РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ НА ОСНОВЕ ESCHERICHIA COLI, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/10 C12N15/52 C12N15/54 C12N15/70 C12N1/21 C12P13/08 

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая №2019109262958, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 27 сентября 2019 года, и заявки на патент Китая №2019108046792, поданной 28 августа 2019 года, а также заявки на патент Китая №2019108046881, поданной 28 августа 2019 года, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к технической области генной инженерии и микроорганизмов, и, в частности, к рекомбинантному штамму с модифицированным геном kdtA, способу его конструирования и его применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-треонин является одной из восьми незаменимых аминокислот, и представляет собой аминокислоту, которую люди и животные не могут синтезировать самостоятельно. L-треонин способен улучшать усвояемость зерна, регулировать баланс метаболизма in vivo и способствовать росту и развитию организмов, и поэтому он широко применяется в кормовой, медицинской и пищевой промышленности.

В настоящее время L-треонин может быть получен в основном с использованием метода химического синтеза, метода гидролиза белков и метода микробиологической ферментации, при этом метод микробиологической ферментации имеет преимущества, заключающиеся в низкой стоимости производства, высокой интенсивности производства и небольшом уровне загрязнения окружающей среды, поэтому данный метод является наиболее широко применяемым среди методов промышленного производства L-треонина. Для продуцирования L-треонина путем микробиологической ферментации могут быть использованы различные бактерии, такие как мутанты, полученные при индукции Escherichia coli (Е. coli), Corynebacterium и Serratia дикого типа, в качестве штаммов-продуцентов. Конкретные примеры включают мутанты, резистентные к аналогам аминокислот или различные аукстрофы, такие как метионин, треонин и изолейцин. Однако при традиционной мутационной селекции штамм растет медленно и производит больше побочных продуктов из-за случайных мутаций, так что получить высокопродуктивный штамм непросто. Следовательно, конструирование рекомбинантной Е. coli с помощью метаболической инженерии является эффективным способом получения L-треонина. В настоящее время сверхэкспрессия или аттенуация генов ключевых ферментов пути синтеза аминокислот и конкурентного пути, опосредованного экспрессионными плазмидами, является основным средством генетической модификации Е. coli. По-прежнему существует необходимость в разработке более экономичного способа получения L-треонина с высокой производительностью.

Е. coli в качестве хозяина для экзогенной экспрессии генов, обладает преимуществами, такими как чистый генетический фон, простые условия технической эксплуатации и культивирования, экономичная крупномасштабная ферментация, и поэтому эксперты в области генной инженерии уделяют ей все больше внимание. Геномная ДНК Е. coli представляет собой кольцевую молекулу в нуклеоиде, а также может быть представлено множество кольцевых плазмидных ДНК. Нуклеоид в клетках Е. coli имеет одну молекулу ДНК, длина которой составляет примерно 4700000 пар оснований, а также содержит 4400 генов, распределенных в молекуле ДНК, и каждый ген имеет среднюю длину примерно 1000 пар оснований. Среди штаммов Е. coli, используемых обычно в молекулярной биологии, наиболее часто используемыми штаммами в экспериментах по рекомбинации ДНК, за некоторым исключением, являются штамм Е. Coli К12 и его производные.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантный штамм на основе штамма Escherichia coli К12 или его производный штамм, способ его рекомбинантного конструирования и его применение для ферментационного получения аминокислоты. Настоящее изобретение главным образом относится к гену дикого типа kdtA (последовательность ОРС представлена в последовательности 73556-74833, идентификационный номер в GenBank СР032667.1), гену дикого типа spoT (последовательность ОРС представлена в последовательности 3815907-3818015, идентификационный номер в GenBank АР009048.1), гену дикого типа yebN (последовательность ОРС представлена в последовательности 1907402-1907968, идентификационный номер в GenBank АР009048.1) штамма К12 Е. coli и его производным (таким как MG1655 и W3110), а также в настоящем изобретении обнаружено, что мутантный ген, полученный при подвергании гена сайт-направленному мутагенезу, и рекомбинантный штамм, содержащий ген, могут быть использованы для продуцирования L-треонина, и по сравнению с немутантным штаммом дикого типа, полученный штамм значительно увеличивает производительность L-треонина и характеризуется хорошей стабильностью, а также имеет более низкую стоимость производства в качестве штамма для продуцирования L-треонина.

На основании указанных выше данных, настоящее изобретение обеспечивает следующие три технических решения:

Согласно первому техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, образованную вследствие мутации в 82-^ом основании кодирующей последовательности гена kdtA дикого типа, представленная в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 82-^ом основании в SEQ ID NO: 1; в частности, мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок. Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, который содержит кодирующую нуклеотидную последовательность гена akdtA, содержащую точечную мутацию, возникающую в кодирующей последовательности. Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, содержит указанную выше нуклеотидную последовательность.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген kdtA, например, Escherichia coli. В одном варианте настоящего изобретения штаммом-хозяином является штамм Е. coli К12 (W3110) или штамм Е. coli CGMCC 7.232. Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, использует плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 82-^ом основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, продуцирующего L-треонин, содержащего мутантный кодирующий ген kdtA. В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п. В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 82-^ом основании в SEQ ID NO: 1; в частности, мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 82-^ом основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена kdtA;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, продуцирующего L-треонин, имеющего точечную мутацию. В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена kdtA, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена kdtA в соответствии с кодирующей последовательностью гена kdtA, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена kdtA дикого типа (SEQ ID NO: 1) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2) кодирующей области гена kdtA, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как kdtA^(G82A).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦАЦЦАГТГААЦЦГЦЦААЦА 3' (SEQ ID NO: 5);

Р2: 5' ТГЦГЦГГАЦГТААГАЦТЦ 3' (SEQ ID NO: 6);

Р3: 5' ГАГТЦТТАЦГТЦЦГЦГЦА 3' (SEQ ID NO: 7); и

Р4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦТТЦЦЦГЦАЦЦТТТАТТГ 3' (SEQ ID NO: 8).

В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с применением Е. coli К12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (kdtA Up и kdtA Down), имеющих длину 927 п. о. и 695 п. о. и содержащих кодирующие области гена kdtA; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением Р1 и Р4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения kdtA^G82A-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность kdtA^G82A-Up-Down имеет длину 1622 п.о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов). В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап

(2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента kdtA^(G82A)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamH I/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента kdtA^(G82A)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOY-kdtA^(G82A).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап

(3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающее трансформацию рекомбинантного вектора pKOV-kdtA^(G82A) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения трансформация на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации; например, на этапе (3) рекомбинантный вектор вводят в штамм-хозяин.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хл ор амфе николо м.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина или увеличения ферментационного объема L-треонина. Применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Согласно второму техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации в 520-^ом основании кодирующей последовательности гена spoT, представленная в SEQ ID NO: 13.

В соответствии с настоящим изобретением мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на тимин (Т) в 520-^ом основании в SEQ ID NO: 13; в частности, мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 14.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16; в частности, рекомбинантный белок содержит замену глицина на цистеин в 174-^ом положении аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок. Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, содержащий кодирующую нуклеотидную последовательность гена spoT, содержащую точечную мутацию в кодирующей последовательности, например, кодирующая нуклеотидная последовательность гена spoT, представленная в SEQ ID NO: 13, содержащая точечную мутацию в 520-^ом основании.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в замене гуанина (Г) на тимин (Т) в 520-^ом основании в SEQ ID NO: 13.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген spoT, например, Escherichia coli. В одном варианте реализации настоящего изобретения штаммом-хозяином является штамм Е. coli К12 (W3110) или штамм Е. coli CGMCC 7.232.

