Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма "Лавр" возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Инфекционный ринотрахеит кошек – контагиозное вирусное заболевание, характеризующееся поражением верхних дыхательных путей, конъюнктивитами и кератитами [1].

Возбудителем инфекционного ринотрахеита кошек является вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae, роду Varicellovirus, виду Alpaherpesvirus 1 (FHV-1 - Felid alphaherpesvirus-1) [2]. Нуклеиновая кислота вируса представлена двуцепочечной ДНК размером около 135 800 п.н. [3] Нуклеотидные и аминокислотные последовательности референтного штамма «С-27» вируса инфекционного ринотрахеита кошек представлена в GenBank под номером NC_013590.2 [4]. Важным при выявлении генома возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек является ген UL47, который кодирует аминокислотную последовательность бекла tegument protein VP13/14 (белок тегумента VP13/14, 866 а.о.), который располагается в диапазоне 14057…16656 п.н. и имеет размер 2598 п.н.

Инфекционный ринотрахеит был зарегистрирован у многих представителей семейства кошачьих, таких как европейских дикие кошки, песчаные кошки, леопардовые кошки, гепарды, горные львы, оцелоты и др. [3, 5]. К инфекции восприимчивы как взрослые кошки всех пород, так и котята, но у молодых животных, зараженных FHV-1, нередко наблюдается летальный исход в результате осложнения пневмонией. В литературе описаны также случаи развития менингоэнцефалита в результате заражения FHV-1 [6] После острой фазы заболевание часто переходит в латентную форму с пожизненным вирусоносительством. Исследователи из Австралии определили серопревалентность FHV-1 на уровне 11-17% у диких представителей семейства кошачьих и 37% у домашних кошек, однако, по другим оценкам около 90% кошек считаются серопозитивными по отношению к FHV-1, из них 45% выделяют вирус в течение всей жизни [1, 5].

Система мер для борьбы с инфекционным ринотрахеитом кошек и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [7, 8, 9]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении неинактивированное вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности вируса для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих ДНК вируса инфекционного ринотрахеита кошек в активном состоянии.

Традиционно для определения титра инфекционной активности данного вируса кошек применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошки (CRFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [8]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с формированием цитопатического действия (ЦПД) в течение нескольких суток; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) наличие вероятности риска контаминации культуры клеток.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе современных методов молекулярной биологии и генетики.

Был разработан способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Предложенный способ является высокочувствительным и специфичным, объективным, экспрессным, более дешевым (стоимость одного исследования на 26,62% ниже по сравнению с наиболее близким прототипом, а именно, составляет 478,65 руб. по сравнению с 652,30 руб.). Таким образом, способ отличается экономической выгодой по временному показателю и материальным затратам. Разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности с возможностью вычитания фоновых показаний опосредованно определять титр инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением интеркалирующего красителя третьего поколения dsSafe.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного и относительно дешевого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины до 2,5 ч; 2) снизить стоимость одного исследования; 3) повысить аналитическую чувствительность до 0,1 lg ТЦД₅₀/см³ благодаря использованию оригинальных высокоспецифичных праймеров и применению флуоресцентного красителя dsSafe; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины (Т_{FHV-UL47-Lavr}) и циклом количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe) гена UL47, представленной в виде логарифмической функции:

lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_q-dsSafe + 9,7689

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9987) и эффективностью амплификации 99,85%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с помощью разработанного способа.

Штамм «Лавр» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: № 457-деп / 23-7 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 – Нуклеотидная последовательность оригинальных прямого и обратного праймеров для гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Примечание: А – дизайн прямого праймера, Б – дизайн обратного праймера, rev/compl – реверсивная комплементарная форма.

Фиг. 2 – Зависимость титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (Т_{FHV-UL47-Lavr}) и цикла количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe), выверенная на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (n=32, p<0,001).

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена UL47 кДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита вакцинного штамма «Лавр».

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, которые кодируются геном UL47 кДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита вакцинного штамма «Лавр».

