РЕАГЕНТ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 C12Q1/689 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие принадлежит к области обнаружения генов, а точнее, настоящее раскрытие относится к реагенту и набору принадлежностей для обнаружения опухолей.

Уровень техники

С развитием социальной экономики возрастает число пациентов, страдающих от опухолей, и заболеваемость ими молодеет. Раннее, безболезненное, быстрое и точное обнаружение опухолей становится все более насущной необходимостью.

Существующие стандартные способы диагностики и последующего наблюдения опухолей в основном включают в себя визуализацию в лабораторных условиях, микроскопию в лабораторных условиях, биопсию тканей и эксфолиативную цитологию или цитологию экскрементов. Технологии визуализации в лабораторных условиях включают в себя в основном компьютерную томографию, ядерно-магнитно-резонансную визуализацию, трансабдоминальное УЗИ и т.д., и эти технологии часто имеют высокий уровень ложноположительных результатов при ранней диагностике рака. Микроскопия in vivo, являющаяся золотым стандартом для диагностики некоторых опухолей, была усовершенствована, и в ней в последние годы используют мягкие материалы, но она все еще является высоко инвазивной и причиняет много боли пациентам, которые могут страдать от боли, кровотечения и других проблем в течение нескольких дней после исследования. Кроме того, микроскопия in vivo обладает низкой специфичностью и чувствительностью для ранней диагностики некоторых опухолей. Биопсию тканей используют для детектирования тканей с подозрениями на заболевания и в основном для детектирования морфологии опухолей клеток и биомаркеров с высокой специфичностью и чувствительностью. Однако биопсия тканей несколько инвазивна для пациентов при отборе образцов и имеет такие недостатки, как длительное время предварительной обработки образцов и усложненные этапы. Эксфолиативная цитология или цитология экскрементов является неинвазивным испытанием и поэтому широко применяется для диагностики некоторых опухолей. Однако некоторые испытания эксфолиативной цитологии или цитологии экскрементов не могут исключать наличия опухолей низкой степени злокачественности и приводят к низкой чувствительности. Такие способы обнаружения, как белок-22 ядерного матрикса, опухолеассоциированные антигены, анализ Immuno Cyt и анализ Uro Vysion, не применяются в обычных клинических исследованиях из-за их низкой чувствительности и/или специфичности.

Эпигенетика является быстро развивающейся областью биологии рака и обладает большим потенциалом для клинических исследований и для исследований трансляционной медицины. Исследования показали, что биохимические пути, критичные для онкогенеза, частично регулируются эпигенетическими явлениями, такими как изменения метилирования ДНК в опухолевых клетках, аномальные модификации гистонов, опосредованный микроРНК сайленсинг различных целевых генов и реконструкция гамартоматозных нуклеосом. Аберрантное метилирование ДНК является наиболее широко изученным эпигенетическим изменением, связанным со всеми типами рака человека. Гиперметилирование, подавляющее такие транскрпипционные факторы, как RUNX3, GATA-4 и GATA-5, вызывает инактивацию их нижестоящих мишеней, вовлеченных в различные клеточные процессы. RUNX3 является важным элементом семейства транскрипционных факторов, и исследования обнаружили, что в клеточных линиях рака легкого и в образцах первичного рака легкого RUNX3 инактивируется аберрантным гиперметилированием ДНК. Аналогично, семейство GATA транскрипционных факторов связано с патогенезом желудочно-кишечных заболеваний, и наблюдается, что среди стимуляторов рака толстой и прямой кишки часто метилируются стимулирующие области генов GATA-4 и GATA-5. Стимуляторы некоторых генов при раке мочевого пузыря также сильно метилируются с частотой метилирования ДНК, составляющей 48-96%, включая такие гены, как A2BP1, NPTX2, POU4F2, HOXA9, MEIS1, GDF15, TMEFF2, VIM, STK11, MSH6, BRCA1, TBX2, TBX3, GATA2, ZIC4, PAX5A, MGMT и IGSF4^[1].

В последние годы обнаружение метилирования специфического участка гена, связанного с опухолью, в образцах крови, мокроты, слюны, фекалий или мочи широко применялось для таких аспектов, как диагностика и ранняя диагностика рака, прогнозирование прогрессирования рака, прогнозирование рака, пост-лечебный мониторинг и прогнозирование реакции на противораковую терапию.

Раскрытие изобретения

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает использование нуклеотидной последовательности (здесь и далее, «нуклеотидной последовательности» или «фрагмента нуклеиновой кислоты»), которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, при приготовлении комплекта для обнаружения опухоли.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает применение реагента для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, для изготовления реагента или набора для обнаружения опухоли.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также обеспечивает праймер, который включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, или SEQ ID NO: 47, или их комплементарных последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые, соответственно, имеют, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из любой пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые имеют, соответственно, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из любой пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

В некоторых вариантах осуществления праймер включает в себя несколько нуклеотидных последовательностей, которые имеют, соответственно, по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с каждым праймером из пары праймеров, показанной как SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает зонд, который включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48, или их комплементарных последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления зонд включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с любой из последовательностей, показанных как SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48, или их комплементарных последовательностей.

В некоторых вариантах осуществления зонд включает в себя нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд представляет собой изолированный праймер или зонд.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает применение вышеупомянутого праймера и/или зонда для изготовления реагента или набора для обнаружения опухоли.

В настоящем раскрытии термин «детектирование», «обнаружение» синонимичный термину «диагностика», включает в себя не только раннюю, но также промежуточную и позднюю диагностику опухолей, а также включает в себя скрининг опухоли, оценку риска, прогнозирование, идентификацию заболевания, диагностику стадий заболевания и выбор терапевтических мишеней.

В необязательном варианте осуществления на стадии заболевания диагностика возможна путем детектирования степени метилирования нуклеотидной последовательности в образце в соответствии с прогрессированием опухоли на различных стадиях или в различные периоды времени. Конкретную стадию опухоли в образце можно выявить путем сопоставления степени метилирования нуклеотидной последовательности, выделенной из образцов опухоли на различных стадиях, со степенью метилирования нуклеотидной последовательности одной или более нуклеиновых кислот, выделенных из образца без аномальной пролиферации клеток.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие предлагает реагент для обнаружения опухолей, который включает в себя реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.

Метилирование относится к добавлению метильной группы к цитозину. После обработки солью гидросульфита, или бисульфита, или гидразина цитозин преобразуется в урацил. Поскольку урацил аналогичен тимину, он распознается как тимин в ходе ПЦР-амплификации. Таким образом, в ПЦР-амплифицированной последовательности неметилированный цитозин преобразуется в тимин (C преобразуется в T), а метилированный цитозин (C) не преобразуется. MSP (план медицинских услуг) представляет собой повсеместно использованную технологию ПЦР для детектирования метилирования гена, в которой праймеры конструируют для обработанного метилированного фрагмента (т.е., не преобразованного C во фрагменте), а затем выполняют ПЦР-амплификацию. Если фрагмент амплифицируется, это указывает на то, что фрагмент метилирован, а если фрагмент не амплифицируется, это указывает на то, что фрагмент не метилирован.

В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения уровня метилирования используют для детектирования последовательности, модифицированной солью гидросульфита, или бисульфита, или гидразина нуклеотидной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления выявляют последовательность, модифицированную бисульфитом нуклеотидной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения уровня метилирования включает в себя праймеры и зонд для обнаружения уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления прямой праймер у указанных праймеров имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:

I. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 46; или

II. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в I.

В некоторых вариантах осуществления обратный праймер у указанных праймеров имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:

III. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 47; или

IV. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в III.

Праймеры используют для амплификации нуклеотидной последовательности. Из уровня техники хорошо известно, что успешное конструирование праймеров имеет решающее значение для ПЦР. По сравнению с обычным ПЦР, конструирование праймеров более важно для обнаружения уровня метилирования. Причина состоит в том, что метилсульфирование вызывает преобразование «C» в нити ДНК в «U», что приводит к снижению содержания GC и появлению длинных прилегающих «T» в последовательности после ПЦР. Можно легко вызвать обрыв нити ДНК, и таким образом, сложно подобрать стабильные праймеры с подходящими значениями Tm. С другой стороны, чтобы отличить сульфированные ДНК от несульфированных и не полностью обработанных ДНК, необходимо, чтобы праймеры имели достаточное количество «C», что повышает сложность подбора стабильных праймеров. Поэтому при детектировании уровня метилирования ДНК выбор фрагмента, амплифицируемого с помощью праймеров, в частности, выбор длины и положения амплифицируемого фрагмента, выбор праймеров и т.д. оказывает влияние на чувствительность и специфичность детектирования. С помощью экспериментов авторы изобретения обнаружили, что различные целевые амплифицируемые фрагменты и праймеры дают разные результаты детектирования. Много раз было обнаружено, что некоторые гены или нуклеотидные последовательности по-разному экспрессируются в опухолях и не опухолях, но предстоит еще долгий путь для преобразования этих генов в опухолевые маркеры и клинического применения опухолевых маркеров. Основная причина состоит в ограниченности реагентов для детектирования, что усложняет детектирование чувствительности и специфичности этих потенциальных опухолевых маркеров, чтобы они отвечали требованиям детектирования, или способ обнаружения сложен в эксплуатации и является дорогостоящим, и его сложно применять клинически в крупном масштабе.

В некоторых вариантах осуществления зонд имеет любую из следующих нуклеотидных последовательностей:

V. Нуклеотидные последовательности, которые имеют по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидными последовательностями, показанными как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 48; или

VI. Комплементарные последовательности из последовательностей, показанных в V.

В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя реагент для обнаружения референсного гена.

В некоторых вариантах осуществления референсный ген представляет собой β-актин (ACTB).

В некоторых вариантах осуществления реагент для обнаружения референсного гена представляет собой праймеры и зонд для референсного гена.

В некоторых вариантах осуществления реагент также включает в себя по меньшей мере один из следующих компонентов: соль гидросульфита, бисульфита или гидразина для модифицирования нуклеотидной последовательности; при этом, конечно, реагент может и не включать в себя соль гидросульфита, бисульфита или гидразина.

В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя один или более из следующих компонентов: ДНК-полимераза, дНТФ, ионы Mg²⁺ и буфер; и, необязательно, реагент включает в себя реакционную систему ПЦР, которая включает в себя ДНК-полимеразу, дНТФ, Mg²⁺ ионы и буфер и используется для амплификации модифицированной нуклеотидной последовательности.

В качестве образца для детектирования с использованием реагента для детектирования/диагностики по настоящему раскрытию может быть выбрано по меньшей мере одно из следующего: ткань, жидкость организма и экскремент.

Необязательно, ткань представляет собой ткань мочевого пузыря.