Для рекомбинантного штамма, раскрытого в данном документе, использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена spoT, представленной в SEQ ID NO: 13, для обеспечения возможности возникновения мутации в 520-^ом основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутантный кодирующий ген spoT.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на тимин (Т) в 520-^ом основании в SEQ ID NO: 13; в частности, мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 14.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена spoT дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 13, для обеспечения возможности возникновения мутации в 520-^ом основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, имеющего точечную мутацию.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена spoT, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена spoT в соответствии с кодирующей последовательностью гена spoT, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена spoT дикого типа (SEQ ID NO: 13) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 14) кодирующей области гена spoT, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как spoT^(G520T).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦГААЦАГЦААГАГЦАГГААГЦ 3' (SEQ ID NO: 17);

Р2: 5' ТГТГГТГГАТАЦАТАААЦГ 3' (SEQ ID NO: 18);

Р3: 5' ГЦАЦЦГТТТАТГТАТЦЦАЦЦ 3'(SEQ ID NO: 19); и

P4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦАЦГАЦАААГТТЦАГЦЦААГЦ 3' (SEQ ID NO: 20).

В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с применением Е. coli К12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (spoT^(G520T)-Up и spoT^(G520T)-Down), имеющих длину 620 п.о. и 880 п.о. и содержащих кодирующие области гена spoT, содержащие точечную мутацию; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением Р1 и Р4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения фрагмента spoT^(G520T)-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность фрагмента spoT^(G520T)-Up-Down имеет длину 1500 п.о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента spoT^(G520T)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamHI/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOY-spoT^(G520T).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающее введение рекомбинантного вектора pKOV-spoT^(G520T) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения введение на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хлорамфениколом. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение обеспечивает применение указанного выше рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Применение нуклеотидной последовательности, рекомбинантного белка, рекомбинантного вектора и рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Согласно третьему техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации в 74-^ом основании кодирующей последовательности гена yebN дикого типа, представленная в SEQ ID NO: 23.

В соответствии с настоящим изобретением мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-^ом основании в SEQ ID NO: 23; в частности, нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 24. Мутация представляет собой изменение в основании/нуклеотиде в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, сайт-направленный мутагенез в ходе ПЦР и/или гомологическая рекомбинация и т.д.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.

Рекомбинантный белок, раскрытый в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; в частности, рекомбинантный белок содержит замену глицина на аспаргиновую кислоту в 25-^ом положении аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25. Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность или рекомбинантный белок. Рекомбинантный вектор, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном варианте осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных липких концов, которые лигируются для конструирования рекомбинантного вектора.

Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, содержащий кодирующую нуклеотидную последовательность гена yebN, содержащую точечную мутацию в кодирующей последовательности, например, кодирующая нуклеотидная последовательность Teu&yebN, представленная в SEQ ID NO: 23, содержащая точечную мутацию в 74-^ом основании.

Согласно рекомбинантному штамму, кодирующая нуклеотидная последовательность гена yebN, содержит мутацию, при которой гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-^ом основании в SEQ ID NO: 23.

В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26. Рекомбинантный штамм, раскрытый в данном документе, конструируют путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен, он может быть выбран из известных в данной области техники штаммов, продуцирующих L-треонин, которые содержат ген yebN, например, Escherichia coli. В одном варианте реализации настоящего изобретения штаммом-хозяином является Е. coli К12, его производный штамм Е. coli К12 (W3110) или штамм E. coli CGMCC 7.232.

Для рекомбинантного штамма, раскрытого в данном документе, использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.

Рекомбинантный штамм согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать или не содержать другие модификации.

Настоящее изобретение обеспечивает способ конструирования рекомбинантного штамма, который содержит следующий этап:

модификация нуклеотидной последовательности кодирующей области гена yebN дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 23, для обеспечения возможности возникновения мутации в 74-^ом основании последовательности с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутантный кодирующий ген yebN. В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению модификация включает применение по меньшей мере одного из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологическая рекомбинация и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация заключается в том, что гуанин (Г) заменен на аденин (А) в 74-^ом основании в SEQ ID NO: 23; в частности, мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 24.

Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена yebN дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 74-^ом основании последовательности с получением мутантной нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания тепа, yebN;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, содержащего точечную мутацию.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (1) включает: конструирование кодирующей области reuayebN, содержащей точечную мутацию, в частности включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена yebN в соответствии с кодирующей последовательностью гена yebN, а также введение точечной мутации в кодирующую область гена yebN дикого типа (SEQ ID NO: 23) с применением методик ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 24) кодирующей области гена yebN, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как yebN^(G74A).

В одном варианте реализации настоящего изобретения на этапе (1) праймерами являются:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦЦТТЦГЦЦААТГТЦТГГАТТГ 3' (SEQ ID NO: 27);

Р2: 5' АТГГАГГГТГГЦАТСТТТАЦ 3' (SEQ ID NO: 28);

Р3: 5' ТГЦАТЦААТЦГГТАААГАТГ 3' (SEQ ID NO: 29); и

Р4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦЦААЦТЦГЦАЦТЦТГЦТГТА 3' (SEQ ID NO: 30). В одном варианте реализации настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с применением Е. coli К12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (yebN^(G74A)-Up и yebN^(G74A)-Down), имеющих длину 690 п.о. и 700 п.о. и содержащих кодирующие области гена yebN, содержащие точечную мутацию; разделение и очистку двух фрагментов ДНК с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами с применением Р1 и Р4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матриц для получения фрагмента yebN^(G74A)-Up-Down.

В одном варианте реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность фрагмента yebN^(G74A)-Up-Down имеет длину 1340 п.о.

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов).

В одном варианте реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности включающее разделение и очистку фрагмента yebN^(G74A)-Up-Down с использованием электрофореза в агарозном геле, затем расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с использованием BamH I/Not I, и разделение и очистку расщепленного фрагмента yebN^(G74A)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с использованием электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKON-yebN^(G74A).

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности включающий введение рекомбинантного вектора pKOV-yebN^(G74A) в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.

В одном варианте реализации настоящего изобретения введение на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению способ дополнительно включает этап скрининга рекомбинантного штамма; например, скрининг осуществляют с использованием культуральной среды с хлорамфениколом. Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный штамм, полученный с помощью указанного выше способа конструирования.

Настоящее изобретение обеспечивает применение указанной выше нуклеотидной последовательности, рекомбинантного белка, рекомбинантного вектора и рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

Применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения описаны и проиллюстрированы более подробно в последующем описании примеров настоящего изобретения. Следует понимать, что следующие примеры предназначены для иллюстрации технических решений настоящего изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения объема правовой охраны настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения и ее эквивалентах.

Если не указано иное, представленные в настоящем описании материалы и реагенты либо коммерчески доступны, либо могут быть получены специалистом в данной области техники в свете предшествующего уровня техники.

