Ссылка на родственные заявки

[01] По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США, серийный номер 62/419,947, поданной 9 ноября 2016 г., которая полностью включена в настоящий документ.

Перечень последовательностей

[02] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 31 октября 2017 г., называется 42363-711_601_SL.txt и ее размер составляет 242369 байт.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[03] Молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, как правило, обнаруживаются на антигенпрезентирующих клетках, где они презентируют антиген для узнавания CD4+ T-клетками, помогая регулировать иммунные ответы. Молекулы МНС класса II образуются путем димеризации альфа- и бета-цепи и стабилизируются в присутствии полипептидного антигена, который связывается в связывающей полости, образованной альфа- и бета-цепью. Тем не менее, производство MHC класса II в сконструированных системах in vitro было проблематичным из-за внутренней нестабильности гетеродимеров белка, даже в присутствии полипептида.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[04] В настоящем документе раскрыты выделенные и очищенные гетеродимеры антиген-МНС и эффективные способы их получения. Гетеродимеры конструируют для облегчения производства и выделения. Используют несколько способов увеличения производства выделенных гетеродимеров. Во-первых, альфа- и бета-цепи по отдельности сливают с частью тяжелой цепи IgG, затем IgG конструируют с архитектурой выступ-во-впадину (с одной из альфа- или бета-цепи IgG, состоящей из выступа и противоположной альфа- или бета-цепью IgG, содержащей впадину). В некоторых случаях гетеродимер может быть дополнительно стабилизирован с помощью цистеиновой ловушки между антигеном и остатком связывающей полости МНС класса II. Чтобы использовать цистеиновую ловушку, антиген может содержать эндогенный или сконструированный цистеин, который образует дисульфидную связь со сконструированным цистеином на альфа- или бета-цепи молекулы МНС, которая находится в непосредственной близости от связывающей полости. Эта цистеиновая ловушка может дополнительно повысить стабильность пептидной молекулы МНС. Неожиданно было обнаружено, что архитектура выступ-во-впадину работает в отсутствие гетерологичных доменов димеризации, которые использовались ранее. Фактически, было обнаружено, что гетерологичный домен димеризации является вредным для образования гетеродимеров.

[05] В настоящем документе согласно одному аспекту предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит один или несколько встречающихся в природе аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из фенилаланина, аргинина, тирозина, триптофана и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток аргинина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток фенилаланина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток тирозина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток триптофана. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток цистеина и остаток триптофана. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит не встречающийся в природе аминокислотный остаток. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит встречающийся в природе аминокислотный остаток. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из аланина, серина, треонина, валина и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток аланина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток серина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток треонина.

[06] Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток валина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток цистеина, остаток серина, остаток аланина и остаток валина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид взаимодействуют через домен C_H3 антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления домен C_H3 происходит от IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления IgG относится к подтипу IgG1. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат C-концевой остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат метку Strep. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый любой из SEQ ID NO: 5-8. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, кодируемый последовательностью ДНК, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-26, 64 или 65. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-63 или ее фрагмент.

[07] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены мультимеры, содержащие два или более описанных в настоящем документе выделенных гетеродимеров. Согласно некоторым вариантам осуществления мультимер дополнительно содержит авидин.

[08] Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из двух или более гетеродимеров связан с авидином. Согласно некоторым вариантам осуществления мультимер дополнительно содержит полимерную главную цепь, причем каждый из двух или более гетеродимеров соединен с полимерным остовом. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный остов представляет собой декстран или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[09] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, содержащие домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере один сконструированный выступ. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один сконструированный выступ не расположен в домене α1 MHC класса II или в домене α2 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированный выступ расположен в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом α2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированным выступом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU).

[010] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, содержащие домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере один сконструированный выступ. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один сконструированный выступ не расположен в домене β1 МНС класса II или в домене β2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированный выступ расположен в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом β2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированным выступом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU).

[011] Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит один или несколько встречающихся в природе аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из фенилаланина, аргинина, тирозина, триптофана и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток аргинина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток фенилаланина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток тирозина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток триптофана. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит остаток цистеина и остаток триптофана.

[012] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, содержащие домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере одну сконструированную полость. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна сконструированная полость не расположена в домене α1 МНС класса II или в домене α2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированная полость расположена в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом α2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированной полостью. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация EU) и их комбинаций.

[013] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, содержащие домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере одну сконструированную полость. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна сконструированная полость не расположена в домене β1 МНС класса II или в домене β2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированная полость расположена в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом β2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированной полостью. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация EU) и их комбинаций.

[014] Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит не встречающийся в природе аминокислотный остаток. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит встречающийся в природе аминокислотный остаток. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из аланина, серина, треонина, валина и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток аланина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток серина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток треонина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток валина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления полость содержит остаток цистеина, остаток серина, остаток аланина и остаток валина.

[015] Согласно некоторым вариантам осуществления выступ расположен в константном домене С_Н3 антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления полость расположена в константном домене С_Н3 антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид дополнительно содержит C-концевой остаток цистеина.

[016] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, кодируемые последовательностью ДНК, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-26, 64 или 65.

[017] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 27-63 или ее фрагмент.

[018] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и/или содержит твердое ядро. Согласно некоторым вариантам осуществления твердое ядро представляет собой ядро из золота или оксида железа. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один гетеродимер ковалентно или нековалентно связан с наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит полиэтиленгликоль.

[019] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены способы получения гетеродимера, содержащего первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который устанавливается в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию; включающие следующие стадии: (а) культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид и второй полипептид, включая в себя их поверхности контакта, причем нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта первого полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта первого полипептида, для кодирования выступа, или нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта второго полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта второго полипептида, для кодирования полости, или и то и другое, и причем культивирование является таким, что первый полипептид и второй полипептид экспрессируется; и (b) извлечение гетеродимера из культуры клеток-хозяев.

[020] Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид, была изменена из исходной нуклеиновой кислоты для кодирования выпуклости, а нуклеиновая кислота, кодирующая второй полипептид, была изменена из исходной нуклеиновой кислоты для кодирования полости.

[021] Согласно некоторым вариантам осуществления стадии (а) предшествует стадия, на которой каждая из одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих исходный аминокислотный остаток на поверхности контакта первого полипептида, заменяется нуклеиновой кислотой, кодирующей импортный аминокислотный остаток, причем выступ содержит один или несколько импортных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток выбирают из фенилаланина, аргинина, тирозина, триптофана и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой аргинин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой фенилаланин.

[022] Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой тирозин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой триптофан. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой цистеин.

[023] Согласно некоторым вариантам осуществления стадии (а) предшествует стадия, на которой каждая из одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих исходный аминокислотный остаток на поверхности контакта второго полипептида, заменяется нуклеиновой кислотой, кодирующей импортный аминокислотный остаток, причем полость содержит один или несколько импортных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток выбирают из цистеина, аланина, серина, треонина или валина. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой цистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой аланин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой серин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой треонин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток представляет собой валин.

