрыва одной молекулы интересующего белка на одну молекулу spCas9 белка. Дополнительно, участие этого белка в процессах репарации может быть лимитировано конформационными ограничениями, которые накладывает spCas9 белок и используемый линкер.

Разработка новой системы привлечения белков к месту разрыва генома для увеличения эффективности редактирования за счет гомологичной репарации расширяет возможности применения системы геномного редактирования.

На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.

Известна система редактирования генома, использующая привлечение белков - участников репарации с помощью MS2 адаптеров [Tran N.-T., Bashir S., Li X., Rossius J., Chu V. Т., Rajewsky K., Kühn R., Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors // Frontiers in Genetics. 2019. T. 10. C. 2-5.].

Ha CtIP белке было показано, что эффективность редактирования с использованием MS2 адаптерной системы выше, чем с использованием сшивки CtIP белка с spCas9 белком. Эта система может быть дополнена за счет использования других адаптерных белков.

Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является расширение арсенала средств для увеличения эффективности геномного редактирования за счет гомологичной репарации в клетках млекопитающих.

Задачей настоящего изобретения является создание нового инструмента для увеличения эффективности геномного редактирования за счет гомологичной репарации в клетках млекопитающих.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в расширении арсенала средств для увеличения эффективности геномного редактирования за счет гомологичной репарации в клетках млекопитающих.

Для решения этой задачи предложена система привлечения белка к месту разрыва ДНК, состоящая из РР7 белка или белка с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности РР7, и гидовой РНК с последовательностью SEQ ID NO: 1 для использования с CRISPR системой для увеличения эффективности редактирования геномной ДНК млекопитающего.

Другими словами, предложено применение белка РР7 или белка с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности белка РР7, в сочетании с гидовой РНК с последовательностью SEQ ID NO: 1 для привлечения белка к месту разрыва ДНК при редактировании генома млекопитающего путем гомологичной репарации с использованием CRISPR системы.

Таким образом, нами предлагается способ редактировании генома млекопитающего путем гомологичной репарации с использованием CRISPR системы, в котором к месту разрыва ДНК привлекают белок, обеспечивающий редактирование генома, с помощью системы, включающей белок РР7 или белок с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности белка РР7, и гидовую РНК с последовательностью SEQ ID NO: 1.

Выбор белков для привлечения к месту разрыва не ограничен CtIP белком, используемым в примерах, приведенных ниже, и может включать другие белки, увеличивающие эффективность редактирования за счет гомологичной репарации.

Известно, что можно проводить изменения последовательности белка без потери его функции [Ng Р.С., Henikoff S., Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function // Annual Review of Genomics and Human Genetics. 2006. T. 7. №1. C. 61-80.]. Это может быть сделано за счет направленного мутагенеза аминокислотных остатков, не влияющих напрямую на его функциональность. Поэтому в предложенной системе возможно использование белка с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности РР7 белка.

Геномное редактирование за счет гомологичной репарации в клетках млекопитающих с предложенной системой происходит с использованием экзогенной последовательности ДНК, которая может быть представлена двуцепочечной или одноцепочечной последовательностью ДНК.

Внесение разрыва в геном для редактирования за счет гомологичной репарации в клетках млекопитающих с предложенной системой происходит с использованием CRISPR белка. CRISPR белки совместимые с предложенной системой представлены spCas9 белком и его вариациями, которые включают, но не ограничены вариантами eSpCas9, SpCas9-HF1, HypaCas9, evoCas9, xCas9, HiFi Cas9, Sniper-Cas9 и LZ3 Cas9.

Система увеличения эффективности редактирования может быть доставлена в клетку в виде ДНК кодирующей последовательность РР7 белка сшитого с последовательностью интересующего белка для привлечения к месту разрыва и последовательность гидовой РНК SEQ ID NO: 1; в виде мРНК для трансляции РР7 белка сшитого с последовательностью интересующего белка и гидовой РНК SEQ ID NO: 1; в виде рибонуклеопротеидного комплекса, включающего адаптерный белок РР7 сшитый с интересующим белком и гидовой РНК SEQ ID NO: 1.

Указанные выше способы доставки в клетку системы с РР7 белком аналогичны способам доставки в клетку белка с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности РР7 белка.

Для увеличения эффективности редактирования за счет гомологичной репарации в клетки, куда доставляется предложенная система с интересующим белком, должны быть доставлены CRISPR белок и донорная конструкция.

Доставка CRISPR белков в виде ДНК или РНК последовательностей может проходить совместно или независимо от доставки предложенной системы с интересующим белком.

Сборку рибонуклеопротеинового комплекса рекомендуется проводить совместно с CRISPR белком перед доставкой в клетки. Доставку донорной последовательности в виде двуцепочечной или одноцепочечной ДНК рекомендуется проводить совместно с доставкой предложенной системы с интересующим белком.

Доставку донорной последовательности в виде двуцепочечной или одноцепочечной ДНК рекомендуется проводить совместно с доставкой предложенной системы с интересующим белком.

Специфичность редактирования с использованием предложенной системы задается направляющей последовательностью РНК длиной 20 пар оснований, которая добавляется с 5' конца к последовательности гидовой РНК SEQ ID NO: 1. Рекомендуемый способ добавления направляющей РНК - это клонирование требуемой последовательности перед последовательностью ДНК, кодирующей РНК SEQ ID NO: 1 по BsmBI сайтам рестрикции. Пример такой конструкции представлен на фиг. 1.

