ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПУТЕМ БЫСТРОГО ИНКУБИРОВАНИЯ И ОБОГАЩЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/18 C12Q1/6806 C12Q1/689 C12Q1/6895 C12Q1/70 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка в соответствии с 35 U.S.C. §119 испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/840,322, поданной 29 апреля 2019 г., описания которой включены в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее описание относится к способам, композициям и наборам для идентификации и анализа микроорганизмов в образце с использованием нуклеозидных или нуклеотидных аналогов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Определение наличия у пациента той или иной микробной инфекции является распространенной клинической проблемой. Сепсис относится к наиболее распространенным причинам смерти госпитализированных пациентов, и, по оценкам, в США ежегодно регистрируют 200 000 смертельных случаев. Вместе с тем сепсис не является точным клиническим синдромом и имеет разнообразные клинические проявления. Диагноз обычно основан на подозрении наличия инфекции в сочетании с признаками дисфункции органа. Ранняя диагностика сепсиса и введение антибиотиков имеет жизненно важное значение, поскольку прогрессирование до тяжелого сепсиса или септического шока имеет серьезные последствия. К сожалению, дифференциация между сепсисом и другими воспалительными заболеваниями часто оказывается сложной задачей в случае с тяжелобольными пациентами. Обнаружение бактериальных инфекций в крови является ключевым шагом в диагностике сепсиса и начале лечения противомикробными препаратами. Вместе с тем у от 60 до 70% пациентов с тяжелым сепсисом посев крови оказывается отрицательными, а у > 80% они были отрицательными в ходе проведенного исследования. Кроме того, традиционные способы микробиологии занимают слишком много времени, чтобы оказывать влияние на терапию первой линии против патогенных бактерий. Развитие ПЦР и масс-спектрометрии повысило вероятность идентификации бактерий в образцах крови, но часто опирается на продолжительную по времени предварительную аналитическую обработку, такую как посев крови, для увеличения патогенной нагрузки. К косвенным показателям инфекции относятся повышенные уровни циркулирующих цитокинов и белков острой фазы, таких как C-реактивный белок; однако их концентрации также возрастают при тех или иных физиологических состояниях, таких как роды, или при патологических повреждениях тканей, таких как ожоги. Как правило, при сепсисе проводят тест на посев крови, чтобы попытаться определить, какой тип бактерий или грибов вызвал инфекцию в крови. Пробы для посева крови отбирают отдельно от других анализов крови, и их часто отбирают более одного раза из разных вен. Для результатов посева крови может потребоваться несколько дней. Из-за условий культивирования in vitro положительные результаты посева крови будут наблюдаться только у от трети до половины пациентов с сепсисом, что фактически подразумевает рост и пролиферацию бактерий в условиях in vitro.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] В настоящее время для обнаружения бактерий часто требуется культивирование, чтобы (1) выделить бактерии для анализа и (2) уменьшить загрязнение от любых фоновых клеток или другого материала, который может затруднить анализ или сделать его невозможным. Например, у пациентов с сепсисом необходимо культивировать кровь, чтобы выделить патогенные бактерии. Аналогичным образом при мониторинге пищи образцы необходимо культивировать, чтобы выделить загрязняющие микроорганизмы. К сожалению, стандартный процесс культивирования может занимать несколько дней. В случае сепсиса такое время задержки может привести к ненужному введению антибиотиков или к неправильной диагностике, которые приводят к осложнениям или смерти пациента. В пищевой промышленности такое время задержки задерживает информацию, которая может привести к отзывам продукции или повлечь за собой другие профилактические меры. Таким образом, быстрая идентификация активных инфекций может обеспечить меры, которые могут снизить уровень проблем и спасти жизни людей.

[0005] Несмотря на то, что способы обнаружения с использованием ПЦР могут и не требовать длительного культивирования, в отличие от подходов к секвенированию без заранее известных результатов ПЦР нуждается в предварительной информации о геномной последовательности интересующих организмов. То есть исследователь должен знать, что он ищет, и это, скорее всего, будет невозможно в случае редких или еще неизвестных организмов. Кроме того, зависимые от ПЦР способы позволяют обнаруживать только наличие генетического материала в образце и не в состоянии различить, происходит ли этот материал из живого или мертвого организма. Во многих случаях идентификация активных инфекций, вызванных живыми микроорганизмами, является наиболее важным фактором для подходов к лечению или даже для идентификации загрязняющих веществ в продуктах питания или окружающей среде.

[0006] Настоящее описание относится к способу идентификации и анализа жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов в образце, включающему: (a) получение образца, содержащего или предположительно содержащего один или несколько видов микроорганизмов; (b) инкубирование образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включены в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты; (c) введение метки в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты путем приведения свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов; (d) выделение или очистку меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот; и (e) определение идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов в образце по результатам секвенирования или определение идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот. В другом варианте осуществления образец получают от субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции. В еще одном варианте осуществления у субъекта диагностирован или подозревается сепсис. В дополнительном варианте осуществления на стадии (a) полученный образец перед стадией (b) обрабатывают с использованием способа удаления нуклеиновых кислот хозяина, чтобы селективно удалить немикробные нуклеиновые кислоты. В еще одном дополнительном варианте осуществления способ удаления нуклеиновых кислот хозяина включает: (i) селективное расщепление немикробной ДНК путем приведения полученного образца в контакт с рекомбинантным белком, содержащим: связывающийся домен, который селективно связывается с немикробными нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном (-ами), или с немикробными нуклеиновыми кислотами, содержащими метилированные CpG остатки, и нуклеазный домен, обладающий активностью при расщеплении нуклеиновых кислот; или (ii) использование афинного агента, связанного с твердой подложкой, который селективно связывается с нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном (-ами), или селективно связывается с метилированными CpG остатками немикробных нуклеиновых кислот. В определенном варианте осуществления образец представляет собой образец окружающей среды, взятый с природоохранного испытательного участка. В другом варианте осуществления проводят тестирование природоохранного участка на предмет загрязнения микроорганизмами. В еще одном варианте осуществления образец представляет собой образец продукта питания с подозрением на загрязнение микроорганизмами. В дополнительном варианте осуществления к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы, вирусы, водоросли, археи и/или простейшие. В еще одном дополнительном варианте осуществления бактерии выбраны из Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica и/или Yersinia pseudotuberculosis. В другом варианте осуществления грибы выбраны из Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp, Blastomyces spp., Cadophora spp., Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp., Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp, Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi, Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp., Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (или Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp., Trichophyton spp., Trichosporon spp. и/или Zopfia rosatii. В еще одном варианте осуществления вирусы выбраны из симплексвируса, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, розеоловируса, лимфокриптовируса, радиновируса, мастаденовируса, α-папилломавируса, β-папилломавируса, Χ-папилломавируса, γ-папилломавируса, мю-папилломавируса, ню-папилломавируса, альфа-полиомавируса, бета-полиомавируса, γ-полиомавируса, дельта-полиомавируса, поксвируса моллюсков, ортопоксвируса, парапоксвируса, α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса, эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса, гамма-ретровируса, дельта-ретровируса, лентивируса, вируса пенистости обезьян, вируса колорадской клещевой лихорадки, ротавируса, сидорнавируса, α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса, норовируса, саповируса, флавивируса, вируса гепатита С, пегивируса, ортогепевируса, кардиовируса, козавируса, энтеровируса, вируса гепатита А, кобувируса, парэховируса, розавируса, саливируса, альфавируса, вируса краснухи, вируса Эбола, вируса Марбурга, хенипавируса, вируса кори, вируса респираторных заболеваний, вируса паротита, метапневмовируса, ортопневмовируса, ледантевируса, лиссавируса, везикуловируса, маммаренавируса, ортохантавируса, ортонайровируса, ортобуньявируса, флебовируса, α-вируса гриппа, β-вируса гриппа, γ-вируса гриппа, куараньявируса, тоготовируса и/или дельтавируса. В дополнительном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина, 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина. В еще одном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина и 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина. В дополнительном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина. В еще одном дополнительном варианте осуществления образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 мин до 180 мин. В другом варианте осуществления образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 мин до 120 мин. В еще одном варианте осуществления реагент метки представляет собой антитело, которое связывается с высокой специфичностью с нуклеозидным или нуклеотидным аналогом одного или более типов. В конкретном варианте осуществления антитело связывается с высокой специфичностью с 5-бром-2'-дезоксиуридином или иоддезоксиуридином. В другом варианте осуществления реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера. В еще одном варианте осуществления реагент метки содержит азидную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими алкинильную группу, посредством клик-химической реакции. В дополнительном варианте осуществления реагент метки содержит алкинильную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими азидную группу, посредством клик-химической реакции. В определенном варианте осуществления реагент метки содержит биотиновую группу. В дополнительном варианте осуществления реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:

, , ,

и .

В дополнительном варианте осуществления реагент метки дополнительно содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер. В еще одном дополнительном варианте осуществления расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер. В определенном варианте осуществления кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или цис-аконитильные группы. В другом варианте осуществления ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер. В еще одном варианте осуществления для выделения или очистки меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот используют аффинный адсорбент. В дополнительном варианте осуществления аффинный адсорбент представляет собой антитело, иммобилизированное на твердой подложке, причем такое антитело связывается с высокой специфичностью с реагентом метки или с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов. В еще одном дополнительном варианте осуществления аффинным адсорбентом является стрептавидин или авидин, иммобилизованный на твердой подложке, и при этом реагент метки содержит биотиновую группу. В определенном варианте осуществления твердая подложка выполнена из нано- или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет. В другом варианте осуществления реагент метки или метку удаляют или отщепляют от выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот до описанной выше стадии (e). В еще одном варианте осуществления идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют с помощью микроматрицы с зондами для нуклеиновых кислот различных микроорганизмов. В дополнительном варианте осуществления идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют посредством: (i) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК; (ii) нанесения меченых продуктов на микроматрицу с зондами, которые содержат уникальные последовательности 16S рРНК вариабельной области 20 или более микроорганизмов; (iii) определения идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов на основе визуализации микроматрицы для флуоресцентных продуктов гибридизации и определения идентичности микроорганизма на основании последовательности зонда микроматрицы. В другом варианте осуществления идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют или подтверждают посредством секвенирования выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот. В еще одном варианте осуществления выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом. В дополнительном варианте осуществления секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот проводят посредством: (a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования; (b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов; (c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов; (d) секвенирования библиотеки амплифицированных продуктов; и (e) определения идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов на основании корреляции последовательностей, полученных из библиотеки амплифицированных продуктов, с базами данных известных последовательностей микроорганизмов с помощью биоинформатического анализа. В другом варианте осуществления свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до описанной выше стадии (e), и при этом экспрессию генов жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов можно установить на основании анализа уровня экспрессии генных продуктов из свежесинтезированной микробной РНК с помощью микроматрицы и/или секвенирования.

[0007] В конкретном варианте осуществления в описании также предложен способ определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце, включающий: (a) отбор образца, содержащего или предположительно содержащего один или более видов микроорганизмов; (b) разделение образца на два образца - контрольный образец и обработанный образец; (с) инкубирование контрольного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты; (c’) инкубирование обработанного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов и противомикробного агента, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты; (d) введение метки в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты контрольного образца и обработанного образца путем приведения свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов; (e) выделение или очистку меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и обработанного образца; (f) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце; (f’) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце; (g) сравнение и определение любых изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце с уровнем экспрессии генов, и/или количествами, или идентичностью выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце, причем снижение уровня экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов). В другом варианте осуществления противомикробный агент выбран из антибиотика, противогрибкового и противовирусного средства. В дополнительном варианте осуществления антибиотик выбран из амоксициллина, ампициллина, бакампициллина, карбенициллина, клоксациллина, диклоксациллина, флуклоксациллина, мезлоциллина, нафциллина, оксациллина, пенициллина G, пенициллина V, пиперациллина, пивампициллина, пивмециллинама, тикарциллина, цефацетрила, цефадроксила, цефалексина, цефалоглицина, цефалония, цефалоридина, цефалотина, цефапирина, цефатризина, цефазафлура, цефазедона, цефазолина, цефрадина, цефроксадина, цефтезола, цефаклора, цефамандола, цефметазола, цефоницида, цефотетана, цефокситина, цефпрозила, цефуроксима, цефузонама, цефкапена, цефдалоксима, цефдинира, цефдиторена, цефетамета, цефиксима, цефменоксима, цефодизима, цефотаксима, цефпимизола, цефподоксима, цефтерама, цефтибутена, цефтиофура, цефтиолена, цефтизоксима, цефтриаксона, цефоперазона, цефтазидима, цефклидина, цефепима, цефлупренама, цефоселиса, цефозопрана, цефпирома, цефкинома, цефтобипрола, цефтаролина, цефакломезина, цефалорама, цефапарола, цефканела, цефедролора, цефемпидона, цефетризола, цефивитрила, цефматилена, цефмепидиума, цефовецина, цефоксазола, цефротила, цефсумида, цефурацетима, цефтиоксида, азтреонама, имипенема, дорипенема, эртапенема, меропенема, азитромицина, эритромицина, кларитромицина, диритромицина, рокситромицина, телитромицина, клиндамицина, линкомицина, амикацина, гентамицина, канамицина, неомицина, нетилмицина, паромомицина, стрептомицина, тобрамицина, флумекина, налидиксиновой кислоты, оксолиновой кислоты, пиромидиновой кислоты, пипемидиновой кислоты, розоксацина, ципрофлоксацина, эноксацина, ломефлоксацина, надифлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина, пефлоксацина, руфлоксацина, балофлоксацина, гатифлоксацина, грепафлоксацина, левофлоксацина, моксифлоксацина, пазуфлоксацина, спарфлоксацина, темафлоксацина, тосуфлоксацина, безифлоксацина, делафлоксацина, клинафлоксацина, гемифлоксацина, прулифлоксацина, ситафлоксацина, тровафлоксацина, сульфаметизола, сульфаметоксазола, сульфизоксазола, триметоприм-сульфаметоксазола, демеклоциклина, доксициклина, миноциклина, окситетрациклина, тетрациклина, тигециклина, ванкомицина, тейкопланина, телаванцина, линезолида, циклосерина, рифампицина, рифабутина, рифапентина, рифалазила, виомицина, капреомицина, бацитрацина, полимиксина В, хлорамфеникола, метронидазола, тинидазола и нитрофурантоина. В еще одном дополнительном варианте осуществления противогрибковый препарат выбран из аморолфина, бутенафина, нафтифина, тербинафина, бифоназола, бутоконазола, клотримазола, эконазола, фентиконазола, кетоконазола, изоконазола, люликоназола, миконазола, омоконазола, оксиконазола, сертаконазола, сульконазола, тиоконазола, терконазола, албаконазола, эфинаконазола, флуконазола, изавуконазола, итраконазола, позаконазола, равуконазола, терконазола, вориконазола, абафунгина, амфотерицина B, нистатина, натамицина, трихомицина, анидулафунгина, каспофунгина, микафунгина, толнафтата, флуцитозина, бутенафина, гризеофульвина, циклопирокса, сульфида селена, таваборола. В другом варианте осуществления противовирусное средство выбрано из ацикловира, бривудина, докозанола, фамцикловира, фоскарнета, идоксуридина, пенцикловира, трифлуридина, видарабина, цитарабина, валацикловира, троматандина, прителивира, амантадина, римантадина, осельтамивира, перамивира, занамивира, асунапревира, боцепревира, цилупревира, данопревира, фалдапревира, глекапревира, гразопревира, нарлапревира, паритапревира, симепревира, совапревира, телапревира, ванипревира, ведропревира, воксилапревира, даклатасвира, элбасвира, ледипасвира, одаласвира, омбитасвира, пибрентасвира, равидасвира, рузасвира, саматасвира, велпатасвира, беклабувира, дасабувира, делеобувира, филибувира, сетробувира, софосбувира, радалбувира, уприфосбувира, ламивудина, телбивудина, клевудина, адефовира, дизопроксилтенофовира, алафенамидтенофовира, энфувиртида, маравирока, викривирока, ценикривирока, PRO 140, ибализумаба, фостемсавира, диданозина, эмтрицитабина, ламивудина, ставудина, зидовудина, амдоксовира, априцитабина, цензавудина, элвуцитабина, рацивира, стампидина, 4′-этинил-2-фтор-2′-дезоксиаденозина, залцитабина, эфавиренза, невирапина, делавирдина, этравирина, рилпивирина, доравирина, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, бевиримата, BMS-955176, ампренавира, фосампренавира, индинавира, лопинавира, нелфинавира, ритонавира, саквинавира, атазанавира, дарунавира, типранавира, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, кобицистата, ритонавира, интерферона-α, пегинтерферона-α, метизазона, рифампицина, имиквимода, ресиквимода, подофиллотоксина, фомивирсена, цидофовира, плеконарила, фавипиравира, галидезивира, ремдезивира, мерицитабина, MK-608, NITD008, мороксидина, тромантадина и триазавирина. В еще одном дополнительном варианте осуществления образец получают у субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции. В конкретном варианте осуществления у субъекта диагностирован или подозревается сепсис. В другом варианте осуществления

