ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данная заявка относится к микроорганизмам с усиленной способностью продуцировать L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащим новый полинуклеотид, и способу получения L-аминокислот с разветвленной цепью с их применением.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
L-аминокислоты представляют собой основные структурные единицы белков и применяются в качестве важных материалов для фармацевтического сырья и пищевых добавок, кормов для животных, питательных добавок, пестицидов, бактерицидов и так далее. В частности, аминокислоты с разветвленной цепью (ВСАА) это общий термин для L-валина, L-лейцина и L-изолейцина, представляющих собой незаменимые аминокислоты. Известно, что аминокислоты с разветвленной цепью обладают антиоксидантным эффектом и непосредственно стимулируют синтез белка в мышечных клетках.
Аминокислоты с разветвленной цепью в основном продуцируются микроорганизмами рода Escherichia или рода Corynebacterium, и известно, что их биосинтез осуществляется с использованием в качестве предшественника 2-кетоизокапроновой кислоты после прохождения нескольких стадий превращения пировиноградной кислоты (патенты Кореи 10-0220018 и 10-0438146). Однако, проблема при продуцировании L-аминокислот с разветвленной цепью микроорганизмом заключается в том, что осуществлять крупномасштабное промышленное производство затруднительно.
Техническая задача
Авторы данного изобретения приложили множество усилий, чтобы получить микроорганизмы, обладающие усиленной способностью продуцировать L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащие новый полинуклеотид, и в результате они доказали, что продуктивность L-аминокислот у микроорганизма рода Corynebacterium, в который внедрен полинуклеотид, может быть усилена, тем самым придя к данному изобретению. Техническое решение
Одной из задач данного изобретения является обеспечение микроорганизма рода Corynebacterium для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающего полинуклеотидную последовательность.
Другой задачей данного изобретения является обеспечение композиции для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающей полинуклеотидную последовательность.
Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение способа получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающего: культивирование микроорганизма рода Corynebacterium и выделение L-аминокислот с разветвленной цепью из среды или его культуры.
Следующей задачей данного изобретения является обеспечение способа повышения продукции L-аминокислот с разветвленной цепью, включающего: добавление полинуклеотидной последовательности в микроорганизм.
Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение применения полинуклеотидной последовательности для продуцирования L-аминокислот с разветвленной цепью.
И еще одной задачей данного изобретения является обеспечение применения микроорганизма для продуцирования L-аминокислот с разветвленной цепью.
Полезные эффекты
При культивировании микроорганизма для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающего новый полинуклеотид по данной заявке, можно получать L-аминокислоты с разветвленной цепью с высокой эффективностью. Кроме того, полученные аминокислоты можно применять в различных продуктах, таких как продукты питания или пищевые добавки для человека, фармацевтические средства, а также корма или кормовые добавки для животных.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее данное изобретение будет описано более подробно. При этом, каждое раскрытие и воплощение, раскрытое в данном документе, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям, с учетом общих признаков. Таким образом, все комбинации различных элементов, описанных в данном документе, входят в объем данного изобретения. Более того, объем данного изобретения не ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.
Кроме того, специалистам в данной области будут очевидны или найдены в ходе рутинных экспериментов множество эквивалентов конкретных аспектов изобретения, описанных в данном документе. Более того, предполагается, что данное изобретение будет охватывать такие эквиваленты.
Одним из аспектов данного изобретения является предоставление микроорганизма рода Corynebacterium для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающего полинуклеотидную последовательность.
В данном описании термин «полинуклеотид», представляющий собой полимер нуклеотидов, состоящий из мономеров нуклеотидов, соединенных в длинную цепочку ковалентными связями, представляет собой цепь ДНК по меньшей мере определенной длины.
В рамках данного изобретения полинуклеотид относится к полинуклеотиду, участвующему в увеличении продуцирования или продукции аминокислот, в частности, аминокислот с разветвленной цепью, более конкретно, аминокислот, включающих лейцин, валин и изолейцин, без ограничения.
Дополнительно, полинуклеотид может быть полинуклеотидом, представленным X-Z-Y-Z' [Общая Формула 1], в Общей Формуле 1, приведенной выше, X может представлять собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более, Y может представлять собой транспозон, Z может представлять собой последовательность от 0 до n последовательности SEQ ID NO: 5, и Z' может представлять собой последовательность от n+1 до 188 последовательности SEQ ID NO: 5, последней последовательности SEQ ID NO: 5, где 188 последовательность SEQ ID NO: 5 может представлять собой любой, выбранный из А (аденина), Т (тимина), G (гуанина) и С (цитозина), в виде "N", в частности, А (аденин) или G (гуанин), без ограничения.
n относится к натуральному числу, включая "0". В указанном выше, когда n представляет собой 0, это означает, что Y присоединен к 3'-концу непосредственно после X. Кроме того, Z и Z' могут представлять собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более, без ограничения.
Кроме того, в Общей Формуле 1, приведенной выше, Y представляет собой транспозон и может состоять из SEQ ID NO: 3, встроенной в направлении по ходу транскрипции относительно n последовательности SEQ ID NO: 5, и может быть встроен в любом положении в последовательностях Z и Z'. В частности, Z и Z', представляющие собой сайты, в которых встроен Y, являются сайтами, присутствующими в положении, расположенном против хода транскрипции от целевого гена, в которые может быть встроен Y для увеличения экспрессии целевого гена, и эндогенно Z и Z' связаны друг с другом с образованием единого расположенного против хода транскрипции, без ограничения. Указанные Z и Z' представляют собой единую непрерывную последовательность, составляя часть одного положения, расположенного против хода транскрипции, встроенного для усиления экспрессии целевого гена, a Y расположен на 3'-конце Z (на 3'-конце X, будучи присоединенным к 0 последовательности Z) и на 5'-конце Z', так что они могут быть разделены между собой на Z и Z'. Например, Z и Z' состоят из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 и в сумме имеют последовательность из 188 нуклеотидов:
1) когда транспозон Y встроен в направлении по ходу транскрипции относительно первой последовательности, первый нуклеотид последовательности от 5'-конца в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 становится Z, а 187 нуклеотидов последовательности, за исключением одного нуклеотида последовательности на 5'-конце нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, становятся Z'. Кроме того, 2) когда транспозон Y встроен в направлении по ходу транскрипции относительно 11 последовательности, 11 нуклеотидов последовательности от 5'-конца в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 становятся Z, а 177 нуклеотидов последовательности, за исключением 11 нуклеотидов последовательности от 5'-конца в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, становятся Z'. Кроме того, 3) когда транспозон Y встроен в направлении по ходу транскрипции относительно 187 последовательности, 187 нуклеотидов последовательности от 5'-конца в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 становятся Z, а один нуклеотид последовательности, за исключением 187 нуклеотидов последовательности от 5'-конца, становится Z', однако приведенное выше описание является только лишь примером, и поэтому не является исчерпывающим.