Необязательно, жидкость организма представляет собой по меньшей мере одно из следующего: кровь, сыворотка, плазма, внеклеточная жидкость, тканевая жидкость, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость и водянистая влага глаза.

Необязательно, экскремент представляет собой по меньшей мере одно из следующего: мокрота, моча, слюна и кал.

Необязательно, экскремент представляет собой мочу.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает набор, который включает в себя вышеупомянутый реагент для детектирования опухолей. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя инструкции. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя реагент для экстракции нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления набор принадлежностей также включает в себя прибор для отбора проб.

В некоторых вариантах осуществления ткань, детектируемую с помощью реагента для детектирования по настоящему раскрытию, выбирают из опухолевой ткани и нормальной ткани паракарциномы (или ткани доброкачественной опухоли).

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также обеспечивает способ для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности в образце, характеризующийся следующими этапами: (1) обработка детектируемого образца солью гидросульфита, бисульфита и гидразина для получения модифицированного детектируемого образца; (2) детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности, например, с использованием вышеупомянутого реагента или набора для детектирования метилирования нуклеотидной последовательности в детектируемом образце, который модифицирован на этапе (1). В необязательном варианте осуществления на этапе (2) для детектирования используют флуоресцентную количественную цепную реакцию полимеразы, специфичную для метилирования, в режиме реального времени.

В одном из вариантов осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ обнаружения опухоли, который включает в себя: детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности в детектируемом образце, необязательно путем вышеупомянутого способа детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности; и определение наличия или риска наличия у пациента опухоли в соответствии с отклонением, необязательно, в соответствии с разностью в уровнях метилирования, с выявленным уровнем метилирования, необязательно, путем вышеупомянутого способа детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, от соответствующего уровня метилирования в обычном контрольном образце. Термин «отклонение» в вышеупомянутых этапах относится к отклонению уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ обработки опухоли у пациента, который включает в себя: обнаружение опухоли у пациента, включая детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, в детектируемом образце, полученном у пациента, и обработку опухоли в случае, когда детектирование опухоли у пациента указывает на наличие или на риск наличия опухоли у обследуемого. Необязательно, уровень метилирования выявляют вышеупомянутым способом детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности. Необязательно, опухоль у пациента выявляют вышеупомянутым способом детектирования опухоли. Необязательно, лечение представляет собой применение хирургии, химиотерапии, лучевой терапии, химиолучевой терапии, иммунотерапии, онколитической вирусной терапии, любого другого вида способа лечения опухолей, использованного согласно уровню техники, или сочетание этих способов лечения.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает способ конструирования праймеров, который включает в себя этапы конструирования праймеров для нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает систему для конструирования праймеров, которая включает в себя:

1) входной компонент; 2) обрабатывающий компонент; и 3) выходной компонент. Необязательно, входной компонент выполнен с возможностью считывать нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4. Необязательно, обрабатывающий компонент загружается с программой для конструирования праймеров, исходя из информации, считываемой входным компонентом. Необязательно, выходной компонент сконфигурирован для вывода последовательностей праймеров, сконструированных с помощью обрабатывающего компонента.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также предлагает систему детектирования опухоли. Система включает в себя: (1) компонент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, или по меньшей мерена 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99%, или на 100% идентична нуклеотидной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 4, и (2) систему определения результата.

В некоторых вариантах осуществления компонент для детектирования уровня метилирования включает в себя вышеупомянутый реагент или набор для детектирования.

В некоторых вариантах осуществления компонент для определения результата выполнен с возможностью вывода данных о риске наличия опухоли и/или типа опухоли согласно уровню метилирования нуклеотидной последовательности, которая имеет по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или 100% идентичности с нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO: 4, который выявляют с помощью системы обнаружения.

В некоторых вариантах осуществления риск наличия опухоли определяют путем сопоставления уровня метилирования детектируемого образца с уровнем метилирования обычного образца, и определяют, что детектируемый образец имеет высокий риск наличия опухоли, если имеется значительная разница или крайне значительная разница между уровнем метилирования детектируемого образца и уровнем метилирования обычного образца.

В некоторых вариантах осуществления, если метилирование нуклеотидной последовательности является положительным, то это указывает на то, что донором детектируемого образца является пациент с опухолью или с высоким риском наличия опухоли. В необязательном варианте осуществления, положительный результат относится к тому, при котором результат детектирования для детектируемого образца сопоставляется с результатом детектирования для обычного образца, если имеется значительная разница или крайне значительная разница между результатом амплификации детектируемого образца и результатом амплификации обычного образца, и тогда донор детектируемого образца является положительным.

В некоторых вариантах осуществления критерии определения системы определения включают в себя следующий критерий: определяют, представляет ли собой образец опухоль или обычный образец, в соответствии со значением точки разделения.

В некоторых вариантах осуществления опухоль выбирают из уротелиальных опухолей. Необязательно, опухоль выбирают из рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака почечной лоханки и рака уретры. Необязательно, опухоль выбирают из рака мочевого пузыря.

Способ детектирования по данной заявке можно использовать до и после лечения опухоли или использовать в сочетании с лечением опухоли. После лечения способ обнаружения используют, например, для оценки успешности лечения, наблюдения за облегчением, обострением и/или прогрессированием (включая метастазы) опухолей после лечения.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1A-1F показаны, соответственно, кривые ROC детектирования фрагментов 1-6 нуклеиновой кислоты в 108 клинических образцах ткани (включая 66 образцов ткани рака мочевого пузыря и 42 образца ткани паракарциномы рака мочевого пузыря);

На Фиг. 2 показаны кривые ROC детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и MEIS1 в 97 образцах мочи (включая 45 образцов рака мочевого пузыря и 52 контрольных образцов);

На Фиг. 3 показаны статистические результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах образцов опухоли, включая 299 образцов мочи (включая 1 образец инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 16 образцов папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 105 образцов рака мочевого пузыря, 31 образцов рака простаты, 17 образцов рака почечной лоханки, 10 образцов рака мочеточников и 119 контрольных образцов) различных типов опухолей с фрагментом 4 нуклеиновой кислоты, причем на Фиг. 3A показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы «рак мочевого пузыря и рак мочеточников и рак почечной лоханки»; на Фиг. 3B показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака мочеточников; на Фиг. 3C показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака почечной лоханки; на Фиг. 3D показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака мочевого пузыря; на Фиг. 3E показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы «инвертированная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности и папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности»; и на Фиг. 3F показано сопоставление кривых ROC контрольной группы и группы рака простаты;

На Фиг. 4 показаны кривые амплификации и кривые плавления различных комплектов праймера и зонда; и

На Фиг. 5 показаны кривые ROC детектирования CG441 в 193 образцах мочи.

Осуществление изобретения

Технические решения по настоящему раскрытию будут описаны ниже применительно к конкретным примерам, при этом конкретные примеры не предназначены для ограничения объема защиты настоящего раскрытия. Некоторые несущественные модификации и корректировки, сделанные другими, исходя из идеи настоящего раскрытия, по-прежнему попадают в объем защиты настоящего раскрытия.

В данной заявке термин «праймер» или «зонд» относится к олигонуклеотиду, который включает в себя область, комплементарную к последовательности по меньшей мере 6 прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле (например, в целевом фрагменте нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть последовательности праймера или зонда не комплементарна к амплифицированной последовательности. В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд включает в себя область, комплементарную к последовательности по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле. В случае, когда праймер или зонд включает в себя область, «комплементарную по меньшей мере к x прилегающих нуклеотидов в целевой молекуле», праймер или зонд является по меньшей мере на 95% комплементарным по меньшей мере к x прилегающих или не смежным блок-нуклеотидам в целевой молекуле. В некоторых вариантах осуществления праймер или зонд является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% комплементарным к целевой молекуле.

В данной заявке «нормальный» образец относится к тому же типу образца, выделенному у лица, про которое известно, что у него нет рака или опухоли.

В данной заявке образцы для детектирования уровня метилирования включают в себя, но не ограничены следующим: ДНК, РНК, мРНК-содержащие образцы ДНК и РНК, а также гибриды ДНК-РНК. ДНК или РНК могут быть однонитевыми или двухнитевыми.

В данной заявке «пациент» является млекопитающим, таким как человек.

В данной заявке термин «уровень метилирования» синонимичен термину «степень метилирования» и обычно выражается как процентная доля метилированного цитозина, который рассчитывают по количеству метилированного цитозина, деленному на сумму количества метилированного цитозина и количества неметилированного цитозина. В настоящее время уровень метилирования, как правило, рассчитывают по количеству метилированных целевых генов, деленному на количества референсных генов, или в других работах из уровня техники рассчитывают по другим формулам.

В данной заявке термин «образец» синонимичен термину «проба».

Как использовано в данной заявке, термин «и/или» относится и покрывает любые и все возможные сочетания одного или более из связанных перечисленных объектов. При использовании в перечне двух или более объектов термин «и/или» означает, что любой один из перечисленных объектов можно использовать по отдельности, или можно использовать любое сочетание двух или более из перечисленных объектов. Например, если состав, сочетание, конструкция и т.д. описаны как включающие в себя (или содержащие) компоненты A, B, C и/или D, состав может включать в себя один A; включать в себя один B; включать в себя один C; включать в себя один D; включать в себя сочетание A и B; включать в себя сочетание A и C; включать в себя сочетание A и D; включать в себя сочетание B и C; включать в себя сочетание B и D; включать в себя сочетание C и D; включать в себя сочетание A, B, и C; включать в себя сочетание A, B, и D; включать в себя сочетание A, C, и D; включать в себя сочетание B, C, и D; или включать в себя сочетание A, B, C, и D.

Пример 1

Авторы изобретения отобрали сотни маркеров генов и фрагменты нуклеиновых кислот для исследования распределения метилированных сайтов генов.

Авторы изобретения отобрали шесть фрагментов нуклеиновых кислот; результаты отбора перечислены в настоящей работе.

Последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты 1-6 показаны, соответственно, как SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 6.

Процесс эксперимента:

Клеточные линии UM-UC-3, J82, SW780, T24, RT4, 5637, SCaBER, UM-UC-3 и J82 были получены у National Infrastructure of Cell Line Resource (Китай), другие клеточные линии были закуплены у ATCC (American Type Culture Collection, Американская коллекция типовых культур). Все клеточные линии были реанимированы в рекомендованных средах. Все клеточные линии были отрицательными при детектировании микоплазмы и имели нормальную клеточную морфологию. После размножения клетки были собраны, упакованы в субпакет при плотности 5×10⁶ клеток на пробирку и сохранены в криогенной холодильной машине при -80°C для экстракции ДНК.

