ВЕКТОРЫ ЭКСПРЕССИИ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА Российский патент 2024 года по МПК C12N15/86 

Область техники, к которой относится изобретение

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к векторам экспрессии для получения белков в клетках млекопитающих. Группа изобретений представлена векторами экспрессии на основе вирусной частицы аденоассоциированного вируса (AAV), которые могут найти свое применение в медицине, в частности для терапии врожденной дисфункции коры надпочечников.

Уровень техники

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН, врожденная гиперплазия надпочечников) - это группа заболеваний, связанных с дефицитом кортизола и/или альдостерона (стероидных гормонов). Дефицит вызван генетическими мутациями в ферменте, участвующем в образовании кортизола и альдостерона из холестерина. Фермент может полностью отсутствовать или производиться в недостаточном количестве. Самые известные формы врожденной гиперплазии коры надпочечников - дефицит фермента 21-гидроксилазы и дефицит 11-бета-гидроксилазы. Дефицит 21-гидроксилазы (CYP21A2) может вызывать снижение уровня кортизола/альдостерона и повышать концентрацию андрогенов. Избыток андрогенов приводит к изменению наружных половых органов по мужскому типу у новорожденных девочек (т.н. вирилизация). Мальчики с данным генетическим дефектом при рождении не показывают характерной клинической симптоматики, но подвержены раннему половому созреванию из-за избытка андрогенов. У людей с таким генетическим дефектом могут рано появиться волосы на лице и теле, акне, а также наблюдаться нарушения менструального цикла. Патология также может привести к бесплодию. Дефицит фермента 21-гидроксилазы возникает из-за мутаций в гене CYP21A2. Больные могут иметь классический (более тяжелый) и неклассический вариант заболевания.

Классический дефицит может быть:

1. Сольтеряющим - тяжелая форма болезни, которая обусловлена чрезвычайно низкой активностью фермента, что вызывает дефицит кортизола и альдостерона. Дефицит альдостерона приводит к патологическому снижению натрия (гипонатриемия) и повышению калия (гиперкалиемия) в организме. При отсутствии лечения может привести к острой надпочечниковой недостаточности и шоку.

2. Простым - активность фермента снижена, но при этом остается достаточной для того, чтобы поддерживать синтез альдостерона на нормальном или немного пониженном уровне.

Неклассический вариант патологии - наиболее распространенный вариант, который вызывает менее тяжелую форму заболевания. Встречается примерно у одного из полутора тысяч новорожденных в европеоидной популяции. При этом варианте развития патологии активность фермента составляет примерно 50%, что позволяет избежать критического дефицита натрия и тяжелых последствий. Концентрация андрогенов повышена незначительно.

Лечение ВДКН согласно Федеральным клиническим рекомендациям [Федеральные клинические рекомендации - протоколы по ведению пациентов с врожденной дисфункцией коры надпочечников в детском возрасте, Проблемы эндокринологии, 2014;60(2): 42 50] осуществляется консервативными методами.

Так препаратом выбора для лечения детей с ВДКН является таблетированный гидрокортизон (1+++). Применение сиропа гидрокортизона и пролонгированных форм глюкокортикоидов у детей в период активного роста не показано (1++). Всем детям с сольтеряющей формой ВДКН показано назначение флудрокортизона, детям грудного возраста - дополнительное введение в пищевой рацион поваренной соли (1++).

Основным принципом терапии всех форм ВДКН является назначение глюкокортикоидов, которые позволяют заместить дефицит кортизола и тем самым подавить избыточную секрецию адренокортикотропного гормона (АКТГ). В результате снижается продукция надпочечниками тех стероидов, которые синтезируются в избытке при конкретном ферментативном блоке.

Существуют различные медикаментозные препараты, обладающие глюкокортикоидной активностью: преднизолон, кортизон, дексаметазон. Пролонгированные синтетические глюкортикоидные препараты (преднизолон, дексаметазон) негативно влияют на рост. Для детей с открытыми зонами роста, особенно младшего возраста, наиболее оптимальными препаратами следует считать таблетированные аналоги гидрокортизона. Первоначальная суточная доза гидрокортизона, необходимая для подавления секреции АКТГ у детей 1-го года жизни, может достигать 20 мг/м². В среднем суточная доза гидрокортизона у детей старше 1 года должна составлять 10-15 мг/м². Препарат дается 3 раза в день в равных дозах (в 7.00, 15.00 и 22.00).

При сольтеряющей форме ВДКН необходима терапия препаратом минералокортикоидов - флудрокортизоном, который назначается в дозе 0,05-0,15 мг в сутки (1-2 раза в день). У детей грудного возраста потребность в минералокортикоидах выше и может достигать 0,3 мг в сутки; дозу можно разделить на 3 приема. У детей без клинических проявлений сольтеряющего синдрома может отмечаться субклинический дефицит минералокортикоидов, критерием которого является повышенный уровень ренина. В таких случаях также показана терапия флудрокортизоном.

Альтернативой консервативному лечению может стать генетическая терапия.

Аденоассоциированный вирус (AAV) является перспективным для использования в генной терапии человека. AAV обладает способностью эффективно инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки человека, при этом геном AAV интегрирует в единичный сайт хромосомы в геном клетки-хозяина. При этом наличие AAV в организме человека не связывают с каким-либо заболеванием.

Известны AVV векторы для генетической терапии, решающие задачу создания средств и способов, при которых возможно получение стабильного и высокого крупномасштабного выхода векторов AAV в клетках насекомых [RU2457252 С2, 27.07.2012]. Таким образом, известные векторы являются универсальными, то есть подходящими для использования их вне зависимости от конкретного заболевания. Однако конкретные задачи зачастую требуют конкретных решений, поэтому под каждую задачу приходится создавать свою оптимальную конструкцию.

Из уровня техники известен AAV вектор, содержащий гРНК и Cas9, где молекула Cas9 представляет собой активную или неактивную Cas9 S. pyogenes. Вектор используется для противоопухолевой терапии, в том числе надпочечников [RU2019133280 A, 22.04.2021]. Однако данное решение не предназначено для терапии врожденной дисфункции коры надпочечников. Также известен AAV вектор, содержащий Cas9, NLS, HA [KR1020150056539 А, 26.05.2015].

Кроме того, известен вектор AAV, содержащий Cas9, SV40 NLS, HA [US20210054405 А, 25.02.2021] и AAV вектор, в том числе серотипа 2, содержащий гидовую РНК, ITR, предназначенный для терапии надпочечников [WO2020082047 А1, 23.04.2020]. Однако ни один из этих векторов не решает задачу терапии врожденной дисфункции коры надпочечников.

Известно применение векторов для нацеливания на ген CYP21A2 в геноме человека, содержащие гидовую РНК и Streptococcus pyogenes Cas9. NLS, фактор элонгации эукариот EF1 альфа [Neville E. Sanjana, Ophir Shalem and Feng Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening, Nat Methods. 2014 Aug; 11(8): 783-784]. Данное решение является наиболее близким к заявляемому решению, однако данное решение касается лентивирусного вектора, что не подходит для лечения врожденной дисфункции коры надпочечников.

Техническая проблема, решаемая заявляемой группой изобретений, заключается в создании генетических конструкций, содержащих оптимизированные последовательности, включая Cas9 S. pyogenes, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.

Раскрытие сущности изобретения

При реализации заявленной группы изобретений достигаются следующие технические результаты:

1. достаточно легкое производство;

2. степень неспецифического разрезания 0,01%;

3. широкий тропизм к разным тканям;

4. высокий уровень экспрессии трансгена: количество вирусных геномов на клетку - от 1 до 100, экспрессия - от 10^-4 до 10^-1 относительно контрольного гена GAPDH.

Технические результаты достигаются за счёт следующего.

Одно из изобретений группы представляет собой вектор экспрессии pAAV-nEFCas9.

Данный вектор представляет собой вирусные частицы аденоассоциированных вирусов, белки капсида природных серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9hu14, rh10 и других) или серотипов, полученных методами синтетической биологии (DJ/8, DJ, anc32 и другие).

