СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6844 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12N1/00 C07H21/02 C07H21/04 

Изобретение относится к области молекулярной диагностики, в частности, к выявлению ДНК бактерий рода Campylobacter с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот, а именно амплификации с детекцией в режиме реального времени.

Изобретение может быть использовано в ветеринарной лабораторной диагностике для выявления ДНК бактерий рода Campylobacter в биологическом материале от животных - кале, сперме, смывах с прямой кишки, из влагалища, абортированных плодах, а также в воде и кормах.

Кампилобактериоз (Campylobacteriosis, Vibriosis) вызывается патогенными формами микроорганизмов этого рода, проявляется в основном поражением репродуктивных органов, акушерско-гинекологическими заболеваниями (задержание последа, метриты, аборты) и поражением желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы. Относится к списку В согласно Международной классификации заразных болезней животных [1]. Для человека бактерии рода Campylobacter spp. сегодня считаются одной из основных причин острых кишечных инфекций, а у людей с ослабленным иммунитетом - генерализованных (септицемических) процессов. Заболеваемость кампилобактериозом в животноводческих, птицеводческих хозяйствах в странах Европы и Северной Америки носит спорадический характер.

Ряд микроорганизмов этого рода в настоящее время являются крайне опасными в связи с их широким распространением в природной среде, высокой выживаемостью и патогенностью. В отчете ВОЗ «Глобальный взгляд на кампилобактериоз» отмечено, что данное зоонозное заболевание является недооцененным инфекционистами мира как гуманной, так и ветеринарной медицины, притом, что частота инфицирования этим возбудителем у населения стремительно растет. Согласно информационному бюллетеню ВОЗ [2], источником заражения у крупного рогатого скота являются инфицированные быки-производители с пожизненной локализацией данных микроорганизмов в органах репродуктивной системы, постоянно выделяющихся с секретом предстательной железы, спермопродукцией и препуциальной слизью.

Важным звеном в эпизоотологии кампилобактериоза имеет технология воспроизводства стада с искусственным осеменением или вольной случкой инфицированными быками. Передача возбудителя инфекции осуществляется, главным образом, половым путем при естественном спаривании, а также при искусственном осеменении. Имеет место быть и фактор передачи возбудителя недоброкачественно простерилизованными акушерскими инструментами, применяемыми при родовспоможении, фетотомии, а также инструментами, применяемыми при искусственном осеменении.

Не исключены и такие пути передачи заражения молодняка животных, как алиментарный и контактный, от больных матерей, что часто фиксируется в овцеводческих хозяйствах.

Резервуарами и переносчиками возбудителя болезни могут быть и свиньи, собаки, лисицы и даже дикие птицы, которые поедают инфицированные плоды и последы, а затем выделяют возбудителя с фекалиями в течении длительного времени. Так, возбудитель кампилобактериоза С.jejuni передается от бактерионосителей с пометом и быстро распространяется по всему поголовью птицы.

В гуманной медицине основным путем распространения инфекции отмечают пищевой, причем ведущим фактором передачи является инфицированное мясо (говядина, свинина, мясо птицы), где кампилобактерии не только хорошо сохраняются, но и при определенных условиях интенсивно размножаются. Домашние животные (кошки, собаки, хомячки) также могут быть причастны к передаче инфекции человеку. В группу риска входят люди, которые профессионально связаны с работой в животноводческих комплексах и птицеводческих хозяйствах. В большей степени страдают дети и женщины, у женщин при кампилобактериозе поражаются репродуктивные органы, что приводит к невынашиванию беременности, выкидышам и бесплодию. Инфицированные беременные женщины способны передавать инфекцию новорожденным детям при родах, а также описана трансплацентарная передача инфекции плоду, которая может привести к прерыванию беременности на любых сроках вынашивания [3].

Кампилобактерии выявляются в трети случаев «диарей путешественников» среди жителей экономически развитых стран, посещающих регионы с высокой степенью циркуляции кампилобактерий среди населения.

Возбудитель попадает в организм животного и человека через слизистую оболочку тонкой кишки и ее лимфоидные образования. Выявлена способность кампилобактерий проникать в собственную пластинку слизистой оболочки в составе фагосомоподобных вакуолей через эпителиальную клетку и посредством прямого межэпителиального проникновения. Сканирующая электронная микроскопия показала, что бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам своими жгутиками, которые затем перфорируют клеточную мембрану. Помимо жгутиков, кампилобактерии имеют молекулы адгезинов, локализирующихся на поверхности самих бактерий и усиливающих связь с энтероцитами [4]. Инвазивная активность возбудителя наделила его способностью легко проникать через наружную мембрану эпителиальных клеток или через межклеточные промежутки эпителия. Эндотоксин вызывает неспецифические реакции у организма. Кампилобактерии продуцируют энтеротоксины, близкие по строению к холерному токсину, и ряд цитотоксинов (гемолизин, шигаподобный токсин, цитолетальный «взрывной» токсин). Далее по лимфатическим сосудам кампилобактерии проникают в мезентериальные лимфоузлы, возникает мезаденит, в патологический процесс может вовлекаться червеобразный отросток.