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера FHV-UL47-F гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера FHV-UL47-R rev/compl гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании РНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек; 2) проведении обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента гена UL47 вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение оригинальных высокоспецифичных праймеров FHV-UL47-F с дизайном 5'-GGTGAAGATGAGAACCCGGTTGT-3' и FHV-UL47-R rev/compl с дизайном 5'-TCATCCGAATCCCCTTCCGC-3', а также флуоресцентного красителя dsSafe для синтеза фрагмента размером 170 п.н.; 3) построении кривых плавления высокого разрешения для ампликонов гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек; 4) определении титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины (Т_{FHV-UL47-Lavr}) с применением логарифмической функции: lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_q-dsSafe + 9,7689, с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9987) и эффективностью амплификации 99,85%.

Молекулярные методы диагностики значительно улучшились за последние годы, что дает огромный потенциал для их применения в клинической диагностике, где требуется более быстрое и точное выявление инфекционных возбудителей [6]. В настоящее время обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция применяются для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек [7, 8].

Для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины ранее разработанный способ не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe по сравнению с наиболее близким прототипом отличается чувствительностью и специфичностью, экспрессностью, снижением стоимости проведения исследования.

В отличие от наиболее близкого прототипа разработанный способ включает этапы экстрагирования РНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек; проведения обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента гена UL47 вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применение разработанных оригинальных высокоспецифических праймеров и флуоресцентного красителя DsSafe; построения кривых плавления высокого разрешения для ампликонов гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек; определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с применением логарифмической функции.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 26,62%; повысить аналитическую чувствительность до 0,1 lg ТЦД₅₀/см³; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины (Т_{FHV-UL47-Lavr}) и циклом количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe) в виде разработанной логарифмической функции. Таким образом, актуально применять предложенный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений цикла количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe) кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек и расчет титра инфекционной активности возбудителя данного заболевания с использованием логарифмической функции.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe и логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки-dsSafe и титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек вакцинного штамма «Лавр».

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в применении высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров FHV-UL47-F с дизайном 5'-GGTGAAGATGAGAACCCGGTTGT-3' и FHV-UL47-R rev/compl с дизайном 5'-TCATCCGAATCCCCTTCCGC-3' для синтеза фрагмента размером 170 п.н., в применении флуоресцентного красителя dsSafe для проведения реакции амплификации и в разработке логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки-dsSafe и в расчете титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек вакцинного штамма «Лавр».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале – Зависимость титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (Т_{FHV-UL47-Lavr}) и цикла количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe), выверенная на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (n=32, p<0,001). (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины подготавливают контрольную панель стандартов данного штамма возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток почки кошки CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют РНК с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» (ООО «Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе проводят обратную транскрипцию, реакцию амплификации с применением праймеров и флуоресцентного красителя dsSafe для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн оригинальных праймеров отражается в таблице 2.

Расчет дизайна праймеров проводили на основании нуклеотидных последовательностей гена UL47 возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. В качестве гомологичных участку указанного гена кДНК возбудителя применяют следующие олигонуклеотиды:

FHV-UL47-F с дизайном 5'-GGTGAAGATGAGAACCCGGTTGT-3' и FHV-UL47-R rev/compl с дизайном 5'-TCATCCGAATCCCCTTCCGC-3' для синтеза фрагмента размером 170 п.н (фиг. 1) в концентрации 6 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,22 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют хлорид магния до концентрации 3,4 мМ. В качестве катализатора обратной транскрипции применяют фермент MMLV-ревертаза (1 е.а.), для реакции амплификации кДНК возбудителя в режиме реального времени – Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 е.а.). Элюаты РНК вируса каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах B. Deiman и R. Sooknanan [10]. Длины FHV-UL47-F и FHV-UL47-R rev/compl составляют 23 и 20 н.о. каждый, что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров равен 7168,7 и 6287,1, соответственно. Праймеры очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров. При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, – 5, а для образования «шпилек», – 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе олигонуклеотидных праймеров для ПЦР в режиме реального времени кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод ближайших соседей [11].

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных праймеров представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 195,6 ккал/моль, 30,8 ккал/моль, 515,3 кал/(K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 174,6 ккал/моль, 28,3 ккал/моль, 455,5 кал/(K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления, представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма учета концентрации солей для прямого и обратного праймеров составили по 56°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 58°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров с участком UL47 возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек при температуре 58°.

