Способ дифференциации вакцинного штамма "Лавр" возбудителя инфекционного ринотрахеита от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ кошек с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ кошек с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Ринотрахеит кошек - широко распространенное инфекционное заболевание вирусной этиологии. Впервые болезнь описана в США как «синдром поражения верхних дыхательных путей» у котят [1]. В России выделение вируса с установлением его этиологической роли было осуществлено Э.И. Элизбарашвили и соавт., затем в Сибири во время вспышки заболевания в питомнике домашних кошек [2].

Возбудитель болезни (FHV, Felid alphaherpesvirus), относится к подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirus, вызывает у взрослых животных преимущественно поражения органов респираторного тракта и глаз [3].

Нуклеиновая кислота вируса представлена двуцепочечной ДНК размером около 135 800 п.н. Важным для выявления генома возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек является V1-ген, который располагается в диапазоне 1259…1690 п.н., имеет размер 432 п.н. (фиг. 1), кодирует мембранный белок V1 размером 144 а.о. [4].

Система мер для борьбы с инфекционным ринотрахеитом кошек и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних животных [5-8].

Для иммунизации животных применяют вакцину, включающую в свой состав антиген FHV вакцинного штамма «Лавр». В случае вспышек данного заболевания важно правильно дифференцировать вакцинный штамм «Лавр» от других штаммов и полевых изолятов ИРТ кошек при проведении лабораторной диагностики для подтверждения безопасности производимого вакцинного лекарственного препарата. Дифференциация штамма «Лавр» также важна для принятия дальнейших мер по лечению и борьбе с заболеванием, поскольку штаммы существенно отличаются друг от друга генетически и по строению и функциям вирусных белков. Следует отметить, что данный анализ необходим на этапе контроля качества вирусосодержащего сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования требуемого штамма для производства вакцин против FHV.

Штамм «Лавр» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: № 457 – деп. / 23-7 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Учитывая, что в настоящее время вакцинный штамм «Лавр» FHV применяется для изготовления вакцин, целесообразно провести поиск способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ участка генома FHV, что даст возможность разработать способ на основе методов молекулярной биологии для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию последнего поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследование температурных графиков плавления продуктов ПЦР целевых участков возбудителей инфекционных заболеваний стало перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов [9-13].

Исследование пиковых значений температур плавления продуктов ПЦР для различных изолятов/штаммов микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ампликонов в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ампликонов и флуоресцирующих красителей последнего поколения позволила выявлять генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных ДНК [14-18].

Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения ПЦР с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определённой температуры ампликоны начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного метода можно достичь высокой точности анализа [15].

Прототипным вариантом проведения дифференциации вакцинного штамма «Лавр» FHV от других штаммов и полевых изолятов вирусов ИРТ является реакция амплификации со специфическими праймерами, гель-электрофорез и секвенирование по Сенгеру [19]. Данный метод является дорогостоящим, трудоемким и продолжительным по времени. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов/изолятов вирусов ИРТ с помощью более современных и менее трудоемких методов молекулярно-биологического анализа.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, быстрого способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Сущность разработанного способа заключается в следующем: 1) создание дизайна оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных прямого и обратного праймеров для синтеза фрагмента ДНК с мутациями, уникальными для вакцинного штамма «Лавр» FHV (фиг. 2); 2) проведение ПЦР с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605; 3) постепенный нагрев ампликонов в широком диапазоне температур, и при достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула ДНК распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя SuperNova v605. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ампликонов, возможно проводить дифференциацию вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2 ч; 2) применять оранжевый полимерный краситель последнего поколения SuperNova v605, который не ингибирует реакцию и характеризующийся яркой флуоресценцией после встраивания в ампликоны, что позволяет достичь точности и чувствительности проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка ДНК V1-гена (целевой участок в диапазоне 1282…1382 п.н., размер ПЦР-продукта составляет 98 п.н.). Данная разработка.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала технических средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против инфекционного ринотрахеита кошек из вакцинного штамма «Лавр», путем использования способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров FHV-F-V1-DIFF и FHV-R-V1-DIFF, рассчитанных для целевого участка V1-гена FHV (размер ПЦР-продукта составляет 98 п.н.); 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению оранжевого полимерного красителя последнего поколения SuperNova v605; 3) с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена по найденным константам проводить дифференциацию вакцинного штамма «Лавр» FHV от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Модель V1-гена ДНК возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек.