В частности, когда транспозон Y встроен в нуклеотидной последовательности после 11 нуклеотида последовательности, нуклеотидная последовательность Z может представлять собой SEQ ID NO: 2 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более. Кроме того, в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 Z', состоящий из 177 нуклеотидов последовательности, за исключением 11 нуклеотидов последовательности от 5'-конца, может быть выбран из SEQ ID NO: 4 или последовательности, гомологичной ей на 90% или более, без ограничения. Последняя последовательность в SEQ ID NO: 4 может представлять собой любое, выбранное из А (аденина), Т (тимина), G (гуанина) и С (цитозина), в виде "N", в частности, А (аденин) или G (гуанин), без ограничения.
X, Z или Z' могут быть включены без ограничения, при условии, что это последовательность, происходящая из микроорганизма, содержащего ее. Кроме того, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 могут быть подтверждены в известной базе данных NCBI Genbank.
Полинуклеотид может быть таким, в котором X может представлять собой SEQ ID NO: 1 и/или нуклеотидную последовательность, гомологичную или идентичную ей по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более, a Z и Z' могут представлять собой SEQ ID NO: 5 и/или нуклеотидную последовательность, гомологичную или идентичную ей по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более, где полинуклеотидная последовательность, обладающая гомологией или идентичностью, может быть таковой из указанного выше диапазона, за исключением последовательности, обладающей идентичностью 100% или может быть последовательностью, обладающей идентичностью менее 100%.
В рамках данного изобретения полинуклеотид относится к такому, который может служить для увеличения продукции L-аминокислот с разветвленной цепью, при условии, что транспозон Y встроен в последовательность, происходящую из микроорганизма, включающую X, Z и Z'.
Кроме того, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или последовательность, гомологичная ей на 90% или более, может быть дополнительно включена 3'-конце Z', без ограничения. В частности, полинуклеотид не ограничен, при условии, что это последовательность, происходящая из микроорганизма, включающая SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более, на 3'-конце Z'.
В одном примере среди полинуклеотидных последовательностей, представленных Общей Формулой 1 выше, последовательность, включающая последовательность X-Z-Z' без Y, представляющего собой транспозон, и последовательность, добавленная на 3'-конце Z', может соответствовать расположенной в направлении против хода транскрипции последовательности NCgl2472, без ограничения.
В частности, полинуклеотидная последовательность, представленная Общей Формулой 1, приведенной выше, может представлять собой SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17, без ограничения.
В данном описании термин «гомология» или «идентичность» относится к степени родства между двумя заданными нуклеотидными последовательностями и может выражаться в процентах.
Термины «гомология» и «идентичность» зачастую могут использоваться взаимозаменяемо друг с другом.
Гомология или идентичность консервативных полинуклеотидных последовательностей может быть установлена при помощи стандартных алгоритмов выравнивания и может применяться со значениями штрафов за открытие гэпа, установленных в используемой программе по умолчанию. По существу, обычно предполагается, что гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются друг с другом в условиях умеренной или высокой жесткости по всей длине их последовательности или по меньшей мере на протяжение приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 80% или 90% от всей длины. Также имеют в виду и полинуклеотиды, которые вместо кодонов в гибридизующихся полинуклеотидах содержат вырожденные кодоны.
Установить, обладают ли две любые полинуклеотидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, можно, например, при помощи известного компьютерного алгоритма, такого как программа FASTA с использованием параметров по умолчанию (Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444). В альтернативном варианте, это можно установить при помощи алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), используемого в программе Needleman пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версии 5.0.0 или более поздней) (пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al, J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно устанавливать при помощи BLAST или ClustalW Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI).
Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов можно устанавливать путем сравнения информации о последовательности, например, с применением компьютерной программы GAP, такой как предложенная Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как описано Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как значение, полученное путем деления количества одинаковых выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных и 0 для неидентичных символов) и взвешенную матрицу сравнения, предложенную Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, как описано в Атласе белковых последовательностей и структур под ред. Schwartz and Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979) (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10 и штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы. Таким образом, термины «гомология» или «идентичность», используемые в данном документе, описывают родство между последовательностями.
Кроме того, вследствие вырожденности кодонов или с учетом предпочтения кодонов у организма, в котором экспрессируется полипептид, могут иметь место различные модификации в кодирующей области полинуклеотида по данному изобретению, в том объеме, который не меняет полинуклеотидную последовательность. Кроме того, полинуклеотид по данному изобретению может включать в себя зонд, который может быть получен из известной генной последовательности, например, любой полинуклеотидной последовательности, которая может гибридизоваться в жестких условиях с последовательностью, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности, так что по меньшей мере один нуклеотид замещается другим нуклеотидом в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 3 и обладает промоторной активностью, без ограничения. «Жесткие условия» относятся к условиям, при которых обеспечивается специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия подробно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al.). Например, жесткие условия могут включать условия, при которых гены, обладающие высокой гомологией или идентичностью 40% или выше, в частности, 70% или выше, 80% или выше, 85% или выше, 90% или выше, более конкретно, 95% или выше, еще более конкретно, 97% или выше, особенно 99% или выше, гибридизуются друг с другом, а гены, обладающие гомологией или идентичностью меньше указанных, не гибридизуются друг с другом, или стандартные условия отмывки при гибридизации по Саузерну, т.е., в частности, однократную, двукратную или трехкратную отмывку при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1X SSC, 0,1% SDS, в частности, 60°С, 0,1Х SSC, 0,1% SDS, и более конкретно, 68°С, 0,1Х SSC, 0,1% SDS.
Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновых кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя, в зависимости от строгости гибридизации, возможны несовпадения между основаниями. Термин «комплементарный» используется для описания взаимодействия между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, полинуклеотид по данному изобретению может включать выделенные фрагменты нуклеотидов, комплементарные полной последовательности, а также по существу схожие с ними нуклеиновокислотные последовательности.
В частности, полинуклеотиды, обладающие гомологией или идентичностью, можно выявить с применением условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm 55°С в описанных выше условиях. Кроме того, значение Tm может быть 60°С, 63°С или 65°С, без ограничения, и может быть соответствующим образом скорректировано специалистом в области техники в зависимости от его задачи.
Надлежащая строгость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и эти переменные хорошо известны в области техники (см. Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
В данном описании термин «микроорганизм, содержащий полинуклеотид», относится к микроорганизму, от природы обладающему способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, или к микроорганизму, у которого способность продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью передана родительскому штамму с отсутствием такой способности продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью. В частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающий полинуклеотид X-Z-Y-Z' [Общая Формула 1], без ограничения. В частности, в микроорганизме полинуклеотид представлен Общей Формулой X-Z-Y-Z', в Общей Формуле 1, приведенной выше, X представляет собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более, Y представляет собой транспозон, a Z и Z' могут представлять собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 90% или более.
В рамках данного изобретения микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, способный продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью, включающий полинуклеотид.
В данной заявке «микроорганизм, способный продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью» может применяться взаимозаменяемо с «микроорганизмом, продуцирующим аминокислоты с разветвленной цепью» и «микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью».
В данном описании термин «аминокислота с разветвленной цепью» относится к аминокислотам с разветвленной алкильной группой на боковой цепи, и он включает валин, лейцин и изолейцин. В частности, в данной заявке аминокислота с разветвленной цепью может представлять собой L-аминокислоту с разветвленной цепью, и L-аминокислота с разветвленной цепью может представлять собой L-валин или L-лейцин, без ограничения.
В данном описании термин «микроорганизм, продуцирующий аминокислоты с разветвленной цепью» включает все микроорганизмы дикого типа или микроорганизмы, генетически модифицированные естественным или искусственным образом, который может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки чужеродного гена или усиления или инактивации активности эндогенного гена, и может представлять собой микроорганизм, в котором возникает генетическая мутация или активность усиливается для продуцирования желаемых аминокислот с разветвленной цепью. Для задач данного изобретения микроорганизм, продуцирующий аминокислоты с разветвленной цепью, характеризуется тем, что продуцирование желаемых аминокислот с разветвленной цепью повышается путем включения полинуклеотид а и, в частности, он может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium. В частности, в данном изобретении микроорганизм, продуцирующий аминокислоты с разветвленной цепью или микроорганизм, обладающий свойством продуцирования аминокислот с разветвленной цепью, может представлять собой микроорганизм, в котором часть генов в пути биосинтеза аминокислот с разветвленной цепью усилена или ослаблена, или в котором часть генов, задействованных в пути деградации аминокислот с разветвленной цепью усилена или ослаблена, без ограничения.
В данном описании термин «микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-аминокислот с разветвленной цепью» может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, который обладает свойством продуцирования аминокислот с разветвленной цепью от природы или в результате модификации. В частности, в данной заявке микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий способностью производить аминокислоты с разветвленной цепью, может относиться к микроорганизму рода Corynebacterium, содержащему полинуклеотид по данной заявке или трансформированному вектором, содержащим ген, кодирующий полинуклеотид, таким образом обладающему продуктивностью по аминокислотам с разветвленной цепью. «Микроорганизм, рода Corynebacterium, обладающий усиленной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью» может относиться к микроорганизму, у которого способность продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью усилена по сравнению с родительским штаммом до трансформации или с немодифицированным микроорганизмом.
«Немодифицированный микроорганизм» может относиться к самому природному штамму, микроорганизму, который не содержит полинуклеотид по данному изобретению, или к микроорганизму, который не трансформирован вектором, содержащим ген, кодирующий полинуклеотид и целевой белок.
В данной заявке «микроорганизм рода Cory neb acterium» может, в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis и так далее, без ограничения.
В другом аспекте данного изобретения является предложена композиция для получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающая полинуклеотидную последовательность.
Композиция для получения L-аминокислот с разветвленной цепью означает композицию, способную продуцировать L-аминокислоты с разветвленной цепью благодаря полинуклеотиду по настоящему изобретению. Например, композиция включает полинуклеотид и может дополнительно включать, без ограничения, структуру, способную управлять полинуклеотидом. Полинуклеотид может быть в форме, включенной в вектор для обеспечения экспрессии функционально связанного гена, внедренного в клетку-хозяина.
В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ получения L-аминокислот с разветвленной цепью, включающий: культивирование микроорганизма рода Corynebacterium в среде и выделение L-аминокислот с разветвленной цепью из среды или его культуры.
В указанном выше способе стадия культивирования микроорганизма может осуществляться известным периодическим культивированием, непрерывным культивированием, культивированием с подпиткой и так далее, без ограничения. В частности, применительно к условиям культивирования, рН культуры можно доводить до подходящих значений рН (например, от рН 5 до рН 9, в частности, от рН 6 до рН 8, и более конкретно, рН 6,8) с помощью основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммония) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты), без ограничения. Кроме того, для поддержания аэробного состояния можно закачивать в культуру кислород или кислородсодержащую газовую смесь. Температуру культуры можно поддерживать от 20°С до 45°С, и в частности, от 25°С до 40°С, и осуществлять культивирование в течение от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов, без ограничения. Продуцируемые в ходе культивирования аминокислоты могут секретироваться в среду или оставаться в клетках.
