Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность, и ее применение Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к области генетики, генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, имеющей промоторную активность (варианты), экспрессионной кассете и вектору на ее основе, клетке-хозяину для получения целевого продукта или экспрессионного вектора.

Уровень техники

Промотор представляет собой элемент ДНК, который способствует транскрипции полинуклеотида, с которым функционально связан промотор. Промотор может также составлять часть элемента промотор/энхансер. Хотя физические границы между элементами промотор и энхансер не всегда ясны, промотор обычно относится к месту на молекуле нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или связанные с ней факторы, и с которого инициируется транскрипция. Энхансеры усиливают активность промотора во времени, а также пространственно. Известно множество промоторов, которые транскрипционно активны в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть разделены на два класса: на тех, которые функционируют конститутивно, и тех, которые регулируются индукцией или снятием репрессии. Для экспрессии белка пригодны оба класса. Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе.

Примерами промоторов и/или энхансеров могут служить промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), CAG промотор, а также сильные промоторы млекопитающих, такие как TTR промотор или EF1-α промотор.

CMV промотор в зависимости от подтипа имеет длину от 589 до 1650 пн (Changyu Zheng ЕТ ALL., All Human EF1α Promoters Are Not Equal: Markedly Affect Gene Expression in Constructs from Different Sources, Int J Med Sci. 2014; 11(5): 404-408, doi: 10.7150/ijms.8033). Промотор CAG (CMV early enhancer/chicken β actin) имеет длину 868 пн (Nieuwenhuis, В., Haenzi, В., Hilton, S. et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: comparison of four promoters. Gene Ther. 2021; 28: 56-74, https://doi.org/10.1038/s41434-020-0169-1).

Все вышеуказанные промоторы имеют длину более 588 пн. Промоторы с длиной более 588 пн. в составе экспрессионных кассет являются не самыми оптимальными вариантами для экспрессии крупных трансгенов с помощью ряда экспрессионных векторов.

Таким образом, является актуальным создание коротких промоторов.

Множество промоторов, в том числе CMV промотор, не являются тканеспецифичными, то есть они не обеспечивают селективную экспрессию терапевтических трансгенов в клетках определенных органов, что является явным недостатком данных промоторов при их использовании для создания генотерапевтического препарата.

Таким образом, является актуальным создание тканеспецифичных промоторов, обеспечивающих селективную экспрессию терапевтических трансгенов в клетках определенных органов.

Раскрытие сущности изобретения

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, обладает промоторной активностью. Промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, имеют длину в диапазоне от 123 до 252 пн. Кроме того, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, обладают тканеспецифичной промоторной активностью в клетках гепатоцитарного происхождения.

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Молекулы нуклеиновых кислот

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

Вектор

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает рекомбинантную вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.

Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.

Подробное описание изобретения

Нуклеиновая кислота

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая имеет промоторную активность и включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота является выделенной нуклеиновой кислотой.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях.

Все нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, обладают промоторной активностью.

Все промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, обладают тканеспецифичной промоторной активностью в клетках гепатоцитарного происхождения.

Все промоторы, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, являются сильными промоторами и их использование в составе экспрессионных векторов приводит к увеличению уровня продукции и активности целевого белка.

Экспрессионная кассета. Экспрессионный вектор.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, которая включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, обладающих промоторной активностью.

Термин «кассета, которая экспрессирует» или «экспрессионная кассета» при использовании в данном документе, в частности, относится к фрагменту ДНК, который способен в соответствующей обстановке запускать экспрессию полинуклеотид а, кодирующего представляющий интерес полипептид, последовательность которого включена в указанную экспрессионную кассету. При введении в клетку-хозяина экспрессионная кассета помимо прочего способна задействовать клеточные механизмы для транскрипции полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, в РНК, которая затем обычно дополнительно процессируется и, наконец, транслируется в представляющий интерес полипептид. Экспрессионная кассета может содержаться в экспрессионном векторе.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, обладающих промоторной активностью;

трансген;

сигнал полиаденилирования;

правый (второй) ITR.

Вышеуказанные структурные элементы экспрессионной кассеты являются функционально связанными между собой.

