КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I Российский патент 2024 года по МПК C12N15/12 A61K48/00 C07K14/47 C12N15/63 C12N5/10 C12N1/15 C12N1/19 C12N1/21 A61P27/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к средствам для применения в генотерапии. В частности, данное изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим фактор комплемента I (CFI) и фактор H-подобный белок 1 (FHL1), векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, и их применению при лечении или профилактике опосредованных комплементом и связанных с комплементом расстройств, включая заболевания глаз, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Желтое пятно представляет собой небольшой участок сетчатки глаза размером примерно от 3 до 5 миллиметров, прилегающий к зрительному нерву. Это наиболее чувствительная область сетчатки, содержащая ямку, депрессивную область, которая обеспечивает высокую остроту зрения и содержит плотную концентрацию колбочек, фоторецепторов, отвечающих за цветовое зрение.

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной функциональной слепоты в развитых странах у лиц старше 50 лет (Seddon, J.M., Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T.E., et al., eds. Ryan S.J., ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001: 1039-1050). ВМД связана с неоваскуляризацией, исходящей из сосудистой сети хориоидеи и распространяющейся в субретинальное пространство. Кроме того, ВМД характеризуется прогрессирующей дегенерацией сетчатки, пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и подлежащей сосудистой оболочки (высоко-сосудистая ткань, которая находится под ПЭС, между сетчаткой и склерой).

Множество факторов, включая окислительный стресс, воспаление с возможным аутоиммунным компонентом, генетический фон (например, мутации), а также экологические или поведенческие факторы, такие как курение и диета, могут способствовать патогенезу ВМД.

Клиническое прогрессирование ВМД характеризуется поэтапно в соответствии с изменениями желтого пятна. Отличительным признаком ранней ВМД является появление друзов, которые представляют собой скопления внеклеточного продукта распада под сетчаткой и появляются в виде желтых пятен на сетчатке во время клинического обследования и на изображениях глазного дна. Друзы делятся на маленькие (<63 мкм), средние (63-124 мкм) и большие (> 124 мкм). Они также считаются твердыми или мягкими в зависимости от того, как выглядят их края при офтальмологическом исследовании. В то время как твердые друзы имеют четко очерченные края, мягкие друзы имеют менее выраженные жидкие края. Шкала фотографической тяжести глазного дна, используемая при исследовании возрастных заболеваний глаз (AREDS), является одной из основных систем классификации, используемых для этого состояния.

ВМД подразделяется на «сухую» и «влажную» (экссудативную или неоваскулярную) формы. Сухая ВМД более распространена, чем влажная ВМД, но сухая форма может переходить во влажную форму, и обе возникают одновременно в значительном количестве случаев. Сухая ВМД обычно характеризуется прогрессирующим апоптозом клеток слоя ПЭС и вышележащих фоторецепторных клеток, а также часто нижележащих клеток в слое хориоидальных капилляров. Сливные зоны гибели клеток ПЭС, сопровождающейся атрофией вышележащих фоторецепторов, называются географической атрофией. Пациенты с этой формой ВМД испытывают медленное и прогрессирующее ухудшение центрального зрения.

Влажная ВМД характеризуется кровотечением и/или утечкой жидкости из аномальных сосудов, которые выросли из сосудов сосудистой оболочки (хориокапилляров) под ПЭС и желтым пятном, что может быть причиной внезапной и инвалидизирующей потери зрения. Было подсчитано, что большая часть потери зрения, которую испытывают пациенты, происходит из-за такой хориоидальной неоваскуляризации (CNV) и ее вторичных осложнений. Подтип неоваскулярной ВМД называется ангиоматозной пролиферацией сетчатки (RAP). В данном документе ангиоматозная пролиферация происходит из сетчатки и распространяется кзади в субретинальное пространство, в конечном итоге сообщаясь в некоторых случаях с новыми сосудами хориоидеи.

Система комплемента (CS) участвует в раннем патогенезе ВМД, основываясь на идентификации компонентов CS в друзе глаз пациентов с ВМД. При ВМД идентифицировано по меньшей мере 129 типов белков, депонированных в друзах, включая различные типы аполипопротеинов (E, B или A-l), несколько амилоидных пептидов (P, Aβ или SA-1), TIMP-3, сывороточный альбумин и некоторые белки, связанные с клеточной функцией (например, субъединица β АТФ-синтазы, скавенджер-рецептор B2 и ретинолдегидрогеназа). Друзы, производные от ВМД, также содержат почти все белки комплемента, включая регуляторные белки (CFH, рецептор комплемента 1 (CR1), витронектин и кластерин), продукты активации и деградации CS (C1q, C3, C3a, C3b и C5a), и элементы терминального пути CS, содержащие компоненты MAC (то есть 5, 6, 8 (α, β и γ) и 9) в отдельной и сложной форме. Накопление друзы может активировать CS, вызвать местную продукцию медиаторов воспаления и привлечь лейкоциты, которые, в свою очередь, усиливают местное воспалительное состояние, присутствующее при ВМД.

Текущие варианты лечения ВМД включают фотодинамическую терапию бензопорфирином (Arch Ophthalmol (1999) 117: 1329-1345) и ряд терапий, нацеленных на путь фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Примеры такой терапии, нацеленной на VEGF, включают аптамер пегаптаниб (N Engl J Med (2004) 351: 2805-2816) и антитела, такие как ранибизумаб (N Engl J Med (2006) 355: 1432-1444) и бевацизумаб (BMJ (2010) 340: c2459). Однако не все пациенты реагируют на лечение антителами к VEGF и либо не восстанавливают зрение, либо прогрессируют до зарегистрированной слепоты.

Разработана терапия для лечения географической атрофии, которая использовалась в клиническом исследовании III фазы. Лампализумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, ингибирующее фактор комплемента D, вводимое интравитреальной инъекцией для остановки скорости прогрессирования географической атрофии. Однако в рандомизированных клинических испытаниях фазы III с участием 906 участников лампализумаб не смог уменьшить увеличение ГА по сравнению с плацебо в течение 48 недель.

Соответственно, в данной области техники существует значительная потребность в новых подходах к лечению заболеваний глаз, таких как ВМД.

Из-за повсеместной природы системы комплемента сверхактивная или неправильно функционирующая система комплемента была вовлечена в патологию многих хронических воспалительных состояний, для которых варианты лечения либо не существуют, либо требуют управления симптомами с помощью регулярных вмешательств в течение нескольких лет. Следовательно, существует общая потребность в разработке методов генной терапии, которые обеспечивают новые или альтернативные методы лечения комплемент-опосредованных и связанных с комплементом расстройств, особенно хронических воспалительных состояний и даже более конкретно тех, которые связаны с гиперреактивностью цикла обратной связи C3b комплемента (Фиг. 1).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявитель идентифицировал оптимизированные по кодонам последовательности фактора комплемента I (CFI) и фактор H-подобный белок 1 (FHL1), которые обеспечивают существенно повышенную экспрессию кодируемых белков CFI и FHL1 по сравнению с последовательностями дикого типа.

Усовершенствованные последовательности, кодирующие CFI и FHL1, разработанные заявителем, позволяют доставлять пациенту более высокие дозы соответствующих белков без увеличения количества вводимого вектора. Таким образом, данное изобретение обеспечивает улучшения в отношении производительности (т.е. доставка белка может быть достигнута с меньшими количествами продуцируемого вектора), эффективности лекарственного средства, а также безопасности. В частности, поскольку более высокая доза кодируемого белка может быть достигнута при доставке того же количества (например, объема) вектора, снижается риск повреждения ткани, в которую вводят вектор. Например, когда вектор доставляется в глаз с помощью субретинальной инъекции, снижается риск повреждения или отслоения сетчатки, вызванного инъекцией больших объемов лекарственного средства. Кроме того, снижается риск нецелевых эффектов, возникающих из-за распространения больших объемов лекарственного средства на прилегающие ткани. Кроме того, использование заявленных нуклеотидных последовательностей в генной терапии может обеспечить лечение одной дозой, обеспечивая долгосрочную стабильную экспрессию белка и избегая необходимости ежемесячных или регулярных инъекций. Нуклеотидные последовательности и композиции по данному изобретению обладают дополнительным преимуществом, поэтому они могут обеспечить одноразовую или «однократную» терапию, которая позволяет избежать повторных или регулярных хирургических вмешательств.

В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор комплемента I (CFI), при этом нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, по меньшей мере на 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 10.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, представляет собой SEQ ID NO: 10.

В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор I Н-подобный белок 1 (CFI), при этом нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 12.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит один или более инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV). В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид содержит ITR AAV на 5'-конце и ITR AAV на 3'-конце.

В некоторых вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8. В предпочтительных вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается вектор, содержащий полинуклеотид по данному изобретению.

В некоторых вариантах реализации, вектор представляет собой аденоассоциированный вирусный (AAV), ретровирусный, лентивирусный или аденовирусный вектор.

В предпочтительных вариантах реализации, вектор представляет собой вектор AAV.

В некоторых вариантах реализации, вектор находится в форме частицы вирусного вектора.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит капсидные белки AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 и капсидные белки AAV2 (AAV2/2). В других вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 и капсидные белки AAV8 (AAV2/8). В других вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV8 и капсидные белки AAV8 (AAV8/8).

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, функционально связана с промотором CMV. В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, функционально связана с регуляторным элементом, таким как регуляторный элемент WPRE. В предпочтительных вариантах реализации, регулирующий элемент WPRE представляет собой регулирующий элемент WPRE3. В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, функционально связана с сигналом полиаденилирования (поли-А), таким как сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, функционально связана с промотором CMV; регулирующим элементом WPRE (предпочтительно регулирующим элементом WPRE3); и сигналом поли-А гормона роста крупного рогатого скота.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, функционально связана с промотором CMV. В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, функционально связана с регуляторным элементом, таким как регуляторный элемент WPRE. В предпочтительных вариантах реализации, регулирующий элемент WPRE представляет собой регулирующий элемент WPRE3. В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, функционально связана с сигналом поли-А, таким как сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, функционально связана с промотором CMV; регулирующим элементом WPRE (предпочтительно регулирующим элементом WPRE3); и сигналом поли-А гормона роста крупного рогатого скота.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается клетка, содержащая полинуклеотид по данному изобретению.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается клетка, трансдуцированная вектором по данному изобретению.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

В конкретном варианте реализации, фармацевтическая композиция подходит для системного введения, например, инфузией через периферическую вену.

В конкретном варианте реализации, фармацевтическая композиция подходит для местного введения, например, интратекального введения.

В предпочтительных вариантах реализации, фармацевтическая композиция предназначена для внутриглазного введения, например, путем интравитреальной инъекции, супрахориоидальной инъекции или субретинальной инъекции.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению для использования в терапии.

В конкретном варианте реализации, полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению используются для лечения опосредованных комплементом расстройств, особенно хронических воспалительных состояний.

В предпочтительном варианте реализации, полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению используются для лечения расстройства, связанного с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению для использования при лечении или профилактике заболевания глаз.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению для использования при лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается способ лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, включающий введение полинуклеотида, вектора или клетки по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается способ предоставления фактора комплемента I (CFI) и/или фактор H-подобного белка 1 (FHL1) субъекту, включающий доставку полинуклеотида, вектора или клетки по данному изобретению в глаз субъекта.

В некоторых вариантах реализации, расстройство связано с чрезмерной активностью цикла обратной связи комплемента C3b и/или недостаточной активностью цикла распада C3b (см. Фиг. 1).

В некоторых вариантах реализации, расстройство представляет собой хроническое воспалительное состояние глаза, опосредованное комплементом.

В некоторых вариантах реализации, расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию. В других вариантах реализации, расстройство представляет собой глаукому, болезнь Штаргардта, центральную серозную хориоретинопатию или пигментный ретинит.

В предпочтительных вариантах реализации, расстройство представляет собой ВМД. В некоторых вариантах реализации, ВМД представляет собой сухую форму ВМД.

В некоторых вариантах реализации, у субъекта диагностирована ВМД или существует риск развития ВМД.

В некоторых вариантах реализации, применение для лечения или профилактики расстройства у субъекта:

(a) имеющего более низкую, чем обычно, активность или концентрацию фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке, предпочтительно имеющую концентрацию или активность, эквивалентную 0-30, 0-20 или 0-10 мкг/мл в сыворотке; и/или

(b) который является гетерозиготным или гомозиготным по SNP, ассоциированному с возрастной макулярной дегенерации (ВМД), предпочтительно редкому варианту фактора комплемента I.

В некоторых вариантах реализации, применение для лечения или профилактики расстройства у субъекта:

(a) имеющего нормальный уровень активности или концентрации фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке, предпочтительно по меньшей мере 30 мкг/мл, например, 30-40 мкг/мл в сыворотке; и/или

(b) который не несет редкого аллеля варианта фактора комплемента I.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике возрастной макулярной дегенерации (ВМД). В предпочтительных вариантах реализации, ВМД представляет собой сухую форму ВМД.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике диабетической ретинопатии.

В некоторых вариантах реализации предотвращается или уменьшается образование географической атрофии и/или уменьшается степень географической атрофии.

В некоторых вариантах реализации, прогрессирование географической атрофии замедляется.

В некоторых вариантах реализации наблюдается по меньшей мере 10% уменьшение увеличения площади географической атрофии в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период. В других вариантах реализации наблюдается по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% уменьшение увеличения площади географической атрофии в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период.

В некоторых вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта или в глазу, например, в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) субъекта, необязательно до уровня, который превышает нормальный уровень для субъекта или его глаза, или ПЭС.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для улучшения или восстановления зрения, или остроты зрения, например, у субъекта, страдающего глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе. В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения потери зрения или остроты зрения, например, потери зрения или остроты зрения, связанных с нарушением зрения, таким как нарушение зрения, описанное в данном документе.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для улучшения или восстановления скорости чтения у субъекта, например, у субъекта, страдающего глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе. В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения снижения скорости чтения у субъекта, например, снижения скорости чтения, связанного с глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения или предотвращения потери фоторецепторов и/или пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), например, потери фоторецепторов и/или ПЭС, связанных с глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят внутриглазно.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной инъекции.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит промотор hAAT. В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит энхансер ApoR. В других вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит двух энхансеров ApoR.

В некоторых вариантах реализации, вектор по данному изобретению не содержит геном AAV2 и капсидный белок AAV8, т.е. вектор по данному изобретению не является вектором AAV2/8.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению не вводят системно. В других вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению не вводят внутривенно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1

C3b циклы обратной связи (амплификации) и разрушения (подавления) альтернативного пути комплемента позвоночных (“I” = фактор комплемента I; “H” = фактор комплемента H; “B” = фактор комплемента B; и “D” = фактор комплемента D).

Фиг. 2

Вестерн-блоттинг супернатантов клеток ARPE19 после трансфекции плазмидами с кодон-оптимизированными CFI и FHL1.

Фиг. 3

ИФА-анализ супернатантов клеток ARPE19 после трансфекции плазмидами с кодон-оптимизированным CFI.

Фиг. 4

ИФА-анализ супернатантов клеток ARPE19 после трансфекции плазмидами с кодон-оптимизированным FHL1.

Фиг. 5

ИФА-анализ супернатантов клеток ARPE19 после трансдукции векторами AAV с кодон-оптимизированным CFI.

Фиг. 6

ИФА-анализ супернатантов клеток ARPE19 после трансдукции векторами AAV с кодон-оптимизированным FHL1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины «содержащий», «включает» и «состоящий из» в контексте данного описания являются синонимами «включая» или «включает»; или «содержащий» или «содержит», и являются включающими или открытыми и не исключают дополнительных, неперечисленных членов, элементов или стадий. Термины «содержащий», «включает» и «состоящий из» также включают термин «состоящий из».

СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА

Система комплемента является неотъемлемой частью гуморальной иммунной системы и участвует в воспалении тканей, опсонизации клеток и цитолизе. Он обеспечивает защиту от микроорганизмов и способствует удалению экзогенного и эндогенных продуктов клеточного распада из тканей хозяина.

Каскад системы комплемента состоит из четырех путей активации. Все пути в конечном итоге заканчиваются центральным расщеплением фактора C3 и образованием его активных фрагментов C3a и C3b. C3a представляет собой анафилатоксин, который запускает ряд хемотаксических и провоспалительных реакций, таких как рекрутирование воспалительных клеток и повышенная проницаемость микрососудов, тогда как C3b отвечает за опсонизацию чужеродных поверхностей, ковалентно связанных с C3b. Опсонизация активированными фрагментами C3 (C3b и iC3b) выполняет три основные функции: (i) устранение продуктов клеточного распада фагоцитарными клетками (например, макрофагами или микроглией) и стимуляция адаптивной иммунной системы (B- и T-клетки); (ii) усиление активации комплемента посредством образования связанной с поверхностью C3-конвертазы; и (iii) сборку конвертазы C5.

Сборка конвертазы C5 отвечает за расщепление C5, что приводит к образованию комплекса цитолитической мембранной атаки (MAC), способного генерировать перфорации в клеточной мембране, тем самым способствуя лизису клеток и устранению ненужных клеток. Посредством всех этих действий каскад врожденного комплемента поддерживает и стимулирует функцию нижестоящих механизмов иммунной системы, которые защищают целостность ткани хозяина. В целом активация пути системы комплемента приводит к провоспалительному ответу, включая образование MAC, которая опосредует лизис клеток, высвобождение хемокинов для привлечения воспалительных клеток к месту повреждения и усиление проницаемости капилляров, что способствует экстравазации инфильтрирующих лейкоцитов. В физиологических условиях активация комплемента эффективно контролируется скоординированным действием растворимых и связанных с мембраной регуляторных молекул комплемента (CRM). Растворимые регуляторы комплемента, такие как C1-ингибитор, ингибитор анафилатоксинов, связывающий белок C4b (C4BP), фактор комплемента H (CFH), фактор комплемента I (CFI), кластерин и витронектин, ограничивают действие комплемента в тканях человека на нескольких участках каскадной реакции. Кроме того, каждая отдельная клетка защищена от атаки гомологичного комплемента поверхностными белками, такими как рецептор комплемента 1 (CR1, CD35), белок мембранного кофактора (CD46) и гликозилфосфатидилинозитол-заякоренные белки, такие как фактор ускорения распада (CD55) или молекулу CD59. Следует отметить, что клетки-хозяева и ткани, которые недостаточно защищены от атаки комплемента, могут подвергаться фоновому лизису клеток.

Данное изобретение относится к лечению или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза. Например, расстройство, опосредованное комплементом, может быть расстройством, связанным с дефектом регуляции альтернативного пути, и, в частности, с избыточной активностью цикла обратной связи комплемента C3b и/или недостаточной активностью цикла разрушения C3b.

В некоторых вариантах реализации, до введения полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению субъект имеет низкие уровни (например, более низкие, чем нормальные уровни) активности фактора комплемента I, например, низкие уровни активности фактора комплемента I в глазах и/или низкий уровень в сыворотке активности фактора комплемента I. Субнормальный уровень активности фактора комплемента I может быть следствием субнормальной экспрессии нормально функционирующего фактора комплемента I или по меньшей мере частичной (например, гетерозиготной) экспрессии (на нормальном или субнормальном уровне) не- или субфункционального варианта фактора комплемента I. (Такой субъект может нести одну или более копий связанного с ВМД SNP, например, субъект может быть гомо- или гетерозиготным по одному из редких вариантов фактора комплемента I, обсуждаемых ниже). Таким образом, у субъекта может быть низкая концентрация (например, концентрация ниже нормы) фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке. Для человека нормальный уровень активности фактора комплемента I (активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b) может быть эквивалентен уровню, обеспечиваемому 30-40 пг/мл фактора комплемента I в сыворотке субъекта. Таким образом, у субъекта с низкой активностью фактора комплемента I активность фактора комплемента I в сыворотке может соответствовать менее 30 мкг/мл и более 0 мкг/мл фактора комплемента I, например, 0-20 или 0-10 мкг/мл (это диапазоны концентрации фактора комплемента I в сыворотке, которые могут охватывать субъект, имеющий низкую концентрацию фактора комплемента I).

Таким образом, субъект, который поддается лечению по данному изобретению, может страдать от опосредованного комплементом расстройства глаза, такого как ВМД, в частности сухой формы ВМД (например, характеризующейся географической атрофией), или может иметь риск развития такого расстройства. Например, субъект может быть гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с расстройством, опосредованным комплементом.

В некоторых вариантах реализации, субъект имеет риск развития ВМД. Например, субъект может быть гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с ВМД, например, к редким мутациям фактора комплемента I, связанным с ВМД на поздней стадии, которые обычно приводят к снижению уровней фактора комплемента I в сыворотке (Kavanagh et al. (2015) Hum Mol Genet 24: 3861-3870). В частности, субъект может нести одну или две копии одного или более из следующих редких вариантов фактора комплемента I: rs144082872 (кодирующего P50A); 4:110687847 (кодирующего P64L); rs141853578 (кодирующего G119R); 4:110685721 (кодирующего V152M); 4:110682846 (кодирующего G162D); 4:110682801 (кодирующего N177I); rs146444258 (кодирующего A240G); rs182078921 (кодирующего G287R); rs41278047 (кодирующего K441R); и rs121964913 (кодирующего R474).

