Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего Российский патент 2023 года по МПК C12N15/12 C12N15/861 C07K14/47 A61K38/17 A61K48/00 A61P3/04 

Группа изобретений относится к области молекулярной биотехнологии и экспериментальной медицины, в частности к молекулярной медицине, касается нуклеиновой кислоты, предназначенной для снижения массы тела млекопитающего, плазмидного экспрессионного вектора для экспрессии в клетках млекопитающего, способа его доставки и способа снижения массы тела млекопитающего. Группа изобретений может быть использована как терапевтический способ снижения массы тела при ожирении.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время проводят исследования молекулярных механизмов развития ожирения, что обусловливает прогресс в разработке новых стратегий лечения этого заболевания, в частности генной терапии. Генная терапия ожирения предусматривает доставку полинуклеотидной последовательности, которая определяет экспрессию терапевтических генов в соответствующих клетках с целью восстановления гомеостаза. Основные методы генной терапии включают доставку вирусных векторов, невирусные носители, способствующие доставке наследственной информации, а также технологии редактирования генома, такие как нуклеазы с цинковыми пальцами, системы кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками (CRISPR) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (Angelidi A.M. et al., 2022) [1].

Выяснение молекулярных механизмов развития ожирения обусловливает прогресс в разработке новых стратегий лечения этого заболевания. Ожирение на данный момент считается одной из серьезных неразрешенных проблем медицины, в том числе из-за распространенности инфекционных заболеваний среди людей с повышенным индексом массы тела проявляется эффект двойной нагрузки на систему общественного здравоохранения (Pugliese et al., 2022) [2].

Известно, что массу тела можно контролировать с помощью сочетания здорового питания и физической активности, однако гипертрофическое ожирение часто осложнено другими сопутствующими заболеваниями, такими как сахарный диабет 2 типа (СД2), сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), артериальная гипертензия и различные формы артрита (de Resende Guimarães et al., 2019) [3]. В случае, когда больным противопоказаны интенсивные физические нагрузки могут быть разработаны альтернативные подходы для борьбы с ожирением. Одним из таких подходов может стать стимуляция перехода белых жировых клеток в более катаболически активные бежевые (бурые) с помощью нутриентов и препаратов на основе малых молекул, а также перепрограммирование с использованием инструментов генной терапии.

Показано, что постоянная симпатическая стимуляция приводит к образованию локусов, экспрессирующих разобщающий белок термогенин (UCP1), в белой жировой ткани (Cinti S. et al., 1997) [4]. Этот процесс называется побурением (Bartelt and Heeren, 2014) [5]. Бежевые адипоциты морфологически напоминающие бурые адипоциты, которые содержат множество липидных капель и большое количество митохондрий, были обнаружены в белой жировой ткани (Phillips K.J., 2019) [6]. Поскольку аналогично клеткам бурой жировой ткани бежевые клетки экспрессируют UCP1, они способны к термогенезу (Harms M., 2013) [7], (Rui L., 2017) [8]. Учитывая особую роль, которую бурая жировая ткань играет в системном метаболизме, регуляция экспрессии гена UCP1 может иметь ключевое значение (Seale P. et al., 2007) [9].

Из уровня техники известны следующие источники информации.

Известно, что транскрипционный регулятор PRDM16 действует путем связывания со специфическими регуляторными последовательностями генов, таких как: UCP1, CIDEA, а также путем взаимодействия с другими белками, такими как PGC-1α (Seale P. et al., 2007) [9].

 В опубликованном ранее исследовании (Tang R. et al., 2020) было предложено несколько потенциальных мер для обращения вспять метаболической дисфункции, связанной с ожирением. В частности, за счёт улучшения количества или качества скелетных мышц. Масса скелетных мышц модулируется миостатином, членом суперсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и мощным негативным регулятором мышечного роста, а уровень миостатина повышается при ожирении и снижается при физических нагрузках. Фоллистатин (FST), белок, который связывает миостатин и активин, может способствовать усилению формирования мышц и одновременно подавлять воспаление. В исследовании было показано, что доставка FST аденоассоциированным вирусом 9 (AAV9) усиливает формирование мышц и смягчает метаболическое воспаление и остеоартрит коленного сустава, вызванный диетой с высоким содержанием жиров у мышей. AAV-опосредованная доставка FST продемонстрировала снижение уровня воспалительных адипокинов и цитокинов, вызванных ожирением, системно и в синовиальной жидкости суставов. Независимо от диеты, мыши, получавшие генную терапию FST, были защищены от посттравматического остеоартрита и ремоделирования костей, вызванного травмой суставов. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что генная терапия FST может обеспечить многофакторный терапевтический подход к вызванному травмой остеоартритe и метаболическому воспалению при ожирении [10].

Известно, что транскрипционный фактор FOXP4 имеет сайты связывания в регуляторных последовательностях гена UCP1. In silico поиск выявил предполагаемый мотив связывания факторов Forkhead в диапазоне от -479 до -472 от сайта начала транскрипции гена UCP1, кроме того было продемонстрировано, что FOXP4 связывается с этим ответным элементом по данным хроматиновой иммунопреципитации (ChIP) на дифференцированных клетках 10T1/2 (Perie L. et al., 2021) [11].