В качестве генома в частицы упакована одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены ITR (internal terminal repeats) вируса AAV, в предпочтительном варианте серотипа 2. Данные ITRs AAV хорошо изучены, их использование даёт стабильный ожидаемый эффект. Однако возможно использование других ITRs AAV, поскольку в уровне техники отсутствуют сведения, указывающие на то, что ITRs из других серотипов AAV при использовании будут давать некорректный результат. Внутри ITRs AAV последовательно расположены промотор первого фактора элонгации эукариот EF1 альфа. Выбор именно этого промотора является результатом серии экспериментов, в которых было показано, что он дает высокий уровень экспрессии трансгена в конструкции вектора по настоящему изобретению. При этом он является эукариотическим, а не вирусным, следовательно, не будет метилироваться и ингибироваться, что также является дополнительным преимуществом настоящего изобретения. Кроме того, промотор является конститутивным, т.е. он будет работать во всех типах клеток. После упомянутого промотора расположена последовательность гистидиновой метки (HA (human influenza hemagglutinin) epitopetag), которая служит для легкой идентификации трансгена методами вестерн-блота, цитометрии и иммуногистохимии. После метки следует сигнал внутриклеточной локализации в ядре 5’-SV40 NLS. Преимуществом данного ядерного сигнала является небольшой размер и, как было показано, высокая степень трансфера белка в ядро. Далее идет кодон-оптимизированная последовательность гена Cas9 Streptococcus pyogenes. Эффектор Cas9 обладает сравнительно небольшим размером, способен вносить двуцепочечный разрыв в целевой локус в геноме. Система геномного редактирования на базе CRISPR/Cas9 проста в использовании и дизайне, степень неспецифического разрезания составляет 0,01% с необходимостью подбора такого специфичного РНК гида, который легко синтезировать. Это является основной задачей, от решения которой зависит достижение указанной специфичности. Был разработан оптимальный РНК гид, который позволяет максимально использовать все преимущества системы геномного редактирования на базе CRISPR/Cas9. Неверно подобранный РНК гид приведёт к снижению эффектов от использования такой системы. Для более эффективного синтеза бактериального белка в клетках человека проведена кодон-оптимизация (последовательность SEQ ID NO: 5), что также позволило получить указанные выше эффекты. Однако возможны и другие варианты кодон-оптимизации, поэтому использованный в данной разработке вариант является демонстративным, показывает принципиальную возможность достижения эффектов по изобретению при оптимизации данной последовательности. После кодон-оптимизированной последовательности расположен еще один сигнал внутриклеточной локализации в ядре 3’-SV40 NLS. В качестве терминатора транскрипции использован синтетический полиА сигнал.

Другим объектом по изобретению является вектор экспрессии AAV-hCYP21A2.

В качестве генома в частицы упакована одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены ITR (internal terminal repeats) AAV, в предпочтительном варианте серотипа 2. Данные ITRs AAV хорошо изучены, их использование даёт стабильный ожидаемый эффект. Однако возможно использование других ITRs AAV, поскольку в уровне техники отсутствуют сведения, указывающие на то, что ITRs из других серотипов AAV при использовании будут давать некорректный результат. Внутри вектора последовательно расположен эукариотический промотор полимеразы III - U6. Данный промотор U6 продемонстрировал высокий уровень транскрипции трансгена в конструкции вектора по изобретению. Он является эукариотическим, а не вирусным, значит не будет ингибироваться в клетке человека, при этом обладает сравнительно небольшим размером, что позволяет упаковать кассету транскрипции РНК-гида в геном AAV. После промотора U6 расположена последовательность РНК-гида в формате crRNA. Это уникальная последовательность в 20 нуклеотидов, комплементарная таргетируемому локусу, сшитая с последовательностью trackRNA (скаффолд). Следом за кассетой экспрессии РНК гида расположена область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 (левое гомологичное плечо). Данный локус был выбран, так как во многих экспериментах показано отсутствие влияния интеграции в него на работу остального генома, что обеспечивает безопасную интеграцию. При этом трансген, интегрированный в этот локус, эффективно транскрибируется в любом типе клеток. Кассета экспрессии трансгена: промотор EFS-NS, именно этот промотор показывает высокий уровень экспрессии трансгена, является эукариотическим, а не вирусным, следовательно, не будет метилироваться и ингибироваться, также это конститутивный промотор, т.е. работает во всех типах клеток, под контролем которого расположена белок-кодирующая кодон-оптимизированная последовательность гена hCYP21A2. При этом кодон-оптимизация позволила увеличить эффективность трансляции гена, оптимизация проведена относительно соответствующей референсной последовательности NG_007941.3. В качестве терминатора транскрипции использован полиА сигнал гена β-глобина человека (human β-globin polyadenylation signal). Следом за полиА сигналом расположена область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 (правое гомологичное плечо).

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующим иллюстративным материалом.

Фиг. 1 - схема расположения слоев растворов йодиксанола в центрифужном стакане. 40% фракции отбирают после центрифугирования пробирок QuickSeal, при этом сначала протыкают отдельной иглой самый верх пробирки для доступа воздуха, а необходимую фракцию отбирают другой иглой со шприцем, при этом отверстие иглы направлено вверх, а острие иглы расположено горизонтально примерно на 2 мм ниже 40-60% интерфазы. Таким образом аспирировали 40% градиента, не задевая интерфазу 25% слоя.

Фиг. 2 - карта AAV-hCYP21A2.

Фиг. 3 - карта pAAV-nEFCas9.

Осуществление изобретения

Одно из изобретений группы представляет собой вектор экспрессии на основе аденоассоциированных вирусов, белки капсида природных серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9hu14, rh10 и других) или серотипов, полученных методами синтетической биологии (DJ/8, DJ, anc32 и другие). В качестве генома в частицы упакована одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены ITR (internal terminal repeats) вируса серотипа 2, внутри последовательно расположены промотор первого фактора элонгации эукариот EF1 альфа, затем последовательность гистидиновой метки (HA (humanin fluenza hemagglutinin) epitopetag), после которой следует сигнал внутриклеточной локализации в ядре 5’-SV40 NLS, далее кодон-оптимизированная последовательность гена Cas9 Streptococcuspyogenes. Затем расположен еще один сигнал внутриклеточной локализации в ядре 3’-SV40 NLS. В качестве терминатора транскрипции использован синтетический полиА сигнал. Примером осуществления изобретения может служить SEQ ID NO:1.

Другое изобретение группы представляет собой вектор экспрессии на основе аденоассоциированных вирусов, белки капсидаприродных серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9hu14, rh10 и других) или серотипов, полученных методами синтетической биологии (DJ/8, DJ, anc32 и другие).

В качестве генома в частицы упакована одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены ITR (internal terminal repeats) вируса серотипа 2, внутри последовательно расположены: эукариотический промотор полимеразы III - U6, последовательность РНК-гида в формате crRNA (уникальная последовательность в 20 нуклеотидов, комплементарная таргетируемому локусу, сшитая с последовательностью trackRNA (скаффолд)), за кассетой экспрессии РНК гида расположена область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 (левое гомологичное плечо) кассета экспрессии трансгена, включающая промотор EFS-NS, под контролем которого расположена белок-кодирующая последовательность гена hCYP21A2, соответствующая референсной последовательности NG_007941.3. В качестве терминатора транскрипции использован полиА сигнал гена β-глобина человека (human β-globin polyadenylation signal). Следом за полиА сигналом расположена область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 (правое гомологичное плечо). Примером реализации является SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность гена CYP21A2 дикого типа NG_007941.3.

SEQ ID NO: 4 представляет собой вариант оптимизированной последовательности SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 представляет собой кодон оптимизированную последовательность гена Cas9 Streptococcus pyogenes.

Поскольку генетическая терапия врожденной дисфункции коры надпочечников, опосредована мутациями гена hCYP21A2, то лечение может быть осуществлено экзогенной экспрессией гена hCYP21A2 с генома вектора, инфицировавшего клетки надпочечников и представленного в ядрах в виде эписомной ДНК. При этом внесение двуцепочечного разрыва в геном инфицированных клеток осуществляют за счет экспрессии РНК-гида, специфичного к последовательности локуса AAVS1, adeno-associated virus integration site 1, PPP1R12C protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C, NC_000019.10, а также за счет экспрессии белка Cas9, способного вносить двуцепочечный разрыв в ДНК в месте гомологичного связывания РНК-гида с мишенью. Интеграция происходит за счет наличия областей гомологии к локусу AAVS1 в векторе AAV-hCYP21A2. В результате процессов внесения разрыва, гомологичной репарации и экспрессии трансгена реализуется экспрессия гена hCYP21A2 и восстанавливается нормальный стероидогенез в коре надпочечников.

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний.

Для получения вирусных частиц использовали плазмидные конструкции, несущие нуклеотидные последовательности геномов векторов, а также последовательности репликации и селекции этих плазмид в бактериальных системах. Получение указанных плазмид осуществляли методами молекулярного клонирования и синтеза генов.

Также использовали плазмиды, несущие гены капсида вирусных части AAV и хелперные гены.

Вирусные вектора собирали в системе адгезионных или суспензионных клеток/специализированных клеточных линий, основанных на клетках HEK293.

ПРИМЕР 1

Выделение и очистка плазмид

Разморозили клетки E.coli, которые хранили при температуре -80°С. Разморозку осуществили на твердую среду. Для этого в 400 мкл жидкой среды LB внесли замороженные клетки (на кончике наконечника), ресуспендировали и перенесли на твердую среду LB содержащую карбенициллин в концентрации 100 мг/л.

Для получения суспензионной культуры в колбу на 250 мл добавили 100 мл среды LB. Внесли 1 колонию на кончике наконечника, E. coli инкубировали 16-20 часов при 37°C в термостатируемом шейкере при постоянном перемешивании 170 об/мин.