[024] Согласно некоторым вариантам осуществления каждый первый полипептид и второй полипептид содержат константный домен антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления константный домен антитела представляет собой домен C_H3. Согласно некоторым вариантам осуществления константный домен антитела происходит из IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления IgG представляет собой человеческий IgG1. Согласно некоторым вариантам осуществления константный домен антитела представляет собой домен C_H2 и C_H3. Согласно некоторым вариантам осуществления C_H3 дополнительно содержит сконструированный выступ или полость (впадину).

[025] В настоящем документе согласно другому аспекту предусмотрены способы получения конъюгата гетеродимер-наночастица, содержащего связывание по меньшей мере одного описанного в настоящем документе гетеродимера с наночастицей, причем наночастица не является липосомальной и/или содержит твердое ядро. Согласно некоторым вариантам осуществления твердое ядро представляет собой ядро из золота или оксида железа. Согласно некоторым вариантам осуществления стадия связывания включает ковалентное или нековалентное связывание по меньшей мере одного гетеродимера с наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления стадия связывания включает ковалентное связывание по меньшей мере одного гетеродимера с наночастицей через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит полиэтиленгликоль.

[026] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрен выделенный гетеродимер, содержащий по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию; или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит один или несколько не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам осуществления выступ содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из фенилаланина, аргинина, тирозина, триптофана и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 53. Согласно определенным вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности SEQ ID NO: 54. Согласно некоторым вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит домен С_Н3, а домен С_Н3 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU). Согласно определенным вариантам осуществления полость содержит не встречающийся в природе аминокислотный остаток. Согласно определенным вариантам осуществления полость содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из аланина, серина, треонина, валина и цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51. Согласно определенным вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 52. Согласно некоторым вариантам осуществления первый или второй полипептид выделенного гетеродимера содержит домен C_H3, а домен C_H3 содержит по меньшей мере одну мутацию выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация EU) и их комбинаций.

[027] Согласно определенным вариантам осуществления один или оба из первого полипептида или второго полипептида не содержат гетерологичный домен димеризации. Согласно определенным вариантам осуществления один или оба из первого полипептида или второго полипептида не содержат лейциновую молнию. Согласно определенным вариантам осуществления один или оба из первого полипептида или второго полипептида не содержат сайт-специфический сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер дополнительно содержит относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к заболеванию антиген содержит полипептид длиной по меньшей мере 11 аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген соединен с доменом α1 МНС класса II или доменом β1 МНС класса II гибким линкером. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген ковалентно связан с доменом α1 МНС класса II или доменом β1 МНС класса II дисульфидной связью, образованной между аминокислотой цистеином, связанной с антигенным пептидом, и аминокислотой цистеином домена α1 МНС класса II или домена β1 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислота цистеин из домена α1 MHC класса II или домена β1 MHC класса II находится в пределах 10 аминокислот от остатка, который образует часть связывающей борозды MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновый остаток домена α1 МНС класса II или β1 домена МНС класса II находится в пределах 3 аминокислот от остатка, который образует часть связывающей борозды МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислота цистеин из домена α1 MHC класса II или домена β1 MHC класса II была введена в природную последовательность домена α1 MHC класса II или домена β1 MHC класса II. Согласно определенным вариантам осуществления выделенный гетеродимер предназначен для применения при лечении индивидуума, у которого диагностировано или предположительно имеется аутоиммунное заболевание. Согласно определенным вариантам осуществления выделенный гетеродимер кодируется полинуклеотидом, кодирующим описанный в настоящем документе первый или второй полипептид. Согласно определенным вариантам осуществления клетка-хозяин содержит полинуклеотид. Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотид стабильно интегрирован в геном. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один гетеродимер конъюгирован с наночастицей с образованием конъюгата гетеродимер-наночастица, причем наночастица не является липосомальной и/или содержит твердое ядро. Согласно определенным вариантам осуществления твердое ядро представляет собой ядро из золота, железа или оксида железа. Согласно определенным вариантам осуществления твердое ядро составляет в диаметре менее 100 нанометров. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей через линкер, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ). Согласно определенным вариантам осуществления полиэтиленгликоль функционализирован малеимидом. Согласно определенным вариантам осуществления полиэтиленгликоль составляет менее чем 5 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат гетеродимер-наночастица, образуется с фармацевтическим вспомогательным веществом, стабилизатором или разбавителем. Согласно определенным вариантам осуществления выделенный гетеродимер или фармацевтическая композиция предназначены для применения в способе лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного состояния. Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного состояния включает введение индивидууму выделенного конъюгата гетеродимер-наночастица или фармацевтической композиции.

[028] Согласно другому аспекту в настоящем документе описан способ получения гетеродимера, содержащего первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию; или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию; включающий стадии: (а) культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид и второй полипептид, включая в себя их поверхности контакта, причем нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта первого полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта первого полипептида, для кодирования выступа, или нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта второго полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта второго полипептида, для кодирования полости, или и то и другое, и причем культивирование таково, что первый полипептид и второй полипептид экспрессируется; и (b) извлечение гетеродимера из культуры клеток-хозяев. Согласно определенным вариантам осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид и второй полипептид, стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина. Согласно определенным вариантам осуществления клетка-хозяин содержит клетку яичника китайского хомячка (СНО). Согласно некоторым вариантам осуществления извлечение гетеродимера из культуры клеток-хозяев или культур клеток-хозяев включает внесение жидкости, содержащей гетеродимер, в колонку для жидкостной хроматографии. Согласно некоторым вариантам осуществления колонка для жидкостной хроматографии содержит белок A, белок G, белок L или их комбинацию.

[029] Согласно другому аспекту в настоящем документе описан способ получения гетеродимера, содержащего первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию; включающий стадии: (а) культивирование первой клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид; (b) культивирование второй клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид; (c) выделение полипептидов из культур клеток-хозяев и (d) образование гетеродимера путем инкубации первого и второго полипептидов вместе; причем нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта первого полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта первого полипептида, для кодирования выступа, или нуклеиновая кислота, кодирующая поверхность контакта второго полипептида, была изменена из нуклеиновой кислоты, кодирующей исходную поверхность контакта второго полипептида, для кодирования полости или и то и другое. Согласно определенным вариантам осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая первый полипептид и второй полипептид, стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина. Согласно определенным вариантам осуществления первая и вторая клетки-хозяева содержат клетки яичника китайского хомячка (СНО). Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно включает извлечение гетеродимера или полипептидов из культуры клеток-хозяев или культур клеток-хозяев и включает внесение жидкости, содержащей гетеродимер или полипептиды, в колонку для жидкостной хроматографии. Согласно некоторым вариантам осуществления колонка для жидкостной хроматографии содержит белок A, белок G, белок L или их комбинацию.