Пример 1

(1) Конструирование Плазмиды pKOV-kdtA^(G82A) с Кодирующей Областью Гена kdtA, Содержащей Сайт-Направленную Мутацию (G28A) (эквивалентно замене аланина на треонин в 28-^ом положении (А28Т) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, кодирующей белок дикого типа, причем измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 4). 3-дезокси-О-маннозосульфамилтрансферазу кодировали геном kdtA, и в штамме Е. coli К12 и его производном штамме (например, MG1655) последовательность ОРС гена kdtA дикого типа представлена в последовательности 73556-74833, идентификационный номер в GenBank СР032667.1. Две пары праймеров для амплификации kdtA были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 82-^ом положении, в последовательности кодирующей области гена kdtA исходного штамма. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) имели следующее строение:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦАЦЦАГТГААЦЦГЦЦААЦА 3' (SEQ ID NO: 5);

Р2: 5' ТГЦГЦГГАЦГТААГАЦТЦ 3' (SEQ ID NO: 6);

Р3: 5' ГАГТЦТТАЦГТЦЦГЦГЦА 3' (SEQ ID NO: 7); и

Р4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦТТЦЦЦГЦАЦЦТТТАТТГ 3' (SEQ ID NO: 8). Способ конструирования был следующим: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма Е. coli К12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 927 п. о. и 695 п. о. и точечную мутацию (фрагменты kdtA^(G82A)-Up и kdtA^(G82A)-Down). Амплификацию с помощью метода ПЦР выполняли следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а Р1 и Р4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (kdtA^(G82A)-Up-Down), имеющий длину примерно 1622 п.о.. Амплификацию с помощью метода ПЦР с перекрывающимися праймерами выполняли следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов). Фрагмент kdtA^(G82A)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BanK VNotl, и расщепленный фрагмент kdtA^(G82A)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKO V- kdtA^(G82A). Вектор рКО V-kdtA^(GS2A) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, результат показан в SEQ ID NO: 11, и вектор рКО V -kdtA^(GS2A) с правильной точечной мутацией (kdtA^(GS2A)) был сохранен для последующего использования. (2) Конструирование Модифицированного Штамма с геном kdtA^(GS2A)_. Содержащим Точечную Мутацию

Ген kdtA дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа Е. coli К12 (W3110) и штамма Е. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-kdtA^(GS2A) была перенесена в Е. coli K12 (W3110) и Е. coliCGM.CC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание А в 82-^ом положении последовательностей гена kdtA в хромосомах двух штаммов. Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды рКО V -kdtA(G82A) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0,5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°С и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37°С и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42°С в течение 12 часов; отбор 15 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai hivitrogen Corporation) для применения в ПЦР-амплификации были следующими:

Р5: 5' ЦТТЦЦЦГАААГЦЦГАТТГ3' (SEQ ID NO: 9); и

Р6: 5' АЦАААТАТАЦТТТААТЦ 3' (SEQ ID NO: 10).

SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-kdtA^(G82A) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификацию выполняли на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров Р5 и Р6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание А в 82-^ом положении в последовательности кодирующей области гена kdtA является успешно модифицированным штаммом, и результаты секвенирования показаны в SEQ ID NO: 12. Рекон, полученный от Е. coli K12 (W3110) был назван YPThr07, и рекон, полученный от E. coli CGMCC 7.232 был назван YPThr 08.

(3) Эксперимент по Ферментации Треонина

Штамм Е. coli K12 (W3110), штамм Е. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr07 и YPThr08 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37°С и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37°С и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирвали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Как видно из результатов Таблицы 2, замена аланина в 28-^ом положении аминокислотной последовательности гена kdtA на треонин способствует увеличению продуктивности L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Пример 2

(1) Конструирование Плазмиды pKOV-spoT^(G520T) с Кодирующей Областью Гена spoT, Содержащей Сайт-Направленную Мутацию (G520T) (эквивалентно замене глицина на цистеин в 174-^ом положении (G174C) в кодирующей белок аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 16)

Фермент SPOT кодировали геном spoT, и в штамме Е. coli K12 и его производном штамме (например, W3110), последовательность ОРС гена spoT дикого типа представлена в последовательности 3815907-3818015, идентификационный номер в GenBank АР009048.1. Две пары праймеров для амплификации spoT были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 520-^ом положении, в последовательности кодирующей области гена spoT исходного штамма. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией mvitrogen) имеют следующее строение:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦГААЦАГЦААГАГЦАГГААГЦ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции BamYL I) (SEQ ID NO: 17);

P2: 5' ТГТГГТГГАТАЦАТАААЦГ 3' (SEQ ID NO: 18);

P3: 5' ГЦАЦЦГТТТАТГТАТЦЦАЦЦ 3' (SEQ ID NO: 19); и

P1: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦАЦГАЦАААГТТЦАГЦЦААГЦ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Not I)(SEQ ID NO: 20); Способ конструирования был следующим: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма Е. coli K12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 620 п.о. и 880 п.о. и точечную мутацию (фрагменты spoT^(G520T)-Up и spoT^(G520T)-Down). ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а Р1 и Р4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (spoT^(G520T)-Up-Down), имеющий длину примерно 1500 п. о.. ПЦР-система: 10 х Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР с перекрывающимися праймерами проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов). Фрагмент spoT^(G520T)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BamH I/NotI, и расщепленный фрагмент spoT^(G520T)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора рКО V-spoT^(G520T). Вектор pKOV-spoT^(G520T) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, а вектор pKOY-spoT^(G520T) с корректной точечной мутацией (spoT^(G520T)) был сохранен для последующего использования.

(2) Конструирование Модифицированного Штамма с геном spoT^(G520T), Содержащим Точечную Мутацию

Ген spoT дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа Е. coli K12 (W3110) и штамма Е. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-spoT^(G520T) была перенесена в Е. coli K12 (W3110) и Е. coliCGM.CC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание Т в 520-м положении последовательностей гена spoT в хромосомах двух штаммов. Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды pKO V-spoT^(G520T) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0.5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°С и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37°С и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42°С в течение 12 часов; отбор 15 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) для амплификации в ходе ПЦР были следующими:

Р5: 5' ЦТТТЦГЦААГАТГАТТАТГГ 3' (SEQ ID NO: 21); и

Р6: 5' ЦАЦГГТАТТЦЦЦГЦТТЦЦТГ 3' (SEQ ID NO: 22).

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: преденатурация при 94°С в течение 5 минут, (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 30 с, 30 циклов), и переэлонгация при 72°С в течение 10 минут. SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-spoT^(G520T) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификация была выполнена на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров Р5 и Р6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание Т в 520-м положении в последовательности кодирующей области гена spoT является успешно модифицированным штаммом. Рекон, полученный от Е. coli K12 (W3110) был назван YPThr03, и рекон, полученный от Е. coli CGMCC 7.232 был назван YPThr 04.

(3) Эксперимент по Ферментации Треонина

Штамм Е. coli К12 (W3110), штамм Е. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr03 и YPThr04 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37°С и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37°С и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Как видно из результатов Таблицы 2, замена глицина в 174-^ом положении аминокислотной последовательности гена spoT на цистеин способствует увеличению продуктивности L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Пример 3:

(1) Конструирование Плазмиды pKOV-yebN^(G74A) с Кодирующей Областью Гена yebN, Содержащей Сайт-Направленную Мутацию (G74A) (эквивалентно замене глицина на аспаргиновую кислоту в 25-м основании (G25D) в кодирующей белок аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, измененной аминокислотной последовательностью является SEQ ID NO: 26)

Фермент YEBN кодировали геном yebN, и в штамме Е. coli К12 и его производном штамме (например, W3110) последовательность ОРС гена yebN дикого типа представлена в последовательности 1907402-1907968, идентификационный номер в GenBank АР009048.1. Две пары праймеров для амплификации yebN были сконструированы и синтезированы в соответствии с последовательностью, и вектор был сконструирован для основания Г, замененного на основание А в 74-ом положении, в последовательности кодирующей области гена yebN исходного штамма. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией mvitrogen) имеют следующее строение:

Р1: 5' ЦГГГАТЦЦЦТТЦГЦЦААТГТЦТГГАТТГ 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Bam Н I) (SEQ ID NO: 27);

Р2: 5' АТГГАГГГТГГЦАТЦТТТАЦ 3' (SEQ ID NO: 28);

Р3: 5' ТГЦАТЦААТЦГГТАААГАТГ 3' (SEQ ID NO:29); и

Р4: 5' ААГГААААААГЦГГЦЦГЦЦААЦТЦЦГЦАЦТЦТГЦТГТА 3' (подчеркнутая часть обозначает участок вырезки эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 30). Способ конструирования был следующим: применение праймеров Р1/Р2 и Р3/Р4 для амплификации в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы генома дикого штамма Е. coli K12, для получения двух фрагментов ДНК, имеющих длину 690 п. о. и 700 п. о. и точечную мутацию (фрагменты yebN^(G74A)-Up и yebN^(G74A)-Down). ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 30 с (30 циклов). Два фрагмента ДНК были разделены и очищены с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве матриц, а Р1 и Р4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами, чтобы получить фрагмент (yebN^(G74A)-Up-Down), имеющий длину примерно 1340 п.о.