к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы и/или вирусы. В еще одном варианте осуществления бактерии выбраны из Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica и/или Yersinia pseudotuberculosis. В дополнительном варианте осуществления грибы выбраны из Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp., Blastomyces spp., Cadophora spp., Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp., Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp., Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi, Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp., Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (или Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp., Trichophyton spp., Trichosporon spp. и/или Zopfia rosatii. В еще одном дополнительном варианте осуществления вирусы выбраны из симплексвируса, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, розеоловируса, лимфокриптовируса, радиновируса, мастаденовируса, α-папилломавируса, β-папилломавируса, Χ-папилломавируса, γ-папилломавируса, мю-папилломавируса, ню-папилломавируса, альфа-полиомавируса, бета-полиомавируса, γ-полиомавируса, дельта-полиомавируса, поксвируса моллюсков, ортопоксвируса, парапоксвируса, α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса, эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса, гамма-ретровируса, дельта-ретровируса, лентивируса, вируса пенистости обезьян, вируса колорадской клещевой лихорадки, ротавируса, сидорнавируса, α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса, норовируса, саповируса, флавивируса, вируса гепатита С, пегивируса, ортогепевируса, кардиовируса, козавируса, энтеровируса, вируса гепатита А, кобувируса, парэховируса, розавируса, саливируса, альфавируса, вируса краснухи, вируса Эбола, вируса Марбурга, хенипавируса, вируса кори, вируса респираторных заболеваний, вируса паротита, метапневмовируса, ортопневмовируса, ледантевируса, лиссавируса, везикуловируса, маммаренавируса, ортохантавируса, ортонайровируса, ортобуньявируса, флебовируса, α-вируса гриппа, β-вируса гриппа, γ-вируса гриппа, куараньявируса, тоготовируса и/или дельтавируса. В определенном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина, 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина. В другом варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина. В еще одном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина и 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина. В конкретном варианте осуществления один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина. В другом варианте осуществления контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 мин до 180 мин. В еще одном варианте осуществления контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 мин до 120 мин. В дополнительном варианте осуществления реагент метки представляет собой антитело, которое связывается с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов. В еще одном дополнительном варианте осуществления антитело связывается с высокой специфичностью с 5-бром-2'-дезоксиуридином или иоддезоксиуридином. В определенном варианте осуществления реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера. В другом варианте осуществления реагент метки содержит азидную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими алкинильную группу, посредством клик-химической реакции. В еще одном варианте осуществления реагент метки содержит алкинильную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими азидную группу, посредством клик-химической реакции. В дополнительном варианте осуществления реагент метки содержит биотиновую группу. В конкретном варианте осуществления реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:

, , , и .

В другом варианте осуществления реагент метки дополнительно содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер. В еще одном варианте осуществления расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер. В дополнительном варианте осуществления кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или цис-аконитильные группы. В еще одном дополнительном варианте осуществления ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер. В конкретном варианте осуществления для выделения или очистки меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот используют аффинный адсорбент. В другом варианте осуществления аффинный адсорбент представляет собой антитело, иммобилизированное на твердой подложке, причем антитело связывается с высокой специфичностью с реагентом метки или с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов. В еще одном варианте осуществления аффинным адсорбентом является стрептавидин или авидин, иммобилизованный на твердой подложке, и при этом реагент метки содержит биотиновую группу. В другом варианте осуществления твердая подложка выполнена из нано- или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет. В еще одном варианте осуществления реагент метки или метку удаляют или отщепляют от выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот до описанных выше стадий (f), (f’) и (g). В дополнительном варианте осуществления определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют с помощью микроматрицы с зондами для нуклеиновых кислот различных микроорганизмов. В еще одном дополнительном варианте уровень экспрессии генов, и/или количество, и/или идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют посредством: (i) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК; (i’) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из обработанного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК; (ii) нанесения меченых продуктов из контрольного образца на первую микроматрицу с зондами, которые содержат уникальные последовательности 16S рРНК вариабельной области 20 или более микроорганизмов; (ii’) нанесения меченых продуктов из обработанного образца на вторую микроматрицу, причем вторая микроматрица является дубликатом первой микроматрицы; и (iii) определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце по результатам визуализации первой микроматрицы и визуализации второй микроматрицы для флуоресцентных продуктов гибридизации и определения каких-либо изменений в интенсивности, месте расположения или отсутствия флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении микроматриц, причем снижение интенсивности флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц, или изменения в месте расположения, или отсутствие флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц указывают на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов). В другом варианте осуществления эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце определяют или подтверждают секвенированием выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и из обработанного образца, причем снижение уровня экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов). В еще одном варианте осуществления выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты из контрольного и обработанного образцов секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом. В дополнительном варианте осуществления секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов проводят посредством: (a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования; (b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов; (c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из контрольного образца; (c’) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из обработанного образца; (d) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из контрольного образца; (d’) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из обработанного образца; и (е) определения любых изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном и обработанном образцах с помощью биоинформатического анализа. В еще одном дополнительном варианте осуществления свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до описанных выше стадий (f), (f ') и (g), и при этом эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) можно установить по результатам определения изменений в уровнях экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов с помощью микроматрицы и/или секвенирования.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0008] На Фиг. 1 представлен пример осуществления порядка действий для обогащения свежесинтезированной ДНК из экспресс-культуры бактерий. Обогащение свежесинтезированной ДНК позволяет проводить генетическую идентификацию живых бактерий в образцах от пациента.

[0009] На Фиг. 2 представлен пример осуществления порядка действий для обогащения свежесинтезированной РНК из экспресс-культуры бактерий. Обогащение свежесинтезированной РНК позволяет оценить экспрессию генов живыми бактериями в образцах от пациента.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0010] В настоящем документе и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа допускают использование форм множественного числа, если контекстом явно не предусмотрено иное. Так, например, использование слова «микроорганизм» подразумевает множество таких микроорганизмов, а использование термина «нуклеозидный аналог» подразумевает ссылку на один или более нуклеозидных аналогов или их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т. д.

[0011] Кроме того, если не указано иное, использование «или» означает «и/или». Аналогичным образом, термины «содержать», «содержит», «содержащий», «включает» и «включающий» являются взаимозаменяемыми и не подразумевают ограничительного характера.

[0012] Следует также понимать, что в тех случаях, когда в описаниях различных вариантов осуществления используется термин «содержащий», специалистам в данной области будет очевидно, что в некоторых конкретных случаях тот или иной вариант осуществления может альтернативно описываться с использованием формулировок «состоящий по существу из» или «состоящий из».

[0013] Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если не дано иное их определение, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что многие способы и реагенты аналогичны или эквивалентны описанным в настоящем документе, в настоящем документе приводятся примеры таких способов и материалов.

[0014] Все публикации, упомянутые в настоящем документе, полностью включаются в настоящий документ путем ссылки с целью описания и раскрытия методологий, которые могут использоваться в связи с описанием, приведенным в настоящем документе. Более того, в отношении любого термина, содержащегося в одной или более публикациях, аналогичного или идентичного термину, в прямой форме определенному в настоящем описании, определение термина, в прямой форме приведенное в настоящем описании, будет иметь приоритет во всех отношениях.

[0015] Следует понимать, что настоящее описание не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами и т. п., описанными в настоящем документе, а потому может изменяться. Используемая в настоящем документе терминология служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не должна рассматриваться как ограничивающая объем изобретения, который определяется исключительно пунктами формулы изобретения.

[0016] За исключением рабочих примеров или в специально оговоренных случаях все числа, отражающие количества ингредиентов или условия реакции, используемые в настоящем документе, следует понимать как дополненные во всех случаях термином «около». Термин «около» при использовании для описания настоящего изобретения в отношении процентных величин означает ± 1%.

[0017] В настоящем документе термин «клик-химия» относится к реакции циклоприсоединения [3+2], проводимой в присутствии катализатора, содержащего медь (I). Катализатор, содержащий медь (I), может содержать ионы меди (I) или функциональную группу, хелатирующую медь(I). Функциональной группой, хелатирующей медь (I), может быть «любая структура, характеризующаяся наличием двух или более полярных групп, которые могут участвовать в образовании комплекса (включающего более одной координационной связи) с ионами меди (I)» (например, см. Salic et al., заявка на патент США № 20070207476 (выше)). К примерам агентов, хелатирующих медь (I), относятся без ограничений, неокупроин- и батокупроиндисульфонат (например, см. Salic et al., заявка на патент США № 20070207476 и Sharpless et al., публикация заявки на патент США № 2003000516671). Реакции циклоприсоединения [3+2] также называют 1,3-диполярными циклоприсоединениями, и они могут происходить между 1,3-диполями и диполярофилами. Примерами 1,3-диполей являются азиды. Примерами диполярофилов являются алкины.

[0018] В настоящем документе термин «краситель» относится к соединению, которое испускает свет, обеспечивая наблюдаемый и регистрируемый сигнал.

[0019] В настоящем документе термин «введение двойной метки» относится к процессу введения метки, в ходе которого в нуклеиновую кислоту вводят метки с использованием двух регистрируемых агентов, которые являются источниками различимых сигналов. Считается, что нуклеиновая кислота, полученная в результате такого процесса введения метки, содержит двойную метку.

[0020] Используемый в настоящем документе термин «алкин с меткой красителя» относится к алкину, который был дополнительно модифицирован для введения в его структуру метки красителя.

[0021] В настоящем документе термины «азид с меткой красителя» и «молекула азида-красителя» относятся к соединению или молекуле с реакционноспособной азидной группой, в которую также введена метка красителя. К примерам относятся, без ограничений: родамин-азид, Alexa Fluor® 350-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 488-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 555-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 568-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 568-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 594-азид, Alexa Fluor® 633-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Alexa Fluor® 647-азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), Cascade Blue® азид (Molecular Probes™/Invitrogen™, г. Карлсбад, штат Калифорния), флуоресцеин-азид, кумарин-азид, BODIPY-азид, цианин-азид или тетраметилродамин (TMR)-азид.

[0022] В настоящем документе термин «циклоалкин с меткой красителя» относится к циклоалкину, который был дополнительно модифицирован для введения в его структуру метки красителя. Термин «циклоалкин» относится к соединениям или молекулам, которые могут вступать в реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения для введения метки в ДНК. В данном контексте к примерам циклоалкинов относятся, без ограничений: циклооктины, дифторциклооктины, гетероциклоалкины, дихлорциклооктины, дибромциклооктины или дииодциклооктины.

[0023] В настоящем документе термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, соединения, молекулы, агента или композиции, которое вызывает соответствующий ответ в клетке, ткани или микроорганизме. Например, в случае обработки микроорганизмов нуклеозидным аналогом эффективное количество представляет собой количество нуклеозида, которое включается в ДНК микроорганизмов.

[0024] В настоящем документе термин «флуорофор» или «флуорогенный» относится к композиции, которая демонстрирует изменение флуоресценции при связывании с интересующим биологическим соединением или аналитом. К предпочтительным флуорофорам настоящего описания относятся флуоресцентные красители с высоким квантовым выходом в водной среде. К примерам флуорофоров, среди прочих, относятся ксантен, индол, бораполиазаиндацен, фуран и бензофуран, цианин. Флуорофоры настоящего изобретения можно заменять, чтобы варьировать растворимость, спектральные свойства или физические свойства флуорофора.

[0025] В настоящем документе термин «метка» относится к химической функциональной группе или белку, которые сохраняют свои исходные свойства (например, спектральные свойства, конформацию и активность) в составе реагента метки настоящего описания и при использовании в способах настоящего описания. Примеры молекул «метки» могут быть напрямую обнаруживаемыми (флуорофор), косвенно обнаруживаемыми (гаптен или фермент) или могут быть использованы для обнаружения и очистки нуклеиновых кислот с введенными нуклеозидами (например, анализ со связыванием биотин-стрептавидин). К таким молекулам «метки» без ограничений относятся полученные путем клик-химической реакции метки биотина, содержащие метки иминобиотин или дестиобиотин, например

, ,

,

и ;

радиоактивные репортерные молекулы, которые можно регистрировать с помощью устройств, измеряющих уровень радиации; пигменты, красители или другие хромогены, которые можно визуально наблюдать или регистрировать с помощью спектрофотометра; спиновые метки, которые можно регистрировать с помощью прибора, анализирующего спиновые метки; флуоресцентные функциональные группы, в которых выходной сигнал генерируется при возбуждении подходящего молекулярного аддукта и которые можно визуализировать при возбуждении светом, поглощаемым красителем, или которые можно регистрировать, например, стандартными флуориметрами или системами визуализации. Молекула «метки» может представлять собой люминесцентное вещество, например люминофор или флуороген; биолюминесцентное вещество; хемилюминесцентное вещество, в котором выходной сигнал генерируется за счет химической модификации сигнального соединения; металлсодержащее вещество; или фермент, в котором происходит зависимая от фермента вторичная генерация сигнала, например образование окрашенного продукта из бесцветного субстрата. «Метка» также может принимать форму химического или биохимического соединения или инертной частицы, включая, без ограничений, коллоидное золото, микросферы, квантовые точки или неорганические кристаллы, например нанокристаллы или люминофоры (например, см. Beverloo et al., Anal. Biochem. 203, 326-34 (1992)). Молекула «метки» также может представлять собой «тагментационную метку» или гаптен, которые используют для «тагментации» нуклеозидного аналога. Затем «тагментационная метка» может связываться с другим реагентом, который селективно связывается с «тагментационной меткой». Например, можно использовать биотин, иминобиотин или дезтиобиотин в качестве «тагментационной метки», а затем использовать авидин или стрептавидин, конъюгированный с субстратом (например, гранулами), меткой или ферментом (например, пероксидазой хрена) для связывания с биотинилированной «тагментационной меткой». В последнем случае можно использовать хромогенный субстрат (например, тетраметилбензидин) или флуорогенный субстрат, такой как Amplex Red или Amplex Gold (Molecular Probes, Inc.). Аналогичным образом тагментационная метка может представлять собой гаптен или антиген (например, дигоксигенин), а для связывания с тагментационной меткой можно использовать ферментативно, флуоресцентно или радиоактивно меченное антитело. Специалистам в данной области известно множество репортерных молекул, и к таковым относятся, без ограничений, частицы, флуоресцентные красители, гаптены, ферменты и их хромогенные, флуорогенные и хемилюминесцентные субстраты и другие репортерные молекулы, описанные в MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS by Richard P. Haugland, 10th Ed., (2005).

[0026] В настоящем документе термины «микроорганизм» или «микроб» используются взаимозаменяемо и относятся к микроскопическому организму, который может существовать одноклеточной форме или в колонии клеток. Для целей настоящего описания термин «микроорганизм», используемый в настоящем документе, включает в себя бактерии, грибы, вирусы, водоросли, археи и простейшие.

[0027] Используемый в настоящем документе термин «пролиферация микроорганизмов» относится к размножению и/или росту микроорганизма (-ов).

[0028] Термины «нуклеозидный аналог» и «нуклеотидный аналог» используются взаимозаменяемо и в настоящем документе относятся к молекуле или соединению, подобным по своей структуре природному нуклеозиду или нуклеотиду, которые включаются в свежесинтезированную микробную нуклеиновую кислоту. Что касается нуклеозидов, то оказываясь внутри клеток, они фосфорилируются до нуклеотидов, а затем встраиваются в образующиеся полимеры нуклеиновых кислот. Нуклеотидам сложно проходить сквозь клеточную мембрану по причине их зарядов, и они более неустойчивы по сравнению с нуклеозидами, а потому для их применения обычно требуется дополнительная стадия и реагенты для трансфекции, чтобы обеспечивать транспорт нуклеотидов через двойной липидный слой. Рассматриваемые нуклеозидные аналоги встраиваются в нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) подобно природному нуклеотиду, причем соответствующий полимеразный фермент распознает аналоги как природные нуклеотиды, и синтез проходит без нарушений. Такие аналоги содержат ряд различных функциональных групп, которые, в конечном счете, используются для регистрации, например галогенированные аналоги (бром, хлор, иод и т. п.), а также аналоги, содержащие биоортогональную функциональную группу, например азидную, алкинильную или фосфиновую.