[030] В настоящем документе согласно одному аспекту предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II, домен C_H2 IgG и домен C_H3 IgG, причем выступ образован мутациями в домене C_H3 IgG, соответствующем S354C и T366W (нумерация EU); и (ii) второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II, домен C_H2 IgG и домен C_H3 IgG, причем полость образована мутациями в домене C_H3 IgG, соответствующем Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация EU).

[031] В настоящем документе согласно одному аспекту предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II, домен C_H2 IgG и домен C_H3 IgG, причем выступ образован мутациями в домене C_H3 IgG, соответствующем S354C и T366W (нумерация EU); и (ii) второй полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II, домен C_H2 IgG и домен C_H3 IgG, причем полость образована мутациями в домене C_H3 IgG, соответствующем Y349C, T366S , L368A и Y407V (нумерация EU).

Краткое описание графических материалов

[032] На фиг. 1A-B показан лентивирусный вектор как в линеаризованной (A), так и в круговой форме (B).

[033] На фиг. 2 показан пример конструирования pMHC с использованием лейциновой молнии.

[034] На фиг. 3 схематично показаны дизайны pMHC выступ-во-впадину (с лейциновой молнией и без нее).

[035] Фиг. 4А-С. На фиг. 4А показан проточный цитометрический анализ экспрессии eGFP в клетках СНО, трансдуцированных лентивирусами, кодирующими pMHC BDC2.5mi/IA^g7-выступ-во-впадину с лейциновой молнией (слева) или без нее (справа). На фиг. 4В и фиг. 4C показаны профили элюирования аффинной хроматографией с белком G культуральных супернатантов из клеток CHO, экспрессирующих pMHC на основе выступ-во-впадину без лейциновой молнии (фиг. 4B) и с лейциновой молнией (фиг. 4C).

[036] На фиг. 5 показана электрофоретическая подвижность pMHC на основе выступ-во-впадину без молнии посредством нативного (слева) и денатурирующего (справа) ДСН-ПААГ.

[037] На фиг. 6 показаны профили окрашивания FACS BDC2.5-CD4+ Т-клеток с использованием тетрамеров, изготовленных с использованием обычных мономеров pMHC (левая панель) или дизайна на основе выступ-во-впадину без молнии (средняя и правая панели).

[038] На фиг. 7 показаны неденатурирующие (слева) и денатурирующие (справа) изображения на геле ДСН-ПААГ для наночастиц PFM, конъюгированных с pMHC BDC2.5mi/IA^g7на основе выступ-во-впадину без молнии.

[039] На фиг. 8 показаны Т-клеточные ответы у мышей, обработанных наночастицами 2.5mi/IA^g7на основе выступ-во-впадину без молнии (слева) или обычными (не основанными на выступе-во-впадину) наночастицами 2.5mi/IA^g7с молниями (справа). Мышей обрабатывали 10 дозами (2 дозы в неделю в течение 5 недель), после чего выделяли Т-клетки селезенки, сортировали на 2.5mi/IA^g7тетрамер-положительные и отрицательные фракции и стимулировали гранулами, покрытыми моноклональными антителами к CD3/к CD28. мРНК анализировали на присутствие транскриптов, соответствующих клеткам TR₁, из тетрамер-положительных и отрицательных фракций.

[040] На фиг. 9А-В показано высвобождение цитокинов из Т-клеток, выделенных у мышей, обработанных, как на фиг. 8. Мышей обрабатывали либо наночастицами на основе выступ-во-впадину 2.5mi/IA^g7без молнии (A), либо обычными наночастицами на основе выступ-во-впадину 2.5mi/IA^g7 (B) с молнией (B).

[041] На фиг. 10 показан профиль очистки mono-Q белка BDC-PEG-биотин. Фракции с номерами от 19 до 38 собирали для скрининга биотина с помощью анализа ИФА и ДСН-ПААГ.

[042] На фиг. 11 показаны профили ДСН-ПААГ очищенных моно-Q фракций. Дорожки помечены номером каждой фракции FPLC. 20 мкл каждой фракции наносили на гель.

[043] На фиг. 12 показан анализ вестерн-блоттинг фракций 22-25 (дорожки 5-9), который показал присутствие биотина исключительно в альфа-цепи мономера pMHC по сравнению с мономером pMHC BDC2.5mi/IA^g7, несущим последовательность биотинилирования в альфа-цепи и биотинилированным с использованием фермента BirA (дорожка 1). Фракции 25-29 объединяли и использовали для получения тетрамеров pMHC. Дорожки 11-17 показывают фракции 30-36.

[044] На фиг. 13 показан профиль проточной цитометрии BDC2.5-CD4+ Т-клеток, окрашенных тетрамерами, полученными с использованием BDC2,5mi/I-A^g7-малеимид-ПЭГ2-биотина.

[045] На фиг. 14А и фиг. 14B показаны профили элюирования FPLC, на фиг. 14C и фиг. 14D показан анализ ДСН-ПААГ элюированных фракций, указанных на фиг. 14А и фиг. 14В.

[046] На фиг. 15А-D показана проточная цитометрия меченых GFP клеток JURMA, экспрессирующих TCR, специфический для DR, в комплексе с полипептидом IGRP_13-25. На фиг. 15А показана клеточная линия отдельно; на фиг. 15В показана клеточная линия, инкубированная с РЕ, меченым DR3 IGRP_13-25, полученным по стандартной технологии димеризации лейциновой молнии; на фиг. 15C показана клеточная линия, инкубированная с PE-меченым DR3 IGRP_13-25, изготовленным с использованием технологии димеризации выступ-во-впадину и цис-ловушки, без лейциновой молнии; на фиг. 15D показана клеточная линия, инкубированная с нерелевантными меченными РЕ гетеродимерами МНС класса II.

[047] На фиг. 16А и фиг. 16B показана стимуляция клеток JURMA, экспрессирующих TCR, специфический для DR, в комплексе с полипептидом IGRP_13-25, конъюгированным с наночастицей.

Подробное описание настоящего изобретения

[048] Различные варианты осуществления описаны ниже. Следует отметить, что конкретные варианты осуществления не предназначены для исчерпывающего описания или для ограничения более широких аспектов, обсуждаемых в настоящем документе. Один аспект, описанный в связи с конкретным вариантом осуществления, не обязательно ограничен этим вариантом осуществления и может применяться на практике с любым другим вариантом (вариантами) осуществления.

[049] В настоящем документе согласно одному аспекту предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию. Первый полипептид, второй полипептид или оба могут содержать домен антитела С_Н3, слитый с полипептидом. Необязательно, либо первый полипептид, либо второй полипептид, либо оба содержат домен C_H2 антитела, расположенный между MHC (α- или β-цепью) и доменом C_H3. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из перечня, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU). Согласно некоторым вариантам осуществления второй полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация EU) и их комбинаций. Согласно другим вариантам осуществления выделенный гетеродимер содержит относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид, необязательно ковалентно связанный с первым или вторым полипептидом. Необязательно, относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид содержит остаток цистеина, который взаимодействует с остатком цистеина либо в первом, либо во втором полипептиде с образованием цистеиновой ловушки.