Далее выделили плазмидную ДНК набором Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген) согласно протоколу производителя. Количество колонок брали из расчета 1 колонка на 1 г клеточного осадка (ёмкость колонки 500 мкг ДНК). С одной колонки элюировали двукратно в 4 мл воды.

После выделения измеряли концентрацию плазмид и проводили рестрикционный анализ, используя рестриктазы согласно таблице 1.

Для каждого образца были поставлены следующие реакции: рестрикция с каждой из указанных в таблице 1 рестриктаз по отдельности, для всех рестриктаз в одной пробирке, К-реакция без рестриктаз.

Приготовили смесь:

10XBuf - 2,5 мкл;

рестриктазы - по 0,5 мкл;

плазмидная ДНК - 600 нг;

вода до 25 мкл.

Инкубировали 1 час при 37°С, визуализировали в 1% агарозном геле.

Таблица 1. Плазмида Рестриктазы Длина фрагментов Количество, мг р225 (15 419 bp) Helper NotI 6021 0,5-1 SalI 4930 PvuI 2727 1741 p226 (6 891 bp) GFP SalI 4893 0,5-1 SpeI 1998 p227 (7 700 bp) Cas9 AgeI 3433 0,5-1 NotI 2836 ApaI 1431

Количество вирусных геномов на клетку - от 1 до 100.

Экспрессия - от 10^-4 до 10^-1 относительно контрольного гена GAPDH.

ПРИМЕР 2

Подготовка клеточной культурой НЕК293

Все объемы сред, растворов и проч. даны из расчета на одну 15 см культуральную чашку.

Приготовили среды для наращивания клеточной массы (GM) и трансфекции (ТМ). Для приготовления GM к 450 мл среды DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л добавили 50 мл FBS (Gibco), 5 ml x100 GlutaMax (Gibco) и 500 мкл антибиотика х 1000 Гентамицин (ПанЭко). Для приготовления ТМ к 490 мл среды DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л добавили 10 мл FBS (Gibco), 5 ml x 100 GlutaMax (Gibco) и 500 мкл антибиотика х 1000 Гентамицин (ПанЭко).

Разаликвотили растворы Версена и Трипсина 0,25% по 50 мл. Аликвоту раствора Версена хранили при комнатной температуре, аликвоты раствора Трипсина 0,25% хранили при -20°С. Перед началом работы с клетками раствор трипсина перенесли на комнатную температуру, среду GM/TM перенесли в водяную баню на температуру +37°С.

Осуществили пассаж клеточной линии. Пассаж клеточной линии не превышал 12.

Разморозили клеточную культуры HEK293. Перед разморозкой криовиалы прогрели 25 мл GM на водяной бане при температуре +37°С.

Криовиалу поместили в водяную баню при температуре +37°С до полного оттаивания. Сразу после оттаивания все содержимое криовиалы перенесли в пробирку на 15 мл, добавили 10 мл прогретой GM. Центрифугировали при 230g в течение 3 минут. Сбросили супернатант, клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл GM, перенесли на клеточный фласк Т75, добавили 14 мл GM. Инкубировали фласк в СО2 инкубаторе, 5% СО2, +37°С до достижения 70% конфлюентности клеток.

Заморозили клеточную культуру HEK293.

Перед заморозкой клеточного банка провели тест на отсутствие микоплазмы в клетках по протоколу MycoReport (Евроген).

Отобрали всю среду с чашки, добавили 5 мл раствора Версена, инкубировали 1 минуту в ламинарном боксе. Отобрали раствор Версена, добавили 3 мл раствора Трипсина 0,25%, инкубировали 3 мин в ламинарном боксе. Добавили 3 мл GM, аккуратно и тщательно ресуспендировали клетки, отобрали 10 мкл клеточной суспензии в пробирку 0,2 мл. Остальные клетки перенесли в пробирку на 15 мл.

Подсчитали количество клеток и определили их жизнеспособность на автоматическом счетчике клеток TC-20 (BioRad): к 10 мкл хорошо перемешанной клеточной суспензии добавили 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего, перемешали; 10 мкл полученной суспензии нанесли на слайд для подсчёта клеток, провели измерение.

Клетки в пробирке 15 мл центрифугировали при 230 g в течение 3 мин.

Подсчитали необходимое количество криовиал так, чтобы в одной криовиале находилось 5 млн клеток в 1 мл раствора для заморозки. Подписали каждую криовиалу: название линии, количество клеток, дата, оператор.

Приготовили раствор для заморозки: на одну криовиалу необходимо 700 мкл FBS (Gibco), 200 мкл Дмем с содержанием глюкозы 4,5 г/л (ПанЭко), 100 мкл ДМСО (ПанЭко).

Ресуспендировали клеточный осадок из пробирки 15 мл центрифугированной при 230 g в течение 3 мин среде для заморозки, разаликвотили по 1 мл в криовиалу. Криовиалы инкубировали 1 сутки в кельвинаторе при -80°С, далее переносили в жидкий азот при -196°С.

Осуществили пассирование клеточной культуры HEK293.

Отобрали всю среду, добавили 5 мл раствора Версена в чашку. Инкубировали 1 мин в ламинарном боксе, отобрали раствор Версена.

Добавили Трипсин 0,25% 3 мл на чашку, инкубировали 3 минуты в ламинарном боксе, добавили равный объем среды GM, аккуратно ресуспендировали клетки, перенесли в фалькон на 15 мл.

Подсчитали количество клеток и определили их жизнеспособность на автоматическом счетчике клеток TC-20 (BioRad): к 10 мкл хорошо перемешанной клеточной суспензии добавили 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего, перемешали; 10 мкл полученной суспензии нанесли на слайд для подсчёта клеток, провели измерение.

6 млн клеток перенесли на новую чашку, добавили 24 мл GM, инкубировали +37°С, 5% СО2 до следующего пассажа.

ПРИМЕР 3

Трансфекция клеточной культуры HEK293

Трансфецирующую смесь составили из лактатного буфера, линейного полиэтилен амина и плазмидной ДНК.

Приготовление лактатного буфера рН 4 (20 мМ натрия лактата, 150 мМ натрия хлорида)

Для приготовления 300 мл лактатного буфера к 290 мл 150 мМ натрия хлорида добавили 1,35 мл 40 % молочной кислоты. Используя 1N раствор гидроксида натрия, довели до рН 4. Полученный раствор довели до 300 мл 150 мМ хлоридом натрия. Стерилизовали через 0,2 мкм фильтр, хранили при температуре 4°С.

Приготовление раствора полиэтиленимина (l-PEI 25) 5 мг/мл

Навеску 1 г сухого линейного полиэтиленимина (25 кДа) растворили в 190 мл 0,2N раствора соляной кислоты при длительном перемешивании. Довели объем соляной кислотой до 200 мл. Конечный раствор имел рН 1-2. Аликвоты раствора хранили при температуре минус 80°С.

Подсчет необходимого количества плазмид и полиэтиленамина (PEI) для трансфекции

Для трансфекции 1 чашки 15 см использовали 38 мкг плазмидной ДНК, при соотношении количества копий плазмид хелперная:упаковочная:трансферная = 1:1:1.

За сутки до трансфекции клетки пересеяли на новые чашки по 10 млн клеток на чашку. Добавили 24 мл среды GM, инкубировали +37°С, 5% СО2.

Трансфекция клеточной культуры HEK293. Приготовили смеси ДНК и PEI согласно таблице 2.

Таблица 2
Схема приготовления трансфицирующей смеси из расчета на 40 чашек Пробирка 1 (плазмидная ДНК) Пробирка 2 (полимер) 0,53 мг целевой плазмиды
0,53 мг плазмиды, несущей ген-эквивалент
нуклеокапсида
0,53 мг хелперной плазмиды 0,6 мл l-PEI 25 до 40 мл лактатного буфера 39,4 мл лактатного буфера Общий объем 40 мл Общий объем 40 мл

Добавили 80 мл смеси DNA-l-PEI 25 в 1 л среды ТМ и перемешали. Отобрали всю среду GM с чашек. Добавили по 27 мл смеси ТМ-ДНК-PEI на чашку. Аккуратно размешали. Инкубировали чашки в инкубаторе +37°С, 5% СО2, 72 часа.

Эффективность трансфекции составляла 95-98%.

Лизис клеток

Приготовили лизирующий буфер, содержащий: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, pH 8,5, 0,5% Triton X-100, бензоназа 50U/ml. Стерилизовали фильтрацией, а не автоклавированием. Хранили при +4°С.

Отобрали всю среду с чашки в серологическую пипетку 25 мл, ею смыли все клетки с чашки. Клеточную суспензию перенесли в пробирку на 50 мл, итерацию повторили со всеми чашками. Пробирку с клеточной суспензией центрифугировали при 400 g в течение 5 мин, супернатант отбирали по мере надобности, хранили при -80°С. Весь клеточный осадок с 40 чашек ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера. Инкубировали при +37°С в течение 1 часа.

