СПОСОБ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО ПОДБОРА ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ЭХИНОКОККОЗОМ ПЕЧЕНИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/6858 C12Q1/686 C12Q1/6883 

Изобретение относится к медицине, хирургии, паразитологии. Способ позволяет улучшить непосредственные и отдаленные показатели лечения больных с паразитарным поражением печени, а в особенности больных с кистозным эхинококкозом.

Эхинококкоз является одним из самых распространенных паразитарных заболеваний в Российской Федерации [1]. На его долю приходится до 1,2% от всех биогельминтозов. Анализ данных литературы свидетельствует о росте заболеваемости эхинококкозом в Российской Федерации и мире за последние 25 лет более чем в три раза (с 0,1 в 1990 г до 0,35 на 100 тыс. населения в 2015 г). Ежегодно регистрируется около 500 случаев заражения человека данным гельминтом, а более 14% заболевших составляют дети [2].

Появление в клинической практике лекарственной терапии антигельминтного действия (особенно бензимидазолов) снизило потребность в агрессивных хирургических процедурах при начальных стадиях паразитарного процесса, однако при анализе литературы становится очевидным, что число рецидивов, даже несмотря на проводимую терапию достигает 70%.

Наиболее изученными препаратами для лечения пациентов с эхинококковым поражением печени являются бензимидазолы, к которым относятся альбендазол и мебендазол [3]. Их основной механизм действия связан с вмешательством в поглощение глюкозы паразитами, что приводит к истощению гликогена в внутриклеточных органеллах паразита. Исследования показали, что эффективность альбендазола превосходят мебендазол [4]. Из исследований данных лекарств следует, что принципиальная разница между ними заключается в расщеплении метаболитов; метаболит альбендазола является мощным пролекарством, обладающим отличными антигельминтными свойствами, в то время как мебендазол распадается на множество малоактивных метаболитов.

Известно, что медикаментозная терапия эхинококкоза показана в следующих случаях:

1) в нерезектабельных случаях при первичном поражении легких и печени множественными кистами и при поражении брюшины;

2) для снижения риска вторичного обсеменения брюшной полости при необходимости пункции эхинококковой кисты и снижения риска рецидива у пациентов в предоперационном и послеоперационном периодах.

Относительными противопоказаниями к проведению медикаментозной терапии включают:

1) большие эхинококковые кисты с высоким риском разрыва;

2) неактивные кисты (стадия СЕ4 и 5 по классификации ВОЗ);

3) ранние сроки беременности;

4) печеночная дисфункция и заболевания, угнетающие функцию костного мозга.

Лечебная доза для среднестатистического 70-килограммового человека составляет 400 мг препарата 2 раза в сутки в течение 28 дней. Наиболее распространенным токсическим эффектом является повышение уровня печеночных ферментов при длительной терапии, которое может наблюдаться у 20% пациентов. Известно также, что бензимидазолы обладают подавляющим действием на костный мозг, которое обычно ослабевает с прекращением действия препарата. Следовательно, во время терапии бензимидазолами крайне важно контролировать уровень печеночных ферментов и показатели периферической крови [5].

К еще одному исследованию относится клинический анализ 612 пациентов (исследование было проведено на базе одного центра) с общим количеством кист 159. Большинство кист (50-75%), сталированных как СЕ1 (активные), были определены как неактивные после начала лечения бензимидазолом (под наблюдением через 1-2 года), по сравнению с 30-50% кист СЕ2 и СЕ3, которые были сталированы как неактивные. Кроме того, 50-60% более мелких кист (менее 6 см в исходном состоянии) лучше реагировали на лечение через 1-2 года по сравнению с 25-50% более крупных кист [6].

Как правило, причинами неэффективности такого лечения являются как невозможность проведения полноценного курса терапии альбендазолом в связи с развивающимся острым лекарственным гепатитом, так и выраженный полиморфизм генов ферментов биотрансформации альбендазола (CYP1A1, GSTM1 и других), продемонстрированные в работах отечественных ученых, однако влияние этого феномена на непосредственные результаты лечения продемонстрировано не было [7].

Прямых прототипов предлагаемому нами способу лечения на сегодняшний день нет.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение возможностей применения лекарственной терапии путем персонификации подбора альбендазола у больных эхинококкозом печени.

Предлагаемый способ диагностики. Для улучшения результатов лечения пациентов с эхинококкозом печени в хирургической клинике Боткинской Больницы был разработан и внедрен диагностический протокол перед назначением противопаразитарной терапии.

С целью индивидуального подбора альбендазола пациентам перед назначением терапии проводилось генетическое тестирование по методике полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аллельспецифичной гибридизацией. С последующим выявлением варианта CYP2J2 rs 890293 (СА), CYP3A4*22 (СС) и CYP3A5*3A6986G (АА), при котором лекарственно индуцированный гепатит встречается у всех без исключения пациентов.