[050] Согласно одному аспекту один полипептид гетеродимера содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере один сконструированный выступ. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один сконструированный выступ не расположен в домене α1 MHC класса II или в домене α2 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированный выступ расположен в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом α2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированным выступом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU). Согласно другим вариантам осуществления полипептид содержит относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид. Необязательно, относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид содержит остаток цистеина, который взаимодействует с остатком цистеина в домене α1 или β1 MHC с образованием цистеиновой ловушки.

[051] Согласно одному аспекту один полипептид гетеродимера содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию и по меньшей мере один сконструированный выступ. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один сконструированный выступ не расположен в домене β1 МНС класса II или в домене β2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированный выступ расположен в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом β2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированным выступом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из S354C, T366W и как S354C, так и T366W (нумерация EU). Согласно другим вариантам осуществления полипептид содержит относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид. Необязательно, относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид содержит остаток цистеина, который взаимодействует с остатком цистеина в домене α1 или β1 MHC с образованием цистеиновой ловушки.

[052] Согласно одному аспекту один полипептид гетеродимера содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию и по меньшей мере одну сконструированную полость. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна сконструированная полость не расположена в домене α1 МНС класса II или в домене α2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированная полость расположена в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом α2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированной полостью. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация ЕU) и их комбинаций. Согласно другим вариантам осуществления полипептид содержит относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид. Необязательно, относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид содержит остаток цистеина, который взаимодействует с остатком цистеина в домене α1 или β1 MHC с образованием цистеиновой ловушки.

[053] Согласно одному аспекту один полипептид гетеродимера содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию и по меньшей мере одну сконструированную полость. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна сконструированная полость не расположена в домене β1 МНС класса II или в домене β2 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления сконструированная полость расположена в домене С_Н3 антитела, слитого с полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид необязательно содержит домен C_H2 антитела, расположенный между доменом β2 MHC класса II и доменом C_H3 со сконструированной полостью. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептид содержит домен C_H3 антитела, а домен C_H3 антитела содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из списка, состоящего из Y349C, T366S, L368A, Y407V (нумерация ЕU) и их комбинаций. Согласно другим вариантам осуществления полипептид содержит относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид. Необязательно, относящийся к аутоиммунному или воспалительному заболеванию пептид содержит остаток цистеина, который взаимодействует с остатком цистеина в домене α1 или β1 MHC с образованием цистеиновой ловушки.

[054] Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» будет понятен специалистам в настоящей области техники и будет варьировать до некоторой степени в зависимости от контекста, в котором он используется. Если есть употребления термина, которые не понятны специалистам в настоящей области техники, учитывая контекст, в котором они используются, «приблизительно» будет означать до плюс или минус 10% конкретного термина.

[055] Использование терминов в единственном и множественном числе и аналогичных ссылок в контексте описания элементов (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) следует толковать как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно указано в настоящем документе. Все описанные в настоящем документе способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «таких как»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшего освещения вариантов осуществления и не налагает ограничения на объем формулы изобретения, если не указано иное. Ни одна формулировка в описании не должна быть истолкована как указывающая на необязательный элемент как существенный.

[056] Используемый в настоящем документе термин «гетеродимер» относится к молекуле, содержащей первый полипептид и второй полипептид, причем второй полипептид отличается по аминокислотной последовательности от первого полипептида по меньшей мере одним аминокислотным остатком. «Мультимер» относится к молекуле, содержащей два или более гетеродимеров или содержащей четыре или более полипептидов, раскрытых в настоящем документе.

[057] Используемый в настоящем документе «индивидуум» является синонимом «субъекта». У индивидуума может быть диагностировано заболевание. У индивидуума может подозреваться наличие определенного заболевания на основании проявления по меньшей мере одного симптома указанного заболевания, наличия семейного анамнеза указанного заболевания, наличия генотипа, соответствующего определению риска для указанного заболевания, или проведения одного из фенотипических «лабораторных тестов» с уровнем или приблизительным уровнем, который означал бы, что индивидуум характеризуется риском заболевания. Индивидуум может представлять собой млекопитающее, такое как лошадь, кошка, собака, свинья, корова, коза или овца. Индивидуум может в определенных случаях представлять собой человека.

[058] Используемый в настоящем документе термин «полипептид» в целом относится к пептидам и белкам, содержащим более десяти аминокислот.

[059] Используемый в настоящем документе термин «первый полипептид» представляет собой любой полипептид, который должен быть связан со вторым полипептидом. Первый и второй полипептид встречаются «поверхностями контакта» (определено ниже). В дополнение к поверхности контакта первый полипептид может содержать один или несколько дополнительных доменов, таких как «связывающие домены» (например, лиганд-связывающий домен) или константные домены антител (или их части), включая в себя домены C_H2, C_H1 и C_L. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид содержит по меньшей мере один домен, который происходит от антитела. Согласно дополнительным вариантам осуществления домен, как правило, представляет собой константный домен, такой как домен С_Н3 антитела. Согласно еще другим вариантам осуществления домен образует поверхность контакта первого полипептида.

[060] Используемый в настоящем документе «второй полипептид» представляет собой любой полипептид, который должен быть связан с первым полипептидом через «поверхность контакта». В дополнение к поверхности контакта второй полипептид может содержать дополнительные домены, такие как «связывающий домен» (например, лиганд-связывающий домен) или константные домены антитела (или их части), включая в себя домены C_H2, C_H1 и C_L. Согласно некоторым вариантам осуществления второй полипептид содержит по меньшей мере один домен, который происходит из антитела. Согласно другим вариантам осуществления домен, как правило, представляет собой константную область, такую как домен С_Н3 антитела. Согласно еще другим вариантам осуществления домен образует поверхность контакта второго полипептида.

[061] Используемый в настоящем документе термин «связывающий домен» включает в себя любую область полипептида, которая отвечает за селективное связывание с представляющей интерес молекулой (например, антигеном).

[062] Используемый в настоящем документе термин «связывающая борозда» относится к молекулярному карману или расщелине, которая существует в гетеродимере МНС класса II, образованном между доменом α1 МНС класса II и доменом β2 МНС класса II. Это часть гетеродимера MHC класса II, которая взаимодействует с антигенами. Антигены, как правило, представляют собой полипептидные антигены, но могут быть дополнительно модифицированы липидными фрагментами, гликолевыми фрагментами или гликолипидными фрагментами. Остатки, которые составляют связывающую борозду, проявляют полиморфизм и объясняют различия в связывании антигена между различными аллелями HLA. Важной особенностью связывающей борозды для молекул МНС класса II является то, что концы борозды открыты и позволяют антигену выходить за пределы одной или обеих сторон связывающей борозды.

[063] Используемый в настоящем документе термин «поверхность контакта» включает в себя те «контактные» аминокислотные остатки в первом полипептиде, которые взаимодействуют с одним или несколькими «контактными» аминокислотными остатками на поверхности контакта второго полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления поверхность контакта содержит домен С_Н3 иммуноглобулина. Согласно другим вариантам осуществления иммуноглобулин происходит из антитела IgG. Антитело IgG может характеризоваться изотипом IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно другим вариантам осуществления иммуноглобулин происходит из человеческого антитела IgG1.