Известно техническое решение, описанное в американском патенте на изобретение US10711281B2, от 02.08.2013 «Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue» (Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, полезные для преобразования жировой ткани) [12], в котором показано использование аденоассоциированных вирусных векторов (ААВ), которые позволяют доставлять представляющие интерес полинуклеотидные последовательности к конкретным типам жировых клеток и обеспечивать экспрессию трансгена. Использование специфичных для жировой ткани регуляторных элементов по изобретению ограничивает экспрессию представляющих интерес полинуклеотидов либо клетками белой жировой ткани, либо бурой жировой ткани. Другие композиции по изобретению предлагается использовать для введения организм млекопитающих, в том числе и людей, в соответствии с обычными процедурами для фармацевтических субстанций. ААВ по данному изобретению могут представлять собой композицию, адаптированную для внутривенного, подкожного введения или внутривенную смесь с физиологически приемлемым носителем для мышечного введения людям. В примерах реализации изобретения предложено использование различных трансгенов, включая гены секретируемых белков (VEGF, NGF, BDNF, GDNF, EGF, PDGF, aFGF, bFGF, GCSF, эритропоэтин, гормон роста, паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, хорионический гонадотропин человека, активины, ингибины, интерлейкины, цитокины, BMP), а также широкий репертуар генов транскрипционных факторов jun, fos, max, mad, SRF, AP1, AP2, myb, MyoD, миогенин, ETS -домен содержащие белки, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, SP1, C/EBP (CCAAT-связывающие белки), регулируемый интерфероном фактор (IRF-1), WT1 (Wilms tumor 1), STAT, GATA-связывающие белки (например, GATA-3).

Недостатком технического решения является отсутствие в изобретении полинуклеотидных последовательностей, которые могли быть использованы в качестве экспрессионных векторов, кодирующих полипептидные молекулы для лечения заболеваний, связанных с жировой тканью, таких как, например, ожирение и сахарный диабет 2 типа. В том числе не приведены полинуклеотидные последовательности, которые могли быть использованы непосредственно для снижения массы тела.

В американском патенте на изобретение US9074012B2, от 07.07.2015 «Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure» (Молекулярный контроль дифференциации бурого жира и расхода энергии) [13], выбранном за наиболее близкий аналог (прототип) описаны способы и композиции для индукции дифференцировки клеток бурого жира посредством изменения экспрессии гена PRDM16 или активности белка PRDM16. Также предложены способы профилактики или лечения ожирения или расстройства, связанного с ожирением, у субъекта посредством стимуляции экспрессии гена PRDM16 или активности белка PRDM16. Кроме того, представлены способы идентификации соединений, которые способны изменять экспрессию гена PRDM16 или активность белка PRDM16. Описанное изобретение основано на том факте, что экспрессия гена PRDM16 может индуцировать дифференцировку бурого жира у млекопитающих. Повышенная активность бурой жировой ткани у млекопитающих индуцирует экспрессию митохондриальных генов, что стимулирует митохондриальный биогенез и клеточное дыхание. Усиление клеточного дыхания (как общего, так и разобщённого) приводит к увеличению тепловыделения и увеличению затрат энергии. Повышенный расход энергии стимулируют скорость метаболизма млекопитающих. Посредством стимуляции скорости метаболизма можно использовать PRDM16 в качестве мишени для лечения и/или предотвращения ожирения или расстройств, связанных с ожирением.

Недостатком технического решения (прототипа) является то, что предложены способы для модуляции экспрессии или активности PRDM16: пептид, пептидомиметик, небольшие молекулы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, но не геннотерапевтические подходы, предполагающие доставку копии гена для увеличения его экспрессии.

В результате проведенного анализа уровня техники можно сделать вывод о том, что предлагаемая группа изобретений может быть признана соответствующей критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень» до даты испрашиваемого приоритета.

Целью предлагаемого технического решения является создание нуклеиновой кислоты, плазмидного экспрессионного вектора и способов, позволяющих обеспечить снижения массы тела млекопитающего.

Техническим результатом от реализации заявленной группы изобретений является эффективное снижение массы тела млекопитающих, а также увеличение эффективности существующих решений и способов терапии ожирения. Изобретение может быть использовано при терапии наследственного ожирения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанный технический результат реализуется заявленной группой изобретений, включающей следующие объекты:

(a) нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1 и способная стимулировать экспрессию гена UCP1;

(b) экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, представляющий собой экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, и способный стимулировать экспрессию гена UCP1;

(c) способ доставки упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции в жировую ткань шприцем в дозе от 1*10¹⁰ до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани;

(d) способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.

Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий заявленную нуклеиновую кислоту.

Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции.

Способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.

Группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом.

В основе предлагаемого изобретения лежит способность трансгена при доставке с использованием аденоассоциированных вирусных векторов в жировую ткань организма млекопитающего вызывать переход белых жировых клеток в более катаболически активные бежевые жировые клетки.

Следствием этого становится обеспечиваемое настоящей группой изобретений эффективное снижение массы тела массы млекопитающего.

ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей группе изобретений описаны нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего (применимо к таким модельным животным, как мыши, а также собаки, что определяет релевантность по отношению к людям), содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1 и способная стимулировать экспрессию гена UCP1, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, представляющий собой последовательность SEQ ID NO: 2, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, способ доставки упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего и способ снижения массы тела массы млекопитающего.

Указанный технический результат достигается совокупностью существенных признаков, представленной в формуле изобретения.

Технический результат обеспечивается за счет того, что нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержит последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FOXP SEQ ID NO: 1.

Также технический результат обеспечивается за счет того, что экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего содержит вышеупомянутую нуклеиновую кислоту.

Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса.

Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, который может содержать элементы генома аденоассоциированного вируса в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1:

- участок начала репликации ori;

- левый инвертированный концевой повтор ITR;

- цитомегаловирусный промотор CMV promoter;

- последовательность интрона гена β-глобина человека;

- последовательность, кодирующую последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FoxP SEQ ID No:1;

- последовательность сигнала полиаденилирования poly(A);

- правый инвертированный концевой повтор ITR;

- промотор гена устойчивости к ампициллину;

- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR.

Также технический результат обеспечивается за счет того, что способ доставки вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего включает введение экспрессионного вектора путём инъекции.

Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции в жировую ткань.

Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение в жировую ткань млекопитающего шприцем в дозе от 1*10¹² до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани.

Также технический результат обеспечивается за счет того, что способ снижения массы тела массы млекопитающего включает доставку вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР, ТАБЛИЦ, ИНЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.