Последовательности разработанных праймеров проверяли на наличие нежелательных совпадений с последовательностями нуклеиновых кислот других возбудителей с использованием GenBank. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для используемых олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляют в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 5 мин для активации фермента Taq ДНК-полимеразы. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 7 с, отжиг олигонуклеотидов при температуре 56°С в течение 20 с и элонгацию проводят при температуре 72°С в течение 10 с.

Результаты ПЦР в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe), определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (C_q-dsSafe). В случае присутствия в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде логистической кривой). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сформированные графики, полученные при анализе флуоресценции красителя dsSafe, входящего в состав реакционной смеси. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует логистическая кривая в виде графика, приближенного к экспоненте.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки-dsSafe и титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:

Е=(10^-1/k-1),

где k – угловой коэффициент в зависимости:

C_q-dsSafe = -k × lg Т_{FHV-UL47-Lavr} + b,

а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного в сырье для вакцины и цикла количественной оценки-dsSafe.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины и циклов количественной оценки-dsSafe реакции амплификации подготавливали контрольную панель стандартов вакцинного штамма «Лавр», в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса с титрами инфекционной активности: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток почки кошки CRFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли РНК в соответствии с методикой, представленной выше.

Проводили реакцию амплификации в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики, как указано выше. Установили зависимость между циклом количественной оценки-dsSafe и титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции:

lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_q-dsSafe + 9,7689

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9987) и эффективностью амплификации 99,85%. Количество повторностей равно 30.

Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек для производства вакцины с помощью разработанного способа.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек штамма «Лавр» с титрами инфекционной активности 6,00, 6,25, 6,50, 6,75, 7,00, 7,25 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы № 1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек вакцинного штамма «Лавр» с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток почки кошки CRFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 10 повторностях. Этап элюирования РНК, постановку обратной транскрипции и реакцию амплификации в режиме реального времени проводили, как описано выше.

Средние значения пороговых циклов амплификации для проб № 1-6 составляли 12,37±0,01, 11,77±0,01, 10,90±0,01, 9,94±0,01, 9,21±0,01, 8,24±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией:

lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_q-dsSafe + 9,7689,

рассчитали средние значения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек для проб № 1-6, которые составили 6,05, 6,23, 6,49, 6,78, 7,00, 7,29 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 9,21±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности представленного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 400 суспензий культурального возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек вакцинного штамма «Лавр» с титрами инфекционной активности от 0,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного ринотрахеита кошек вакцинного штамма «Лавр» с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток почки кошки CRFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 12 повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот, постановку обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией, представленной выше, с получением значений титра инфекционной активности для каждой из 400 проб. Для положительного контроля значение цикла количественной оценки составило 9,21±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей логистические кривые не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли тестировали в реакции амплификации с помощью разработанных праймеров и логарифмической функции. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со значениями стандартов на 99,74-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=80), на 99,19-99,73% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=80), на 98,99-99,18% для 3,9-1,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=80), на 96,24-99,56% для 0,99-0,10 lg ТЦД₅₀/см³ (n=80), на 93,02-96,23% для 0,00-0,09 lg ТЦД₅₀/см³ (n=80). Каждую пробу исследовали в 12 повторностях разными операторами и на разных амплификаторах для повышения достоверности и вопроизводимости результатов анализа. Таким образом, полученные данные свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

При определении аналитической чувствительности подготавливали серию стандартов вакцинного штамма «Лавр» с титрами инфекционной активности_, равными 0,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 12 повторностях. Этапы работы провели, как описано выше. Выявлено, что с достоверностью 96,24-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек со значениями от 0,10 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³.

Аналитическая чувствительность разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe составляет не менее 0,1 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 96,24%.

Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe.