Фиг. 2 - Дизайн оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605. Примечание: rev/compl - перевернутая комплементарная форма обратного праймера.

Фиг. 3 - Диаграмма максимумов температур плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов FHV. Примечание: для исследования использовали следующие штаммы и изоляты возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек: «Лавр», «LOU-27», «WH2020», «MM-10», «GD2018», «CH-B», «KANS_02», «NEWY_03», «CALI_14», «PHIL_01», «KANS_04», «MOLW_03».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов ДНК V1-гена вакцинного штамма «Лавр» FHV;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых ДНК V1-гена вакцинного штамма «Лавр» FHV.

SEQ ID NO:3 представляет последовательность прямого праймера FHV-F-V1-DIFF.

SEQ ID NO:4 представляет последовательность обратного праймера FHV-R-V1-DIFF.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагирование ДНК из образца; 2) проведение ПЦР специфического фрагмента ДНК V1-гена FHV размером 98 п.н. с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров FHV-F-V1-DIFF с дизайном 5'- CATGATATACGATGACAATAAGT-3' и FHV-R-V1-DIFF с дизайном 5'- CTACGGACCCAAGAATTGTAT-3' (фиг. 2, таблицы 1, 2) и оранжевого полимерного красителя SuperNova v605; 3) детекция результатов анализа с температурных графиков плавления продуктов ПЦР и проведение инструментального дифференциального анализа геномов вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других производственных штаммов/полевых изолятов FHV.

По результатам анализа опубликованных в научной литературе данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации штаммов и изолятов FHV с помощью секвенирования по Сенгеру [19], однако, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа максимумов температур плавления ПЦР-продуктов с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить анализ. Краситель SuperNova v605 более чувствителен своих аналогов, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот. Максимум возбуждения для красителя SuperNova v605 отмечается при длине волны 405 нм, а максимум излучения - при 605 нм [20].

В отличие от прототипа разработанный способ позволяет провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка ДНК V1-гена вакцинных штаммов/полевых изолятов FHV. Разработанный способ предусматривает проведение ПЦР специфического фрагмента V1-гена ДНК FHV в диапазоне 1285…1382 п.н. с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров. Разработанный способ предусматривает проведение плавления продуктов ПЦР в разработанном режиме с учетов пиков температур плавления двуцепочечных ДНК и применение красителя SuperNova v605, а также детекцию результатов анализа с определением максимальных значений температур плавления для решения задачи по дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Обоснованием выбранного участка V1-гена FHV является наличие двух уникальных нуклеотидных мутаций, характерных для вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек в сравнении со штаммами и изолятами FHV, а именно замена А₁₃₁₄ на T₁₃₁₄, G₁₃₄₈ на T₁₃₄₈.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров FHV-F-V1-DIFF и FHV-R-V1-DIFF, рассчитанных для амплификации целевого участка ДНК V1-гена FHV размером 98 п.н. и анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v605.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена также на графическом материале - Диаграмма максимумов температур плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов FHV. Примечание: для исследования использовали следующие штаммы и изоляты возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек: «Лавр», «LOU-27», «WH2020», «MM-10», «GD2018», «CH-B», «KANS_02», «NEWY_03», «CALI_14», «PHIL_01», «KANS_04», «MOLW_03» (фиг. 3).

На основном этапе исследования проводят выделение ДНК из образцов с использованием набора «ДНК-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе проводят ПЦР с применением высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров и оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 для исследования стандартного образца и проб. Стандартным образцом является культуральная суспензия FHV вакцинного штамма «Лавр», которая изначально исследована с помощью секвенирования по Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте (n = 5). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ.