На фигуре 1 представлена структурная карта плазмидного экспрессионного вектора pAAV-FOXP4, экспрессирующего нуклеотидную последовательность гена FOXP4.

На фигуре 2 показано изменение экспрессии генов в результате трансдукции ААВ (или AAV, т.е. аденоассоциированный вирус).

На фигуре 3 показано снижение массы животных после введения ААВ - отображена сравнительная динамика относительной массы тела мышей Agouti yellow, представляющих собой модель ожирения и диабета 2-го типа, после введения аденоассоциированного вектора, экспрессирующего последовательность, кодирующую FOXP4.

Таблица 1 - Олигонуклеотиды для ПЦР и их последовательности.

Таблица 2 - Олигонуклеотиды для клонирования и их последовательности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения и общая терминология

Далее будут приведены ссылки на определенные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы предлагаемыми объектами изобретения. Подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.

Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей группы изобретений.

Настоящая группа изобретений не ограничивается изложенными в данном документе способами и материалами. В случае, если один или несколько из включенных литературных ссылок, патентов и аналогичных материалов отличается от или противоречит данной заявке, включая, в частности, определенные термины, использование терминов, описанные приемы и т.п., преимущественную силу имеет настоящая заявка.

Далее следует принять во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, могут быть представлены также совместно в одном варианте. И наоборот, разнообразные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, могут быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.

Если представлен диапазон значений, то следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное между верхней и нижней границами этого диапазона и любые другие указанные или промежуточные значения в этом установленном интервале охватываются настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, что также входит в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указано, что диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любое из обоих включенных пределов, также входят в объем изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.

Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное.

Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено.

Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.

Для описания настоящего изобретения используются следующие термины.

Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое значение, какое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение, если не указано иное. Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в изобретение посредством ссылки.

Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны среднему специалисту.

Некоторые из терминов и сокращений используют как нижеследующие:

AAВ - аденоассоциированный вирус (AAV).

Диабет 2 типа - это метаболическое заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией (повышенным содержанием глюкозы в крови) и сниженной чувствительностью тканей к инсулину.

Клетки 3T3-L1 - линия преадипоцитов мыши, способная к дифференцировке.

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.

РНК - рибонуклеиновая кислота.

Нуклеиновая кислота - высокомолекулярное органическое соединение, образованное остатками нуклеотидов.

ПЦР - полимеразная цепная реакция, используется для амплификации ДНК.

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции.

Плазмида pAAV-MCS - это плазмидный экспрессионный вектор, содержащий регуляторные элементы, фланкированные ITR.

Сайты рестрикции - короткие последовательности нуклеотидов в ДНК, распознающиеся и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции.

Транскрипты PPIA - транскрипты гена пептидилпролилизомеразы А, проявляющие высокую стабильность экспрессии.

Экспрессия гена - процесс, в ходе которого наследственная информация о последовательности нуклеотидов в ДНК (последовательность гена) преобразуется в функциональный продукт - РНК или белок.

Экспрессионный вектор - генетическая конструкция, содержащая промотор и другие регуляторные последовательности, обеспечивающие эффективную транскрипцию рекомбинантного гена.

Экспрессионный вектор pAAV-FOXP4 - это плазмидный экспрессионный вектор на основе pAAV-MCS, экспрессирующий нуклеотидную последовательность гена FOXP4.

Agouti yellow - это сублиния мышей породы agouti с мутацией, снижающей активность меланокортиновых рецепторов, с возрастом вызывает гиперфагию, ожирение и диабет второго типа у мышей (A^y мыши).

CMV - цитомегаловирус, элементы генома которого используются для регуляции экспрессии трансгенов.

FOXP4 - транскрипционный фактор 4 семейства FoxP (forkhead box P).

MW - молекулярная масса вещества в Дальтонах.

PBS - фосфатно-солевой буфер (Phosphate Buffered Saline).

SEQ ID NO: 1 - Homo sapiens forkhead box P4 (FOXP4), последовательность, кодирующая транскрипционный фактор 4, семейства FoxP (4 транскриптный вариант, мРНК последовательность ID: NM_001405824.1).

SEQ ID NO: 2 - последовательность экспрессионного вектора, содержащего элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой.

UCP1 - термогенин, разобщающий белок 1, ядерно-кодируемый митохондриальный переносчик протонов и жирных кислот.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Заявлена нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO:1, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, представляющий собой экспрессионный вектор, например, на основе генома аденоассоциированного вируса, в частности, плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO:2, способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора в жировую ткань млекопитающего шприцем, например, в дозе от 1*10¹⁰ до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани, способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.

Осуществляют продукцию аденоассоциированного вирусного вектора с использованием экспрессионного вектора по данному изобретению. Аденоассоциированные вирусные векторы (AAV) получают путем трансфекции суспензионных клеток HEK293. Для трансфекции суспензионные культуры клеток доращивают до концентрации 1*10⁶ клеток/мл. Трансфекцию осуществляют путём внесения трансфекционной смеси в среду для культивирования. Трансфекционную смесь готовят исходя из массы вносимой плазмидной ДНК (пДНК) 1,5 мкг на миллион клеток путем смешивания последовательно добавляемых пДНК pAAV-FOXP4, pHelper (Cell Biolabs, pHelper содержит аденовирусные гены E2A, E4 и VA РНК) и вектора pRC8 (содержит последовательность капсидного белка аденоассоциированного вируса) и раствора полиэтиленимина (PEI, линейный полимер с MW 40000), взятых из массового соотношения пДНК:PEI 1:5.

После предварительного добавления компоненты разбавляют бессывороточной средой, содержимое пробирок перемешивают пипетированием, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут и вносят в среду для культивирования. Трансфицированные клетки инкубируют в течение 4-5 дней при температуре 37°C в шейкерном CO₂-инкубаторе. Далее проводится выделение вирусных векторов, включающее в себя лизис клеточной культуры, осветление и стерильная фильтрация осветлённых лизатов и хроматографическая очистка. Хроматографическая очистка проводится с использованием аффинного сорбента.