[0029] В настоящем документе термин «аффиный адсорбент» относится к реагенту, который используют для очистки или выделения образующегося полимера нуклеиновой кислоты, который содержит один или более меченых нуклеотидных аналогов, описанных в настоящем документе. «Аффинный адсорбент», как правило, фиксируется на твердой подложке, такой как гранулы, и селективно связывается с описанной в настоящем документе меткой. Как правило, такая метка выполняет функцию «тагментационной метки», как описано выше. В одном примере осуществления аффинный адсорбент представляет собой стрептавидин, конъюгированный с твердой подложкой, такой как гранулы, суперпарамагнитные микро- или наночастицы, планшет и т. д. В другом варианте осуществления аффиный адсорбент представляет собой антитело или аффинный лиганд другого рода, специфичные к метке или «тагментационной метке», иммобилизованные на твердой подложке, такой как гранулы, суперпарамагнитные микро-или наночастицы, планшет и т. д.

[0030] В настоящем документе термин «лигирование Штаудингера» означает химическую реакцию, разработанную Saxon и Bertozzi (E. Saxon and C. Bertozzi, Science, 2000, 287: 2007-2010), которая представляет собой модификацию классической реакции Штаудингера. Классическая реакция Штаудингера представляет собой химическую реакцию, в ходе которой в комбинации азида с фосфином или фосфитом образуется азаилидное промежуточное соединение, которое при гидролизе дает на выходе фосфиноксид и амин. Реакция Штаудингера представляет собой способ восстановления азида до амина в мягких условиях; и в качестве восстановителя обычно используют трифенилфосфин. В процессе лигирования Штаудингера электрофильная ловушка (как правило, сложный метиловый эфир) соответствующим образом внедряется в триарилфосфиновую арильную группу (как правило, в орто-положении к атому фосфора) и вступает в реакцию с азидом с образованием азаилидного промежуточного соединения, которое в водной среде перестраивается в соединение с амидной группой и фосфиноксидной функциональной группой. Лигирование Штаудингера получило такое название, поскольку в этом процессе происходит лигирование (соединяет/ковалентно связывает) двух исходных молекул вместе, тогда как в классической реакции Штаудингера два продукта после гидролиза не связаны ковалентно.

[0031] Термины «субъект», «пациент» и «отдельное лицо» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и относятся к животному, в частности к человеку, у которого может быть взят образец. Сюда относятся человек и не относящиеся к человеку животные. Термины «не относящиеся к человеку животные» и «не относящиеся к человеку млекопитающие» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и включают в себя всех позвоночных, например млекопитающих, таких как не относящиеся к человеку приматы (в частности, высшие приматы), овцы, собаки, грызуны (например, мышь или крыса), морские свинки, козы, свиньи, кошки, кролики, коровы, и не относящиеся к млекопитающим животные, например куры, земноводные, рептилии и т. д. В одном варианте осуществления субъектом является человек. В другом варианте осуществления субъектом является экспериментальное животное или замена животным в качестве модели заболевания. Термин «млекопитающее» относится к любому животному, отнесенному к классу млекопитающих, включая людей, не относящихся к человеку приматов, домашних и сельскохозяйственных животных и зоопарковых, спортивных или ручных животных, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи, козы, кролики и т. д. Понятие пациент или субъект включает в себя любое подмножество из перечисленных, например все вышеуказанные, но за исключением одной или более групп или видов, таких как люди, приматы или грызуны. Субъект может быть мужского или женского пола. Субъект может быть полностью развитым субъектом (например, взрослый), или субъектом, проходящим процесс развития (например, ребенок, младенец или плод).

[0032] Живые, пролиферирующие микроорганизмы (например, бактерии водоросли, археи, простейшие и грибы) непрерывно синтезируют новую ДНК. В полную противоположность этому микроорганизмы, которые больше не являются жизнеспособными, больше не будут синтезировать ДНК. Несмотря на возможность того, что живые, непролиферирующие микроорганизмы будут синтезировать новую ДНК для восстановления и сохранения своих геномов, скорость синтеза новой ДНК будет гораздо ниже, чем скорость синтеза у живых, пролиферирующих микроорганизмов. В настоящем описании предложены методологии и технологии, в которых используют указанные выше различия в синтезе ДНК, чтобы быстро и эффективно идентифицировать живые, пролиферирующие микроорганизмы в образце, например в образце крови пациента или образце из окружающей среды; или в образце продукта питания с подозрением на загрязнение. В частности, методологии и технологии, представленные в настоящем документе, позволяют идентифицировать живые, пролиферирующие микроорганизмы в образце независимо от того, содержит ли он дополнительно или загрязнен нежизнеспособными или непролиферирующими микроорганизмами. Более конкретно методологии и технологии, представленные в настоящем документе, позволяют селективно обогащать и секвенировать свежесинтезированную микробную ДНК, полученную от одного или более микроорганизмов в образце, что позволяет идентифицировать живые, пролиферирующие микроорганизмы, содержащиеся в образце.

[0033] В описании также приводятся способы и композиции, которые можно использовать для селективного обогащения ДНК и РНК конкретного организма или аналогичной группы организмов в смешанной популяции. Например, для приложений, связанных с удалением нуклеиновых кислот хозяина, необходимо проводить обогащение ДНК или РНК инфицирующего организма, отделяя их от фона ДНК или РНК инфицированного хозяина. Способы позволяют быстро обогащать ДНК и/или РНК целевых организмов (например, бактерий) из смешанной популяции для идентификации целевого организма. Обогащение требует таких условий, которые позволяли бы синтезировать ДНК и/или РНК только целевым организмам. Например, для селективного ингибирования целевой популяции или субпопуляции в образце можно использовать условия среды, температуру и/или специфические ингибиторы.

[0034] В качестве примера, можно взять образец крови пациента с сепсисом или с подозрением на сепсис и культивировать в условиях, при которых происходит ингибирование синтеза ДНК и/или РНК клетками млекопитающих в образце крови, тогда как бактериальные клетки в образце могут продолжать синтезировать ДНК и/или РНК. За счет этого происходит селективное введение метки в бактериальную ДНК и/или РНК. В одном варианте осуществления образец крови можно выделить и нанести на планшет или культивировать в бульоне Лурия - Бертани или в других бактериальных средах так, чтобы клетки млекопитающих прекратили синтез ДНК и/или РНК (или чтобы синтез ДНК и/или РНК в них существенно снизился), в то же время популяция микроорганизмов будет продолжать синтезировать ДНК и РНК, что приведет к селективному встраиванию, например, EdU. В другом варианте осуществления температура посева крови может быть снижена, причем репликация и синтез в клетках млекопитающих будут ингибироваться, в то время как при возврате к более высокой температуре будет продолжаться или возобновляться только репликация и синтез в микроорганизмах. Температура может быть снижена в течение периода времени от нескольких минут до нескольких часов. В другом варианте осуществления можно использовать низкомолекулярный ингибитор синтеза ДНК и/или РНК, селективно нацеленный на механизмы синтеза ДНК и/или РНК млекопитающих. Например, из гриба Amanita получают один из ингибиторов, называемый альфа-аманитином, и из-за него ежегодно погибают около ста неразборчивых грибников. Ингибиторы РНК-полимеразы могут быть специфичными к отдельному классу организмов. Альфа-аманитин, например, влияет на высшие эукариоты, но не оказывает никакого эффекта на бактерии. И наоборот, некоторые лекарственные средства оказывают специфическое воздействие на бактериальную РНК-полимеразу. Наиболее известным из них является рифампин, который вырабатывается грибами и в настоящее время используется в качестве противотуберкулезного лекарственного средства в форме производного рифампина - рифампицина (Rif). Rif проявляет специфичность к бактериальным РНК-полимеразам. Подобная специфичность ингибиторов проявляется по двум причинам. Во-первых, ингибиторы часто вырабатываются одним организмом для уничтожения другого, и продуцирующий организм должен вырабатывать ингибитор, который не приводит к его собственной гибели. Во-вторых, ингибиторы, как правило, связываются с менее консервативными участками фермента, где вариации последовательности могут препятствовать их воздействию на все РНК-полимеразы.

[0035] В описании также представлены варианты осуществления, относящиеся к удалению нуклеиновых кислот хозяина из образца до идентификации продолжающегося синтеза микробных нуклеиновых кислот с использованием способов настоящего описания. Такие методики и композиции для удаления нуклеиновых кислот хозяина относятся, например, к селективному расщеплению немикробных нуклеиновых кислот в образце, содержащем как микробные нуклеиновые кислоты, так и немикробные нуклеиновые кислоты, так что образец значительно обогащается микробными нуклеиновыми кислотами. К примерам способов удаления нуклеиновых кислот хозяина относятся описанные в Feehery et al., PLoS ONE 8:e76096 (2013); Sachse et al., Journal of Clinical Microbiology 47:1050-1057 (2009); Barnes et al., PLoS ONE 9(10):e109061 (2014); Leichty et al., Genetics 198(2):473-81 (2014)); Hasan et al., J Clin Microbiol 54(4):919-27 (2016); и Liu et al., PLoS ONE 11(1):e0146064 (2016); описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Кроме того, доступны также имеющиеся на рынке наборы для удаления нуклеиновых кислот хозяина, в том числе NEBNext Microbiome DNA Enrichment™ Kit, Molzym MolYsis Basic™ kit и MICROBEEnrich™ Kit.

[0036] В некоторых вариантах осуществления в способах и композициях для удаления нуклеиновых кислот хозяина, описанных в настоящем документе, используются преимущества свойств, связанных с немикробными нуклеиновыми кислотами, включая метилирование по остаткам CpG и взаимодействие со связывающими ДНК белками, такими как гистоны. Например, в конкретном варианте осуществления в способах и композициях для удаления нуклеиновых кислот хозяина можно использовать белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, который селективно связывается с немикробными нуклеиновыми кислотами (например, гистоны, рестрикционные ферменты). В дополнительном варианте осуществления способы и композиции для удаления нуклеиновых кислот хозяина могут включать рекомбинантный белок, который селективно связывается с немикробными нуклеиновыми кислотами, и который также селективно разлагает немикробные нуклеиновые кислоты, то есть такой рекомбинантный белок содержит как домен, связывающий немикробную нуклеиновую кислоту, так и домен нуклеазы. В конкретном варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, представляет собой гистон. Гистоны обнаруживаются в ядрах эукариотических клеток, а также в некоторых археях, а именно Thermoproteales и Euryarchaea, но не в бактериях или вирусах. В дополнительном варианте осуществления связанные с гистоном немикробные нуклеиновые кислоты можно затем удалять из образца с использованием субстрата, содержащего аффинный агент, селективно связывающийся с гистонным белком, то есть с гистон-связывающим доменом. К примерам аффинных агентов, которые могут связываться с гистонным белком, относятся, без ограничений, хромодомен, Tudor, злокачественная опухоль головного мозга (MBT), гомеодомен растений (PHD), бромодомен, SANT, YEATS, пролин-триптофан-триптофан-пролин (PWWP), соседний с бромодоменом гомологичный домен (BAH), повторы анкриина, повторы WD40, ATRX-DNMT3A-DNMT3L (ADD) или zn-CW. В другом варианте осуществления гистон-связывающий домен может включать в себя домен, который специфически связывается с гистоном из такого белка, как HAT1, CBP/P300, PCAF/GCN5, TIP60, HB01 (ScESA1, SpMST1), ScSAS3, ScSAS2 (SpMST2), ScRTT109, SirT2 (ScSir2), SUV39H1, SUV39H2, G9a, ESET/SETDB1, EuHMTase/GLP, CLL8, SpClr4, MLL1, MLL2, MLL3, MLL4, MLL5, SET1A, SET1B, ASH1, Sc/Sp SET1, SET2 (Sc/Sp SET2), NSD1, SYMD2, DOT1, Sc/Sp DOT1, Pr-SET 7/8, SUV4 20H1, SUV420H2, SpSet 9, EZH2, RIZ1, LSD1/BHC110, JHDM1a, JHDM1b, JHDM2a, JHDM2b, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, CARM1, PRMT4, PRMT5, Haspin, MSK1, MSK2, CKII, Mst1, Bmi/Ring1A, RNF20/RNF40 или ScFPR4, или их гистон-связывающего фрагмента.

[0037] В дополнительном варианте осуществления в описании также предложен белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или домен, связывающийся с нуклеиновой кислотой, которые селективно связываются с ДНК, содержащей метилированный CpG. Динуклеотидный мотив CG («сайты CpG» или «сайты CG») присутствует в участках ДНК, где за цитозиновым нуклеотидом следует гуаниновый нуклеотид в линейной последовательности оснований вдоль направления от ее 5′ до 3′. Островки CpG (или островки CG) представляют собой области с высокой частотой сайтов CpG. Сокращение CpG означает 5′-C-фосфат-G-3′, то есть цитозин и гуанин, разделенные одним фосфатом. Цитозины в CpG-динуклеотидах могут быть метилированы до 5-метилцитозина. Метилирование цитозина встречается по всему геному человека на многих сайтах CpG. Метилирование цитозина на сайтах CG также встречается по всему геному других эукариотов. У млекопитающих, например, от 70% до 80% цитозинов в CpG могут быть метилированными. У интересующих микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы, такое метилирование CpG не происходит, или его уровень значительно ниже, чем метилирование CpG в геноме человека. Поэтому удаления нуклеиновых кислот хозяина можно достичь за счет селективного расщепления ДНК с метилированными CpG.

[0038] В некоторых вариантах осуществления в описании предложен способ удаления нуклеиновых кислот хозяина, в котором используют белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен, который связывается с островками CpG или сайтами CpG. В другом варианте осуществления связывающийся домен содержит белок или его фрагмент, который связывается с островками метилированных CpG. В еще одном варианте осуществления связывающийся домен белка, связывающегося с нуклеиновой кислотой, содержит домен связывающий метил-CpG (MBD). Примером MBD является полипептид, содержащий около 70 остатков, фолдинг которого приводит к сэндвичевой альфа/бета-структуре, содержащей слой скрученного бета-листа с наложенным другим слоем, образованным альфа1-спиралью и шпилькой на С-конце. Оба этих слоя обладают амфипатическими свойствами, причем альфа1-спираль и бета-лист проходят параллельно, а гидрофобные поверхности плотно прилегают друг к другу. Бета-лист состоит из двух длинных внутренних цепочек (бета2 и бета3), расположенных между двумя более короткими наружными цепочками (бета1 и бета4). В дополнительном варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен содержат белок, который выбран из группы, состоящей из MECP2, MBD1, MBD2 и MBD4 или их фрагмента. В еще одном дополнительном варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен содержат MBD2. В определенном варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен содержат фрагмент MBD2. В другом варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен содержат MBD5, MBD6, SETDB1, SETDB2, TIP5/BAZ2A или BAZ2B, или их фрагмент. В еще одном варианте осуществления белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, или связывающийся домен содержат белок метилирования или деметилирования CpG или его фрагмент. В дополнительном варианте осуществления связанные с CpG немикробные нуклеиновые кислоты можно затем удалять из образца с использованием субстрата, содержащего аффинный агент, селективно связывающийся с белком, связывающимся с нуклеиновой кислотой, или связывающимся доменом, которые связываются с островками CpG или сайтами CpG. Примеры аффинных агентов включают антитела или фрагменты антител, которые селективно связываются с белком, связывающимся с нуклеиновой кислотой, или связывающимся доменом, которые связываются с островками CpG или сайтами CpG. Аффинные агенты, содержащие антитела или фрагменты антител, могут быть связаны с субстратом или в альтернативном варианте осуществления сами по себе могут быть связаны со вторым антителом, которое связано с субстратом, тем самым обеспечивая возможность для разделения и удаления не относящихся к микроорганизмам нуклеиновых кислот из образца.

[0039] В другом варианте осуществления в описании предложен способ удаления нуклеиновых кислот хозяина, в котором используют нуклеазу или рекомбинантный белок, содержащий домен нуклеазы, причем нуклеаза расщепляет на фрагменты немикробные нуклеиновые кислоты. В последнем случае рекомбинантный белок может также содержать домен, связывающийся с нуклеиновой кислотой, проявляющий активность белков, связывающихся с нуклеиновой кислотой (например, гистонов, связывающих метил-CpG белков). Нуклеаза или домен нуклеазы могут включать в себя, без ограничений, неспецифическую нуклеазу, эндонуклеазу, неспецифическую эндонуклеазу, неспецифическую экзонуклеазу, хоуминг-эндонуклеазу и рестрикционную эндонуклеазу. В другом варианте осуществления домен нуклеазы получают из любой нуклеазы, причем нуклеаза или домен нуклеазы сами по себе не имеют своей собственной уникальной мишени. В еще одном варианте осуществления домен нуклеазы обладает активностью при слиянии с другими белками. К примерам неспецифических нуклеаз относятся FokI и I-TevI. В некоторых вариантах осуществления доменом нуклеазы является FokI или ее фрагмент. В дополнительном варианте осуществления доменом нуклеазы является I-TevI или ее фрагмент. В еще одном дополнительном варианте осуществления FokI, или I-TevI, или их фрагмент не включает в себя мутаций и/или относится к дикому типу. К дополнительным примерам нуклеаз относятся, без ограничений, дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I), RecBCD эндонуклеаза, T7 эндонуклеаза, T4 эндонуклеаза IV, Bal 31 эндонуклеаза, эндонуклеаза I (эндо I), микрококковая нуклеаза, эндонуклеаза II (эндо VI, экзо III), нейроспоровая эндонуклеаза, S1-нуклеаза, P1-нуклеаза, нуклеаза бобов мунг I, нуклеаза грибов Ustilago (ДНКаза I), AP эндо нуклеаза и эндо R.