Аналогично можно проводить сшивку интересующего белка с РР7 белком. Для этого к последовательности интересующего белка методом ПЦР с перекрывающимися праймерами добавляется линкер и сайты рестрикции. Рекомендуется использовать линкер с NLS последовательностью, направляющей белок в ядро. По сайтам рестрикции кодирующая последовательность интересующего белка добавляется с 3' конца кодирующей последовательности белка РР7. Пример такой конструкции представлен на фиг. 2.

Для проверки полученной системы в эукариотических клетках была получена плазмида, экспрессирующая РР7 белок, сшитый через короткий линкер с CtIP белком. Для CtIP белка известно увеличение эффективности редактирования при доставке его к месту разрыва [Tran N.-T., Bashir S., Li X., Rossius J., Chu V. Т., Rajewsky K., Kühn R., Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors // Frontiers in Genetics. 2019. T. 10. C. 2-5.]. Для считывания экспрессии конструкции к С-концу CtIP белка через разрезающуюся Т2А последовательность был добавлен красный флуоресцентный белок mRuby. В эту же плазмиду была добавлена кассета для транскрипции последовательности гидовой РНК SEQ ID NO: 1.

Эффективность системы была проверена на клеточной линии Hela Kyoto. В качестве места для редактирования генома был выбран TGTCCCTAGTGGCCCCACTG участок AAVS1 локуса. Редактирование генома происходило за счет вставки флуоресцентного EGFP белка. Использование флуоресцентного белка позволяет считывать эффективность редактирования за счет появления в клетках зеленого флуоресцентного сигнала, который можно детектировать методом проточной цитофлуориметрии. При проверке эффективности использовался следующий протокол. Методом лентивирусной вставки была получена моноклональная клеточная линия HelaKyoto экспрессирующая spCas9 белок. Экспрессия белка была подтверждена с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Клетки были рассажены на планшет и трансфецированы двумя плазмидами - плазмидой, которая содержит кассету для экспрессии РР7 белка сшитого с CtIP белком и кассету для экспрессии последовательности гидовой РНК SEQ ID NO: 1 направленной к TGTCCCTAGTGGCCCCACTG участку AAVS1 локуса, и донорной плазмидой, которая содержит EGFP последовательность для встраивания в AAVS1 локус. Через два дня после трансфекции методом цитофлуориметрического сортинга были отобраны клетки с флуоресцентным сигналом mRuby и фоновым сигналом от EGFP донора. Чтобы избавиться от фонового EGFP сигнала клетки велись на протяжении 10 дней после сортинга. После этого оставшийся процент клеток с EGFP сигналом был подсчитан методом проточной цитофлуориметрии. Эти данные позволяют делать выводы об эффективности репарации при использовании предложенного способа.

В качестве контрольных точек использовались CRISPR система без CtIP белка, CRISPR система с привлечением CtIP белка с помощью предложенной системы привлечения белка, в которой последовательность гидовой РНК SEQ ID NO: 1 была заменена на последовательность гидовой РНК для MS2 адаптерной системы, CRISPR система с привлечением CtIP белка с помощью MS2 адаптерной системы, CRISPR система с привлечением CtIP белка с помощью MS2 адаптерной системы с единичной C/U заменой в шпильках. Единичные C/U замены в шпильках MS2 системы изменяют динамику привлечения белков к месту разрыва и были использованы в качестве альтернативного варианта классической MS2 системы. Для каждой точки эксперимент проводился в трех повторностях. Статистика рассчитывалась с использованием t-критерия Стьюдента в сравнении с контролем spCas9 (**р<0.01, ***р<0.001), либо между разными вариантами систем, где это обозначено. Результаты эксперимента представлены на фиг. 3.

По результатам эксперимента видно, что специфичность предложенной системы не пересекается со специфичностью MS2 адаптеров. Эффективность предложенной системы совпадает с эффективностью редактирования при использовании MS2 адаптеров. Предложенная система расширяет возможности существующих систем редактирования и облегчает их применение в фундаментальных исследованиях клеточной биологии, а также терапии генетических заболеваний.

Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека, не предполагает использование человеческих эмбрионов.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="Последовательности.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2022-12-15">

<ApplicantFileReference>202212152</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

автономное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Российский национальный исследовательский медицинский

университет имени Н.И. Пирогова&quot; Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniya &quot;Rossijskij

natsionalnyj issledovatelskij meditsinskij universitet imeni N.I.

Pirogova&quot; Ministerstva zdravookhraneniya Rossijskoj

Federatsii</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Система привлечения белка к месту

разрыва ДНК для увеличения эффективности редактирования генома

млекопитающего</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>140</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..140</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gttttagagctaggcctaaggagtttatatggaaacccttaggcctagc

aagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggcctaaggagtttatatggaaacccttaggccaagtg

gcaccgagtcggtgctttttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к системе для привлечения белка к месту разрыва ДНК при редактировании генома млекопитающего путем гомологичной репарации с использованием CRISPR системы, включающей интересующий белок, сшитый с белком РР7, и гидовую РНК. Предложенная система расширяет арсенал существующих систем редактирования и облегчает их применение в фундаментальных исследованиях клеточной биологии, а также терапии генетических заболеваний. 3 ил., 1 пр.

Система для привлечения белка к месту разрыва ДНК при редактировании генома млекопитающего путем гомологичной репарации с использованием CRISPR системы, включающая интересующий белок, сшитый с белком РР7 или с белком с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности белка РР7, и гидовую РНК с последовательностью SEQ ID NO: 1.