Для постановки ПЦР готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х - 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ - 2,5 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 5 мкл, краситель SuperNova v605 - 1,0 мкл, Taq ДНК-полимераза - 1 е.а. (0,1 мкл), элюат ДНК - 5 мкл, деионизированная вода - 4 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку ПЦР осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США), или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Предварительную денатурацию проводят при температуре 98°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 98°С в течение 10 секунд, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 57°С в течение 25 секунд и элонгацию - при температуре 72°С в течение 20 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов ДНК представленных выше вакцинных штаммов/полевых изолятов FHV для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие максимумы температур плавления характерны для указанных выше штаммов/изолятов FHV, что позволяет проводить дифференциацию вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью разработанного способа.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Разработка способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из вируссодержащего образца, как указано выше.

На следующем этапе осуществляли постановку ПЦР для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для осуществления реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше.

Исследование логистических кривых для анализа данных пиков температуры плавления ампликонов участка V1-гена ДНК штаммов/полевых изолятов FHV и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96. Проводили построение кривых плавления в виде параболы и детектировали максимумы температур плавления для полученных графиков. Тестировали кДНК FHV указанных штаммов и полевых изолятов в 30 повторностях для каждого образца для получения результатов с высокой степенью достоверности (табл. 4).

Выявили, что при n=30, p<0,001 данная температура для вакцинного штамма «Лавр» составила 75,36±0,01°С, для остальных исследуемых штаммов/изолятов вируса ИРТ - 73,54±0,04°С (фиг. 3, табл. 4).

Таким образом, для исследуемых штаммов/изолятов FHV характерны определенные максимальные пики графиков температуры плавления. При этом значительно отличается именно вакцинный штамм «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа - предлагаемое изобретение.

Специфичность анализа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 оценивали при исследовании суспензий штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Грей» возбудителя парвовирусного энтерита, штамма «SAT-1/Кения/2017» возбудителя ящура, штамма «Мира» калицивируса кошек. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 6,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

В качестве положительного контроля использовали суспензию вакцинного штамма «Лавр» FHV. Отрицательным контролем служила деионизированная вода. Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификации с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов графики не были сформированы, что подтверждало высокую специфичность компонентов реакционной смеси данного способа для FHV.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек, и отрицательного контроля не формировали графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля получены следующие значения температур плавления: 75,36±0,01°С (n = 3, p<0,005). Результаты анализа контролей подтверждают представленные данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605.

Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 425 заведомо положительных проб вирусных суспензий возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек штамма «Лавр» с титрами инфекционной активности не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведение ПЦР с последующим плавлением ампликонов осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 425 исследуемых проб FHV все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 200 проб вирусной суспензии FHV различных штаммов и изолятов, за исключением вакцинного штамма «Лавр». В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 200 проб содержали геном FHV, но не штамма «Лавр». Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (Dse) составила 99,14-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,41-100,00%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2 ч) дифференциацию вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке V1-гена ДНК FHV имеется две нуклеотидных мутации, уникальные для вакцинного штамма «Лавр», что позволило разработать олигонуклеотидные праймеры FHV-F-V1-DIFF и FHV-R-V1-DIFF, рассчитанные для амплификации целевого участка ДНК V1-гена FHV размером 98 п.н. и анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605. Разработанный способ характеризуется 100%-ной аналитической специфичностью. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,14-100,00%, диагностическая специфичность - 98,17-100,0%, точность - 99,41-100,00%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605»:

1. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.

2. Taxonomy. Felid alphaherpesvirus-1. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Felid+alphaherpesvirus-1 (Дата обращения: 14.10.2023).

3. Willoughby K, Bennett M, McCracken CM, Gaskell RM. Molecular phylogenetic analysis of felid herpesvirus 1. Vet Microbiol. 1999 Sep 1;69(1-2):93-7. doi: 10.1016/s0378-1135(99)00094-2. PMID: 10515276.