В контексте настоящего описания термин «функционально связанный» относится к связи полинуклеотидных (или полипептидных) элементов в функциональную связь. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в условиях функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию указанной кодирующей последовательности. Термин «функционально связанный» означает, что связанные последовательности ДНК являются, как правило, непрерывными, и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, являются также непрерывными и находятся в рамке считывания.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает левый (первый) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает правый (второй) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16;

промотор с нуклеотидной последовательностью, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, Мили 15;

трансген;

сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17;

правый (второй) ITR с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает трансген, который кодирует белок или малую ингибирующую нуклеиновую кислоту.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает трансген, который кодирует белок, который выбирают из группы, включающей фактор VIII или его функциональный вариант, фактор IX или его функциональный вариант, белок SMN1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов), полипептид RBD-S вируса SARS-cov2 или терапевтическое антитело.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, имеющих промоторную активность, или любую из вышеуказанных экспрессионных кассет.

В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы» («вектор экспрессии» или «экспрессионный вектор»)).

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть вставлены в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, AAV, аденовирус или лентивирус.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный (экспрессионный) вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть вставлены в вирусный геном.

В некоторых вариантах экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (AAV).

В некоторых вариантах AAV выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rh10, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-1, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2.6, rAAV2.8, rAAV2.9, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV. HS С14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор или кассета, кроме промотора, может включать другую последовательность контроля экспрессии. Термин «другая последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они вставлены. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора или кассеты, включая выбор последовательностей контроля экспрессии, может зависеть от таких факторов, как выбор типа клетки-хозяина для трансформации, требуемый уровень экспрессии белка, и т.д. Последовательности контроля экспрессии, помимо промотора, включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Последовательности контроля экспрессии включают, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга.

В дополнение к вышеуказанным генам и последовательностям контроля экспрессии, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор или кассета.

В одном из вариантов настоящего изобретения экспрессионный вектор относится к вектору, содержащему одну или несколько интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующих генов или трансгенов, которые фланкированы парвовирусными или инвертированными концевыми повторяющимися последовательностями (ITR).

Ни кассета, ни вектор по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих неструктурные белки (Rep) и структурные белки (Сар) аденоассоциированного вируса.

Клетка-хозяин

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения целевого продукта или для получения любого из вышеуказанных экспрессионных векторов, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, имеющих промоторную активность.

Термин «клетка-хозяин» при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор или кассета по изобретению. Следует понимать, что «клетка-хозяин» означает не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

Экспрессионные векторы или кассеты по изобретению могут быть использованы для трансфекции клетки млекопитающего, клетки растения, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Трансфекция может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными (экспрессионными) векторами.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансфекции, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки, SK-HEP1, HUH7, Hep-RG и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии по изобретению вводятся в клетки-хозяев а млекопитающих целевой белок продуцируется путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии целевого белка в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения целевого белка в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Целевой белок может быть выделен из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с использованием человеческих эмбрионов.

Вышеуказанная клетка-хозяин не относится к клетке-хозяину, полученной с модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой график, который показывает увеличение доли флюоресценции клеток экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 1 и 2.

Доля EGFP-экспрессирующих клеток после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и с добавлением вирусной промоторной области цитомегаловируса (CMV) (контроль);

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 2;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 1.

Фигура 2 представляет собой график, который показывает увеличение доли флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 3-7 и SEQ ID NO: 11-14.

Доля EGFP-экспрессирующих клеток после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 4;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 5;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 6;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

6 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 13;

7 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

8 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

9 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 12;

10 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 3 представляет собой график, который показывает увеличение доли флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 8-10 и 15.

Доля EGFP-экспрессирующих клеток после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 10;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 9;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 15.

Фигура 4 представляет собой график, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 3-7 и SEQ ID NO: 11-14.

Интенсивность флюоресценции клеток, экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 4;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 5;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 6;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

6 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 13;

7 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

8 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

9 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 12;

10 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 5 представляет собой график, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 8-10 и 15.

Интенсивность флюоресценции клеток, экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 10;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 9;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 15.

Фигура 6 представляет собой график, который показывает увеличение уровня продукции белка свертывания крови при использовании нуклеиновых кислот, проявляющих промоторную активность и соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 3, 11 и 14.

Уровень продукции белка свертывания крови при трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3;

3 - экспрессионной кассетой, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

4 - экспрессионной кассетой, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14.

Фигура 7 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности белка свертывания крови при использовании нуклеиновых кислот, проявляющих промоторную активность и соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 3, 11 и 14.

Уровень активности белка свертывания крови при трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3;

3 - экспрессионной кассетой, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

4 - экспрессионной кассетой, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14.