При анализе специфичности, исследовали суспензии вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек, а также возбудителей парвовирусного энтерита собак, коронавирусного энтерита собак, аденовируса 1 серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составляло не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 7 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (таблица 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю инфекционного ринотрахеита кошек и может быть использован для определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» в сырье для вакцины.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения являются возможности сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий при определении титра инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 26,62%; повысить аналитическую чувствительность до 0,1 lg ТЦД₅₀/см³ за счет разработки оригинальных высокоспецифичных праймеров и применения флуоресцентного красителя dsSafe; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины (Т_{FHV-UL47-Lavr}) и циклом количественной оценки-dsSafe (C_q-dsSafe ), представленной в виде логарифмической функции:

lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_q-dsSafe + 9,7689

с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,9987) и эффективностью амплификации 99,85%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с помощью разработанного способа.

Источники информации

1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.

2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-1 (Дата обращения: 13.10.2023).

3. Bergmann M, Ballin A, Schulz B, Dörfelt R, Hartmann K. Therapie des akuten viralen Katzenschnupfens [Treatment of acute viral feline upper respiratory tract infections]. Tierarztl Prax Ausg K Kleintiere Heimtiere. 2019 Apr;47(2):98-109. German. doi: 10.1055/a-0870-0801. Epub 2019 Apr 23. PMID: 31013527.

4. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 14.10.2023).

5. Lee Y, Maes RK, Kruger JM, Kiupel M, Giessler KS, Soboll Hussey G. Safety and Efficacy of Felid Herpesvirus-1 Deletion Mutants in Cats. Viruses. 2021 Jan 22;13(2):163. doi: 10.3390/v13020163. PMID: 33499363; PMCID: PMC7911815.

6. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.

7. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.

8. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087. doi: 10.2460/ajvr.21.07.0087. PMID: 35930783.

9. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.

10. Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus deteCqion-London: Academic press, 1995. – P. 261-285.

11. Анализ методом ближайших соседей. URL: https://studfile.net/preview/4000471/page:45 (Дата обращения: 11.10.2023).

Таблица 1

Состав реакционной смеси для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

Наименование компонента смеси Концентрация компонента FHV-UL47-F-праймер 6 пМ FHV-UL47-R rev/compl - праймер 6 пМ Дезоксирибоаденозинтрифосфат (dATP) по 0,22 мМ каждого Дезоксирибогуанозинтрифосфат (dGTP) Дезоксирибоцитидинтрифосфат (dCTP) Дезоксириботимидинтрифосфат (dTTP) Хлорид магния 3,4 мМ Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) 20% от объема реакционной смеси Taq ДНК-зависимая ДНК-полимераза 1 е.а. MMLV-ревертаза 1 е.а.

Примечание: объем вносимого элюата ДНК – 5 мкл,

объем реакционной смеси – 25 мкл.

Таблица 2

Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

Наименование олигонуклеотидов Дизайн олигонуклеотидов (5'…3') FHV-UL47-F-праймер GGTGAAGATGAGAACCCGGTTGT FHV-UL47-R rev/compl -праймер TCATCCGAATCCCCTTCCGC

Таблица 3

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

Параметры олигонуклеотидов Характеристики олигонуклеотидов FHV-UL47-F-праймер FHV-UL47-R rev/compl -праймер Длина (L), н.о. 23 20 Молекулярный вес (Mw) 7168,7 6287,1 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 195,6 174,6 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 30,8 28,3 Дифференциал энтальпии (dS), кал/ºК×моль 515,3 455,5 Температура плавления (Tm), °С:
- метод ближайших соседей 56 56

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 4

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и реакции амплификации для опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Количество циклов Обратная транскрипция - 42 15 мин. 1 Предварительный прогрев - 95 5 мин. 1 Реакция амплификации Денатурация 95 7 с 40 Отжиг праймеров 56 20 с Элонгация 72 10 с

Таблица 5

Достоверность способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

(n=12)

Значения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (стандарты), lg ТЦД₅₀/см³ Достоверность (%) определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с помощью разработанного способа 8,0-6,0 99,74-100,00 5,9-4,0 99,19-99,73 3,9-1,0 98,99-99,18 0,99-0,1 96,24-99,56 0,0-0,09 93,02-96,23

Таблица 6

Специфичность способа опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe (разработанный способ)

(n=7)

Наименование инфекционного агента Результаты исследования с помощью предлагаемого изобретения Возбудитель инфекционного ринотрахеита кошек штамм «Лавр» + Возбудитель парвовирусного энтерита собак - Возбудитель коронавирусного энтерита собак - Аденовирус 1 серотипа -