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР с перекрывающимися праймерами проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 60 с (30 циклов).

Фрагмент yebN^(G74A)-Up-Down был разделен и очищен с использованием метода электрофореза в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмида pKOV (приобретена у Addgene) были расщеплены BamH I/NotI, и расщепленный фрагмент yebN^(G74A)-Up-Down и расщепленная плазмида pKOV были разделены и очищены с использованием метода электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKO V - yebN^(G74A) Вектор pKOY-yebN^(G74A) был отправлен в компанию, занимающуюся секвенированием, для секвенирования и идентификации, а вектор pKOV-yebN^(G74A) с корректной точечной мутацией (yebN^(G74A)) был сохранен для последующего использования.

(2) Конструирование Модифицированного Штамма с геном yebN^(G74A), Содержащим Точечную Мутацию

Ген yebN дикого типа был сохранен на хромосомах штамма Escherichia coli дикого типа Е. coli K12 (W3110) и штамма Е. coli CGMCC 7.232, обладающего высокой способностью к продуцированию L-треонина (сохранен в China General Microbiological Culture Collection Center). Сконструированная плазмида pKOV-yebN^(G74A) была перенесена в Е. coli K12 (W3110) и Е. coZ/CGMCC 7.232, соответственно, и путем аллельной замены основание Г было заменено на основание А в 74-^омположении последовательностей генауе&Ув хромосомах двух штаммов.

Указанный способ осуществляли следующим образом: трансформация плазмиды рКО V -yebN^(G74A) в компетентные клетки бактерии-хозяина посредством процесса электротрансформации, и добавление клеток в 0.5 мл жидкой культуральной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при 30°С и 100 об/мин в течение 2 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 18 часов; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой культуральной среды LB, и культивирование при при 37°С и 200 об/мин в течение 8 часов; нанесение на твердую культуральную среду LB, содержащую хлорамфеникол (34 мкг/мл), 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 42°С в течение 12 часов; отбор 1-5 единичных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 4 часов; нанесение на твердую культуральную среду, содержащую 10% сахарозы, 100 мкл культурального раствора, и культивирование при 30°С в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и выделение колоний на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) и в соотношении один к одному с твердой культуральной средой LB; и отбор штаммов, которые растут на твердой культуральной среде LB и не растут на твердой культуральной среде LB, содержащей хлорамфеникол (34 мкг/мл) для индентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Shanghai Invitrogen Corporation) для амплификации в ходе ПЦР были следующими:

Р5: 5' ЦЦАТЦАЦГГЦТТГТТГТТЦ 3' (SEQ ID NO: 31); и

Р6: 5' АЦГААААЦЦЦТЦААТААТЦ 3' (SEQ ID NO: 32).

ПЦР-система: 10 × Ex Taq буфер 5 мкл, смесь dNTP (2,5 ммоль каждая) 4 мкл, Mg²⁺(25 ммоль) 4 мкл, праймеры (10 пмоль) 2 мкл каждый, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: преденатурация при 94°С в течение 5 минут, (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С при 30 с, элонгация при 72°С в течение 30 с, 30 циклов), и переэлонгация при 72°С в течение 10 минут.SSCP (Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) электрофорез выполняли на продукте, амплифицированном в ходе ПЦР; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV-yebN^(G74A) использовали для положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали для отрицательного контроля, и воду использовали для бланковой пробы. В SSCP-электрофорезе одноцепочечные нуклеотидные цепочки, имеющие одинаковую длину, но разное строение последовательностей, образовали различные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали различной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствует положению материала, используемого для отрицательного контроля, и штаммом, в случае которого положение фрагмента при электрофорезе соответствует положению материала, используемого для положительного контроля, является штамм с успешно замененной аллелью. ПЦР-амплификация была выполнена на целевом фрагменте путем применения штамма с успешно замененной аллелью в качестве матрицы и применения праймеров Р5 и Р6, а затем целевой фрагмент лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей, полученных в результате секвенирования было определено, что рекон, образованный путем замены основания Г на основание А в 74-м положении в последовательности кодирующей области гена yebN является успешно модифицированным штаммом. Рекон, полученный от Е. coli K12 (W3110) был назван YPThr05, и рекон, полученный от Е. coli CGMCC 7.232 был назван YPThr 06.

(3) Эксперимент по Ферментации Треонина

Штамм Е. coli К12 (W3110), штамм Е. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr05 и YPThr06 инокулировали при 25 мл в жидкой культуральной среде, описанной в Таблице 1, соответственно, и культивировали при 37°С и 200 об/мин в течение 12 часов. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в Таблице 1, и подвергали ферментации при 37°С и 200 об/мин в течение 36 часов. Содержание L-треонина определяли с помощью метода ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты представлены в Таблице 2.

Как видно из результатов Таблицы 2, замена глицина в 25-^ом положении аминокислотной последовательности гена yebN на аспаргиновую кислоту способствует увеличению продуцирования L-треонина исходным штаммом, продуцирующим L-треонин, как с высокой, так и с низкой продуктивностью.

Примеры согласно настоящему изобретению описаны выше. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными выше примерами. Любые изменения, эквиваленты, улучшения и т.п., внесенные без отступления от существа и принципа настоящего изобретения, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.

--->

Лист последовательностей

<110> Heilongjiang Eppen Biotech Co., Ltd

<120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ НА ОСНОВЕ ESCHERICHIACOLI, СПОСОБ ЕГО

КОНСТРУИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> CPWO20110939

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1278

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg

60

ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt

120

ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa

180

actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt

240

accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat

300

gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa

360

gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg

420

ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc

480

gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt

540

gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag

600

gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa

660

gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact

720

cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg

780

aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt

840

gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc

900

acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat

960

ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc

1020

gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg

1080

cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag

1140

gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa

1200

gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg

1260

ccaccgaaaacgcattga

1278

<210> 2

<211> 1278

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

atgctcgaattgctttacaccgcccttctctaccttattcagccgctgatctggatacgg

60

ctctgggtgcgcggacgtaagactccggcctatcgaaaacgctggggtgaacgttacggt

120

ttttaccgccatccgctaaaaccaggcggcattatgctgcactccgtctccgtcggtgaa

180

actctggcggcaatcccgttggtgcgcgcgctgcgtcatcgttatcctgatttaccgatt

240

accgtaacaaccatgacgccaaccggttcggagcgcgtacaatcggctttcgggaaggat

300

gttcagcacgtttatctgccgtatgatctgcccgatgcactcaaccgtttcctgaataaa

360

gtcgaccctaaactggtgttgattatggaaaccgaactatggcctaacctgattgcggcg

420

ctacataaacgtaaaattccgctggtgatcgctaacgcgcgactctctgcccgctcggcc

480

gcaggttatgccaaactgggtaaattcgtccgtcgcttgctgcgtcgtattacgctgatt

540

gctgcgcaaaatgaagaagatggtgcacgttttgtggcgctgggcgcaaaaaataatcag

600

gtgaccgttaccggtagcctgaaattcgatatttctgtaacgccgcagttggctgctaaa

660

gccgtgacgctgcgccgccagtgggcaccacaccgcccggtatggattgccaccagcact

720

cacgaaggcgaagagagtgtggtgatcgccgcacatcaggcattgttacagcaattcccg

780

aatttattgctcatcctggtaccccgtcatccggaacgcttcccggatgcgattaacctt

840

gtccgccaggctggactaagctatatcacacgctcttcaggggaagtcccctccaccagc

900

acgcaggttgtggttggcgatacgatgggcgagttgatgttactgtatggcattgccgat

960

ctcgcctttgttggcggttcactggttgaacgtggtgggcataatccgctggaagctgcc

1020

gcacacgctattccggtattgatggggccgcatacttttaactttaaagacatttgcgcg

1080

cggctggagcaggcaagcgggctgattaccgttaccgatgccactacgcttgcaaaagag

1140

gtttcctctttactcaccgacgccgattaccgtagtttctatggccgtcatgccgttgaa

1200

gtactgtatcaaaaccagggcgcgctacagcgtctgcttcaactgctggaaccttacctg

1260

ccaccgaaaa cgcattga

1278

<210> 3

<211> 425

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 3

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 4

<211> 425

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Thr Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 5