Кроме того, в используемой культуральной среде в качестве источника углерода можно использовать сахара и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например, соевое масло, масло семян подсолнечника, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например, глицерин и этанол) и органические кислоты (например, уксусную кислоту), как в отдельности, так и в комбинации, без ограничения. В качестве источника азота можно использовать азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, мальтозный экстракт, кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония), как в отдельности, так и в комбинации, без ограничения. В качестве источника фосфора можно использовать однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, их соответствующие натрийсодержащие соли, как в отдельности, так и в комбинации, без ограничения. Кроме того, среда также может содержать незаменимые способствующие росту соединения, такие как другие соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.
В способе выделения аминокислот, полученных на стадии культивирования по данному изобретению, желаемые аминокислоты можно собирать из культуральной жидкости подходящим способом, известным в области техники, соответствующим способу культивирования. Например, можно применять центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и ВЭЖХ, и можно собирать желаемые аминокислоты из среды или микроорганизма подходящим способом, известным в области техники.
Кроме того, стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки и его можно осуществлять подходящим способом, известным в области техники. Таким образом, выделенные аминокислоты могут находиться в очищенном состоянии или в форме ферментированного микроорганизмом раствора, содержащего аминокислоты (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
Кроме того, в рамках данного изобретения микроорганизм, содержащий полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, характеризуется тем, что продуцирование аминокислот с разветвленной цепью, включая валин, лейцин или изолейцин, повышается. Это важно в том плане, что продуцирование аминокислот с разветвленной цепью может быть повышено за счет полинуклеотида по данному изобретению, обладающего промоторной активностью, по сравнению со штаммом рода Corynebacterium дикого типа, не способного продуцировать аминокислоты с разветвленной цепью или способного продуцировать их в следовом количестве.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ увеличения продукции L-аминокислот с разветвленной цепью, включающий: добавление полинуклеотидной последовательности в микроорганизм.
В еще одном аспекте данного изобретения предложено применение полинуклеотидной последовательности для получения L-аминокислот с разветвленной цепью.
В следующем аспекте данного изобретения предложено применение микроорганизма для получения L-аминокислот с разветвленной цепью.
«Увеличение продукции L-аминокислот с разветвленной цепью» относится к увеличению способности продуцировать L-аминокислоты с разветвленной цепью, обеспечивающей продуцирование L-аминокислот с разветвленной цепью с высоким выходом по сравнению с микроорганизмом до включения полинуклеотидной последовательности, то есть немодифицированным микроорганизмом.
«Полинуклеотид» и «L-аминокислоты с разветвленной цепью» являются такими, как описано выше.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее данное изобретение будет описано более подробно на Примерах. Однако, данные Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях, и объем изобретения не ограничивается указанными Примерами.
Пример 1. Отбор мутантных штаммов для увеличения способности продуцировать налип посредством случайного мутагенеза
Пример 1-1. Индукция случайного мутагенеза посредством УФ облучения Для отбора мутантных штаммов с повышенной способностью продуцировать валин штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (патент Кореи №10-1117022), продуцирующий валин, высаживали на питательную среду, содержащую агар, и культивировали при 30°С в течение 36 часов. Сотни полученных таким образом колоний облучали УФ при комнатной температуре для индукции случайных мутаций в геноме штамма.
Пример 1-2. Эксперимент с ферментативным титром штаммов с индуцированными мутациями и отбор штаммов
Эксперимент с ферментативным титром штаммов, в которых индуцировали случайную мутацию, проводили для отбора мутантных штаммов с повышенной продуктивностью по L-валину по сравнению с Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, использованным в качестве родительского штамма. Каждую колонию субкультивировали в питательной среде и затем каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. Затем при помощи ВЭЖХ анализировали концентрацию L-валина, результаты анализа концентрации L-валина показаны в Таблице 1 ниже.
Питательная среда (рН 7,2)
Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
Глюкоза 100 г, (NH4)2SO4 40 г, белок сои 2,5 г, твердые вещества экстракта кукурузы 5 г, мочвина 3 г, KH2PO4 1 г, MgSO4 × 7 Н2О 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1 мг, кальция пантотенат 2 мг, никотинамид 3 мг, СаСО3 30 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Согласно Таблице 1, отбирали штамм С10 с наибольшим увеличением продукции валина по сравнению с контрольным родительским штаммом KCCM11201P. Пример 2. Подтверждение мутации посредством секвенирования генов
Основные гены штамма С10 с повышенной способностью продуцировать валин секвенировали и сравнивали с генами штамма KCCM11201P и штамма дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС14067. В результате подтвердили, что штамм С10 содержал транспозон в определенном положении.
В частности, подтвердили, что в С10 транспозон, представленный SEQ ID NO: 3, был встроен на 3'-конце 11 последовательности SEQ ID NO: 5.
В следующих ниже Примерах предпринимали попытку определить влияние встроенного в определенном положении транспозона на продукцию аминокислот с разветвленной цепью у микроорганизмов рода Corynebacterium, то есть валина, изолейцина и лейцина.
Пример 3. Получение штаммов с встроенным транспозоном и оценка их способности продуцировать валин
Пример 3-1. Получение штамма с встроенным транспозоном из Corynebacterium glutamicum KCCM11201P и оценка его способности продуцировать L-валин
Для встраивания транспозона, представленного SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum KCCM11201P получали вектор, содержащий целевую мутацию. Подробнее, выделяли геномную ДНК штамма С10 с использованием мини-набора для выделения общей ДНК G-spin (intron, кат.номер 17045) согласно протоколу, прилагаемому к набору, и использовали геномную ДНК в качестве матрицы для проведения ПЦР. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут и затем 25 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 150 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут, и получали продукт ПЦР размером 1485 пн с использованием праймера 1 с последовательностью SEQ ID NO: 8 и праймера 2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 (далее обозначаемый как «фрагмент 1 с внедренной мутацией»).