Бактерии, преодолевшие желудок, внедряются в слизистую оболочку тонкой кишки и ее лимфоидные образования.

По состоянию на 2014 г. род Campylobacter включал 26 видов и 9 подвидов [5]. Примерно половина из них - известные патогены млекопитающих, хотя заболевание человека в основном связано с C. jejuni и C. coli. Имеются данные, свидетельствующие о том, что другие Campylobacter spp., такие как C. concisus, C. upsaliensis, C. hyointestinalis, C. fetus, С. curvas и C. lari, могут также вызывать заболевания у людей [6]. Заболеваемость кампилобактериозом постепенно увеличивается, и Campylobacter в настоящее время считается ведущей причиной бактериального гастроэнтерита во всем мире [7].

Для выявления возбудителей кампилобактериоза в настоящее время используются тест-системы: тест система «КАМ-БАК», предназначенная для выявления ДНК Campylobacter jejuni в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью электрофоретического метода детекции [8], которая является моновидовой, и тест-система фирмы Амплисенс «АмплиСенс Shigella spp. и EIEC / Salmonella spp. / Campylobacter spp. - FL» для комплексного выявления нескольких возбудителей, в том числе и кампилобактериоза [9], но она предназначена для медицинского использования. Из перечисленных систем максимально приближенной к настоящему изобретению является тест-система «КАМ-БАК».

Сущность изобретения заключается в новом наборе нуклеотидных последовательностей праймеров и зонда для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с целью детекции генома бактерий рода Campylobacter.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям гена 16S pРНК, по которым осуществляется родовидовая идентификация исследуемых образцов.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, используют специальный оригинальный набор синтетических олигонуклеотидных последовательностей в виде двух праймеров и зонда для амплификации участка генома бактерий рода Campylobacter с целью их детекции в исследуемых образцах.

Последовательности имеют следующий нуклеотидный состав:

Прямой праймер F: 5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'

Зонд: 5'-GTTGCTGCGTCAGGGTTTCCCCCATT-3'

Обратный праймер R: 5'-AGAAAAGGAGTTTACGCTCCG-3'

Техническое решение было создано на основе методики качественного обнаружения генома бактерий рода Campylobacter посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [10]. Изобретение непосредственно увеличивает специфичности праймеров и зонда, что увеличивает эффективность системы и снижает долю ложноположительных результатов.

Праймеры и зонды, кодирующие последовательность гена 16S рРНК для идентификации кампилобактерий:

Прямой праймер:

5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'

Зонд:

5'-GTTGCTGCGTCAGGGTTTCCCCCATT-3'

Обратный праймер:

5'-AGAAAAGGAGTTTACGCTCCG-3'

Высокую специфичность и чувствительность системы с указанными последовательностями подтвердили в следующем эксперименте.

Мишенью амплификации выбрали высокоспецифичный участок гена 16S рРНК, позволяющий определить шесть видов кампилобактерий: C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. helveticus и C. hyointestinalis. Подобрана оптимальная концентрация ионов магния (2,5 мМ) и температура отжига праймеров (60 °С). Было протестировано 18 референтных штаммов различных бактерий. Положительный результат был показан только со штаммами, относящимися к роду Campylobacter. Чувствительность метода при использовании указанного праймера составила 40 молекул-мишеней. С использованием данной методики исследовали 76 проб сырья животного происхождения. Геном бактерий рода Campylobacter был обнаружен в 18 образцах, что подтверждалось ранее проведенными культуральными исследованиями. Полученные результаты показывают, что оптимизированный вариант полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, основанный на амплификации гена 16S pРНК, представляет собой специфичный, чувствительный, быстрый, воспроизводимый и точный метод для качественного обнаружения бактерий рода Campylobacter в пробах сырья животного происхождения.

Реакционную смесь собирали из следующих компонентов в расчете на одну пробу объемом 25 мкл: 5 мкл ДНК; 10× ПЦР- буфера; 2,5 мкл 2,5 мМ dNTP; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; по 0,3 пкМ прямого и обратного праймеров; 0,15 пкМ зонда; 2,5 Е SynTaq ДНК-полимеразы.