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

cgggatccaccagtgaaccgccaaca

26

<210> 6

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

tgcgcggacgtaagactc

18

<210> 7

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

gagtcttacgtccgcgca

18

<210> 8

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

aaggaaaaaagcggccgcttcccgcacctttattg

35

<210> 9

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

cttcccgaaagccgattg

18

<210> 10

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

acaaaatatactttaatc

18

<210> 11

<211> 1596

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

accagtgaaccgccaacaaaggcgagatcggcaatgccatacagtaacatcaactcgccc

60

atcgtatcgccaaccacaacctgcgtgctggtggaggggacttcccctgaagagcgtgtg

120

atatagcttagtccagcctggcggacaaggttaatcgcatccgggaagcgttccggatga

180

cggggtaccaggatgagcaataaattcgggaattgctgtaacaatgcctgatgtgcggcg

240

atcaccacactctcttcgccttcgtgagtgctggtggcaatccataccgggcggtgtggt

300

gcccactggcggcgcagcgtcacggctttagcagccaactgcggcgttacagaaatatcg

360

aatttcaggctaccggtaacggtcacctgattattttttgcgcccagcgccacaaaacgt

420

gcaccatcttcttcattttgcgcagcaatcagcgtaatacgacgcagcaagcgacggacg

480

aatttacccagtttggcataacctgcggccgagcgggcagagagtcgcgcgttagcgatc

540

accagcggaattttacgtttatgtagcgccgcaatcaggttaggccatagttcggtttcc

600

ataatcaacaccagtttagggtcgactttattcaggaaacggttgagtgcatcgggcaga

660

tcatacggcagataaacgtgctgaacatccttcccgaaagccgattgtacgcgctccgaa

720

ccggttggcgtcatggttgttacggtaatcggtaaatcaggataacgatgacgcagcgcg

780

cgcaccaacgggattgccgccagagtttcaccgacggagacggagtgcagcataatgccg

840

cctggttttagcggatggcggtaaaaaccgtaacgttcaccccagcgttttcgataggcc

900

ggagacttacgtccgcgcacccagagccgtatccagatcagcggctgaataaggtagaga

960

agggcggtgtaaagcaattcgagcatagtaaatagctgacttatggatgtgctggggatt

1020

ctatgtatttagctgtggctttaccattacttttcccgtttttgacttaaatagcttcag

1080

tttggtctgatctgccgctacatcttcattttttttgtatttttatgcgattcattgaaa

1140

ctcggccccattttcaaatctacataggccgtactgacattatcgaaatgctatttttta

1200

tctatttgatttttatgattaaagtatattttgtgtataaaaatcattcgggtcggattg

1260

ctgcgaaagaaatgatacactagcacgtcaaagtaagtgcgttatcagtattcaggtagc

1320

tgttgagcctggggcggtagcgtgcttttttctgcttaacttaaccagacaatcacacaa

1380

aagagtcgctagtggaaaagccatttcgaaaaatcctggtcataaagatgcgatatcatg

1440

gggatatgttattaactactcctgtcatcagtacgctcaagcagaattatcctgatgcaa

1500

aaatcgatatgctgctttatcaggacaccatccctattttgtctgaaaacccggaaatta

1560

atgcgctctatgggataagcaataaaggtgcgggaa

1596

<210> 12

<211> 544

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

cttcccgaaagccgattgtacgcgctccgaaccggttggcgtcatggttgttacggtaat

60

cggtaaatcaggataacgatgacgcagcgcgcgcaccaacgggattgccgccagagtttc

120

accgacggagacggagtgcagcataatgccgcctggttttagcggatggcggtaaaaacc

180

gtaacgttcaccccagcgttttcgataggccggagacttacgtccgcgcacccagagccg

240

tatccagatcagcggctgaataaggtagagaagggcggtgtaaagcaattcgagcatagt

300

aaatagctgacttatggatgtgctggggattctatgtatttagctgtggctttaccatta

360

cttttcccgtttttgacttaaatagcttcagtttggtctgatctgccgctacatcttcat

420

tttttttgtatttttatgcgattcattgaaactcggccccattttcaaatctacataggc

480

cgtactgacattatcgaaatgctattttttatctatttgatttttatgattaaagtatat

540

tttg

544

<210> 13

<211> 2109

<212> ДНК

<213>Escherichiacoli

<400> 13

atgtatctgtttgaaagcctgaatcaactgattcaaacctacctgccggaagaccaaatc

60

aagcgtctgcggcaggcgtatctcgttgcacgtgatgctcacgaggggcaaacacgttca

120

agcggtgaaccctatatcacgcacccggtagcggttgcctgcattctggccgagatgaaa

180

ctcgactatgaaacgctgatggcggcgctgctgcatgacgtgattgaagatactcccgcc

240

acctaccaggatatggaacagctttttggtaaaagcgtcgccgagctggtagagggggtg

300

tcgaaacttgataaactcaagttccgcgataagaaagaggcgcaggccgaaaactttcgc

360

aagatgattatggcgatggtgcaggatatccgcgtcatcctcatcaaacttgccgaccgt

420

acccacaacatgcgcacgctgggctcacttcgcccggacaaacgtcgccgcatcgcccgt

480

gaaactctcgaaatttatagcccgctggcgcaccgtttaggtatccaccacattaaaacc

540

gaactcgaagagctgggttttgaggcgctgtatcccaaccgttatcgcgtaatcaaagaa

600

gtggtgaaagccgcgcgcggcaaccgtaaagagatgatccagaagattctttctgaaatc

660

gaagggcgtttgcaggaagcgggaataccgtgccgcgtcagtggtcgcgagaagcatctt

720

tattcgatttactgcaaaatggtgctcaaagagcagcgttttcactcgatcatggacatc

780

tacgctttccgcgtgatcgtcaatgattctgacacctgttatcgcgtgctgggccagatg

840

cacagcctgtacaagccgcgtccgggccgcgtgaaagactatatcgccattccaaaagcg

900

aacggctatcagtctttgcacacctcgatgatcggcccgcacggtgtgccggttgaggtc

960

cagatccgtaccgaagatatggaccagatggcggagatgggtgttgccgcgcactgggct

1020

tataaagagcacggcgaaaccagtactaccgcacaaatccgcgcccagcgctggatgcaa

1080

agcctgctggagctgcaacagagcgccggtagttcgtttgaatttatcgagagcgttaaa

1140

tccgatctcttcccggatgagatttacgttttcacaccggaagggcgcattgtcgagctg

1200

cctgccggtgcaacgcccgtcgacttcgcttatgcagtgcataccgatatcggtcatgcc

1260

tgcgtgggcgcacgcgttgaccgccagccttacccgctgtcgcagccgcttaccagcggt

1320

caaaccgttgaaatcattaccgctccgggcgctcgcccgaatgccgcttggctgaacttt

1380

gtcgttagctcgaaagcgcgcgccaaaattcgtcagttgctgaaaaacctcaagcgtgat

1440

gattctgtaagcctgggccgtcgtctgctcaaccatgctttgggtggtagccgtaagctg

1500

aatgaaatcccgcaggaaaatattcagcgcgagctggatcgcatgaagctggcaacgctt

1560

gacgatctgctggcagaaatcggacttggtaacgcaatgagcgtggtggtcgcgaaaaat

1620

ctgcaacatggggacgcctccattccaccggcaacccaaagccacggacatctgcccatt

1680

aaaggtgccgatggcgtgctgatcacctttgcgaaatgctgccgccctattcctggcgac

1740

ccgattatcgcccacgtcagccccggtaaaggtctggtgatccaccatgaatcctgccgt

1800

aatatccgtggctaccagaaagagccagagaagtttatggctgtggaatgggataaagag

1860

acggcgcaggagttcatcaccgaaatcaaggtggagatgttcaatcatcagggtgcgctg