Полученный фрагмент 1 с внедренной мутацией обрабатывали рестрикционным ферментом XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) и затем лигировали с вектором pDZ (патент Кореи №10-0924065 и международная публикация № WO 2008-033001), обработанным тем же самым рестрикционным ферментом, с применением лигазы Т4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Полученным геном трансформировали Е. coli DH5α и затем проводили отбор на среде LB, содержащей канамицин. Получали ДНК с применением набора для очистки плазмидной ДНК DNA-spin (iNtRON) и получали вектор pDZ-PNCgl2472(Tn), содержащий фрагмент 1 с внедренной мутацией.
Затем Corynebacterium glutamicum KCCM11201P трансформировали pDZ-PNCgl2472(Tn) посредством гомологичной рекомбинации с хромосомой (van der Rest et al., ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Штамм с вектором, внедренным в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Затем штамм, в котором транспозон с последовательностью SEQ ID NO: 3, был встроен на З'-конце 11 последовательности SEQ ID NO: 5, верифицировали при помощи ПЦР с использованием праймера 1 с последовательностью SEQ ID NO: 8 и праймера 2 с последовательностью SEQ ID NO: 9 на основе трансформанта Corynebacterium glutamicum, в котором произошла вторичная рекомбинация. Рекомбинантный штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11201P-PNCgl2472-Tn обозначали СА08-1533 и депонировали под регистрационным номером KCCM12707P.
Для сравнения способности продуцировать валин у продуцирующих валин штаммов Corynebacterium glutamicum KCCM11201P и СА08-1533 проводили оценку в колбах. Каждый штамм субкультивировали в питательной среде и затем каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. Затем при помощи ВЭЖХ анализировали концентрацию L-валина, результаты анализа концентрации L-валина показаны в Таблице 3 ниже.
Питательная среда (рН 7,2)
Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
Глюкоза 100 г, (NH4)2SO4 40 г, белок сои 2,5 г, твердые вещества экстракта кукурузы 5 г, мочевина 3 г, KH2PO4 1 г, MgSO4 × 7 Н2О 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1 мг, кальция пантотенат 2 мг, никотинамид 3 мг, СаСО3 30 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
В результате подтвердили, что способность продуцировать L-валин у штамма СА08-1533 повышалась на 7,4% по сравнению с KCCM11201P.
Пример 3-2. Получение штамма с встроенным транспозоном из Corynebacterium glutamicum CJ7V и оценка его способности продуцировать L-валин
Для исследования, проявляется ли эффект повышения способности продуцировать L-валин у других продуцирующих L-валин штаммов Corynebacterium glutamicum, внедряли один вид мутации (ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, issue 3, pp.45 - 467) в штамм дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС14067 для получения штамма, обладающего улучшенной способностью продуцировать L-валин.
Подробнее, выделяли геномную ДНК штамма дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 с применением мини-набора для выделения общей ДНК G-spin (intron, кат. номер 17045) согласно протоколу, прилагаемому к набору. Геномную ДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР. Для конструирования вектора для внедрения мутации A42V в ген ilvN использовали набор праймеров из праймера 3 (SEQ ID NO: 10) и праймера 4 (SEQ ID NO: 11) и набор праймеров из праймера 5 (SEQ ID NO: 12) и праймера 6 (SEQ ID NO: 13) для получения фрагментов ДНК (А, В), соответственно. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут и затем 25 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут.
В результате получали фрагменты А и В, каждый из которых имел полинуклеотид из 537 пн. Используя указанные два фрагмента в качестве матрицы, проводили ПЦР по методу перекрывания-продления с применением праймера 3 с последовательностью SEQ ID N0:10 и праймера 6 с последовательностью SEQ ID NO: 13. Получали продукт ПЦР размером 1044 пн (далее обозначаемый как «фрагмент 2 с внедренной мутацией»).
Полученный фрагмент 2 с внедренной мутацией обрабатывали рестрикционным ферментом XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) и затем лигировали с вектором pDZ, обработанным тем же самым рестрикционным ферментом, с применением лигазы Т4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Полученным геном трансформировали Е. coli DH5α и затем проводили отбор на среде LB, содержащей канамицин. Получали ДНК с применением набора для очистки плазмидной ДНК DNA-spin (iNtRON). Вектор для внедрения мутации A42V в ген ilvN обозначали pDZ-ilvN(A42V).
Затем Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 трансформировали pDZ-ilvN(A42V) посредством гомологичной рекомбинации с хромосомой (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Штамм с вектором, внедренным в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина.
Амплифицировали фрагмент гена основе трансформанта Corynebacterium glutamicum, в котором произошла вторичная рекомбинация, при помощи ПЦР с применением праймера 3 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и праймера 6 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и подтверждали внедрение мутации в штамм посредством секвенирования. Рекомбинантный штамм обозначали Corynebacterium glutamicum CJ7V.
Наконец, получали штамм, трансформированный pDZ-PNCgl2472(Tn), таким же образом, как описано в Примере 3-1, на основе Corynebacterium glutamicum CJ7V и обозначали CJ7V-PNCgl2472-Tn. В частности, подтверждали, что в CJ7V-PNCgl2472-Tn транспозон, представленный SEQ ID NO: 3, был встроен на 3'-конце 11 последовательности SEQ ID NO: 5.
Для сравнения способности продуцировать L-валин у полученных штаммов штаммы культивировали таким же образом, как в Примере 3-1, и затем анализировали концентрацию L-валина, результаты анализа концентрации L-валина показаны в Таблице 5 ниже.
В результате подтвердили, что способность продуцировать L-валин у штамма CJ7V-NCgl2472(Tn) повышалась на 9,4% по сравнению с CJ7V.
Пример 3-3. Получение штамма с встроенным транспозоном из Corynebacterium glutamicum CJ8V и оценка его способности продуцировать L-валин
Для изучения, наблюдается ли эффект повышения способности продуцировать L-валин у других продуцирующих L-валин штаммов Corynebacterium glutamicum, внедряли один вид мутации (ilvN(A42V)) в штамм дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 для получения штамма, обладающего улучшенной способностью продуцировать L-валин, и обозначали рекомбинантный штамм Corynebacterium glutamicum CJ8V.