1) Экстракция ДНК

ДНК экстрагировали из 17 клеточных линий рака мочевого пузыря с использованием наборов для выделения ДНК (QIAGEN DNA Mini Kit, #51306), закупленных у QIAGEN.

2) Модифицирование ДНК

ДНК модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH.

Модифицированные последовательности показаны в Таблице 1.

Таблица 1

Исходный фрагмент После модифицирования Фрагмент 1 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 25 Фрагмент 2 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 2) SEQ ID NO: 26 Фрагмент 3 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 3) SEQ ID NO: 27 Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 4) SEQ ID NO: 28 Фрагмент 5 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 5) SEQ ID NO: 29 Фрагмент 6 нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 6) SEQ ID NO: 30

3) Амплификация и детектирование

Праймеры и зонды для определения того, метилированы ли фрагменты нуклеиновых кислот, показаны в Таблице 2.

Таблица 2 Последовательности праймеров и зондов для фрагментов нуклеиновых кислот

Фрагмент нуклеиновой кислоты Праймер и зонд последовательности ACTB
(референсный ген) F: TTTTGGATTGTGAATTTGTG (SEQ ID NO: 49)
R: AAACCTACTCCTCCCTTAAA (SEQ ID NO: 50)
P: TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT (SEQ ID NO: 51) Фрагмент 1
нуклеиновой кислоты F: CGAGAGGTTATATAAGTTTACG (SEQ ID NO: 7)
R: AATTTCCTAACAAATAATTTCCG (SEQ ID NO: 8)
P: CGCCCGAAAACGTATAAATTACTCC (SEQ ID NO: 9) Фрагмент 2
нуклеиновой кислоты F: TTTAAGGATTAATAATAGAGCG (SEQ ID NO: 10)
R: GAACCGCGTAATTAAAAC (SEQ ID NO: 11)
P: CTAACTCTCGCCGTACCGAATC (SEQ ID NO: 12) Фрагмент 3
нуклеиновой кислоты F: GGACGGAGATATAAGGAT (SEQ ID NO: 13)
R: ATAAACGAACACCAAAATC (SEQ ID NO: 14)
P: CGCAACCCCATAAAACCCAA (SEQ ID NO: 15) Фрагмент 4
нуклеиновой кислоты F: GTAGTCGAGAAGTATTCG (SEQ ID NO: 16)
R: GATAAACGTACACTTAACG (SEQ ID NO: 17)
P: ATCCTTCCAACGACAATAACG (SEQ ID NO: 18) Фрагмент 5
нуклеиновой кислоты F: TTCGTTTATTTATGGATTACG (SEQ ID NO: 19)
R: CGTAAATCGACTCCTTATAC (SEQ ID NO: 20)
P: AACAACGACGACCGAACGAT (SEQ ID NO: 21) Фрагмент 6
нуклеиновой кислоты F: GAAAATAATGTCGAATTTCGT (SEQ ID NO: 22)
R: AAAATCGAAAATCCCACG (SEQ ID NO: 23)
P: CTCGAACAAACGTCTCCTTAAC (SEQ ID NO: 24)

Реакционная система показана в Таблице 3.

Таблица 3

Компонент реакции Добавленное количество (мкл) iTaq Universal SYBR супермикс зеленый (Green supermix) (2×) 10 Праймеры (F+R, 12,5 мкМ) 0,2 Вода без нуклеазы 8,8 Матричная ДНК 1 Общий объем 20

Протокол амплификации показан в Таблице 4.

Таблица 4

Этап Температура и время Число циклов Предварительная денатурация 95 °C в течение 10 мин 1 Усиление 95° C в течение 30 с 45 55° C в течение 30 с 72° C в течение 30 с,
накопление флуоресценции Кривая плавления 95° C в течение 5 с 1 65° C в течение 60 с,
непрерывное накопление флуоресценции, до достижения 97 °C Охлаждение 40 °C в течение 3 с 1

После завершения детектирования количество копий количественной системы каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждой клеточной линии было количественно рассчитано с использованием стандартной кривой, а степень метилирования каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря была рассчитана по формуле «количество копий фрагмента нуклеиновой кислоты ÷ количество копий референсного гена ACTB × 100».

Были выявлены уровни метилирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря. Результаты детектирования показаны в Таблице 5.

Таблица 5 Результаты детектирования уровней метилирования фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря

Клеточная линия Фрагмент 1 НК Фрагмент 2 НК Фрагмент 3 НК Фрагмент 4 НК Фрагмент 5 НК Фрагмент 6 НК BFTC-905 14% 34% 56% 58% 73% 55% CAL-29 57% 59% 81% 51% 39% 50% SCABER 10% 8% 3% 90% 83% 95% VM-CUB-1 88% 87% 87% 87% 56% 97% RT-112 78% 71% 83% 76% 66% 84% SW780 44% 51% 62% 72% 75% 80% DSH1 89% 85% 78% 92% 54% 95% RT4 90% 83% 86% 74% 80% 92% SW1710 86% 67% 81% 70% 58% 77% 639-V 35% 62% 91% 85% 76% 95% UM-UC-3 92% 83% 85% 89% 88% 84% LB831-BLC 78% 81% 89% 82% 71% 72% KU-19-19 56% 68% 84% 60% 63% 34% 647-V 13% 50% 83% 83% 60% 85% 5637 1% 5% 36% 84% 86% 98% J82 79% 80% 76% 74% 35% 80% T-24 62% 83% 87% 76% 55% 83%

Из Таблицы 5 видно, что в 17 клеточных линиях рака мочевого пузыря, 6 фрагментов нуклеиновых кислот метилированы до различной степени, среди которых фрагменты нуклеиновых кислот 3, 4, и 6 метилированы в большем количестве клеточных линий по сравнению с другими фрагментами.

Пример 2

Была выявлена чувствительность и специфичность каждого фрагмента нуклеиновой кислоты по Примеру 1 к 108 клиническим образцам ткани (включая 66 образцов ткани рака мочевого пузыря и 42 образцов ткани параканциномы рака мочевого пузыря паракарцинома).

Процесс эксперимента:

1) Экстракция ДНК

ДНК экстрагировали из каждого образца среза ткани с использованием набора принадлежностей для экстракции ДНК (HiPure FFPE DNA Kit, D3126-03), закупленного у компании Magen.

2) Модифицирование ДНК, амплификация и детектирование, причем праймеры и зонды для фрагментов были теми же, что и в Примере 1.

3) Способ расчета

После завершения детектирования количество копий количественной системы каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждой клеточной линии было рассчитано с использованием стандартной кривой, а степень метилирования каждого фрагмента нуклеиновой кислоты в каждом образце ткани была рассчитана по формуле «количество копий фрагмента нуклеиновой кислоты ÷ количество копий референсного гена ACTB × 100». Наконец, был выбран порог в качестве критерия, чтобы отличить группу рака от контрольной группы. Если преобразованное соотношение больше заданного порога, то метилирование определяют как положительное, а если преобразованное соотношение больше или равно заданного порога, то метилирование определяют как отрицательное. Согласно критерию, статистические результаты детектирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в 108 клинических образцах ткани показаны в Таблице 6, а кривые ROC показаны на Фиг. 1A-1F.

Таблица 6 Результаты детектирования 6 фрагментов нуклеиновых кислот в клинических образцах ткани

Фрагмент Чувствительность Специфичность AUC (P<0,001) Фрагмент 1 нуклеиновой кислоты 65,2 80,5 0,783 Фрагмент 2 нуклеиновой кислоты 77,3 83,3 0,854 Фрагмент 3 нуклеиновой кислоты 81,8 90,5 0,915 Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты 84,8 92,2 0,925 Фрагмент 5 нуклеиновой кислоты 63,6 91,1 0,773 Фрагмент 6 нуклеиновой кислоты 78,8 92,9 0,896

Результаты показывают, что различные фрагменты имеют различия в чувствительности и специфичности к образцам ткани. Среди них чувствительность и специфичность фрагментов нуклеиновой кислоты 3 и 4 выше, чем у других фрагментов.

Пример 3

Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию сопоставили с маркерами MEIS1, NKX6-2, OTX1, SIM2, SOX1, BARHL2, ZNF154 и RUNX3 метилирования гена рака мочевого пузыря, о которых часто сообщалось в документах.

Было взято 20 образцов ткани мочевого пузыря с внедренным парафином, включая 10 образцов рака мочевого пузыря и 10 контрольных образцов гландулярного цистита.

Процесс эксперимента:

1) Экстракция ДНК

ДНК экстрагировали из каждого среза ткани с использованием набора для экстракции ДНК (набор для экстракции ДНК HiPure FFPE HiPure FFPE DNA Kit, D3126-03), закупленного у компании Magen.

2) Модифицирование ДНК

ДНК модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH.

3) Амплификация и детектирование

Реакционная система и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 1.

Последовательности праймеров показаны в Таблице 7.

Таблица 7

Наименование Последовательность ACTB (референсный ген) Прямой праймер: TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT (SEQ ID NO: 52)
Обратный праймер: AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO: 53) Фрагмент 4
нуклеиновой кислоты Прямой праймер: GCGTTCGGAGTTGTTTAGC (SEQ ID NO: 54)
Обратный праймер: CACCGACGCCACAAACG (SEQ ID NO: 55) MEIS1 Прямой праймер: GTTCGGGATAAGATTTCGGGG (SEQ ID NO: 56)
Обратный праймер: TAATTAAAACTACGCAACCCGACT (SEQ ID NO: 57) NKX6-2 Прямой праймер: AGAAGAAGTATTCGCGTTCGAT (SEQ ID NO: 58)
Обратный праймер: GATCATACCCAACGAATAAACG (SEQ ID NO: 59) OTX1 Прямой праймер: GTTAGTAGTAGTAGAGCGGGAGC (SEQ ID NO: 60)
Обратный праймер: GACGTAAATTAACCACTACTTTCG (SEQ ID NO: 61) SIM2 Прямой праймер: GTAGGCGTAGAGGGGATAATTCG (SEQ ID NO: 62)
Обратный праймер: ACCCCGCGCTAAATCTACAAC (SEQ ID NO: 63) SOX1 Прямой праймер: TAATTAGGATCGGGTTAAACGGT (SEQ ID NO: 64)
Обратный праймер: AAACGCTTACTAATCTCCGAAT (SEQ ID NO: 65) BARHL2 Прямой праймер: CGTTAGTAGTCGGATTATAAGCGAAC (SEQ ID NO: 66)
Обратный праймер: AAAAATTACGAAACAAACACGACCG (SEQ ID NO: 67) ZNF154 Прямой праймер: GTTAGGTTTGGGATAGGGATCG (SEQ ID NO: 68)
Обратный праймер: CGCTACCATCAAACTCTACG (SEQ ID NO: 69) RUNX3 Прямой праймер: GAGGTTTAGTACGCGTTCG (SEQ ID NO: 70)
Обратный праймер: CCCGCCTCCTAAATCTATCG (SEQ ID NO: 71)

4) Способ расчета был таким же, как и в Примере 2.

Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и маркеры в 20 образцах ткани показаны в Таблице 8, а результаты статистического анализа показаны в Таблице 9.

Таблица 8 Результаты детектирования уровней метилирования 9 генов в образцах ткани мочевого пузыря

Образец № Тип образца MEIS1 NKX6-2 OTX1 SIM2 SOX1 BARHL2 Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты ZNF154 RUNX3 BA01 рак мочевого пузыря 54,1% 0,0% 3,7% 39,8% 0,0% 0,0% 21,6% 0,0% 0,0% BA02 рак мочевого пузыря 133,0% 0,0% 0,9% 68,5% 9,7% 1,3% 1,7% 0,0% 11,0% BA03 рак мочевого пузыря 87,5% 0,0% 50,6% 2,6% 19,4% 34,8% 46,8% 75,8% 23,0% BA04 рак мочевого пузыря 8,6% 36,4% 46,5% 48,6% 66,7% 36,7% 46,1% 79,9% 37,8% BA05 рак мочевого пузыря 98,6% 0,0% 0,6% 28,8% 6,0% 0,0% 0,0% 7,7% 8,1% BA06 рак мочевого пузыря 52,5% 21,5% 53,2% 60,4% 8,1% 20,3% 45,7% 87,9% 3,2% BA07 рак мочевого пузыря 0,0% 17,7% 119,5% 57,5% 25,8% 70,8% 12,7% 161,5% 23,4% BA08 рак мочевого пузыря 53,8% 57,7% 48,5% 64,7% 14,1% 54,8% 29,0% 94,0% 43,4% BA09 рак мочевого пузыря 54,1% 21,1% 47,5% 28,4% 8,9% 23,8% 43,6% 55,9% 55,9% BA10 рак мочевого пузыря 74,1% 2,3% 63,9% 59,0% 52,8% 67,1% 42,8% 76,8% 85,8% BB01 Контрольный 3,4% 0,0% 1,2% 26,4% 11,4% 0,0% 1,4% 11,5% 42,3% BB02 Контрольный 5,3% 2,4% 1,1% 11,1% 6,7% 8,9% 0,7% 7,0% 54,3% BB03 Контрольный 0,4% 0,0% 2,2% 7,3% 3,7% 0,6% 0,0% 3,9% 37,7% BB04 Контрольный 0,9% 0,0% 7,1% 2,1% 12,8% 0,0% 0,0% 23,3% 19,6% BB05 Контрольный 0,7% 0,0% 0,6% 4,7% 10,0% 0,9% 1,2% 18,0% 14,2% BB06 Контрольный 3,2% 1,4% 2,0% 11,3% 5,1% 0,9% 1,0% 9,8% 43,2% BB07 Контрольный 5,3% 0,0% 4,4% 1,8% 9,9% 0,0% 1,0% 6,8% 17,2% BB08 Контрольный 2,1% 0,0% 33,7% 18,7% 3,9% 0,0% 0,0% 8,2% 15,9% BB09 Контрольный 0,9% 0,0% 1,4% 3,1% 0,0% 0,0% 0,0% 15,4% 1,2% BB10 Контрольный 3,5% 0,0% 0,9% 25,9% 40,3% 24,0% 7,8% 3,8% 124,0%

В Таблице процент метилирования = количественная концентрация целевого гена / количественная концентрация референсного гена × 100%.

Таблица 9 Статистические результаты

MEIS1 NKX6-2 OTX1 SIM2 SOX1 BARHL2 Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты ZNF154 RUNX3 Чувствительность 90,0% 60,0% 70,0% 90,0% 50,0% 70,0% 90,0% 70,0% 20,0% Специфичность 90,0% 90,0% 90,0% 90,0% 90,0% 90,0% 90,0% 90,0% 90,0%

Результаты показывают, что MEIS1, SIM2 и фрагмент 4 нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию могут позволить хорошо различать образцы ткани рака, взятые у пациентов с раком мочевого пузыря, и образцы ткани мочевого пузыря, взятые у людей без рака мочевого пузыря, и их чувствительность и специфичность к образцам ткани рака мочевого пузыря у тех и других составляет 90%.

Пример 4

Информация об образцах: 97 образцов мочи, включая 45 образцов рака мочевого пузыря и 52 контрольных образцов.

В настоящем примере экстракция и преобразование ДНК были такими же, как и в Примере 3.

Последовательности праймеров и зондов показаны в Таблице 10.

Таблица 10

Наименование Последовательность ACTB
(референсный ген) Прямой праймер: TTTTGGATTGTGAATTTGTG (SEQ ID NO: 49)
Обратный праймер: AAACCTACTCCTCCCTTAAA (SEQ ID NO: 50)
Зонд: TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT (SEQ ID NO: 51) Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты Прямой праймер: GCGTTCGGAGTTGTTTAGCG (SEQ ID NO: 72)
Обратный праймер: CACCGACGCCACAAACGA (SEQ ID NO: 73)
Зонд: CTATTACCGCCGCCGCCGTCG (SEQ ID NO: 74) MEIS1 Прямой праймер: GTTCGGGATAAGATTTCGGGG (SEQ ID NO: 75)
Обратный праймер: TAATTAAAACTACGCAACCCGACT (SEQ ID NO: 76)
Зонд: CGAGAGGGGTCGGGCGAGTTAG (SEQ ID NO: 77)

Система амплификации по настоящему примеру показана в Таблице 11.

Таблица 11

Компонент реакции Добавленное количество (мкл) 5× буфер 4 Ионы магния (25 мМ) 4 дНТФ (10 мМ) 0,8 Прямой праймер F (25 мкМ) 0,4 Обратный праймер R (25 мкМ) 0,4 Зонд P (10 мкМ) 0,4 Taq-полимераза (5 единиц/мкл) 0,4 H₂O 7,6 Матричная ДНК 2 Общий объем 20

Протокол амплификации по настоящему примеру показан в Таблице 12.

Таблица 12

Этап Температура и время Число циклов Предварительная денатурация 95 °C в течение 5 мин 1 Усиление 95 °C в течение 20 с 45 65 °C в течение 20 с 62 °C в течение 40 с Охлаждение 40 °C в течение 3 мин 1

В 97 образцах мочи, если величина Ct детектирования уровня метилирования составляет больше, чем величина точки разделения, то метилирование определяют как отрицательное, а в противном случае метилирование определяют как положительное. Значение точки разделения для детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляет 34,65, а значение точки разделения для детектирования MEIS1 составляет 33,82. Результаты детектирования показаны в Таблице 13.

Таблица 13 Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты и MEIS1 в 97 образцах мочи

Образец № Тип образца Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты MEIS1 Значение Ct Результат выявления Значение Ct Результат выявления UF001 Контрольный 35,21 отрицательный 34,82 отрицательный UF002 Контрольный 35,59 отрицательный 35,67 отрицательный UF003 Контрольный 45 отрицательный 36,27 отрицательный UF004 Контрольный 45 отрицательный 38,84 отрицательный UF005 Контрольный 37,64 отрицательный 36,16 отрицательный UF006 Контрольный 35,74 отрицательный 33,77 положительный UF007 Контрольный 35,29 отрицательный 36,04 отрицательный UF008 Контрольный 35,78 отрицательный 35,24 отрицательный UF009 Контрольный 38,69 отрицательный 33,45 положительный UF010 Контрольный 36,29 отрицательный 35,19 отрицательный UF011 Контрольный 45 отрицательный 37,9 отрицательный UF012 Контрольный 45 отрицательный 38,24 отрицательный UF013 Контрольный 35,66 отрицательный 34,53 отрицательный UF014 Контрольный 36,01 отрицательный 33,99 отрицательный UF015 Контрольный 45 отрицательный 37,7 отрицательный UF016 Контрольный 35,51 отрицательный 43 отрицательный UF017 Контрольный 38,13 отрицательный 37,21 отрицательный UF018 Контрольный 36,81 отрицательный 36,47 отрицательный UF019 Контрольный 35,47 отрицательный 38,45 отрицательный UF020 Контрольный 38,94 отрицательный 36,76 отрицательный UA009 Контрольный 37,26 отрицательный 34,56 отрицательный UA011 Контрольный 35,81 отрицательный 35,53 отрицательный UA013 Контрольный 39,42 отрицательный 38,74 отрицательный UA018 Контрольный 37,11 отрицательный 35,1 отрицательный UA022 Контрольный 37 отрицательный 35,63 отрицательный UA023 Контрольный 34,74 отрицательный 36,69 отрицательный UA027 Контрольный 45 отрицательный 35,29 отрицательный UA028 Контрольный 36,54 отрицательный 33,88 отрицательный UA029 Контрольный 38,01 отрицательный 34,08 отрицательный UA030 Контрольный 37,43 отрицательный 35,35 отрицательный UA032 Контрольный 37,35 отрицательный 35,88 отрицательный UA037 Контрольный 45 отрицательный 36,94 отрицательный UA040 Контрольный 39,99 отрицательный 35,97 отрицательный UA042 Контрольный 36,98 отрицательный 35,32 отрицательный UA046 Контрольный 45 отрицательный 34,91 отрицательный UA049 Контрольный 36,78 отрицательный 34,18 отрицательный UE001 Контрольный 36,62 отрицательный 34,69 отрицательный UE002 Контрольный 40,11 отрицательный 33,89 отрицательный UE003 Контрольный 38,04 отрицательный 32,22 положительный UE004 Контрольный 35,21 отрицательный 32,48 положительный UE005 Контрольный 35,85 отрицательный 33,81 положительный UE006 Контрольный 34,83 отрицательный 35,28 отрицательный UE008 Контрольный 34,7 отрицательный 33,87 отрицательный UE009 Контрольный 45 отрицательный 35,98 отрицательный UE010 Контрольный 36,34 отрицательный 35 отрицательный UE013 Контрольный 45 отрицательный 35,5 отрицательный UE014 Контрольный 36,1 отрицательный 32,03 положительный UE016 Контрольный 37,54 отрицательный 34,6 отрицательный UE017 Контрольный 37,84 отрицательный 31,55 положительный UE018 Контрольный 38,09 отрицательный 33,71 положительный UE019 Контрольный 39,16 отрицательный 35,08 отрицательный UE020 Контрольный 36,56 отрицательный 36,16 отрицательный UC107 рак мочевого пузыря 26,19 положительный 30,05 положительный UC108 рак мочевого пузыря 27,43 положительный 31,65 положительный UD043 рак мочевого пузыря 34,26 положительный 38,77 отрицательный UD044 рак мочевого пузыря 28,51 положительный 31,87 положительный UD046 рак мочевого пузыря 31,21 положительный 33,72 положительный UD047 рак мочевого пузыря 28,08 положительный 32 положительный UD049 рак мочевого пузыря 34,4 положительный 35,46 отрицательный UD051 рак мочевого пузыря 27,47 положительный 31,34 положительный UD054 рак мочевого пузыря 28,2 положительный 31,28 положительный UD056 рак мочевого пузыря 27,87 положительный 31,01 положительный UD057 рак мочевого пузыря 26,69 положительный 30,22 положительный UD059 рак мочевого пузыря 31,27 положительный 33,76 положительный UD060 рак мочевого пузыря 28,24 положительный 37,69 отрицательный UD063 рак мочевого пузыря 28,89 положительный 33,08 положительный UD065 рак мочевого пузыря 30,45 положительный 33,72 положительный UD068 рак мочевого пузыря 31,03 положительный 33,82 отрицательный UD070 рак мочевого пузыря 30,46 положительный 33,93 отрицательный UD072 рак мочевого пузыря 34,65 отрицательный 34,76 отрицательный UD076 рак мочевого пузыря 27,43 положительный 31,16 положительный UD084 рак мочевого пузыря 31,18 положительный 38,69 отрицательный UD089 рак мочевого пузыря 35,94 отрицательный 31,28 положительный UA001 рак мочевого пузыря 39,38 отрицательный 37,19 отрицательный UA002 рак мочевого пузыря 34,58 положительный 33,91 отрицательный UA003 рак мочевого пузыря 30,83 положительный 29,99 положительный UA004 рак мочевого пузыря 27,54 положительный 30,54 положительный UA063 рак мочевого пузыря 27,48 положительный 29,67 положительный UA066 рак мочевого пузыря 27,38 положительный 30,61 положительный UA067 рак мочевого пузыря 33,04 положительный 35,16 отрицательный UA068 рак мочевого пузыря 31,82 положительный 33,7 положительный UA069 рак мочевого пузыря 34,33 положительный 38,53 отрицательный UA070 рак мочевого пузыря 29,89 положительный 32,33 положительный UA071 рак мочевого пузыря 25,65 положительный 28,54 положительный UA072 рак мочевого пузыря 36,09 отрицательный 27,93 положительный UC018 рак мочевого пузыря 30,49 положительный 34,31 отрицательный UC035 рак мочевого пузыря 25,15 положительный 27,93 положительный UC045 рак мочевого пузыря 34,14 положительный 38,61 отрицательный UC062 рак мочевого пузыря 34,52 положительный 31,73 положительный UC068 рак мочевого пузыря 33,77 положительный 33,31 положительный UC070 рак мочевого пузыря 26,54 положительный 29,28 положительный UC080 рак мочевого пузыря 26,07 положительный 30,74 положительный UC082 рак мочевого пузыря 38,23 отрицательный 37,59 отрицательный UC083 рак мочевого пузыря 32,52 положительный 33,67 положительный UC087 рак мочевого пузыря 29,51 положительный 32,2 положительный UC092 рак мочевого пузыря 29,64 положительный 31,9 положительный UC095 рак мочевого пузыря 26,63 положительный 31,88 положительный