Данное изобретение может дополнительно включать определение того, подвержен ли субъект риску развития комплемент-опосредованного расстройства (например, ВМД), например, путем определения, является ли субъект гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с комплемент-опосредованным расстройством (например, путем определения, является ли субъект гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более редким вариантам фактора комплемента I, связанным с ВМД, перечисленным выше).

Альтернативно, субъект может иметь нормальный уровень активности или концентрации эндогенного фактора комплемента I, например, в глазу и/или сыворотке, и/или может не иметь редкого варианта аллеля фактора комплемента I.

В некоторых вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению, таким образом, увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в глазу субъекта. В других вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению, таким образом, увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в глазу субъекта до уровня, который превышает нормальный уровень в глазу. Более конкретно, уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b повышается в ПЭС глаза.

Следует принимать во внимание, что активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта после экспрессии фактора комплемента I из полинуклеотида или вектора по данному изобретению может включать активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b со стороны эндогенного фактора комплемента I субъекта (то есть фактор комплемента I субъекта, не продуцируемый экспрессией из полинуклеотида или вектора), и активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b, продуцируемая экспрессией из полинуклеотида или вектора по данному изобретению, так что общий уровень C3b-инактивации и iC3b- активности деградации у субъекта превышает нормальный уровень.

В некоторых вариантах реализации, уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, повышен до уровня, который по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20% или 25% превышает нормальный уровень.

В других вариантах реализации, уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, повышается до уровня, который в два раза превышает нормальный уровень или до 80%, 60%, 40% или на 20% выше нормального уровня.

Например, уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, может быть повышен до уровня, который составляет 5-100%, 5-80%, 5-60%, 5-40%, 5- 20%, 10-100%, 10-80%, 10-60%, 10-40%, 10-20%, 15-100%, 15-80%, 15-60%, 15-40%, 15-20%, 20-100%, 20-80%, 20-60%, 20-40%, 25-100%, 25-80%, 25-60% или 25-40% выше нормального уровня.

В некоторых вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению не вызывает заметного повышения уровня активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в плазме/сыворотке субъекта. В других вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению не приводит к заметному увеличению уровня активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в плазме/сыворотке субъекта до уровня, превышающего нормальный уровень.

В предыдущем разделе, за исключением явно неприменимых, ссылка на фактор комплемента I и активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b может быть заменена фактором комплемента H или фактор H-подобным белком 1, и способностью действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b и для увеличения скорости диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы, соответственно. В некоторых вариантах реализации, до введения полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению субъект имеет низкие уровни (например, более низкие, чем нормальные уровни) фактора комплемента H, например, низкие уровни фактора комплемента H в глазе и/или низкие уровни фактора комплемента H в сыворотке. Для человека нормальный уровень фактора комплемента H может составлять около 200-500 мкг/мл в сыворотке субъекта. Таким образом, у субъекта с низким уровнем фактора комплемента H уровни в сыворотке могут быть меньше 200 мкг/мл и больше 0 мкг/мл, например, 0-100 мкг/мл. Альтернативно, субъект может иметь нормальный уровень эндогенного фактора комплемента H, например, в глазу и/или сыворотке.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I (CFI)

Фактор комплемента I (фактор I, CFI), также известный как инактиватор C3b/C4b, представляет собой белок, который у человека кодируется геном CFI.

Фактор комплемента I представляет собой сериновую протеазу, которая циркулирует в состоянии, подобном зимогену (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844) в концентрации ~35 мкг/мл (Nilsson et al. (2011) Mol Immunol 48: 1611-1620). Белок фактора комплемента I представляет собой сильно N-гликозилированный гетеродимер, состоящий из двух полипептидных цепей, связанных одной дисульфидной связью. Тяжелая цепь (50 кДа) включает N-концевую область; домен мембраноатакующего комплекса Fl (FIMAC); CD5-подобный домен или богатый цистеином (SRCR) домен рецептора скавенджера; два домена рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDLr); и С-концевой участок с неизвестной функцией, который является участком изменчивости последовательностей у разных видов (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844). Легкая цепь (38 кДа) содержит домен сериновой протеазы (SP) с консервативными каталитическими остатками (Goldberger et al. (1987) J Biol Chem 262: 10065-10071).

Фактор комплемента I инактивирует C3b, расщепляя его на iC3b, C3d и C3d, g и аналогичным образом C4b на C4c и C4d. Для правильного выполнения своих функций фактор комплемента I требует присутствия кофакторных белков, таких как C4b-связывающий белок (C4BP), фактор комплемента H (CFH), рецептор комплемента 1 (CR1/CD35) и белок мембранного кофактора (MCP/CD46) (Degn et al. (2011) Am J Hum Genet 88: 689-705).

iC3b неспособен связываться с фактором B и, таким образом, не может поддерживать амплификацию каскада комплемента или активацию через альтернативный путь. Следовательно, как только C3b был расщеплен до iC3b, не происходит ни инициации альтернативного пути, ни активации терминального каскада комплемента.

iC3b способен оказывать провоспалительное действие путем связывания и активации рецептора комплемента 3 (CR3) (CD11b/CD18) на полиморфно-ядерных лейкоцитах (в основном нейтрофилах), NK-клетках и мононуклеарных фагоцитах, таких как макрофаги.

Фактор комплемента I способен преобразовывать iC3b в C3d,g посредством протеазной активности, требующей кофактора CR1. C3d,g не может связываться с CR3. Поскольку реакция iC3b с рецептором комплемента CR3 является основным механизмом, с помощью которого активация комплемента вызывает воспаление, расщепление iC3b до C3d,g имеет важное значение для уменьшения воспаления, вызванного комплементом (Lachmann (2009) Adv. Immunol. 104: 115-149).

Уникальная способность фактора комплемента I как способствовать расщеплению C3b до iC3b, так и ускорять расщепление iC3b - в сочетании с его относительно низкой концентрацией в сыворотке крови человека, что влияет на количество, необходимое для доставки для терапевтической эффективности, - делает его особенно выгодной мишенью.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен расщеплять C3b до неактивного продукта разложения. Например, полипептид фактора комплемента I может быть способен расщеплять C3b на iC3b.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен преобразовывать iC3b в неактивный продукт разложения. Например, полипептид фактора комплемента I может быть способен преобразовывать iC3b в C3d,g

В предпочтительных вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен расщеплять C3b до iC3b и обрабатывать iC3b до C3d,g

Соответственно, фрагмент или производное фактора комплемента I может сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b нативного фактора комплемента I.

Активность в отношении инактивации C3b и деградации iC3b фактора комплемента I или его фрагмента, или производного может быть определена с использованием любого подходящего метода, известного специалисту в данной области техники. Например, измерение протеолитической активности фактора комплемента I описано в Hsiung et al. (Biochem. J. (1982) 203: 293-298). И гемолитический, и конглютинирующий анализы активности CFI описаны в Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) “Complement Technology” in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17. Более подробное описание, включая протеолитический анализ, дано Harrison RA (1996) in “Weir's Handbook of Experimental Immunology” 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A'Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37. Анализ склеивания высокочувствителен и может использоваться как для обнаружения первого (двойного) клипа, превращающего фиксированный C3b в iC3b, так и для определения реактивности с конглютинином; и для обнаружения последнего клипа на C3dg, начиная с фиксированного iC3b и ища потерю реактивности с конглютинином. Гемолитический анализ используется для превращения C3b в iC3b, а протеолитический анализ обнаруживает все зажимы.

В некоторых вариантах реализации фактор комплемента I представляет собой фактор комплемента I.

Примером белка фактора комплемента I человека является белок фактора комплемента I человека, имеющий регистрационный номер UniProtKB P05156. Эта приведенная в качестве примера последовательность имеет длину 583 аминокислоты (раскрыта как SEQ ID NO: 1), из которых аминокислоты с 1 по 18 образуют сигнальную последовательность.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 1. В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой последовательность, раскрытую в положениях с 19 по 583 SEQ ID NO: 1.

MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADWCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVTQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

(SEQ ID NO: 1)

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 9, которая соответствует номеру доступа NCBI NP_000195. В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой последовательность, раскрытую в положениях с 19 по 583 SEQ ID NO: 9.

MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADWCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

(SEQ ID NO: 9)

Примером нуклеотидной последовательности дикого типа, кодирующей фактор комплемента I, является нуклеотидная последовательность, имеющая номер доступа NCBI NM_000204, раскрытая в данном документе как SEQ ID NO: 2.

ATGAAGCTTCTTCATGTTTTCCTGTTATTTCTGTGCTTCCACTTAAGGTTTTGCAAGGTCACTTATACATCTCAAGAGGATCTGGTGGAGAAAAAGTGCTTAGCAAAAAAATATACTCACCTCTCCTGCGATAAAGTCTTCTGCCAGCCATGGCAGAGATGCATTGAGGGCACCTGTGTTTGTAAACTACCGTATCAGTGCCCAAAGAATGGCACTGCAGTGTGTGCAACTAACAGGAGAAGCTTCCCAACATACTGTCAACAAAAGAGTTTGGAATGTCTTCATCCAGGGACAAAGTTTTTAAATAACGGAACATGCACAGCCGAAGGAAAGTTTAGTGTTTCCTTGAAGCATGGAAATACAGATTCAGAGGGAATAGTTGAAGTAAAACTTGTGGACCAAGATAAGACAATGTTCATATGCAAAAGCAGCTGGAGCATGAGGGAAGCCAACGTGGCCTGCCTTGACCTTGGGTTTCAACAAGGTGCTGATACTCAAAGAAGGTTTAAGTTGTCTGATCTCTCTATAAATTCCACTGAATGTCTACATGTGCATTGCCGAGGATTAGAGACCAGTTTGGCTGAATGTACTTTTACTAAGAGAAGAACTATGGGTTACCAGGATTTCGCTGATGTGGTTTGTTATACACAGAAAGCAGATTCTCCAATGGATGACTTCTTTCAGTGTGTGAATGGGAAATACATTTCTCAGATGAAAGCCTGTGATGGTATCAATGATTGTGGAGACCAAAGTGATGAACTGTGTTGTAAAGCATGCCAAGGCAAAGGCTTCCATTGCAAATCGGGTGTTTGCATTCCAAGCCAGTATCAATGCAATGGTGAGGTGGACTGCATTACAGGGGAAGATGAAGTTGGCTGTGCAGGCTTTGCATCTGTGGCTCAAGAAGAAACAGAAATTTTGACTGCTGACATGGATGCAGAAAGAAGACGGATAAAATCATTATTACCTAAACTATCTTGTGGAGTTAAAAACAGAATGCACATTCGAAGGAAACGAATTGTGGGAGGAAAGCGAGCACAACTGGGAGACCTCCCATGGCAGGTGGCAATTAAGGATGCCAGTGGAATCACCTGTGGGGGAATTTATATTGGTGGCTGTTGGATTCTGACTGCTGCACATTGTCTCAGAGCCAGTAAAACTCATCGTTACCAAATATGGACAACAGTAGTAGACTGGATACACCCCGACCTTAAACGTATAGTAATTGAATACGTGGATAGAATTATTTTCCATGAAAACTACAATGCAGGCACTTACCAAAATGACATCGCTTTGATTGAAATGAAAAAAGACGGAAACAAAAAAGATTGTGAGCTGCCTCGTTCCATCCCTGCCTGTGTCCCCTGGTCTCCTTACCTATTCCAACCTAATGATACATGCATCGTTTCTGGCTGGGGACGAGAAAAAGATAACGAAAGAGTCTTTTCACTTCAGTGGGGTGAAGTTAAACTAATAAGCAACTGCTCTAAGTTTTACGGAAATCGTTTCTATGAAAAAGAAATGGAATGTGCAGGTACATATGATGGTTCCATCGATGCCTGTAAAGGGGACTCTGGAGGCCCCTTAGTCTGTATGGATGCCAACAATGTGACTTATGTCTGGGGTGTTGTGAGTTGGGGGGAAAACTGTGGAAAACCAGAGTTCCCAGGTGTTTACACCAAAGTGGCCAATTATTTTGACTGGATTAGCTACCATGTAGGAAGGCCTTTTATTTCTCAGTACAATGTATAA

(SEQ ID NO: 2)

Нуклеотидные последовательности фактора комплемента I, используемые в данном изобретении, предпочтительно оптимизированы по кодонам. Различные клетки различаются использованием конкретных кодонов. Это смещение кодонов соответствует смещению относительного количества определенных тРНК в типе клеток. Изменяя кодоны в последовательности так, чтобы они соответствовали относительной численности соответствующих тРНК, можно увеличить экспрессию. Точно так же можно уменьшить экспрессию, сознательно выбирая кодоны, для которых известно, что соответствующие тРНК редки в конкретном типе клеток. Таким образом, доступна дополнительная степень трансляционного контроля.

Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей фактор комплемента I, является нуклеотидная последовательность, раскрытая как SEQ ID NO: 10.

ATGAAACTGCTGCATGTCTTCCTCCTCTTCCTGTGCTTCCACCTCCGTTTCTGTAAAGTCACCTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAGTATACCCACCTGAGCTGCGACAAAGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAACGCTGCATTGAAGGTACTTGTGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACGGCCGTGTGTGCCACCAACAGGAGGAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAATGCCTCCACCCTGGCACCAAGTTTCTGAACAACGGGACCTGCACAGCCGAGGGGAAATTCAGCGTCTCCCTCAAGCACGGCAATACAGACTCCGAGGGCATTGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAAAGCAGCTGGTCCATGCGGGAGGCCAATGTCGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAGGGCGCTGATACACAGCGCCGCTTTAAACTCAGTGACCTCAGCATCAACAGCACTGAGTGTCTGCACGTGCACTGCCGGGGCCTGGAGACCAGCCTGGCTGAGTGCACCTTCACCAAGCGCAGGACCATGGGCTACCAGGATTTTGCAGATGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCAGACAGCCCCATGGATGACTTCTTCCAGTGTGTCAATGGCAAGTACATTTCCCAGATGAAGGCTTGTGACGGGATCAATGATTGCGGGGATCAGAGCGATGAGCTCTGCTGCAAGGCCTGCCAAGGGAAGGGCTTTCACTGTAAGTCTGGGGTGTGCATCCCTTCTCAGTATCAGTGCAACGGAGAGGTGGACTGCATCACTGGGGAGGACGAGGTGGGCTGTGCTGGCTTCGCCTCTGTGGCCCAGGAGGAGACAGAGATCCTCACAGCTGACATGGATGCAGAGCGGCGGCGCATCAAGAGTCTGCTCCCAAAGCTCTCCTGCGGCGTTAAGAATCGCATGCACATCCGGAGGAAGCGGATCGTTGGAGGCAAACGGGCTCAGCTGGGGGACTTGCCGTGGCAGGTGGCCATCAAAGATGCCTCCGGAATCACCTGTGGTGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATCCTGACCGCCGCCCACTGCCTTCGGGCCAGCAAGACTCACCGCTACCAGATCTGGACCACCGTGGTGGATTGGATTCACCCCGACCTGAAGAGGATTGTCATTGAGTATGTCGACCGCATCATCTTCCATGAAAACTACAATGCCGGGACGTATCAGAACGACATCGCCCTCATCGAGATGAAGAAGGATGGGAACAAGAAGGACTGTGAGCTGCCTCGCTCCATCCCCGCCTGTGTACCATGGTCTCCGTACCTGTTCCAGCCAAATGACACATGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAAGACAACGAGAGGGTCTTCTCCCTGCAGTGGGGTGAAGTCAAGCTGATCAGCAACTGCTCCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTATGACGGCAGCATTGACGCGTGCAAGGGAGACAGTGGGGGCCCCCTGGTCTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGAGTTGTGTCCTGGGGCGAGAACTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCGGGCGTGTACACAAAGGTGGCAAACTATTTTGACTGGATCTCCTATCACGTTGGCAGGCCC TTCATTTCACAGTACAACGTATAA

(SEQ ID NO: 10)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I, по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 10. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 10.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 55-1752 SEQ ID NO: 10. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I находится имеет положения 55-1752 SEQ ID NO: 10.

Еще одним примером оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор комплемента I, является SEQ ID NO: 8.

ATGAAGCTGCTGCATGTCTTTCTGCTGTTTCTGTGCTTCCATCTGCGGTTCTGTAAAGTGACCTATACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAGTGTCTGGCCAAGAAGTACACACACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGTCAGCCTTGGCAGCGGTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCTTACCAGTGCCCAAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACAAATCGGAGATCTTTTCCAACATATTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAGTGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACAGCCGAGGGCAAGTTTTCTGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACAGATAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGATAAGACCATGTTCATCTGTAAGAGCTCCTGGTCCATGAGGGAGGCAAACGTGGCATGCCTGGATCTGGGATTCCAGCAGGGAGCAGACACACAGAGGCGCTTTAAGCTGTCCGACCTGTCTATCAATAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGTAGGGGCCTGGAGACATCCCTGGCAGAGTGCACCTTCACAAAGCGGAGAACCATGGGCTACCAGGACTTTGCCGACGTGGTGTGCTATACCCAGAAGGCCGATAGCCCCATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTATATCTCCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAATGACTGTGGCGATCAGTCTGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGTCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCTTCCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGATTGTATCACAGGAGAGGACGAAGTGGGATGCGCAGGATTTGCATCTGTGGCACAGGAGGAGACAGAGATCCTGACAGCCGACATGGATGCCGAGAGGCGCCGGATCAAGTCTCTGCTGCCTAAGCTGAGCTGTGGCGTGAAGAATCGGATGCACATCAGAAGGAAGCGCATCGTGGGAGGCAAGAGGGCACAGCTGGGCGATCTGCCATGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCTCTGGCATCACCTGCGGCGGCATCTACATCGGAGGATGTTGGATCCTGACCGCAGCACACTGCCTGAGAGCAAGCAAGACACACAGGTATCAGATCTGGACCACAGTGGTGGATTGGATCCACCCAGACCTGAAGAGAATCGTGATCGAGTACGTGGATAGGATCATCTTTCACGAGAACTACAATGCCGGCACATATCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGATGGCAATAAGAAGGACTGTGAGCTGCCCAGATCCATCCCTGCATGCGTGCCATGGAGCCCCTATCTGTTCCAGCCCAACGATACCTGCATCGTGTCCGGATGGGGAAGGGAGAAGGACAATGAGCGGGTGTTTTCTCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCTCCAACTGTTCTAAGTTCTACGGCAATAGGTTTTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGATGGCAGCATCGACGCCTGTAAGGGCGATTCCGGAGGACCACTGGTGTGCATGGACGCAAACAATGTGACATACGTGTGGGGAGTGGTGTCCTGGGGAGAGAACTGCGGCAAGCCAGAGTTCCCCGGCGTATATACCAAGGTGGCCAATTATTTTGATTGGATTTCCTACCACGTCGGCAGGCCCTTTATTTCCCAGTATAATGTCTAA

(SEQ ID NO: 8)

Преимущество данного изобретения состоит в том, что фактор комплемента I особенно трудно получить в форме очищенного белка. Соответственно, изобретатели разработали способ модуляции системы комплемента, например, для обеспечения лечения возрастной макулярной дегенерации (ВМД), путем введения фактора комплемента I в форме вектора AAV, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор комплемента I. Вектор AAV может быть введен в интересующий участок, например, в глаз, чтобы сделать возможной трансляцию in situ полипептида фактора комплемента I.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА H (CFH)

Фактор комплемента H (фактор H, CFH) представляет собой белок контроля комплемента.

Фактор комплемента H представляет собой крупный (155 кДа) растворимый гликопротеин, который присутствует в плазме человека в типовой концентрации 200-300 мкг/мл (Hakobyan et al. (2008) 49(5): 1983- 90). Основная функция фактора комплемента H - регулировать альтернативный путь системы комплемента.

Фактор комплемента H обеспечивает кофакторную активность для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b. Фактор комплемента H также увеличивает скорость диссоциации комплекса C3bBb (конвертаза C3) и комплекса (C3b)NBB (конвертаза C5), и тем самым снижает активность альтернативного пути комплемента.

Фактор комплемента H состоит из 20 модулей контрольного белка комплемента (CCP) (также называемых короткими консенсусными повторами или суши-доменами), соединенных друг с другом короткими линкерами (от трех до восьми аминокислотных остатков) и расположенных в удлиненном порядке «головка-в-хвост». Каждый из модулей CCP состоит из около 60 аминокислот с четырьмя дисульфидными остатками цистеина, связанными в порядке 1-3 2-4, и гидрофобным ядром, построенным вокруг почти неизменного остатка триптофана. Модули CCP пронумерованы от 1 до 20 (от N-конца белка). CCP 1-4 и CCP 19-20 взаимодействуют с C3b, в то время как CCP 7 и CCP 19-20 связываются с GAG и сиаловой кислотой (Schmidt et al. (2008) Journal of Immunology 181: 2610-2619).