В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из суспензии референтного штамма С. jejuni ATCC 29428 с оптической плотностью 0,5 ед. по стандарту МакФарланда, что соответствует 1×108 КОЕ/см3. Суспензию готовили с применением 0,9%-го раствора NaCl. В качестве отрицательного контроля использовали бидистиллированную воду. Амплификацию в режиме реального времени проводили на термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) при условиях: прогрев смеси при 50 °С 2 мин; активация фермента при 95 °С 10 мин; 45 циклов - 95 °С 15 с, 60 °С 1 мин. Результаты интерпретировали по наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct. Пробу считали положительной при Сt - 40.

С использованием оптимизированных праймеров и зонда исследовали 76 проб сырья животного происхождения. Геном бактерий рода Campylobacter был обнаружен в 18 образцах. Наибольшее количество положительных проб наблюдали при исследовании полуфабрикатов куриных (44,0%). Также геном бактерий рода Campylobacter выявили в тушках птицы (23,1%), крови птицы (25,0%), сыром молоке (9,1%).

Заявленное изобретение позволяет выявлять геном бактерий рода Campylobacter при наличии приблизительно 40 молекул-мишеней в исследуемом образце, соответственно выбранные праймеры обладают высокой специфичностью. Отсутствие ложноположительных реакций подтвердили ранее проведенные анализы проб культуральным методом. Показано, что данные последовательности обеспечивают точное определение бактерий рода Campylobacter (значение R2 выше 0,99) с эффективностью ПЦР 92,26%.

Литература:

1. https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/#ui-id-2.

2. https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/campylobacter

3. М.К.Бехтерева, О.И. Ныркова, А.Н. Сиземов Лекция Кампилобактериоз, журнал Педиатор, том 3, №3, 2012 г.

4. Иванов В.П., Бойцов А.Г. Кампилобактеры и кампилобактериозы. - СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 1995. - 144.

5. Fitzgerald C, Patrick M, Gonzalez A, Akin J, Polage CR, Wymore K, Gillim-Ross L, Xavier K, Sadlowski J, Monahan J, Hurd S, Dahlberg S, Jerris R, Watson R, Santovenia M, Mitchell D, Harrison C, Tobin-D'Angelo M, DeMartino M, Pentella M, Razeq J, Leonard C, Jung C, Achong-Bowe R, Evans Y, Jain D, Juni B, Leano F, Robinson T, Smith K, Gittelman RM, Garrigan C, Nachamkin I. Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool. J Clin Microbiol. 2016 May;54(5):1209-15. doi: 10.1128/JCM.01925-15. Epub 2016 Mar 9. PMID: 26962088; PMCID: PMC4844741.

6. Lund M. Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR / M. Lund, S. Nordentoft, K. Pedersen, M. Madsen // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42 (11). - P. 5125-5132; DOI: 10.1128/ JCM.42.11.5125-5132.2004.

7. Kaakoush NO, Castaño-Rodríguez N, Mitchell HM, Man SM. Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clin Microbiol Rev. 2015 Jul;28(3):687-720. doi: 10.1128/CMR.00006-15. PMID: 26062576; PMCID: PMC4462680.

8. https://www.interlabservice.ru/catalog/reagenty/ptsr-diagnostika/veterinariya/kam-bak.html

9. https://www.amplisens.ru/upload/iblock/064/FSR%202008_03087_27.02.19.pdf

10. Г. С. Скитович, К. В. Серова, Н. Б. Шадрова, О. В. Прунтова. Выявление бактерий Сampylobacter spp. с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени // Ветеринария сегодня. - 2019. - № 4(31). - С. 3-12. - DOI 10.29326/2304-196X-2019-4-31-3-7.

Изобретение относится к области молекулярной диагностики. Описаны синтетические олигонуклеотидные последовательности в виде двух праймеров и зонда для амплификации участка генома бактерий рода Campylobacter методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с целью их детекции в исследуемых образцах. Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям гена 16S pРНК, по которым осуществляется родовидовая идентификация исследуемых образцов.

Синтетические олигонуклеотидные последовательности в виде двух праймеров и зонда для амплификации участка генома бактерий рода Campylobacter методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с целью их детекции в исследуемых образцах, характеризующиеся тем, что имеют следующий нуклеотидный состав:

5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’

5’-GTTGCTGCGTCAGGGTTTCCCCCATT-3’

5’-AGAAAAGGAGTTTACGCTCCG-3’.