Центрифугировали при 4000 g в течение 15 минут, осветленный супернатант переместили в чистую пробирку.

ПРИМЕР 4

Выделение и очистка ААВ

Приготовили буферы 1M NaCl/PBS-MK buffer и 1x PBS-MK buffer.

Для приготовления 1M NaCl/PBS-MK buffer растворили 5.84 г NaCl, 26.3 мг MgCl2 (56,0 мг 6 H2O X MgCl2) и 14.91мг KCl в 1× PBS до конечного объема 100 мл. Фильтровали через 0,22 мкм, хранили при +4°С.

Для приготовления 1x PBS-MK buffer растворили 26.3 мг MgCl2 (56,0 мг 6 H2О X MgCl2) и 14.91мг KCl в 1×PBS до конечного объема 100 мл. Профильтровали через 0,22 мкм, хранили при +4°С.

Для каждого ультрацентрифугирования использовали только растворы йодиксанола приготовленные в соответствии с таблицей 3.

Таблица 3
Расчет для приготовления растворов йодиксанола на 2 пробирки Quick-Seal (39 ml) Концентрация йодиксанола OptiPrep, мл 1 M NaCl/PBS-MK buffer, мл 1x PBS-MK buffer, мл Phenol Red, мл 15% 4,5 13,5 - - 25% 5,5 - 7,7 0,04 40% 8 - 4 - 60% 10,2 - - 0,04

Ультрацентрифугирование

Добавили в центрифужный стакан слои растворов йодиксанола в порядке согласно таблице 4 с использованием шприца 10 мл и иглы Зельдигера.

Таблица 4 Концентрация Йодиксанола, мл 39 ml
QuickSeal 1. Клеточный лизат 16 2. 15% 8 3. 25% 6 4. 40% 5 5. 60% 5

Градиент наносили с верхних слоев, чтобы не нарушать целостность градиента.

При заполнении пробирки QuickSeal, пробирку доверху заполнили клеточным лизатом, без пузырей сверху. Пробирки уравновесили PBS до 0,0005 гр на аналитических весах. Центрифугировали при 360 000 g (59 000 rpm для ротора Ti 70 Beckman Coulter) в течение 1 час 30 мин, +10°С.

После центрифугирования пробирок QuickSeal сначала проткнули отдельной иглой самый верх пробирки для доступа воздуха, затем другой иглой со шприцем отобрали фракцию 40%, как показано на фиг. 1. Отверстие иглы смотрит вверх, острие иглы расположено горизонтально примерно на 2 мм ниже 40-60% интерфазы. Аспирировали 40% градиента, не задевая интерфазу 25% слоя.

Перенесли отобранную фракцию в фалькон на 50 мл.

Ультрафильтрация

Разбавили отобранную после ультрацентрифугирования фракцию 40% йодиксанола в 5 раз раствором PBS/Pluronic F68 (0,001%), профильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. В фильтр Amicon Ultra-15 добавили 3 мл H2O, центрифугировали при 2000 g в течение 1 мин, затем удалили полностью всю жидкость из пробирки и из фильтра. Добавили в фильтр 3 мл раствора PBS/Pluronic F68 (0,001%) центрифугировали при 2000 g в течение 1 мин, удалили полностью всю жидкость из пробирки и из фильтра. Добавили 15 мл разбавленного вируса в фильтр Amicon Ultra-15, центрифугировали при 2500 g в течение 10 минут в бакетном роторе. Отбросили прошедшую через колонку жидкость и заполнили пробирку Amicon Ultra-15 до использования всего раствора вектора. Далее раствором вируса хорошо омыли мембрану пипеткой 100-1000 мкл. Центрифугировали при 2500 g в течение 10 минут.

После центрифугирования суспензия вектора осталась в верхней части концентратора (объем 500 мкл), повторили центрифугирование в течение 3 минут.

После прохождения всего раствора вирусных частиц промыли концентрированный вирус PBS/Pluronic F68 (0,001%) комнатной температуры 2 раза. В фильтр-кассете должно осталось около 500 мкл вирусной суспензии.

Хорошо омыли мембраны, после чего вирус разаликвотили по 20 мкл в 0,2 мл пробирки, оставили 5 мкл для определения титра.

AAV-CYP21 - 7.80E+12 вирусных частиц в 1 мл. AAV-Cas9 - 1.93E+12 вирусных частиц в 1 мл.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="1.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-05-05">

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью «Генетические технологии»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Limited Liability Company Genetic

Technologies</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Глазова Ольга

Владимировна</InventorName>

<InventorNameLatin>Glazova Olga Vladimirovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Векторы экспрессии на основе

аденоассоциированного вируса</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>4774</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..4774</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtc

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcac

taggggttcctgcggcctctagaaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacat

cgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcgg

ggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatata

agtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaa

tgtcgccgaagaaaaagcgcaaggtcgaagcgtccgacaaaaaatactccatcggtctggacattggtac

taactctgtaggctgggccgttatcacggacgagtacaaagtacctagcaaaaagttcaaagtattgggg

aatactgacaggcattccataaagaagaatctcataggagcattgctgtttgattccggagagacagcag

aagctactcgactcaagagaaccgcacgacgccgatatacacgccgaaaaaaccgaatctgctacctgca

ggagatcttctccaatgaaatggctaaggtagacgacagcttctttcatcgacttgaagaatcttttctt

gttgaggaggataagaagcacgaacggcaccctattttcggcaatatcgtggatgaggtcgcgtatcatg

aaaagtatcccaccatctaccacttgcgaaagaagctggtagatagtaccgacaaggcggatttgagact

catataccttgcactggcccacatgataaaattcagagggcacttcctcatcgaaggtgatcttaatcca

gacaacagtgacgtcgataagttgttcattcagctcgtgcagacttacaatcaactgtttgaagaaaatc

ccataaatgcgtcaggcgtagatgcaaaggctatactctccgcgcgattgtcaaaatcccgacggcttga

gaatctcatagcccaacttcccggcgaaaagaaaaacggattgttcgggaaccttattgccttgtcactc

ggtttgactcctaattttaagagtaatttcgatctggctgaggatgcaaaactgcagctgagtaaagata

catacgacgacgacctggacaatctcctggcccagattggagaccagtacgccgacctgttcttggctgc

caaaaacctctcagacgctattctcctgtcagacattttgcgcgtgaatactgagattacgaaggccccc

ctgtctgcctccatgattaagcgctatgatgagcaccatcaagacttgacccttcttaaagcgctggtac

ggcagcagctccctgaaaaatataaagaaatcttcttcgaccagtccaaaaatggctacgcgggctacat

cgacggaggtgcaagccaggaggagttctataagtttataaagccgatccttgagaagatggatgggacc

gaagaactcctggtgaaacttaacagggaggatctgctgcgaaagcagcgcacatttgataatgggtcca

ttccacatcaaattcatcttggagaattgcacgccattttgagaagacaggaggacttctatccgtttct

taaggacaatcgggaaaaaatagaaaagatacttacattccgaattccttactatgtcgggcccttggcg

cgagggaactctcggttcgcttggatgactcgaaaaagtgaggagactataactccttggaattttgaag

aagtcgtagacaaaggtgcttccgcgcaatcttttatagagagaatgactaatttcgacaaaaacctccc

aaacgagaaggttctgccaaagcacagccttctctacgagtattttactgtctataacgaactcactaag

gtgaaatacgtaactgaagggatgaggaagcctgcctttttgagtggcgagcagaagaaagcgatagtag

atttgctttttaaaaccaaccggaaggtcactgtgaaacaacttaaagaagactacttcaagaagataga

gtgtttcgacagcgtagaaatatctggcgtagaggaccgcttcaatgcaagcttgggcacttaccatgac

ctcctcaagataatcaaagataaagattttcttgataatgaagagaatgaggatatccttgaagacatag

tgttgactctcacgttgtttgaggatagggagatgatagaagagcgcttgaagacctatgctcatctctt

cgatgataaagtaatgaagcaactcaagcggagaaggtatactggttggggtcggctttctaggaaactc

atcaacggtattcgggataaacagtccggcaaaactatattggatttccttaagagtgatggcttcgcga

accgaaactttatgcaacttatacatgatgattcacttacatttaaggaagacattcaaaaagcgcaagt

atctggccagggcgactctctgcacgaacacatagcaaaccttgctggatcccctgcgataaagaaaggt

atactgcagacagtaaaagttgtggacgaactcgtcaaggttatgggtaggcataagcccgaaaatatag

tgattgaaatggcacgcgagaaccaaactacacaaaaaggtcaaaagaacagcagagaacggatgaaacg

aatagaggaggggatcaaggaacttggatcccaaatactgaaagagcaccccgtagaaaatacccagctt

caaaacgagaagctttatctgtactacctgcaaaacggcagagatatgtacgtagaccaggaactggaca

tcaacagattgtctgattatgatgtagatcacattgtgccgcagagcttcctcaaagatgattccataga

taacaaagtactcactcgaagtgacaaaaacagagggaaatccgataatgttcccagtgaggaagtcgtc

aagaagatgaagaattattggcggcaacttctcaacgcgaaactcatcacccaaagaaaattcgataacc

tcactaaagctgaacgcggaggactgtcagagcttgataaagcaggttttatcaaaaggcaactcgtaga

aacgagacaaataacaaaacatgtcgctcaaattttggactctcgcatgaatacaaagtatgatgaaaat

gacaagctgattcgcgaggtcaaagtaataacgctcaaaagtaaacttgtctccgatttccgaaaggact

ttcagttttacaaagtcagagagataaataattaccaccacgcccatgacgcctacctcaatgctgtggt

tggtacggctcttatcaagaaatatccgaagctcgagagcgagtttgtctatggcgactacaaggtttac

gatgtcaggaaaatgatagcgaagtctgagcaagagataggtaaggccacggctaaatactttttctatt

caaatatcatgaattttttcaaaaccgagataacgttggcgaatggcgaaatcaggaaaaggcctcttat

agagactaacggagaaacaggcgagattgtctgggataagggtagggatttcgctactgtgcgaaaggta

ctgagcatgccccaggttaacattgtcaaaaagactgaggtccaaacgggtggcttttctaaggagagta

tcctgccaaaacgcaattcagataagctcatagcgagaaaaaaggattgggacccaaagaaatatggcgg

cttcgactctccgacggtcgcatatagtgtgctggtggttgccaaagttgaaaagggcaagtctaaaaaa

ctgaaatcagtgaaggagcttctcggaataactattatggagcgcagctcatttgaaaagaatccaatcg

atttcttggaagcaaaaggatataaagaagtcaagaaggacctgatcatcaaacttccaaagtactcact

gttcgaacttgagaacggacggaagcggatgcttgcgagtgctggagaacttcaaaaaggtaacgagctc

gcccttccatcaaagtacgtaaattttttgtacttggcatcacactatgagaagctcaaaggctcccccg

aggataatgagcaaaagcagcttttcgtggaacaacataaacattaccttgatgaaatcatcgaacaaat

aagcgaattctctaaacgagttattcttgcagacgcgaatctggacaaggtgcttagcgcatacaacaag

catcgggataagccgattcgagaacaagccgaaaatataatccatcttttcactctgacgaacttgggtg

cgccggcagccttcaagtacttcgataccactattgataggaaacggtatacgagtacaaaagaagtgct

ggacgctacgcttatccatcagtccatcactgggctctacgagacgaggattgaccttagtcagttgggc

ggggacagccccaagaagaagagaaaggtggaggccagctaagaattcaataaaagatctttattttcat

tagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctc

tgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggc

ctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>3119</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3119</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtc

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcac

taggggttcctgcggcctctagagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaa

ggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgt

agaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgctta

ccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggggcca

ctagggacaggatgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa

agtggcaccgagtcggtgcttttttgaattccaattggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacct

ctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccc

cctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtc

cacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattccc

agggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccacta

gggacaggattaagcttgctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagag

cgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgatccggtgcctagagaaggt

ggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaacc

gtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggaccgg

tgtctcgccatgctgctcctgggcctgctgctgctgctgcccctgctggctggcgcccgcctgctgtgga

actggtggaagctccggagcctccacctcccgcctcttgccccgggcttcttgcacctgctgcagcccga

cctccccatctatctgcttggcctgactcagaaattcgggcccatctacaggctccaccttgggctgcaa

gatgtggtggtgctgaactccaagaggaccattgaggaagccatggtcaaaaagtgggcagactttgctg

gcagacctgagccacttacctacaagctggtgtctaggaactacccggacctgtccttgggagactactc

cctgctctggaaagcccacaagaagctcacccgctcagccctgctgctgggcatccgtgactccatggag

ccagtggtggagcagctgacccaggagttctgtgagcgcatgagagcccagcccggcacccctgtggcca

ttgaggaggaattctctctcctcacctgcagcatcatctgttacctcaccttcggagacaagatcaagga

cgacaacttaatgcctgcctattacaaatgtatccaggaggtgttaaaaacctggagccactggtccatc

caaattgtggacgtgattccctttctcaggttcttccccaatccaggtctccggaggctgaagcaggcca

tagagaagagggatcacatcgtggagatgcagctgaggcagcacaaggagagcctcgtggcaggccagtg

gagggacatgatggactacatgctccaaggggtggcgcagccgagcatggaagagggctctggacagctc

ctggaagggcacgtgcacatggctgcagtggacctcctgatcggtggcactgagaccacagcaaacaccc

tctcctgggccgtggtttttttgcttcaccaccctgagattcagcagcgactgcaggaggagctagacca

cgaactgggccctggtgcctccagctcccgggtcccctacaaggaccgtgcacggctgcccttgctcaat

gccaccatcgccgaggtgctgcgcctgcggcccgttgtgcccttagccttgccccaccgcaccacacggc

ccagcagcatctccggctacgacatccctgagggcacagtcatcattccgaacctccaaggcgcccacct

ggatgagacggtctgggagaggccacatgagttctggcctgatcgcttcctggagccaggcaagaactcc

agagctctggccttcggctgcggtgcccgcgtgtgcctgggcgagccgctggcgcgcctggagctcttcg

tggtgctgacccgactgctgcaggccttcacgctgctgccctccggggacgccctgccctccctgcagcc

cctgccccactgcagtgtcatcctcaagatgcagcctttccaagtgcggctgcagccccgggggatgggg

gcccacagcccgggccagagccagtaaaataaaagatctttattttcattagatctgtgtgttggttttt

tgtgtgctcgagtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtcta

acccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctcc

ttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggg

gtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccaga

acctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgcgcggccgcaggaaccccta

gtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgccc

gacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>10338</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10338</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggagaacttacaggtcctgccacaatcctaatgcaaggatggagctgca