4. Pennington MR, Voorhees IEH, Callaway HM, Dehghanpir SD, Baines JD, Parrish CR, Van de Walle GR. The HIV Integrase Inhibitor Raltegravir Inhibits Felid Alphaherpesvirus 1 Replication by Targeting both DNA Replication and Late Gene Expression. J Virol. 2018 Sep 26;92(20):e00994-18. doi: 10.1128/JVI.00994-18. PMID: 30045987; PMCID: PMC6158441.

5. Shi L, Huang S, Lu Y, Su Y, Guo L, Guo L, Xie W, Li X, Wang Y, Yang S, Chai H, Wang Y. Cross-species transmission of feline herpesvirus 1 (FHV-1) to chinchillas. Vet Med Sci. 2022 Nov;8(6):2532-2537. doi: 10.1002/vms3.914. Epub 2022 Aug 29. PMID: 36037318; PMCID: PMC9677351.

6. Summers SC, McLeland SM, Hawley JR, Quimby JM, Lappin MR. Effect of repeated administration of a parenteral feline herpesvirus-1, calicivirus, and panleukopenia virus vaccine on select clinicopathologic, immunological, renal histologic, and immunohistochemical parameters in healthy adult cats. Am J Vet Res. 2022 May 21;83(7):ajvr.21.07.0087.

7. Bergmann M, Speck S, Rieger A, Truyen U, Hartmann K. Antibody response to feline herpesvirus-1 vaccination in healthy adult cats. J Feline Med Surg. 2020 Apr;22(4):329-338. doi: 10.1177/1098612X19845702. Epub 2019 May 13. PMID: 31079527.

8. Gaskell R, Dawson S, Radford A, Thiry E. Feline herpesvirus. Vet Res. 2007 Mar-Apr;38(2):337-54. doi: 10.1051/vetres:2006063. Epub 2007 Feb 13. PMID: 17296160.

9. Slaviero M, Ehlers LP, de Almeida BA, Pereira PR, Panziera W, da Costa FVA, Pavarini SP, Sonne L. Generalized and fatal felid alphaherpesvirus-1 natural infection with liver involvement in a feline leukaemia virus-positive adult cat: a case report. Vet Res Commun. 2022 Dec;46(4):1319-1324. doi: 10.1007/s11259-022-09977-6. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35854050.

10. Pennington MR, Ledbetter EC, Van de Walle GR. New Paradigms for the Study of Ocular Alphaherpesvirus Infections: Insights into the Use of Non-Traditional Host Model Systems. Viruses. 2017 Nov 18;9(11):349. doi: 10.3390/v9110349. PMID: 29156583; PMCID: PMC5707556.

11. Cottingham E, Johnstone T, Hartley CA, Devlin JM. Update on feline alphaherpesvirus-1 seroprevalence in Victorian feral and owned cats. Aust Vet J. 2022 May;100(5):187-189. doi: 10.1111/avj.13147. Epub 2022 Jan 25. Erratum in: Aust Vet J. 2022 Aug;100(8):414. PMID: 35080011; PMCID: PMC9306845.

12. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8. Doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

13. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45. Doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

14. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7. Doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

15. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265.

16. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623. Doi: 10.1111/tbed.12554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

17. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5.

18. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437.

19. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec;284(24):4174. Doi: 10.1111/febs.14319. Epub 2017 Nov 24. PMID: 29171728.

20. Флуоресцентные полимерные красители SuperNova. URL: https://www.beckman.co.il/ru/reagents/coulter-flow-cytometry/supernova-fluorescent-polymer-dyes. (Дата обращения: 15.10.2023).