Для встраивания транспозона, представленного SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum CJ8V получали вектор, содержащий целевую мутацию. Подробнее, выделяли геномную ДНК штамма С10 с использованием мини-набора для выделения общей ДНК G-spin (intron, кат. номер 17045) согласно протоколу, прилагаемому к набору, и использовали геномную ДНК в качестве матрицы для проведения ПЦР. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут и затем 25 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 150 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 7 минут и получали продукт ПЦР размером 1082 пн (фрагмент А') с использованием праймера 1 с последовательностью SEQ ID NO: 8 и праймера 7 с последовательностью SEQ ID NO: 14. Дополнительно, выделяли геномную ДНК штамма АТСС 13869 с использованием мини-набора для выделения общей ДНК G-spin (intron, кат. номер 17045) согласно протоколу, прилагаемому к набору, и использовали геномную ДНК в качестве матрицы для проведения ПЦР. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 5 минут и затем 25 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация элонгация при 72°С в течение 150 секунд, с последующей элонгацией при 72°С в течение 7 минут и получали продукт ПЦР размером 328 пн (фрагмент В') с использованием праймера 2 с последовательностью SEQ ID NO: 9 и праймера 8 с последовательностью SEQ ID NO: 15. Используя указанные два фрагмента в качестве матрицы, проводили ПЦР по методу перекрывания-продления с применением праймера 1 (SEQ ID NO: 8) и праймера 2 (SEQ ID NO: 9). Получали продукт ПЦР размером 1390 пн (далее обозначаемый как «фрагмент 3 с внедренной мутацией»).
Полученный фрагмент 3 с внедренной мутацией обрабатывали рестрикционным ферментом XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA) и затем лигировали с вектором pDZ (патент Кореи №10-0924065 и международная публикация № WO 2008-033001), обработанным тем же самым рестрикционным ферментом, с применением лигазы Т4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Полученным геном трансформировали Е. coli DH5α и затем проводили отбор на среде LB, содержащей канамицин. Получали ДНК с применением набора для очистки плазмидной ДНК DNA-spin (iNtRON) и получали вектор pDZ-PNCgl2472(Tn)-l, содержащий фрагмент 3 с внедренной мутацией. Использованные последовательности праймеров приведены в Таблице 6 ниже.
Продуцирующий L-валин штамм Corynebacterium glutamicum CJ8V трансформировали pDZ-PNCgl2472(Tn)-1 посредством гомологичной рекомбинации с хромосомой таким же образом, как описано в Примере 3-1, и обозначали CJ8V-PNCgl2472-Tn-l. В частности, подтверждали, что в CJ8V-PNCgl2472-Tn-1 транспозон, представленный SEQ ID NO: 3, был встроен на 3'-конце 11й последовательности SEQ ID NO: 5.
Для подтверждения способности продуцировать L-валин у штамма CJ8V-PNCgl2472-Tn-l, полученного выше, штамм культивировали таким же образом, как в Примере 3-1 для анализа концентрации L-валина, результаты анализа концентрации L-валина показаны в Таблице 7 ниже.
В результате подтвердили, что способность продуцировать L-валин у штамма CJ7V-PNCgl2472-Tn-1 повышалась на 8,7% по сравнению с CJ8V.
Пример 4. Получение штаммов с встроенным транспозоном из продуцирующих L-лейцин штаммов Corynebacterium glutamicum KCCM11661P, KCCM11662 и оценка их способности продуцировать L-лейцин
Продуцирующие L-лейцин штаммы Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (патент Кореи №10-1851898) и KCCM11662P (патент Кореи №10-1796830) трансформировали pDZ-PNCgl2472(Tn)-1 и pDZ-PNCgl2472(Tn) посредством гомологичной рекомбинации с хромосомой (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), соответственно. Штаммы с вектором, внедренным в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, отбирали на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Затем штаммы, в хромосому которых был встроен транспозон, верифицировали при помощи ПЦР с использованием праймера 1 с последовательностью SEQ ID NO: 8 и праймера 2 с последовательностью SEQ ID NO: 9 на основе трансформантов Corynebacterium glutamicum, в которых произошла вторичная рекомбинация. Рекомбинантные штаммы обозначали Corynebacterium glutamicum KCCM11661P-PNCgl2472-Tn и KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1, соответственно.
Для сравнения способности продуцировать лейцин у Corynebacterium glutamicum KCCM11661P-PNCgl2472-Tn-1 и KCCM11662P-PNCgl2472-Tn проводили эксперимент с ферментативным титром. Каждый штамм субкультивировали в питательной среде и затем каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. Затем при помощи ВЭЖХ анализировали концентрацию L-лейцина, результаты анализа концентрации L-лейцина показаны в Таблице 7 ниже.
Питательная среда (рН 7,2)
Глюкоза 10 г, мясной экстракт 5 г, полипептон 10 г, хлорид натрия 2,5 г, дрожжевой экстракт 5 г, агар 20 г, мочевина 2 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
Глюкоза 50 г, (NH4)2SO4 20 г, твердые вещества экстракта кукурузы 20 г, KH2PO4 1 г, MgSO4 × 7 Н2О 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1 мг, СаСО3 15 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
В результате подтвердили, что способность продуцировать L-лейцин у штаммов KCCM11661P-PNCgl2472-Tn и KCCM11662P-PNCgl2472-Tn-1 повышалась приблизительно на 10% по сравнению с KCCM11661P и KCCM11662P, соответственно.
Пример 5. Получение штаммов с встроенным транспозоном из продуцирующего L-изолейцин штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11248P и оценка их способности продуцировать L-изолейцин
Получали штамм путем встраивания в хромосому продуцирующего L-изолейцин штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (патент Кореи №10-1335789) посредством гомологичной рекомбинации таким же образом, как описано в Примере 3-1 выше, и обозначали KCCM 11248P-PNCgl2472-Tn-1.
Для оценки способности продуцировать изолейцин штамм KCCM11248P-PNCgl2472-Tn-1 культивировали следующим образом.