Было показано, что генная терапия с использованием фактора комплемента H может облегчить индуцированную ВМД-подобную патологию у мышей (Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243). Мышам совместно вводили субретинально: (i) аденовирусный вектор, экспрессирующий компонент комплемента C3, который, как ранее было показано, воспроизводит многие патологические особенности ВМД человека; и (ii) аденовирусный вектор, экспрессирующий фактор комплемента Н. По сравнению с контрольными животными, получавшими GFP вместо фактора комплемента H, мыши, трансдуцированные фактором комплемента H, показали снижение пролиферации эндотелиальных клеток на 91% и ослабление атрофии ПЭС на 69%. Электроретинография показала улучшение функции сетчатки у мышей, получавших фактор комплемента H, а иммуноцитохимия родопсина и RPE65 соответствовала восстановлению фоторецепторов и ПЭС у таких животных.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способен действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b. В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способны увеличивать скорость диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы.

В предпочтительных вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способен действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b и увеличивать скорость диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы.

В некоторых вариантах реализации фактор комплемента H представляет собой фактор комплемента H.

Примером белка фактора комплемента H человека является белок фактора комплемента H человека, имеющий номер доступа UniProtKB P08603. Эта приведенная в качестве примера последовательность имеет длину 1231 аминокислоты (раскрыта как SEQ ID NO: 3), из которых аминокислоты с 1 по 18 образуют сигнальную последовательность.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента H представляет собой SEQ ID NO: 3. В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента H находится в положениях с 19 по 1231 SEQ ID NO: 3.

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEWEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGWAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLE YPTCAKR

(SEQ ID NO: 3)

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор комплемента H, является нуклеотидная последовательность, имеющая номер доступа NCBI NM_000186.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H представляет собой SEQ ID NO: 4.

ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAA AAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAG

(SEQ ID NO: 4)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, при этом белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, представляет собой SEQ ID NO: 4.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 55-3696 SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, при этом белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H находится в положениях 55-3696 SEQ ID NO: 4.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В другом варианте реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична положениям 19-1231 SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, кодирует аминокислотную последовательность в положениях 19-1231 SEQ ID NO: 3.

ФАКТОР Н-ПОДОБНЫЙ БЕЛОК 1 (FHL1)

Фактор H-подобный белок 1 (FHL1) представляет собой сплайсинговый вариант фактора комплемента H, который содержит первые 7 CCP фактора комплемента H, за которыми следует карбоксиконцевой хвост из четырех аминокислот (Clark, S.J. et al. (2015) J Clin Med 4: 18-31).

В некоторых вариантах реализации, FHL1 представляет собой FHL1 человека.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность FHL1 представляет собой SEQ ID NO: 11.

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCM ENGWSPTPRCIRVSFTL

(SEQ ID NO: 11)

Нуклеотидные последовательности FHL1, используемые в данном изобретении, предпочтительно оптимизированы по кодонам.

Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей FHL1, является SEQ ID NO: 12.

ATGCGCCTCCTGGCCAAGATCATCTGCCTCATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCTGAGGACTGCAATGAGCTGCCGCCCAGGAGGAACACAGAGATCCTGACAGGGAGCTGGTCTGACCAGACCTACCCTGAGGGCACCCAGGCGATCTACAAGTGCCGGCCGGGCTACAGGAGCCTGGGGAACATCATCATGGTGTGTAGAAAGGGCGAATGGGTGGCCCTCAACCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGGCCCTGTGGCCACCCCGGGGACACACCCTTCGGGACCTTCACCCTGACCGGCGGCAATGTGTTTGAGTACGGCGTGAAGGCTGTCTACACATGCAACGAGGGGTACCAGCTGCTGGGCGAGATTAACTACCGGGAGTGTGACACCGATGGGTGGACCAACGACATTCCCATCTGTGAGGTGGTCAAGTGTCTCCCCGTGACAGCCCCAGAAAATGGCAAAATCGTGAGCAGCGCCATGGAGCCTGACCGCGAATATCACTTTGGGCAGGCCGTGAGGTTTGTGTGCAACTCGGGCTACAAAATTGAAGGTGATGAGGAGATGCACTGCAGCGATGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAATGTGTGGAGATCTCCTGCAAGTCTCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCAATCAGCCAGAAGATTATTTACAAAGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTATGAGTATTCAGAGAGGGGAGATGCCGTCTGCACTGAGAGCGGCTGGAGACCACTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGTTGTGACAACCCTTACATCCCAAATGGCGACTACTCCCCTCTGCGGATCAAACACCGGACCGGGGATGAAATCACCTATCAGTGCCGCAATGGATTCTACCCGGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAATGCACCAGCACAGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGTACGCTGAAGCCTTGCGACTATCCAGACATCAAGCACGGAGGCCTGTACCACGAAAACATGCGGCGGCCTTATTTCCCTGTGGCAGTGGGGAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCTCTGGCTCCTACTGGGACCACATCCACTGCACACAGGACGGCTGGTCTCCAGCTGTGCCCTGCCTGAGGAAATGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGATACAACCAGAACTATGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCACCCTGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACAACTGTGACCTGCATG GAGAATGGTTGGAGCCCCACCCCGCGCTGCATCCGGGTGTCCTTCACGCTCTGA

(SEQ ID NO: 12)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 11.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12.

ПОЛИНУКЛЕОТИД

Полинуклеотиды по данному изобретению могут включать ДНК или РНК, предпочтительно ДНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Специалисту будет понятно, что множество различных полинуклеотидов могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Кроме того, следует понимать, что квалифицированные специалисты могут, используя стандартные методы, производить замены нуклеотидов, которые не влияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами по данному изобретению, чтобы отразить использование кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды данного изобретение должны экспрессироваться.

Полинуклеотиды можно модифицировать любым способом, доступным в данной области техники. Такие модификации могут быть выполнены для увеличения активности или продолжительности жизни полинуклеотидов по данному изобретению in vivo.

Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды ДНК, могут быть получены рекомбинантно, синтетически или любыми способами, доступными специалистам в данной области техники. Они также могут быть клонированы стандартными методами.

Более длинные полинуклеотиды обычно получают с использованием рекомбинантных способов, например, с использованием методов клонирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это будет включать создание пары праймеров (например, около из 15-30 нуклеотидов), фланкирующих последовательность-мишень, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученной из клетки животного или человека, выполнение полимеразной цепной реакции в условиях, которые вызывают амплификацию желаемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси с помощью агарозного геля) и извлечение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы так, чтобы они содержали подходящие сайты узнавания рестрикционного фермента, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий вектор.

СТРОЕНИЕ ГЛАЗА

Описанные в данном документе лекарственные средства могут быть доставлены в глаз млекопитающего, предпочтительно в глаз человека, в связи с лечением или профилактикой заболевания глаз, такого как возрастная макулярная дегенерация (ВМД).

Специалист в области лечения заболеваний глаз будет иметь подробное и полное представление о строении глаза. Однако, далее описано следующее строение, имеющие особое отношение к данному изобретению.

Сетчатка

Сетчатка представляет собой многослойную мембрану, которая выстилает внутреннюю заднюю камеру глаза и воспринимает изображение визуального мира, которое передается в мозг через зрительный нерв. По порядку от внутренней части глаза к внешней, сетчатка состоит из слоев нейросенсорной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки, при этом сосудистая оболочка находится вне пигментного эпителия сетчатки.

Нейросенсорная часть сетчатки и фоторецепторы

В нейросенсорной сетчатке находятся фоторецепторные клетки, которые непосредственно воспринимают свет. Он состоит из следующих слоев: внутренняя пограничная мембрана (ВПМ); слой нервных волокон; слой ганглиозных клеток; внутренний плексиформный слой; внутренний ядерный слой; внешний плексиформный слой; внешний ядерный слой (ядра фоторецепторов); внешняя пограничная мембрана (ВПМ); и фоторецепторы (внутренний и внешний сегменты палочек и колбочек).

Специалист в данной области техники будет иметь детальное понимание фоторецепторных клеток. Вкратце, фоторецепторные клетки - это специализированные нейроны, расположенные в сетчатке, которые преобразуют свет в биологические сигналы. Фоторецепторные клетки состоят из палочек и колбочек, которые по-разному распределены по сетчатке.

Клетки-палочки распределены в основном по наружным частям сетчатки. Они очень чувствительны и обеспечивают зрение при слабом освещении. В сетчатке нормального человека содержится в среднем около 125 миллионов палочек.

Колбочки сетчатки находятся на сетчатке, но особенно сильно сконцентрированы в ямке, ямке в нейросенсорной сетчатке, которая отвечает за центральное зрение с высоким разрешением. Колбочки сетчатки менее чувствительны, чем палочки сетчатки. В сетчатке нормального человека содержится в среднем около 6-7 миллионов колбочек.

Пигментный эпителий сетчатки

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) представляет собой пигментированный слой клеток, расположенный непосредственно за пределами нейросенсорной сетчатки. ПЭС выполняет ряд функций, включая транспортировку питательных и других веществ к фоторецепторным клеткам и поглощение рассеянного света для улучшения зрения.

Сосудистая оболочка

Сосудистая оболочка представляет собой сосудистый слой, расположенный между ПЭС и внешней склерой глаза. Сосудистая сеть сосудистой оболочки обеспечивает снабжение сетчатки кислородом и питательными веществами.

ВОЗРАСТНАЯ МАКУЛЯРНАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ (ВМД)

Клиническое прогрессирование возрастной макулярной дегенерации (ВМД) характеризуется поэтапно в соответствии с изменениями желтого пятна. Отличительным признаком ранней ВМД является появление друзов, которые представляют собой скопления внеклеточного продукта распада под сетчаткой и появляются в виде желтых пятен на сетчатке во время клинического обследования и на изображениях глазного дна. Друзы делятся на маленькие (<63 мкм), средние (63-124 мкм) и большие (> 124 мкм). Они также считаются твердыми или мягкими в зависимости от того, как выглядят их края при офтальмологическом исследовании. В то время как твердые друзы имеют четко очерченные края, мягкие друзы имеют менее выраженные жидкие края. Шкала фотографической тяжести глазного дна, используемая при исследовании возрастных заболеваний глаз (AREDS), является одной из основных систем классификации, используемых для этого состояния.

ВМД подразделяется на «сухую» и «влажную» (экссудативную или неоваскулярную) формы. Сухая ВМД более распространена, чем влажная ВМД, но сухая форма может переходить во влажную форму, и обе возникают одновременно в значительном количестве случаев. Сухая ВМД обычно характеризуется прогрессирующим апоптозом клеток слоя ПЭС и вышележащих фоторецепторных клеток, а также часто нижележащих клеток в слое хориоидальных капилляров. Сливные зоны гибели клеток ПЭС, сопровождающейся атрофией вышележащих фоторецепторов, называются географической атрофией (ГА). Пациенты с этой формой ВМД испытывают медленное и прогрессирующее ухудшение центрального зрения.

Влажная ВМД характеризуется кровотечением и/или утечкой жидкости из аномальных сосудов, которые выросли из сосудов сосудистой оболочки (хориокапилляров) под ПЭС и желтым пятном, что может быть причиной внезапной и инвалидизирующей потери зрения. Было подсчитано, что большая часть потери зрения, которую испытывают пациенты, происходит из-за такой хориоидальной неоваскуляризации (CNV) и ее вторичных осложнений.

Описанное в данном документе лечение или профилактика ВМД может уменьшить или предотвратить появление фенотипа ВМД, описанного выше. Предпочтительно лечение ВМД позволяет поддерживать или улучшать зрительную функцию.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или уменьшению образования географической атрофии. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к замедлению прогрессирования географической атрофии. Например, это приводит к уменьшению по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% уменьшение увеличения площади ГА в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к лечению географической атрофии, например, снижению степени географической атрофии.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или уменьшению образования друз. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению количества существующих друз, например, к уменьшению размера и/или количества существующих друз.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или снижению отложения комплемента. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению существующего отложения комплемента.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к улучшению или восстановлению зрения, или остроты зрения. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД уменьшает потерю зрения или остроты зрения.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к улучшению или восстановлению скорости чтения у субъекта. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД уменьшает снижение скорости чтения у субъекта.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению или предотвращению потери фоторецепторов и/или пигментного эпителия сетчатки (ПЭС).

ДИАБЕТИЧЕСКАЯ РЕТИНОПАТИЯ

Диабетическая ретинопатия представляет собой состояние, характеризующееся повреждением кровеносных сосудов сетчатки, которое вызвано высоким уровнем сахара в крови, связанным с диабетом. При отсутствии лечения диабетическая ретинопатия может вызвать слепоту.

Хотя субъекты с легкой степенью диабетической ретинопатии могут иметь хорошее зрение, два типа диабетической ретинопатии, а именно диабетический макулярный отек (DMO) и пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR), могут угрожать зрению субъекта.

Диабетический макулярный отек характеризуется вытеканием жидкости из поврежденных кровеносных сосудов в задней части глаза. Вытекающая жидкость накапливается в желтом пятне, что приводит к отеку и нечеткости зрения. В конечном итоге это может привести к ухудшению центрального зрения и неспособности читать или управлять автомобилем. Боковое зрение обычно остается нормальным.

Пролиферативная диабетическая ретинопатия характеризуется закрытием кровеносных сосудов сетчатки, что приводит к росту ненормальных, хрупких кровеносных сосудов на поверхности сетчатки. Это может привести к необратимой потере зрения из-за кровотечения в глазу, рубцевания и отслоения сетчатки.

ВЕКТОРЫ

Вектор представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает перенос объекта из одной среды в другую.

Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы

В одном аспекте в данном изобретении предлагается вектор AAV, содержащий полинуклеотид по данному изобретению.

Предпочтительно вектор AAV находится в форме частицы вектора AAV.

Способы получения и модификации вирусных векторов и вирусных векторных частиц, таких как полученные из AAV, хорошо известны в данной области техники.

Вектор AAV может содержать геном AAV или его фрагмент, или производное.

Известно, что AAV способен упаковывать геномы размером до 5,2 к.о. (Dong, J.-Y. et al. (1996) Human Gene Therapy 7: 2101-2112).

Геном AAV представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая может кодировать функции, необходимые для продукции частицы AAV. Эти функции включают те, которые действуют в цикле репликации и упаковки AAV в клетке-хозяине, включая инкапсидацию генома AAV в частицу AAV. Встречающиеся в природе AAV дефицитны по репликации и полагаются на обеспечение вспомогательных функций в транс для завершения цикла репликации и упаковки. Соответственно, геном AAV вектора AAV по данному изобретению обычно является репликационно-дефицитным.

Геном AAV может быть в одноцепочечной форме, с положительным или отрицательным смыслом, или, альтернативно, в двухцепочечной форме. Использование двухцепочечной формы позволяет обойти стадию репликации ДНК в клетке-мишени и, таким образом, может ускорить экспрессию трансгена.

Геном AAV может происходить из любого природного серотипа, изолята или клады AAV. Таким образом, геном AAV может быть полным геномом встречающегося в природе AAV. Как известно специалисту в данной области техники, AAV, встречающиеся в природе, можно классифицировать в соответствии с различными биологическими системами.

Обычно AAV упоминаются в соответствии с их серотипом. Серотип соответствует вариантному подвиду AAV, который благодаря своему профилю экспрессии поверхностных антигенов капсида имеет отличительную реактивность, которая может использоваться для отличия его от других вариантных подвидов. Обычно вирус, имеющий конкретный серотип AAV, не может эффективно перекрестно реагировать с нейтрализующими антителами, специфичными для любого другого серотипа AAV.

Серотипы AAV включают AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11, а также рекомбинантные серотипы, такие как Rec2 и Rec3, недавно идентифицированные из мозга приматов. В данном изобретении может использоваться любой из этих серотипов AAV.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV представляет собой векторную частицу AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 или Rec3 AAV.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV2. В других вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV8.

Капсидный белок может быть мутантным капсидным белком, таким как описанный в WO 2008/124724, который включен в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации, вектор AAV содержит капсид AAV8 с мутацией Y733F.

Обзоры серотипов AAV можно найти в Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 и Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27. Последовательности геномов AAV или элементов геномов AAV, включая последовательности ITR, гены rep или cap для использования в изобретении, могут быть получены из следующих номеров доступа для последовательностей полных геномов AAV: аденоассоциированный вирус 1 NC_002077, AF063497; аденоассоциированный вирус 2 NC_001401; аденоассоциированный вирус 3 NC_001729; аденоассоциированный вирус 3B NC_001863; аденоассоциированный вирус 4 NC_001829; аденоассоциированный вирус 5 Y18065, AF085716; аденоассоциированный вирус 6 NC_001862; AAV птиц ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; штамм AAV птиц DA-1 NC_006263, AY629583; AAV крупного рогатого скота NC_005889, AY388617.

AAV также может относиться к филогенетической группе или клонам. Это относится к филогенетическим отношениям AAV естественного происхождения и, как правило, к филогенетической группе AAV, которая может быть прослежена до общего предка и включает всех его потомков. Кроме того, AAV может относиться к конкретному изоляту, то есть генетическому изоляту определенного AAV, встречающегося в природе. Термин «генетический изолят» описывает популяцию AAV, которая подверглась ограниченному генетическому смешению с другими встречающимися в природе AAV, тем самым определяя узнаваемую, на генетическом уровне, особую популяцию.

Специалист в области техники может выбрать подходящий серотип, филогенетическую группу, клон или изолят AAV для использования в изобретении на основе своих общих знаний. Например, было показано, что капсид AAV5 эффективно трансдуцирует фоторецепторы колбочек приматов, о чем свидетельствует успешная коррекция унаследованного дефекта цветового зрения (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).

Серотип AAV определяет тканевую специфичность инфекции (или тропизм) AAV. Соответственно, предпочтительными серотипами AAV для использования в AAV, вводимых пациентам в соответствии с изобретением, являются те, которые обладают естественным тропизмом или высокой эффективностью инфицирования клеток-мишеней в глазу. В некоторых вариантах реализации серотипы AAV для использования в изобретении представляют собой серотипы, которые трансдуцируют клетки нейросенсорной сетчатки, пигментного эпителия сетчатки и/или сосудистой оболочки.

Обычно геном AAV естественного серотипа, изолята или филогенетической группы AAV содержит по меньшей мере одну инвертированную концевую повторяющуюся последовательность (ITR). Последовательность ITR действует в цис-системе, обеспечивая функциональную точку начала репликации и позволяя интегрировать и вырезать вектор из генома клетки. В предпочтительных вариантах реализации одна или более последовательностей ITR фланкируют нуклеотидные последовательности, кодирующие фактор комплемента I и/или FHL1. Геном AAV обычно также включает гены упаковки, такие как гены rep и/или cap, которые кодируют функции упаковки для частицы AAV. Ген rep кодирует один или более белков Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 или их варианты. Ген cap кодирует один или более капсидных белков, таких как VP1, VP2 и VP3 или их варианты. Эти белки составляют капсид частицы AAV. Варианты капсида обсуждаются ниже.

Промотор будет функционально связан с каждым из генов упаковки. Конкретные примеры таких промоторов включают промоторы p5, p19 и p40 (Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). Например, промоторы p5 и p19 обычно используются для экспрессии гена rep, тогда как промотор p40 обычно используется для экспрессии гена cap.

Как обсуждалось выше, геном AAV, используемый в векторе AAV по изобретению, может поэтому быть полным геномом встречающегося в природе AAV. Например, вектор, содержащий полный геном AAV, можно использовать для получения вектора AAV или векторной частицы in vitro. Однако, хотя в принципе такой вектор можно вводить пациентам, на практике это будет происходить редко. Предпочтительно геном AAV будет дериватизирован для введения пациентам. Такая дериватизация является стандартной в данной области техники, и изобретение охватывает использование любых известных производных генома AAV и производных, которые могут быть получены с применением методов, известных в данной области техники. Дериватизация генома AAV и капсида AAV рассмотрены в Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, и в Choi et al. and Wu et al., упомянутых выше.

Производные генома AAV включают любые усеченные или модифицированные формы генома AAV, которые позволяют экспрессию трансгена из вектора AAV по изобретению in vivo. Как правило, можно значительно усечь геном AAV, чтобы включить минимальную вирусную последовательность, но при этом сохранить указанную выше функцию. Это предпочтительно по соображениям безопасности для снижения риска рекомбинации вектора с вирусом дикого типа, а также для предотвращения запуска клеточного иммунного ответа из-за присутствия белков вирусных генов в клетке-мишени.

Обычно производное будет включать по меньшей мере одну инвертированную концевую повторяющуюся последовательность (ITR), предпочтительно более одной ITR, например, две ITR или более. Одна или более ITR могут происходить из геномов AAV, имеющих разные серотипы, или могут быть химерными или мутантными ITR. Предпочтительный мутант ITR имеет делецию trs (сайт концевого разрешения). Эта делеция позволяет продолжить репликацию генома для создания одноцепочечного генома, который содержит как кодирующие, так и комплементарные последовательности, то есть самокомплементарный геном AAV. Это позволяет обойти репликацию ДНК в клетке-мишени и, таким образом, обеспечивает ускоренную экспрессию трансгена.

Одна или более ITR предпочтительно будут фланкировать нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор комплемента I или FHL1 с любого конца. Включение одного или более ITR предпочтительно для содействия образованию конкатамера вектора по изобретению в ядре клетки-хозяина, например, после преобразования одноцепочечной векторной ДНК в двухцепочечную ДНК под действием полимераз ДНК клетки-хозяина. Образование таких эписомальных конкатамеров защищает векторную конструкцию в течение жизни клетки-хозяина, тем самым обеспечивая пролонгированную экспрессию трансгена in vivo.