Далее осуществляют тангенциальную фильтрацию для перевода в фосфатную буферную систему. В полученном растворе определяют содержание вирусных геномов с использованием полимеразной цепной реакции.

Далее осуществляют введение раствора аденоассоциированных вирусных векторов путём инъекции в жировую ткань млекопитающего шприцем (BD Micro-Fine Plus), в дозе от 1*10¹⁰ до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани.

Материалы и методы

Культивирование суспензионной культуры HEK293

Суспензионные клеточные культуры выращивают на синтетических средах, в частности BalanCD HEK293, не содержащей животных компонентов (Irvine Scientific) в диапазоне концентраций клеток от 1*10⁵ до 3*10⁶ клеток/мл. Клетки HEK293 культивируют в пластиковых колбах Эрленмейера (Corning) и инкубируют при 37°C во влажной модифицированной атмосфере (95% воздуха, 5% CO2). Клетки пассируют дважды в неделю путем добавления свежей среды до достижения концентрации 1*10⁵ клеток/мл.

Продукция аденоассоциированного вируса.

Продукцию аденоассоциированного вируса проводят путем транзиентной трансфекции суспензионной культуры клеток HEK293. Для трансфекции наращивают клетки HEK293 до концентрации 1*10⁶ клеток/мл. Трансфекцию осуществляют путём внесения трансфекционной смеси в среду для культивирования. Трансфекционную смесь готовят исходя из массы вносимой плазмидной ДНК (пДНК) 1,5 мкг на миллион клеток путем смешивания последовательно добавляемых пДНК pAAV-FOXP4, pHelper (Cell Biolabs, pHelper содержит аденовирусные гены E2A, E4 и VA РНК) и вектора pRC8 (содержит последовательность капсидного белка аденоассоциированного вируса) в одну центрифужную пробирку и раствора PEI (линейный полимер с MW 40000, Polysciences) в концентрации 1 мкг/мл, взятой из соотношения пДНК:PEI 1:5 в другую. После предварительного добавления компоненты разбавляют бессывороточной средой, содержимое пробирок перемешивают пипетированием и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.

Для наработки вирусного продукта осуществляют инкубацию для культивирования суспензионной клеточной культуры при температуре 37,0°С, влажности 70 %, содержании СО₂ 5 %, перемешивании 120 об/мин. Через 96-120 часов после трансфекции осуществляют химический лизис клеточной суспензии с использованием 10% полисорбата 20 в течение 1 часа при 37,0°С и перемешивании 250 об/мин. После химического лизиса проводят ферментативную обработку эндонуклеазой Serratia marcescens (собственного производства, 20 единиц активности на мл клеточной культуры) с целью гидролиза свободных нуклеиновых кислот. Полученные лизаты осветляют добавлением диатомита (0,01 г/мл Celite HyFlo Super Cel, Roth), перемешиванием в течение 5 минут при 37.0°C, с последующей стерилизующей фильтрацией лизатов через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. AAV очищают с использованием аффинного сорбента POROS CaptureSelect AAVX Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific) на хроматографе Bio-Rad Quest 10 Plus. Полученный элюат нейтрализуют до pH 7.

Для дальнейшего использования вирусного продукта осуществляют тангенциальную фильтрацию для перевода в PBS на фильтрах с отсечкой 100000 Дальтон (Vivaspin Turbo 15, Sartorius).

Культивирование клеток 3T3-L1.

Клетки выращивают на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 4,5 г/л, Paneco) с добавлением 10% бычьей телячьей сыворотки (NBCS, новозеландское происхождение, Gibco) и 2 мМ L-глутамина (Paneco). Клетки 3T3-L1 высевают на обработанные клеточной культурой пластиковые чашки и инкубируют при 37°C во влажной модифицированной атмосфере (95% воздуха, 5% CO2). Клетки пассируют один раз в неделю по достижении примерно 70% конфлюентности, а среду (DMEM+10%BCS) заменяют каждые 3 дня.

Трансдукция ААV клеток 3T3-L1.

После посева клеток в 48-луночный культуральный планшет (Corning) рассчитывали необходимый объем вирусного элюата (в диапазоне от 10 000 до 100 000 вирусных геномов на клетку). Таким образом, для трансдукции 100 000 клеток с 40 000 вирусных геномов на клетку в лунку вносят 4*10⁹ вирусных геномов. Необходимый объем вирусного элюата добавляют сразу после посева.

Количественная ПЦР.

Тотальную РНК выделяли с помощью реагента для выделения нуклеиновых кислот Лира+ (Биолабмикс) в соответствии с рекомендациями производителя. ДНК гидролизировали безрибонуклеазным набором дезоксирибонуклеаз (Invitrogen), синтезировали комплементарную ДНК используя обратную транскриптазу OT-M-MMuLV-RH (Биолабмикс) и Oligo(dT) в качестве затравки (Invitrogen). Количество выделенной РНК оценивали спектрофотометрически на приборе NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Для проведения количественной полимеразной цепной реакции использовали синтезированную кДНК, готовую смесь 5X SYBR Green qPCR Master Mix (Евроген) и специфические олигонуклеотиды на StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific). Олигонуклеотиды были синтезированы в соответствии с последовательностями UCP1_For, UCP1_Rev, FOXP4_For, FOXP4_Rev, PPIA_For, PPIA_Rev, указанными в Таблице 1.

Таблица 1 - Олигонуклеотиды для ПЦР и их последовательности Название олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида UCP1_For 5’ GTACACCAAGGAAGGACCGA 3’ UCP1_Rev 5’ TTTATTCGTGGTCTCCCAGC 3’ FOXP4_For 5’ GCCTACTTCCGAAGAAACACG 3’ FOXP4_Rev 5’ CCGCTCATCCACAGTCCAC 3’ PPIA_For 5’ CAGACAAAGTTCCAAAGACAG 3’ PPIA_Rev 5’ CATTATGGCGTGTAAAGTCAC 3’

Определяли пороговые циклы (Ct) для положительного контроля (PPIA) и изучаемых генов и рассчитывали относительные уровни РНК исходя из метода сравнения Ct, где ΔCt - это разница между Ct изучаемого гена и Ct PPIA. Величины ΔCt использовали для расчета 2-ΔCt. Все результаты количественной ПЦР получали в трипликатах.