[064] Используемый в настоящем документе термин «выступ» относится по меньшей мере к одной боковой цепи аминокислоты, которая выступает из поверхности контакта первого полипептида и, следовательно, может располагаться в компенсаторной полости в соседней поверхности контакта (т.е. поверхности контакта второго полипептида), чтобы стабилизировать гетеродимер и тем самым способствовать образованию гетеродимера, например, по отношению к образованию гомодимера. Выступ может существовать в исходной поверхности контакта или может быть введен синтетически (например, путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей поверхность контакта). «Сконструированный выступ» вводят синтетически. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность контакта первого полипептида, изменяют для кодирования выступа. Для достижения этой цели нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один «исходный» аминокислотный остаток на поверхности контакта первого полипептида, заменяют нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один «импортный» аминокислотный остаток, который характеризуется большим объемом боковой цепи, чем исходный аминокислотный остаток. Понятно, что может быть более одного исходного и соответствующего импортного остатка. Согласно некоторым вариантам осуществления верхний предел для числа замененных исходных остатков представляет собой общее количество остатков на поверхности контакта первого полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления импортными остатками для образования выступа, как правило, являются встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки выбирают из аргинина (R), цистеина (C), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W). Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки выбирают из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W). Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки представляют собой триптофан и тирозин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки представляют собой триптофан и цистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления исходный остаток для образования выступа характеризуется небольшим объемом боковой цепи, например, аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, серин, треонин или валин. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток серина заменяют цистеином, а остаток треонина заменяют триптофаном. Согласно некоторым вариантам осуществления серин в положении 354 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всего выступа. Согласно некоторым вариантам осуществления треонин в положении 366 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всего выступа. Согласно другим вариантам осуществления аминокислотные замены содержат S354C и T366W (нумерация EU). Вся нумерация соответствует Edelman, Gerald M. et al. PNAS 63(1) (1969): 78-85.

[065] Используемый в настоящем документе термин «полость» относится по меньшей мере к одной боковой цепи аминокислоты, которая углублена от поверхности контакта второго полипептида и, следовательно, вмещает соответствующий выступ в смежной поверхности контакта первого полипептида. Полость может существовать в исходной поверхности контакта или может быть введена синтетически (например, путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей поверхность контакта). «Сконструированную полость» вводят синтетически. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность контакта второго полипептида, изменяют для кодирования полости. Для достижения этого нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один «исходный» аминокислотный остаток на поверхности контакта второго полипептида, заменяют ДНК, кодирующей по меньшей мере один «импортный» аминокислотный остаток, который характеризуется меньшим объемом боковой цепи, чем исходный аминокислотный остаток. Понятно, что может быть более одного исходного и соответствующего импортного остатка. Верхний предел для количества заменяемых исходных остатков представляет собой общее количество остатков на поверхности контакта второго полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления импортными остатками для образования полости, как правило, являются встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки выбирают из аланина (A), цистеина (C), серина (S), треонина (T) и валина (V). Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки выбирают из аланина (A), серина (S), треонина (T) и валина (V). Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки выбирают из аланина (A), цистеина (C), серина (S) и валина (V). Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки представляют собой серин, аланин или треонин. Согласно некоторым вариантам осуществления импортные остатки представляют собой аланин (A), цистеин (C), серин (S) и валин (V). Согласно некоторым вариантам осуществления тирозин в положении 349 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всей полости. Согласно некоторым вариантам осуществления треонин в положении 366 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всей полости. Согласно некоторым вариантам осуществления лейцин в положении 368 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всей полости. Согласно некоторым вариантам осуществления тирозин в положении 407 заменяют другим аминокислотным остатком для образования части или всей полости. Согласно некоторым вариантам осуществления исходный остаток для образования полости характеризуется большим объемом боковой цепи, например, тирозин, аргинин, фенилаланин или триптофан. Согласно другим вариантам осуществления исходный остаток выбирают из тирозина, треонина и лейцина. Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько остатков тирозина заменяют на цистеин или валин, остаток треонина заменяют на серин, а остаток лейцина заменяют на аланин. Согласно другим вариантам осуществления аминокислотные замены содержат Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация EU). Вся нумерация соответствует Edelman, Gerald M. et al. PNAS 63(1) (1969): 78-85.

[066] Используемый в настоящем документе термин «исходный» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который заменен «импортным» остатком, который может характеризоваться меньшим или большим объемом боковой цепи, чем исходный остаток. Импортный аминокислотный остаток может представлять собой встречающийся в природе или не встречающийся в природе аминокислотный остаток, но предпочтительно является встречающимся. «Встречающиеся в природе» аминокислотные остатки представляют собой остатки, кодируемые генетическим кодом. Под «не встречающимся в природе» аминокислотным остатком подразумевается остаток, который не кодируется генетическим кодом, но который способен ковалентно связывать соседний аминокислотный остаток(остатки) в полипептидной цепи. Примерами не встречающихся в природе аминокислотных остатков являются норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как описанные в Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991), например. Для получения таких не встречающихся в природе аминокислотных остатков, могут применяться процедуры Noren et al. Science 244: 182 (1989) и Ellman et al., смотрите выше. Вкратце, это включает в себя химическую активацию супрессорной тРНК не встречающимся в природе аминокислотным остатком с последующей транскрипцией in vitro и трансляцией РНК. Способ по настоящему изобретению включает замену по меньшей мере одного исходного аминокислотного остатка, но можно заменить более одного исходного остатка. Как правило, не более чем все остатки на поверхности контакта первого или второго полипептида будут содержать исходные аминокислотные остатки, которые заменяются. Предпочтительные исходные остатки для замены являются «погруженными». Под «погруженными» подразумевается, что остаток по существу недоступен для растворителя. Согласно некоторым вариантам осуществления импортный остаток не является цистеином для предотвращения возможного окисления или неправильного связывания дисульфидных связей.

[067] Выступ «устанавливается» в полости, что означает, что пространственное расположение выступа и полости на поверхности контакта первого полипептида и второго полипептида, соответственно, а также размеры выступа и полости таковы, что выступ может быть расположен в полости без значительного нарушения нормальной ассоциации первого и второго полипептидов на поверхности контакта. Поскольку выступы, содержащие одну из нескольких аминокислот, такие как, без ограничения, Cys, Tyr, Phe и Trp, как правило, не проходят перпендикулярно от оси поверхность контакта и характеризуются предпочтительными конформациями, выравнивание выступа с соответствующей полостью зависит от моделирования пары выступ/полость на основе трехмерной структуры, такой как структура, полученная с помощью рентгеновской кристаллографии или ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Это может быть достигнуто с использованием общепринятых в технике способов.