agttcagtttgggaatcatcagcctggattggtttggtggaagccagggagtggttgagacccccacagg

ggagctctgaggaaggaagttccgaaggagggaacgtaagaaatgaccaggtcagaaccaagggtggtcc

agaagctaacccttagcttagggacagtttcacagagaacacgtccatgatgcaagactctgctgagggc

ctggagcagtgaagactggggcaaggtcaccctctgggaagtgaagtcaccagagaccttgcggagcagc

tttgagagttctctgagtaggaaggtaacagaatgtgaaggacactggagagaaggccaataggaagcaa

acaaaaacaggccaaggaaacccagtacagggggctgcagggcccagggagtgggtccctcatctctcct

ccccacgcttggccaggtccccacctcccgggagtgcgtgggctttgaggctgtgcaggaagtgccggtg

gggctggtgcagccggccagcgcaaccctgtacgactactacaaccccggtgagcactgcaggacaccct

gaaattcaggagaactttggcataggtgccctcctatgggacaatggacaccggggtagtgagggggcag

agagccctggggctccctgggactgaggaggcagaatggaggggcctgtgccctaactcctctctgttct

ccagagcgcagatgttctgtgttttacggggcaccaagtaagagcagactcttggccaccttgtgttctg

ctgaagtctgccagtgtgctgagggtgagactgagggcctggggcggggcagtggaggcgggatggccgg

ggccccccccacactgtctgatgggttccccaacttcagggaagtgccctcgccagcgtcgcgccctgga

gcggggtctgcaggacgaggatggctacaggatgaagtttgcctgctactacccccgtgtggagtacggt

cagtcttcccaccgaggccctggcctgaccctccctcggggaccggccgttttggtctctctgggtgtag

cctgctcctcttacaggtcatgcacgcagcctgtttgctctgacaccaacttcctaccctctcagcctca

aagtaactcacctttcccccttctcctcaccccctcttaggcttccaggttaaggttctccgagaagaca

gcagagctgctttccgcctctttgagaccaagatcacccaagtcctgcacttcagtatgaagcaaaccgg

agaggcgggcagggctggggggagacagggaggctgaggtgtggccgaggacctgaccatctggaagtgt

gaaaatccccttgggctgtcagaagccttgggcttggccataaatagggaggcagtggcacctctccatg

ggggtggcgaaggtggaatgagaggatctacacagagtccccagcctgggctcaccctgcaccttctctt

cccctctgaccacttttgcgcacgtcatccccgcagccaaggatgtcaaggccgctgctaatcagatgcg

caacttcctggttcgagcctcctgccgccttcgcttggaacctgggaaagaatatttgatcatgggtctg

gatggggccacctatgacctcgagggacagtgagtcatctggtcccctcagtctcttgtcctccccatgc

ctcgccacctaggccttgcccctcagaagccagatgcctgtgctctccgtttccacctgccatcctcccg

agccctgctgactgcccctttgccccctgcagcccccagtacctgctggactcgaatagctggatcgagg

agatgccctctgaacgcctgtgccggagcacccgccagcgggcagcctgtgcccagctcaacgacttcct

ccaggagtatggcactcaggggtgccaggtgtgagggctgccctcccacctccgctgggaggaacctgaa

cctgggaaccatgaagctggaagcactgctgtgtccgctttcatgaacacagcctgggaccagggcatat

taaaggcttttggcagcaaagtgtcagtgttggcagtgaagtgtcagtgtgtgttgctagggctgagagc

agtgcccctgcccgatgcagttctgggcaggccaggttgacataaccttagactctctgagccctgatga

cccttgggctgttcagctctgctagaacctcccagatgacccgctaggagtctagtgcttcacaggacca

ccccgagcagaactgggacccaagagcctgcaccccaaggaccagagtccatgccaagaccacccttcag

cttccaaggccctccactgcccggctgtcgccagtcaccacggcctcagacagggcttgtgctcagctga

cacctgtgacacagctcttctgcctcatgagctgttgtccagctacacctccccgactctgtcctcgtgc

tgctggcggttctgaggtctgcagattttagctgagttccgggctgttgaaagcctgctgacgcttggtt

ctgttatcagtggaatgaggtgactttcccggagttgtgcaatcctcaggtccggcagtgtcttcttcca

gttactggtttcaaacaagccaaaagtctgactttggtgtgtttgtgaatcctctgaggaagccgctgtt

ctcctggggtctccccttcccaccggacctgcctaactttcccccatttagtggcacacctggggtcttc

agagatgactccgcgtctgtccaaagaagtttggtgagatcagtttccgtagaggtcatgacagttcagc

agcctgccatccagtcattcgacagaaattcgggaatctttcacttcatgccatgccctgtgccaggtgc

cagagatacagctgctcactccagggctcatcgctggggagacagataagaggacgggcagtccccaccc

tctgtgaaagatgtgatgtcagggagcagtgtggtcctgtggggcatctaaccaagtcaggggcattgcc

aggcagggacagggaaggcttcctggagcaggtggcctccaagtggggctctgaagactgagaaggagcc

aggaaaagagcaggggtagatgagggcatctggggcagaaggagaatatacaaaggcccagaggccgggg

gcaggacagggtacctttggggacattgcatgtaattgaccacattcggagtttggatttggaagtggtg

gaagagatggagatggtgagacaagtagtaagcacgtcagccttccaggtgcgctcctttccgatgagca

ctgtcttatcccacgtaactttgagaagtttgggcctttcccactgtggcagaggtttcctgaggctctt

gcatacatggccctatggttgctcatcagatctttctcccagtagctgctcagcatggtggtggcataag

cccattttccggagccagggattcagttgcagcaagacatggcccggtctgggaggtcaaccatgaagaa

ggcagtagctgtcattgcccaaccccagaaatcccaatcctgttttctccctctcagtcctgatcatgga

ttcagcagcagcgaactcgccaatgtagtgggtggcacagccagggtcttgactctggctctgcagtagc

acagtctggaaaagctctgaggggagagagacccccactggtccgagggtctggcacagagccagaaatg

ggggggaaggtatggggctgggtcgcctctgacctctcaggtaccatccaggaggccctggcctctcact

gaacccggccactcctctttggcatggcctcttcccaaatccccaaactgcctccttacccacaaaagtg

gtctctgagtgtcagtccagtgggacccccaccccttatggcttcagttccccaaatagggctggaccct

tgatcctgatccagctgtggctatccagccccttcctggggactttggactttgaggggggcatgcccag

ttgtgctgggaatccatactttccctggctggagtagaacctgtggactgtagtcctgagggcagtcatg

ttctgcctgtgcctggaaacacaagaaacttgactgcagagagaagaaagaggagagaggaacagagcga

ggaaaccgcccgtctccggggctttttctgttccctatccttgactttctaagaccagtggggtcccctc

ctctgcttctttttcctgagttctgtgaaattccccaattcttattttttatctcaaaccagctcaaggt

gggctgttttcctttcaaccaaagaaaggtgctcctggtggctaaaggtacatattcgacagctagattt

ccaggctggaatcctgccctccacaacatgcgaacaatacccgtgttgcatatagagcatggctgtgaag

agttgagtgagtgcccacaaagcacttagagcagtgtctggtacatgctattactccgcagcgggaaacc

acttcctcctttgtcttctgggcacttttgtgagtgaaaggaggcactaataacaatcacactgggatac

ctgtatatactggaatgccccaggcaaaccaggcttaaactgtattactctatctgtagcttaaactaac

aaacaacccacacaaatcacattttgttcttcaggcgattcaggaaggcctattaggcagggactgccat

tttctctctgagacaaacatcatgccagtaaactggcccacggtggggtggcagagggagagggcccagg

tgggggcggacactattgcctgcacagttgatgtggaaccagaaagctgactctggatgcaggaaaaagg

tcagggttgcatttcccttccttgcttcttgatgggtgatcaatttttttgaaatacggacgtcccaagg

ccaatgagactggtgtcattccagaaaagggccactctgtgggcgggtcggtgggagggtacctgaaggt

ggggtcaagggaggccccaaaacagtctacacagcaggagggatggctggggctcttgagctataagtgg

cacctcagggccctgacgggcgtctcgccatgctgctcctgggcctgctgctgctgctgcccctgctggc

tggcgcccgcctgctgtggaactggtggaagctccggagcctccacctcccgcctcttgccccgggcttc

ttgcacctgctgcagcccgacctccccatctatctgcttggcctgactcagaaattcgggcccatctaca

ggctccaccttgggctgcaaggtgagaggctgatctcgctctggccctcaccataggagggggcggaggt

gacggagagggtcctctctccgctgacgctgctttggctgtctcccagatgtggtggtgctgaactccaa

gaggaccattgaggaagccatggtcaaaaagtgggcagactttgctggcagacctgagccacttacctgt

aagggccgggggcattttttctttcttaaaaaaatttttttttaagagatgggttcttgctatgctgccc

aggctggtcttaaattcctagtctcaaatgatcctcccacctcagcctcaagtgtgagccacctttgggg

catccccaatccaggtccctggaagctcttgggggggcatatctggtggggagaaagcaggggttgggga

ggccgaagaaggtcaggccctcagctgccttcatcagttcccaccctccagcccccacctcctcctgcag

acaagctggtgtctaggaactacccggacctgtccttgggagactactccctgctctggaaagcccacaa

gaagctcacccgctcagccctgctgctgggcatccgtgactccatggagccagtggtggagcagctgacc

caggagttctgtgaggtaaggctgggctcctgaggccacctcgggtcagcctcgcctctcacagtagccc

ccgccctgcccgctgcacagcggcctgctgaactcacactgtttctccacagcgcatgagagcccagccc

ggcacccctgtggccattgaggaggaattctctctcctcacctgcagcatcatctgttacctcaccttcg