1920

gcaaacctgacggcggcaattaacaccacgacttcgaatattcaaagtttgaatacggaa

1980

gagaaagatggtcgcgtctacagcgcctttattcgtctgaccgctcgtgaccgtgtgcat

2040

ctggcgaatatcatgcgcaaaatccgcgtgatgccagacgtgattaaagtcacccgaaac

2100

cgaaattaa

2109

<210> 14

<211> 2109

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

atgtatctgtttgaaagcctgaatcaactgattcaaacctacctgccggaagaccaaatc

60

aagcgtctgcggcaggcgtatctcgttgcacgtgatgctcacgaggggcaaacacgttca

120

agcggtgaaccctatatcacgcacccggtagcggttgcctgcattctggccgagatgaaa

180

ctcgactatgaaacgctgatggcggcgctgctgcatgacgtgattgaagatactcccgcc

240

acctaccaggatatggaacagctttttggtaaaagcgtcgccgagctggtagagggggtg

300

tcgaaacttgataaactcaagttccgcgataagaaagaggcgcaggccgaaaactttcgc

360

aagatgattatggcgatggtgcaggatatccgcgtcatcctcatcaaacttgccgaccgt

420

acccacaacatgcgcacgctgggctcacttcgcccggacaaacgtcgccgcatcgcccgt

480

gaaactctcgaaatttatagcccgctggcgcaccgtttatgtatccaccacattaaaacc

540

gaactcgaagagctgggttttgaggcgctgtatcccaaccgttatcgcgtaatcaaagaa

600

gtggtgaaagccgcgcgcggcaaccgtaaagagatgatccagaagattctttctgaaatc

660

gaagggcgtttgcaggaagcgggaataccgtgccgcgtcagtggtcgcgagaagcatctt

720

tattcgatttactgcaaaatggtgctcaaagagcagcgttttcactcgatcatggacatc

780

tacgctttccgcgtgatcgtcaatgattctgacacctgttatcgcgtgctgggccagatg

840

cacagcctgtacaagccgcgtccgggccgcgtgaaagactatatcgccattccaaaagcg

900

aacggctatcagtctttgcacacctcgatgatcggcccgcacggtgtgccggttgaggtc

960

cagatccgtaccgaagatatggaccagatggcggagatgggtgttgccgcgcactgggct

1020

tataaagagcacggcgaaaccagtactaccgcacaaatccgcgcccagcgctggatgcaa

1080

agcctgctggagctgcaacagagcgccggtagttcgtttgaatttatcgagagcgttaaa

1140

tccgatctcttcccggatgagatttacgttttcacaccggaagggcgcattgtcgagctg

1200

cctgccggtgcaacgcccgtcgacttcgcttatgcagtgcataccgatatcggtcatgcc

1260

tgcgtgggcgcacgcgttgaccgccagccttacccgctgtcgcagccgcttaccagcggt

1320

caaaccgttgaaatcattaccgctccgggcgctcgcccgaatgccgcttggctgaacttt

1380

gtcgttagctcgaaagcgcgcgccaaaattcgtcagttgctgaaaaacctcaagcgtgat

1440

gattctgtaagcctgggccgtcgtctgctcaaccatgctttgggtggtagccgtaagctg

1500

aatgaaatcccgcaggaaaatattcagcgcgagctggatcgcatgaagctggcaacgctt

1560

gacgatctgctggcagaaatcggacttggtaacgcaatgagcgtggtggtcgcgaaaaat

1620

ctgcaacatggggacgcctccattccaccggcaacccaaagccacggacatctgcccatt

1680

aaaggtgccgatggcgtgctgatcacctttgcgaaatgctgccgccctattcctggcgac

1740

ccgattatcgcccacgtcagccccggtaaaggtctggtgatccaccatgaatcctgccgt

1800

aatatccgtggctaccagaaagagccagagaagtttatggctgtggaatgggataaagag

1860

acggcgcaggagttcatcaccgaaatcaaggtggagatgttcaatcatcagggtgcgctg

1920

gcaaacctgacggcggcaattaacaccacgacttcgaatattcaaagtttgaatacggaa

1980

gagaaagatggtcgcgtctacagcgcctttattcgtctgaccgctcgtgaccgtgtgcat

2040

ctggcgaatatcatgcgcaaaatccgcgtgatgccagacgtgattaaagtcacccgaaac

2100

cgaaattaa

2109

<210> 15

<211> 702

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 15

Met Tyr Leu Phe Glu Ser Leu Asn Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Glu Asp Gln Ile Lys Arg Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Ala Arg Asp

20 25 30

Ala His Glu Gly Gln Thr Arg Ser Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Thr His

35 40 45

Pro Val Ala Val Ala Cys Ile Leu Ala Glu Met Lys Leu Asp Tyr Glu

50 55 60

Thr Leu Met Ala Ala Leu Leu His Asp Val Ile Glu Asp Thr Pro Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Gln Asp Met Glu Gln Leu Phe Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu

85 90 95

Val Glu Gly Val Ser Lys Leu Asp Lys Leu Lys Phe Arg Asp Lys Lys

100 105 110

Glu Ala Gln Ala Glu Asn Phe Arg Lys Met Ile Met Ala Met Val Gln

115 120 125

Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Thr His Asn Met

130 135 140

Arg Thr Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Lys Arg Arg Arg Ile Ala Arg

145 150 155 160

Glu Thr Leu Glu Ile Tyr Ser Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile His

165 170 175

His Ile Lys Thr Glu Leu Glu Glu Leu Gly Phe Glu Ala Leu Tyr Pro

180 185 190

Asn Arg Tyr Arg Val Ile Lys Glu Val Val Lys Ala Ala Arg Gly Asn

195 200 205

Arg Lys Glu Met Ile Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ile Glu Gly Arg Leu

210 215 220

Gln Glu Ala Gly Ile Pro Cys Arg Val Ser Gly Arg Glu Lys His Leu

225 230 235 240

Tyr Ser Ile Tyr Cys Lys Met Val Leu Lys Glu Gln Arg Phe His Ser

245 250 255

Ile Met Asp Ile Tyr Ala Phe Arg Val Ile Val Asn Asp Ser Asp Thr

260 265 270

Cys Tyr Arg Val Leu Gly Gln Met His Ser Leu Tyr Lys Pro Arg Pro

275 280 285

Gly Arg Val Lys Asp Tyr Ile Ala Ile Pro Lys Ala Asn Gly Tyr Gln

290 295 300

Ser Leu His Thr Ser Met Ile Gly Pro His Gly Val Pro Val Glu Val

305 310 315 320

Gln Ile Arg Thr Glu Asp Met Asp Gln Met Ala Glu Met Gly Val Ala

325 330 335

Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu His Gly Glu Thr Ser Thr Thr Ala Gln

340 345 350

Ile Arg Ala Gln Arg Trp Met Gln Ser Leu Leu Glu Leu Gln Gln Ser

355 360 365

Ala Gly Ser Ser Phe Glu Phe Ile Glu Ser Val Lys Ser Asp Leu Phe

370 375 380

Pro Asp Glu Ile Tyr Val Phe Thr Pro Glu Gly Arg Ile Val Glu Leu

385 390 395 400

Pro Ala Gly Ala Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Asp

405 410 415

Ile Gly His Ala Cys Val Gly Ala Arg Val Asp Arg Gln Pro Tyr Pro

420 425 430

Leu Ser Gln Pro Leu Thr Ser Gly Gln Thr Val Glu Ile Ile Thr Ala

435 440 445

Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ala Ala Trp Leu Asn Phe Val Val Ser Ser