Результаты статистического анализа вышеуказанных результатов детектирования показаны в Таблице 14, а кривые ROC показаны на фиг. 2.

Таблица 14

Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты MEIS1 Точка разделения 34,65 33,82 Чувствительность 91,1 71,1 Специфичность 100,0 84,6 AUC 0,956 0,790

Результаты показывают, что при детектировании уровней метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в образцах мочи для выявления рака мочевого пузыря специфичность детектирования имеет высокое значение, составляющее 100%, а чувствительность составляет 91,1%. При детектировании уровней метилирования гена MEIS1 в образцах мочи для выявления рака мочевого пузыря специфичность детектирования составляет лишь 84,6%, а чувствительность составляет лишь 71,1%.

Пример 5

Информация об образцах: 299 образцов мочи, включая 1 образец инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 16 образцов папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности, 105 образцов рака мочевого пузыря, 31 образцов рака простаты, 17 образцов рака почечной лоханки, 10 образцов рака мочеточников и 119 контрольных образцов.

В настоящем раскрытии экстракция и преобразование ДНК, последовательности праймеров и зондов для фрагмента 4 нуклеиновой кислоты, система амплификации и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 4.

Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах образцов опухоли показаны в Таблице 15.

Таблица 15 Результаты детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты в различных типах опухолей в образцах мочи