Таблица 1

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидного праймера Нуклеотидная последовательность (5'→3') FHV-F-V1-DIFF CATGATATACGATGACAATAAGT FHV-R-V1-DIFF CTACGGACCCAAGAATTGTAT

Таблица 2

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 (предлагаемое изобретение)

Параметры праймеров Характеристики олигонуклеотидов FHV-F-V1-DIFF FHV-R-V1-DIFF Длина, н.о. 23 21 Молекулярный вес (Mw) 7079.7 6436.3 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 169.6 168.3 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 24.7 25.2 Дифференциал энтальпии (dS), кал/К×моль 451.4 445.4 Температура плавления™, °С:
- с коррекцией концентрации солей 56 57

Примечание: термодинамические параметры олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,

температура 25°С,

водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 3

Временные и температурные режимы ПЦР для дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ с помощью анализа температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 (предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Кол-во циклов Предварительный прогрев - 98 3 мин 1 ПЦР Денатурация 98 10 с 35 Отжиг праймеров 57 25 с Элонгация 72 20 с Плавление Удержание
на шаге 1 65 90 с 1 Удержание на шагах 2 - 250* 65,1-90,0 2 с 1 на каждый шаг

Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С,

* - детекция сигнала.

Таблица 4

Средние показания максимальных экстремумов графиков температур плавления при исследовании ампликонов штаммов и изолятов возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек (FHV) (предлагаемое изобретение)

(n = 30, p<0,001)

Наименование штамма/изолята гепатита собак Максимум температуры плавления ПЦР-продукта при использовании разработанного способа, °С «Лавр» 75,36±0,01°С «LOU-27» 73,54±0,03°С «WH2020» 73,54±0,04°С «MM-10» 73,54±0,02°С «GD2018» 73,54±0,04°С «CH-B» 73,54±0,02°С «KANS_02» 73,54±0,02°С «NEWY_03» 73,54±0,02°С «CALI_14» 73,54±0,02°С «PHIL_01» 73,54±0,01°С «KANS_04» 73,54±0,02°С «MOLW_03» 73,54±0,02°С

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FHV Lavr Super

Nova v605.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-03-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-25</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>549</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-25</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации вакцинного

штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других

штаммов и полевых изолятов с помощью анализа температурного графика

плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного

красителя SuperNova v605</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>432</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..432</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttatcctttattacatgaatttcccccatgatatacgatgacaataagt

aatgcgttaaataataggagagtgagtcccatattgagaatcataagtctacacatacaattcttgggtc

cgtaggtccttccacctgaaaatggagatgggctgatataagatggtatctcagacataccacgtggttg

atgccaggtacgattagacgactttaatggttgaggggttagtgggatctccacagtgctatctgagaaa

tcccgtttcatcattaagattttctcgtctggatgcccaaattttacacgtccctgtggggttgaatgta

gataaggagatcccagttcatctgtataccactgtgtagaggatcggggtaatttcatagttgtagagtc

gagccatgggttagtgtggacattaggtttatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>144</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..144</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MNKPNVHTNPWLDSTTMKLPRSSTQWYTDELGSPYLHSTPQGRVKFGHP

DEKILMMKRDFSDSTVEIPLTPQPLKSSNRTWHQPRGMSEIPSYISPSPFSGGRTYGPKNCMCRLMLLNM

GLTLLLFIALLIVIVYHGGNSCNKG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catgatatacgatgacaataagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FHV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctacggacccaagaattgtat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Описан способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ. Способ включает анализ температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 и олигонуклеотидных праймеров. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала технических средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против инфекционного ринотрахеита кошек из вакцинного штамма «Лавр». 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации вакцинного штамма «Лавр» возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек от других штаммов и полевых изолятов вируса ИРТ, включающий анализ температурного графика плавления продуктов ПЦР V1-гена с применением оранжевого полимерного красителя SuperNova v605 и олигонуклеотидных праймеров FHV-F-V1-DIFF с дизайном 5'-CATGATATACGATGACAATAAGT-3' и FHV-R-V1-DIFF с дизайном 5'-CTACGGACCCAAGAATTGTAT-3' для амплификации специфического фрагмента ДНК V1-гена FHV размером 98 п.н., при проведении которого определено, что для вакцинного штамма «Лавр» FHV температурный пик имеет значение 75,36±0,01°С.

2. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается до 2,5 ч.