[068] «Исходная нуклеиновая кислота» представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес полипептид, который может быть «изменен» (т.е. генетически модифицирован или мутирован) для кодирования выступа или полости. Исходная или стартовая нуклеиновая кислота может представлять собой встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту или может содержать нуклеиновую кислоту, которая была подвергнута предварительному изменению (например, фрагмент гуманизированного антитела). Под «изменением» нуклеиновой кислоты подразумевается, что исходная нуклеиновая кислота мутирует путем вставки, делеции или замены по меньшей мере одного кодона, кодирующего представляющий интерес аминокислотный остаток. Как правило, кодон, кодирующий исходный остаток, заменяется кодоном, кодирующим импортный остаток. Способы генетической модификации ДНК таким образом были рассмотрены в публикации Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991) и включают сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез и мутагенез полимеразной цепной реакцией (ПЦР), например.

[069] Выступ или полость могут быть «введены» в поверхность контакта первого или второго полипептида синтетическими средствами, например, с помощью рекомбинантных технологий, синтеза пептидов in vitro, тех способов введения не встречающихся в природе аминокислотных остатков, которые были описаны ранее, путем ферментативного или химического сочетания пептидов или некоторой комбинации этих способов. Соответственно, выступ или полость, которые «вводятся», являются «не встречающимися в природе» или «ненативными», что означает, что они не существуют в природе или в исходном полипептиде (например, гуманизированном моноклональном антителе).

[070] Предпочтительно импортный аминокислотный остаток для образования выступа содержит относительно небольшое количество «ротамеров» (например, приблизительно 3-6). «Ротамер» представляет собой энергетически выгодную конформацию боковой цепи аминокислоты. Количество ротамеров различных аминокислотных остатков приведено в Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).

[071] Используемый в настоящем документе термин «выступ-во-впадину» относится к архитектуре полипептида, требующей выступа на поверхности контакта первого полипептида и соответствующей полости (или «впадины») на поверхности контакта второго полипептида, так что выступ может быть расположена в полости, чтобы способствовать образованию гетеродимера. Выступы могут быть созданы путем замещения небольших аминокислотных боковых цепей на поверхности контакта первого полипептида более крупными боковыми цепями (например, фенилаланином или тирозином). Полости идентичного или сходного размера с выпуклостями могут быть созданы на поверхности контакта второго полипептида путем замещения больших боковых цепей аминокислот меньшими (например, аланином или треонином). Выступы и полости могут быть получены синтетическими способами, такими как изменение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, или синтезом пептидов с использованием рутинных способов специалистом в настоящей области техники. Согласно некоторым вариантам осуществления поверхность контакта первого полипептида расположена в домене Fc в первом полипептиде, а поверхность контакта второго полипептида расположена в домене Fc во втором полипептиде. Гетеродимеры с «выступом-во-впадину» и способы их получения и применения описаны в патентах США №5731168; 5807706; 5821333; 7642228; 7695936; 8216805 и 8679785; и в публикации Merchant et al., Nature Biotechnology, 1998, 16: 677-681, все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[072] Используемый в настоящем документе термин «выделенный» гетеродимер означает гетеродимер, который был идентифицирован и отделен и/или извлечен из компонента его естественной среды для культивирования клеток. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению гетеродимера, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворы. Согласно предпочтительным вариантам осуществления гетеродимер будет очищен (1) до более чем 95 мас.% белка, как определено способом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или серебром.

[073] Под «наносферой», «NP» или «наночастицей» в настоящем документе подразумевается небольшая дискретная частица, которую вводят индивидуально или множественно субъекту, образцу клетки или образцу ткани, в зависимости от ситуации. Согласно определенным вариантам осуществления используемый в настоящем документе термин «наночастица» включает в себя любые слои вокруг ядра наночастицы. Согласно определенным вариантам осуществления наночастицы характеризуются по существу сферической формой. Согласно определенным вариантам осуществления наночастица не является липосомой или вирусной частицей. Согласно другим вариантам осуществления наночастица состоит из любого подходящего материала, например, твердого вещества, твердого ядра, металла, дендримера, полимерной мицеллы, оксида металла или белка или фрагмента или их комбинаций. Используемый в настоящем документе термин «по существу сферический» означает, что форма частиц не отклоняется от сферы более чем на 10%. Различные известные антигенные или пептидные комплексы по настоящему изобретению могут быть применены к частицам. Наночастицы по настоящему изобретению характеризуются размером от приблизительно 1 нм до приблизительно 1 мкм, от приблизительно 1 нм до приблизительно 500 нм или, альтернативно, от приблизительно 1 нм до приблизительно 100 нм, или, альтернативно, от приблизительно 1 нм до приблизительно 50 нм, или, альтернативно, от приблизительно 5 нм до приблизительно 100 нм, и согласно некоторым аспектах относится к среднему или среднему диаметру множества наночастиц, когда предполагается множество наночастиц. Более мелкие наноразмерные частицы могут быть получены, например, с помощью процесса фракционирования, в результате чего более крупные частицы могут осесть в водном растворе. Верхнюю часть раствора затем извлекают способами, известными специалистам в настоящей области техники. Эта верхняя часть обогащена частицами меньшего размера. Процесс может повторяться до тех пор, пока не будет получен желаемый средний размер. Термин «наноструктура», как правило, используется для описания структур размером менее чем 1 мкм.

[074] Комплекс антиген-MHC-наночастица («NP-комплекс» или «комплекс» или pMHC-NP или «комплекс наночастиц») относится к презентации пептида, углевода, липида или другого антигенного сегмента, фрагмента или эпитопа антигенной молекулы или белка (т.е. аутопептид или аутоантиген) на поверхности, такой как ядро наночастицы.

[075] «Ядро наночастиц» представляет собой подложку наночастиц, которая включает в себя слои или покрытия или не включает в себя их. Комплекс наночастиц содержит ядро по меньшей мере с комплексом антиген-МНС, связанным с ядром.

[076] «Плотность», когда речь идет о pMHC на наночастицу, рассчитывается как площадь поверхности ядра наночастицы с внешними слоями или без них, которые также могут включать в себя линкеры. Площадь поверхности представляет собой общую доступную площадь поверхности используемой конструкции. Согласно одному аспекту, когда используют ПЭГ-линкер, это может увеличить общий диаметр ядра наночастицы приблизительно на 20 нм² наночастицы, что увеличивает площадь поверхности соответственно общей доступной площади поверхности наночастицы. Другими словами, это конечная площадь поверхности наночастицы без добавления одного или нескольких из pMHC, костимулирующих молекул и/или цитокинов.

[077] «Антиген» в контексте настоящего документа относится ко всей части, фрагменту или сегменту молекулы, которая может индуцировать иммунный ответ у субъекта или экспансию иммунной клетки, предпочтительно Т- или В-клетки.