Тип образца Значение Ct фрагмента 4 нуклеиновой кислоты Результат выявления фрагмента 4 нуклеиновой кислоты UA126 инвертированная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 37,89 отрицательный UD007 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 45 отрицательный UD035 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 39,18 отрицательный UD055 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 36,92 отрицательный UD058 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 36,77 отрицательный UD061 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 31,52 положительный UD091 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 40,48 отрицательный UD106 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 33,11 положительный UD123 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 37,45 отрицательный UD159 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 34,93 положительный UD160 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 35,19 положительный UD181 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 38,92 отрицательный UD230 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 37,64 отрицательный UD232 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 45 отрицательный UD319 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 38,82 отрицательный UG043 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 36,51 отрицательный UC071 папиллярная уротелиальная опухоль с низким потенциалом злокачественности 28,56 положительный UA010 Контрольный 37,29 отрицательный UA012 Контрольный 45 отрицательный UA014 Контрольный 45 отрицательный UA015 Контрольный 45 отрицательный UA016 Контрольный 36,49 отрицательный UA017 Контрольный 37,42 отрицательный UA020 Контрольный 36,91 отрицательный UA021 Контрольный 45 отрицательный UA024 Контрольный 45 отрицательный UA025 Контрольный 36,85 отрицательный UA026 Контрольный 45 отрицательный UA031 Контрольный 45 отрицательный UA033 Контрольный 45 отрицательный UA034 Контрольный 35,75 положительный UA035 Контрольный 38,62 отрицательный UA036 Контрольный 45 отрицательный UA039 Контрольный 45 отрицательный UA041 Контрольный 34,56 положительный UA043 Контрольный 45 отрицательный UA044 Контрольный 37,17 отрицательный UA045 Контрольный 37,63 отрицательный UA047 Контрольный 33,25 положительный UA048 Контрольный 37,92 отрицательный UA050 Контрольный 45 отрицательный UA051 Контрольный 37,24 отрицательный UA052 Контрольный 38,46 отрицательный UA108 Контрольный 36,84 отрицательный UA109 Контрольный 40,73 отрицательный UA114 Контрольный 37,47 отрицательный UA117 Контрольный 38,63 отрицательный UA118 Контрольный 39,81 отрицательный UA128 Контрольный 42,86 отрицательный UC001 Контрольный 34,94 положительный UC002 Контрольный 36,77 отрицательный UC005 Контрольный 37,97 отрицательный UC006 Контрольный 45 отрицательный UC007 Контрольный 37,7 отрицательный UC009 Контрольный 38,15 отрицательный UC011 Контрольный 38,43 отрицательный UC012 Контрольный 38,92 отрицательный UC013 Контрольный 37,17 отрицательный UC017 Контрольный 37,49 отрицательный UC019 Контрольный 37,67 отрицательный UC020 Контрольный 37,79 отрицательный UC022 Контрольный 37,67 отрицательный UC023 Контрольный 38,4 отрицательный UC024 Контрольный 39,64 отрицательный UC026 Контрольный 37,81 отрицательный UC027 Контрольный 45 отрицательный UC030 Контрольный 37,23 отрицательный UC031 Контрольный 45 отрицательный UC032 Контрольный 36,74 отрицательный UC033 Контрольный 38,47 отрицательный UC039 Контрольный 37,73 отрицательный UC040 Контрольный 38,62 отрицательный UC041 Контрольный 37,8 отрицательный UC044 Контрольный 38,03 отрицательный UC046 Контрольный 34,15 положительный UC047 Контрольный 37,57 отрицательный UC048 Контрольный 36,51 отрицательный UC051 Контрольный 45 отрицательный UC052 Контрольный 37,56 отрицательный UC055 Контрольный 45 отрицательный UC056 Контрольный 45 отрицательный UC059 Контрольный 45 отрицательный UC060 Контрольный 39,64 отрицательный UC061 Контрольный 45 отрицательный UC063 Контрольный 37,51 отрицательный UC064 Контрольный 38,07 отрицательный UC081 Контрольный 36,53 отрицательный UC097 Контрольный 37,37 отрицательный UC098 Контрольный 37,81 отрицательный UD008 Контрольный 45 отрицательный UD040 Контрольный 39,98 отрицательный UD041 Контрольный 35,93 положительный UD045 Контрольный 37,53 отрицательный UD050 Контрольный 38,19 отрицательный UD071 Контрольный 38,29 отрицательный UD073 Контрольный 37,69 отрицательный UD108 Контрольный 37,99 отрицательный UD124 Контрольный 39,18 отрицательный UD126 Контрольный 37,49 отрицательный UD200 Контрольный 42,77 отрицательный UD236 Контрольный 45 отрицательный UD238 Контрольный 37,68 отрицательный UD242 Контрольный 37,06 отрицательный UD259 Контрольный 34,49 положительный UD263 Контрольный 45 отрицательный UD265 Контрольный 45 отрицательный UD266 Контрольный 38,52 отрицательный UD269 Контрольный 37,42 отрицательный UD270 Контрольный 36,66 отрицательный UD274 Контрольный 38,54 отрицательный UD276 Контрольный 45 отрицательный UD277 Контрольный 38,73 отрицательный UD281 Контрольный 39,23 отрицательный UD301 Контрольный 38,06 отрицательный UD304 Контрольный 45 отрицательный UD306 Контрольный 36,66 отрицательный UD316 Контрольный 38,57 отрицательный UD318 Контрольный 36,85 отрицательный UD323 Контрольный 39,11 отрицательный UD325 Контрольный 38,66 отрицательный UD326 Контрольный 38,6 отрицательный UD328 Контрольный 40,71 отрицательный UD331 Контрольный 37,89 отрицательный UD336 Контрольный 32,95 положительный UG004 Контрольный 37,95 отрицательный UG009 Контрольный 45 отрицательный UG021 Контрольный 45 отрицательный UG036 Контрольный 38,4 отрицательный UG039 Контрольный 45 отрицательный UG066 Контрольный 38,08 отрицательный UG093 Контрольный 45 отрицательный UD164 Контрольный 36,5 отрицательный UG035 Контрольный 38,61 отрицательный UD346 Контрольный 37,55 отрицательный UD357 Контрольный 37,33 отрицательный UD364 Контрольный 45 отрицательный UA002-2 рак мочевого пузыря 35,86 положительный UA006 рак мочевого пузыря 33,2 положительный UA008 рак мочевого пузыря 29,04 положительный UA053 рак мочевого пузыря 30,97 положительный UA055 рак мочевого пузыря 29,19 положительный UA056 рак мочевого пузыря 28,83 положительный UA057 рак мочевого пузыря 37,26 отрицательный UA060 рак мочевого пузыря 32,61 положительный UA061 рак мочевого пузыря 37,8 отрицательный UA062 рак мочевого пузыря 29,53 положительный UA073 рак мочевого пузыря 29,92 положительный UA074 рак мочевого пузыря 34,94 положительный UA077 рак мочевого пузыря 32,69 положительный UA078 рак мочевого пузыря 29,86 положительный UA079 рак мочевого пузыря 35,04 положительный UA090 рак мочевого пузыря 36,6 отрицательный UA091 рак мочевого пузыря 29,57 положительный UA092 рак мочевого пузыря 30,71 положительный UA094 рак мочевого пузыря 31,85 положительный UA097 рак мочевого пузыря 29,41 положительный UA100 рак мочевого пузыря 36,99 отрицательный UA104 рак мочевого пузыря 37,5 отрицательный UA111 рак мочевого пузыря 31,03 положительный UA115 рак мочевого пузыря 34,47 положительный UA116 рак мочевого пузыря 31,71 положительный UA119 рак мочевого пузыря 33,26 положительный UA121 рак мочевого пузыря 31,05 положительный UA122 рак мочевого пузыря 30,28 положительный UA124 рак мочевого пузыря 29,37 положительный UA134 рак мочевого пузыря 29,32 положительный UA135 рак мочевого пузыря 36,85 отрицательный UA137 рак мочевого пузыря 31,16 положительный UA138 рак мочевого пузыря 30,48 положительный UA139 рак мочевого пузыря 28,75 положительный UA141 рак мочевого пузыря 28,14 положительный UA147 рак мочевого пузыря 45 отрицательный UA149 рак мочевого пузыря 29,24 положительный UA154 рак мочевого пузыря 31,17 положительный UB001 рак мочевого пузыря 31,57 положительный UB003 рак мочевого пузыря 29,23 положительный UB005 рак мочевого пузыря 28,74 положительный UB006 рак мочевого пузыря 31,12 положительный UB008 рак мочевого пузыря 32,25 положительный UC096 рак мочевого пузыря 36,11 положительный UC101 рак мочевого пузыря 30,2 положительный UD003 рак мочевого пузыря 35,16 положительный UD004 рак мочевого пузыря 29,16 положительный UD009 рак мочевого пузыря 29,79 положительный UD011 рак мочевого пузыря 28,87 положительный UD014 рак мочевого пузыря 32,92 положительный UD015 рак мочевого пузыря 34,54 положительный UD016 рак мочевого пузыря 30,08 положительный UD018 рак мочевого пузыря 32,11 положительный UD028 рак мочевого пузыря 34,16 положительный UD030 рак мочевого пузыря 28,73 положительный UD038 рак мочевого пузыря 29,54 положительный UD039 рак мочевого пузыря 36,31 отрицательный UD078 рак мочевого пузыря 33,22 положительный UD080 рак мочевого пузыря 28,36 положительный UD095 рак мочевого пузыря 31,15 положительный UD099 рак мочевого пузыря 35,08 положительный UD109 рак мочевого пузыря 30,96 положительный UD110 рак мочевого пузыря 36,1 положительный UD111 рак мочевого пузыря 32,91 положительный UD134 рак мочевого пузыря 33,59 положительный UD135 рак мочевого пузыря 33,21 положительный UD136 рак мочевого пузыря 28,59 положительный UD137 рак мочевого пузыря 35,82 положительный UD141 рак мочевого пузыря 34,57 положительный UD142 рак мочевого пузыря 34,63 положительный UD145 рак мочевого пузыря 29,86 положительный UD150 рак мочевого пузыря 34,84 положительный UD161 рак мочевого пузыря 30,01 положительный UD162 рак мочевого пузыря 35,01 положительный UD174 рак мочевого пузыря 34,83 положительный UD175 рак мочевого пузыря 32,68 положительный UD205 рак мочевого пузыря 30,64 положительный UD210 рак мочевого пузыря 34,01 положительный UD220 рак мочевого пузыря 29,11 положительный UD221 рак мочевого пузыря 29,06 положительный UD225 рак мочевого пузыря 37,17 отрицательный UD237 рак мочевого пузыря 33,03 положительный UD243 рак мочевого пузыря 36,29 положительный UD244 рак мочевого пузыря 30,27 положительный UD257 рак мочевого пузыря 29,87 положительный UD268 рак мочевого пузыря 29,51 положительный UD293 рак мочевого пузыря 32,53 положительный UD298 рак мочевого пузыря 30,48 положительный UD303 рак мочевого пузыря 32,98 положительный UD308 рак мочевого пузыря 34,96 положительный UD312 рак мочевого пузыря 35,02 положительный UD314 рак мочевого пузыря 31,95 положительный UD330 рак мочевого пузыря 30,06 положительный UD349 рак мочевого пузыря 32,5 положительный UD355 рак мочевого пузыря 30,59 положительный UD361 рак мочевого пузыря 33,99 положительный UD366 рак мочевого пузыря 31,61 положительный UD367 рак мочевого пузыря 31,71 положительный UG003 рак мочевого пузыря 32,28 положительный UG025 рак мочевого пузыря 35,58 положительный UG046 рак мочевого пузыря 34,94 положительный UG053 рак мочевого пузыря 33,5 положительный UG059 рак мочевого пузыря 30,67 положительный UG064 рак мочевого пузыря 32,83 положительный UG080 рак мочевого пузыря 32 положительный UA088 рак простаты 35,19 положительный UA089 рак простаты 34,53 положительный UA093 рак простаты 36,14 положительный UA105 рак простаты 36,46 отрицательный UD064 рак простаты 34,91 положительный UD102 рак простаты 45 отрицательный UD127 рак простаты 36,5 отрицательный UD138 рак простаты 37,08 отрицательный UD151 рак простаты 36,07 положительный UD154 рак простаты 36,95 отрицательный UD165 рак простаты 37,88 отрицательный UD179 рак простаты 35,7 положительный UD206 рак простаты 39,03 отрицательный UD233 рак простаты 35,56 положительный UD240 рак простаты 34,29 положительный UD254 рак простаты 37,11 отрицательный UD255 рак простаты 45 отрицательный UD294 рак простаты 45 отрицательный UD310 рак простаты 37,97 отрицательный UD338 рак простаты 37,18 отрицательный UD341 рак простаты 38,13 отрицательный UD351 рак простаты 38,71 отрицательный UG007 рак простаты 34,69 положительный UG011 рак простаты 37,87 отрицательный UG037 рак простаты 38,11 отрицательный UG038 рак простаты 45 отрицательный UG044 рак простаты 33,04 положительный UG054 рак простаты 36,13 положительный UG061 рак простаты 36,66 отрицательный UA110 рак простаты 45 отрицательный UD292 рак простаты 45 отрицательный UA080 рак почечной лоханки 30,98 положительный UA085 рак почечной лоханки 34,92 положительный UA086 рак почечной лоханки 35,11 положительный UA106 рак почечной лоханки 33,1 положительный UA142 рак почечной лоханки 37,85 отрицательный UD013 рак почечной лоханки 35,76 положительный UD023 рак почечной лоханки 30,23 положительный UD042 рак почечной лоханки 33,77 положительный UD062 рак почечной лоханки 35,71 положительный UD067 рак почечной лоханки 38,29 отрицательный UD079 рак почечной лоханки 31,58 положительный UD113 рак почечной лоханки 28,25 положительный UD125 рак почечной лоханки 30,63 положительный UD251 рак почечной лоханки 31,07 положительный UD290 рак почечной лоханки 36,56 отрицательный UD291 рак почечной лоханки 31,54 положительный UD053 рак почечной лоханки 31 положительный UD167 рак мочеточников 29,78 положительный UD094 рак мочеточников 33,57 положительный UD156 рак мочеточников 36,74 отрицательный UD176 рак мочеточников 29,94 положительный UD177 рак мочеточников 31,76 положительный UD246 рак мочеточников 31,02 положительный UD253 рак мочеточников 34,98 положительный UD350 рак мочеточников 31,66 положительный UG078 рак мочеточников 34,14 положительный UG085 рак мочеточников 30,01 положительный

При детектировании, если значение Ct детектирования ACTB составляет менее 32, это указывает на то, что образец отвечает требованиям или его эксплуатация проводится надлежащим образом. Если значение Ct детектирования уровня метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляет менее 36,3, это указывает на то, что результат детектирования является положительным, а в противном случае результат детектирования является отрицательным.

Результаты статистического анализа вышеуказанных результатов детектирования показаны в Таблице 16, а кривые ROC показаны на фиг. 3.

Таблица 16

Группа анализа Индикатор Фрагмент 4 нуклеиновой кислоты Сопоставление контрольной группы и группы рака мочевого пузыря и рака мочеточников и рака почечной лоханки Специфичность 93,3% Чувствительность 90,9% AUC 0,962 (P<0,001) Сопоставление контрольной группы и группы рака мочеточников Специфичность 92,4% Чувствительность 90,0% AUC 0,979 (P<0,001) Сопоставление контрольной группы и группы рака почечной лоханки Специфичность 92,4% Чувствительность 82,4% AUC 0,927 (P<0,001) Сопоставление контрольной группы и рак мочевого пузыря группа Специфичность 93,3% Чувствительность 90,4% AUC 0,966 (P<0,001) Сопоставление контрольной группы и группы инвертированной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности и папиллярной уротелиальной опухоли с низким потенциалом злокачественности Специфичность 92,4 Чувствительность 83,6 AUC 0,923 (P<0,001) Сопоставление контрольной группы и группы рака простаты Специфичность 80,7 Чувствительность 58,1 AUC 0,671 (P=0,006)

Как видно из результатов, приведенных в вышеуказанных Таблицах, фрагмент 4 нуклеиновой кислоты обладает высокой чувствительностью и специфичностью для детектирования различных типов опухолей в образцах мочи.

Пример 6

Праймеры и зонды также оказывают большое влияние на выявление эффектов маркеров опухоли. В ходе исследования авторы изобретения сконструировали несколько пар праймеров и их соответствующих зондов для отбора зондов и праймеров, которые могут повысить чувствительность и специфичность детектирования как можно больше, для обеспечения практического применения реагента для детектирования по настоящему раскрытию для клинического детектирования. Некоторые праймеры и зонды (6 комплектов) показаны в Таблице 17, а результаты детектирования показаны в Таблице 18. Все праймеры и зонды были сконструированы авторами изобретения с использованием метилированной последовательности фрагмента 4 нуклеиновой кислоты, которая была получена путем преобразования с помощью сульфита ы качестве матрицы. Они были синтезированы компанией Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.