Результаты

Предложенная по данному изобретению нуклеиновая кислота предназначена для снижения массы тела млекопитающего и содержит последовательность гена транскрипционного фактора 4 семейства FOXP (FOXP4) SEQ ID NO: 1. Результат достигается путём создания последовательности нуклеотидов для экспрессии гена FOXP4 в клетках жировой ткани.

В другой неограничивающей реализации изобретения предложен экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.

Ещё в одном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор, представляющий собой, например, плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии, например, с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой следующие элементы:

- участок начала репликации ori;

- левый инвертированный концевой повтор ITR;

- цитомегаловирусный промотор CMV promoter;

- последовательность интрона гена β-глобина человека;

- последовательность, кодирующую последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FoxP SEQ ID No:1;

- последовательность сигнала полиаденилирования poly(A);

- правый инвертированный концевой повтор ITR;

- промотор гена устойчивости к ампициллину;

- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR.

На фигуре 1 представлена структурная карта плазмидного экспрессионного вектора pAAV-FOXP4, экспрессирующего нуклеотидную последовательность гена FOXP4. ДНК с нуклеотидной последовательностью FOXP4 была синтезирована и встроена в плазмиду pAAV-MCS по сайтам рестрикции (EcoRI и HindIII) под контролем CMV промотора.

В другой неограничивающей реализации изобретения предложен способ доставки вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции шприцем, например, в дозе от 1*10¹⁰ до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани.

В другой неограничивающей реализации изобретения предложен способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.

Сущность и промышленная применимость заявленной группы изобретений поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.

Пример 1

Для осуществления заявленного технического результата был создан экспрессионный вектор, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой. На первом этапе использовали прямой праймер для FOXP4 и обратный праймер FOXP4 (pAAV_EcoRI_FOXP4_For и pAAV_HindIII_FOXP4_Rev, последовательность в Таблице 2), в качестве матрицы использовали полученную ранее плазмиду pCS2+FOXP4. Программа амплификации: предварительное плавление ДНК при 98°С в течение 30 секунд, 15 циклов амплификации, включающих плавление в течение 10 секунд при 98°С, отжиг в течение 30 секунд при 55°С и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд, конечную элонгацию при 72°С в течение 3 минут.

Таблица 2 - Олигонуклеотиды для клонирования и их последовательности Название олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида pAAV_EcoRI_FOXP4_For 5’ CATCTGAATTCATGATGGTGGAGTCTGCATC 3’ pAAV_HindIII_FOXP4_ Rev 5’ CATCTAAGCTTTAGGACATGTCCTCTCCTCC 3’

Для последующих манипуляций использовали очищенный продукт ПЦР 1 этапа. Полученный в результате амплификации фрагмент кодирующей последовательности гена FOXP4 встраивали в вектор pAAV-CMV-MCS. Реакцию рестрикции проводили по методике, рекомендуемой производителем pAAV-CMV-MCS с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII (New England Biolabs Inc., США). Для лигирования использовали 10X T4 DNA Ligation Buffer и T4 DNA Ligase (New England Biolabs Inc., США). Реакцию лигирования очищенного после рестрикиции фрагмента и вектора проводили согласно рекомендованному протоколу производителя в объёме 20 мкл при 16°С в течение 16 часов (ночи). Инактивирование фермента проводили при 65°С в течение 10 минут.

Трансформацию клеток проводили по стандартному протоколу [14]. Для проведения трансформации аликвоту химически компетентных клеток Escherichia coli DH5α извлекали из морозильной камеры (-80°С) и помещали в лёд для медленного оттаивания. К оттаявшим клеткам добавляли по 5 мкл охлажденной лигазной смеси и инкубировали во льду 30 мин. Проводили тепловой шок в течение 30 сек при 42°С на водяной бане, затем перемещали пробирку с клетками в лед и инкубировали 2 мин. Затем добавляли к клеткам по 1 мл предварительно нагретой до 37°С питательной среды SOC и инкубировали в термостате в течение 1 часа при 37°С и перемешивании со скоростью 180-200 об/мин. Высевали суспензию трансформированных клеток на предварительно подсушенные в термостате при 37°С чашки Петри с LB-агаром и ампициллином по 100 мкл на чашку. Культивировали клетки в термостате при 37°С в течение 16-18 часов.

Для анализа колоний трансформированных клеток проводили ПЦР-скрининг с использованием специфических олигонуклеотидных затравок pAAV_EcoRI_FOXP4_For и pAAV_HindIII_FOXP4_ Rev (Таблица 1) и готовой смеси для ПЦР ScreenMix (Евроген, Россия). Реакционную смесь готовили согласно рекомендациям производителя. В качестве матрицы для ПЦР использовали термолизаты отдельных колоний бактерий. Для этого клетки каждой из 8 колоний отбирали с поверхности питательной среды уколом наконечника микропипетки и переносили в пробирку с 20 мкл воды. Пробирки с суспензией бактерий нагревали при 95°С в течение 5 минут. В ПЦР брали по 2 мкл суспензии. Проводили ПЦР со следующими параметрами: предварительное плавление ДНК при 95°С в течение 3 минут, 25 циклов амплификации, включающих плавление в течение 20 секунд при 95°С, отжиг в течение 20 секунд при 55°С и элонгацию при 72°С в течение 2 минут, конечную элонгацию при 72°С в течение 5 минут. Клоны, для которых методом ПЦР было подтверждено наличие вставки корректного размера, передавали на секвенирование. Отбирали клоны с корректной последовательностью по результатам секвенирования.