[0040] Интересующие микроорганизмы можно идентифицировать в различных образцах, включая, без ограничений, образцы, взятые у пациентов (например, кровь, моча и спинномозговая жидкость), образцы продуктов питания (например, мука, говядина и салат) или образцы окружающей среды (например, почвенные воды и мазки, взятые в здании больницы). Основное преимущество способов, композиций и наборов, описанных в настоящем документе, заключается в том, что жизнеспособный (-е) и/или пролиферирующий (-е) микроорганизм (-ы) в пробе можно идентифицировать без необходимости продолжительного культивирования микроорганизма перед идентификацией. Поэтому микроорганизмы, подобные Treponema pallidum (сифилис), и бактерии из окружающей среды, которые не могут быть культивированы in vitro в обычной культуральной среде или в культуре тканей, можно с легкостью идентифицировать с помощью способов, композиций и наборов настоящего описания.

[0041] Кроме того, в настоящем документе описаны способы введения метки, очистки и секвенирования свежесинтезированных нуклеиновых кислот для идентификации и анализа жизнеспособных микроорганизмов в организме пациента, пище, окружающей среде или другом образце. Способы настоящего описания можно дополнительно использовать для скрининга исследуемых соединений (например, антибиотиков) для определения их воздействия на жизнеспособные микроорганизмы, идентифицированные в образце. В способах, описанных в настоящем документе, используют нуклеозидные аналоги, которые «скармливают» микроорганизмам и вводят в свежесинтезированные или образующиеся нуклеиновые кислоты. Что касается микроорганизмов, любой вид микроорганизмов можно обнаруживать с помощью способов, описанных в настоящем документе, включая бактерии, грибы, вирусы, водоросли, археи и простейшие.

[0042] Бактерии являются прокариотами, и в них нет ядра и отсутствуют органеллы. В семействе бактерий существует два класса: грамположительные бактерии с более толстой клеточной стенкой, и грамотрицательные с более тонким слоем между внутренней и наружной мембранами. Бактерии чрезвычайно разнообразны, и с точки зрения их численности несомненно являются самым успешным организмом на Земле. Бактерии являются единственными микроорганизмами, которые, не причиняя ущерба, могут жить в организме человека, часто способствуя таким функциям организма, как пищеварение. Не считая вирусов, бактерии вызывают наиболее серьезные проблемы, связанные с заболеваниями человека, например сепсисом. К примерам бактерий, которые можно идентифицировать и анализировать с использованием способов, композиций и наборов, описанных в настоящем документе, относятся, без ограничений, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis.

[0043] Грибы относятся к эукариотам, а значит, имеют четко различимые ядро и органеллы. Клетки крупнее, чем у прокариот, таких как бактерии. После достижения определенного уровня роста колонии грибов могут быть видны невооруженным глазом, например плесень на хлебе. Грибы можно разделить на три основные группы: (1) плесневые грибы с ростом нитей (волокон) и образованием многоклеточных структур, (2) дрожжи, которые обычно не образуют волокон и могут быть одноклеточными, и (3) шляпочные грибы с плодовым телом для образования спор. Грибы могут создавать проблемы для иммунодефицитных пациентов и могут быть опасными патогенами для растений. К примерам грибов, которые можно идентифицировать и анализировать с использованием способов, композиций и наборов, описанных в настоящем документе, относятся, без ограничений, Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp., Blastomyces spp., Cadophora spp, Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp., Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp, Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi, Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp., Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (или Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp, Trichophyton spp, Trichosporon spp и Zopfia rosatii.

[0044] Вирусы представляют собой большую группу субмикроскопических инфекционных агентов, которые обычно считаются неживыми чрезвычайно сложными молекулами, которые, как правило, содержат белковую оболочку, окружающую ядро генетического материала с РНК или ДНК, но без полупроницаемой мембраны, которые способны расти и размножаться только в живых клетках и вызывают различные серьезные заболевания у людей, животных и растений. К примерам вирусов, которые могут идентифицироваться и анализироваться с использованием способов, композиций и наборов, раскрываемых в настоящем документе, без ограничений относятся симплексвирус, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, розеоловирус, лимфокриптовирус, радиновирус, мастаденовирус, α-папилломавирус, β-папилломавирус, Χ-папилломавирус, γ-папилломавирус, мю-папилломавирус, ню-папилломавирус, альфа-полиомавирус, бета-полиомавирус, γ-полиомавирус, дельта-полиомавирус, поксвирус моллюсков, ортопоксвирус, парапоксвирус, α-вирус гепатита TTV, β-вирус гепатита TTV, γ-вирус гепатита TTV, цикловирус, гемициркулярный вирус, гемикибивирус, гемивонгвирус, эритровирус, депендовирус, бокавирус, ортогепаднавирус, гамма-ретровирус, дельта-ретровирус, лентивирус, вирус пенистости обезьян, вирус колорадской клещевой лихорадки, ротавирус, сидорнавирус, α-коронавирус, β-коронавирус, торовирус, мамастровирус, норовирус, саповирус, флавивирус, вирус гепатита С, пегивирус, ортогепевирус, кардиовирус, козавирус, энтеровирус, вирус гепатита А, кобувирус, парэховирус, розавирус, саливирус, альфавирус, вирус краснухи, вирус Эбола, вирус Марбурга, хенипавирус, вирус кори, вирус респираторных заболеваний, вирус паротита, метапневмовирус, ортопневмовирус, ледантевирус, лиссавирус, везикуловирус, маммаренавирус, ортохантавирус, ортонайровирус, ортобуньявирус, флебовирус, α-вирус гриппа, β-вирус гриппа, γ-вирус гриппа, куараньявирус, тоготовирус и дельтавирус.

[0045] Водоросли представляют собой более сложную для определения группу организмов, которая, по некоторым определениям, включает как прокариоты, так и эукариоты. В отличие от других микроорганизмов водоросли, как правило, осуществляют фотосинтез и, как правило, присутствуют водной среде. Опасное цветение водорослей (HAB) представляет собой цветение водорослей, которое оказывает негативное воздействие на другие организмы из-за выработки природных токсинов, механического повреждения других организмов или по другим причинам. HAB часто ассоциируется с масштабной гибелью обитателей водной среды и связывается с различными формами отравления моллюсками. HAB присуще токсичным или иным вредным фитопланктонам, таким как динофлагелляты рода Alexandrium и Karenia, или диатомы рода Pseudo-nitzschia. Подобное цветение часто отличается красным или коричневым оттенком, и его обычно называют красными приливами. Способы, композиции и наборы настоящего описания позволяют идентифицировать такие водоросли из образцов, например, образцов окружающей среды.

[0046] Археи относятся к прокариотам с морфологией, сходной с бактериями. Археи отличаются от эукариотов и бактерий своими генетическими, биохимическими и структурными особенностями. Например, археи содержат уникальные флагеллины и липиды, связанные простой эфирной связью, и в их клеточных стенках отсутствует муреин. Археям присущи некоторые общие характеристики с известными патогенами, которые могут отражать способность вызывать заболевание. К таким характеристикам относятся неограниченный доступ в организм хозяина (то есть возможность) и способности продолжительной колонизации и совместного существования с эндогенной флорой в организме хозяина. Выявление анаэробных архей в кишечной, вагинальной и оральной микробной флоре человека демонстрирует их способность колонизировать человеческий организм-хозяин. Способы, композиции и наборы настоящего описания позволяют идентифицировать такие археи из образцов, например образцов окружающей среды, образцов, взятых у субъекта и т. д.

[0047] Термин «простейшие» относится к одноклеточным эукариотам как к свободноживущим, так и к паразитирующим, которые питаются органическими веществами, такими как другие микроорганизмы или органические ткани и отходы. В соответствии с традиционным определением диапазон размеров простейших составляет от всего 1 микрометра до нескольких миллиметров или более. Все простейшие являются гетеротрофами, получающими питательные вещества из других организмов либо за счет их поглощения целиком, либо за счет потребления их органических остатков и отходов жизнедеятельности. Некоторые простейшие питаются посредством фагоцитоза, захвата органических частиц псевдоподиями (как это делают амебы) или поступления пищи через специальное ротоподобное отверстие, называемое цитостомой. Другие питаются посредством осмотрофиии, поглощая растворенные питательные вещества через клеточные мембраны. Многие простейшие патогены являются паразитами человека, вызывающими такие заболевания, как малярия (Plasmodium), амебиоз, лямблиоз, токсоплазмоз, криптоспоридиоз, трихомониаз, болезнь Шагаса, лейшманиоз, африканский трипаносомоз (сонная болезнь), амебную дизентерию, акантамебный кератит и первичный амебный менингоэнцефалит (неглериаз). Способы, композиции и наборы настоящего описания позволяют идентифицировать таких простейших из образцов, например образцов окружающей среды, образцов, взятых у субъекта и т. д.

[0048] Способы настоящего описания обеспечивают идентификацию и анализ перечисленных выше микроорганизмов из образца, в частности, жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов. Как указано выше, образец может происходить из самых различных источников, в том числе от субъектов, из окружающей среды, из продуктов питания и т. д. С композициями, способами и наборами настоящего описания можно использовать любой набор типов образцов, включая, без ограничений, кровь, мочу, слюну, аспират среднего уха, желчь, вагинальные выделения, гной, плевральные выпоты, синовиальную жидкость и абсцессы брюшной полости. Таким образом, способы, композиции и наборы настоящего описания не подразумевают конкретных ограничений по типу и месту отбора образца, взятого у субъекта. Более того, способы, наборы и композиции, описанные в настоящем документе, обеспечивают улучшение по сравнению со стандартными методологиями при идентификации микроорганизмов, вызывающих сепсис у пациента или вызывающих инфекцию мочевыводящих путей у пациента, поскольку способы, наборы и композиции, описанные в настоящем документе, в состоянии значительно быстрее стандартных методологий идентифицировать провоцирующие микроорганизмы. В связи с этим, противомикробный (-е) препарат (-ы) для идентифицированного (-ых) микроорганизма (-ов) можно вводить гораздо раньше, тем самым противодействуя микробной инфекции и устраняя ее более эффективным образом и, по возможности, предотвращая или купируя побочные эффекты, связанные с микробной инфекцией, такие как септический шок, озноб, повышенная температура, боли в теле, изменения умственной способности, утомляемость, недомогание, проблемы с дыханием, аномальные инфекции сердца, воспаление, тошнота и рвота, состояние тревоги и т. д. Кроме того, способы, наборы и композиции, описанные в настоящем документе, могут также определять эффективность противомикробного агента в ингибировании или уничтожении того или иного микроорганизма. Таким образом, если микроорганизм устойчив к конкретному противомикробному агенту, способы, наборы и композиции, описанные в настоящем документе, могут позволить быстро установить этот факт, чтобы можно было попытаться использовать другой противомикробный агент.

[0049] В способах, композициях и наборах настоящего описания могут использоваться нуклеозидные и нуклеотидные аналоги для идентификации синтеза растущей микробной нуклеиновой кислоты. Как более подробно описано ниже, в способах, композициях и наборах настоящего описания может использоваться множество типов нуклеозидных и нуклеотидных аналогов, преимуществом применения которых может быть установление исходного уровня синтеза нуклеиновых кислот и определение изменений скорости синтеза нуклеиновых кислот, например, при добавлении противомикробного агента. Нуклеозиды обычно используют в экспериментах, в ходе которых аналоги добавляют в клеточную культуру или вводят животным, поскольку нуклеозидные аналоги легко захватываются живыми клетками, где они фосфорилируются до нуклеотида, а затем встраиваются в растущий полимер нуклеиновой кислоты. Напротив, нуклеотиды более неустойчивы и более подвержены расщеплению ферментами до или после встраивания в клетки и, как правило, менее стабильны, чем нуклеозиды. Кроме того, из-за дополнительных зарядов фосфатных групп транспорт нуклеотидов в живые клетки осложняется, и для этого обычно требуется стадия трансфекции, чтобы обеспечить достаточную концентрацию нуклеотидов, проходящих через клеточную мембрану. Такой подход не является идеальным для экспериментов in vivo или ex vivo/in vivo, в ходе которых для точной интерпретации результатов воздействие на клетки должно быть сведено к минимуму. По этим причинам приведенное ниже описание по существу относится к нуклеозидам, как к аналогу, добавляемому к клеткам или вводимому животным, однако это ни в коей мере не подразумевает ограничительного характера, и при этом нуклеотиды являются в равной мере важными.

[0050] Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги могут представлять собой аналог любого из четырех оснований ДНК (аденин (A), цитозин (C), гуанин (G) или тимин (T)) или любого из четырех оснований РНК (аденин (A), цитозин (C), гуанин (G) или урацил (U)) и включать в себя их трифосфатные и фосфорамидатные формы. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги встраиваются в свежесинтезированную нуклеиновую кислоту посредством полимераз, присутствующими в микроорганизмах. Нуклеозидные и нуклеотидные аналоги отличаются от нуклеозидов природного происхождения изменениями в фосфатном остове, пентозном сахаре и/или рибозе или дезоксирибозе, которые вводят с использованием методик синтетической химии, например нуклеотид или нуклеозид могут быть изменены таким образом, чтобы содержать регистрируемую метку (например, краситель, флуорофор), биоортогональную функциональную группу (например, функциональную группу, которая участвует в определенных химических реакциях, таких как клик-химические реакции), биомолекулу (например, фермент, антитело, биотин) и т. д., любой из которых может быть использован в способах, композициях и наборах настоящего описания для идентификации растущих полимеров микробных нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления нуклеозидный аналог представляет собой галогенированный аналог, включая, без ограничений, бромированную, хлорированную и иодированную функционалюную группу. Примерами галогенированных аналогов являются, без ограничений, 2’(S)-2’-дезокси-2’-фтор-5-этинилуридин, (2’S)-2’-фтор-5-этинилуридин, 5-бром-2’-дезоксиуридин, 5-бромуридин, 5-иод-2’-дезоксиуридин и 5-иодуридин. Что касается галогенированных аналогов, для связывания с такими аналогами были специально разработаны антитела, которые связываются с ними с высокой аффинностью, например бром-2’-дезоксиуридин и иоддезоксиуридин (см. Dako, г. Карпинтерия, штат Калифорния; BD Bioscience, г. Сан-Диего, штат Калифорния; EMD Biosciences, г. Мэдисон, штат Висконсин). В другом варианте осуществления нуклеозидный или нуклеотидный аналог содержит биоортогональную функциональную группу, включая, без ограничений, азидную, алкинильную или фосфинильную функциональную группу. К примерам нуклеозидных или нуклеотидных аналогов, содержащих биоортогональную функциональную группу относятся, без ограничений, 2-этиниладенозин, N6-пропаргиладенозин, 2'-(O-пропаргил)-аденозин, 3'-(O-пропаргил)-аденозин, 5-этинил-цитидин, 5-этинил-2'-дезоксицитидин, 2'-(O-пропаргил)-цитидин, 3'-(O-пропаргил)-цитидин, 2'-(O-пропаргил)-гуанозин, 3'-(O-пропаргил)-гуанозин, 5-этинил-уридин, 5-этинил-2'-дезоксиуридин, 2'-(O-пропаргил)-уридин, 3'-(O-пропаргил)-уридин, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридин, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридин, 8-азидоаденозин, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозин, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозин, 5-азидометилуридин, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридин, 5-(3-азидопропил)-уридин, 5-азидо-PEG₄-уридин, 5-азидо-PEG₄-цитидин и 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидин.