Генотипирование по полиморфным маркерам CYP2J2 rs 890293, CYP3A4*22, CYP3A5*3, оценивало фармагогенетические особенности метаболизма альбендазола. Генотипирование CYP2J2 rs 890293 С>А, CYP3A4*22 (rs35599367), CYP3A5*3 (rs776746) A>G, проведено методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аллельспецифичной гибридизацией (Real-time PCR) в связи с наличием ряда преимуществ: практически полное устранение угрозы контаминации исследуемых материалов специфическими продуктами реакции, снижение требований к организации лабораторного процесса, сокращение трудозатрат и времени анализа, проведение ПЦР-анализа в одном помещении. Используемое оборудование для проведения фармакокинетических и фармакогенетических исследований: прибор ДНК-амплификатор СFХ96 Touch™ Real-TimePCRDetectionSystem (Bio-RadLaboratories, Inc.; USA) для проведения ГЩР в режиме реального времени.

Биологическим материалом, для экстракции геномной ДНК, являлось 4 мл венозной крови, забор которой осуществлялся из локтевой вены в вакуумную пробирку VACUETTE® (GreinerBio-One, Австрия), содержащую ЭДТА-К2 или ЭДТА-К3. Образцы хранились при -80°С вплоть до момента экстракции ДНК. Выделение геномной ДНК из цельной крови осуществлялось спомощью набора реагентов «MagNaPureCompactNucleicAcidIsolationKitI» для выделения геномной ДНК из цельной крови (Roche, Швейцария) на автоматизированной системе MagNaPureCompact(Roche, Швейцария), S-Сорб для выделения ДНК на кремниевом сорбенте (ООО «Синтол», Россия). Концентрация экстрагированной ДНК определялась с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (ThermoFisherScientific, NY, USA).

Носительство полиморфного маркера гена CYP2J2(rs890293) определялось с помощью коммерческого набора «TaqMan® SNPGenotypingAssays» и TaqManUniversalMasterMix II, noUNG (AppliedBiosystems, США). Для ГЩР использовалось 20 мкл смеси компонентов. Согласно инструкции производителя, применялся реактив «TaqMan ® SNPGenotypingAssays» - 1 мкл в 20-кратном разведении в 10 мкл TaqManUniversalMasterMix II, no UNG, и 9 мкл воды, свободной от РНКаз. В каждую пробирку вносилось по 5 мкл ДНК исследуемых образцов. Для определения однонуклеотидных генетических полиморфизмов использовался метод ПНР в реальном времени на приборе CFX96 TouchRealTimeSystem с ПО CFX Manager версии 3.0 (BioRad, США).

Определение носительства однонуклеотидного генетического полиморфизма проводилось методом аллель-специфической ПНР в режиме реального времени на приборе CFX96 TouchRealTimeSystem с ПО CFX Manager версии 3.0 (BioRad, США) с использованием коммерческого набора реагентов для определения полиморфизма G/A гена CYP3A5*3 (rs776746) (ООО «Синтол», Россия). Для ПНР использовалось 20 мкл смеси компонентов. Согласно инструкции производителя, в каждую пробу вносилось: 2.5×Реакционная смесь - 10 мкл, 2.5×Разбавитель - 10 мкл, Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл - 0,5 мкл. В каждую пробирку вносилось по 5 мкл ДНК исследуемых образцов. Программа амплификации включала в себя этап инкубации при 95°С в течение 3 минут, затем повтор этапов денатурации при 95°С - 15 секунд и отжига при 60°С - 40 секунд в течение 39 циклов. Сигнал флуоресценции развивался по соответствующему каналу: ROX и HEX.

Носительство полиморфного маркера CYP3A4*22 (rs35599367), определялось с помощью коммерческого набора «TaqMan ® SNPGenotypingAssays» и TaqManUniversalMasterMix II, noUNG (AppliedBiosystems, США). Согласно инструкции производителя, применялся «TaqMan ® SNPGenotypingAssays» 0,5 мкл в 40-кратном разведении в 10 мкл TaqManUniversalMasterMix II, no UNG и 9,5 мкл воды, свободной от РНКаз. В каждую пробирку вносилось по 5 мкл ДНК исследуемых образцов. Программа амплификации включала в себя этап инкубации при 95°С в течение 10 минут, затем денатурация при 95°С - 15 секунд и отжиг при 60°С - 1 минута в течение 49 циклов. Сигнал флуоресценции развивался по соответствующему каналу: FAM и VIC.

При анализе влияния генетического полиморфмизма цитохромов Р450 на частоту и тяжесть лекарственно индуцированного гепатита нами были проанализированы все генотипические варианты пациентов в исследовании. При этом вариант, сочетающий в себе CYP2J2 rs 890293 (СС), CYP3A4*22 (СС) и CYP3A5*3A6986G (GG) встретился у 39 (78%) пациентов (р<0, 001). У 6 (12%) больных по результатам обследования были получены данные о наличии CYP2J2 rs 890293 (СА), CYP3A4*22 (СС) и CYP3A5*3A6986G (АА) (р>0,05). Намного реже в нашей работе встречались комбинации CYP2J2 rs 890293 (СА), CYP3A4*22 (СТ) и CYP3A5*3A6986G (GA) - 3 (6%) и другие (р>0,05). При этом, хотелось бы отметить, что частота развития тяжелых форм лекарственно индуцированного гепатита имела корреляционную связь с вариантом CYP2J2 rs 890293 (СА), CYP3A4*22 (СС) и CYP3A5*3A6986G (АА), что требовало значимой редукции дозы бензимидазолов (р<0,001).