450 455 460

Lys Ala Arg Ala Lys Ile Arg Gln Leu Leu Lys Asn Leu Lys Arg Asp

465 470 475 480

Asp Ser Val Ser Leu Gly Arg Arg Leu Leu Asn His Ala Leu Gly Gly

485 490 495

Ser Arg Lys Leu Asn Glu Ile Pro Gln Glu Asn Ile Gln Arg Glu Leu

500 505 510

Asp Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Asp Asp Leu Leu Ala Glu Ile Gly

515 520 525

Leu Gly Asn Ala Met Ser Val Val Val Ala Lys Asn Leu Gln His Gly

530 535 540

Asp Ala Ser Ile Pro Pro Ala Thr Gln Ser His Gly His Leu Pro Ile

545 550 555 560

Lys Gly Ala Asp Gly Val Leu Ile Thr Phe Ala Lys Cys Cys Arg Pro

565 570 575

Ile Pro Gly Asp Pro Ile Ile Ala His Val Ser Pro Gly Lys Gly Leu

580 585 590

Val Ile His His Glu Ser Cys Arg Asn Ile Arg Gly Tyr Gln Lys Glu

595 600 605

Pro Glu Lys Phe Met Ala Val Glu Trp Asp Lys Glu Thr Ala Gln Glu

610 615 620

Phe Ile Thr Glu Ile Lys Val Glu Met Phe Asn His Gln Gly Ala Leu

625 630 635 640

Ala Asn Leu Thr Ala Ala Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asn Ile Gln Ser

645 650 655

Leu Asn Thr Glu Glu Lys Asp Gly Arg Val Tyr Ser Ala Phe Ile Arg

660 665 670

Leu Thr Ala Arg Asp Arg Val His Leu Ala Asn Ile Met Arg Lys Ile

675 680 685

Arg Val Met Pro Asp Val Ile Lys Val Thr Arg Asn Arg Asn

690 695 700

<210> 16

<211> 702

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 16

Met Tyr Leu Phe Glu Ser Leu Asn Gln Leu Ile Gln Thr Tyr Leu Pro

1 5 10 15

Glu Asp Gln Ile Lys Arg Leu Arg Gln Ala Tyr Leu Val Ala Arg Asp

20 25 30

Ala His Glu Gly Gln Thr Arg Ser Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Thr His

35 40 45

Pro Val Ala Val Ala Cys Ile Leu Ala Glu Met Lys Leu Asp Tyr Glu

50 55 60

Thr Leu Met Ala Ala Leu Leu His Asp Val Ile Glu Asp Thr Pro Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Gln Asp Met Glu Gln Leu Phe Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu

85 90 95

Val Glu Gly Val Ser Lys Leu Asp Lys Leu Lys Phe Arg Asp Lys Lys

100 105 110

Glu Ala Gln Ala Glu Asn Phe Arg Lys Met Ile Met Ala Met Val Gln

115 120 125

Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Thr His Asn Met

130 135 140

Arg Thr Leu Gly Ser Leu Arg Pro Asp Lys Arg Arg Arg Ile Ala Arg

145 150 155 160

Glu Thr Leu Glu Ile Tyr Ser Pro Leu Ala His Arg Leu Cys Ile His

165 170 175

His Ile Lys Thr Glu Leu Glu Glu Leu Gly Phe Glu Ala Leu Tyr Pro

180 185 190

Asn Arg Tyr Arg Val Ile Lys Glu Val Val Lys Ala Ala Arg Gly Asn

195 200 205

Arg Lys Glu Met Ile Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ile Glu Gly Arg Leu

210 215 220

Gln Glu Ala Gly Ile Pro Cys Arg Val Ser Gly Arg Glu Lys His Leu

225 230 235 240

Tyr Ser Ile Tyr Cys Lys Met Val Leu Lys Glu Gln Arg Phe His Ser

245 250 255

Ile Met Asp Ile Tyr Ala Phe Arg Val Ile Val Asn Asp Ser Asp Thr

260 265 270

Cys Tyr Arg Val Leu Gly Gln Met His Ser Leu Tyr Lys Pro Arg Pro

275 280 285

Gly Arg Val Lys Asp Tyr Ile Ala Ile Pro Lys Ala Asn Gly Tyr Gln

290 295 300

Ser Leu His Thr Ser Met Ile Gly Pro His Gly Val Pro Val Glu Val

305 310 315 320

Gln Ile Arg Thr Glu Asp Met Asp Gln Met Ala Glu Met Gly Val Ala

325 330 335

Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu His Gly Glu Thr Ser Thr Thr Ala Gln

340 345 350

Ile Arg Ala Gln Arg Trp Met Gln Ser Leu Leu Glu Leu Gln Gln Ser

355 360 365

Ala Gly Ser Ser Phe Glu Phe Ile Glu Ser Val Lys Ser Asp Leu Phe

370 375 380

Pro Asp Glu Ile Tyr Val Phe Thr Pro Glu Gly Arg Ile Val Glu Leu

385 390 395 400

Pro Ala Gly Ala Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Asp

405 410 415

Ile Gly His Ala Cys Val Gly Ala Arg Val Asp Arg Gln Pro Tyr Pro

420 425 430

Leu Ser Gln Pro Leu Thr Ser Gly Gln Thr Val Glu Ile Ile Thr Ala

435 440 445

Pro Gly Ala Arg Pro Asn Ala Ala Trp Leu Asn Phe Val Val Ser Ser

450 455 460

Lys Ala Arg Ala Lys Ile Arg Gln Leu Leu Lys Asn Leu Lys Arg Asp

465 470 475 480

Asp Ser Val Ser Leu Gly Arg Arg Leu Leu Asn His Ala Leu Gly Gly

485 490 495

Ser Arg Lys Leu Asn Glu Ile Pro Gln Glu Asn Ile Gln Arg Glu Leu

500 505 510

Asp Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Asp Asp Leu Leu Ala Glu Ile Gly

515 520 525

Leu Gly Asn Ala Met Ser Val Val Val Ala Lys Asn Leu Gln His Gly

530 535 540

Asp Ala Ser Ile Pro Pro Ala Thr Gln Ser His Gly His Leu Pro Ile

545 550 555 560

Lys Gly Ala Asp Gly Val Leu Ile Thr Phe Ala Lys Cys Cys Arg Pro

565 570 575

Ile Pro Gly Asp Pro Ile Ile Ala His Val Ser Pro Gly Lys Gly Leu

580 585 590

Val Ile His His Glu Ser Cys Arg Asn Ile Arg Gly Tyr Gln Lys Glu

595 600 605

Pro Glu Lys Phe Met Ala Val Glu Trp Asp Lys Glu Thr Ala Gln Glu

610 615 620

Phe Ile Thr Glu Ile Lys Val Glu Met Phe Asn His Gln Gly Ala Leu

625 630 635 640

Ala Asn Leu Thr Ala Ala Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asn Ile Gln Ser