Фигура 8 представляет собой график по оценке тканеспецифичности впервые полученных последовательностей на клеточных линиях Huh7 и U87, который показывает увеличение доли клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 3-7 и SEQ ID NO: 11-14.

Доля EGFP-экспрессирующих клеток после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 4;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 5;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 6;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

6 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 13;

7 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

8 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

9 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 12;

10 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 9 представляет собой график по оценке тканеспецифичности впервые полученных последовательностей на клеточных линиях Huh7, HepG2 и НЕК293, который показывает увеличение доли клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 7 и 11.

Доля EGFP-экспрессирующих клеток после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11.

Фигура 10 представляет собой график по оценке тканеспецифичности полученных последовательностей на клеточной линии СНО, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 1 и 2.

Интенсивность флюоресценции клеток, экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и с добавлением вирусной промоторной области цитомегаловируса (CMV) (контроль);

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 2;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 1.

Фигура 11 представляет собой график по оценке тканеспецифичности полученных последовательностей на клеточной линии HepG2, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 1 и 2.

Интенсивность флюоресценции клеток, экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и с добавлением вирусной промоторной области цитомегаловируса (CMV) (контроль);

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 2;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 1.

Фигура 12 представляет собой график по оценке тканеспецифичности полученных последовательностей на клеточных линиях Huh7 и U87, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 3 7 и SEQ ID NO: 11-14.

Интенсивность флюоресценции клеток экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 4;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 5;

4 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 6;

5 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

6 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 13;

7 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

8 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

9 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 12;

10 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 13 представляет собой график по оценке тканеспецифичности полученных последовательностей на клеточных линиях Huh7, HepG2 и НЕК293, который показывает увеличение интенсивности флюоресценции клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP под контролем промоторов, соответствующих нуклеиновым последовательностям SEQ ID NO: 7 и 11. Интенсивность флюоресценции клеток, экспрессирующих EGFP после трансфекции:

1 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP и без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 7;

3 - экспрессионной кассетой с трансгеном EGFP под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11.

Фигура 14 представляет собой график, который показывает увеличение уровня продукции белка свертывания крови при доставке экспрессионной кассеты, содержащей последовательность фактора свертывания под контролем промоторных областей, соответствующих SEQ ID NO: 3, 8, 11 и 14, в виде экспрессионного вектора на основе AAV.

Уровень продукции белка свертывания крови при трансдукции:

1 - экспрессионный вектором, содержащим кассету с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8;

3 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

4 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

5 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 15 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности белка свертывания крови при доставке экспрессионной кассеты, содержащей последовательность фактора свертывания под контролем промоторных областей, соответствующих SEQ ID NO: 3, 8, 11 и 14, в виде экспрессионного вектора на основе AAV

Уровень активности белка свертывания крови при трансдукции:

1 - экспрессионным вектором, содержащим кассету с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8;

3 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

4 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген - фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 14;

5 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 3.

Фигура 16 представляет собой график, который показывает увеличение уровня продукции белка свертывания крови при доставке экспрессионной кассеты, содержащей последовательность фактора свертывания под контролем промоторных областей, соответствующих SEQ ID NO: 8 и 11, в виде экспрессионного вектора на основе rAAV5 или rAAV6.

Уровень продукции белка свертывания крови при трансдукции:

1 - экспрессионным вектором, содержащим кассету с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

3 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8.

Фигура 17 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности белка свертывания крови при доставке экспрессионной кассеты, содержащей последовательность фактора свертывания под контролем промоторных областей, соответствующих SEQ ID NO: 8 и 11, в виде экспрессионного вектора на основе rAAV5 или rAAV6.

Уровень активности белка свертывания крови при трансдукции:

1 - экспрессионным вектором, содержащим кассету с трансгеном фактора свертывания крови без промоторной области (контроль);

2 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11;

3 - экспрессионным вектором, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8.

Фигура 18 представляет собой график, который показывает увеличение уровня белка фактора свертывания крови под контролем промоторных областей, соответствующих нуклеиновым кислотам SEQ ID NO: 8 и 11 при доставке в виде экспрессионного вектора на основе AAV in vivo мышам линии B6.129S-F8tm1Smoc.

Уровень белка фактора свертывания крови в плазме животных после инъекции:

1 - контрольного раствора без AAV (негативный контроль).

2 - экспрессионным вектором на основе AAV, содержащим кассету, в которой трансген -фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8.