Таблица 17. Праймеры и зонды

Наименова-ние Последова-тельность № Последовательность CG443-F SEQ ID №: 31 AGGTTCGTTTACGAGGTTTTC CG443-R SEQ ID №: 32 CCTACGCCAACTACTCCG CG443-P SEQ ID №: 33 CGAACGCTCCCGCTCCAAA CG447-F SEQ ID №: 34 TGCGTTAAGTGTACGTTTATC CG447-R SEQ ID №: 35 CGTAAAACAACTACAACTCGCG CG447-P SEQ ID №: 36 TTCTCCTCCTACGCCTACTACCTA CG190-F SEQ ID №: 37 GCGTTGCGTAGGTAGTAGGC CG190-R SEQ ID №: 38 GAACCTCGAAAAAATAATACCGTT CG190-P SEQ ID №: 39 AGGAGAACGAGGCGCGCGA CG437-F SEQ ID №: 40 GCGTTCGGAGTTGTTTAGCG CG437-R SEQ ID №: 41 CACCGACGCCACAAACGA CG437-P SEQ ID №: 42 CTATTACCGCCGCCGCCGTCG CG441-F SEQ ID №: 43 GCGGTCGTTGTATCGTTATC CG441-R SEQ ID №: 44 GAATACTTCTCGACTACCCG CG441-P SEQ ID №: 45 TAACGACCCCCGCAACAAACCG CG446-F SEQ ID №: 46 CGTTGTATCGTTATCGGTGAGC CG446-R SEQ ID №: 47 GCGCACTTAAAAATCCGCG CG446-P SEQ ID №: 48 CTTCTCGACTACCCGCAACAACAATAACG A1-F SEQ ID №: 78 TTGGATTGTGAATTTGTGTTTGT A1-R SEQ ID №: 79 CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA A1-P SEQ ID №: 51 TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT A2-F SEQ ID №: 80 GATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT A2-R SEQ ID №: 81 CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA A2-P SEQ ID №: 51 TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT A3-F SEQ ID №: 82 GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT A3-R SEQ ID №: 83 CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA A3-P SEQ ID №: 51 TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT

Скрининг комплектов праймеров и зондов выполняли с использованием 5637 клеточной линии (положительной) рака мочевого пузыря и клеточной линии (отрицательной) SK-N-BE. С помощью детектирования микоплазмы и анализа клеточной морфологии определили, что клетки были нормальными. Клетки были размножены и собраны, а ДНК экстрагировали с использованием набора для экстракции ДНК (QIAGEN DNA Mini Kit, #51306), закупленного у QIAGEN. Экстрагированную ДНК количественно определяли с использованием УФ-спектрофотометра, а затем модифицировали с помощью сульфита с использованием набора для преобразования ДНК (EZ DNA Methylation Kit, D5002), закупленного у компании ZYMO RESEARCH. ДНК разбавляли буфером 1×TE до 6000 копий/мкл. Были получены соответственно положительная референсная P0 (100% положительная ДНК, т.е., степень метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты составляла 100%), и отрицательная референсная N0 (100% отрицательная ДНК, т.е., степень метилирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты была равна 0). P1 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:9, P2 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:99, а P3 была получена путем смешивания положительной ДНК с отрицательной ДНК в соотношении 1:999.

Кривые плавления праймера были получены в соответствии с системой и протоколом амплификации по Примеру 1, и в дальнейшем результаты амплификации комплектов праймера и зонда были получены в соответствии с системой обнаружения и протоколом амплификации по Примеру 4. Кривые амплификации и кривые плавления комплектов праймера и зонда показаны на Фиг. 4.

Данные результатов детектирования комплектов праймера и зонда в различных эталонах показана в Таблице 18.

Таблица 18. Значения Ct при детектировании комплектов праймеров и зондов в различных референсных генах

Выявление
ДНК CG190 CG437 CG441 CG443 CG446 CG447 A1
(внутренний эталон) A2
(внутренний эталон) A3
(внутренний эталон) P0 (LOD 100%) 24,973 25,809 24,934 25,090 25,238 25,355 24,582 24,363 24,371 P1 (LOD 10%) 28,340 29,020 28,035 28,285 28,637 28,949 24,691 24,270 24,715 P2 (LOD 1%) 31,520 32,309 31,090 31,145 32,637 31,902 24,504 24,285 24,559 P3 (LOD 0,1%) 35,293 33,738 35,012 34,949 34,738 34,824 24,449 24,230 24,566 N0 (отрицат.) 37,176 34,520 Усиление отсутст. 35,754 40,895 Усиление отсутст. 24,793 24,449 24,840

Значение точки разделения для определения результата равно 38, и если значение Ct меньше или равно 38, это указывает на то, что результат детектирования является положительным, а если значение Ct больше 38, это указывает на то, что результат детектирования является отрицательным.

Как показано в Таблице 18, все 6 сочетания зондов и праймеров могут позволить выявить 5637 положительных клеточных линий рака мочевого пузыря при ограничении детектирования (LOD), составляющем 0,1%, и лишь комплекты праймеров и зондов CG441, CG446 и CG447 не вызывают неспецифичной амплификации в отрицательной клеточной линии SK-N-BE или неправильного определения клеточной линии как положительной. Для практического применения в клинических исследованиях авторы изобретения сконструировали и выбрали три комплекта последовательностей праймеров и зондов для обнаружения референсного гена ACTB, где детектирование и оценка результатов референсных генов показывают, что результаты детектирования систем обнаружения A1, A2 и A3 праймеров и зондов согласуются.

На Фиг. 4 показано, что кривые плавления систем обнаружения CG190, CG437 и CG443 имеют два пика, причем позиции пиков плавления в результатах детектирования референсных генов P0, P1, и P2 согласуются, позиции пиков плавления некоторых систем обнаружения в результатах детектирования референсных генов P3 и N0 сильно отличаются от позиций в результате детектирования P0, значения Ct of количественно определенных кривые амплификации указывают на то, что системы обнаружения не могут позволить хорошо отличить отрицательный референсный ген от референсного гена P3, и предел детектирования не может достигнуть одной тысячной. Кривая плавления системы обнаружения CG446 также имеет два пика, позиция пика плавления CG446 в результате детектирования N0 сильно отличается от позиции в результате детектирования P0, значение Ct количественно определенной кривой амплификация CG446 указывает на то, что система обнаружения может позволить хорошо различать отрицательный референс от референса P3, а предел детектирования может достигать одной тысячной. Кривые плавления систем обнаружения CG441 и CG447 имеют один пик, кривая амплификация и пик плавления отсутствуют в результате детектирования N0, значения Ct количественно определенных кривых амплификации CG441 и CG447 указывают на то, что системы обнаружения могут позволить хорошо различать отрицательный референс от референса P3, а предел детектирования достигает одной тысячной. Интенсивность флуоресцентного сигнала CG447 на стадии платформы значительно ниже, чем интенсивность флуоресцентного сигнала CG441 и CG446.

Пример 7

Комплект праймера и зонда CG441 был выявлен в 193 образцах мочи (включая 89 образцы рака мочевого пузыря и 104 контрастных образцов), а система амплификации и протокол амплификации были такими же, как и в Примере 4. Результаты детектирования показаны в Таблице 19.

Таблица 19. Результаты детектирования комплекта праймеров и зондов CG441 в 193 образцах мочи