gagacaagatcaaggtgcctcacagcccctcaggcccacccccagcccctccctgagcctctccttgtcc

tgaactgaaagtactccctccttttctggcaggacgacaacttaatgcctgcctattacaaatgtatcca

ggaggtgttaaaaacctggagccactggtccatccaaattgtggacgtgattccctttctcagggtgagg

acctggagcctagacacccctgggttgtaggggagaggctggggtggagggagaggctccttcccacagc

tgcattctcatgcttcctgccgcagttcttccccaatccaggtctccggaggctgaagcaggccatagag

aagagggatcacatcgtggagatgcagctgaggcagcacaaggtggggactgtacgtggacggcctcccc

tcggcccacagccagtgatgctaccggcctcagcattgctatgaggcgggttcttttgcataccccagtt

atgggcctgttgccactctgtactcctctccccaggccagccgctcagcccgctcctttcaccctctgca

ggagagcctcgtggcaggccagtggagggacatgatggactacatgctccaaggggtggcgcagccgagc

atggaagagggctctggacagctcctggaagggcacgtgcacatggctgcagtggacctcctgatcggtg

gcactgagaccacagcaaacaccctctcctgggccgtggtttttttgcttcaccaccctgaggtgcgtcc

tggggacaagcaaaaggctccttcccagcaacctggccagggcggtgggcaccctcactcagctctgagc

actgtgcggctggggctgtgcttgcctcaccggcactcaggctcactgggttgctgagggagcggctgga

ggctgggcagctgtgggctgctggggcaggactccacccgatcattccccagattcagcagcgactgcag

gaggagctagaccacgaactgggccctggtgcctccagctcccgggtcccctacaaggaccgtgcacggc

tgcccttgctcaatgccaccatcgccgaggtgctgcgcctgcggcccgttgtgcccttagccttgcccca

ccgcaccacacggcccagcaggtgactcccgagggttggggatgagtgaggaaagcccgagcccagggag

gtcctggccagcctctaactccagcccccttcagcatctccggctacgacatccctgagggcacagtcat

cattccgaacctccaaggcgcccacctggatgagacggtctgggagaggccacatgagttctggcctggt

atgtggggggccgggggcctgccgtgaaaatgtggtggaggctggtccccgctgccgctgaacgcctccc

cacccacctgtccacccgcccgcagatcgcttcctggagccaggcaagaactccagagctctggccttcg

gctgcggtgcccgcgtgtgcctgggcgagccgctggcgcgcctggagctcttcgtggtgctgacccgact

gctgcaggccttcacgctgctgccctccggggacgccctgccctccctgcagcccctgccccactgcagt

gtcatcctcaagatgcagcctttccaagtgcggctgcagccccgggggatgggggcccacagcccgggcc

agagccagtgatggggcaggaccgatgccagccgggtacctcagtttctcctttattgctcccgtacgaa

cccctcccctcccccctgtaaacacagtgctgcgagatcgctggcagagaaggcttcctccagcggctgg

gtggtgaaggaccctggctcttctctcggggcgacccctcagtgctcggcagtcatactggggtgcgaga

gaggtgggcagcagctcagcctccccccgctggggagcgaaagtttcttggtctcagcttcatttccgtg

aagggcaccgagaactcgaagcccttccagtggtaccagctcactccctgggaaaggggttgtcaagaga

gagtcaaagccggatgtcccatctgctcttcccgttccccttaaggaggtagctcccagcactcaaccaa

cctccccgcagagctcccttcctgaccctccgctgcagaggattgaggcttaattctgagctggcccttt

ccagccaataaatcaactccagctccctctgcgaggctggcatgattgttccatttcacccagccactca

gtcccttgcctgttacactgtggggctgaaacctaggcaggccgagccccagccaccccagctctgagcc

gcctccccacccctcacctgatggtccactgtgctcccgtagagcccgttgaggttggcgtagtggcagt

tcctgtaccaccaggcccctcggtaggagacagcgcaggagatgagcaagctgttggggtcccgatcacg

ggcagagaagacactgccgctgtggtagctcatggagtcccctgggcagggtggaggaaggagccatgag

ggcctcccctcccagcctcaccctcccagcctcacagcctctgcttacctgcggtgccgtggtagccctc

caagtggaggcggtagtactccgcagccgagtctacgtggaaggagtcgtactgggcgaacacagcctcg

tccccagcccgcaggtccacgcgcatggagtagtcacctgcctgtgtcaggctgtgcagggcctcattgc

ctgggggtgggatacgtgccctcatcagggtcctggtgtccacagggcccccatccccatccgtagttcc

ccagtccctgtgaggcactgacccagccagaactctccagagatgttcccaaaaccatgggcatagtcct

cccagtccctccagaagtctgtctgtccatccatgcggcgctggaacacctgggaagcaagtgggggcac

catcagcctctggctcccggggcaacagaccctgccctgcacagacccctgggcttcccaatgccaccca

ccagccagccgcccccatcagtctccatgtcgcaaaacacgttcaggggccgctcgcggttgccgttgag

gaagatggtgctggtcctggaggcaccggctccgttctgcatctcctccccgcagtccctggggaagggg

atccgcagcccacctgggagaggagagcaggggccagtccttttccaagccttaggccctggctgcccac

ccagcccccggccccgggcccgtgcgtccaggtacccgtggtgaaagaggtggacacgggcggcaggagg

ctctggccccacatggcctggagccgtgcattgtaggaggtggagggaaagaggccaaggagctggtgag

atgtgatccctcctgggagcaggatctcctgtgggacagacaagggggggtcaggggagagggaggtgga

gaccctccgggagggccagaggcagcacctcctggaatcacccagggaggggagttgggtcagtggggcc

ggggcacctggttctgtccaccaggggtgtggaagctgagcaggtagcctgcgggccggactgggggctc

agtccaagtgagcagggcggtgcggggggtcacttccttggcctccaagtcccgaggggcctctagccct

aggagggaaagcaggaagaggagatggggatgaggcccaacctggctccctctacctcctctccctgtcc

cacacaccccacagaccctacctgtggtgaaggtgatgctggctggggaagtgaggttggggccccgcag

gccacgcactgtggcggtgtagttggtgtggaggacaaggtcatgcagggggtagtccaccgcgctgcct

ggggtctccgcctgcagaggcggggctgggagtgtagagaggggcatcaaggcctgccccctccatcctc

ggccagagtccagcctcccccctgcaatccccaccctgaacaagtcccctccagaggcctcaggcctgct

cacccccaggggctgtgacctggacgtcataggtgtccacaggattctgggggggcttccagtgcagcac

ggcgaatccctcggtcaagttcagtgcacgcaactgtgtgggaccgtcaggaactgggggaaggggaggg

gctcagaagggtccccgcggctctctctactccgtgcctccccagactccactggcctcccgtccgcaa<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1485</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1485</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgctcttgctcggtctgttgttgttgctcccattgcttgcaggagccc

gcctgttgtggaactggtggaagctccggagcctgcatctcccccccttggcccctggctttcttcatct

tttgcagcccgacctgcctatatatctgctgggtctcactcagaagtttggacctatctaccgcctccac

ctggggctgcaggatgtggttgtgctcaattcaaaacgcacaattgaggaggcgatggttaagaaatggg

ccgactttgccggaaggcctgaaccactgacatataagctcgttagccgcaattacccagacctttccct

gggcgattactccctgctctggaaagcccataagaagctcacacgatcagcactgctgctgggaattcgc

gacagcatggagcctgtcgtagaacagctgactcaggaattctgtgagcgcatgcgggcccaacctggca

cacctgttgccatcgaggaggagttttctttgcttacatgctccattatctgctacctcacattcggcga

caagattaaagacgacaatctgatgcccgcctactacaagtgcatccaagaggtgctgaagacatggagt

cactggagcatccaaatcgtcgatgtgatcccatttctgagattcttccccaaccccgggcttaggagac

ttaagcaggctatcgaaaagagggatcacatagtcgaaatgcaacttagacagcacaaagagtctctggt

ggccggccagtggcgcgacatgatggactatatgctgcagggcgtggctcagccatccatggaagaaggc

agcggacaactccttgaggggcatgttcatatggccgccgttgacttgctgattggcggaaccgaaacaa

ctgctaatacactgtcctgggctgtggtattcctgctgcatcaccctgagatacagcaacggctccaaga

ggagctcgatcatgagctggggcccggtgcctcttcaagccgggtcccttacaaggaccgggcccgcctt

cctctgttgaatgcaaccatagctgaagtgctcagattgcgcccggtcgtaccactggccctccctcata

gaaccaccaggcccagcagtatctccggatatgatatcccagaggggactgtgattatcccaaacctgca

gggcgcccatctggacgagactgtgtgggagcggccacatgaattctggcctgacagattcctcgagcct

gggaagaactctcgggctctggcctttggttgcggggcaagggtatgcctgggggaacccttggcccggc

tggagcttttcgtagtgctgacacggctcctccaggcctttacgctgctgccaagcggcgacgctctgcc

tagcctgcaaccactgcctcattgctcagtcattctcaaaatgcagccttttcaagtgaggctgcagcca

cgaggtatgggcgcacattctcctggccagagccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>4101</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..4101</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacaaaaaatactccatcggtctggacattggtactaactctgtaggctgg