В предпочтительных вариантах реализации элементы ITR будут единственными последовательностями, сохраненными из нативного генома AAV в производном. Таким образом, производное предпочтительно не будет включать гены rep и/или cap нативного генома и любые другие последовательности нативного генома. Это предпочтительно по причинам, описанным выше, а также для уменьшения возможности интеграции вектора в геном клетки-хозяина. Кроме того, уменьшение размера генома AAV обеспечивает повышенную гибкость при включении других элементов последовательности (таких как регуляторные элементы) в вектор в дополнение к трансгену.

Следовательно, в производном по изобретению могут быть удалены следующие части: одна инвертированная концевая повторяющаяся последовательность (ITR), гены репликации (rep) и капсида (cap). Однако в некоторых вариантах реализации производные могут дополнительно включать один или более генов rep и/или cap или другие вирусные последовательности генома AAV. Встречающийся в природе AAV с высокой частотой интегрируется в конкретный участок хромосомы 19 человека и демонстрирует незначительную частоту случайной интеграции, так что сохранение интегративной способности вектора может быть допущено в терапевтических условиях.

Когда производное включает капсидные белки, то есть VP1, VP2 и/или VP3, производное может быть химерным, перетасованным или модифицированным капсидом производным одного или более встречающихся в природе AAV. В частности, изобретение включает предоставление последовательностей капсидных белков из разных серотипов, филогенетических групп, клонов или изолятов AAV в одном и том же векторе (т.е. псевдотипическом векторе).

Производные с химерным, перетасованным или модифицированным капсидом обычно выбирают для обеспечения одной или более желаемых функциональностей для вектора AAV. Таким образом, эти производные могут демонстрировать повышенную эффективность доставки генов, пониженную иммуногенность (гуморальную или клеточную), измененный диапазон тропизма и/или улучшенное нацеливание на конкретный тип клеток по сравнению с вектором AAV, содержащим природный геном AAV, такой как геном AAV2. Повышенная эффективность доставки гена может быть достигнута за счет улучшенного связывания с рецептором или корецептором на поверхности клетки, улучшенной интернализации, улучшенного переноса внутрь клетки и в ядро, улучшенного распаковывания вирусной частицы и улучшенного преобразования одноцепочечного генома в двухцепочечную форму. Повышенная эффективность может также относиться к измененному диапазону тропизма или нацеливанию на конкретную популяцию клеток, так что доза вектора не разбавляется путем введения в ткани, где она не требуется.

Химерные капсидные белки включают те, которые образуются путем рекомбинации между двумя или более последовательностями, кодирующими капсид природных серотипов AAV. Это может быть выполнено, например, с помощью подхода спасения маркера, в котором неинфекционные последовательности капсида одного серотипа котрансфицируют с последовательностями капсида другого серотипа, и направленный отбор используется для отбора последовательностей капсида, обладающих желаемыми свойствами. Последовательности капсида различных серотипов могут быть изменены путем гомологичной рекомбинации внутри клетки для получения новых химерных капсидных белков.

Химерные капсидные белки также включают те, которые генерируются путем конструирования последовательностей капсидных белков для переноса доменов конкретных капсидных белков, поверхностных петель или определенных аминокислотных остатков между двумя или более капсидными белками, например, между двумя или более капсидными белками разных серотипов.

Перетасованные или химерные капсидные белки также могут быть получены перетасовкой ДНК или подверженной ошибкам ПЦР. Гибридные капсидные гены AAV могут быть созданы путем случайного фрагментирования последовательностей родственных генов AAV, например, генов, кодирующих капсидные белки нескольких различных серотипов, а затем последующей повторной сборки фрагментов в реакции самопримирования полимеразы, которая также может вызывать перекрестные переходы в областях гомологии последовательностей. Библиотека гибридных генов AAV, созданная таким образом, путем перетасовки генов капсида нескольких серотипов, может быть подвергнута скринингу для выявления вирусных клонов, обладающих желаемой функциональностью. Аналогичным образом, подверженная ошибкам ПЦР может использоваться для случайной мутации генов капсида AAV для создания разнообразной библиотеки вариантов, которые затем могут быть отобраны по желаемому свойству.

Последовательности генов капсида также могут быть генетически модифицированы для введения специфических делеций, замен или вставок по отношению к нативной последовательности дикого типа. В частности, гены капсида можно модифицировать путем вставки последовательности неродственного белка или пептида в открытую рамку считывания кодирующей последовательности капсида или на N- и/или C-конце кодирующей последовательности капсида.

Неродственный белок или пептид может преимущественно быть таким, который действует как лиганд для определенного типа клеток, тем самым обеспечивая улучшенное связывание с клеткой-мишенью или повышая специфичность нацеливания вектора на конкретную популяцию клеток. Примером может быть использование пептида RGD для блокирования поглощения пигментным эпителием сетчатки и, таким образом, усиления трансдукции окружающих тканей сетчатки (Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). Неродственный белок также может быть белком, который способствует очистке вирусной частицы как части производственного процесса, то есть эпитопом или аффинной меткой. Место вставки обычно выбирают так, чтобы не мешать другим функциям вирусной частицы, например, интернализации, транспортировке вирусной частицы. Специалист может определить подходящие сайты для вставки на основе своих общих знаний. Конкретные сайты раскрыты в Choi et al., упомянутой выше.

Изобретение дополнительно включает обеспечение последовательностей генома AAV в порядке и конфигурации, отличных от порядка и конфигурации нативного генома AAV. Изобретение также включает замену одной или более последовательностей, или генов AAV последовательностями из другого вируса или химерными генами, состоящими из последовательностей более чем одного вируса. Такие химерные гены могут состоять из последовательностей двух или более родственных вирусных белков разных видов вирусов.

Вектор AAV по изобретению может иметь форму нуклеотидной последовательности, содержащей геном AAV или его производное, и последовательность, кодирующую фактор комплемента I или FHL1, или их производные.

Частицы AAV по изобретению включают транскапсидированные формы, в которых геном или производное AAV, имеющее ITR одного серотипа, упаковано в капсид другого серотипа. Частицы AAV по изобретению также включают мозаичные формы, в которых смесь немодифицированных белков капсида двух или более различных серотипов составляет вирусный капсид. Частица AAV также включает химически модифицированные формы, несущие лиганды, адсорбированные на поверхности капсида. Например, такие лиганды могут включать антитела для нацеливания на конкретный рецептор клеточной поверхности.

Таким образом, например, частицы AAV по изобретению включают частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV2 (AAV2/2), частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV5 (AAV2/5) и частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV8 (AAV2/8), а также с геномом AAV2 и капсидными белками более чем одного серотипа.

Вектор AAV может содержать несколько копий (например, 2, 3 и т.д.) нуклеотидной последовательности, упомянутой в данном документе.

ПРОМОТОРЫ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Полинуклеотид или вектор по изобретению может также включать элементы, обеспечивающие экспрессию трансгенов фактора комплемента I или FHL1 in vitro или in vivo. Их можно назвать последовательностями контроля экспрессии. Таким образом, полинуклеотид или вектор обычно содержат последовательности контроля экспрессии (например, содержащие последовательность промотора), функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансген.

Может быть использован любой подходящий промотор, выбор которого может быть легко сделан специалистом в данной области техники. Последовательность промотора может быть конститутивно активной (то есть работать на любом фоне клетки-хозяина) или, альтернативно, может быть активной только в конкретной среде клетки-хозяина, что позволяет осуществлять целевую экспрессию трансгена в конкретном типе клеток (например, тканеспецифический промотор). Промотор может проявлять индуцируемую экспрессию в ответ на присутствие другого фактора, например, фактора, присутствующего в клетке-хозяине. В любом случае, когда вектор вводят для терапии, предпочтительно, чтобы промотор был функциональным на фоне клетки-мишени.

В некоторых вариантах реализации предпочтительно, чтобы промотор проявлял специфическую для клеток сетчатки экспрессию, чтобы трансген мог экспрессироваться только в популяциях клеток сетчатки. Таким образом, экспрессия промотора может быть специфичной для клеток сетчатки, например, ограничиваться только клетками нейросенсорной сетчатки и пигментным эпителием сетчатки.

Предпочтительные промоторы, которые не являются специфичными для клеток сетчатки, включают промотор куриного бета-актина (CBA), необязательно в комбинации с элементом энхансера цитомегаловируса (CMV). Примером промотора для использования в изобретении является промотор CAG, например, промотор, используемый в кассете экспрессии rAVE (GeneDetect.com).

В предпочтительных вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор CMV.

Примером последовательности промотора CMV является:

GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCG

(SEQ ID NO: 13)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью, которая идентична на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 13. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность промотора, представленного SEQ ID NO: 13.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13.

Еще одним примером промоторной последовательности является:

ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT

(SEQ ID NO: 5)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью, которая идентична на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 5. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность промотора, представленного SEQ ID NO: 5.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

Примеры промоторов на основе человеческих последовательностей, которые могут индуцировать экспрессию генов, специфичных для сетчатки, включают родопсинкиназу для палочек и колбочек (Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), PR2.1 только для колбочек (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) и/или RPE65 (Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) или VMD2 (Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73) для пигментного эпителия сетчатки.

Полинуклеотид или вектор по изобретению может также содержать одну или более дополнительных регуляторных последовательностей, которые могут действовать пре- или посттранскрипционно. Регуляторная последовательность может быть частью локуса природного трансгена или может быть гетерологичной регуляторной последовательностью. Полинуклеотид или вектор по изобретению может содержать части 5'-UTR или 3'-UTR из нативного транскрипта трансгена.

Регуляторные последовательности представляют собой любые последовательности, которые облегчают экспрессию трансгена, т.е. действуют, увеличивая экспрессию транскрипта, улучшая ядерный экспорт мРНК или повышая ее стабильность. Такие регуляторные последовательности включают, например, энхансерные элементы, посттранскрипционные регуляторные элементы и сайты полиаденилирования.

Предпочтительным сайтом полиаденилирования является сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-А).

Примером сигнала гормона роста крупного рогатого скота поли-А (bGH поли-А) является:

GTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG

(SEQ ID NO: 14)

Еще одним примером сигнала поли-А гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-А) является:

TCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGG

(SEQ ID NO: 6)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью, которая идентична на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 14 или 6. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность сигнала полиаденилирования, представленного SEQ ID NO: 14 или 6.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью 14 или 6.

В контексте полинуклеотида или вектора по изобретению такие регуляторные последовательности будут цис-действующими. Однако изобретение также включает использование транс-действующих регуляторных последовательностей, расположенных на дополнительных генетических конструкциях.

Предпочтительным посттранскрипционным регуляторным элементом для использования в векторе AAV по данному изобретению является посттранскрипционный регуляторный элемент гепатита сурка (WPRE) или его вариант.

Примером WPRE является:

ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC

(SEQ ID NO: 7)

WPRE представляет собой трехчастичный элемент, содержащий элементы гаммы, альфа и бета в указанном порядке. Также в изобретении можно использовать укороченную версию WPRE, которая содержит только минимальные гамма и альфа элементы (упоминается как WPRE3; Choi, J.-H. et al. (2014) Molecular Brain 7: 17).

Примером последовательности WPRE3 является:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGT

(SEQ ID NO: 15)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит посттранскрипционный регуляторный элемент с нуклеотидной последовательностью, которая идентична на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 15 или 7. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность посттранскрипционного регуляторного элемента, представленного SEQ ID NO: 15 или 7.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит посттранскрипционный регуляторный элемент с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15 или 7.

Другой регуляторной последовательностью, которую можно использовать в полинуклеотиде или векторе по изобретению, является последовательность ДНК, обладающая способностью связывания с ядерным матриксом (SAR). Дополнительные регуляторные последовательности могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники.

СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ

Полинуклеотид или вектор по изобретению можно вводить системно (например, вливанием в периферическую вену) и можно вводить местно (например, в систему ЦНС путем интратекальной инъекции). В предпочтительных вариантах реализации полинуклеотид или вектор вводят внутриглазно.

Термин «внутриглазный» относится к внутренней части глаза, таким образом, внутриглазное введение относится к введению внутрь глаза субъекта.

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции. В некоторых вариантах реализации указанное введение осуществляется роботом.

Объем вводимой лекарственной композиции может, например, составлять около 10-500 мкл, например, около 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 или 50-150 мкл. Объем может, например, составлять около 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл. Предпочтительно объем вводимой лекарственной композиции составляет 100 мкл.

Специалист в данной области техники будет знаком с индивидуальными субретинальными, прямыми ретинальными, супрахориоидальными или интравитреальными инъекциями и сможет выполнять их.

Предпочтительно полинуклеотид или вектор вводят с помощью субретинальной инъекции.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или фармацевтическую композицию, содержащую их, вводят не более одного раза или не более двух раз в течение жизни субъекта.

Субретинальная инъекция

Субретинальные инъекции представляют собой инъекции в субретинальное пространство, то есть под нейросенсорную сетчатку. Во время субретинальной инъекции вводимый материал направляется внутрь фоторецепторных клеток и слоев пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и создает пространство между ними.

Когда инъекция проводится через небольшую ретинотомию, может возникнуть отслоение сетчатки. Отслоившийся приподнятый слой сетчатки, образованный введенным материалом, называется «пузырь».

Отверстие, создаваемое субретинальной инъекцией, должно быть достаточно маленьким, чтобы введенный раствор не возвращался обратно в полость стекловидного тела после введения. Такой рефлюкс будет особенно проблематичным при инъекции лекарства, потому что действие лекарства будет направлено в сторону от целевой зоны. Предпочтительно, инъекция создает самоуплотняющуюся точку входа в нейросенсорную сетчатку, т.е. после того, как инъекционная игла удалена, отверстие, созданное иглой, закрывается так, что через отверстие выходит очень мало или практически не выходит впрыснутый материал.

Для облегчения этого процесса коммерчески доступны специальные иглы для субретинальных инъекций (например, тефлоновые иглы для субретинальных инъекций DORC 41G, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, Нидерланды). Это иглы, предназначенные для проведения субретинальных инъекций.

Если во время инъекции не происходит повреждения сетчатки и до тех пор, пока используется достаточно маленькая игла, практически весь введенный материал остается локализованным между отслоившейся нейросенсорной сетчаткой и ПЭС в месте локализованного отслоения сетчатки (т.е. не происходит рефлюкса в полость стекловидного тела). Действительно, типичное сохранение пузыря в течение короткого периода времени указывает на то, что обычно происходит небольшой выход введенного материала в стекловидное тело. Пузырь может рассеиваться в течение более длительного периода времени, поскольку впрыскиваемый материал впитывается.

Визуализация глаза, в частности сетчатки, например, с помощью оптической когерентной томографии, может быть проведена до операции.

Объем вводимой лекарственной композиции может, например, составлять около 10-500 мкл, например, около 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 или 50-150 мкл. Объем может, например, составлять около 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл. Предпочтительно объем вводимой лекарственной композиции составляет 100 мкл. Большие объемы могут увеличить риск растяжения сетчатки, в то время как меньшие объемы трудно увидеть.

Двухстадийная субретинальная инъекция

Полинуклеотид или вектор по изобретению можно доставлять с повышенной точностью и безопасностью с помощью двухстадийного метода, в котором локализованная отслойка сетчатки создается субретинальной инъекцией первого раствора. Первый раствор не содержит полинуклеотида или вектора. Затем используют вторую субретинальную инъекцию для доставки лекарственного средства, содержащего полинуклеотид или вектор, в субретинальную жидкость пузыря, созданную первой субретинальной инъекцией. Поскольку инъекция, доставляющая лекарственное средство, не используется для отслоения сетчатки, на этой второй стадии может быть введен определенный объем раствора.

В некоторых вариантах реализации субретинальная инъекция вектора включает стадии:

(a) введение субъекту раствора путем субретинальной инъекции в количестве, эффективном для по меньшей мере частичного отслоения сетчатки с образованием субретинального пузыря, причем раствор не содержит полинуклеотида или вектора; и

(b) введение лекарственной композиции путем субретинальной инъекции в пузырь, образованный на стадии (а), причем лекарственное средство включает полинуклеотид или вектор.

Объем раствора, вводимого на стадии (а) для по меньшей мере частичного отделения сетчатки, может составлять, например, около 10-1000 мкл, например, около 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10- 500, 50-500, 100-500, 250-500 мкл. Объем может составлять, например, около 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкл.

Объем лекарственной композиции, вводимой на стадии (b), может составлять, например, около 10-500 мкл, например, около 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 или 50-150 мкл. Объем может составлять, например, около 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл. Предпочтительно объем лекарственной композиции, вводимой на стадии (b), составляет 100 мкл. Большие объемы могут увеличить риск растяжения сетчатки, в то время как меньшие объемы трудно увидеть.

Раствор, который не содержит лекарственное средство (т.е. «раствор» стадии (а)), может быть составлен аналогично раствору, который действительно содержит лекарственное средство, как описано ниже. Предпочтительный раствор, который не содержит лекарственное средство, представляет собой сбалансированный физиологический раствор (BSS) или аналогичный буферный раствор, соответствующий pH и осмоляльности субретинального пространства.

Визуализация сетчатки во время операции

При определенных обстоятельствах, например, во время конечной стадии дегенерации сетчатки, идентифицировать сетчатку сложно, потому что она тонкая, прозрачная и ее трудно увидеть на фоне разрушенного и сильно пигментированного эпителия, на котором она находится. Использование синего витального красителя (например, Brilliant Peel®, Geuder; MembraneBlue-Dual®, Dore) может облегчить идентификацию отверстия в сетчатке, сделанного для процедуры отслоения сетчатки (т.е. стадия (а) в методе двухстадийной субретинальной инъекции изобретения), так что лекарственное средство можно вводить через то же отверстие без риска обратного рефлюкса в полость стекловидного тела.

Использование синего витального красителя также позволяет идентифицировать любые области сетчатки, где есть утолщенная внутренняя ограничивающая мембрана или эпиретинальная мембрана, поскольку инъекция через любую из этих структур затрудняет чистый доступ в субретинальное пространство. Кроме того, сокращение любой из этих структур в ближайшем послеоперационном периоде может привести к растяжению входного отверстия сетчатки, что может привести к оттоку лекарственного средства в полость стекловидного тела.

Супрахориоидальная инъекция

Полинуклеотид или вектор по изобретению можно доставлять в супрахориоидальное пространство с использованием подхода ab externo, в котором используется микрокатетер (см., например, Peden et al. (2011) PLoS One 6 (2): e17140). В этом методе выполняется лимбальная перитомия конъюнктивы для обнажения оголенной склеры, с последующей склеротомией для обнажения оголенной сосудистой оболочки. Микрокатетер (например, iTrack 250A от iScience Interventional, опционально подключаемый к системе освещения, такой как система микроосвещения на основе лазерных диодов iLumin (iScience Interventional)) вводится в супрахориоидальное пространство и продвигается в направлении назад к диску зрительного нерва. После перемещения кончика микрокатетера в желаемое положение инъекция полинуклеотида или вектора формирует пузырек внутри сетчатки и сосудистой оболочки.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор доставляется супрахориоидально способом, включающим (i) введение микрокатетера в супрахориоидальное пространство; (ii) продвижение микрокатетера в указанном пространстве до тех пор, пока кончик не окажется вблизи пораженной области сетчатки; и (iii) инъекцию полинуклеотида или вектора из наконечника микрокатетера для создания пузыря.

В некоторых вариантах реализации указанные выше процедуры введения выполняются непосредственно роботом.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ИНЪЕКЦИОННЫЕ РАСТВОРЫ

Лекарственные средства, например, полинуклеотиды или векторы по изобретению, могут быть включены в фармацевтические композиции. Эти композиции могут содержать, помимо лекарственного средства, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, вспомогательное вещество, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала может быть определена специалистом в соответствии со способом введения, например, посредством субретинальной, прямая ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

Фармацевтическая композиция обычно находится в жидкой форме. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, нефть, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, хлорид магния, декстроза или другой раствор сахаридов или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. В некоторых случаях может использоваться поверхностно-активное вещество, такое как плюроновая кислота (PF68) 0,001%.

Для инъекции в очаг поражения активный ингредиент может быть в форме водного раствора, который не содержит пирогенов и имеет подходящий pH, изотоничность и стабильность. Квалифицированный специалист может приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические носители, такие как инъекция хлорида натрия, инъекция Рингера или инъекция лактата Рингера. При необходимости могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки.

Для замедленного высвобождения лекарственное средство может быть включено в фармацевтическую композицию, которая составлена для медленного высвобождения, например, в микрокапсулах, образованных из биосовместимых полимеров, или в липосомальных системах-носителях в соответствии со способами, известными в данной области техники.

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ

Следует принимать во внимание, что все ссылки в данном документе на лечение включают лечебное, паллиативное и профилактическое лечение; хотя в контексте изобретения ссылки на профилактику чаще связаны с профилактическим лечением. Лечение также может включать остановку прогрессирования заболевания.

Предпочтительно лечение млекопитающих, особенно людей. Однако в объем изобретения входят как лечение человека, так и ветеринарное лечение.

ВАРИАНТЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ, АНАЛОГИ, ГОМОЛОГИ И ФРАГМЕНТЫ

Помимо конкретных белков и нуклеотидов, упомянутых в данном документе, изобретение также включает использование их вариантов, производных, аналогов, гомологов и фрагментов.

В контексте изобретения вариант любой данной последовательности представляет собой последовательность, в которой конкретная последовательность остатков (будь то остатки аминокислот или нуклеиновых кислот) была модифицирована таким образом, что рассматриваемый полипептид или полинуклеотид по существу сохраняет свою функцию. Вариант последовательности может быть получен путем добавления, делеции, замены, модификации, замены и/или изменения по меньшей мере одного остатка, присутствующего в природном белке.

Термин «производное», используемый в данном документе в отношении белков или полипептидов по изобретению, включает любую замену, изменение, модификацию, замену, делецию и/или добавление одного (или более) аминокислотных остатков из или в последовательность, обеспечивая, что полученный белок или полипептид по существу сохраняет по меньшей мере одну из своих эндогенных функций.

Термин «аналог», используемый в данном документе по отношению к полипептидам или полинуклеотидам, включает любой миметик, то есть химическое соединение, которое обладает по меньшей мере одной из эндогенных функций полипептидов или полинуклеотидов, которые оно имитирует.

Обычно могут быть произведены аминокислотные замены, например, от 1, 2 или 3 до 10 или 20 замен при условии, что модифицированная последовательность по существу сохраняет требуемую активность или способность. Аминокислотные замены могут включать использование не встречающихся в природе аналогов.

Белки, используемые в изобретении, также могут иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащие изменения и приводят к функционально эквивалентному белку. Преднамеренные замены аминокислот могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, до тех пора, пока сохраняется эндогенная функция. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющими аналогичные значения гидрофильности, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.

Консервативные замены могут быть выполнены, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной строке в третьем столбце могут быть заменены друг на друга:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ Неполярные G A P I L V Полярные-незаряженные C S T M N Q Полярные-заряженные D E K R H АРОМАТИЧЕСКИЕ F W Y

Используемый в данном документе термин «гомолог» означает объект, имеющий определенную гомологию с аминокислотной последовательностью дикого типа и нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин «гомология» может быть приравнен к «идентичности».

Гомологичная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть идентична на по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%, предпочтительно на по меньшей мере 95% или 97% или на 99% рассматриваемой последовательности. Обычно гомологи содержат те же активные центры и т.д., что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотных остатков, имеющих сходные химические свойства/функции), в контексте изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательностей.

Гомологичная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, которая может быть идентична на по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%, предпочтительно на по меньшей мере 95% или 97% или на 99% рассматриваемой последовательности. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства, в контексте изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательностей.

Предпочтительно, ссылка на последовательность, которая имеет процент идентичности с любой из SEQ ID NO, подробно описанных в данном документе, относится к последовательности, которая имеет заявленную процентную идентичность по всей длине указанной SEQ ID NO.

Сравнение гомологии можно проводить на глаз или, чаще, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитывать процентную гомологию или идентичность между двумя или более последовательностями.

Процент гомологии может быть вычислен по смежным последовательностям, т.е. одна последовательность выравнивается с другой последовательностью, и каждая аминокислота в одной последовательности напрямую сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называется выравниванием «без пропусков». Обычно такое выравнивание без пропусков выполняется только для относительно небольшого числа остатков.

Хотя это очень простой и последовательный метод, он не принимает во внимание, что, например, в идентичной в остальном паре последовательностей одна вставка или делеция в нуклеотидной последовательности может привести к нарушению выравнивания следующих кодонов, таким образом потенциально может привести к значительному снижению процента гомологии при выполнении глобального выравнивания. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей разработаны для получения оптимальных выравниваний, которые учитывают возможные вставки и делеции без чрезмерного снижения общей оценки гомологии. Это достигается путем вставки «пробелов» в выравнивание последовательностей, чтобы попытаться максимизировать локальную гомологию.

Однако эти более сложные методы назначают «штрафы за пропуски» для каждого пробела, возникающего в выравнивании, так что для одинакового количества идентичных аминокислот выравнивание последовательности с минимальным возможным числом пробелов, отражающее более высокую степень родства между двумя сравниваемыми последовательностями, наберет более высокий балл, чем то, у которого много пробелов. Обычно используются «аффинные затраты на разрыв», при которых взимается относительно высокий штраф за существование разрыва и меньший штраф за каждый последующий остаток в разрыве. Это наиболее часто используемая система оценки пробелов. Высокие штрафы за пропуски, конечно, приведут к оптимизированному выравниванию с меньшим количеством пропусков. Большинство программ выравнивания позволяют изменять штрафы за пробелы. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей предпочтительно использовать значения по умолчанию. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit штраф за пропуск по умолчанию для аминокислотных последовательностей составляет -12 за пропуск и -4 за каждое удлинение.

Поэтому для расчета максимального процента гомологии необходимо прежде всего произвести оптимальное выравнивание с учетом штрафов за пробелы. Подходящей компьютерной программой для выполнения такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры другого программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают, помимо прочего, пакет BLAST (см. Ausubel et al. (1999) ibid-Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для автономного и онлайн-поиска (см. Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительнее использовать программу GCG Bestfit. Другой инструмент, называемый BLAST 2 Sequences, также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).

Хотя конечный процент гомологии можно измерить с точки зрения идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основан на сравнении пар по принципу «все или ничего». Вместо этого обычно используется масштабированная матрица оценок сходства, которая присваивает оценки каждому попарному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой широко используемой матрицы является матрица BLOSUM62-матрица по умолчанию для набора программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют либо общедоступные значения по умолчанию, либо настраиваемую таблицу сравнения символов, если таковая имеется (дополнительную информацию см. в руководстве пользователя). Для некоторых приложений предпочтительно использовать общедоступные значения по умолчанию для пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.

После того, как программное обеспечение произвело оптимальное выравнивание, можно рассчитать процент гомологии, предпочтительно процент идентичности последовательностей. Программное обеспечение обычно делает это как часть сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.

«Фрагменты» полноразмерного фактора комплемента I или FHL1, также являются вариантами, и этот термин обычно относится к выбранной области полипептида или полинуклеотида, которая представляет интерес либо функционально, либо, например, в анализе. Таким образом, «фрагмент» относится к последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, которая является частью полноразмерного полипептида или полинуклеотида.

Такие варианты могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, таких как сайт-направленный мутагенез. Когда должны быть сделаны вставки, может быть получена синтетическая ДНК, кодирующая вставку, вместе с 5'- и 3'-фланкирующими областями, соответствующими природной последовательности с любой стороны от сайта вставки. Фланкирующие области будут содержать удобные сайты рестрикции, соответствующие сайтам в естественной последовательности, так что последовательность может быть разрезана подходящим ферментом(ами), а синтетическая ДНК лигирована в разрез. Затем ДНК экспрессируют в соответствии с изобретением, чтобы получить кодируемый белок. Эти методы только иллюстрируют многочисленные стандартные методы, известные в данной области техники, для манипулирования последовательностями ДНК, и также могут использоваться другие известные методы.

Специалист в данной области техники поймет, что они могут комбинировать все признаки изобретения, раскрытые в данном документе, не выходя за рамки раскрытого объема изобретения.

Предпочтительные признаки и варианты реализации изобретения теперь будут описаны посредством неограничивающих примеров.

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалиста в данной области техники. Такие методы описаны в литературе. См., например, Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен в данный документ посреством ссылки.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Оптимизация кодонов

Нуклеотидные последовательности, кодирующие фактор комплемента I (CFI) и фактор H-подобный белок 1 (FHL1), были кодон-оптимизированы с использованием ряда подходов, обобщенных в Таблице 1.

Таблица 1

Номер RC Трансген Инструмент для кодон-оптимизации Базовый или отредактированный вручную Размер AAV RC128 CFI GeneArt (ThermoFisher) Базовый 3948 п.о. RC129 CFI GeneArt (ThermoFisher) Отредактированный вручную 3948 п.о. RC130 CFI GenScript Базовый 3948 п.о. RC131 CFI GenScript Отредактированный вручную 3948 п.о. RC132 CFI IDT Базовый 3948 п.о. RC133 CFI IDT Отредактированный вручную 3948 п.о. RC134 CFI JCat Базовый 3948 п.о. RC135 CFI JCat Отредактированный вручную 3948 п.о. RC136 CFI COOL Базовый 3948 п.о. RC137 CFI COOL Отредактированный вручную 3948 п.о. RC138 FHL-1 GeneArt (ThermoFisher) Базовый 3546 п.о. RC139 FHL-1 GeneArt (ThermoFisher) Отредактированный вручную 3546 п.о. RC140 FHL-1 GenScript Базовый 3546 п.о. RC141 FHL-1 GenScript Отредактированный вручную 3546 п.о. RC142 FHL-1 IDT Базовый 3546 п.о. RC143 FHL-1 IDT Отредактированный вручную 3546 п.о. RC144 FHL-1 JCat Базовый 3546 п.о. RC145 FHL-1 JCat Отредактированный вручную 3546 п.о. RC146 FHL-1 COOL Базовый 3546 п.о. RC147 FHL-1 COOL Отредактированный вручную 3546 п.о.

Для «базовой» кодон-оптимизации последовательность CFI или FHL-1 вводилась в 5 онлайн-инструментов для кодон-оптимизации:

1. GeneArt (https://www.thermofisher.com/uk/en/home/life-science/cloning/gene- synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html)

2. GenScript (https://www.genscript.com/quick_order/gene_services_gene_synthesis)

3. IDT (https://eu.idtdna.com/CodonOpt)

4. JCat (http://www.jcat.de/)

5. COOL

(http://cool.syncti.org/setup_input_sequence_create_wf1.php?=Start+Using+Codon+ Optimization+On-Line%3E%3E%3E)

Для всех онлайн-инструментов использовался стандартный генетический код человека.

Для онлайн-инструментов 1–4, описанных выше, для каждого онлайн-инструмента была создана одна последовательность.

Для онлайн-инструмента 5 использовались настройки по умолчанию, и в качестве целевого хозяина экспрессии был выбран Homo sapiens. Кроме того, было введено 39 генов, которые высоко экспрессируются в ПЭС (Таблица 2) в инструмент (на основе Таблицы 4 Booij, JC et al. (2010) PLoS One 5: e9341).

Таблица 2

Символ гена Genbank ID HUGO C6orf105 NM_032744 ADTRP BEST1 NM_004183 BEST1 TMEM27 NM_020665 TMEM27 LRP8 NM_004631 LRP8 LGI1 NM_005097 LGI1 FAM40B AB032996 STRIP2 ERMN AB033015 ERMN LRAT NM_004744 LRAT RLBP1 NM_000326 RLBP1 DUSP6 NM_001946 DUSP6 RBP1 NM_002899 RBP1 SLC16A3 NM_004207 SLC16A3 WFDC1 NM_021197 WFDC1 KIAA0953 AF131834 EFR3B CA14 NM_012113 CA14 RGR NM_002921 RGR STRA6 NM_022369 STRA6 RDH5 NM_002905 RDH5 BMP4 NM_001202 BMP4 CXCL14 NM_004887 CXCL14 LHX2 NM_004789 LHX2 C1QTNF5 NM_015645 C1QTNF5 SLC6A20 NM_020208 SLC6A20 SLC16A8 NM_013356 SLC16A8 CDH3 NM_001793 CDH3 FRZB NM_001463 FRZB SERPINF1 NM_002615 SERPINF1 SPOCK1 NM_004598 SPOCK1 LMO1 NM_002315 LMO1 RDH11 NM_016026 RDH11 SFRP5 NM_003015 SFRP5 SGK1 NM_005627 SGK1 KRT18 NM_000224 KRT18 EZR NM_003379 EZR DHCR7 NM 001360 DHCR7 ITGAV NM_002210 ITGAV GALNT11 NM 022087 GALNT11 PCP4 NM 006198 PCP4 BASP1 NM_006317 BASP1

Онлайн-инструмент 5 сгенерировал 70 оптимизированных последовательностей для CFI и 55 для FHL-1, использовалась последовательность с наивысшим ранжированием.

Для «ручной» кодон-оптимизации пять основных кодон-оптимизированных последовательностей CFI и FHL-1, сгенерированные выше, были подвергнуты ручной оптимизации для устранения скрытых сайтов сплайсинга, сайтов связывания микроРНК, удаления тандемных повторяющихся кодонов и проверки содержания GC.

Удаление скрытого сайта сплайсинга

Скрытые сайты сплайсинга были идентифицированы с помощью инструмента www.Fruitfly.org. Для анализа использовали пороговое значение 0,4, но были модифицированы только последовательности с оценкой > 0,75.

Сайты сплайсинга удаляли, по возможности изменяя GT донорного сайта или AG акцепторного сайта. Когда это было невозможно (например, для последовательностей, кодирующих валин), 5'-соседнее основание было изменено.

Затем все модифицированные последовательности были проанализированы с помощью инструмента www.Fruitfly.org, чтобы подтвердить, что все сайты сплайсинга были либо удалены, либо уменьшены до порога ниже 0,75.

Удаление сайта связывания микроРНК

МикроРНК идентифицировали с помощью инструмента www.Genecards.org.

Для CFI были идентифицированы следующие сайты связывания миРНК: hsa-mir-335-5p, hsa-mir-181a-5p, hsa-mir-26b-5p.

Для FHL-1 были идентифицированы следующие сайты связывания миРНК (на основе последовательности фактора комплемента H, CFH): hsa-mir-146a-5p.

Каждая кодон-оптимизированная последовательность (после удаления сайта сплайсинга, если необходимо) затем пропускалась через инструмент STarMir (http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/starmirtest2.pl), чтобы проверить, присутствуют ли еще сайты связывания миРНК. Были изменены любые сайты миРНК, которые были идентифицированы с логистической вероятностью> 0,75.

Удаление тандемных повторяющихся кодонов

Все последовательности вручную проверяли на наличие тандемных повторяющихся кодонов. Там, где они были обнаружены, второй кодон был заменен на следующий наиболее часто используемый кодон в Homo sapiens (с использованием таблицы использования кодонов SnapGene).

Последовательности дикого типа и кодон-оптимизированные последовательности подробно описаны ниже:

GT005: Последовательность CFI дикого типа:

ATGAAGCTTCTTCATGTTTTCCTGTTATTTCTGTGCTTCCACTTAAGGTTTTGCAAGGTCACTTATACATCTCAAGAGGATCTGGTGGAGAAAAAGTGCTTAGCAAAAAAATATACTCACCTCTCCTGCGATAAAGTCTTCTGCCAGCCATGGCAGAGATGCATTGAGGGCACCTGTGTTTGTAAACTACCGTATCAGTGCCCAAAGAATGGCACTGCAGTGTGTGCAACTAACAGGAGAAGCTTCCCAACATACTGTCAACAAAAGAGTTTGGAATGTCTTCATCCAGGGACAAAGTTTTTAAATAACGGAACATGCACAGCCGAAGGAAAGTTTAGTGTTTCCTTGAAGCATGGAAATACAGATTCAGAGGGAATAGTTGAAGTAAAACTTGTGGACCAAGATAAGACAATGTTCATATGCAAAAGCAGCTGGAGCATGAGGGAAGCCAACGTGGCCTGCCTTGACCTTGGGTTTCAACAAGGTGCTGATACTCAAAGAAGGTTTAAGTTGTCTGATCTCTCTATAAATTCCACTGAATGTCTACATGTGCATTGCCGAGGATTAGAGACCAGTTTGGCTGAATGTACTTTTACTAAGAGAAGAACTATGGGTTACCAGGATTTCGCTGATGTGGTTTGTTATACACAGAAAGCAGATTCTCCAATGGATGACTTCTTTCAGTGTGTGAATGGGAAATACATTTCTCAGATGAAAGCCTGTGATGGTATCAATGATTGTGGAGACCAAAGTGATGAACTGTGTTGTAAAGCATGCCAAGGCAAAGGCTTCCATTGCAAATCGGGTGTTTGCATTCCAAGCCAGTATCAATGCAATGGTGAGGTGGACTGCATTACAGGGGAAGATGAAGTTGGCTGTGCAGGCTTTGCATCTGTGGCTCAAGAAGAAACAGAAATTTTGACTGCTGACATGGATGCAGAAAGAAGACGGATAAAATCATTATTACCTAAACTATCTTGTGGAGTTAAAAACAGAATGCACATTCGAAGGAAACGAATTGTGGGAGGAAAGCGAGCACAACTGGGAGACCTCCCATGGCAGGTGGCAATTAAGGATGCCAGTGGAATCACCTGTGGGGGAATTTATATTGGTGGCTGTTGGATTCTGACTGCTGCACATTGTCTCAGAGCCAGTAAAACTCATCGTTACCAAATATGGACAACAGTAGTAGACTGGATACACCCCGACCTTAAACGTATAGTAATTGAATACGTGGATAGAATTATTTTCCATGAAAACTACAATGCAGGCACTTACCAAAATGACATCGCTTTGATTGAAATGAAAAAAGACGGAAACAAAAAAGATTGTGAGCTGCCTCGTTCCATCCCTGCCTGTGTCCCCTGGTCTCCTTACCTATTCCAACCTAATGATACATGCATCGTTTCTGGCTGGGGACGAGAAAAAGATAACGAAAGAGTCTTTTCACTTCAGTGGGGTGAAGTTAAACTAATAAGCAACTGCTCTAAGTTTTACGGAAATCGTTTCTATGAAAAAGAAATGGAATGTGCAGGTACATATGATGGTTCCATCGATGCCTGTAAAGGGGACTCTGGAGGCCCCTTAGTCTGTATGGATGCCAACAATGTGACTTATGTCTGGGGTGTTGTGAGTTGGGGGGAAAACTGTGGAAAACCAGAGTTCCCAGGTGTTTACACCAAAGTGGCCAATTATTTTGACTGGATTAGCTACCATGTAGGAAGGCCTTTTATTTCTCAGTACAATGTATAA

(SEQ ID NO: 16)

RC001: Последовательность FHL-1 дикого типа:

ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATATAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCaAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGA

(SEQ ID NO: 17)

RC128: CFI GeneArt- Базовый:

ATGAAGCTGCTGCATGTGTTTCTGCTGTTCCTCTGCTTCCACCTGAGGTTCTGCAAAGTGACCTACACCAGCCAAGAGGACCTGGTGGAAAAGAAGTGCCTGGCCAAGAAGTACACCCACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGCCAGCCTTGGCAGAGATGCATCGAGGGCACCTGTGTGTGCAAGCTGCCCTATCAGTGCCCCAAGAATGGCACAGCCGTGTGCGCCACCAACAGAAGAAGCTTCCCTACCTACTGCCAGCAGAAAAGCCTGGAATGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTTCTGAACAACGGCACCTGTACCGCCGAGGGCAAGTTTAGCGTGTCCCTGAAGCACGGCAACACCGACTCTGAGGGCATCGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAGAGCAGCTGGTCCATGCGCGAGGCCAATGTGGCTTGTCTGGATCTGGGATTCCAGCAGGGCGCCGACACACAGAGAAGATTCAAGCTGAGCGACCTGAGCATCAACAGCACCGAGTGCCTGCATGTGCACTGTAGAGGCCTGGAAACAAGCCTGGCCGAGTGCACCTTCACCAAGAGAAGGACCATGGGCTACCAGGACTTCGCCGACGTCGTGTGCTACACCCAGAAAGCCGACTCTCCCATGGACGATTTCTTCCAGTGCGTGAACGGCAAGTACATCAGCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAACGATTGCGGCGATCAGAGCGACGAGCTGTGCTGCAAAGCCTGTCAAGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGTCCGGCGTGTGTATCCCTAGCCAGTACCAGTGCAATGGCGAGGTGGACTGTATCACCGGCGAGGATGAAGTGGGCTGTGCCGGATTTGCCAGCGTGGCCCAAGAGGAAACCGAGATCCTGACCGCCGATATGGACGCCGAGCGGCGGAGAATCAAAAGCCTGCTGCCTAAGCTGTCCTGCGGCGTGAAGAACCGGATGCACATCCGGCGCAAGAGAATCGTCGGAGGCAAAAGAGCACAGCTGGGCGATCTGCCTTGGCAAGTGGCCATCAAGGATGCCAGCGGCATCACATGTGGCGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATTCTGACAGCCGCTCATTGTCTGCGGGCCAGCAAGACCCACCGGTATCAGATCTGGACCACCGTGGTGGACTGGATTCACCCCGACCTGAAGCGGATCGTGATCGAGTACGTGGACCGGATCATCTTCCACGAGAACTACAACGCCGGCACCTACCAGAACGATATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGACGGGAACAAGAAGGACTGCGAGCTGCCTAGATCTATCCCCGCCTGTGTTCCTTGGAGCCCCTACCTGTTCCAGCCTAACGATACCTGCATCGTGTCCGGCTGGGGCAGAGAGAAGGATAACGAGAGGGTGTTCAGCCTGCAGTGGGGCGAAGTGAAACTGATCAGCAACTGCAGCAAGTTCTACGGCAACCGGTTCTACGAGAAAGAAATGGAATGCGCCGGCACATACGACGGCTCCATCGATGCCTGTAAAGGCGATTCTGGCGGCCCTCTCGTGTGCATGGATGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGCGTCGTGTCCTGGGGAGAGAATTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCCGGCGTGTACACCAAGGTGGCCAACTACTTCGACTGGATCAGCTACCACGTGGGCAGACCCTTTATCAGCCAGTACAACGTGTGA