Образец № Тип образца ACTB (референсный ген) CG441 Результат выявления UA141 рак мочевого пузыря 25,77 28,79 положительный UD080 рак мочевого пузыря 27,98 28,55 положительный UD136 рак мочевого пузыря 28,61 28,55 положительный UD030 рак мочевого пузыря 28,62 28,97 положительный UB005 рак мочевого пузыря 28,09 29,01 положительный UA139 рак мочевого пузыря 27,84 29,53 положительный UA056 рак мочевого пузыря 27,94 30,66 положительный UD011 рак мочевого пузыря 27,88 28,89 положительный UA008 рак мочевого пузыря 28,02 31,41 положительный UD221 рак мочевого пузыря 27,97 29,18 положительный UD220 рак мочевого пузыря 28,07 29,25 положительный UD004 рак мочевого пузыря 28,18 29,54 положительный UA055 рак мочевого пузыря 28,58 31,55 положительный UB003 рак мочевого пузыря 28,53 29,88 положительный UA149 рак мочевого пузыря 27,98 29,49 положительный UA134 рак мочевого пузыря 28,73 32,23 положительный UA124 рак мочевого пузыря 27,25 32,72 положительный UA097 рак мочевого пузыря 28,43 30,24 положительный UD268 рак мочевого пузыря 28,16 29,72 положительный UA062 рак мочевого пузыря 27,8 30,46 положительный UD038 рак мочевого пузыря 28,16 30,23 положительный UA091 рак мочевого пузыря 29,07 33,89 положительный UD009 рак мочевого пузыря 28,09 30,74 положительный UD145 рак мочевого пузыря 28,26 29,84 положительный UA078 рак мочевого пузыря 27,87 31,69 положительный UD257 рак мочевого пузыря 28,27 30,65 положительный UA073 рак мочевого пузыря 28,04 31,23 положительный UD161 рак мочевого пузыря 28,58 30,16 положительный UD016 рак мочевого пузыря 29,27 30,28 положительный UC101 рак мочевого пузыря 28,5 30,95 положительный UD244 рак мочевого пузыря 27,84 30,99 положительный UA122 рак мочевого пузыря 28,31 31,12 положительный UD298 рак мочевого пузыря 28,52 30,43 положительный UA138 рак мочевого пузыря 28,26 31,49 положительный UD205 рак мочевого пузыря 28,63 31,62 положительный UA092 рак мочевого пузыря 28,84 31,46 положительный UD109 рак мочевого пузыря 28,69 31,26 положительный UA053 рак мочевого пузыря 27,98 32,22 положительный UA111 рак мочевого пузыря 28,61 31,82 положительный UA121 рак мочевого пузыря 28,76 31,62 положительный UB006 рак мочевого пузыря 28,5 31,92 положительный UD095 рак мочевого пузыря 28,02 31,17 положительный UA137 рак мочевого пузыря 31,55 31,86 положительный UA154 рак мочевого пузыря 28,33 33,49 положительный UB001 рак мочевого пузыря 28,79 31,74 положительный UA116 рак мочевого пузыря 28,36 32,16 положительный UA094 рак мочевого пузыря 30,78 33,13 положительный UD018 рак мочевого пузыря 30,32 33,01 положительный UB008 рак мочевого пузыря 28,58 32,81 положительный UD293 рак мочевого пузыря 28,53 32,7 положительный UA060 рак мочевого пузыря 28,7 36,1 положительный UD175 рак мочевого пузыря 28,82 33,06 положительный UA077 рак мочевого пузыря 28,14 33,82 положительный UD111 рак мочевого пузыря 32,89 33,47 положительный UD014 рак мочевого пузыря 28,35 32,94 положительный UD336 контрольный 29,06 39,21 отрицательный UD303 рак мочевого пузыря 28,76 36,95 положительный UD237 рак мочевого пузыря 30,92 34,63 положительный UA006 рак мочевого пузыря 28,13 40,73 отрицательный UD135 рак мочевого пузыря 28,59 33,82 положительный UD078 рак мочевого пузыря 28,63 33,74 положительный UA047 контрольный 28,44 33,44 положительный UA119 рак мочевого пузыря 28,85 34,58 положительный UD134 рак мочевого пузыря 28,85 34,18 положительный UD210 рак мочевого пузыря 34,47 положительный UC046 контрольный 28,98 35,98 положительный UD028 рак мочевого пузыря 28,32 34,14 положительный UA115 рак мочевого пузыря 30,82 35,14 положительный UD259 контрольный 28,64 37,1 положительный UD015 рак мочевого пузыря 28,21 36,08 положительный UA041 контрольный 28,9 38,6 отрицательный UD141 рак мочевого пузыря 29,8 34,97 положительный UD142 рак мочевого пузыря 29,92 35,47 положительный UD174 рак мочевого пузыря 29,03 36,32 положительный UD150 рак мочевого пузыря 29,44 36,45 положительный UA074 рак мочевого пузыря 32,62 36,47 положительный UC001 контрольный 28,89 36,78 положительный UD308 рак мочевого пузыря 28,52 35,41 положительный UA079 рак мочевого пузыря 29,33 40,29 отрицательный UD099 рак мочевого пузыря 28,14 36,62 положительный UD003 рак мочевого пузыря 28,46 40,21 отрицательный UA034 контрольный 28,95 39,11 отрицательный UD137 рак мочевого пузыря 30,71 39,03 отрицательный UA002-2 рак мочевого пузыря 29,72 37,66 положительный UD041 контрольный 28,7 38,65 отрицательный UD110 рак мочевого пузыря 28,6 37,43 положительный UC096 рак мочевого пузыря 30,93 44 отрицательный UD243 рак мочевого пузыря 31,46 36,57 положительный UD039 рак мочевого пузыря 28,43 39,76 отрицательный UA016 контрольный 28,94 43 отрицательный UD164 контрольный 28,73 40,47 отрицательный UC048 контрольный 28,21 44 отрицательный UC081 контрольный 27,9 40,39 отрицательный UA090 рак мочевого пузыря 28,71 40,83 отрицательный UD270 контрольный 29,85 37,27 положительный UD306 контрольный 28,91 44 отрицательный UC032 контрольный 28,93 38,9 отрицательный UC002 контрольный 28,58 37,82 положительный UA108 контрольный 28,66 38,81 отрицательный UD318 контрольный 29,83 39,14 отрицательный UA025 контрольный 28,91 43 отрицательный UA135 рак мочевого пузыря 28,79 39,61 отрицательный UA020 контрольный 28,82 43 отрицательный UA100 рак мочевого пузыря 28,14 44 отрицательный UD242 контрольный 29,58 44 отрицательный UA044 контрольный 29,17 44 отрицательный UC013 контрольный 28,33 44 отрицательный UD225 рак мочевого пузыря 30,63 39,58 отрицательный UC030 контрольный 29,2 44 отрицательный UA051 контрольный 28,72 39,49 отрицательный UA057 рак мочевого пузыря 30,11 44 отрицательный UA010 контрольный 28,93 39,99 отрицательный UD357 контрольный 27,73 44 отрицательный UC097 контрольный 28,88 44 отрицательный UD269 контрольный 30,34 40,72 отрицательный UA017 контрольный 29,56 44 отрицательный UA114 контрольный 28,04 43 отрицательный UD126 контрольный 28,81 38,62 отрицательный UC017 контрольный 28,92 44 отрицательный UA104 рак мочевого пузыря 28,79 44 отрицательный UC063 контрольный 28,27 44 отрицательный UD045 контрольный 28,29 44 отрицательный UD346 контрольный 29,17 44 отрицательный UC052 контрольный 28,07 44 отрицательный UC047 контрольный 29,03 44 отрицательный UA045 контрольный 28,45 44 отрицательный UC022 контрольный 28,93 38,73 отрицательный UC019 контрольный 28,94 39,08 отрицательный UD238 контрольный 28,2 39,73 отрицательный UD073 контрольный 28,31 40,61 отрицательный UC007 контрольный 28,61 44 отрицательный UC039 контрольный 28,04 41,53 отрицательный UC020 контрольный 28,66 44 отрицательный UC041 контрольный 28,16 44 отрицательный UA061 рак мочевого пузыря 28,57 39,92 отрицательный UC026 контрольный 29,23 39,74 отрицательный UC098 контрольный 28,68 43 отрицательный UA048 контрольный 29,52 44 отрицательный UC005 контрольный 29,43 40,93 отрицательный UD108 контрольный 28,36 44 отрицательный UC044 контрольный 28,83 39,09 отрицательный UC064 контрольный 28,87 39,75 отрицательный UC009 контрольный 28 44 отрицательный UD050 контрольный 28,79 44 отрицательный UD071 контрольный 29,67 44 отрицательный UC023 контрольный 29,51 44 отрицательный UC011 контрольный 28,65 44 отрицательный UA052 контрольный 29,08 39,13 отрицательный UC033 контрольный 28,84 44 отрицательный UD266 контрольный 29,92 39,91 отрицательный UD274 контрольный 28,81 44 отрицательный UC040 контрольный 29,21 40,05 отрицательный UA035 контрольный 31,25 44 отрицательный UA117 контрольный 29,24 44 отрицательный UD277 контрольный 28,64 44 отрицательный UC012 контрольный 28,89 44 отрицательный UD124 контрольный 30,65 39,12 отрицательный UD281 контрольный 28,62 44 отрицательный UC024 контрольный 29,61 44 отрицательный UC060 контрольный 31,53 44 отрицательный UA118 контрольный 33,15 44 отрицательный UD040 контрольный 28,75 44 отрицательный UA109 контрольный 31,61 44 отрицательный UD200 контрольный 32,69 44 отрицательный UA128 контрольный 31,09 44 отрицательный UA147 рак мочевого пузыря 30,53 44 отрицательный UA021 контрольный 28,93 39,63 отрицательный UD364 контрольный 30,84 39,72 отрицательный UC061 контрольный 31,94 40,68 отрицательный UA050 контрольный 28,88 43 отрицательный UC059 контрольный 30,63 43 отрицательный UD263 контрольный 30,59 43 отрицательный UD008 контрольный 30,29 44 отрицательный UC056 контрольный 32,65 44 отрицательный UC055 контрольный 28,32 44 отрицательный UC027 контрольный 32,18 44 отрицательный UD265 контрольный 30,04 44 отрицательный UD236 контрольный 28,35 44 отрицательный UA015 контрольный 29,47 44 отрицательный UG093 контрольный 29,74 44 отрицательный UA014 контрольный 31,76 44 отрицательный UA012 контрольный 31,47 44 отрицательный UA024 контрольный 32,56 44 отрицательный UA036 контрольный 30,78 44 отрицательный UA043 контрольный 30,74 44 отрицательный UA033 контрольный 29,55 44 отрицательный UA031 контрольный 29,48 44 отрицательный UA026 контрольный 28,84 44 отрицательный UA039 контрольный 33 44 отрицательный UC006 контрольный 31,89 44 отрицательный UC031 контрольный 30,49 44 отрицательный UC051 контрольный 31,51 44 отрицательный UD276 контрольный 32,49 44 отрицательный

Значение точки разделения для определения результата задано равным 38,6, и если значение Ct меньше или равно 38,6, то детектирование определяют как положительное, а если значение Ct больше 38,5, то результат детектирования определяют как отрицательный. Полученная специфичность детектирования фрагмента 4 нуклеиновой кислоты к образцам рака мочевого пузыря в 193 образцах мочи составляет 93,3%, чувствительность составляет 84,3%, а площадь под кривой ROC равна 0,931 (P<0,001). Кривая ROC показана на Фиг. 5.

Список литературы:

1. Mbeutcha, A., Lucca, I., Mathieu, R., Lotan, Y. & Shariat, S. F. Current Status of Urinary Biomarkers for Detection and Surveillance of Bladder Cancer. Urologic Clinics of North America 43, 47–62 (2016).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, содержащий праймер и зонд, а также применение данного реагента для обнаружения уротелиальной опухоли у пациента. Изобретения можно использовать для обнаружения и диагностирования опухолей. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 26 ил., 19 табл., 7 пр.

1. Реагент для детектирования уровня метилирования нуклеотидной последовательности, характеризующийся тем, что содержит: праймер, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, или SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, или SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, или SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 46,или SEQ ID NO: 47 или их комплементарные последовательности; и

зонд, содержащий нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 48 или их комплементарные последовательности.

2. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

3. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.

4. Реагент по п. 1, в котором праймер представляет собой пару праймеров, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44.

5. Реагент по п. 1, в котором зонд содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 48 или их комплементарные последовательности.

6. Реагент по п. 1, в котором зонд содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 45.

7. Реагент по п. 1, в котором указанный праймер представляет собой пару праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, а

указанный зонд содержит нуклеотидную последовательность, показанную как SEQ ID NO: 45.

8. Применение реагента по любому из пп. 1-7 для обнаружения уротелиальной опухоли у пациента.

9. Применение по п. 8, в котором исследуют по меньшей мере один образец, выбранный из группы, состоящей из ткани, жидкости организма и экскремента.

10. Применение по п. 9, в котором образец представляет собой ткань мочевого пузыря.

11. Применение по п. 9, в котором образец представляет собой по меньшей мере один образец, выбранный из группы, состоящей из мокроты, мочи, слюны и кала.

12. Применение по п. 11, в котором образец представляет собой мочу.

13. Применение по п. 8, в котором обнаружение включает в себя: детектирование уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в детектируемом образце, полученном у обследуемого; и

обозначение наличия или риска наличия у пациента уротелиальной опухоли в соответствии с отклонением уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в образце от уровня метилирования нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 в образце, взятом у субъекта, который не имеет уротелиальной опухоли.

14. Применение по п. 8, в котором уротелиальная опухоль представляет собой по меньшей мере одну опухоль, выбранную из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака мочеточников, рака почечной лоханки и рака уретры.