[078] Используемый в настоящем документе термин «относящийся к заболеванию» антиген относится к антигену или его фрагменту, выбранному для лечения выбранного заболевания и участвующему в процессе заболевания. Например, относящийся к сахарному диабету антиген представляет собой антиген или его фрагмент, который, когда он представлен, вызывает иммунный ответ, который служит для лечения сахарного диабета; таким образом, относящийся к сахарному диабету антиген, производящий такой эффект, выбирают для лечения сахарного диабета. Антиген, относящийся к рассеянному склерозу (MS), выбирают для лечения MS. Относящийся к сахарному диабету антиген не будет выбран для лечения MS. Аналогично, относящийся к аутоиммунитету антиген представляет собой антиген, который имеет отношение к аутоиммунному заболеванию и не может быть выбран для лечения нарушения или заболевания, отличного от аутоиммунитета, например, рака. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к заболеванию антигены раскрыты в настоящем документе, и, кроме того, такие антигены могут быть определены для конкретного заболевания на основе техник, механизмов и способов, документированных в литературе.

Гетеродимеры MHC класса II и архитектура «выступ-во-впадине»

[079] Экспрессия молекул МНС класса II была затруднена, поскольку секретируемые α- и β-цепи МНС класса II, лишенные трансмембранного и цитоплазматического доменов, не образуют стабильных гетеродимеров даже в присутствии пептидного лиганда. Трансмембранные области α- и β-цепей MHC класса II способствуют правильной сборке гетеродимера αβ предположительно благодаря взаимодействию двух α-спиральных трансмембранных сегментов.

[080] В настоящее время уровень техники заключается в получении рекомбинантных молекул pMHC класса II для производства тетрамеров pMHC с использованием лейциновой молнии. Это также справедливо для предприятия по производству тетрамеров NIH и коммерческих поставщиков тетрамеров pMHC.

[081] Этот подход, однако, предлагает свои собственные ограничения в качестве платформы для построения мономеров pMHC класса II для производства относящихся к заболеванию соединений наночастиц pMHC класса II: 1) вероятность того, что последовательности jun/fos могут быть распознаны как «чужеродные» и, таким образом, являются иммуногенными для индивидуумов, подвергнутых лечению pMHC-наночастицами, которые могут потенциально ограничивать терапевтическую активность, особенно после многократного введения; 2) хроматографическое отделение комплексов pMHC от супернатантов эукариотической клеточной культуры (т.е. яичника китайского хомячка -CHO-) затруднено, если метки аффинного разделения не введены в комплекс pMHC; и 3) аффинные метки также являются проблематичными из-за антигенности аффинных меток, таких как FLAG или 6xHIS. Из-за возможности антигенности и их потенциального широкого применения при очистке различных белков эти метки не подходят для применения с человеческими терапевтическими средствами. К сожалению, добавление аффинных меток к этим белкам может вызвать производство антител к лекарственным средствам (ADA).

[082] В настоящем документе согласно одному аспекту предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие по меньшей мере один первый полипептид и по меньшей мере один второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию.

[083] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который может быть расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II или их комбинацию или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II, домен β2 МНС класса II или их комбинацию, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II, домен α2 МНС класса II или их комбинацию.

[084] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены выделенные гетеродимеры, содержащие первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид и второй полипептид встречаются на поверхности контакта, причем поверхность контакта первого полипептида содержит сконструированный выступ, который расположен в сконструированной полости на поверхности контакта второго полипептида; и (i) первый полипептид содержит домен α1 МНС класса II и домен α2 МНС класса II, а второй полипептид содержит домен β1 MHC класса II и домен β2 MHC класса II или (ii) первый полипептид содержит домен β1 МНС класса II и домен β2 МНС класса II, а второй полипептид содержит домен α1 МНС класса II и домен α2 МНС класса II.

[085] Согласно некоторым вариантам осуществления каждый первый полипептид и второй полипептид содержат домен С_Н3 антитела и взаимодействуют через домены С_Н3. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид, каждый, содержат домен С_Н2 антитела и взаимодействуют через домены С_Н2. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый первый полипептид и второй полипептид содержат домен С_Н2 и домен С_Н3 антитела и взаимодействуют через домены С_Н2, домены С_Н3 или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид, каждый, содержат домен C_H2 и домен C_H3 антитела и взаимодействуют через домены C_H3. Согласно некоторым вариантам осуществления домен C_H3 происходит от IgG. Согласно некоторым вариантам осуществления домен C_H2 происходит от IgG. IgG может быть подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления IgG относится к подтипу IgG1.

[086] Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат C-концевой остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат C-концевой остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид или второй полипептид дополнительно содержат C-концевой остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид дополнительно содержит C-концевой остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления второй полипептид дополнительно содержит C-концевой остаток цистеина.

[087] Биотинилирование pMHC через BirA представляет собой технику, как правило, используемую для получения биотинилированных мономеров pMHC, подходящих для тетрамеризации с использованием стрептавидина. Такие тетрамеры pMHC и их производные высшего порядка (пентамеры, декстрамеры или другие мультимеры) применимы в качестве реагентов, способных подсчитывать частоту антиген-специфических Т-клеток в биологических образцах. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид или второй полипептид дополнительно содержат сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид дополнительно содержит сайт биотинилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления второй полипептид дополнительно содержит сайт биотинилирования.

[088] Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и/или второй полипептид дополнительно содержат метку Strep. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид и второй полипептид дополнительно содержат метку Strep. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид или второй полипептид дополнительно содержат метку Strep. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид дополнительно содержит метку Strep. Согласно некоторым вариантам осуществления второй полипептид дополнительно содержит метку Strep.

[089] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер дополнительно содержит лейциновую молнию. Согласно некоторым вариантам осуществления первый полипептид содержит фрагмент C-Jun, а второй полипептид содержит фрагмент C-Fos. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер не содержит лейциновой молнии.

[090] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер лишен посторонних последовательностей белков, которые могут быть мишенью иммунореактивности, таких как последовательность биотинилирования, на которую нацеливается фермент BirA, чтобы присоединить молекулу биотина или метку эпитопа/аффинности/очистки (например, c-Myc, FLAG, V5, полигистидин, 6xHIS и т.д.). Часто димеры МНС получают с использованием гетерологичных доменов димеризации. Некоторые примеры включают в себя лейциновые молнии (димеры Fos/Jun, Acid-p1/Base-p1 или GCN4), димеры белка иммунитета к колицину E9/E9-ДНКазы или димеры домена T1 Kv1.2. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер лишен домена димеризации, отличного от архитектуры «выступ-во-впадину». Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер лишен домена димеризации лейциновой молнии. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный гетеродимер лишен доменов димеризации c-FOS/c-JUN.

[091] Согласно некоторым вариантам осуществления домен α1 MHC класса II и домен α2 MHC класса II, и домен β1 MHC класса II, и домен β2 MHC класса II гетеродимера происходят от молекулы лейкоцитарного антигена (HLA), такой как HLA-DR, HLA-DQ или HLA-DP. Согласно некоторым вариантам осуществления домен α1 MHC класса II и домен α2 MHC класса II получены из DRA, DQA1 или DPA1. Согласно определенным вариантам осуществления домен α1 МНС класса II или домен α2 МНС класса II получены из DRA, DQA1 или DPA1. Согласно некоторым вариантам осуществления домен β1 MHC класса II и β2 MHC класса II получены из HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 или HLA-DPB1. Согласно некоторым вариантам осуществления домен β1 MHC класса II или β2 MHC класса II получены из HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 или HLA-DPB1.