645 650 655

Leu Asn Thr Glu Glu Lys Asp Gly Arg Val Tyr Ser Ala Phe Ile Arg

660 665 670

Leu Thr Ala Arg Asp Arg Val His Leu Ala Asn Ile Met Arg Lys Ile

675 680 685

Arg Val Met Pro Asp Val Ile Lys Val Thr Arg Asn Arg Asn

690 695 700

<210> 17

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

cgggatccgaacagcaagagcaggaagc

28

<210> 18

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

tgtggtggatacataaacg

19

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

gcaccgtttatgtatccacc

20

<210> 20

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

aaggaaaaaagcggccgcacgacaaagttcagccaagc

38

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

ctttcgcaagatgattatgg

20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

cacggtattcccgcttcctg

20

<210> 23

<211> 567

<212> ДНК

<213>Escherichiacoli

<400> 23

atgaatatcactgctactgttcttcttgcgtttggtatgtcgatggatgcatttgctgca

60

tcaatcggtaaaggtgccaccctccataaaccgaaattttctgaagcattgcgaaccggc

120

cttatttttggtgccgtcgaaaccctgacgccgctgatcggctggggaatgggcatgtta

180

gccagccggtttgtccttgaatggaaccactggattgcgtttgtgctgctgatattcctc

240

ggcgggcgaatgattattgagggttttcgtggcgcagatgatgaagatgaagagccgcgc

300

cgtcgacacggtttctggctactggtaaccaccgcgattgccaccagcctggatgccatg

360

gctgtgggtgttggtcttgctttcctgcaggtcaacattatcgcgaccgcattggccatt

420

ggttgtgcaaccttgattatgtcaacattagggatgatggttggtcgctttatcggctca

480

attattgggaaaaaagcggaaattctcggcgggctggtgctgatcggcatcggcgtccag

540

atcctctggacgcacttccacggttaa

567

<210> 24

<211> 567

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

atgaatatcactgctactgttcttcttgcgtttggtatgtcgatggatgcatttgctgca

60

tcaatcggtaaagatgccaccctccataaaccgaaattttctgaagcattgcgaaccggc

120

cttatttttggtgccgtcgaaaccctgacgccgctgatcggctggggaatgggcatgtta

180

gccagccggtttgtccttgaatggaaccactggattgcgtttgtgctgctgatattcctc

240

ggcgggcgaatgattattgagggttttcgtggcgcagatgatgaagatgaagagccgcgc

300

cgtcgacacggtttctggctactggtaaccaccgcgattgccaccagcctggatgccatg

360

gctgtgggtgttggtcttgctttcctgcaggtcaacattatcgcgaccgcattggccatt

420

ggttgtgcaaccttgattatgtcaacattagggatgatggttggtcgctttatcggctca

480

attattgggaaaaaagcggaaattctcggcgggctggtgctgatcggcatcggcgtccag

540

atcctctgga cgcacttcca cggttaa

567

<210> 25

<211> 188

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 25

Met Asn Ile Thr Ala Thr Val Leu Leu Ala Phe Gly Met Ser Met Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ala Ala Ser Ile Gly Lys Gly Ala Thr Leu His Lys Pro Lys

20 25 30

Phe Ser Glu Ala Leu Arg Thr Gly Leu Ile Phe Gly Ala Val Glu Thr

35 40 45

Leu Thr Pro Leu Ile Gly Trp Gly Met Gly Met Leu Ala Ser Arg Phe

50 55 60

Val Leu Glu Trp Asn His Trp Ile Ala Phe Val Leu Leu Ile Phe Leu

65 70 75 80

Gly Gly Arg Met Ile Ile Glu Gly Phe Arg Gly Ala Asp Asp Glu Asp

85 90 95

Glu Glu Pro Arg Arg Arg His Gly Phe Trp Leu Leu Val Thr Thr Ala

100 105 110

Ile Ala Thr Ser Leu Asp Ala Met Ala Val Gly Val Gly Leu Ala Phe

115 120 125

Leu Gln Val Asn Ile Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ile Gly Cys Ala Thr

130 135 140

Leu Ile Met Ser Thr Leu Gly Met Met Val Gly Arg Phe Ile Gly Ser

145 150 155 160

Ile Ile Gly Lys Lys Ala Glu Ile Leu Gly Gly Leu Val Leu Ile Gly

165 170 175

Ile Gly Val Gln Ile Leu Trp Thr His Phe His Gly

180 185

<210> 26

<211> 188

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

Met Asn Ile Thr Ala Thr Val Leu Leu Ala Phe Gly Met Ser Met Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ala Ala Ser Ile Gly Lys Asp Ala Thr Leu His Lys Pro Lys

20 25 30

Phe Ser Glu Ala Leu Arg Thr Gly Leu Ile Phe Gly Ala Val Glu Thr

35 40 45

Leu Thr Pro Leu Ile Gly Trp Gly Met Gly Met Leu Ala Ser Arg Phe

50 55 60

Val Leu Glu Trp Asn His Trp Ile Ala Phe Val Leu Leu Ile Phe Leu

65 70 75 80

Gly Gly Arg Met Ile Ile Glu Gly Phe Arg Gly Ala Asp Asp Glu Asp

85 90 95

Glu Glu Pro Arg Arg Arg His Gly Phe Trp Leu Leu Val Thr Thr Ala

100 105 110

Ile Ala Thr Ser Leu Asp Ala Met Ala Val Gly Val Gly Leu Ala Phe

115 120 125

Leu Gln Val Asn Ile Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ile Gly Cys Ala Thr

130 135 140

Leu Ile Met Ser Thr Leu Gly Met Met Val Gly Arg Phe Ile Gly Ser

145 150 155 160

Ile Ile Gly Lys Lys Ala Glu Ile Leu Gly Gly Leu Val Leu Ile Gly

165 170 175

Ile Gly Val Gln Ile Leu Trp Thr His Phe His Gly

180 185

<210> 27

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

cgggatccct tcgccaatgt ctggattg

28

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 28

atggagggtg gcatctttac

20

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 29

tgcatcaatc ggtaaagatg

20

<210> 30

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 30

aaggaaaaaa gcggccgcca actccgcact ctgctgta

38

<210> 31

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 31

ccatcacggcttgttgttc

19

<210> 32

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 32

acgaaaaccctcaataatc

19

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен нуклеотид для ферментативного получения L-треонина, содержащий нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации, заключающуюся в замене гуанина (Г) на аденин (А) в 82-м основании кодирующей последовательности гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1. Также предложены рекомбинантный белок для ферментативного получения L-треонина, кодируемый указанным нуклеотидом, вектор, содержащий указанный нуклеотид, рекомбинантная бактерия, содержащая указанный нуклеотид, их применение для ферментативного получения L-треонина, а также способ конструирования указанной рекомбинантной бактерии. Изобретение обеспечивает продукцию L-треонина в высокой концентрации. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

1. Нуклеотид для ферментативного получения L-треонина, содержащий нуклеотидную последовательность, образованную вследствие мутации, заключающейся в замене гуанина (Г) на аденин (А) в 82-ом основании кодирующей последовательности гена kdtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1.

2. Нуклеотид по п. 1, где мутантная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

3. Рекомбинантный белок для ферментативного получения L-треонина, кодируемый нуклеотидом по п. 1, где указанная аминокислотная последовательность рекомбинантного белка представлена в SEQ ID NO: 4.

4. Рекомбинантный вектор для ферментативного получения L-треонина, содержащий нуклеотид по п. 1.

5. Рекомбинантный вектор по п. 4, где рекомбинантный вектор образован путем введения нуклеотидной последовательности в плазмиду.

6. Рекомбинантная бактерия для ферментативного получения L-треонина, содержащая нуклеотид по п. 1.

7. Рекомбинантная бактерия по п. 6, где рекомбинантную бактерию конструируют путем введения рекомбинантного вектора по п. 4 в штамм-хозяин; указанный штамм-хозяин выбран из E. Coli K12, его производного штамма E. coli K12 (W3110) или штамма E. coli CGMCC 7.232.

8. Способ конструирования рекомбинантной бактерии по п. 6, включающий следующие этапы:

(1) модификация нуклеотидной последовательности гена дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для получения мутантной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;

(2) лигирование мутантной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантной бактерии.

9. Способ конструирования рекомбинантной бактерии по п. 8, отличающийся тем, что указанная плазмида представляет собой плазмиду pKOV.

10. Применение нуклеотида по п. 1, рекомбинантного белка по п. 3, рекомбинантного вектора по п. 4 или рекомбинантной бактерии по п. 6 для ферментативного получения L-треонина.