3- экспрессионным вектором на основе AAV, содержащим кассету, в которой трансген -фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11.

Фигура 19 представляет собой график, который показывает увеличение уровня активности фактора свертывания крови под контролем промоторных областей, соответствующих нуклеиновым кислотам SEQ ID NO: 8 и 11 при доставке в виде экспрессионного вектора на основе AAV in vivo мышам линии B6.129S-F8tm1Smoc.

Уровень белка фактора свертывания крови в плазме животных после инъекции:

1 - контрольного раствора без AAV (негативный контроль).

2 - экспрессионным вектором на основе AAV, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 8.

3 - экспрессионным вектором на основе AAV, содержащим кассету, в которой трансген фактор свертывания крови находится под контролем промотора, соответствующего нуклеиновой последовательности SEQ ID NO: 11.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей. Вкратце, плазмидную ДНК нарабатывали для дальнейших манипуляций в клетках Е. coli, выращиваемых под селективным давлением с антибиотиками для того, чтобы плазмиды не терялись в клеточной популяции. Плазмидную ДНК выделяли из клеток коммерческими наборами, измеряли концентрацию и использовали для клонирования с помощью обработки эндонуклеазами рестрикции или методами ПЦР-амплификации. Фрагменты ДНК лигировали между собой с помощью лигаз и трансформировали в бактериальные клетки для отбора клонов и дальнейших наработок. Все полученные генетические конструкции подтверждали по паттернам рестрикции и полным секвенированием по Сэнгеру.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по методу Сэнгера. Анализ последовательностей ДНК и белков, и обработку данных о последовательностях осуществляли в программе SnapGene версии 4.2 и выше для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Культивирование клеточных культур

В экспериментах были использованы клеточные линии НЕК293 (Human Embryonic Kidney clone 293), HUH7 (human hepatocellular carcinoma cell lines), U87-MG (Uppsala 87 Malignant Glioma cell lines), CHO-K1-S (Chinese hamster ovary cell lines) и HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell lines). Суспензионные клетки HEK293, используемые для наработки AAV, культивировали в стандартных условиях при 37°С и 5% CO₂, на полной питательной среде без FBS и антибиотика. Адгезионные клетки НЕК293, HUH7 и HepG2, используемые для проверки эффективности экспрессии EGFP и препаратов AAV, культивировали в стандартных условиях при 37°С и 5% CO₂, на полной питательной среде DMEM с добавлением 10% FBS, антибиотика/антимикотика. Для адгезионных клеток U87-MG и CHO-K1-S, используемых для проверки на тканеспецифичность культивирование проводилось в стандартных условиях при 37°С и 5% CO₂ на полной питательной среде ЕМЕМ с добавлением 10% FBS, антибиотика/антимикотика и DMEM/F12 с добавлением 5% FBS, антибиотика/антимикотика, соответственно.

Пересев клеток осуществляли при достижении 80-90% конфлюентности. Для диссоциации клеточного монослоя использовали TrypLE Select enzyme (10х). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окраски Trypan Blue и одноразовых камер для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика Countess II.

Трансфекция клеточных культур

Для оценки функциональной активности новых вариантов промоторов при трансфекции использовались плазмиды, содержащие экспрессионную кассету для экспрессии различных вариантов трансгенов EGFP и фактора свертывания крови. Модельные клеточные линии заранее засевали в лунки 12-луночных планшетов с плотностью 10000 кл/см². Через сутки вносили одинаковое количество копий плазмидной ДНК исследуемых и контрольных образцов в составе комплекса с Lipofectamine 3000. Для вариантов трансгена на основе гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (EGFP) на 3 день после трансфекции определяли долю клеток экспрессирующих белок EGFP и интенсивность флюоресценции клеток методом проточной цитометрии. Для варианта трансгена на основе фактора свертывания крови на 7 день после трансфекции определяли содержание белка свертывания крови и его активность в среде культивирования методом ИФА и хромогенного теста. Для негативного контроля были использованы интактные клетки модельных линий.

Наработка и очистка вирусных частиц рекомбннантных векторов AAV

Для получения рекомбннантных вирусных частиц AAV, содержащих трансген на основе фактора свертывания крови, использовали клетки-продуценты НЕК293, которые трансфецировали 3-мя плазмидами:

• Плазмида, содержащая экспрессионную кассету AAV для экспрессии фактора свертывания крови;

• Плазмида, содержащая гены Сар серотипа AAV6/AAV5 и гены Rep серотипа AAV2. Каждый ген с помощью альтернативных рамок считывания кодирует несколько белковых продуктов;

• Плазмида, содержащая гены аденовируса Ad2, необходимые для сборки и упаковки капсидов AAV.