(SEQ ID NO: 18)

RC129: CFI GeneArt-Оптимизированый вручную:

ATGAAGCTGCTCCATGTGTTTCTGCTCTTCCTCTGCTTCCACCTGAGGTTCTGCAAAGTGACCTACACCAGCCAAGAGGACCTGGTGGAAAAGAAATGCCTGGCCAAGAAATACACCCACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGCCAGCCTTGGCAGAGATGCATCGAGGGCACCTGTGTGTGCAAGCTGCCCTATCAGTGCCCCAAGAATGGCACAGCCGTGTGCGCTACAAACAGAAGGAGCTTCCCTACCTACTGCCAGCAAAAAAGCCTGGAGTGCCTGCACCCCGGCACCAAGTTTCTGAACAATGGCACCTGTACCGCCGAGGGCAAGTTTAGCGTGTCCCTGAAGCACGGCAACACCGACTCTGAGGGCATCGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAGAGCTCCTGGTCCATGCGCGAGGCCAATGTGGCTTGTCTGGATCTGGGATTCCAGCAAGGCGCCGACACACAGAGAAGGTTCAAGCTGAGCGACCTGAGCATCAACAGCACCGAGTGCCTGCATGTGCACTGTAGAGGCCTGGAAACAAGCCTGGCCGAGTGCACCTTCACCAAGAGAAGGACCATGGGCTACCAGGACTTCGCCGACGTCGTGTGCTACACCCAGAAAGCCGACTCTCCCATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTACATCAGCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAACGATTGCGGCGATCAGAGCGACGAGCTGTGCTGTAAAGCCTGTCAAGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGTCCGGCGTGTGTATCCCTAGCCAGTACCAGTGCAATGGCGAGGTGGACTGTATCACCGGCGAGGATGAAGTGGGCTGTGCCGGATTTGCCAGCGTGGCCCAAGAGGAAACCGAGATCCTGACCGCCGATATGGACGCCGAGCGGAGGAGAATCAAAAGCCTGCTCCCTAAGCTGTCCTGCGGCGTGAAGAACCGGATGCACATCCGGCGCAAGAGAATCGTCGGAGGCAAAAGAGCACAGCTGGGCGATCTGCCTTGGCAAGTGGCCATCAAGGATGCCAGCGGCATCACATGTGGCGGGATCTACATCGGCGGATGCTGGATTCTGACAGCCGCTCATTGTCTGCGGGCCAGCAAGACCCACCGGTATCAGATCTGGACCACAGTGGTCGACTGGATTCACCCCGACCTGAAGCGGATCGTGATCGAGTACGTGGACCGGATCATTTTCCACGAGAACTACAACGCCGGCACCTACCAGAACGATATCGCCCTGATCGAGATGAAAAAGGACGGGAACAAGAAAGACTGCGAGCTGCCTAGATCTATCCCCGCCTGTGTTCCTTGGAGCCCCTACCTGTTCCAGCCTAACGATACCTGCATCGTGTCCGGCTGGGGCAGAGAGAAGGATAACGAGAGGGTGTTCAGCCTGCAGTGGGGCGAAGTGAAACTGATCAGCAACTGCAGCAAGTTCTACGGCAACCGGTTCTACGAGAAAGAAATGGAATGCGCCGGCACATACGACGGCTCCATCGATGCCTGTAAAGGCGATTCTGGCGGACCTCTCGTGTGCATGGATGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGCGTCGTGTCCTGGGGAGAGAATTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCCGGCGTGTACACCAAGGTGGCCAACTACTTCGACTGGATCAGCTACCACGTGGGCAGACCC TTTATCAGCCAGTACAACGTGTGA

(SEQ ID NO: 19)

RC130: CFI Genscript-Базовый:

ATGAAGCTGCTGCATGTCTTTCTGCTGTTTCTGTGCTTCCATCTGAGGTTCTGCAAGGTCACTTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTCGAGAAGAAGTGTCTGGCCAAGAAGTACACACACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGTCAGCCTTGGCAGCGGTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCTTACCAGTGCCCAAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACAAATCGGAGATCTTTTCCAACATATTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAGTGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACAGCCGAGGGCAAGTTTTCTGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACAGATAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGATAAGACCATGTTCATCTGTAAGAGCAGCTGGTCCATGAGGGAGGCAAACGTGGCATGCCTGGATCTGGGATTCCAGCAGGGAGCAGACACACAGAGGCGCTTTAAGCTGTCCGACCTGTCTATCAATAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGTAGGGGCCTGGAGACATCCCTGGCAGAGTGCACCTTCACAAAGCGGAGAACAATGGGCTACCAGGACTTTGCCGACGTGGTGTGCTATACCCAGAAGGCCGATAGCCCTATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTATATCTCCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAATGACTGTGGCGATCAGTCTGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGTCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCTTCCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGATTGTATCACAGGAGAGGACGAAGTGGGATGCGCAGGATTTGCATCTGTGGCACAGGAGGAGACAGAGATCCTGACAGCCGACATGGATGCCGAGAGGCGCCGGATCAAGTCTCTGCTGCCTAAGCTGAGCTGTGGCGTGAAGAATCGGATGCACATCAGAAGGAAGCGCATCGTGGGAGGCAAGCGGGCCCAGCTGGGCGATCTGCCCTGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCTCTGGCATCACCTGCGGCGGCATCTACATCGGCGGCTGTTGGATTCTGACCGCAGCACACTGCCTGAGAGCAAGCAAGACACACAGGTATCAGATCTGGACCACAGTGGTGGATTGGATTCACCCAGACCTGAAGAGAATCGTGATCGAGTACGTGGATAGGATCATCTTCCACGAGAACTACAATGCCGGCACATATCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGATGGCAATAAGAAGGACTGTGAGCTGCCCAGATCCATCCCTGCATGCGTGCCCTGGAGCCCCTATCTGTTCCAGCCCAACGATACCTGCATCGTGTCCGGATGGGGAAGGGAGAAGGACAATGAGCGGGTGTTTTCTCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCTCCAACTGTTCTAAGTTCTACGGCAATAGGTTTTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGATGGCAGCATCGACGCCTGTAAGGGCGATTCCGGAGGACCACTGGTGTGCATGGACGCAAACAATGTGACATACGTGTGGGGAGTGGTGTCCTGGGGAGAGAACTGCGGCAAGCCAGAGTTTCCCGGCGTGTATACCAAGGTGGCCAATTATTTTGATTGGATTTCATACCATGTCGGGAGACCATTCATTAGTCAGTACAACGTGTGA

(SEQ ID NO: 20)

RC131: CFI Genscript-Оптимизированный вручную:

ATGAAGCTGCTCCATGTCTTTCTGCTCTTTCTGTGCTTCCATCTGAGGTTCTGCAAGGTCACTTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTCGAGAAGAAATGTCTGGCCAAGAAATACACACACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGTCAGCCTTGGCAGCGGTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCTTACCAGTGCCCAAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACAAATCGGAGATCTTTTCCAACATATTGCCAGCAAAAGAGCCTGGAGTGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACAGCCGAGGGCAAGTTTTCTGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACAGATAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGATAAGACCATGTTCATCTGTAAGAGCTCCTGGTCCATGAGGGAGGCAAACGTGGCATGCCTGGATCTGGGATTCCAGCAAGGAGCAGACACACAGAGGCGCTTTAAGCTGTCCGATCTGAGTATCAATAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGTAGGGGCCTGGAGACATCCCTGGCAGAGTGCACCTTCACAAAGCGGAGAACAATGGGCTACCAGGACTTTGCCGACGTGGTCTGCTATACCCAGAAGGCCGATAGCCCTATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTATATCTCCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAATGACTGTGGCGATCAGTCTGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGTCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCTTCCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGATTGTATCACAGGAGAGGACGAAGTGGGATGCGCAGGATTTGCATCTGTGGCACAGGAGGAAACAGAGATCCTGACAGCCGACATGGATGCCGAGAGGCGCCGGATCAAGTCTCTGCTCCCTAAGCTGAGCTGTGGCGTGAAGAATCGGATGCACATCAGAAGGAAGCGCATCGTGGGAGGCAAGCGGGCCCAGCTGGGCGATCTGCCCTGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCTCTGGCATCACCTGCGGCGGGATCTACATCGGCGGATGTTGGATTCTGACCGCAGCCCACTGCCTGAGAGCAAGCAAGACACACAGATATCAGATCTGGACCACAGTGGTCGATTGGATTCACCCAGACCTGAAGAGAATCGTGATCGAGTACGTGGATAGGATCATTTTCCACGAGAATTACAATGCTGGCACATATCAGAATGATATCGCTCTCATCGAGATGAAGAAAGATGGCAATAAGAAAGACTGTGAGCTGCCCAGATCCATCCCTGCATGCGTGCCCTGGAGCCCCTATCTGTTCCAGCCCAACGATACCTGCATCGTGTCCGGATGGGGAAGGGAGAAGGACAATGAGCGGGTGTTTTCTCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCTCCAACTGTTCTAAGTTCTACGGCAATAGGTTTTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGATGGCAGCATCGACGCCTGTAAGGGCGATTCCGGAGGCCCACTGGTGTGCATGGACGCAAACAATGTGACATACGTGTGGGGAGTGGTCTCCTGGGGAGAGAACTGCGGCAAGCCAGAGTTTCCCGGCGTGTATACCAAGGTGGCCAATTATTTTGATTGGATTTCATACCATGTCGGGAGACCATTCATTAGTCAATACAACGTTTGA

(SEQ ID NO: 21)

RC132: CFI IDT-Базовый:

ATGAAGCTCCTCCACGTCTTCTTGTTGTTTCTCTGTTTCCACCTGAGATTTTGCAAAGTAACTTACACCAGTCAAGAAGACTTGGTCGAGAAGAAGTGTCTCGCCAAAAAGTATACTCACCTGAGCTGTGATAAAGTGTTCTGTCAGCCGTGGCAGCGCTGCATTGAGGGTACATGTGTCTGTAAACTGCCTTATCAGTGTCCGAAGAACGGTACGGCTGTCTGTGCTACTAACAGACGGTCTTTTCCTACTTATTGCCAGCAGAAGAGTTTGGAATGTCTCCACCCTGGTACCAAGTTTCTCAACAATGGCACCTGTACTGCTGAAGGTAAATTCTCCGTCAGTCTCAAGCATGGTAACACTGACAGTGAAGGGATAGTAGAGGTAAAGTTGGTTGACCAGGACAAGACGATGTTCATATGCAAGTCAAGCTGGTCCATGCGCGAGGCGAATGTCGCTTGTCTTGATTTGGGCTTCCAGCAAGGGGCAGACACACAGAGAAGATTCAAATTGAGCGACCTGAGTATAAATTCAACCGAGTGCCTCCATGTACATTGCAGAGGGCTCGAGACTTCACTTGCCGAATGTACATTTACGAAGAGGCGGACTATGGGATATCAGGACTTTGCCGACGTAGTATGTTATACTCAGAAAGCAGACAGTCCTATGGATGACTTTTTCCAATGCGTCAACGGCAAATACATCAGTCAAATGAAAGCGTGCGACGGTATCAACGATTGTGGTGACCAGTCTGATGAGCTTTGCTGTAAAGCATGTCAAGGAAAGGGGTTCCATTGCAAGAGTGGTGTATGTATTCCCTCACAATATCAGTGCAATGGGGAAGTCGATTGCATAACAGGTGAGGATGAGGTGGGCTGCGCGGGATTTGCTTCTGTGGCGCAAGAGGAGACTGAGATCCTTACAGCGGATATGGACGCCGAACGAAGACGCATCAAATCTCTCCTTCCCAAACTTTCATGCGGCGTCAAAAACCGAATGCATATACGCAGGAAGAGAATTGTTGGGGGAAAGCGGGCACAGCTGGGCGACCTCCCCTGGCAAGTTGCAATAAAGGATGCAAGTGGGATAACGTGCGGGGGCATCTACATCGGGGGGTGCTGGATCTTGACTGCCGCCCACTGTCTTAGAGCCTCTAAGACCCATAGGTACCAAATCTGGACAACTGTAGTTGACTGGATACATCCGGACCTTAAACGCATAGTTATTGAATACGTTGACCGCATAATATTTCATGAGAATTATAACGCGGGTACCTATCAGAATGACATCGCCCTCATCGAGATGAAAAAAGACGGGAATAAAAAGGACTGCGAGCTGCCGCGCTCTATACCTGCGTGTGTCCCCTGGAGTCCTTATCTTTTCCAACCTAACGATACGTGTATAGTGAGCGGCTGGGGCCGGGAGAAGGACAATGAACGAGTTTTTTCCTTGCAATGGGGAGAAGTGAAGCTTATTTCCAATTGTTCAAAGTTTTATGGAAATAGATTTTATGAAAAAGAAATGGAGTGTGCGGGCACTTATGACGGGTCAATTGATGCTTGCAAAGGTGATAGCGGGGGCCCACTTGTCTGCATGGACGCTAACAACGTGACTTATGTGTGGGGTGTTGTGTCCTGGGGCGAAAACTGTGGCAAGCCCGAGTTTCCCGGCGTATACACCAAAGTAGCTAATTATTTCGACTGGATTAGTTATCATGTTGGGCGGCCATTTATATCCCAGTATAATGTCTAA

(SEQ ID NO: 22)

RC133: CFI IDT-Оптимизированный вручную:

ATGAAGCTCCTGCACGTCTTCTTGCTGTTTCTCTGTTTCCACCTGAGATTTTGCAAAGTAACTTACACCAGTCAAGAAGACTTGGTCGAGAAGAAATGTCTCGCCAAAAAGTATACTCACCTGAGCTGTGATAAAGTGTTCTGTCAGCCGTGGCAGCGCTGCATTGAGGGTACATGTGTCTGTAAACTGCCTTATCAGTGTCCGAAGAACGGCACGGCTGTCTGTGCTACTAACAGACGGTCTTTTCCTACTTATTGCCAGCAAAAGAGTTTGGAATGTCTCCACCCTGGTACCAAGTTTCTCAACAATGGCACCTGTACTGCTGAAGGCAAATTCTCCGTCAGTCTCAAGCATGGTAACACTGATTCTGAAGGGATAGTAGAAGTAAAGTTGGTTGACCAGGACAAGACGATGTTCATATGCAAGTCAAGCTGGTCCATGCGCGAGGCGAATGTCGCTTGTCTTGATTTGGGCTTCCAGCAAGGGGCAGACACACAGAGAAGATTCAAATTGAGCGACCTGAGTATAAATTCAACCGAGTGCCTCCATGTACATTGCAGAGGGCTCGAGACTTCTCTTGCTGAGTGTACATTTACGAAGAGGCGGACTATGGGATATCAGGACTTTGCTGACGTAGTGTGTTATACTCAGAAAGCAGACAGTCCTATGGATGACTTTTTCCAATGCGTCAACGGCAAATACATCAGTCAAATGAAAGCGTGCGACGGTATCAACGATTGTGGTGACCAGTCTGATGAGCTTTGCTGTAAAGCATGTCAAGGAAAGGGGTTCCATTGCAAGAGTGGTGTATGTATTCCCTCACAATATCAGTGCAATGGGGAAGTCGATTGCATAACAGGCGAGGATGAGGTGGGCTGCGCGGGATTTGCTTCTGTGGCGCAAGAGGAAACTGAGATCCTTACAGCGGATATGGACGCCGAACGAAGACGCATCAAATCTCTCCTTCCCAAACTTTCATGCGGCGTCAAAAACCGAATGCATATACGCAGGAAGAGAATTGTTGGGGGAAAGCGGGCACAGCTGGGCGACCTCCCCTGGCAAGTTGCAATAAAGGATGCAAGTGGGATAACGTGCGGGGGCATCTACATCGGGGGCTGCTGGATCTTGACTGCCGCTCACTGTCTTAGAGCCTCTAAGACCCATAGATACCAAATCTGGACAACTGTAGTTGACTGGATACATCCGGACCTTAAACGCATAGTTATTGAATACGTTGACCGCATAATCTTTCATGAGAATTATAACGCGGGCACATACCAAAATGACATCGCCCTGATCGAGATGAAAAAGGACGGGAATAAAAAGGACTGCGAGCTGCCGCGCTCTATACCTGCGTGTGTCCCCTGGAGTCCTTATCTTTTCCAACCTAACGATACGTGTATAGTGAGCGGCTGGGGCCGGGAGAAGGACAATGAACGAGTTTTTTCCTTGCAATGGGGAGAAGTGAAGCTTATTTCCAATTGTTCAAAGTTTTATGGAAATAGATTTTATGAAAAAGAAATGGAGTGTGCGGGCACTTATGACGGGTCAATTGATGCTTGCAAAGGTGATAGCGGGGGCCCACTTGTCTGCATGGACGCTAACAATGTGACTTATGTGTGGGGTGTTGTGTCCTGGGGCGAAAACTGTGGCAAGCCCGAGTTTCCCGGCGTATACACCAAAGTAGCTAATTATTTCGACTGGATTAGTTATCATGTTGGGCGGCCA TTTATATCCCAGTATAATGTCTAA

(SEQ ID NO: 23)

RC134: CFI JCat-Базовый:

ATGAAGCTGCTGCACGTGTTCCTGCTGTTCCTGTGCTTCCACCTGCGCTTCTGCAAGGTGACCTACACCAGCCAGGAGGACCTGGTGGAGAAGAAGTGCCTGGCCAAGAAGTACACCCACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAGCGCTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACCAACCGCCGCAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAGTGCCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAACGGCACCTGCACCGCCGAGGGCAAGTTCAGCGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACCGACAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAGAGCAGCTGGAGCATGCGCGAGGCCAACGTGGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAGGGCGCCGACACCCAGCGCCGCTTCAAGCTGAGCGACCTGAGCATCAACAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGCCGCGGCCTGGAGACCAGCCTGGCCGAGTGCACCTTCACCAAGCGCCGCACCATGGGCTACCAGGACTTCGCCGACGTGGTGTGCTACACCCAGAAGGCCGACAGCCCCATGGACGACTTCTTCCAGTGCGTGAACGGCAAGTACATCAGCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAACGACTGCGGCGACCAGAGCGACGAGCTGTGCTGCAAGGCCTGCCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCCAGCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGACTGCATCACCGGCGAGGACGAGGTGGGCTGCGCCGGCTTCGCCAGCGTGGCCCAGGAGGAGACCGAGATCCTGACCGCCGACATGGACGCCGAGCGCCGCCGCATCAAGAGCCTGCTGCCCAAGCTGAGCTGCGGCGTGAAGAACCGCATGCACATCCGCCGCAAGCGCATCGTGGGCGGCAAGCGCGCCCAGCTGGGCGACCTGCCCTGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCAGCGGCATCACCTGCGGCGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATCCTGACCGCCGCCCACTGCCTGCGCGCCAGCAAGACCCACCGCTACCAGATCTGGACCACCGTGGTGGACTGGATCCACCCCGACCTGAAGCGCATCGTGATCGAGTACGTGGACCGCATCATCTTCCACGAGAACTACAACGCCGGCACCTACCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGACGGCAACAAGAAGGACTGCGAGCTGCCCCGCAGCATCCCCGCCTGCGTGCCCTGGAGCCCCTACCTGTTCCAGCCCAACGACACCTGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAGGACAACGAGCGCGTGTTCAGCCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCAGCAACTGCAGCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTACGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGACGGCAGCATCGACGCCTGCAAGGGCGACAGCGGCGGCCCCCTGGTGTGCATGGACGCCAACAACGTGACCTACGTGTGGGGCGTGGTGAGCTGGGGCGAGAACTGCGGCAAGCCCGAGTTCCCCGGCGTGTACACCAAGGTGGCCAACTACTTCGACTGGATCAGCTACCACGTGGGCCGCCCCTTCATCAGCCAGTACAACGTGTAA

(SEQ ID NO: 24)

RC135: CFI JCat-Оптимизированный вручную:

ATGAAGCTGCTCCACGTGTTCCTGCTCTTCCTGTGCTTCCACCTGCGCTTCTGCAAGGTGACCTACACCAGCCAGGAGGACCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAATACACCCACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAGCGCTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACCAACCGCCGGAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAAAAGAGCCTGGAGTGCCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACCGCCGAGGGCAAGTTCAGCGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACCGACAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAGAGCTCCTGGAGCATGCGCGAGGCCAACGTGGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAAGGCGCCGACACCCAGCGCCGGTTCAAGCTGAGCGACCTGAGCATCAACAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGCCGCGGCCTGGAGACCAGCCTGGCCGAGTGCACCTTCACCAAGCGCCGGACCATGGGCTACCAGGACTTCGCCGACGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCTGACTCTCCCATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTACATCAGCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAACGACTGCGGCGACCAGAGCGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGCCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCCAGCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGACTGCATCACCGGCGAGGACGAGGTGGGCTGCGCCGGCTTCGCCAGCGTGGCCCAGGAGGAAACCGAGATCCTGACCGCCGACATGGACGCCGAGCGCAGAAGGATCAAGAGCCTGCTCCCCAAGCTGAGCTGCGGCGTGAAGAACCGCATGCACATCCGCAGAAAGCGCATCGTGGGCGGGAAGCGCGCCCAGCTGGGCGACCTGCCCTGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCAGCGGCATCACCTGCGGCGGAATCTACATCGGCGGGTGCTGGATCCTGACCGCCGCTCACTGCCTGCGCGCCAGCAAGACCCACCGCTACCAGATCTGGACCACAGTGGTCGACTGGATCCACCCCGACCTGAAGCGCATCGTGATCGAGTACGTGGACCGCATCATTTTCCACGAGAACTACAACGCCGGCACCTACCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAAGATGGAAACAAGAAAGACTGCGAGCTGCCCCGCAGCATCCCCGCCTGCGTGCCCTGGAGCCCCTACCTGTTCCAGCCCAACGACACCTGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAGGACAACGAGCGCGTGTTCAGCCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCAGCAACTGCAGCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTACGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGACGGCAGCATCGACGCCTGCAAGGGCGACAGCGGCGGGCCCCTGGTGTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGCGTGGTCAGCTGGGGCGAGAACTGCGGCAAGCCCGAGTTCCCCGGCGTGTACACCAAGGTGGCCAACTACTTCGACTGGATCAGCTACCACGTGGGCCGCCCCTTTATCTCTCAATACAACGTCTAA

(SEQ ID NO: 25)

RC136: CFI COOL-Базовый: см. 10 выше.