В результате культивирования отобранных клонов получили плазмидный экспрессионный вектор, представляющий собой последовательность SEQ ID NO: 2, который содержал последовательность FOXP4.

Пример 2

Для осуществления заявленного технического результата была продемонстрирована способность созданного экспрессионного вектора, представляющего собой плазмидный экспрессионный вектор, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой осуществлять продукцию аденоассоциированных вирусных векторов. После продукции была проведена хроматографическая очистка аденоассоциированных вирусных векторов, в результате которой был получен элюат AAV8-FOXP4, содержащий 6,67*10¹² копий вирусных геномов.

Для осуществления заявленного технического результата была продемонстрирована способность полученного рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора трансдуцировать клетки преадипоцитов мыши 3T3-L1 и, тем самым, влиять на экспрессию генов. В частности, была продемонстрирована способность аденоассоциированного вектора по изобретению вызывать экспрессию гена FOXP4, что свидетельствует об эффективности трансдукции преадипоцитов мыши AAV8-FOXP4 и функциональности экспрессионной конструкции. Кроме того, показана способность аденоассоциированного вирусного вектора по изобретению стимулировать экспрессию гена UCP1, кодирующего термогенин, характерный для клеток бурой жировой ткани разобщающий белок (Фиг. 2). На фиг. 2 представлены результаты оценки количества транскриптов соответствующих генов в клетках культуры преадипоцитов мыши 3T3-L1 после трансдукции аденоассоциированными вирусными векторами, несущими плазмидный экспрессионный вектор pAAV-FOXP4, экспрессирующим последовательность, кодирующую FOXP4. По оси ординат - относительное количество транскриптов, нормализованное на количество транскриптов PPIA.

Пример 3

Для осуществления заявленного технического результата, способности аденоассоциированного вирусного вектора по данному изобретению снижать массу млекопитающих была выбрана сублиния мышей с мутацией гена agouti, снижающей активность меланокортиновых рецепторов, Agouti yellow (A^y мыши). Данная мутация вызывает гиперфагию, ожирение и диабет второго типа у мышей, и моделирует развитие наследственно-обусловленного ожирения по меланокортиновому типу.

Ожирение, как мультифакторное заболевание, обусловлено не только средовыми факторами, но и генетическими. Среди людей, как и среди грызунов, встречаются монолокусные формы ожирения, к числу которых относится меланокортиновое ожирение (Waalen, 2014) [15]. Развитие такой наследственной формы ожирения вызвано мутациями, нарушающими функцию центральной меланокортиновой системы гипоталамуса, которая регулирует аппетит и расходование энергии. Использование экспериментальных животных моделей, которые моделируют развитие ожирения по меланокортиновому типу релевантно, поскольку среди генетически обусловленных типов ожирения у человека такой тип часто встречается наиболее часто (Waalen, 2014) [15].

Для эксперимента использованы самки мышей C57/6J генотипа A^y/a одинакового возраста и веса. Генотип Ay/a характеризуется доминантной мутацией гена agouti и развитием меланокортинового ожирения после 10-ти недельного возраста. Мыши A^y/a постепенно набирают массу тела и отличаются по весу от мышей дикого типа того же возраста. Для исследования были использованы 4- месячные мыши Ay/a (30-35 г; n=8).

Мышам с генотипом Agouti yellow осуществляли введение раствора аденоассоциированных вирусных векторов путём инъекции в жировую ткань (отложения жировой ткани в районе 4 пары молочных желёз) млекопитающего шприцем (BD Micro-Fine Plus), в дозе 1*10¹² вирусных геномов / кг жировой ткани. Мышам из контрольной группы осуществляли введение пустых капсидов аденоассоциированного вируса. После введения вышеупомянутых аденоассоциированного вектора, экспрессирующего последовательность, кодирующую FOXP4, а также пустых капсидов в жировые отложения млекопитающего, осуществляли измерение массы тела экспериментальных и контрольных животных. Наблюдали последовательное снижение массы тела в группе с введением аденоассоциированного вектора по изобретению в ходе еженедельного измерения в течение месяца после введения.

Полученные результаты и примеры аналогичны на всем заявленном диапазоне дозы экспрессионного вектора от 1*10¹⁰ до 5*10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани.

Объекты заявленной группы изобретений в дальнейшем будут образовывать основу для следующего этапа разработки лекарственных средств. На следующем этапе эти последовательности подвергают общепризнанному пути разработки лекарственных средств. Путь разработки лекарственных средств определяет потенциальную ценность предлагаемых объектов путем оценки ряда факторов, включая биодоступность, токсикологию, фармакологию и эффективность на животных моделях, перед тем как они будут признаны возможными для тестирования на человеке.

Предлагаемые объекты заявленной группы изобретений, отвечающие целевому профилю, могут быть востребованы фармацевтическими компаниями для создания на их основе терапевтического препарата для лечения заболеваний, связанных с ожирением, включая диабет 2 типа.

Эквиваленты.

Специалистам в данной области будут очевидны, или они смогут достоверно установить при помощи обычных экспериментальных методик, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов реализации, описанные в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем охраны следующей формулы изобретения.

Резюмируя вышесказанное, заявленная группа изобретений может быть признана соответствующей критерию патентоспособности «Промышленная применимость» во всех частных формах воплощения признаков формулы изобретения до даты испрашиваемого приоритета и обеспечивает достижение технического результата, который заключается в эффективном снижении массы тела млекопитающих, а также увеличении эффективности существующих решений и способов терапии ожирения.

Источники литературы:

1. Angelidi A.M. et al. "Novel Noninvasive Approaches to the Treatment of Obesity: From Pharmacotherapy to Gene Therapy", Endocr Rev. 2022 May 12;43(3):507-557, doi: 10.1210/endrev/bnab034.