Через 72 часа после трансфекции клетки лизировали, после чего проводили очистку и концентрирование вирусных частиц с помощью методов фильтрации, хроматографии и ультрацентрифугирования. Титр вирусных частиц определяли с помощью количественной ПЦР с праймерами и пробой, специфичными к участку рекомбинантного вирусного генома, и выражали в виде количества копий вирусных геномов на 1 мл.

Трансдукция клеточных культур

Клеточную линию HUH7 заранее засевали в лунки 12-луночных планшетов с плотностью 10000 кл/см². После прикрепления клеток к адгезивной подложке, вносились препараты AAV при MOI 500000 вг/кл. На 7 день после трансдукции определяли содержание белка свертывания крови и его активность в культуральной жидкости методом ИФА и хромогенным тестом. Работы по оценке уровня и активности белка свертывания крови в культуральной жидкости проводили в 6 независимых экспериментах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.

Определение доли клеток экспрессирующих репортерный белок EGFP и интенсивность флюоресценции клеток с помощью проточной цитометрии

Для оценки экспрессии репортерного белка EGFP на проточном цитофлюориметре, на 3 день после трансфекции к клеточным осадкам добавляли заранее подготовленную смесь буфера и йодида пропидия (PI) из расчета 1 мкл PI с концентрацией 10 мкг/мл на 1 мл буфера. В лунки 96-луночного микропланшета переносили неокрашенные PI и нетранфецированные плазмидной ДНК клетки (изотип) для оценки компенсации, в остальные лунки микропланшета для измерения контролей с PI и опытных образцов добавили смесь буфера с PI. После переноса образцов клеток в микропланшет их инкубировали в течении 5 мин в условиях отсутствия света. После инкубации микропланшеты с экспериментальными образцами клеток загружали в проточный цитометр для проведения анализа. Методом проточной цитометрии оценивали процент клеток, содержащих EGFP, а также среднюю интенсивность сигнала флюоресценции. Каждый образец измеряли в трех технических повторностях (количество анализируемых событий не менее 10.000).

Определение количества белка фактора свертывают крови методом ИФА

Оценка содержания белка фактора свертывания крови в среде культивирования после трансфекции и трансдукции клеток линии HUH7 целевыми кандидатами проводили «сэндвич»-методом неконкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Вкратце, разведенные в коммерческом буфере образцы культуральной жидкости, переносили в 96-луночный микропланшет, сенсибилизированные первичными специфичными к фактору свертывания крови антителами. В этот же микропланшет вносили стандарты для построения калибровочной кривой, контроли. Планшет инкубировали 1 час при температуре 37°С. Отмывку лунок микропланшета буфером производили перед внесением биотинилированных антител, раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы хрена и субстрата тетраметилбензидина (ТМВ). Далее вносился раствор с биотинилированными детектирующими антителами специфичными к фактору свертываемости крови и микропланшет инкубировали 30 минут при температуре 37°С. К образовавшемуся комплексу добавляли раствор конъюгата стрептавидин-пероксидазы хрена и планшет инкубировали 30 минут при температуре 37°С. Для визуализации ферментативной реакции вносили раствор ТМВ. По достижении нужной степени интенсивности окрашивания во все лунки добавляли стоп-раствор для остановки реакции. После остановки реакции проводили измерение оптической плотности. Концентрация фактора свертывания крови в исследуемых образцах определяли путем нормирования хромогенного окрашивания по калибровочной кривой стандартного образца с учетом коэффициента предварительного разведения.