Примечание: «+» - наличие экспоненциального графика (положительный образец),

«-» - отсутствие экспоненциального графика (отрицательный образец).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FHV-Lavr-UL47.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-07-02">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-15</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>555</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-15</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя

инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе

анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с

применением флуоресцентного красителя ds Safe</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2592</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2592</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcagattgggtccccgaaagcggtggacccacacgacgcccacgaa

gatcttctaatcgtcgtagtcatccctttttgagacctgaaggtggcaatcctgaacgtggacagcaagt

acaagatattagagatcagtatgggactagcgcagatcccagggaagatggaccatcaacgtctggtttt

tggcattttatgcgaggggtattcggtggtgaagatgagaacccggttgtgatgcatcgcccaagacgtg

attttcaaccaccaccgggtgaagactcaagcgatgaagatgatgaagaggacccccggcaatttgcctc

atggggtgacatgttactatatggagatcaatacgaggcggaaggggattcggatgatcaagaagaggct

gacaataatataacagatgatgacacttctgatatggacggaataagcgatgatgaggaagaagatgata

atgaaatcgatatggttggatatggagaggaagataattatcccaatctaaggggagatgaagaagcctc

cttggcaatcgactctgatgacccgatacctagtggggatgggggggaagaggatgtggactctgaagac

cttccagctgatagggatcgtcttacatctctcctaagatatttggaaagtggaatacttgggacatcat

cacgaagattgatagagagaaccgcgagggaggtatacatggatcaatttcaaccaggtggtcgtggagc

agaggtagaatctgggatatctgatcgtctaaaccgtctggtccggggtgggatttcagatttacaattt

cggggaccctttttagaggaagaagatgatccaaatgccgaaactggagaatggcggaggctggtaccca

tcacagttacactaactccatcatgggaattagtaatacgtgatcatggtcgccggcgacgcacattaaa

cccagaaactattttctatgaagatgtggaaggattgcgtaggttacgtgtaccatctgtcctagcggat

aggttgacacgagaggcatttatcgagaaaatgaatgttctgtttatgtttagggacctatcagagagcg

ataattataacgaagaacagatatggactaccatgccatctctacacggttttgcgcagggttgttggtt

tgaggcggatatcgcatatccaccagggggtatgtatactacacccaccagtgaggtacgtgggatatgg

agacgtactattcgacaggggatagtcctccaacacagactttgcctcggtaattttatcagagcggtaa

ccatcaatgacttacaccatcggtccgcaatcaattttctattggatgcgtgtatccgatcgtgtataaa

ctgtcatatgatgggaagattaattcataatgcctataatcagttggaaggtcaggaagcccctataggc

tctcttgcatggatggtaggaagaacggccatacgaccacttccaacaccatgcactcagtattttccac

tgaaggaattttttggggcacctagaggatctcgtaattcaatataccgcagttcctttggtgcgctttt

gtattggtcggaactcagattggccattggggatcctggaaatattaatatcagatatgccgggtatcat

atccagacagcagaggtctatcttctctctcgtggtacatctaaaaatcctggatatacgagggaggaat

tagatggtatggaaactatcttatctctggggacacttatgttagaggtggcggtgcagtggatgtacgt

agccacggctcgcattctcagtgagcacccgaatatcaaagcgtaccgtagcgtacgtagtacagtattc

gcgtccggtgttccgctgggaagtgttaaactcgcggatgctgaatatgaccttttacgccgtcctgagg

tgtcggtagcccgtgacaccaccgcgttaggtcaagcattatttttagcatattatacaaccagaactgc

cctaacggcactgattagagattatgcggtcgcttctatgttaggtcatgaacggacggccatgagcgca

tatctaggtattgtactgctaatccaacgccttggggggcacttgaacttaatattgttgaccctggccg

gggcggctatacatggaggacgccgagtgcccatacatcaggcgacgctaccacggtataccatgattgc

tgatatactagctccgttgcttcaacaacagacattgacaggtttctggaaaacaagagatatactatgc

caccaattgggactcgtaccaatgccgggtccacccacacaaggaaaacaggtggttataaatctggcta

tgccatctgaggatctcgagggattgacaccccagggagctatacaatctaacacggcattgggagatat

ccaggtagacctggcggatactcttcaacattatcatcggatgatccttggggagatgtcatcagatcag

ttgggacggcaagggctggaacgtatgcgaggtggagcttcaaggagacgagggaggcggggaattaacc

atgtataagtactctgtgcatat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>864</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..864</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MADWVPESGGPTRRPRRSSNRRSHPFLRPEGGNPERGQQVQDIRDQYGT