gccgttatcacggacgagtacaaagtacctagcaaaaagttcaaagtattggggaatactgacaggcatt

ccataaagaagaatctcataggagcattgctgtttgattccggagagacagcagaagctactcgactcaa

gagaaccgcacgacgccgatatacacgccgaaaaaaccgaatctgctacctgcaggagatcttctccaat

gaaatggctaaggtagacgacagcttctttcatcgacttgaagaatcttttcttgttgaggaggataaga

agcacgaacggcaccctattttcggcaatatcgtggatgaggtcgcgtatcatgaaaagtatcccaccat

ctaccacttgcgaaagaagctggtagatagtaccgacaaggcggatttgagactcatataccttgcactg

gcccacatgataaaattcagagggcacttcctcatcgaaggtgatcttaatccagacaacagtgacgtcg

ataagttgttcattcagctcgtgcagacttacaatcaactgtttgaagaaaatcccataaatgcgtcagg

cgtagatgcaaaggctatactctccgcgcgattgtcaaaatcccgacggcttgagaatctcatagcccaa

cttcccggcgaaaagaaaaacggattgttcgggaaccttattgccttgtcactcggtttgactcctaatt

ttaagagtaatttcgatctggctgaggatgcaaaactgcagctgagtaaagatacatacgacgacgacct

ggacaatctcctggcccagattggagaccagtacgccgacctgttcttggctgccaaaaacctctcagac

gctattctcctgtcagacattttgcgcgtgaatactgagattacgaaggcccccctgtctgcctccatga

ttaagcgctatgatgagcaccatcaagacttgacccttcttaaagcgctggtacggcagcagctccctga

aaaatataaagaaatcttcttcgaccagtccaaaaatggctacgcgggctacatcgacggaggtgcaagc

caggaggagttctataagtttataaagccgatccttgagaagatggatgggaccgaagaactcctggtga

aacttaacagggaggatctgctgcgaaagcagcgcacatttgataatgggtccattccacatcaaattca

tcttggagaattgcacgccattttgagaagacaggaggacttctatccgtttcttaaggacaatcgggaa

aaaatagaaaagatacttacattccgaattccttactatgtcgggcccttggcgcgagggaactctcggt

tcgcttggatgactcgaaaaagtgaggagactataactccttggaattttgaagaagtcgtagacaaagg

tgcttccgcgcaatcttttatagagagaatgactaatttcgacaaaaacctcccaaacgagaaggttctg

ccaaagcacagccttctctacgagtattttactgtctataacgaactcactaaggtgaaatacgtaactg

aagggatgaggaagcctgcctttttgagtggcgagcagaagaaagcgatagtagatttgctttttaaaac

caaccggaaggtcactgtgaaacaacttaaagaagactacttcaagaagatagagtgtttcgacagcgta

gaaatatctggcgtagaggaccgcttcaatgcaagcttgggcacttaccatgacctcctcaagataatca

aagataaagattttcttgataatgaagagaatgaggatatccttgaagacatagtgttgactctcacgtt

gtttgaggatagggagatgatagaagagcgcttgaagacctatgctcatctcttcgatgataaagtaatg

aagcaactcaagcggagaaggtatactggttggggtcggctttctaggaaactcatcaacggtattcggg

ataaacagtccggcaaaactatattggatttccttaagagtgatggcttcgcgaaccgaaactttatgca

acttatacatgatgattcacttacatttaaggaagacattcaaaaagcgcaagtatctggccagggcgac

tctctgcacgaacacatagcaaaccttgctggatcccctgcgataaagaaaggtatactgcagacagtaa

aagttgtggacgaactcgtcaaggttatgggtaggcataagcccgaaaatatagtgattgaaatggcacg

cgagaaccaaactacacaaaaaggtcaaaagaacagcagagaacggatgaaacgaatagaggaggggatc

aaggaacttggatcccaaatactgaaagagcaccccgtagaaaatacccagcttcaaaacgagaagcttt

atctgtactacctgcaaaacggcagagatatgtacgtagaccaggaactggacatcaacagattgtctga

ttatgatgtagatcacattgtgccgcagagcttcctcaaagatgattccatagataacaaagtactcact

cgaagtgacaaaaacagagggaaatccgataatgttcccagtgaggaagtcgtcaagaagatgaagaatt

attggcggcaacttctcaacgcgaaactcatcacccaaagaaaattcgataacctcactaaagctgaacg

cggaggactgtcagagcttgataaagcaggttttatcaaaaggcaactcgtagaaacgagacaaataaca

aaacatgtcgctcaaattttggactctcgcatgaatacaaagtatgatgaaaatgacaagctgattcgcg

aggtcaaagtaataacgctcaaaagtaaacttgtctccgatttccgaaaggactttcagttttacaaagt

cagagagataaataattaccaccacgcccatgacgcctacctcaatgctgtggttggtacggctcttatc

aagaaatatccgaagctcgagagcgagtttgtctatggcgactacaaggtttacgatgtcaggaaaatga

tagcgaagtctgagcaagagataggtaaggccacggctaaatactttttctattcaaatatcatgaattt

tttcaaaaccgagataacgttggcgaatggcgaaatcaggaaaaggcctcttatagagactaacggagaa

acaggcgagattgtctgggataagggtagggatttcgctactgtgcgaaaggtactgagcatgccccagg

ttaacattgtcaaaaagactgaggtccaaacgggtggcttttctaaggagagtatcctgccaaaacgcaa

ttcagataagctcatagcgagaaaaaaggattgggacccaaagaaatatggcggcttcgactctccgacg

gtcgcatatagtgtgctggtggttgccaaagttgaaaagggcaagtctaaaaaactgaaatcagtgaagg

agcttctcggaataactattatggagcgcagctcatttgaaaagaatccaatcgatttcttggaagcaaa

aggatataaagaagtcaagaaggacctgatcatcaaacttccaaagtactcactgttcgaacttgagaac

ggacggaagcggatgcttgcgagtgctggagaacttcaaaaaggtaacgagctcgcccttccatcaaagt

acgtaaattttttgtacttggcatcacactatgagaagctcaaaggctcccccgaggataatgagcaaaa

gcagcttttcgtggaacaacataaacattaccttgatgaaatcatcgaacaaataagcgaattctctaaa

cgagttattcttgcagacgcgaatctggacaaggtgcttagcgcatacaacaagcatcgggataagccga

ttcgagaacaagccgaaaatataatccatcttttcactctgacgaacttgggtgcgccggcagccttcaa

gtacttcgataccactattgataggaaacggtatacgagtacaaaagaagtgctggacgctacgcttatc

catcagtccatcactgggctctacgagacgaggattgaccttagtcagttgggcggggac</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан вектор экспрессии, представляющий собой вирусную частицу аденоассоциированного вируса (AAV), имеющую капсидные белки AAV, в которую упакована в качестве генома одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены последовательности ITR AAV, внутри ITR AAV последовательно расположены промотор первого фактора элонгации эукариот EF1 альфа, последовательность гистидиновой метки, сигнал внутриклеточной локализации в ядре 5’-SV40 NLS, кодон-оптимизированная последовательность гена Cas9 Streptococcus pyogenes, еще один сигнал внутриклеточной локализации в ядре 3’-SV40 NLS, в качестве терминатора транскрипции использован синтетический полиА сигнал. Также описан вектор экспрессии, представляющий собой вирусную частицу аденоассоциированного вируса (AAV), имеющую капсидные белки AAV, в которую упакована в качестве генома одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены последовательности ITR AAV, внутри ITR AAV последовательно расположены эукариотический промотор полимеразы III - U6, после которого расположена кассета экспрессии РНК гида, включающая последовательность РНК-гида в формате crRNA, комплементарную таргетируемому локусу, сшитую с последовательностью trackRNA, область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 - левое гомологичное плечо, кассета экспрессии траснгена: промотор EFS-NS, под контролем которого расположена белок-кодирующая последовательность гена hCYP21A2 на 78-99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 3, терминатор транскрипции - полиА сигнал, область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 - правое гомологичное плечо. Группа изобретений расширяет арсенал средств для получения белков в клетках млекопитающих. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Вектор экспрессии, представляющий собой вирусную частицу аденоассоциированного вируса (AAV), имеющую капсидные белки AAV, в которую упакована в качестве генома одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены последовательности ITR AAV, внутри ITR AAV последовательно расположены промотор первого фактора элонгации эукариот EF1 альфа, последовательность гистидиновой метки, сигнал внутриклеточной локализации в ядре 5’-SV40 NLS, кодон-оптимизированная последовательность гена Cas9 Streptococcus pyogenes, еще один сигнал внутриклеточной локализации в ядре 3’-SV40 NLS, в качестве терминатора транскрипции использован синтетический полиА сигнал.

2. Вектор экспрессии по п. 1, характеризующийся тем, что ITR AAV представляет собой ITR AAV серотипа 2.

3. Вектор экспрессии по п. 1, характеризующийся тем, что кодон-оптимизированная последовательность гена Cas9 Streptococcuspyogenes представляет собой SEQ ID NO:5.

4. Вектор экспрессии по п. 1, характеризующийся тем, что вектор представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1.

5. Вектор экспрессии, представляющий собой вирусную частицу аденоассоциированного вируса (AAV), имеющую капсидные белки AAV, в которую упакована в качестве генома одноцепочечная молекула ДНК, на концах которой расположены последовательности ITR AAV, внутри ITR AAV последовательно расположены эукариотический промотор полимеразы III - U6, после которого расположена кассета экспрессии РНК гида, включающая последовательность РНК-гида в формате crRNA, комплементарную таргетируемому локусу, сшитую с последовательностью trackRNA, область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 - левое гомологичное плечо, кассета экспрессии траснгена: промотор EFS-NS, под контролем которого расположена белок-кодирующая последовательность гена hCYP21A2 на 78-99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 3, терминатор транскрипции - полиА сигнал, область гомологии с локусом человеческого генома AAVS1 - правое гомологичное плечо.

6. Вектор экспрессии по п. 5, характеризующийся тем, что последовательность РНК-гида в формате crRNA представляет собой последовательность в 20 нуклеотидов.

7. Вектор экспрессии по п. 5, характеризующийся тем, что ITR AAV представляет собой ITR AAV серотипа 2.

8. Вектор экспрессии по п. 5, характеризующийся тем, что полиА сигнал является полиА сигналом гена β-глобина человека.

9. Вектор экспрессии по п. 5, характеризующийся тем, что вектор представляет собой последовательность SEQ ID NO: 2.