Определение уровня активности белка фактора свертывают крови методом ИФА

Оценка активности белка фактора свертывания крови в среде культивирования после трансфекции и трансдукции клеток линии HUH7 целевыми кандидатами и контрольными образцами проводили при помощи хромогенного теста. Суть теста заключается в том, что в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и фактора IXa фактор X переходит в активированную форму Ха, фактор VIII действует как кофактор в этой реакции, и скорость активации фактора X линейно связана с количество фактора VIII. Вкратце, разведенные в коммерческом буфере образцы среды культивирования, стандарты для построения калибровочной кривой и контроли переносились в 96-луночный микропланшет. Далее образцы подвергались инкубации в течение 3 минут при температуре 37°С, с последующим внесением в лунки микропланшета раствора Factor reagent, содержащий фактор IXa, фактор X, тромбин, CaCl₂ и фосфолипиды. После этого микропланшет инкубировался 4 минуты при температуре 37°С с последующим в лунки раствора хромогенного субстрата S-2765+I-2581. Далее микропланшет инкубировался 7 минут при температуре 37°С. По достижению нужной степени интенсивности окрашивания во все лунки добавляли 20% раствор уксусной кислоты для остановки реакции. Далее измерялась оптическая плотность растворов в лунках микропланшета. Активность фактора свертывания крови в исследуемых образцах определялась путем нормирования хромогенного окрашивания по калибровочной кривой стандартного образца с учетом предварительного разведения. Проведение in vivo исследования на лабораторных животных

Для экспериментов были использованы мыши линии В6.129S-F8tm1Smoc, дефицитные по фактору свертывания крови (самцы возрастом 6 8 недель). Препараты вводили животным однократно путем внутривенного введения в хвостовую вену. Группе животных отрицательного контроля вводился буферный раствор, не содержащий AAV. Отбор плазмы крови производился в день инъекции до введения препаратов, далее - на 70 день после введения экспрессионных векторов. Все исследования на животных проводились в полном соответствии с рекомендациями ARRIVE.

Статистический анализ данных

Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), для сравнения результатов эксперимента использовали однофакторный дисперсионный анализ с поправкой на множественные попарные сравнения по методу Даннета (One-way ANOVA), и они были определены как статистически значимые.

Пример 1.

С целью повышения уровня экспрессии гена интереса при дизайне генетических конструкций использовали панель промоторов (SEQ ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15), которые были разработаны на основе сайтов связывания факторов транскрипции. Эти нуклеотидные последовательности в составе экспрессионной кассеты, состоящей из левого (первого) ITR (инвертированные концевые повторы), соответствующего последовательности SEQ ID NO: 16, промотора, который выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, гена интереса, сигнала полиаденилирования (SEQ ID NO: 17), правого (второго) ITR (SEQ ID NO: 18), где геном интереса может быть представлена последовательностью зеленого флуоресцентного белка (GFP) или последовательностью белков из каскада свертывания крови были протестированы in vitro путем трансфекции модельных клеточных линий (НЕК293, HUH7, U87-MG, CHO-K1-S и HepG2). В качестве контроля использовалась экспрессионная кассета, содержащая левый (первый) ITR (SEQ ID NO: 16), гена интереса, сигнал полиаденилирования (SEQ ID NO: 17), правого (второго) ITR (SEQ ID NO: 18). Также на фигурах 1 и 2 приведен дополнительный контроль, содержащие те же элементы экспрессионной кассеты с добавлением конститутивного вирусного промотора цитомегаловируса (CMV).

Все нуклеиновые кислоты SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, которые являются промоторными областями, обеспечивают увеличение доли (Фигура 1-3) клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP и увеличение интенсивности флюоресценции (Фигура 4-5) белка EGFP в случае использования последовательности зеленого флуоресцентного белка в виде гена интереса. В случае использования последовательности фактора свертывания крови в качестве гена интереса также наблюдалось увеличение уровня продукции (Фигура 6) и активности (Фигура 7) белка свертывания крови по сравнению с использованием нуклеиновой кислоты гена интереса без промоторной области. Таким образом, нуклеиновые кислоты (SEQ ID NO: 1-15) проявляют промоторную активность в составе экспрессионной кассеты с различными вариантами трансгенов при трансфекции модельных клеточных линий (Huh7, CHO-K1-S и HepG2).

Пример 2.

Для того, чтобы провести оценку тканеспецифичности разработанных последовательностей нуклеиновых кислот (SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15), которые обладают промоторной активность, нуклеотидные последовательности были протестированы при трансфекции на модельных клеточных линиях (НЕК293, HUH7, U87-MG, CHO-K1-S и HepG2) in vitro в составе экспрессионной кассеты, состоящей из левого (первого) ITR (инвертированные концевые повторы), соответствующего последовательности SEQ ID NO: 16, промотора (SEQ ID NO: 1-15), гена интереса, сигнала полиаденилирования (SEQ ID NO: 17), правого (второго) ITR (SEQ ID NO: 18), где геном интереса может быть представлена последовательностью белка EGFP или нуклеиновыми кислотами, кодирующими белки из каскада свертывания крови. В качестве контроля использовалась экспрессионная кассета, содержащая левый (первый) ITR (SEQ ID NO: 16), гена интереса, сигнала полиаденилирования (SEQ ID NO: 17), правого (второго) ITR (SEQ ID NO: 18). Также на фигурах 8, 10, 11 и 12 был использован контроль, содержащий те же элементы экспрессионной кассеты с добавлением вирусной промоторной области цитомегаловируса (CMV).