[0051] В конкретном варианте осуществления нуклеозидный аналог содержит биоортогональную функциональную группу, которая может участвовать либо в клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения, либо в лигировании Штаудингера с функциональной группой реагента метки. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособную биоортогональную функциональную группу вводят в основание нуклеозида. Основанием, содержащим реакционноспособную биоортогональную функциональную группу, может быть пурин (например, аденин или гуанин) или пиримидин (например, цитозин, урацил или тимин). В некоторых вариантах осуществления основанием является урацил; в некоторых таких вариантах осуществления урацил содержит реакционноспособную биоортогональную функциональную группу в 5-положении. В некоторых вариантах осуществления основанием является аденин; в некоторых таких вариантах осуществления аденин содержит реакционноспособную биоортогональную функциональную группу. В определенных вариантах осуществления биоортогональная функциональная группа не связана с основанием напрямую, тогда как в других вариантах осуществления биоортогональная функциональная группа непосредственно ковалентно связана с основанием. В определенных вариантах осуществления реакционноспособная биоортогональная функциональная группа введена в сахар (рибозу и дезоксирибозу) нуклеозида. В определенных вариантах осуществления биоортогональная функциональная группа не связана с сахаром напрямую, тогда как в других вариантах осуществления биоортогональная функциональная группа непосредственно ковалентно связана с сахаром. В определенных вариантах осуществления реакционноспособная биоортогональная функциональная группа связана с фосфатной группой нуклеозида. Сахар, содержащий реакционноспособную биоортогональную функциональную группу, может быть ковалентно связан с пурином (например, аденином или гуанином) или пиримидином (например, цитозином, урацилом или тимином). В определенных вариантах осуществления основанием является урацил, в то время как в других вариантах осуществления основанием является аденин.

[0052] Реакционноспособная биоортогональная функциональная группа может представлять собой 1,3-диполь, например нитрилоксид, азид, диазометан, нитрон или нитрилимин. В определенных вариантах осуществления 1,3-диполем является азид. В альтернативном варианте осуществления реакционноспособная биоортогональная функциональная группа может представлять собой диполярофил, например алкен (например, винил, пропиленил и т. п.) или алкин (например, этинил, пропинил и т. п.). В определенных вариантах осуществления диполярофил представляет собой алкин, такой как, например, этинильная группа.

[0053] Описанные выше биоортогональные функциональные группы не являются природными, но относятся к не оказывающим воздействия биоортогональным химическим функциональным группам, обладающим уникальными химическими функциями, которые могут быть модифицированы в ходе высокоселективных реакций. В частности, в такие встроенные нуклеозиды вводят метку с использованием реагентов метки, содержащих химическую группу, которая селективно образует ковалентную связь с нуклеозидом в среде клетки.

[0054] Для исследования сложных клеточных процессов, включая пролиферацию микроорганизмов, необходима способность отслеживать биомолекулы по мере выполнения ими своих функций в их естественной среде. В последние годы биоортогональные функциональные группы применяли в качестве дополнительного способа мечения биомолекулы. Было описано применение биоортогональных функциональных групп для обнаружения метаболитов и посттрансляционных модификаций с использованием азидной функциональной группы в качестве биоортогональной функциональной группы. После встраивания в целевые биомолекулы, в ходе метаболических процессов или посредством химических модификаций, в азид можно вводить зонды, для чего используют три высокоселективных реакции: лигирование Штаудингера, катализируемое Cu(I) циклоприсоединение азид-алкин или напряженное [3+2] циклоприсоединение (например, см. Agard et al., J Am Chem Soc. 2004 Nov 24;1 26(46):1 5046-7).

[0055] Биоортогональные функциональные группы можно использовать для введения метки в нуклеиновую кислоту посредством встраивания нуклеозидных или нуклеотидных аналогов. Таким образом, можно ввести метку в нуклеиновые кислоты с помощью биоортогонального мечения, такого как лигирование Штаудингера, катализируемое Cu(I) [3+2] циклоприсоединение азидов и алкинов («клик-химическая реакция») или клик-химическая реакция «без меди», и такие процессы независимым образом описаны в работах Barry Sharpless и Carolyn Bertozzi (например, см. Sharpless et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Mar 15;41 (6):1 053-7; Meldal et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057; Agard et al., J Am Chem Soc. 2004 Nov 24;1 26(46):1 5046-7; патент США № 7,122,703; публикация заявки на патент США № 2003000516671). Клик-химическая реакция и лигирование Штаудингера были модифицированы для измерения пролиферации клеток при прямой регистрации встраивания нуклеотидов. См. Salic, et al., Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids, публикации заявок на патент США № 20070207476 и 20070099222 (поданы 27 октября 2006 г.).

[0056] Методики проведения клик-химических реакций для введения метки в нуклеиновые кислоты включают обработку клетки первым нуклеозидным или нуклеотидным аналогом, содержащим реакционноспособную ненасыщенную группу, так что первый нуклеозидный аналог встраивается в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты. Затем на клетку воздействуют реагентом метки, содержащим вторую реакционноспособную ненасыщенную группу, связанную с меткой, так что между первой и второй реакционноспособными ненасыщенными группами происходит [3+2] циклоприсоединение.

[0057] Приведенные ниже описания реакций [3+2] циклоприсоединения для введения метки в микробные нуклеиновые кислоты представлены только в качестве примеров и не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения.

[0058] В одном примере мечения микробной ДНК с помощью клик-химической реакции образцы обрабатывают эффективным количеством модифицированного алкином нуклеозидного аналога, например 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), в течение определенного периода времени, так чтобы обеспечить встраивание EdU в свежесинтезированную ДНК. После введения метки EdU меченая микробная ДНК реагирует в присутствии катализатора, содержащего медь (I), с линкером азид-дисульфид-биотин. Между азидом и встроенным нуклеозидным аналогом образуется ковалентная связь в ходе реакции [3+2] циклоприсоединения, и полученный комплекс затем может быть зафиксирован на субстрате, конъюгированном со стрептавидином (например, гранулы). После промывки субстрата микробную ДНК отделяют от субстрата путем добавления восстановителей, таких как дитиотреитол (DTT). Затем можно определять последовательность микробной ДНК стандартными способами (например, Illumina Nextera DNA Flex с амплификацией библиотеки ПЦР).

[0059] В другом примере мечения микробной ДНК с помощью клик-химической реакции образцы обрабатывают эффективным количеством модифицированного азидом аналога нуклеозида, например 5-азидо-2'-дезоксиурацилом (AzdU), в течение определенного периода времени, так чтобы обеспечить встраивание AzdU в свежесинтезированную ДНК. После мечения AzdU меченая микробная ДНК реагирует в присутствии катализатора, содержащего медь (I), с меченным красителем алкином. В результате реакции [3+2] циклоприсоединения между азидными и алкиновыми функциональными группами образуется ковалентная связь. Затем метку красителя можно регистрировать стандартными способами, включая, без ограничений, проточную цитометрию, флуоресцентную микроскопию, визуализацию, анализы на многолуночном планшете или многопараметрический скрининг.

[0060] В одном примере мечения РНК с помощью клик-химической реакции образцы инкубируют в присутствии эффективного количества модифицированного алкином нуклеозидного аналога, например 5-этинилуридином (EU), в течение определенного периода времени, так чтобы обеспечить встраивание EU в свежесинтезированную микробную РНК. После мечения EU микроорганизмы лизируют и проводят реакцию в присутствии катализатора, содержащего медь (I), с линкером азид-дисульфид-биотин. Между азидом и встроенным нуклеозидным аналогом образуется ковалентная связь в ходе реакции [3+2] циклоприсоединения, и полученный комплекс затем может быть зафиксирован на субстрате, конъюгированном со стрептавидином (например, гранулы). После промывки субстрата РНК отделяют от субстрата путем добавления восстановителей, таких как дитиотреитол (DTT). Проводят обратную транскрипцию РНК в кДНК. Из кДНК можно получать библиотеки секвенирования.

[0061] Один из альтернативных вариантов осуществления клик-химической реакции, преимуществом которого является проведение реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения без катализатора, содержащего медь (I), был описан в работе Bertozzi et al. и представляет собой клик-химическую реакцию «без меди». Bertozzi et al., Compositions and methods for modification of biomolecules, заявка на патент США № 20060110782.

[0062] Например, микроорганизмы можно сначала обрабатывать эффективным количеством модифицированного азидом нуклеозидного аналога, например AzdU, в течение заданного периода времени, так что модифицированный азидом нуклеозидный аналог встраивается в свежесинтезированную микробную ДНК. После добавления AzdU клетки обрабатывают эффективным количеством соединения или молекулы с реакционноспособной циклоалкинильной функциональной группой, так что реакция напряженного [3+2] циклоприсоединения проходит между азидной и циклоалкинильной функциональными группами. Циклоалкин может быть модифицирован таким образом, чтобы дополнительно содержать метку красителя, которую затем можно регистрировать стандартными способами, включая, без ограничений, проточную цитометрию, флуоресцентную микроскопию, визуализацию, анализы на многолуночном планшете или многопараметрический скрининг; биотиновую метку, которую можно использовать с аффинным адсорбентом; фермент пероксидазы хрена (HRP); и т. д. К циклоалкинам, которые можно использовать в реакциях напряженного [3+2] циклоприсоединения для введения метки в ДНК, относятся, без ограничений: циклооктины, дифторциклооктины, гетероциклоалкины, дихлорциклооктины, дибромциклооктины или дииодциклооктины. Для мечения микробной ДНК можно применять другие химические реакции, известные в данной области. Например, азид-фосфиновую химическую реакцию, описанную Bertozzi et al., также известную как лигирование Штаудингера, можно использовать для регистрации встраивания модифицированного азидом нуклеозидного аналога, например AzdU, в свежесинтезированную микробную ДНК. См. Bertozzi et al., Chemoselective ligation, заявка на патент США № 20070037964. Микроорганизмы сначала обрабатывают эффективным количеством модифицированного азидом нуклеозидного аналога, например AzdU, в течение определенного периода времени. Затем на микроорганизмы воздействуют специально сконструированной фосфиновой функциональной группой. Одним примером специально сконструированной фосфиновой функциональной группы является сложный метиловый эфир 2-дифенилфосфанилбензойной кислоты. При использовании азид-фосфиновой химической реакции для введения метки в микробную ДНК специально сконструированная фосфиновая функциональная группа будет дополнительно содержать молекулу красителя, биотиновую функциональную группу, фермент и т. д. После проведения реакции между азидными и фосфиновыми функциональными группами молекулу биотина можно использовать для анализа с аффинным адсорбентом; и т. п.

[0063] Для оценки как исходного уровня пролиферации микроорганизмов, так и последующего изменения пролиферации микроорганизмов в описании дополнительно предложено использовать второй нуклеозидный или нуклеотидный аналог с меткой, которая отличается от введенной в первый использованный нуклеозидный или нуклеотидный аналог. Дополнительно предусмотрена возможность использования третьего и/или четвертого нуклеозидного или нуклеотидного аналогов для оценки эффективности воздействия противомикробного агента (например, антибиотика) на пролиферацию микроорганизмов или экспрессию генов микроорганизмами. Исходный уровень скорости синтеза можно регистрировать путем мечения нуклеиновой кислоты с использованием первого нуклеозидного или нуклеотидного аналога. Нет необходимости удалять первый нуклеозидный или нуклеотидный аналог перед введением второго нуклеозидного или нуклеотидного аналога. Более того, предварительное удаление первого нуклеозидного или нуклеотидного аналога перед введением второго нуклеозидного или нуклеотидного аналога может затруднять точное определение скорости пролиферации микроорганизмов. Кроме того, отсутствие стадии промывки обеспечивает совместимость способа с приложениями высокопроизводительного скрининга (HTS).

[0064] Одно из основных преимуществ композиций, способов и наборов, описанных в настоящем документе, заключается в том, что в отличие от стандартных протоколов для идентификации микроорганизма (-ов) в пробе не требуется продолжительная стадия культивирования. Поскольку в жизнеспособных, пролиферирующих организмах идет постоянное образование ДНК, композиции, способы и наборы настоящего описания могут идентифицировать микроорганизм без применения стадии культивирования для роста микроорганизмов. Напротив, в композициях, способах и наборах настоящего описания используют стадию инкубирования, в ходе которой образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов в течение минимального периода времени, так чтобы нуклеозидные или нуклеотидные аналоги встраивались в образующиеся микробные нуклеиновые кислоты. Соответственно, после получения образца его можно инкубировать в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов в течение около 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 35 мин, 40 мин, 45 мин, 50 мин, 55 мин, 60 мин, 65 мин, 70 мин, 75 мин, 80 мин, 85 мин, 90 мин, 95 мин, 100 мин, 105 мин, 110 мин, 115 мин, 120 мин, 125 мин, 130 мин, 145 мин, 150 мин, 155 мин, 160 мин, 165 мин, 170 мин, 175 мин, 180 мин, 190 мин, 200 мин, 220 мин, 330 мин, 240 мин, 260 мин, 280 мин, 300 мин, 350 мин, 400 мин, 500 мин, 600 мин или в любом диапазоне, который включает в себя или находится между любыми двумя из вышеуказанных моментов времени, включая их дробные приращения.

[0065] В описании дополнительно предложено метить образующиеся микробные нуклеиновые кислоты меткой, содержащей нуклеозидные или нуклеотидные аналоги с реагентами метки одного или более типов. Описанные в настоящем документе реагенты метки специфически связываются с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами. Например, реагентом метки может быть первое антитело, которое может быть конъюгировано с меткой или связано вторым антителом, ковалентно связанным с меткой, причем первое антитело связывается со встроенным нуклеозидным или нуклеотидным аналогом. Примеры таких первых антител могут включать в себя анти-BrdU антитела, анти-ldU антитела и анти-CldU антитела, и все они доступны на рынке от различных поставщиков. Вместе с тем, предусмотрено использование и других антител, которые могут селективно связываться со встроенными нуклеозидными или нуклеотидными аналогами (как описано выше). Что касается второго антитела, такое второе антитело может быть закреплено на субстрате, таком как гранулы или планшет. Поэтому второе антитело может функционировать в качестве аффинного адсорбента, который позволяет выделять или очищать свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты. В альтернативном варианте осуществления реагентами метки могут быть соединения, содержащие функциональные группы (например, азиды), которые сконструированы так, чтобы вступать в химическую реакцию с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами с комплементарными биоортогональными функциональными группами (например, алкинильными группами) и с меткой, такой как функциональная группа красителя, функциональная группа флуорофора, аффинный лиганд (например, GST, биотин, гистидин и т. д.), фермент (например, пероксидаза хрена) и т. п. К примерам реагентов метки, содержащих биотиновую метку, относятся следующие соединения:

, ,

,

и .

[0066] Как уже упоминалось выше, роль метки состоит в возможности визуализации или обнаружения полимера нуклеиновой кислоты, например свежесинтезированной микробной ДНК, после мечения. Как правило, метку (или регистрируемый агент или функциональную группу) выбирают таким образом, чтобы она могла селективно связываться с аффинным адсорбентом, или в альтернативном варианте осуществления могла бы быть источником сигнала, интенсивность которого связана (например, пропорциональна) с количеством меченого полимера нуклеиновой кислоты, например, в анализируемом образце. Соответственно, подразумевается, что для обнаружения, идентификации и количественного определения свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот можно использовать несколько меток, например первая метка может быть связана с аффинным адсорбентом, чтобы обеспечивать выделение свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот, а вторую, третью или более меток можно использовать в качестве источника сигналов, которые могут быть измерены и интенсивность которых соотносится с количеством меченого полимера нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе. Особым преимуществом такого использования множества меток является возможность определения скорости пролиферации или синтеза новых нуклеиновых кислот; или тестирования эффективности введенного агента, например антибиотиков. Более того, реагенты метки могут дополнительно содержать химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер, так что при необходимости метку можно удалять. Можно использовать любое число химически расщепляемых линкеров, но таковым обычно должен быть линкер, который может расщепляться в мягких условиях проведения реакции, такой как кислотно-неустойчивые линкеры, линкеры, неустойчивые в основной среде, диазолинкеры или дисульфидные линкеры. К примерам кислотно-неустойчивых линкеров относятся линкеры, содержащие гидразоновую, енаминовую, енольноэфирную, иминную или цис-аконитильную группы. К примерам линкеров, неустойчивых в основной среде, относятся карбаматные и сложноэфирные линкеры. В альтернативном варианте осуществления расщепляемым линкером может быть ферментативно расщепляемый линкер. К примерам ферментативно расщепляемых линкеров относятся пептидные линкеры или β-глюкуронидоновые линкеры.

[0067] Как описано в настоящем документе, способ идентификации и анализа микроорганизмов в образце дополнительно предусматривает выделение или очистку меченых микробных нуклеиновых кислот. В конкретном варианте осуществления меченые микробные нуклеиновые кислоты можно очищать или выделять с использованием аффинного адсорбента. В таком случае в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты вводят метку с использованием реагента метки, который, как описано в настоящем документе, связывается со встроенным нуклеозидным аналогом и который включает в себя метку, которая может селективно связываться иммобилизованным аффинным адсорбентом. В качестве реагента метки можно использовать антитело или другой тип аффинного лиганда (например, GST, биотин, гистидин и т. д.). В качестве аффинного адсорбента можно использовать второе антитело, специфичное к реагенту метки, или можно использовать другой тип агента или соединения с высокой и селективной аффинностью к реагенту метки. Например, реагентом метки может быть биотинилированная молекула, которая связывается с нуклеозидным аналогом посредством клик-химической реакции, и которая сама по себе может селективно связываться аффинным адсорбентом, содержащим авидин или стрептавидин. Поэтому взаимодействие между биотинилированным реагентом метки и стрептавидиновым аффинным адсорбентом позволяет выделять или очищать «меченые» микробные нуклеиновые кислоты из микробных нуклеиновых кислот «без метки» и других компонентов микроорганизмов. Как правило, аффинный адсорбент иммобилизован на твердой подложке, такой как планшет, гранулы, нано- или микроматериалы (например, магнитные наночастицы).