2. Pugliese et al. "Obesity and infectious diseases: pathophysiology and epidemiology of a double pandemic condition", Int. J. Obes 46, 449-465 (2022), https://doi.org/10.1038/s41366-021-01035-6.

3. De Resende Guimarães MFB et al. "High prevalence of obesity in rheumatoid arthritis patients: association with disease activity, hypertension, dyslipidemia and diabetes, a multi-center study", Adv. Rheumatol, 2019 Oct 16;59(1):44, doi: 10.1186/s42358-019-0089-1.

4. Cinti S. et al. "Immunohistochemical localization of leptin and uncoupling protein in white and brown adipose tissue", Endocrinology, 1997 Feb; 138(2):797-804, doi: 10.1210/endo.138.2.4908.

5. Bartelt A., Heeren J. "Adipose tissue browning and metabolic health",Nat. Rev. Endocrinol, (2014) 10:24-36, doi: 10.1038/nrendo.2013.204.

6. Phillips K.J. "Beige Fat, Adaptive Thermogenesis, and Its Regulation by Exercise and Thyroid Hormone", Biology (Basel), 2019 Jul 31;8(3):57, doi: 10.3390/biology8030057.

7. Harms M., Seale P. "Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential", Nat. Med., 2013 Oct;19(10):1252-63, doi: 10.1038/nm.3361.

8. Rui L. "Brown and Beige Adipose Tissues in Health and Disease", Compr. Physiol, 2017 Sep 12;7(4):1281-1306, doi: 10.1002/cphy.c170001.

9. Seale P. et al. "Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16", Cell Metab., 2007 Jul;6(1):38-54, doi: 10.1016/j.cmet.2007.06.001.

10. Tang R. et al. «Gene therapy for follistatin mitigates systemic metabolic inflammation and post-traumatic arthritis in high-fat diet-induced obesity», Sci. Adv., 2020 May 8;6(19):eaaz7492, doi: 10.1126/sciadv.aaz7492.

11. Perie L. et al. The forkhead box transcription factor FoxP4 regulates thermogenic programs in adipocytes. J. Lipid Res., 2021;62:100102, doi: 10.1016/j.jlr.2021.100102.

12. Патент на изобретение US10711281B2 (Universitat Autonoma de Barcelona (ES)), от 14.07.2020 «Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue».

13. Патент на изобретение US9074012B2 (Dana Farber Cancer Institute (US)), от 07.07.2015 «Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure» (прототип).

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 239-241 с.

15. Waalen J. The genetics of human obesity. Transl. Res. 2014;164(4):293-301. DOI 10.1038/nrg1556.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень

последовательностей Foxp4 с номером заявки.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023127016</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-21</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Автономная некоммерческая

образовательная организация высшего образования

&quot;Научно-Технологический Университет

&quot;Сириус&quot;&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Sirius University of Science and

Technology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Нуклеиновая кислота,

предназначенная для снижения массы тела млекопитающего,

экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ

его доставки и способ снижения массы тела

млекопитающего</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2004</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2004</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggtggaatctgcctcggagacaatcaggtcggctccatctggtcaga

atggcgtgggcagcctctctggacaagcagatggcagcagcggcggggccacagggacaactgcaagtgg

cacgggcagggaagtgaccacgggtgcagacagcaatggtgagatgagtcccgcagagctgctgcacttc

cagcagcaacaggctctccaagtggcccggcagttcctgctgcagcaggcctcaggcctgagctccccag

ggaacaatgacagcaaacagtctgcctctgctgtgcaggtgcctgtgtcggtggccatgatgtcgccgca

gatgcttaccccgcaacagatgcagcagatcctgtcgcccccgcagctgcaggccttgctccagcagcag

caagccctcatgctccagcagctacaggagtactacaagaagcagcaggagcagctccacctgcagctcc

tcacccagcagcaggctgggaaaccgcagcccaaagaggcactggggaacaagcagctggccttccagca

gcagctcctgcaaatgcaacagttgcagcagcagcacctgctcaacctgcagaggcaggggctggtcagc

ctgcagcccaaccaagcctcggggcccctccagacccttccgcaagcagctgtttgcccaacagacctgc

cccagctgtggaagggcgagggtgcccccgggcagcctgccgaggacagcgtcaagcaggaggggctgga

cctcactggcacggccgccaccgctacctcgtttgccgctccccccaaggtctcaccccccctctcccac

cataccctgcccaacggacagcctactgtgctcacatctcggagagacagctcttcccacgaggagaccc

ccggctcccaccccctgtacggacacggagagtgcaagtggccaggctgtgagaccctgtgtgaagacct

gggccagtttatcaaacacctcaacacagagcacgccctggatgaccggagtacagcccagtgccgggta

cagatgcaggtggtgcagcagctggagatccagctcgccaaggagagcgagcggctgcaggccatgatgg

cccacctgcacatgcggccctcggagcccaagcccttcagccagccagtgaccgtctctgcagcagactc

attcccagatggtctcgtgcaccccccgacctcggccgcagcccctgtcacccctctacggccccctggc

ctgggctctgcctccctgcatggtgggggcccagcccgtcggagaagcagtgacaagttctgctccccca

tctcctcagagctggcccagaatcatgagttctacaagaacgccgacgtccggccccccttcacctacgc

ctccctcatccgccaggccatcctggaaacccctgacaggcagctgaccctgaatgagatctataactgg

ttcaccaggatgttcgcctatttccgcagaaacactgccacctggaagaacgccgtgcgccacaacctca

gcctgcacaagtgcttcgtccgcgtggagaacgtcaagggtgccgtgtggactgtggacgagcgggagta

tcagaagcggagaccgccaaagatgacagggagccccaccctggtgaagaacatgatctctggcctcagc

tatggagcacttaatgccagctaccaggccgccctggccgagagcagcttccccctcctcaacagccctg

gcatgctgaaccctggctccgccagcagcctgctgcccctcagccacgatgacgtgggtgcccccgtgga

gccgctgcccagcaacggcagcagcagccctcctcgcctctccccgccccagtacagccaccaggtgcag

gtgaaggaggagccagcagaggcagaggaagacaggcagcccgggcctcccctgggcgcccctaacccca

gcgcctcggggcctccggaagacagggacctggaggaggagctgccgggagaagaactgtcctaa</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6636</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6636</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaa

gcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcc

aactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtggagctagttattaatagtaatcaattacggggt

cattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc

gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgtcaatagggactttc

cattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgc

caagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt

atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttgg

cagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca

atgggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg

caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcg

cctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggatt

cgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgccta

tagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaata

ctttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaag

aataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaat

tgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttatttt

atggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctctt

atcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgg

gattcgaacatcgattgaattccccggggatccatggtggaatctgcctcggagacaatcaggtcggctc

catctggtcagaatggcgtgggcagcctctctggacaagcagatggcagcagcggcggggccacagggac

aactgcaagtggcacgggcagggaagtgaccacgggtgcagacagcaatggtgagatgagtcccgcagag

ctgctgcacttccagcagcaacaggctctccaagtggcccggcagttcctgctgcagcaggcctcaggcc

tgagctccccagggaacaatgacagcaaacagtctgcctctgctgtgcaggtgcctgtgtcggtggccat

gatgtcgccgcagatgcttaccccgcaacagatgcagcagatcctgtcgcccccgcagctgcaggccttg

ctccagcagcagcaagccctcatgctccagcagctacaggagtactacaagaagcagcaggagcagctcc

acctgcagctcctcacccagcagcaggctgggaaaccgcagcccaaagaggcactggggaacaagcagct

ggccttccagcagcagctcctgcaaatgcaacagttgcagcagcagcacctgctcaacctgcagaggcag

gggctggtcagcctgcagcccaaccaagcctcggggcccctccagacccttccgcaagcagctgtttgcc

caacagacctgccccagctgtggaagggcgagggtgcccccgggcagcctgccgaggacagcgtcaagca

ggaggggctggacctcactggcacggccgccaccgctacctcgtttgccgctccccccaaggtctcaccc

cccctctcccaccataccctgcccaacggacagcctactgtgctcacatctcggagagacagctcttccc

acgaggagacccccggctcccaccccctgtacggacacggagagtgcaagtggccaggctgtgagaccct

gtgtgaagacctgggccagtttatcaaacacctcaacacagagcacgccctggatgaccggagtacagcc

cagtgccgggtacagatgcaggtggtgcagcagctggagatccagctcgccaaggagagcgagcggctgc

aggccatgatggcccacctgcacatgcggccctcggagcccaagcccttcagccagccagtgaccgtctc

tgcagcagactcattcccagatggtctcgtgcaccccccgacctcggccgcagcccctgtcacccctcta

cggccccctggcctgggctctgcctccctgcatggtgggggcccagcccgtcggagaagcagtgacaagt

tctgctcccccatctcctcagagctggcccagaatcatgagttctacaagaacgccgacgtccggccccc

cttcacctacgcctccctcatccgccaggccatcctggaaacccctgacaggcagctgaccctgaatgag

atctataactggttcaccaggatgttcgcctatttccgcagaaacactgccacctggaagaacgccgtgc

gccacaacctcagcctgcacaagtgcttcgtccgcgtggagaacgtcaagggtgccgtgtggactgtgga

cgagcgggagtatcagaagcggagaccgccaaagatgacagggagccccaccctggtgaagaacatgatc

tctggcctcagctatggagcacttaatgccagctaccaggccgccctggccgagagcagcttccccctcc

tcaacagccctggcatgctgaaccctggctccgccagcagcctgctgcccctcagccacgatgacgtggg

tgcccccgtggagccgctgcccagcaacggcagcagcagccctcctcgcctctccccgccccagtacagc

caccaggtgcaggtgaaggaggagccagcagaggcagaggaagacaggcagcccgggcctcccctgggcg

cccctaaccccagcgcctcggggcctccggaagacagggacctggaggaggagctgccgggagaagaact

gtcctaaaagcttgcctcgagcagcgctgctcgagagatctacgggtggcatccctgtgacccctcccca

gtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgca

tcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggca

agttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatct

tggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggat

tccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggc

caggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacag

gcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgca

ggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgacca

aaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg

ggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaacca

tagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac

ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttcc

ccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaa

aaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgt

tggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggcta

ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaa

tttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctg

atgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgct

cccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtca

tcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataa

tggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta

aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaagg

aagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttt

ttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacat

cgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagc

acttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgcc

gcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat

gacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgaca

acgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatc

gttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggc

aacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactgg

atggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgata

aatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccg

tatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagata

ggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaa

aacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatccctta

acgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttt

tttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc

aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttct

agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatc

ctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttac

cggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgaccta

caccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggac

aggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt

atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg

gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgct

cacatgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генотерапевтическим методам с использованием гена транскрипционного фактора 4 FOXP (FOXP4), и может быть использовано в медицине для снижения массы тела млекопитающего. Предложены кодирующая FOXP4 нуклеиновая кислота, содержащий ее экспрессионный вектор, способ его доставки в жировые отложения млекопитающего и способ снижения массы тела млекопитающего. Изобретение обеспечивает получение средства для эффективного снижения массы тела млекопитающих. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1.

2. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1.

3. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего по п. 2, представляющий собой экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса.

4. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего по п. 2, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2.

5. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора по любому из пп. 2-4 путём инъекции.

6. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора по п. 5 путём инъекции в жировую ткань.

7. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего по п. 5, включающий введение в жировую ткань млекопитающего шприцем в дозе от 1⋅10¹⁰ до 5⋅10¹² вирусных геномов/кг жировой ткани.

8. Способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора по любому из пп. 2-4 в жировые отложения млекопитающего.