RC137: CFI COOL-Оптимизированный вручную:

ATGAAACTGCTCCATGTCTTCCTCCTGTTCCTGTGCTTCCACCTCCGTTTCTGTAAAGTCACCTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAATATACCCACCTGAGCTGCGACAAAGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAACGCTGCATTGAAGGCACTTGTGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACGGCCGTGTGTGCCACCAACAGGAGAAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAAAAGAGCCTGGAATGCCTCCACCCTGGCACCAAGTTTCTGAACAATGGGACCTGCACAGCCGAGGGGAAATTCAGCGTCTCCCTCAAGCACGGCAATACAGACTCCGAGGGCATTGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAAAGCTCCTGGTCCATGCGGGAGGCCAATGTCGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAAGGCGCTGATACACAGCGCAGATTTAAACTCAGTGACCTCAGCATCAACAGCACTGAGTGTCTGCACGTGCACTGCCGGGGCCTGGAGACCAGCCTGGCTGAGTGCACCTTCACCAAGCGCAGGACCATGGGCTACCAGGATTTTGCAGATGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCAGACAGCCCCATGGATGACTTCTTTCAGTGTGTCAATGGCAAGTACATTTCCCAGATGAAGGCTTGTGACGGGATCAATGATTGCGGGGATCAGAGCGATGAGCTCTGCTGTAAGGCCTGCCAAGGGAAGGGCTTTCACTGCAAGTCTGGGGTGTGCATCCCTTCTCAGTATCAGTGCAACGGAGAGGTGGACTGCATCACTGGGGAGGACGAGGTGGGCTGTGCTGGCTTCGCCTCTGTGGCCCAGGAGGAAACAGAGATCCTCACAGCTGACATGGATGCAGAGCGGAGGCGCATCAAGAGTCTGCTCCCAAAGCTCTCCTGCGGCGTTAAGAATCGCATGCACATCCGGAGGAAGCGGATCGTTGGAGGCAAACGGGCTCAGCTGGGGGACTTGCCGTGGCAGGTGGCCATCAAAGATGCCTCCGGAATCACCTGTGGTGGCATCTACATCGGCGGGTGCTGGATCCTGACCGCCGCTCACTGCCTTCGGGCCAGCAAGACCCATCGCTACCAGATCTGGACCACAGTGGTCGATTGGATTCACCCCGACCTGAAGAGGATTGTCATTGAGTATGTCGACCGCATCATTTTCCATGAAAACTACAATGCCGGGACGTATCAGAACGACATCGCCCTCATCGAGATGAAGAAAGATGGGAACAAGAAAGACTGTGAGCTGCCTCGCTCCATCCCCGCCTGTGTACCATGGTCTCCGTACCTGTTCCAGCCAAATGACACATGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAAGACAACGAGAGGGTCTTCTCCCTGCAGTGGGGTGAAGTCAAGCTGATCAGCAACTGCTCCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTATGACGGCAGCATTGACGCGTGCAAGGGAGACAGTGGGGGCCCCCTGGTCTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGAGTTGTGTCCTGGGGCGAGAACTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCGGGCGTGTACACAAAGGTGGCAAACTATTTTGACTGGATCTCCTATCACGTTGGCAGGCCCTTCATTAGCCAGTATAATGTATAA

(SEQ ID NO: 26)

RC138: FHL-1 GeneArt- Базовый:

ATGAGACTGCTGGCCAAGATCATCTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGATTGCAATGAGCTGCCTCCTCGGAGAAACACCGAGATCCTGACAGGCTCTTGGAGCGACCAGACATACCCTGAGGGAACCCAGGCCATCTACAAGTGCAGACCCGGCTACAGAAGCCTGGGCAACATCATCATGGTCTGCCGGAAAGGCGAGTGGGTCGCCCTGAATCCTCTGCGGAAGTGCCAGAAAAGACCCTGCGGACACCCTGGCGATACCCCTTTCGGAACCTTTACACTGACCGGCGGCAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAAGCCGTGTACACCTGTAACGAGGGCTACCAGCTGCTGGGCGAGATCAACTACAGAGAGTGCGATACCGACGGCTGGACCAACGACATCCCTATCTGCGAGGTGGTCAAGTGCCTGCCTGTGACAGCCCCTGAGAACGGCAAGATTGTGTCCAGCGCCATGGAACCCGACAGAGAGTACCACTTTGGCCAGGCCGTCAGATTCGTGTGCAACAGCGGCTACAAGATCGAGGGCGACGAGGAAATGCACTGCAGCGACGATGGCTTCTGGTCCAAAGAAAAGCCTAAGTGCGTGGAAATCAGCTGCAAGAGCCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCTATCAGCCAGAAGATTATCTACAAAGAGAACGAGCGGTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTACGAGTACAGCGAGAGGGGCGACGCCGTGTGTACAGAATCTGGATGGCGACCTCTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGCTGCGACAACCCTTACATCCCCAACGGCGACTACAGCCCACTGCGGATCAAACACAGAACCGGCGACGAGATCACCTACCAGTGCCGGAATGGCTTCTACCCTGCCACCAGAGGCAATACCGCCAAGTGTACAAGCACCGGCTGGATCCCTGCTCCTCGGTGTACACTGAAGCCCTGCGACTACCCCGATATCAAGCACGGCGGACTGTACCACGAGAACATGCGGAGGCCTTACTTCCCTGTGGCCGTGGGCAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACACCCAGCGGCAGCTACTGGGATCACATCCACTGTACCCAGGACGGCTGGTCACCAGCTGTGCCTTGCCTGAGAAAGTGCTACTTCCCCTACCTGGAAAACGGCTACAACCAGAACTACGGCCGGAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCATCCTGGATACGCCCTGCCTAAGGCTCAGACCACCGTGACCTGCATGGAAAATGGCTGGTCCCCAACACCTCGGTGCATCCGGGTGTCCTTCACACTGTAA

(SEQ ID NO: 27)

RC139: FHL-1 GeneArt-Оптимизированный вручную:

ATGAGACTGCTCGCCAAGATCATTTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGATTGCAATGAGCTGCCTCCCCGGAGAAACACCGAGATCCTGACAGGCTCTTGGAGCGACCAGACATACCCTGAGGGAACCCAGGCCATCTACAAGTGCAGACCCGGCTACAGAAGCCTGGGCAACATCATTATGGTCTGCCGGAAAGGCGAGTGGGTCGCCCTGAATCCTCTGCGGAAGTGCCAGAAAAGACCCTGCGGACACCCTGGCGATACCCCTTTCGGAACCTTTACACTGACCGGCGGGAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAAGCCGTGTACACCTGTAACGAGGGCTACCAGCTGCTCGGCGAGATCAACTACAGAGAGTGCGATACCGACGGCTGGACCAACGACATCCCTATCTGCGAGGTGGTCAAGTGCCTGCCTGTGACAGCCCCTGAGAACGGCAAGATTGTGTCCAGCGCCATGGAACCCGACAGAGAGTACCACTTTGGCCAGGCCGTCAGATTCGTGTGCAACAGCGGCTACAAGATCGAGGGCGACGAGGAAATGCACTGCAGCGACGATGGCTTCTGGTCCAAAGAAAAGCCTAAGTGCGTGGAAATCAGCTGCAAGAGCCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCTATCAGCCAGAAGATTATCTACAAAGAGAACGAGCGGTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTACGAGTACAGCGAGAGGGGCGACGCCGTGTGTACAGAATCTGGATGGCGACCTCTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGCTGCGACAACCCTTACATCCCCAACGGCGACTACAGCCCACTGCGGATCAAACACAGAACCGGCGACGAGATCACCTACCAGTGCCGGAATGGCTTCTACCCTGCCACCAGAGGCAATACCGCCAAGTGTACAAGCACCGGCTGGATCCCTGCTCCTCGGTGTACACTGAAGCCCTGCGACTACCCCGATATCAAGCACGGCGGACTGTACCACGAGAACATGCGGAGGCCTTACTTCCCTGTGGCCGTGGGCAAGTACTATAGCTACTATTGCGACGAGCACTTCGAGACACCCAGCGGCAGCTACTGGGATCACATCCACTGTACCCAGGACGGCTGGTCACCAGCTGTGCCTTGCCTGAGAAAGTGCTACTTCCCCTACCTGGAAAACGGCTACAACCAGAACTACGGCCGGAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCATCCTGGATACGCCCTGCCTAAGGCTCAGACCACAGTGACCTGCATGGAAAATGGCTGGTCCCCAACACCTCGGTGCATCCGGGTGTCCTTCACACTGTAA

(SEQ ID NO: 28)

RC140: FHL-1 Genscript-Базовый:

ATGCGGCTGCTGGCCAAGATCATCTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGACTGTAACGAGCTGCCCCCTCGGAGAAATACAGAGATCCTGACCGGCTCTTGGAGCGATCAGACATATCCTGAGGGCACCCAGGCCATCTACAAGTGCAGGCCAGGCTATCGCTCCCTGGGCAACATCATCATGGTGTGCAGGAAGGGAGAGTGGGTGGCCCTGAATCCTCTGAGGAAGTGCCAGAAGAGGCCATGTGGACACCCAGGCGACACCCCTTTCGGCACCTTTACACTGACCGGCGGCAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAGGCCGTGTATACATGCAACGAGGGCTACCAGCTGCTGGGCGAGATCAATTACAGAGAGTGTGACACAGATGGCTGGACCAACGATATCCCAATCTGCGAGGTGGTGAAGTGTCTGCCAGTGACCGCCCCCGAGAATGGCAAGATCGTGAGCTCCGCCATGGAGCCCGACAGGGAGTATCACTTCGGCCAGGCCGTGCGCTTCGTGTGCAACTCTGGCTACAAGATCGAGGGCGATGAGGAGATGCACTGTAGCGACGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAGTGCGTGGAGATCAGCTGTAAGTCCCCAGACGTGATCAATGGCTCTCCCATCAGCCAGAAGATCATCTATAAGGAGAACGAGAGGTTTCAGTACAAGTGCAATATGGGCTACGAGTATTCCGAGAGGGGCGATGCCGTGTGCACCGAGTCTGGCTGGAGACCACTGCCCTCCTGCGAGGAGAAGTCTTGTGACAACCCATATATCCCCAATGGCGATTACTCTCCCCTGCGGATCAAGCACAGAACAGGCGACGAGATCACCTATCAGTGCCGGAACGGCTTCTACCCTGCCACAAGAGGCAATACCGCCAAGTGTACAAGCACCGGATGGATCCCTGCACCAAGGTGCACCCTGAAGCCTTGTGACTATCCAGATATCAAGCACGGCGGCCTGTATCACGAGAATATGAGGCGCCCTTACTTCCCAGTGGCCGTGGGCAAGTACTATAGCTACTATTGCGACGAGCACTTTGAGACCCCTTCCGGCTCTTACTGGGACCACATCCACTGTACACAGGATGGATGGTCCCCAGCAGTGCCTTGCCTGAGGAAGTGTTACTTCCCATATCTGGAGAACGGCTACAACCAGAATTATGGCCGCAAGTTTGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCATGCCACCCAGGATACGCACTGCCTAAGGCACAGACCACAGTGACATGCATGGAGAATGGCTGGTCTCCCACCCCTCGGTGTATCAGAGTGAGCTTTACACTGTGA

(SEQ ID NO: 29)

RC141: FHL-1 Genscript-Оптимизированный вручную:

ATGCGGCTGCTCGCCAAGATCATTTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGACTGTAACGAGCTGCCCCCTCGGAGAAATACAGAGATCCTGACCGGCTCTTGGAGCGATCAGACATATCCTGAGGGCACCCAGGCCATCTACAAGTGCAGGCCAGGCTATCGCTCCCTGGGCAACATCATTATGGTGTGCAGGAAGGGAGAGTGGGTGGCCCTGAATCCTCTGAGGAAGTGCCAGAAGAGGCCATGTGGACACCCAGGCGACACCCCTTTCGGCACCTTTACACTGACCGGCGGGAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAGGCCGTGTATACATGCAACGAGGGCTACCAGCTGCTCGGCGAGATCAATTACAGAGAGTGTGACACAGATGGCTGGACCAACGATATCCCAATCTGCGAGGTGGTCAAGTGTCTGCCAGTGACCGCCCCCGAGAATGGCAAGATCGTGAGCTCCGCCATGGAGCCCGACAGGGAGTATCACTTCGGCCAGGCCGTGCGCTTCGTGTGCAACTCTGGCTACAAGATCGAGGGCGATGAGGAAATGCACTGTAGCGACGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAGTGCGTGGAGATCAGCTGCAAGTCCCCAGACGTGATCAATGGCTCTCCCATCAGCCAGAAGATCATTTATAAGGAGAACGAGAGGTTTCAGTACAAGTGCAATATGGGCTACGAGTATTCCGAGAGGGGCGATGCCGTGTGCACCGAGTCTGGCTGGAGACCACTGCCCTCCTGCGAGGAAAAGTCTTGTGACAACCCATATATCCCCAATGGCGATTACTCTCCCCTGCGGATCAAGCACAGAACAGGCGACGAGATCACCTATCAGTGCCGGAACGGCTTCTACCCTGCCACAAGAGGCAATACCGCCAAGTGTACAAGCACCGGATGGATCCCTGCACCAAGGTGCACCCTGAAGCCTTGTGACTATCCAGATATCAAGCACGGCGGGCTGTATCACGAGAATATGAGGCGCCCTTACTTCCCAGTGGCCGTGGGCAAGTACTATAGCTACTATTGCGACGAGCACTTTGAGACCCCTTCCGGCTCTTACTGGGACCACATCCACTGTACACAGGATGGATGGTCCCCAGCAGTGCCTTGCCTGAGGAAGTGTTACTTCCCATATCTGGAGAACGGCTACAACCAGAATTATGGCCGCAAGTTTGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCATGCCACCCAGGATACGCACTGCCTAAGGCACAGACCACAGTGACATGCATGGAGAATGGCTGGTCTCCCACCCCTCGGTGTATCAGAGTGAGCTTTACACTGTGA

(SEQ ID NO: 30)

RC142: FHL-1 IDT-Базовый:

ATGAGACTGCTTGCGAAAATTATATGCCTGATGCTTTGGGCTATTTGCGTTGCGGAAGACTGTAACGAACTCCCGCCCCGCCGAAATACAGAGATCCTCACAGGCAGTTGGAGCGACCAAACGTACCCTGAAGGTACGCAGGCCATATATAAGTGTAGGCCAGGCTACAGATCACTTGGTAACATAATAATGGTATGTCGGAAAGGAGAGTGGGTCGCTCTCAACCCTCTTAGGAAATGTCAAAAAAGACCCTGTGGGCATCCGGGAGATACGCCTTTCGGGACATTCACTCTCACGGGCGGAAACGTATTCGAATATGGCGTGAAGGCAGTGTATACCTGCAATGAAGGGTATCAGCTGCTTGGGGAAATTAATTATAGGGAATGTGACACGGATGGGTGGACAAACGATATTCCAATATGCGAAGTAGTTAAATGCCTGCCCGTTACTGCACCGGAGAATGGCAAAATAGTCAGTAGTGCAATGGAGCCGGATCGCGAGTATCATTTTGGTCAGGCCGTGCGGTTCGTATGTAATTCTGGGTACAAGATCGAAGGTGACGAAGAGATGCATTGCTCAGATGACGGCTTTTGGAGTAAAGAAAAGCCTAAGTGTGTTGAAATCAGCTGTAAGAGTCCAGACGTGATTAACGGTTCCCCGATCTCTCAGAAGATAATTTACAAGGAAAACGAACGATTCCAATATAAGTGTAACATGGGCTACGAGTATTCCGAGCGAGGTGACGCAGTATGTACGGAAAGCGGGTGGCGACCTCTGCCCTCCTGCGAGGAAAAGAGCTGTGATAATCCGTATATCCCCAACGGTGACTATAGCCCACTGCGCATAAAACATCGGACGGGAGATGAGATTACATACCAATGCCGCAATGGTTTTTACCCCGCCACCCGAGGGAACACGGCAAAGTGCACTTCTACGGGGTGGATTCCAGCTCCTAGGTGCACTCTTAAACCCTGCGACTACCCAGATATCAAGCATGGTGGACTGTATCATGAGAATATGAGGAGACCATACTTTCCAGTTGCAGTGGGCAAGTACTATAGCTATTACTGTGATGAGCACTTTGAAACTCCGTCTGGGAGCTACTGGGATCATATCCATTGTACGCAAGACGGCTGGAGTCCAGCAGTTCCATGCTTGCGGAAATGTTATTTTCCCTACCTCGAAAACGGATATAATCAGAACTATGGGAGGAAGTTTGTTCAAGGCAAAAGCATTGATGTGGCATGTCACCCCGGTTATGCCCTGCCCAAGGCGCAAACCACAGTAACTTGCATGGAGAATGGATGGAGCCCCACACCCAGATGTATACGAGTATCCTTCACGCTTTGA

(SEQ ID NO: 31)

RC143: FHL-1 IDT-Оптимизированный вручную:

ATGAGACTGCTTGCGAAAATTATATGCCTGATGCTTTGGGCTATTTGCGTTGCGGAAGACTGTAACGAACTCCCGCCCCGCCGAAATACAGAGATCCTCACAGGCAGTTGGAGCGACCAAACGTACCCTGAAGGCACGCAGGCCATATATAAGTGTAGGCCAGGCTACAGATCACTTGGTAACATAATCATGGTGTGTCGGAAAGGAGAGTGGGTCGCTCTCAACCCTCTTCGCAAATGTCAAAAAAGACCCTGTGGGCATCCGGGAGATACGCCTTTCGGGACATTCACTCTCACGGGCGGAAACGTATTCGAATATGGCGTGAAGGCAGTGTATACCTGCAATGAAGGGTATCAGCTGCTTGGGGAAATTAATTATAGGGAATGTGACACGGATGGGTGGACAAACGATATTCCAATATGCGAAGTAGTTAAATGCCTGCCCGTTACTGCACCGGAGAATGGCAAAATAGTCAGTAGCGCAATGGAGCCGGATCGCGAGTATCATTTTGGTCAGGCCGTGCGGTTCGTATGTAATTCTGGGTACAAGATCGAAGGTGACGAAGAGATGCATTGCTCAGATGACGGCTTTTGGAGCAAGGAAAAGCCTAAGTGTGTTGAAATCAGCTGTAAGAGTCCAGACGTGATTAACGGTTCCCCGATCTCTCAGAAGATAATTTACAAGGAAAACGAACGATTCCAATATAAGTGTAACATGGGCTACGAGTATTCCGAGCGAGGTGACGCAGTATGTACGGAAAGCGGGTGGCGACCTCTGCCCTCCTGCGAGGAAAAGAGCTGTGATAATCCGTATATCCCCAACGGCGACTATAGCCCACTGCGCATAAAACATCGGACGGGAGATGAGATTACATACCAATGCCGCAATGGTTTTTACCCCGCCACCCGAGGGAACACGGCAAAGTGCACTTCTACGGGGTGGATTCCAGCTCCTAGGTGCACTCTTAAACCCTGCGACTACCCAGATATCAAGCATGGTGGACTGTATCATGAGAATATGAGGAGACCATACTTTCCAGTTGCAGTGGGCAAGTACTATAGCTATTACTGTGATGAGCACTTTGAAACTCCGTCTGGGAGCTACTGGGATCATATCCATTGTACGCAAGACGGCTGGAGTCCAGCAGTTCCATGCTTGCGGAAATGTTATTTTCCCTACCTCGAAAACGGATATAATCAGAATTACGGCAGGAAATTTGTGCAAGGCAAAAGCATTGATGTGGCATGTCACCCCGGTTATGCCCTGCCCAAGGCGCAAACCACAGTAACTTGCATGGAGAATGGATGGAGCCCCACACCCAGATGTATACGAGTATCCTTCACGCTTTGA