[0068] В описании также предусмотрено, что композиции, способы и наборы настоящего описания могут обнаруживать эффективность воздействия агента на жизнеспособность, рост и пролиферацию микроорганизмов. Например, противомикробный агент можно добавлять непосредственно в образец, и итоговое воздействие на жизнеспособность, рост и/или пролиферацию микроорганизмов можно устанавливать с использованием способов, описанных в настоящем документе, на основании обнаружения или отсутствия свежесинтезированных нуклеиновых кислот. Для большего контроля результатов образец можно разделять на два образца, «контрольный» образец и «обработанный» образец, причем противомикробный агент добавляют к «обработанному» образцу, а к «контрольному» образцу добавляют контрольную несущую среду, а затем определяют любые различия в образовании свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот между двумя образцами, причем, если в «обработанном» образце оказывается меньше свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот по сравнению с «контрольным» образцом, или они вовсе отсутствуют, такой результат будет указывать на эффективность противомикробного агента. В альтернативном варианте осуществления эффект противомикробного агента в тестируемой системе можно определять при заборе первого образца до введения противомикробного агента и заборе второго, третьего или более образцов в один или более моментов времени после введения противомикробного агента. Например, образец крови можно получать у пациента-человека с сепсисом до и после введения антибиотиков, причем сниженная скорость синтеза или отсутствие свежесинтезированных нуклеиновых кислот указывает на эффективность воздействия антибиотиков на жизнеспособность, рост и/или пролиферацию бактерий, вызывающих сепсис. К примерам противомикробных агентов, которые можно использовать с композициями, способами и наборами настоящего описания без ограничений относятся антибиотики, противогрибковые, противовирусные и противопаразитарные средства. Антибиотики представляют собой класс противомикробных средств, проявляющих активность против бактерий, и относятся к наиболее важному классу противомикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями. Антибиотики широко применяют для лечения и профилактики таких инфекций. Они могут либо уничтожать бактерии, либо подавлять их рост. К примерам антибиотиков, которые можно использовать с композициями, способами и наборами, описанными в настоящем документе, без ограничений относятся пенициллины, например амоксициллин, ампициллин, бакампициллин, карбенициллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин, мезлоциллин, нафциллин, оксациллин, пенициллин G, пенициллин V, пиперациллин, пивампициллин, пивмециллинам, тикарциллин; цефалоспорины, такие как цефацетрил, цефадроксил, цефалексин, цефалоглицин, цефалоний, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефатризин, цефазафлур, цефазедон, цефазолин, цефрадин, цефроксадин, цефтезол, цефаклор, цефамандол, цефметазол, цефоницид, цефотетан, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим, цефузонам, цефкапен, цефдалоксим, цефдинир, цефдиторен, цефетамет, цефиксим, цефменоксим, цефодизим, цефотаксим, цефпимизол, цефподоксим, цефтерам, цефтибутен, цефтиофур, цефтиолен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим, цефклидин, цефепим, цефлупренам, цефоселис, цефозопран, цефпиром, цефкином, цефтобипрол, цефтаролин, цефакломезин, цефалорам, цефапарол, цефканел, цефедролор, цефемпидон, цефетризол, цефивитрил, цефматилен, цефмепидиум, цефовецин, цефоксазол, цефротил, цефсумид, цефурацетим, цефтиоксид; монобактамы, такие как азтреонам; карбапенемы, такие как имипенем, дорипенем, эртапенем и меропенем; макролидные антибиотики, такие как азитромицин, эритромицин, кларитромицин, диритромицин, рокситромицин и телитромицин; линкозамиды, такие как клиндамицин и линкомицин; аминогликозидные антибиотики, такие как амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, паромомицин, стрептомицин и тобрамицин; хинолоновые антибиотики, такие как флумекин, налидиксиновая кислота, оксолиновая кислота, пиромидиновая кислота, пипемидиновая кислота, розоксацин, ципрофлоксацин, эноксацин, ломефлоксацин, надифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, руфлоксацин, балофлоксацин, гатифлоксацин, грепафлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, пазуфлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, тосуфлоксацин, безифлоксацин, делафлоксацин, клинафлоксацин, гемифлоксацин, прулифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин; сульфаниламиды, такие как сульфаметизол, сульфаметоксазол, сульфизоксазол, триметоприм-сульфаметоксазол; тетрациклиновые антибиотики, такие как демеклоциклин, доксициклин, миноциклин, окситетрациклин, тетрациклин и тигексициклин; гликопептидные антибиотики, такие как ванкомицин и тейкопланин; липогликопептидные антибиотики, такие как телаванцин; оксазолидиноновые антибиотики, такие как линезолид и циклосерин; рифамицины, такие как рифампин, рифабутин, рифапентин и рифалазил; туберактиномицины, такие как виомицин и капреомицин; другие антибиотики, такие как бацитрацин, полимиксин В, хлорамфеникол, метронидазол, тинидазол и нитрофурантоин. Противогрибковые агенты представляют собой класс противомикробных средств, проявляющих активность против грибов, и относятся к наиболее важному классу противогрибковых агентов для борьбы с грибковыми инфекциями. Противогрибковые лекарственные средства широко применяют для лечения и профилактики таких инфекций. Они могут либо уничтожать грибы, либо подавлять их рост. К примерам противогрибковых средств, которые можно использовать с композициями, способами и наборами, описанными в настоящем документе, относятся, без ограничений, аллиламиновые противогрибковые средства, такие как аморолфин, бутенафин, нафтифин и тербинафин; имидазольные противогрибковые средства, такие как бифоназол, бутоконазол, клотримазол, эконазол, фентиконазол, кетоконазол, изоконазол, люликоназол, миконазол, омоконазол, оксиконазол, сертаконазол, сульконазол, тиоконазол и терконазол; триазольные противогрибковые средства, такие как албаконазол, эфинаконазол, флуконазол, изавуконазол, итраконазол, посаконазол, равуконазол, терконазол и вориконазол; и тиазольные противогрибковые средства, такие как абафунгин; полиеновые противогрибковые средства, такие как амфотерицин B, нистатин, натамицин и трихомицин; эхинокандины, такие как анидулафунгин, каспофунгин и микафунгин; тиокарбаматные противогрибковые средства, такие как толнафтат; антиметаболитные противогрибковые средства, такие как флуцитозин; бензиламины, такие как бутенафин; другие противогрибковые средства, такие как гризеофульвин, циклопирокс, сульфид селена и таваборол. К противовирусным относятся лекарственные средства, которые предотвращают проникновение, репликацию, распространение и/или созревание вирусов. К примерам противовирусных средств, которые можно использовать с композициями, способами и наборами, описанными в настоящем документе, относятся, без ограничений, противогерпетические средства, такие как ацикловир, бривудин, докозанол, фамцикловир, фоскарнет, идоксуридин, пенцикловир, трифлуридин, видарабин, цитарабин, валацикловир, троматидин и прителивир; противогриппозные агенты, такие как амантадин, римантадин, осельтамивир, перамивир и занамивир; ингибиторы протеазы NS3/4A, такие как асунапревир, боцепревир, цилупревир, данопревир, фалдапревир, глекапревир, гразопревир, нарлапревир, паритапревир, симепревир, совапревир, телапревир, ванипревир, ведропревир и воксилапревир; ингибиторы NS5A, такие как даклатасвир, элбазовир, ледипасвир, одаласвир, омбитасвир, пибрентасвир, равидасвир, рузасвир, саматасвир и велпатасвир; ингибиторы РНК-полимеразы NS5B, такие как беклабувир, дасабувир, делеобувир, филибувир, сетробувир, софосбувир, радалбувир и уприфосбувир; средства против гепатита В, такие как ламивудин, телбивудин, клевудин, адефовир, дизопроксилтенофовир и алафенамидтенофовир; ингибиторы проникновения/слияния, такие как энфувиртид, маравирок, викривирок, ценикривирок, PRO 140, ибализумаб и фостемсавир; ингибиторы обратной транскриптазы, такие как диданозин, эмтрицитабин, ламивудин, ставудин, зидовудин, амдоксовир, априцитабин, цензавудин, элвуцитабин, рацивир, стампидин, 4′-этинил-2-фтор-2′-дезоксиаденозин, зальцитабин, эфавиренз, невирапин, делавирдин, этравирин, рилпивирин и доравирин; ингибиторы интегразы, такие как долутегравир, элвигравир, ралтегравир, BI 224436, каботегравир, биктегравир и MK-2048; ингибиторы созревания, такие как бевиримат и BMS-955176; ингибиторы протеазы, такие как ампренавир, фосампренавир, индинавир, лопинавир, нелфинавир, ритонавир, саквинавир, атазанавир, дарунавир и типранавир; ингибиторы интегразы, такие как долутегравир, элвигравир, ралтегравир, BI 224436, каботегравир, биктегравир и MK-2048; нуклеотидные аналоги/NtRTI, такие как дизопроксилтенофовир, алафенамидтенофовир (TAF); стимуляторы фармакокинетики, такие как кобицистат и ритонавир; и интерфероны, такие как интерферон-α и пегинтерферон-α; другие противовирусные средства, такие как метизазон, рифампицин, имиквимод, ресиквимод, подофиллотоксин, фомивирсен, цидофовир, плеконарил, фавипиравир, галидезивир, ремдезивир, мерицитабин, MK-608, NITD008, мороксидин, тромантадин и триазавирин.

[0069] Композиции, способы и наборы, описанные в настоящем документе, также позволяют идентифицировать микроорганизмы в образце за счет идентификации свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот с использованием микроматрицы, содержащей зонды для нуклеиновых кислот множества разных микроорганизмов. Как правило, на микроматрице будут размещены зонды для нуклеиновых кислот 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000, 100 000 различных микроорганизмов или в любом диапазоне численности, который включает или находится между любыми двумя приведенными выше значениями, включая их дробные приращения. Зонды, как правило, выполнены таким образом, чтобы их последовательности были комплементарны сегментам одного или более геномов целевого организма (например, 16S рРНК). Олигонуклеотиды можно наносить на матрицу механическим осаждением, распылять через модифицированную головку струйного принтера или синтезировать in situ в ходе последовательности фотокатализируемых реакций. Зонды размещают на матрице в форме прямоугольной решетки «элементов», каждый из которых содержит множество копий одного и того же олигонуклеотида. Плотность элементов на матрице меняется в зависимости от платформы, от 20 000 точек на планшете для стандартной точечной матрицы до нескольких миллионов для таких платформ, как NimbleGen и Affymetrix, где используются олигонуклеотиды синтезированные in situ. Матрицы могут быть разграничены прокладкой на подсекции, что позволяет тестировать сразу несколько образцов на одном планшете. Дублирующиеся элементы, рассредоточенные случайным образом по матрице, можно использовать для коррекции несоответствий, вызванных царапинами и пространственными эффектами. В некоторые матрицы включают зонды отрицательного контроля со случайными последовательностями для формирования порогового уровня коррекции фонового шума. В предшествующем уровне техники были описаны матрицы для обнаружения любого числа патогенов, в том числе ViroChip (Wang D. et al., PLoS Biol. 2003; 1:E2); микроматрицы для повторного секвенирования патогенов (Leski T. et al. PLoS ONE. 2009; 4:e6569); универсальная микроматрица для обнаружения (Belosludtsev Y. et al., BioTechniques. 2004; 37:654-8,66); GreeneChip (Quan et al., J Clin Microbiol. 2007; 45:2359-64); и матрица Lawrence Livermore для обнаружения микроорганизмов (Gardner S. et al. BMC Genomics. 2010; 11:668). Например, матрица Lawrence Livermore для обнаружения микроорганизмов содержит зонды для почти 6000 вирусов и 15 000 бактерий, а также для грибов и простейших организмов. После нанесения свежесинтезированной микробной ДНК на микроматрицу будет наблюдаться флуоресценция любого зонда, который регистрирует свою специфическую последовательность, и она будет считываться сканером. Необработанные данные сканера затем анализируют с помощью алгоритмов. Для идентификации большого числа нуклеотидных последовательностей или зондов, являющихся отличительными признаками микробов, используют методы биоинформатики.

[0070] Композиции, способы и наборы, описанные в настоящем документе, также позволяют идентифицировать микроорганизмы в образце за счет секвенирования свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот со встроенными нуклеозидными или нуклеотидными аналогами настоящего описания. Для секвенирования свежесинтезированной микробной ДНК или микробной РНК, которая прошла обратную транскрипцию в кДНК, можно использовать множество методологий секвенирования, в том числе методики секвенирования, основанные на методе секвенирования путем обрыва дидезокси-цепи по Сэнгеру, in vitro транспозиция, платформы секвенирования следующего поколения, включая приборы 454 FLX™ или 454 TITANIUM™ (Roche), анализатор генома SOLEXA™ (Illumina), одномолекулярный секвенатор HELISCOPE™ (Helicos Biosciences) и секвенатор ДНК SOLID™ (Life Technologies/Applied Biosystems), а также другие платформы по-прежнему находящиеся в стадии разработки такими компаниями, как Intelligent Biosystems и Pacific Biosystems. Несмотря на то, что химические реакции, на основании которых формируется информация о последовательности, разнятся для различных платформ секвенирования следующего поколения, для них всех характерна общая особенность построения данных последовательности из очень большого числа матриц секвенирования, на которых реакции секвенирования проходят одновременно. Как правило, данные всех таких реакций секвенирования собирают с помощью сканера, а затем группируют и анализируют с помощью компьютеров и мощного программного обеспечения биоинформатики. Реакции секвенирования проводят, считывают, группируют и анализируют в «массово-параллельном» или «мультиплексном» режиме. В свете массово-параллельного характера работы таких приборов потребовалось изменение представлений о том, какие матрицы секвенирования необходимы, и каким образом их формировать, чтобы получать максимально возможные объемы данных секвенирования от этих мощных приборов. Поэтому вместо потребности в геномных библиотеках клонов ДНК в E. coli в настоящее время важно мыслить в категориях систем in vitro для построения библиотек фрагментов ДНК, содержащих набор или популяцию фрагментов ДНК, полученных из целевой ДНК в образце, причем комбинация всех фрагментов ДНК в наборе или популяции демонстрирует последовательности, качественно и/или количественно представляющие последовательность целевой ДНК, из которой были получены фрагменты ДНК. Действительно, в некоторых случаях необходимо мыслить в категориях построения библиотек фрагментов ДНК, состоящих из множества библиотек фрагментов геномной ДНК, в каждый из которых вводят различные адресные метки или штрихкоды, чтобы обеспечивать идентификацию источника каждого секвенированного фрагмента.

[0071] Как правило, такие способы секвенирования следующего поколения требуют фрагментации геномной ДНК или двухцепочечной кДНК (полученной из РНК) на более мелкие фрагменты оцДНК и введения меток в по меньшей мере одну цепочку или предпочтительно в обе цепочки фрагментов оцДНК. В некоторых способах метки формируют сайты праймирования для секвенирования ДНК с использованием ДНК-полимеразы. В некоторых способах метки также формируют сайты для захвата фрагментов на поверхности, например на грануле (например, для некоторых из этих способов перед эмульсионной ПЦР-амплификацией; например, с использованием способов, описанных в патенте США № 7,323,305). В большинстве случаев библиотеки фрагмента ДНК, используемые в качестве матриц для секвенирования следующего поколения, содержат фрагменты ДНК с 5′- и 3′-меткой или «фрагменты ДНК с двойной меткой». Как правило, современные способы получения библиотек фрагмента ДНК для секвенирования следующего поколения включают фрагментацию целевой ДНК, которую требуется секвенировать (например, целевую ДНК, содержащую геномную ДНК или двухцепочечную кДНК после обратной транскрипции РНК) с использованием ультразвукового диспергатора, распылителя или нуклеазы и связывание (например, посредством лигирования) олигонуклеотидов, состоящих из адапторов или меток с 5′- и 3′-концами фрагментов. В некоторых способах секвенирования следующего поколения в процессе секвенирования используют субстраты кольцевой оцДНК. Например, в заявках на патент США № 20090011943; 20090005252; 20080318796; 20080234136; 20080213771; 20070099208; и 20070072208, поданных Drmanac et al., описано формирование матриц кольцевых оцДНК для массово-параллельного секвенирования ДНК. В заявке на патент США № 20080242560, поданной Gunderson и Steemers, описаны способы, включающие: получение цифровых гранул ДНК (см., например, ФИГ. 8 в заявке на патент США № 20080242560); и/или локус-специфические расщепление и амплификацию ДНК, например геномной ДНК, включая амплификацию с множественным замещением или амплификацию полного генома (например, ФИГ. 17 в упомянутом документе), или гиперразветвленную амплификацию по типу катящегося кольца (RCA) (например, ФИГ. 18 в упомянутом документе) для построения матриц амплифицированной нуклеиновой кислоты (например, ILLUMINA BeadArrays™; ILLUMINA, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США).