Все нуклеиновые кислоты SEQ ID NO:1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, которые являются промоторными областями, обеспечивают увеличение доли (Фигура 8 и 9) клеток, экспрессирующих репортерный белок EGFP, и увеличение интенсивности флюоресценции (Фигура 10-13) белка EGFP в клеточных линиях гепатоцитарного происхождения по сравнению с использованием нуклеиновой кислоты без промоторной области. Таким образом, нуклеиновые кислоты (SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) обладают тканеспецифичной промоторной активностью в клетках гепатоцитарного происхождения.

Пример 3.

Нами были получены экспрессионные вектора на основе AAV, содержащие экспрессионные кассеты, кодирующие трансген (фактор свертывания крови) под контролем нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 8, 11 и 14, которые обладают промоторной активностью. Указанные экспрессионные вектора были проверены при трансдукции клеток линии Huh7 in vitro. В качестве контроля использовался экспрессионный вектор на основе AAV, который не содержал промоторной области.

Использование экспрессионных векторов, содержащих нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 8, 11 и 14, приводят к увеличению уровня продукции (Фигура 14) и активности (Фигура 15) белка свертывания крови по сравнению с использованием экспрессионного вектора, не содержащего промоторной области. При использовании экспрессионных векторов на основе AAV различных серотипов, содержащих нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 8 и 11, также наблюдалось увеличение уровня продукции (Фигура 16) и активности (Фигура 17) белка свертывания крови по сравнению с контролем. Полученные результаты соответствуют данными, полученными при трансфекции клеток линии Huh7 (Фигуры 6 и 7). Таким образом, нуклеиновые кислоты (SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) проявляют промоторную активность при доставке в виде экспрессионного вектора с различными вариантами трансгенов при трансдукции модельных клеточных линий.

Пример 4.

Для того чтобы оценить промоторную активность нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 8 и 11 в составе экспрессионного вектора in vivo, были получены препараты на основе AAV, где в качестве трансгена выступает фактор свертывания крови под контролем нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 8 или 11. Далее исследуемые препараты были введены лабораторным мышам линии В6.129S-F8tm1Smoc. В качестве негативного контроля был использован буфер для разведения вирусного препарата не содержащий AAV частиц. Препараты AAV вводили животным однократно путем внутривенного гидродинамического введения в хвостовую вену. Отбор плазмы крови производился в день инъекции до введения препаратов (0 день), далее - на 70 день после введения.

В результате проведенных in vivo исследований было показано, что в случае использования исследуемых препаратов, содержащих последовательность гена фактора свертывания крови под контролем нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 8 и 11, наблюдается достоверное увеличение количества фактора свертывания крови и его активности в плазме животных на 70 день после введения препаратов (Фигура 18-19). Таким образом, нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 8 и 11 проявляют промоторную активность при доставке в виде экспрессионного вектора на основе AAV in vivo.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АО "БИОКАД"

<120> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность, и ее применение

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 1

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca g 201

<210> 2

<211> 209

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 2

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca gggccctgt 209

<210> 3

<211> 168

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 3

ttgcaatgtt tgcccatttt acccagccag tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata 60

actggggtga ccttggttaa tattcaccag cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac 120

tgcttaaata cggacgagga cagggccctg tctcctcagc ttcaggca 168

<210> 4

<211> 158

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 4

ttgcaatgtt tgcccatttt gtggtttccc cagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc 60

tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt tgcccctctg 120

gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgt 158

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 5

ttgcaatgtt tgcccatttt actgagccag gggcccagcc agtggactta gcccctgttt 60

gctcctccga taactggggt gaccttggtt aatattcacc agcagttgcc cctctggatc 120

cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgt 154

<210> 6

<211> 150

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 6

ttgcaatgtt tgcccatttt agtggtttcc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc 60

ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gttgcccctc tggatccact 120

gcttaaatac ggacgaggac agggccctgt 150

<210> 7

<211> 123

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 7

ttgcaatgtt tgcccatttt gtggtttagc cagtggactt agcccctgtt tgctcctccg 60

ataactgggg tgaccttggt taatattcac cctgcttaaa tacggacgag gacagggccc 120

tgt 123

<210> 8

<211> 127

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 8

gcccaaggtc ttacataaga ggacgtggtt tagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc 60

tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccctgct taaatacgga cgaggacagg 120

gccctgt 127

<210> 9

<211> 123

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 9

agttaatgat taactatttt gtggtttagc ctccaaagtc caaaatgtaa acatactccg 60

ataactgggg tgaccttggt taataattaa cctgcttaaa tacggacgag gacagggccc 120

tgt 123

<210> 10

<211> 136

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 10

agttaatgat taactatttt gtggtttagc ctccaaagtc caaaatgtaa acatactccg 60

ataactgggg tgaccttggt taataattaa cgttaataat tttcctgctt aaatacggac 120

gaggacaggg ccctgt 136

<210> 11

<211> 176

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 11

ttgcaatgtt tgcccatttt acagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 60

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gttaataatt ttctcccccg ttgcccctct 120

ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggca 176

<210> 12

<211> 170

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 12

ttgcaatgtt tgccccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt 60

gaccttggtt aatattcacc agcagttaat aattttctcc cccgttgccc ctctggatcc 120

actgcttaaa tacggacgag gacagggccc tgtctcctca gcttcaggca 170

<210> 13

<211> 163

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 13

ttgcaatgtt tgcccccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 60

cttggttaat attcaccgtt aataattttc tcccccgttg cccctctgga tccactgctt 120

aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag gca 163

<210> 14

<211> 252

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 14

tgtttgctgc agttaatgat taactatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagcctcca aagtccaaaa tgtaaacata ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata attaacagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240

ggacagtgaa tc 252

<210> 15

<211> 176

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность

<400> 15

agttaatgat taactatttt acagcctcca aagtccaaaa tgtaaacata ctccgataac 60

tggggtgacc ttggttaata attaacagca gttaataatt ttctcccccg ttgcccctct 120

ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggca 176

<210> 16

<211> 130

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая является первым инвертированным

концевым повтором (ITR)

<400> 16

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая представляет сигнал

полиаденилирования

<400> 17

cgcgaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtgatgcagc 60

<210> 18

<211> 141

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, которая является вторым инвертированным

концевым повтором (ITR)

<400> 18

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описана нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность, имеющая нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. Также описана экспрессионная кассета, содержащая указанную молекулу нуклеиновой кислоты и функционально связанный трансген. Представлен экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту или экспрессионную кассету. Также представлена клетка-хозяин для получения целевого продукта, содержащая указанную нуклеиновую кислоту или экспрессионную кассету, где целевой продукт представляет собой белок, малую ингибирующую нуклеиновую кислоту или экспрессионный вектор. Изобретение расширяет арсенал промоторов. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 19 ил., 4 пр.

1. Нуклеиновая кислота, имеющая промоторную активность, имеющая нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

2. Экспрессионная кассета, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1 и функционально связанный трансген.

3. Экспрессионная кассета по п. 2, где трансген кодирует белок или малую ингибирующую нуклеиновую кислоту.

4. Экспрессионная кассета по п. 3, где трансген кодирует белок, который выбирают из группы, включающей фактор VIII или его функциональный вариант, фактор IX или его функциональный вариант, белок SMN1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов), полипептид RBD-S вируса SARS-cov2 или терапевтическое антитело.

5. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1 или экспрессионную кассету по любому из пп. 2-4.

6. Экспрессионный вектор по п. 7, который представляет собой плазмиду, AAV, лентивирус или аденовирус.

7. Экспрессионный вектор по п.8, который представляет собой AAV, который выбирают из группы, включающей следующие серотипы AAV: AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, rAAV.rh8, rAAV.rhlO, rAAV.rh20, rAAV.rh39, rAAV.Rh74, rAAV.RHM4-l, AAV.hu37, rAAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, rAAV.7m8, rAAV.PHP.B, rAAV2.5, rAAV2.6, rAAV2.8, rAAV2.9, rAAV2tYF, rAAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 или AAV.HSC16.

8. Клетка-хозяин для получения целевого продукта, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 1 или экспрессионную кассету по любому из пп. 2-4, где целевой продукт представляет собой белок, малую ингибирующую нуклеиновую кислоту или экспрессионный вектор по пп. 5-7.