(SEQ ID NO: 32)

RC144: FHL-1 JCat- Базовый

ATGCGCCTGCTGGCCAAGATCATCTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGACTGCAACGAGCTGCCCCCCCGCCGCAACACCGAGATCCTGACCGGCAGCTGGAGCGACCAGACCTACCCCGAGGGCACCCAGGCCATCTACAAGTGCCGCCCCGGCTACCGCAGCCTGGGCAACATCATCATGGTGTGCCGCAAGGGCGAGTGGGTGGCCCTGAACCCCCTGCGCAAGTGCCAGAAGCGCCCCTGCGGCCACCCCGGCGACACCCCCTTCGGCACCTTCACCCTGACCGGCGGCAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAGGCCGTGTACACCTGCAACGAGGGCTACCAGCTGCTGGGCGAGATCAACTACCGCGAGTGCGACACCGACGGCTGGACCAACGACATCCCCATCTGCGAGGTGGTGAAGTGCCTGCCCGTGACCGCCCCCGAGAACGGCAAGATCGTGAGCAGCGCCATGGAGCCCGACCGCGAGTACCACTTCGGCCAGGCCGTGCGCTTCGTGTGCAACAGCGGCTACAAGATCGAGGGCGACGAGGAGATGCACTGCAGCGACGACGGCTTCTGGAGCAAGGAGAAGCCCAAGTGCGTGGAGATCAGCTGCAAGAGCCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCCATCAGCCAGAAGATCATCTACAAGGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGCAACATGGGCTACGAGTACAGCGAGCGCGGCGACGCCGTGTGCACCGAGAGCGGCTGGCGCCCCCTGCCCAGCTGCGAGGAGAAGAGCTGCGACAACCCCTACATCCCCAACGGCGACTACAGCCCCCTGCGCATCAAGCACCGCACCGGCGACGAGATCACCTACCAGTGCCGCAACGGCTTCTACCCCGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAGTGCACCAGCACCGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGCACCCTGAAGCCCTGCGACTACCCCGACATCAAGCACGGCGGCCTGTACCACGAGAACATGCGCCGCCCCTACTTCCCCGTGGCCGTGGGCAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCAGCGGCAGCTACTGGGACCACATCCACTGCACCCAGGACGGCTGGAGCCCCGCCGTGCCCTGCCTGCGCAAGTGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGCTACAACCAGAACTACGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGACGTGGCCTGCCACCCCGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACCACCGTGACCTGCATGGAGAACGGCTGGAGCCCCACCCCCCGCTGCATCCGCGTGAGCTTCACCCTGTAA

(SEQ ID NO: 33)

RC145: FHL-1 JCat-Оптимизированный вручную:

ATGCGCCTGCTCGCCAAGATCATTTGCCTGATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCCGAGGACTGCAACGAGCTGCCCCCTCGCCGGAACACCGAGATCCTGACCGGCAGCTGGAGCGACCAGACCTACCCCGAGGGCACCCAGGCCATCTACAAGTGCCGCCCCGGCTACCGCAGCCTGGGCAACATCATTATGGTGTGCCGCAAGGGCGAGTGGGTGGCCCTGAACCCCCTGCGCAAGTGCCAGAAGCGCCCCTGCGGCCACCCCGGCGACACCCCCTTCGGCACCTTCACCCTGACCGGCGGCAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAGGCCGTGTACACCTGCAACGAGGGCTACCAGCTGCTCGGCGAGATCAACTACCGCGAGTGCGACACCGACGGCTGGACCAACGACATCCCCATCTGCGAGGTGGTCAAGTGCCTGCCCGTGACCGCCCCCGAGAACGGCAAGATCGTGAGCTCCGCCATGGAGCCCGACCGCGAGTACCACTTCGGCCAGGCCGTGCGCTTCGTGTGCAACAGCGGCTACAAGATCGAGGGCGACGAGGAGATGCACTGCAGCGACGATGGCTTCTGGAGCAAGGAGAAGCCCAAGTGCGTGGAGATCAGCTGCAAGAGCCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCCATCAGCCAGAAGATCATTTACAAGGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGCAACATGGGCTACGAGTACAGCGAGCGCGGCGACGCCGTGTGCACCGAGAGCGGCTGGCGCCCCCTGCCCAGCTGCGAGGAAAAGAGCTGCGACAACCCCTACATCCCCAACGGCGACTACAGCCCCCTGCGCATCAAGCACCGCACCGGCGACGAGATCACCTACCAGTGCCGCAACGGCTTCTACCCCGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAGTGCACCAGCACCGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGCACCCTGAAGCCCTGCGACTACCCCGACATCAAGCACGGCGGGCTGTACCACGAGAACATGCGCCGGCCCTACTTCCCCGTGGCCGTGGGCAAGTACTATAGCTACTATTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCAGCGGCAGCTACTGGGACCACATCCACTGCACCCAGGACGGCTGGAGCCCCGCCGTGCCCTGCCTGCGCAAGTGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGCTACAACCAGAACTACGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGACGTGGCCTGCCACCCCGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACCACAGTGACCTGCATGGAGAACGGCTGGAGCCCCACCCCCCGCTGCATCCGCGTGAGCTTCACCCTGTAA

(SEQ ID NO: 34)

RC146: FHL-1 COOL-Базовый: см. SEQ ID NO:12 выше.

RC147: FHL-1 COOL-Оптимизированный вручную:

ATGCGCCTCCTGGCCAAGATCATTTGCCTCATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCTGAGGACTGCAATGAGCTGCCGCCCAGGAGAAACACAGAGATCCTGACAGGGAGCTGGTCTGACCAGACCTACCCTGAGGGCACCCAGGCGATCTACAAGTGCCGGCCGGGCTACAGGAGCCTGGGGAACATCATTATGGTGTGTAGAAAGGGCGAATGGGTGGCCCTCAACCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGGCCCTGTGGCCACCCCGGGGACACACCCTTCGGGACCTTCACCCTGACCGGCGGGAATGTGTTTGAGTACGGCGTGAAGGCTGTCTACACATGCAACGAGGGGTACCAGCTGCTCGGCGAGATTAACTACCGGGAGTGTGACACCGATGGGTGGACCAACGACATTCCCATCTGTGAGGTGGTCAAGTGTCTCCCCGTGACAGCCCCAGAAAATGGCAAAATTGTGAGCTCCGCCATGGAGCCTGACCGCGAATATCACTTTGGGCAGGCCGTGAGGTTTGTGTGCAACTCGGGCTACAAAATTGAAGGTGATGAGGAAATGCACTGCAGCGATGACGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAATGTGTGGAGATCTCCTGCAAGTCTCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCAATCAGCCAGAAGATTATCTACAAAGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTATGAGTATTCAGAGAGGGGAGATGCCGTCTGCACTGAGAGCGGCTGGAGACCACTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGTTGTGACAACCCTTACATCCCAAATGGCGACTACTCCCCTCTGCGGATCAAACACCGGACCGGGGATGAAATCACCTATCAGTGCCGCAATGGATTCTACCCGGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAATGCACCAGCACAGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGTACGCTGAAGCCTTGCGACTATCCAGACATCAAGCACGGAGGCCTGTACCACGAAAACATGCGGAGGCCTTATTTCCCTGTGGCAGTGGGGAAGTACTATAGCTACTATTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCTCTGGCTCCTACTGGGACCACATCCACTGCACACAGGACGGCTGGTCTCCAGCTGTGCCCTGCCTGAGGAAATGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGATACAACCAGAACTATGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCACCCTGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACAACTGTGACCTGCATGGAGAATGGTTGGAGCCCCACCCCGCGCTGCATCCGGGTGTCCTTCACGCTCTGA

(SEQ ID NO: 35)

Генерация плазмид

Все 10 кодон-оптимизированных последовательностей были синтезированы и клонированы в основу вектора AAV. Вектор также содержал левую и правуюй инвертированную концевую повторяющуюся последовательности (ITR) AAV-2, фланкирующие модифицированный промотор CBA/CAG (куриный бета-актин с энхансером CMV; «CBA»). Промотор управляет экспрессией кодон-оптимизированных FHL1 или CFI. Кроме того, за трансгеном следуют модифицированная последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE) и последовательность поли-A гормона роста крупного рогатого скота (bGH polyA), расположенная в 3' положении относительно кДНК.

Трансфекция

Все 20 плазмид трансфицировали в клетки ARPE19, используя следующую процедуру:

1 день: Клетки ARPE19 диссоциировали и подсчитывали с помощью ViCell. Клетки высевали в 48-луночный планшет из расчета 6x10⁴ клеток на лунку в 500 мкл DMEM, 10% FBS на лунку.

2 день: Конфлюэнтность была проверена и составила 70-80%. Затем клетки трансфицировали 0,25 мкг плазмидной ДНК с использованием PEI при соотношении ДНК: PEI 1:3 в дубликате:

1. 2 × 0,25 мкг ДНК разводили в 2 × 5 мкл ФСБ.

2. 2 × 0,75 мкл PEI разводили в 2 × 5 мкл ФСБ.

3. Смесь PEI добавляли по каплям к смеси ДНК, перемешивали и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут.

4. К смеси добавляли 2 × 250 мкл DMEM/Glutamax/10% FBS.

5. Среду удаляли из клеток и заменяли 250 мкл комплексов ДНК/PEI на лунку.

3 день: Среду удаляли и заменяли 125 мкл бессывороточной среды DMEM/Glutamax.

5 день: Среду собирали, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C, затем супернатант переносили в свежую пробирку.

Вестерн-блоттинг

Супернатанты от трансфекции анализировали вестерн-блоттингом (использовали первичные антитела к CFI и FHL-1: козью антисыворотку к CFI 1: 3000; Quidel A312 1: 3000; и вторичные кроличьи антитела к козьим антителам с HRP 1: 5000).

Результаты Вестерн-блоттинга показаны на Фиг. 2.

CFI ИФА

Супернатанты после трансфекции анализировали с помощью ИФА на CFI, используя следующую процедуру:

1 день: Планшет для ИФА покрывали 50 мкл на лунку поликлонального антитела барана к CFI, разведенного 1:4000 в 1х буфере для покрытия. Планшеты хранили при 4 °C в течение ночи.

2 день: Планшет промывали 3 раза 200 мкл на лунку PBS-Tween (0,05%), затем наносили на ткань. 200 мкл 1% BSA фракции V в PBS-Tween (0,05%) вносили в каждую лунку и позволяли блокироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.

Образцы и стандартную кривую получали во время инкубации с блокировкой. Стандартная кривая была построена с использованием очищенного белка CFI (Sigma C5938-1MG), разбавленного в DMEM 2% FBS. Образцы разбавляли 1:10, 1:20 и 1:40 в DMEM 2% ФСБ.

После 2 часов блокировки планшет промывали 3 раза, как описано выше, затем 50 мкл образца или стандарта загружали в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем антитело к CFI (Ox21) разводили 1:2000 в DMEM 5% FBS и 50 мкл этого вносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем ослиные антитела к мышиным антитела с HRP разбавляли 1: 5000 в DMEM 5% FBS, и 50 мкл наносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как указано выше, затем в каждую лунку наносили 100 мкл реагента TMB и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение приблизительно 15 минут. После получения достаточного синего цвета в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 М серной кислоты, чтобы остановить реакцию.

Затем была записана A450, данные были обработаны и перенесены в Microsoft Excel для анализа.

Результаты CFI ИФА представлены на Фиг. 3.

FHL1 ИФА

Супернатанты после трансфекции анализировали с помощью ИФА на FHL1, используя следующую процедуру:

1 день: Планшет для ИФА покрывали 50 мкл на лунку антитела к FHL-1 (Biorad, AbD33594.1), разведенного до 5 мкг/мл в 100 мМ карбонат/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Планшеты хранили при 4 °C в течение ночи.

2 день: Планшет промывали 3 раза 200 мкл на лунку PBS-Tween (0,05%), затем наносили на ткань. 200 мкл 1% BSA фракции V в PBS-Tween (0,05%) вносили в каждую лунку и позволяли блокироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.

Образцы и стандартную кривую получали во время инкубации с блокировкой. Стандартная кривая была построена для белка FHL1-His, разбавленного DMEM 2% FBS. Образцы разбавляли блокирующим раствором 1: 5, 1:10 и 1:30.

После 2 часов блокировки планшет промывали 3 раза, как описано выше, затем 50 мкл образца или стандарта загружали в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем антитело к CFH (Ox24, Santa Cruz Biotechnologies, sc-53067) разбавляли 1: 3000 в DMEM 5% FBS, и 50 мкл наносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем ослиные антитела к мышиным антитела с HRP разбавляли 1: 5000 в DMEM 5% FBS, и 50 мкл наносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как указано выше, затем в каждую лунку наносили 100 мкл реагента TMB и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение приблизительно 15 минут. После получения достаточного синего цвета в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 М серной кислоты, чтобы остановить реакцию.

Затем была записана A450, данные были обработаны и перенесены в Microsoft Excel для анализа.

Результаты FHL1 ИФА представлены на Фиг. 4.

Производство векторов AAV2

Лучшие четыре (CFI) и пять (FHL1) последовательностей были использованы в последующих исследованиях с использованием AAV.

Клетки HEK293 трансфицировали выбранными кодон-оптимизированными плазмидами вместе с pRepCap и pHelper в соответствии с типичным протоколом тройной трансфекции, а именно:

1 день: Клетки HEK293 диссоциировали и подсчитывали с помощью ViCell. Клетки высевали в 10-сантиметровую чашку из расчета 6x10⁵ клеток на см² в 10 мл DMEM 10% FBS на чашку.

2 день: Конфлюэнтность была проверена и составила 70-80%.

Среду заменяли 10 мл DMEM/Glutamax с 5% FBS.

Через 4 часа клетки трансфицировали 5 мкг плазмиды с использованием PEI при соотношении ДНК: PEI 1: 3.

3 день: К 11 мл среды в каждом планшете добавляли 15 мМ бутирата.

5 день: Супернатант собирали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут для удаления остатков клеток.

Супернатант переносили в свежую пробирку и 1/5 об. и добавляли реагент AAVanced (AAV110A-1, Cambridge Bioscience) (2,75 мл в 11 мл).

Затем смесь хранили при 4 °C.

8 день: Смесь супернатант/AAV центрифугировали при 1000 об/мин в течение 30 минут при 4 °C.

Супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 500 мкл ФСБ. Затем его переносили в пробирку на 1,5 мл и центрифугировали в течение 3 минут при 1500 g.

Супернатант отбрасывали, а оставшийся осадок ресуспендировали в 1/100 исходного объема (т.е. 100 мкл на 11 мл супернатанта).

Вектор хранили при -80 °C.

Трансдукция клеток ARPE19

Клетки ARPE19 трансдуцировали кодон-оптимизированными векторами.

1 день: Клетки ARPE19 диссоциировали и подсчитывали на ViCell, затем высевали 1 × 10⁵ клеток на лунку в 200 мкл DMEM/Glutamax 10% FBS.

2 день: Добавляли вектор к клеткам.

3 день: Среду заменяли бессывороточной средой.

4 день: Супернатант собирали, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C, затем переносили в свежую пробирку.

Концентрацию общего белка оценивали с помощью анализа Брэдфорда.

CFI ИФА

Супернатанты трансдукции анализировали с помощью ИФА на CFI в соответствии с описанным выше протоколом.

Результаты CFI ИФА показаны на Фиг. 5.

FHL-1 ИФА

Супернатанты трансдукции анализировали с помощью ИФА на FHL1 в соответствии с описанным выше протоколом.

Результаты FHL1 ИФА представлены на Фиг. 6.

ВЫВОДЫ

Каждая из RC136 (CFI; SEQ ID NO: 10) и RC146 (FHL-1; SEQ ID NO: 12) дает более высокую экспрессию трансгена, чем последовательности дикого типа и другие протестированные кодон-оптимизированные последовательности.

Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации раскрытых агентов, композиций, применений и способов изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было раскрыто в связи с конкретными предпочтительными вариантами реализации, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами реализации. Действительно, различные модификации раскрытых способов реализации изобретения, которые очевидны для специалиста, предназначены для того, чтобы находиться в пределах объема следующей формулы изобретения.

Группа изобретений относится к средствам для применения в генотерапии. Предложены полинуклеотид, кодирующий фактор H-подобный белок 1 (FHL1), вектор, содержащий указанный полинуклеотид, клетка для экспрессии FHL1 и их применение для лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства, связанного с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b, включая заболевания глаз, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) или диабетическая ретинопатия. Нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 12. Изобретения позволяют доставлять пациенту более высокие дозы соответствующего белка без увеличения количества вводимого вектора. 12 н. и 25 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Выделенный полинуклеотид для экспрессии фактор H-подобного белка 1 (FHL1) in vitro или in vivo, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор H-подобный белок 1 (FHL1), причем нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 12.

2. Выделенный полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12.

3. Выделенный полинуклеотид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) на его 5'-конце и ITR AAV на его 3'-конце.

4. Выделенный полинуклеотид по п. 3, отличающийся тем, что ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8.

5. Выделенный полинуклеотид по п. 3, отличающийся тем, что ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

6. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, функционально связана с промотором CMV, регуляторным элементом WPRE и сигналом поли-А.

7. Выделенный полинуклеотид по п. 6, отличающийся тем, что промотор имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 13 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 13.

8. Выделенный полинуклеотид по п. 6 или 7, отличающийся тем, что сигнал поли-А представляет собой сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота.

9. Выделенный полинуклеотид по п. 8, отличающийся тем, что сигнал поли-А имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 6 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 6.

10. Выделенный полинуклеотид по любому из пп. 6-9, отличающийся тем, что регуляторный элемент WPRE имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15 или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 7.

11. Вектор для экспрессии фактор H-подобного белка 1 (FHL1) in vitro или in vivo, содержащий полинуклеотид по любому предшествующему пункту.

12. Вектор по п. 11, отличающийся тем, что вектор представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV).

13. Вектор по п. 11 или 12, отличающийся тем, что вектор находится в форме вирусной векторной частицы.

14. Вектор по п. 13, отличающийся тем, что векторная частица AAV содержит капсидные белки AAV2 или AAV8.

15. Вектор по п. 14, отличающийся тем, что векторная частица AAV содержит геном AAV2 или AAV8 и капсидные белки AAV2 или AAV8.

16. Клетка для экспрессии фактор H-подобного белка 1 (FHL1) in vitro или in vivo, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-10.

17. Клетка для экспрессии фактор H-подобного белка 1 (FHL1) in vitro или in vivo, трансдуцированная вектором по любому из пп. 11-15 и содержащая его.

18. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства, связанного с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-10, вектор по любому из пп. 11-15 или клетку по п. 16 или 17 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

19. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 при лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза, связанного с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию.

21. Применение по п. 19, отличающееся тем, что расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД).

22. Применение по п. 20 или 21, отличающееся тем, что ВМД представляет собой сухую ВМД.

23. Применение по любому из пп. 19-22, отличающееся тем, что образование географической атрофии предотвращается или уменьшается и/или степень географической атрофии снижается.

24. Применение по любому из пп. 19-23, отличающееся тем, что прогрессирование географической атрофии замедляется.

25. Применение по любому из пп. 19-24, отличающееся тем, что введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта.

26. Применение по любому из пп. 19-24, отличающееся тем, что введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в глазу субъекта.

27. Применение по любому из пп. 19-24, отличающееся тем, что введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) субъекта.

28. Применение по любому из пп. 25-27, отличающееся тем, что уровень активности в отношении инактивации C3b и деградации iC3b повышается до уровня, превышающего нормальный уровень.

29. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 для улучшения или восстановления скорости чтения у субъекта, страдающего опосредованным комплементом расстройством глаза, связанным с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b, или уменьшения снижения скорости чтения, связанного с опосредованным комплементом расстройством глаза, связанным с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

30. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 для уменьшения или предотвращения потери фоторецепторов, связанной с опосредованным комплементом расстройством глаза, связанным с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

31. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 для уменьшения или предотвращения потери пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), связанной с опосредованным комплементом расстройством глаза, связанным с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

32. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 для уменьшения или предотвращения потери фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), связанной с опосредованным комплементом расстройством глаза, связанным с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b.

33. Применение по любому из пп. 19-32, отличающееся тем, что полинуклеотид, вектор или клетку вводят внутриглазно.

34. Применение по любому из пп. 19-33, отличающееся тем, что полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

35. Применение по любому из пп. 19-34, отличающееся тем, что полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной инъекции.

36. Способ лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, связанного с гиперактивностью цикла обратной связи комплемента C3b, включающий введение полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 нуждающемуся в этом субъекту.

37. Способ предоставления фактор H-подобного белка 1 (FHL1) субъекту, включающий доставку полинуклеотида по любому из пп. 1-10, вектора по любому из пп. 11-15 или клетки по п. 16 или 17 в глаз субъекта.