[0072] В конкретном варианте осуществления в описании предложено использовать методы секвенирования на основе транспосом для идентификации микроорганизмов в образце. Такие методы секвенирования на основе транспосом описаны в US2014/0162897; US2015/0368638; US2018/0245069; US2018/0023119; WO20122103545; WO20150160895; WO2016130704; WO2019028047; US9574226; EP3161152; описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Количество стадий, необходимых для трансформации целевой нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, в модифицированные адапторные матрицы, готовые к секвенированию следующего поколения, можно свести к минимуму за счет использования фрагментации и тагментации, опосредованных транспозазой. Такой процесс, называемый в настоящем документе «тагментацией», часто включает модификацию целевой нуклеиновой кислоты транспосомным комплексом, содержащим фермент транспозазу в комплексе с парой транспозонов, содержащей одноцепочечную адапторную последовательность и участок двухцепочечной концевой последовательности транспозона, с необязательными дополнительными последовательностями, сконструированными для той или иной конкретной цели. Тагментация приводит к одновременной фрагментации целевой нуклеиновой кислоты и лигированию адаптеров к 5′-концам обеих цепей дуплексных фрагментов нуклеиновой кислоты. Если транспосомные комплексы фиксированы на подложке, после реакции тагментации полученные фрагменты связываются с твердой подложкой (либо непосредственно в случае связанных с 5′-концом транспосомных комплексов, либо посредством гибридизации в случае связанных с 3′-концом транспосомных комплексов). В частности, за счет использования транспозазы и концевых композиций транспозона, описанных в настоящем документе, можно получать библиотеки линейных фрагментов оцДНК с двойной меткой или меченых кольцевых фрагментов оцДНК (и продуктов их амплификации) из целевой микробной ДНК (включая двухцепочечную кДНК, полученную из микробной РНК) для геномного, субгеномного, транскриптомного или метагеномного анализа или анализа экспрессии микробной РНК (например, для использования при получении меченой целевой молекулы для анализа на микроматрице; например для анализа изменения числа копий, для обнаружения и анализа однонуклеотидных полиморфизмов и для обнаружения генов из образцов окружающей среды, например из почвенных или водных источников).

[0073] В конкретном варианте осуществления в методе секвенирования на основе транспосом, описанном в настоящем документе, используют реакцию транспозиции in vitro для одновременного расщепления свежесинтезированной микробной ДНК на фрагменты и введения метки на 5′-конце каждого фрагмента. Реакцию транспозиции in vitro можно проводить посредством сборки с использованием либо отдельно взятой транспозазы и концевых композиций транспозона, либо единичной композиции транспосомы, содержащей стабильный комплекс, образованный транспозазой и концевой композицией транспозона. Таким образом, следует понимать, что в любом методе секвенирования на основе транспосом, в котором описано применение транспозазы и концевой композиции транспозона, также можно использовать транспосомную композицию, полученную из транспозазы и концевой композиции транспозона, и в любом методе секвенирования на основе транспосом, в котором описано применение транспосомной композиции, также можно использовать отдельно взятую транспозазу и концевые композиции транспозона, из которых состоит транспосомная композиция.

[0074] Метод секвенирования на основе транспосом, описанный в настоящем документе, можно использовать для получения библиотеки фрагментов ДНК с меткой из свежесинтезированной микробной ДНК, причем такой метод секвенирования на основе транспосом включает: инкубирование свежесинтезированной микробной ДНК в реакции транспозиции in vitro с по меньшей мере одной транспозазой и концевой композицией транспозона, с которой транспозаза образует комплекс транспозиции, причем концевая композиция транспозона содержит (i) перенесенную цепочку с перенесенной концевой последовательностью транспозона и необязательно дополнительной последовательностью 5′-перенесенной концевой последовательности транспозона, и (ii) цепочку без переноса с последовательностью, комплементарной перенесенной концевой последовательности транспозона, в таких условиях и в течение достаточного времени, при которых может происходить множество вставок в свежесинтезированную микробную ДНК, каждая из которых приводит к соединению первой метки, содержащей перенесенную цепочку или состоящей из нее, с 5′-концом нуклеотида в целевой ДНК, тем самым приводя к фрагментации целевой ДНК и получая популяцию отожженых 5′-меченых фрагментов ДНК, каждый из которых содержит первую метку на 5′-конце; и затем присоединение 3′-концов 5′-меченых фрагментов ДНК к первой метке или ко второй метке, тем самым создавая библиотеку фрагментов ДНК с меткой (например, содержащую либо кольцевые фрагменты оцДНК с меткой, либо 5′- и 3′-меченые фрагменты ДНК (или «фрагменты ДНК с двойной меткой»)). В дополнительном варианте осуществления в вышеописанном методе секвенирования на основе транспосом используют отдельно взятую транспозазу и концевую композицию транспозона, тогда как в других вариантах осуществления метод секвенирования на основе транспосом проводят с использованием транспосомной композиции, содержащей комплекс, образованный между транспозазой и концевой композицией транспозона.

[0075] В описании дополнительно предложена идентификация микроорганизмов с помощью метода секвенирования на основе транспосом, в котором транспосомные комплексы закреплены на твердой подложке. Примером коммерческого продукта, использующего связанные с гранулами транспосомы для секвенирования, является система Nextera™ DNA Flex, поставляемая компанией Illumina®. Систему Nextera™ DNA Flex можно использовать для идентификации микроорганизмов с применением способов, описанных в настоящем документе. Библиотеки фрагментов нуклеиновых кислот могут быть получены способом на основе транспосом, в котором две концевые последовательности транспозона, одна из которых связана с последовательностью метки, и транспозаза образуют транспосомный комплекс. Транспосомные комплексы используют для фрагментации и введения метки в целевые нуклеиновые кислоты в растворе для создания меченой библиотеки, готовой для использования в секвенаторе. Транспосомные комплексы можно иммобилизовать на твердой поверхности, например, за счет биотина, связанного с 5′-концом одной из двух концевых последовательностей. Использование иммобилизованных транспосом обеспечивает существенные преимущества по сравнению с подходами с растворенной фазой за счет уменьшения времени работы и общего времени на подготовку библиотеки, стоимости и потребностей в реагентах, снижения уровня требований к вводимым образцам и обеспечения возможности использования неочищенных или разложившихся образцов в качестве отправной точки для получения библиотеки. Примеры процедур транспозиции и систем для иммобилизации транспосом на твердой поверхности, позволяющих получать однородные по размерам фрагменты и стабильный выход библиотеки, подробно описаны в WO2014/108810 и WO2016/189331, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых способах тагментации с использованием гранул, описанных в публикации PCT № WO2016/189331 и US 2014/093916A1, транспосомы связаны с магнитными гранулами за счет взаимодействия биотин-стрептавидин.

[0076] Как правило, транспосома иммобилизуется на субстрате, например планшете или грануле, за счет ковалентных или нековалентных партнеров по связыванию, например аффинного элемента и аффино связывающегося партнера. Например, транспосомный комплекс иммобилизуют на покрытой стрептавидином грануле за счет биотинилированного линкера, связанного с транспосомным комплексом. Свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты захватываются иммобилизованным транспосомным комплексом, после чего проводят фрагментацию нуклеиновых кислот и введение метки («тагментация»). Меченые фрагменты амплифицируют, интересующие ампликоны необязательно захватываются (например, посредством зондов гибридизации), и меченые фрагменты секвенируют.

[0077] Использование связанных с твердой подложкой транспосомных комплексов для получения библиотеки снижает потребность в нормализации входных данных образцов, используемых в процессе формирования библиотеки, и в нормализации выходных данных библиотеки перед стадиями обогащения или секвенирования. Использование этих комплексов также позволяет получать библиотеки с более унифицированными размерами вставок по сравнению со способами с растворенной фазой даже при использовании различных исходных концентраций образцов. В некоторых вариантах осуществления транспосомные комплексы иммобилизуют на подложке посредством одного или более полинуклеотидов (например, олигонуклеотидов), таких как полинуклеотид (олигонуклеотид), содержащий концевую последовательность транспозона. В некоторых вариантах осуществления транспосомный комплекс можно иммобилизовать с помощью линкера, добавленного к концу последовательности транспозона, например, связывая фермент транспозазу с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления фермент транспозаза и полинуклеотид транспозона (например, олигонуклеотид) иммобилизованы на твердой подложке. Когда речь идет о иммобилизации молекул (например, нуклеиновых кислот, ферментов) на твердой подложке, термины «иммобилизованный», «фиксированный» и «закрепленный» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и предполагается, что, если прямо или косвенно из контекста не следует иное, оба термина охватывают прямое или опосредованное, ковалентное или нековалентное присоединение. В определенных вариантах осуществления настоящего описания ковалентное присоединение может быть предпочтительным, но по существу все, что требуется, это чтобы молекулы (например, нуклеиновые кислоты, ферменты) оставались бы иммобилизованными на подложке или связанным с ней в условиях, в которых предполагается использовать подложку, например в приложениях, требующих амплификации и/или секвенирования нуклеиновых кислот. В некоторых случаях при тагментации гранул транспосомы могут быть связаны с поверхностью гранулы за счет пары лигандов, например аффинного элемента и аффинно связывающегося партнера.

[0078] Технологию на основе транспозонов можно применять для фрагментации ДНК, например, как показано в примере рабочего процесса для наборов подготовки образцов NEXTERA™ XT и FLEX DNA (Illumina, Inc.), в которых свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты обрабатывают транспосомными комплексами, которые одновременно фрагментируют и метят («тагментация») мишень, таким образом создавая популяцию фрагментированных молекул нуклеиновой кислоты, меченных уникальными адапторными последовательностями на концах фрагментов.

[0079] Реакция транспозиции представляет собой реакцию, в которой один или более транспозонов вставляются в целевые нуклеиновые кислоты в случайных сайтах или почти случайных сайтах. Компоненты реакции транспозиции включают в себя транспозазу (или другой фермент, способный к фрагментированию и мечению нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе, такой как интеграза) и транспозонный элемент, который включает в себя двухцепочечную концевую последовательность транспозона, связывающуюся с ферментом, и адапторную последовательность, присоединенную к одной из двух концевых последовательностей транспозона. Одна цепь двухцепочечной концевой последовательности транспозона переносится в одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, а комплементарная цепь концевой последовательности транспозона не переносится (непереносимая последовательность транспозона). При необходимости или по желанию адапторная последовательность может содержать одну или более функциональных последовательностей (например, последовательности праймеров).

[0080] Поэтому в дополнительном варианте осуществления идентификация и анализ микроорганизмов в образце дополнительно включает стадии получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот, включающие: обеспечение твердой подложки, содержащей иммобилизованный на ней транспосомный комплекс, описанный в настоящем документе; и приведение твердой подложки в контакт с выделенными или очищенными свежесинтезированными микробными нуклеиновыми кислотами в условиях, достаточных для фрагментации целевой нуклеиновой кислоты на множество целевых фрагментов и для соединения 3′-конца первого транспозона с 5′-концом целевых фрагментов, чтобы получить множество целевых фрагментов с 5′-меткой. В дополнительном варианте осуществления способ дополнительно включает амплификацию целевых 5′-меченых фрагментов. В еще одном дополнительном варианте осуществления способы дополнительно включают секвенирование одного или более из целевых 5′-меченых фрагментов или амплификацию их продуктов.В некоторых аспектах в настоящем описании предложена библиотека 5′-меченых фрагментов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот, полученных способами, описанными в настоящем документе.

[0081] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены наборы, которые включают по меньшей мере один нуклеозидный аналог и реагент метки настоящего изобретения. Такой набор, как правило, будет также включать в себя инструкции по применению нуклеозидного аналога и реагента метки в одном или нескольких способах, обычно для обнаружения или измерения изменения в синтезе микробной нуклеиновой кислоты.

[0082] В одном примере осуществления набор включает в себя нуклеозидный или нуклеотидный аналог, который содержит биоортогональную функциональную группу, и первый реагент метки, который может участвовать в клик-химической реакции с биоортогональной функциональной группой. К дополнительным компонентам набора относятся аффинные адсорбенты, буферы и другие реагенты для обнаружения и стандарты.

[0083] Приведенные ниже примеры призваны проиллюстрировать, а не ограничивать описание. Несмотря на то, что все они являются характерными примерами возможного использования, в альтернативном варианте осуществления можно применять другие процедуры, известные специалистам в данной области.

ПРИМЕРЫ

[0084] Пример способа обнаружения и идентификации бактерий в образце, полученном от пациента с сепсисом. Методологии и технологии настоящего описания позволяют обнаруживать бактерии у пациента с сепсисом. Как показано на Фиг. 1, образец крови культивируют в среде, содержащей нуклеозидный реагент метки 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU). После короткого периода культивирования (от нескольких минут до нескольких часов) живые клетки, осуществляющие синтез ДНК, встраивают EdU в свои геномы. В данном случае, если необходимо установить резистентность к антибиотикам, в культуральную среду можно включить представляющие интерес антибиотики. После быстрого культивирования клетки затем лизируют, и при необходимости может быть проведена очистка ДНК из лизата. В свежесинтезированную ДНК, содержащую EdU, затем вводят метку биотина, путем клик-реакции с линкером азид-дисульфид-биотин. После введения метки биотина свежесинтезированную ДНК захватывают на гранулы, конъюгированные со стрептавидином. После промывки гранул ДНК отделяют от гранул путем добавления дитиотреитола (DTT). Для идентификации бактерии, продуцирующей ДНК, получают библиотеки секвенирования с использованием стандартных способов (например, Illumina Nextera DNA Flex с ПЦР-амплификацией библиотеки), а затем секвенируют. Биоинформатический анализ последовательностей позволяет идентифицировать бактерии, вызывающие сепсис.

[0085] Пример способа быстрого анализа экспрессии микробных генов в образцах, содержащих живые микроорганизмы. Методологии и технологии настоящего описания также можно использовать для быстрого анализа экспрессии микробных генов в образцах, содержащих живые микроорганизмы (Фиг. 2). Вместо культивирования с EdU образцы культивируют с 5-этинил-уридином (EU), который затем встраивается в свежесинтезированную микробную РНК. После введения метки биотина и очистки РНК с помощью стрептавидина проводят обратную транскрипцию РНК в кДНК. Из кДНК получают библиотеки секвенирования. Проводимое затем секвенирование и биоинформатический анализ обнаруживают экспрессию генов живых микроорганизмов в пробе. Такой анализ экспрессии генов можно использовать, чтобы идентифицировать гены, вызывающие фенотип заболевания, или чтобы определить, отвечает ли микроорганизм на антибиотики. В дополнение к информации об экспрессии генов для идентификации штаммов также можно использовать анализ последовательности РНК. Поскольку РНК синтезируется в живых непролиферирующих микроорганизмах, анализ РНК может позволить идентифицировать загрязняющие или инфекционные микроорганизмы, которые являются жизнеспособными, но не размножаются в культуре.

[0086] Будет очевидно, что возможны различные модификации без отклонения от сущности и объема настоящего описания. Соответственно, нижеследующая формула изобретения охватывает другие варианты осуществления.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ идентификации пролиферирующих микроорганизмов в образце с использованием нуклеозидных или нуклеотидных аналогов. Также предложен способ определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма(ов) в образце с использованием нуклеозидных или нуклеотидных аналогов. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать пролиферирующие микроорганизмы в образце, а также определить эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизмов. 2 н. и 65 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Способ идентификации пролиферирующих микроорганизмов в образце, включающий:

(a) отбор образца, содержащего или предположительно содержащего один или более видов микроорганизмов;

(b) инкубирование образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включены в микробные нуклеиновые кислоты внутри одного или нескольких типов микроорганизмов во время синтеза ДНК;

(c) введение метки в микробные нуклеиновые кислоты путем приведения микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки азид-линкер-биотин, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов, включенными в микробные нуклеиновые кислоты;

(d) выделение или очистку меченых микробных нуклеиновых кислот с использованием аффинного адсорбента стрептавидина или авидина, иммобилизованного на твердой подложке;

(e) расщепление линкера для получения выделенных или очищенных микробных нуклеиновых кислот из аффинного адсорбента; и

(f) определение идентичности пролиферирующих микроорганизмов в образце по результатам секвенирования выделенных или очищенных микробных нуклеиновых кислот.

2. Способ по п. 1, в котором образец получают от субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции.