SADPREDGPSTSGFWHFMRGVFGGEDENPVVMHRPRRDFQPPPGEDSSDEDDEEDPRQFASWGDMLLYGD

QYEAEGDSDDQEEADNNITDDDTSDMDGISDDEEEDDNEIDMVGYGEEDNYPNLRGDEEASLAIDSDDPI

PSGDGGEEDVDSEDLPADRDRLTSLLRYLESGILGTSSRRLIERTAREVYMDQFQPGGRGAEVESGISDR

LNRLVRGGISDLQFRGPFLEEEDDPNAETGEWRRLVPITVTLTPSWELVIRDHGRRRRTLNPETIFYEDV

EGLRRLRVPSVLADRLTREAFIEKMNVLFMFRDLSESDNYNEEQIWTTMPSLHGFAQGCWFEADIAYPPG

GMYTTPTSEVRGIWRRTIRQGIVLQHRLCLGNFIRAVTINDLHHRSAINFLLDACIRSCINCHMMGRLIH

NAYNQLEGQEAPIGSLAWMVGRTAIRPLPTPCTQYFPLKEFFGAPRGSRNSIYRSSFGALLYWSELRLAI

GDPGNINIRYAGYHIQTAEVYLLSRGTSKNPGYTREELDGMETILSLGTLMLEVAVQWMYVATARILSEH

PNIKAYRSVRSTVFASGVPLGSVKLADAEYDLLRRPEVSVARDTTALGQALFLAYYTTRTALTALIRDYA

VASMLGHERTAMSAYLGIVLLIQRLGGHLNLILLTLAGAAIHGGRRVPIHQATLPRYTMIADILAPLLQQ

QTLTGFWKTRDILCHQLGLVPMPGPPTQGKQVVINLAMPSEDLEGLTPQGAIQSNTALGDIQVDLADTLQ

HYHRMILGEMSSDQLGRQGLERMRGGASRRRGRRGINHVVLCAYQ</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtgaagatgagaacccggttgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcatccgaatccccttccgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe. Основными преимуществами предлагаемого изобретения являются возможности сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий при определении титра инфекционной активности штамма «Лавр» возбудителя ИРТ кошек в сырье для вакцины до 2,5 ч; снизить стоимость одного исследования на 26,62%; повысить аналитическую чувствительность до 0,1lgТЦД₅₀/см³ благодаря применению высокоспецифичных праймеров и применению флуоресцентного красителя dsSafe; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя ИРТ кошек в сырье для вакцины и циклом количественной оценки-dsSafe, представленной в виде логарифмической функции с высокой достоверностью аппроксимации 0,9987 и эффективностью амплификации 99,85%. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины на основе анализа кривых плавления ампликонов высокого разрешения гена UL47 с применением флуоресцентного красителя dsSafe и олигонуклеотидных праймеров FHV-UL47-F с дизайном 5'-GGTGAAGATGAGAACCCGGTTGT-3' и FHV-UL47-R rev/compl с дизайном 5'-TCATCCGAATCCCCTTCCGC-3' для синтеза фрагмента размером 170 п.н., и включающий следующие этапы:

- экстрагирование РНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек;

- проведение обратной транскрипции и реакции амплификации специфического фрагмента гена UL47 вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек с применением праймеров и использованием флуоресцентного красителя dsSafe;

- построение кривых плавления высокого разрешения для ампликонов гена UL47 кДНК вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек;

- расчет титра инфекционной активности вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сырье для вакцины с применением логарифмической функции: lg Т_{FHV-UL47-Lavr} = -0,3007 × C_{q-ds Safe} + 9,7689, с достоверностью аппроксимации 0,9987, и эффективностью амплификации 99,85%.

2. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается до 2,5 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 0,1 lg ТЦД₅₀/см³.