Каждым штаммом инокулировали 25 мл среды для посева, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора посевной культуры инокулировали 24 мл среды для продуцирования, находящейся в конической колбе с дефлекторами объемом 250 мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 200 об/мин при температуре 30°С в течение 48 часов. Составы среды для посева и среды для продуцирования показаны ниже.
Среда для посева (рН 7,0)
Глюкоза 20 г, пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, мочевина 1,5 г, KH2PO4 4 г, K2HPO4 8 г, MgSO4 × 7 Н2О 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1000 мкг, кальция пантотенат 2000 мкг, никотинамид 2000 мкг (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (рН 7,0)
Глюкоза 100 г, (NH4)2SO4 40 г, белок сои 2,5 г, твердые вещества экстракта кукурузы 5 г, мочевина 3 г, KH2PO4 1 г, MgSO4 × 7 Н2О 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин-HCl 1000 мкг, кальция пантотенат 2000 мкг, никотинамид 3000 мкг, СаСО3 30 г (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
По окончании культивирования измеряли концентрацию L-изолейцина при помощи ВЭЖХ. Измеренная концентрация L-лизина приведена в Таблице 9 ниже.
В результате подтвердили, что способность продуцировать L-изолейцин у штамма KCCM11248P-PNCgl2472-Tn повышалась приблизительно на 34% по сравнению с KCCM11248P.
На основании вышеизложенного материала специалисты в области техники, к которой относится изобретение, поймут, что данное изобретение возможно реализовать и в других конкретных воплощениях без изменения технической концепции или существенных признаков данного изобретения. В этой связи, приведенные в качестве примеров воплощения, раскрытые в данном документе, служат исключительно для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем данного изобретения. Напротив, предполагается, что данное изобретение охватывает не только приведенные в качестве примера воплощения, но также и различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые будут соответствовать духу данного изобретения и входить в его объем, определяемый прилагающейся формулой изобретения.
Номер депонирования
Депозитарий: Центр культур микроорганизмов Кореи (Международный орган по депонированию)
Регистрационный номер: KCCM12707P
Дата депонирования: 20200427
1390
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Микроорганизм с усиленной способностью продуцировать
L-аминокислоты с разветвленной цепью и способ получения L-аминокислот
с разветвленной цепью с его применением
<130> OPA21082
<150> KR 10-2020-0061174
<151> 2020-05-21
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 1
caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta
60
tgacactaat ttcagcaaa
79
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 2
cttgagttta g
11
<210> 3
<211> 970
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 3
agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac
60
gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc
120
tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc
180
cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt
240
cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac
300
atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga
360
gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa
420
cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc
480
cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat
540
cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac
600
attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga
660
cgccggatac gactcaagca agacccgcag tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt
720
gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa
780
ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt
840
cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga
900
ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc
960
gatctcttag
970
<210> 4
<211> 177
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> (177)
<223> n представляет собой a или g
<400> 4
ctaataccgc aaatgggggt agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg
60
agtttttctc taaaaccggc gtgaactggg ggttaactac ctcttcgggg gtggttgggg
120
tggcgggggt agtccttgag gggtggggaa cttatttaaa tacccccgaa aaacaan
177
<210> 5
<211> 188
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<220>
<221> misc_feature
<222> (188)
<223> n представляет собой a или g
<400> 5
cttgagttta gctaataccg caaatggggg tagcgggtgt gttgaggggt ggctggccgg
60
acagggattt gagtttttct ctaaaaccgg cgtgaactgg gggttaacta cctcttcggg
120
ggtggttggg gtggcggggg tagtccttga ggggtgggga acttatttaa atacccccga
180
aaaacaan
188
<210> 6
<211> 153
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 6
gcaaatggac acccgtgcca acatattagc gatccgcctc gactatgttc acccccaaag
60
gggaagtaca ctgtaccctt gtcgaatgat tgttactcgt gacgcgccct atgggtgtac
120
cagcacgggt gtaaagcagg aggaaatctg aag
153
<210> 7
<211> 153
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 7
gcaaatggaa acccgtgcca acatattggc gatccgcctc gactatgttc acccccaaag
60
gggaagtaca ctgtaccctt gtcgaatgat tgttactcgt gacgcgccct atgggtgtac
120
cagcacgggt gtaaagcagg aggaaatctg aag
153
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 1
<400> 8
ctattctaga caaaggtttg gcagtttc
28
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 2
<400> 9
ctattctaga cttcagattt cctcctgctt
30
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 3
<400> 10
aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg
32
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 4
<400> 11
agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac
30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 5
<400> 12
gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact
30
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 6
<400> 13
aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg
32
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 7
<400> 14
taccgcaaat gggggtagcg g
21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 8
<400> 15
ccgctacccc catttgcggt a
21
<210> 16
<211> 1390
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 16
caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta
60
tgacactaat ttcagcaaac ttgagtttag agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc
120
cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga
180
aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct
240
ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca
300
ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg
360
cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg
420
ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta
480
cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc
540
cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa
600
acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa
660
ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc
720
cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga cgccggatac gactcaagca agacccgcag
780
tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc
840
cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact
900
gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc
960
cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg
1020
cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc gatctcttag ctaataccgc aaatgggggt
1080
agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg agtttttctc taaaaccggc
1140
gtgaactggg ggttaactac ctcttcgggg gtggttgggg tggcgggggt agtccttgag
1200
gggtggggaa cttatttaaa tacccccgaa aaacaaagca aatggacacc cgtgccaaca
1260
tattagcgat ccgcctcgac tatgttcacc cccaaagggg aagtacactg tacccttgtc
1320
gaatgattgt tactcgtgac gcgccctatg ggtgtaccag cacgggtgta aagcaggagg
1380
aaatctgaag
1390
<210> 17
<211> 1390
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> полинуклеотид
<400> 17
caaaggtttg gcagtttcgt ccaataattt cactttttcc acaaggaaaa aggtgttcta
60
tgacactaat ttcagcaaac ttgagtttag agattgcgcg gatagaaaga tacagggggc
120
cacggtgggg tggtgaacaa gagcaggcac gaggcctggt agatacggat tcgaccaaga
180
aaacgtacac cactcaggag cactcgtgcc tgcccttcca tcctctatca tcgaccccct
240
ctggtgccag ttcgccgcgc tgatcccacc cgtgaccgac acccacccac ttcggtgcca
300
ccgcccacgc atcccggacc ggatcatctt cgacaagctc atccaggtcc tcgtcctcgg
360
cgcctcctat gccaagatcg ccgacacgac atgctcggcc accaccttgc gcacccgccg
420
ggacgagtgg atcaccgctg gcatcttcga gcagctggaa cagatctgtt tggaattcta
480
cgaccgtatc gtcggactcg atctggaaaa cttaagcgtg gacgggtgca tcgtcaaagc
540
cccctgcggt ggtgaagccg ccgggcgatc cccggttgac cggggcaaac aaggcacgaa
600
acgctccctg ctggtcgacg gcgcaggtat cccgcttggg tgcgtggtcg ccggtgccaa
660
ccggcatgac tcaccgttgt tgcgcccgac attggagaaa ctaggccggt tcggactcgc
720
cctgcccgat caaatcaccg tgcatctgga cgccggatac gactcaagca agacccgcag
780
tctgttgacc gaacttggct gcgagtgggt gatcagccag aaaggggtcc cgttgcaggc
840
cggggcccgg tgggtggtgg aacggacgaa ctcgtggcat aaccgcgggt tcaagaaact
900
gcaggtgtgt accgaacgtc gcatccgggt cattgaagcg ttcatttctt tagccaacgc
960
cgtgatcgtt gttcgccggc tggtccggga ggcctggtgc acctatcgct gggagactcg
1020
cccgacccaa caaccctgac ctatccgcgc gatctcttag ctaataccgc aaatgggggt
1080
agcgggtgtg ttgaggggtg gctggccgga cagggatttg agtttttctc taaaaccggc
1140
gtgaactggg ggttaactac ctcttcgggg gtggttgggg tggcgggggt agtccttgag
1200
gggtggggaa cttatttaaa tacccccgaa aaacaaggca aatggaaacc cgtgccaaca
1260
tattggcgat ccgcctcgac tatgttcacc cccaaagggg aagtacactg tacccttgtc
1320
gaatgattgt tactcgtgac gcgccctatg ggtgtaccag cacgggtgta aagcaggagg
1380
aaatctgaag
<---
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащий полинуклеотидную последовательность, представленную X–Z–Y–Z′, где X представляет собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более, Y представляет собой транспозон, состоящий из SEQ ID NO: 3, Z представляет собой последовательность от 0 до 11 положения последовательности SEQ ID NO: 5, и Z′ представляет собой последовательность от 12 положения последовательности SEQ ID NO: 5 до 188 положения последовательности SEQ ID NO: 5, Z-Z’ представляет собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более. Предложены также композиция для получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащая полинуклеотидную последовательность, и способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, включающий культивирование указанного микроорганизма. Изобретение обеспечивает эффективное получение L-аминокислоты с разветвленной цепью. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 табл., 5 пр.
1. Микроорганизм рода Corynebacterium для получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащий полинуклеотидную последовательность, представленную ниже Общей Формулой 1:
[Общая Формула 1]
X–Z–Y–Z′,
в Общей Формуле 1, приведенной выше,
X представляет собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более,
Y представляет собой транспозон, состоящий из SEQ ID NO: 3,
Z представляет собой последовательность от 0 до 11 положения последовательности SEQ ID NO: 5, и Z′ представляет собой последовательность от 12 положения последовательности SEQ ID NO: 5 до 188 положения последовательности SEQ ID NO: 5,
Z-Z’ представляет собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более.
2. Микроорганизм по п. 1, где Y встроен в направлении по ходу транскрипции от 11 положения последовательности SEQ ID NO: 5.
3. Микроорганизм по п. 1, где Z и Z′ представляют собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более.
4. Микроорганизм по п. 1, где X, Z или Z′ представляет собой последовательность, происходящую из микроорганизма, содержащего ее.
5. Микроорганизм по п. 1, дополнительно содержащий на 3′-конце Z′ SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или последовательность, гомологичную им на 95% или более.
6. Микроорганизм по п. 5, где последовательность, дополнительно включенная на 3′-конце Z′, представляет собой последовательность, происходящую из микроорганизма, содержащего ее.
7. Микроорганизм по любому из пп. 1-6, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.
8. Композиция для получения L-аминокислоты с разветвленной цепью, содержащая полинуклеотидную последовательность, представленную ниже Общей Формулой 1, и структуру, способную управлять полинуклеотидом:
[Общая Формула 1]
X–Z–Y–Z′,
в Общей Формуле 1, приведенной выше,
X представляет собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более,
Y представляет собой транспозон, состоящий из SEQ ID NO: 3,
Z представляет собой последовательность от 0 до 11 положения последовательности SEQ ID NO: 5, и Z′ представляет собой последовательность от 12 положения последовательности SEQ ID NO: 5 до 188 положения последовательности SEQ ID NO: 5,
Z-Z’ представляет собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более.
9. Композиция по п. 8, где Y встроен в направлении по ходу транскрипции от 11 положения последовательности SEQ ID NO: 5.
10. Композиция по п. 8, где Z и Z′ представляют собой SEQ ID NO: 5 или последовательность, гомологичную ей на 95% или более.
11. Способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью,
включающий:
культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по любому из пп. 1-6 в среде
и
выделение L-аминокислот с разветвленной цепью из среды или его культуры.
| KENNERKNECHT N | |||
| ET AL | |||
| Export of L-isoleucine from Corynebacterium glutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family | |||
| J Bacteriol | |||
| Топчак-трактор для канатной вспашки | 1923 |
|
SU2002A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| Устройство для магнитного каротажа скважин | 1960 |
|
SU135157A1 |
| EP 3567110 A1, 13.11.2019 | |||
| СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА L-АМИНОКИСЛОТ ПОСРЕДСТВОМ ФЕРМЕНТАЦИИ | 2001 |
|
RU2268941C2 |