Таким образом, предлагаемый современный диагностический способ персонифицированного подбора противопаразитарной терапии, основанный на генетическом полиморфизме цитохромов Р450 позволяет снизить частоту и тяжесть развития лекарственно индуцированного гепатитау больных эхинококкозом печени.

Список литературы.

1. Гасанов К.Г. Эхинококковое поражение печени у жителей Астраханской области: эпидемиология, клиника, диагностика / К.Г. Гасанов, Р.С. Аракельян, X.М. Галимзянов [и др.] // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2019. - №4. - С.39-43. - DOI 10.33092/0025-8326mp2019.4.39-43. - EDNUUYHLJ.

2. Ермакова Л.А. Анализ заболеваемости человека лавральными гельминтозами (эхинококкоз, токсокароз, дирофиляриоз) в Российской Федерации. Эпидемиология и вакцинопрофилактики/ Ермакова Л.А., Твердохлебова Т.И., Нагорный С.А., Пшеничная Н.Ю., Болатчиев К.Х. 2017; 16 (1): 43-46. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2017-16-1-43-46.

3. Bennett A., Guyatt Н. Reducing intestinal nematode infection: efficacy of albendazole and mebendazole //Parasitology Today. - 2000. - T. 16. - №. 2. - C. 71-77.

4. Heinrich S, Tripke V, Huber T, Siegel E, Dennebaum M, Staib L, Wörns MA, Oberholzer K, Mittler J, Lang H. Ergebnisse der multimodalenTherapie der hepatischenEchinokokkose [Results of multimodal treatment of hepatic echinococcosis]. Chirurg. 2020 Nov;91(11):943-954. German. doi: 10.1007/s00104-020-01157-z. PMID: 32189047.

5. Gomez I Gavara C, López-Andújar R, Belda Ibáñez T, RamiaÁngel JM, Moya Herraiz Á, Orbis Castellanos F, Pareja Ibars E, San Juan Rodríguez F. Review of the treatment of liver hydatid cysts. World J Gastroenterol. 2015 Jan 7;21(1):124-31. doi: 10.3748/wjg.v21.i1.124. PMID: 25574085;

6. Richter J, Lindner AK, Geisel D, Torsello GF, Martinez GE, Isner C, Schürmann D, Pfäfflin F, Orhun A, Manciulli T, Brunetti E. Treatment of a giant hepatic echinococcal cyst with percutaneous drainage and in vivo assessment of the protoscolicidal effect of praziquantel. Clin J Gastroenterol. 2021 Jun;14(3):888-892. doi: 10.1007/s12328-021-01397-4. Epub 2021 Apr 13. PMID: 33851365; PMCID: PMC8154811.

7. Ángeles-Arvizu A, Enriquez-Flores S, Jiménez-Gutiérrez A, Pérez-Rangel A, Luna-Arias JP, Castillo-Romero A, Hernández JM, León-Avila G. MDR1 protein (ABC-C1) Over Expression in Giardia Intestinalis Incubated with Albendazole and Nitazoxanide. Acta Parasitol. 2021 Dec;66(4):1158-1166. doi: 10.1007/s11686-021-00385-5. Epub 2021 Apr 11. PMID: 33840056.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и паразитологии, и может быть использовано для персонифицированного подбора противопаразитарной терапии у больных эхинококкозом печени. Проводят генетическое тестирование полиморфизма цитохромов Р450 CYP2J2 rs890293, CYP3A4*22, CYP3A5*3 A6986G методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аллельспецифичной гибридизацией. При выявлении комбинации генотипов СА CYP2J2 rs890293, СС CYP3A4*22 и АА CYP3A5*3 A6986G подбирают противопаразитарную терапию с редукцией дозы альбендазола. Способ обеспечивает снижение частоты и тяжести развития лекарственно индуцированного гепатита у больных эхинококкозом печени за счет редукции дозы альбендазола в случае выявления комбинации генотипов СА CYP2J2 rs890293, СС CYP3A4*22 и АА CYP3A5*3 A6986G.

Способ персонифицированного подбора противопаразитарной терапии у больных эхинококкозом печени, заключающийся в выявлении вариантных форм цитохрома Р450 при проведении генетического тестирования полиморфизма цитохромов Р450 CYP2J2 rs890293, CYP3A4*22, CYP3A5*3 A6986G методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с аллельспецифичной гибридизацией, и при выявлении комбинации генотипов СА CYP2J2 rs890293, СС CYP3A4*22 и АА CYP3A5*3 A6986G подбирают противопаразитарную терапию с редукцией дозы альбендазола.