3. Способ по п. 2, в котором у субъекта диагностирован или подозревается сепсис.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором для стадии (a) полученный образец перед стадией (b) обрабатывают с использованием способа удаления нуклеиновых кислот хозяина, чтобы селективно удалить немикробные нуклеиновые кислоты.

5. Способ по п. 4, в котором способ удаления нуклеиновых кислот хозяина включает:

удаление немикробных нуклеиновых кислот путем:

(а) селективного расщепления немикробной ДНК путем приведения полученного образца в контакт с рекомбинантным белком, содержащим: связывающийся домен, который селективно связывается с немикробными нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном(ами), или с немикробными нуклеиновыми кислотами, содержащими метилированные CpG остатки, и нуклеазный домен, обладающий активностью при расщеплении нуклеиновых кислот; или

(b) использования аффинного агента, связанного с твердой подложкой, который селективно связывается с нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном(ами), или селективно связывается с метилированными CpG остатками немикробных нуклеиновых кислот.

6. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой образец окружающей среды, взятый с природоохранного испытательного участка.

7. Способ по п. 6, в котором проводят тестирование природоохранного участка на предмет загрязнения микроорганизмами.

8. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой образец продукта питания с подозрением на загрязнение микроорганизмами.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы, вирусы, водоросли, археи и/или простейшие.

10. Способ по п. 9, в котором бактерии выбраны из Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica и/или Yersinia pseudotuberculosis.

11. Способ по п. 9, в котором грибы выбраны из Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp., Blastomyces spp., Cadophora spp., Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp., Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp., Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi., Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp., Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (или Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp., Trichophyton spp., Trichosporon spp. и/или Zopfia rosatii.

12. Способ по п. 9, в котором вирусы выбраны из симплексвируса, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, розеоловируса, лимфокриптовируса, радиновируса, мастаденовируса, α-папилломавируса, β-папилломавируса, Х-папилломавируса, γ-папилломавируса, мю-папилломавируса, ню-папилломавируса, альфа-полиомавируса, бета-полиомавируса, γ-полиомавируса, дельта-полиомавируса, поксвируса моллюсков, ортопоксвируса, парапоксвируса, α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса, эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса, гамма-ретровируса, дельта-ретровируса, лентивируса, вируса пенистости обезьян, вируса колорадской клещевой лихорадки, ротавируса, сидорнавируса, α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса, норовируса, саповируса, флавивируса, вируса гепатита С, пегивируса, ортогепевируса, кардиовируса, козавируса, энтеровируса, вируса гепатита А, кобувируса, парэховируса, розавируса, саливируса, альфавируса, вируса краснухи, вируса Эбола, вируса Марбурга, хенипавируса, вируса кори, вируса респираторных заболеваний, вируса паротита, метапневмовируса, ортопневмовируса, ледантевируса, лиссавируса, везикуловируса, маммаренавируса, ортохантавируса, ортонайровируса, ортобуньявируса, флебовируса, α-вируса гриппа, β-вируса гриппа, γ-вируса гриппа, куараньявируса, тоготовируса и/или дельтавируса.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина, 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина и 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 мин до 180 мин.

18. Способ по п. 17, в котором образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 до 120 мин.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера.

20. Способ по п. 1, в котором реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:

, ,

,

и .

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер.

22. Способ по п. 21, в котором расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер.

23. Способ по п. 22, в котором кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или цис-аконитильные группы.

24. Способ по п. 21, в котором ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер.

25. Способ по п. 1, в котором твердая подложка аффинного адсорбента выполнена из нано- или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет.

26. Способ по п. 1, в котором выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом.

27. Способ по п. 26, в котором секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот проводят посредством:

(a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования;

(b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов;

(c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов;

(d) секвенирования библиотеки амплифицированных продуктов; и

(e) определения идентичности пролиферирующих микроорганизмов на основании корреляции последовательностей, полученных из библиотеки амплифицированных продуктов, с базами данных известных последовательностей микроорганизмов с помощью биоинформатического анализа.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до стадии (f) по п. 1, и при этом экспрессию генов пролиферирующих микроорганизмов можно установить на основании анализа уровня экспрессии генных продуктов из свежесинтезированной микробной РНК с помощью микроматрицы и/или секвенирования.

29. Способ определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма(ов) в образце, включающий:

(a) отбор образца, содержащего или предположительно содержащего один или более видов микроорганизмов;

(b) разделение образца на два образца - контрольный образец и обработанный образец;

(с) инкубирование контрольного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в микробные нуклеиновые кислоты внутри одного или нескольких типов микроорганизмов во время синтеза ДНК;

(c’) инкубирование обработанного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов и противомикробного агента, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в микробные нуклеиновые кислоты внутри одного или нескольких типов микроорганизмов во время синтеза ДНК;

(d) введение метки в микробные нуклеиновые кислоты контрольного образца и обработанного образца путем приведения микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов;

(e) выделение или очистку меченых микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и обработанного образца;

(f) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, или идентичности выделенных или очищенных меченых микробных нуклеиновых кислот путем секвенирования в контрольном образце;

(f’) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и идентичности выделенных или очищенных меченых микробных нуклеиновых кислот путем секвенирования в обработанном образце; и

(g) сравнение и определение изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных меченых микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце с уровнем экспрессии генов, и/или количествами, или идентичностью выделенных или очищенных меченых микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце,

причем снижение уровня экспрессии генов микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма(ов).

30. Способ по п. 29, в котором противомикробный агент выбран из антибиотика, противогрибкового и противовирусного средства.

31. Способ по п. 30, в котором антибиотик выбран из амоксициллина, ампициллина, бакампициллина, карбенициллина, клоксациллина, диклоксациллина, флуклоксациллина, мезлоциллина, нафциллина, оксациллина, пенициллина G, пенициллина V, пиперациллина, пивампициллина, пивмециллинама, тикарциллина, цефацетрила, цефадроксила, цефалексина, цефалоглицина, цефалония, цефалоридина, цефалотина, цефапирина, цефатризина, цефазафлура, цефазедона, цефазолина, цефрадина, цефроксадина, цефтезола, цефаклора, цефамандола, цефметазола, цефоницида, цефотетана, цефокситина, цефпрозила, цефуроксима, цефузонама, цефкапена, цефдалоксима, цефдинира, цефдиторена, цефетамета, цефиксима, цефменоксима, цефодизима, цефотаксима, цефпимизола, цефподоксима, цефтерама, цефтибутена, цефтиофура, цефтиолена, цефтизоксима, цефтриаксона, цефоперазона, цефтазидима, цефклидина, цефепима, цефлупренама, цефоселиса, цефозопрана, цефпирома, цефкинома, цефтобипрола, цефтаролина, цефакломезина, цефалорама, цефапарола, цефканела, цефедролора, цефемпидона, цефетризола, цефивитрила, цефматилена, цефмепидиума, цефовецина, цефоксазола, цефротила, цефсумида, цефурацетима, цефтиоксида, азтреонама, имипенема, дорипенема, эртапенема, меропенема, азитромицина, эритромицина, кларитромицина, диритромицина, рокситромицина, телитромицина, клиндамицина, линкомицина, амикацина, гентамицина, канамицина, неомицина, нетилмицина, паромомицина, стрептомицина, тобрамицина, флумекина, налидиксиновой кислоты, оксолиновой кислоты, пиромидиновой кислоты, пипемидиновой кислоты, розоксацина, ципрофлоксацина, эноксацина, ломефлоксацина, надифлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина, пефлоксацина, руфлоксацина, балофлоксацина, гатифлоксацина, грепафлоксацина, левофлоксацина, моксифлоксацина, пазуфлоксацина, спарфлоксацина, темафлоксацина, тосуфлоксацина, безифлоксацина, делафлоксацина, клинафлоксацина, гемифлоксацина, прулифлоксацина, ситафлоксацина, тровафлоксацина, сульфаметизола, сульфаметоксазола, сульфизоксазола, триметоприм-сульфаметоксазола, демеклоциклина, доксициклина, миноциклина, окситетрациклина, тетрациклина, тигециклина, ванкомицина, тейкопланина, телаванцина, линезолида, циклосерина, рифампицина, рифабутина, рифапентина, рифалазила, виомицина, капреомицина, бацитрацина, полимиксина В, хлорамфеникола, метронидазола, тинидазола и нитрофурантоина.

32. Способ по п. 30, в котором противогрибковый препарат выбран из аморолфина, бутенафина, нафтифина, тербинафина, бифоназола, бутоконазола, клотримазола, эконазола, фентиконазола, кетоконазола, изоконазола, люликоназола, миконазола, омоконазола, оксиконазола, сертаконазола, сульконазола, тиоконазола, терконазола, албаконазола, эфинаконазола, флуконазола, изавуконазола, итраконазола, позаконазола, равуконазола, терконазола, вориконазола, абафунгина, амфотерицина B, нистатина, натамицина, трихомицина, анидулафунгина, каспофунгина, микафунгина, толнафтата, флуцитозина, бутенафина, гризеофульвина, циклопирокса, сульфида селена, таваборола.

33. Способ по п. 30, в котором противовирусное средство выбрано из ацикловира, бривудина, докозанола, фамцикловира, фоскарнета, идоксуридина, пенцикловира, трифлуридина, видарабина, цитарабина, валацикловира, троматандина, прителивира, амантадина, римантадина, осельтамивира, перамивира, занамивира, асунапревира, боцепревира, цилупревира, данопревира, фалдапревира, глекапревира, гразопревира, нарлапревира, паритапревира, симепревира, совапревира, телапревира, ванипревира, ведропревира, воксилапревира, даклатасвира, элбасвира, ледипасвира, одаласвира, омбитасвира, пибрентасвира, равидасвира, рузасвира, саматасвира, велпатасвира, беклабувира, дасабувира, делеобувира, филибувира, сетробувира, софосбувира, радалбувира, уприфосбувира, ламивудина, телбивудина, клевудина, адефовира, дизопроксилтенофовира, алафенамидтенофовира, энфувиртида, маравирока, викривирока, ценикривирока, PRO 140, ибализумаба, фостемсавира, диданозина, эмтрицитабина, ламивудина, ставудина, зидовудина, амдоксовира, априцитабина, цензавудина, элвуцитабина, рацивира, стампидина, 4′-этинил-2-фтор-2′-дезоксиаденозина, залцитабина, эфавиренза, невирапина, делавирдина, этравирина, рилпивирина, доравирина, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, бевиримата, BMS-955176, ампренавира, фосампренавира, индинавира, лопинавира, нелфинавира, ритонавира, саквинавира, атазанавира, дарунавира, типранавира, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, кобицистата, ритонавира, интерферона-α, пегинтерферона-α, метизазона, рифампицина, имиквимода, ресиквимода, подофиллотоксина, фомивирсена, цидофовира, плеконарила, фавипиравира, галидезивира, ремдезивира, мерицитабина, MK-608, NITD008, мороксидина, тромантадина и триазавирина.

34. Способ по любому из пп. 29-33, в котором образец получают от субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции.

35. Способ по п. 34, в котором у субъекта диагностирован или подозревается сепсис.

36. Способ по любому из пп. 29-35, в котором к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы и/или вирусы.

37. Способ по п. 36, в котором бактерии выбраны из Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica и/или Yersinia pseudotuberculosis.

38. Способ по п. 36, в котором грибы выбраны из Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp., Blastomyces spp., Cadophora spp., Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp., Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp., Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi., Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp., Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (или Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp., Trichophyton spp., Trichosporon spp. и/или Zopfia rosatii.

39. Способ по п. 36, в котором вирусы выбраны из симплексвируса, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса, розеоловируса, лимфокриптовируса, радиновируса, мастаденовируса, α-папилломавируса, β-папилломавируса, Х-папилломавируса, γ-папилломавируса, мю-папилломавируса, ню-папилломавируса, альфа-полиомавируса, бета-полиомавируса, γ-полиомавируса, дельта-полиомавируса, поксвируса моллюсков, ортопоксвируса, парапоксвируса, α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса, эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса, гамма-ретровируса, дельта-ретровируса, лентивируса, вируса пенистости обезьян, вируса колорадской клещевой лихорадки, ротавируса, сидорнавируса, α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса, норовируса, саповируса, флавивируса, вируса гепатита С, пегивируса, ортогепевируса, кардиовируса, козавируса, энтеровируса, вируса гепатита А, кобувируса, парэховируса, розавируса, саливируса, альфавируса, вируса краснухи, вируса Эбола, вируса Марбурга, хенипавируса, вируса кори, вируса респираторных заболеваний, вируса паротита, метапневмовируса, ортопневмовируса, ледантевируса, лиссавируса, везикуловируса, маммаренавируса, ортохантавируса, ортонайровируса, ортобуньявируса, флебовируса, α-вируса гриппа, β-вируса гриппа, γ-вируса гриппа, куараньявируса, тоготовируса и/или дельтавируса.

40. Способ по любому из пп. 29-39, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина, 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.

41. Способ по любому из пп. 29-40, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина.

42. Способ по любому из пп. 29-41, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N⁶-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG₄-уридина, 5-азидо-PEG₄-цитидина и 5-азидо-PEG₄-2'-дезоксицитидина.

43. Способ по любому из пп. 29-42, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.

44. Способ по любому из пп. 29-43, в котором контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 до 180 мин.

45. Способ по п. 44, в котором контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 до 120 мин.

46. Способ по любому из пп. 29-45, в котором реагент метки представляет собой антитело, которое связывается с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.

47. Способ по п. 46, в котором антитело связывается с высокой специфичностью с 5-бром-2'-дезоксиуридином или иоддезоксиуридином.

48. Способ по любому из пп. 29-47, в котором реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера.

49. Способ по п. 48, в котором реагент метки содержит азидную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими алкинильную группу, посредством клик-химической реакции.

50. Способ по п. 48, в котором реагент метки содержит алкинильную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими азидную группу, посредством клик-химической реакции.

51. Способ по любому из пп. 29-50, в котором реагент метки содержит биотиновую группу.

52. Способ по п. 51, в котором реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:

, ,

,

и .

53. Способ по любому из пп. 29-52, в котором реагент метки дополнительно содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер.

54. Способ по п. 53, в котором расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер.

55. Способ по п. 54, в котором кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или цис-аконитильные группы.

56. Способ по п. 53, в котором ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер.

57. Способ по любому из пп. 29-56, в котором для выделения или очистки меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот используют аффинный адсорбент.

58. Способ по п. 57, в котором аффинный адсорбент представляет собой антитело, иммобилизированное на твердой подложке, причем антитело связывается с высокой специфичностью с реагентом метки или с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.

59. Способ по п. 57, в котором аффинным адсорбентом является стрептавидин или авидин, иммобилизованный на твердой подложке, и при этом реагент метки содержит биотиновую группу.

60. Способ по п. 58 или 59, в котором твердая подложка выполнена из нано- или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет.

61. Способ по любому из пп. 29-60, в котором реагент метки или метку удаляют или отщепляют от выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот до стадий (f), (f’) и (g) по п. 29.

62. Способ по любому из пп. 29-61, в котором определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют с помощью микроматрицы с зондами для нуклеиновых кислот различных микроорганизмов.

63. Способ по п. 62, в котором уровень экспрессии генов, и/или количество, и/или идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют посредством:

(i) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК;

(i’) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из обработанного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК;

(ii) нанесения меченых продуктов из контрольного образца на первую микроматрицу с зондами, которые содержат уникальные последовательности 16S рРНК вариабельной области 20 или более микроорганизмов;

(ii’) нанесения меченых продуктов из обработанного образца на вторую микроматрицу, причем вторая микроматрица является дубликатом первой микроматрицы; и

(iii) определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма(ов) в образце по результатам визуализации первой микроматрицы и визуализации второй микроматрицы для флуоресцентных продуктов гибридизации и определения каких-либо изменений в интенсивности, месте расположения или отсутствия флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении микроматриц,

причем снижение интенсивности флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц, или изменения в месте расположения, или отсутствие флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц указывают на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма(ов).

64. Способ по любому из пп. 29-63, в котором эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма(ов) в образце определяют или подтверждают секвенированием выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и из обработанного образца,

причем снижение уровня экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма(ов).

65. Способ по п. 64, в котором выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты из контрольного и обработанного образцов секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом.

66. Способ по п. 65, в котором секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов проводят посредством:

(a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования;

(b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов;

(c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из контрольного образца;

(c’) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из обработанного образца;

(d) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из контрольного образца;

(d’) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из обработанного образца; и

(е) определения любых изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном и обработанном образцах с помощью биоинформатического анализа.

67. Способ по любому из пп. 29-66, в котором свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до стадий (f), (f') и (g) по п. 29, и при этом эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма(ов) можно установить по результатам определения изменений в уровнях экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов с помощью микроматрицы и/или секвенирования.