[092] Согласно некоторым вариантам осуществления два или более гетеродимеров ковалентно связаны друг с другом через полимерный остов, образуя мультимер. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный остов представляет собой декстран или полиэтиленгликоль. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из полипептидов в гетеродимере присоединен к остову полимера. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из полипептидов в гетеродимере присоединен к полимерному остову через концевой остаток цистеина на каждом из полипептидов. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из полипептидов в гетеродимере присоединен к полимерному остову через сайт биотинилирования на каждом из полипептидов.

[093] Согласно некоторым вариантам осуществления два гетеродимера ковалентно связаны друг с другом через авидин с образованием мультимера.

Антигены

[094] Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе гетеродимеры дополнительно содержат антиген. Согласно определенным вариантам осуществления антиген представляет собой полипептидный антиген, который составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более аминокислот в длину, и согласно некоторым вариантам осуществления длиной не более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 100 аминокислот. Согласно определенным вариантам осуществления антиген представляет собой относящийся к заболеванию антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген представляет собой относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген. Согласно определенным вариантам осуществления антиген представляет собой относящийся к воспалительному заболеванию антиген. Описанные в настоящем документе антигены соединены с N-концом полипептида MHC класса IIα или MHC класса IIβ. Согласно определенным вариантам осуществления антигены соединены гибким пептидным линкером. Линкер может, например, представлять собой полипептидный линкер и содержать глицин и серин.

[095] Согласно определенным вариантам осуществления антиген представляет собой относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой относящийся к сахарному диабету I типа, рассеянному склерозу, глютеиновой болезни, первичному билиарному циррозу, аутоиммунному гепатиту, первичному склерозирующему холангиту, пузырчатке, пузырчатке листовидной, пузырчатке обыкновенной, нейромиелиту зрительного нерва со спектральным расстройством, артриту (включая в себя ревматоидный артрит), аллергической астме, воспалительным заболеваниям кишечника (включая в себя болезнь Крона и язвенный колит), системной красной волчанке, атеросклерозу, хронической обструктивной болезни легких, эмфиземе, псориазу, аутоиммунному гепатиту, увеиту, синдрому Шегрена, склеродермии, антифосфолипидному синдрому, ANCA-ассоциированному васкулиту или синдрому мышечной скованности антиген. Согласно дополнительному аспекту относящийся к заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к опухоли или раку. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к сахарному диабету I типа. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к рассеянному склерозу. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к ревматоидному артриту. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к болезни Крона. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, связанный с неспецифическим язвенным колитом. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к глютеиновой болезни. Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к аутоиммунному заболеванию антиген представляет собой антиген, относящийся к аутоиммунному заболеванию гепатобилиарной системы. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген, относящийся к аутоиммунному заболеванию гепатобилиарной системы, представляет собой относящийся к первичному билиарному циррозу, аутоиммунному гепатиту или первичному склерозирующему холангиту антиген. Согласно определенным вариантам осуществления антиген получают из микроба желудочно-кишечного тракта. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген, полученный из микроба желудочно-кишечного тракта, представляет собой флагеллин, Fla-2, Fla-X, неохарактеризованный белок E.coli (YIDX) или интегразу бактероидов. Согласно определенным вариантам осуществления антиген представляет собой пищевой антиген. Согласно определенным вариантам осуществления пищевой антиген представляет собой глиадин. Согласно определенным вариантам осуществления пищевой антиген представляет собой овальбумин. Согласно определенным вариантам осуществления пищевой антиген представляет собой полученный из арахиса антиген.

Цистеиновое улавливание

[096] Цистеиновая ловушка может быть использована для стабилизации описанного в настоящем документе гетеродимера. Цистеиновое улавливание включает образование ковалентно связанных полипептидных комплексов из несвязанных полипептидных партнеров. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновое улавливание включает введение цистеина в стратегически выбранном положении в области взаимодействия полипептидных партнеров для образования стабилизированного полипептидного комплекса. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновое улавливание может стабилизировать полипептидный комплекс, чтобы способствовать определенной конформации и предотвращать диссоциацию. Цистеиновое улавливание также называют дисульфидным улавливанием и дисульфидным сшиванием. Примеры способов и применений цистеинового улавливания рассмотрены в Kufareva, et al., Methods Enzymol. 570: 389-420 (2016). В контексте MHC цистеин встраивают в полипептид, который, как известно или предположительно, связывается в связывающей борозде димера MHC класса II. Цистеин затем вводят в связывающую борозду или недалеко от нее, так что когда полипептид связывается со связывающей бороздой, цистеин связывающей борозды может приближаться и образовывать дисульфидную связь с цистеином полипептида.

[097] Для применения цистеиновой ловушки требуется, чтобы два цистеина были встроены в полипептиды, которые составляют гетеродимеры. Первый цистеин представляет собой «цистеин связывающей борозды», который находится внутри или рядом с бороздой MHC класса II. Цистеин связывающей борозды может находиться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот от связывающей борозды. Цистеин может быть расположен либо на альфа-, либо на бета-цепях, а также на N- или C-конце связывающей борозды. Второй цистеин представляет собой «цистеин полипептида», который находится внутри или вблизи антигенного полипептида, который связывается в связывающей борозде. Цистеин полипептида может находиться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот антигенного полипептида. Цистеин полипептида может находиться на N- или C-конце антигенного полипептида. Как правило, антигенный полипептид присоединяется либо к альфа-цепи, либо к бета-цепи гибким линкером, и между линкером и антигенным полипептидом располагается цистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления структура полипептидной цепи представляет собой антигенный полипептид-цистеин полипептида-линкер-домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления структура полипептидной цепи представляет собой антигенный полипептид-цистеин полипептида-линкер-домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления структура полипептидной цепи представляет собой цистеин полипептида-антигенный полипептид-линкер-домен α1 MHC класса II, домен α2 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления структура полипептидной цепи представляет собой цистеин полипептида-антигенный полипептид-линкер-домен β1 MHC класса II, домен β2 MHC класса II. Эти полипептиды MHC класса II могут дополнительно содержать домен C_H2 и C_H3 со сконструированным выступом на одном полипептиде и домен C_H2 и C_H3 со сконструированной впадиной на другом полипептиде. В некоторых случаях антигенный полипептид может содержать встречающийся в природе цистеин, что исключает необходимость добавления остатка цистеина.

[098] Согласно некоторым вариантам осуществления полипептиды описанных в настоящем документе гетеродимеров содержат одну или несколько мутаций для введения цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться в альфа-цепи МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться в бета-цепи МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться в домене α1 MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться в домен β1 МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться рядом со связывающей бороздой, которая образована между цепями α1 и β1 MHC класса II на одной или обеих цепях альфа и бета. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может быть в полипептидном антигене, который связан со связывающей бороздой. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может быть на N-конце антигенного полипептида, который связывается со связывающей бороздой. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может происходить на С-конце антигенного полипептида, который связывается со связывающей бороздой. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на N-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на N-конце связывающей борозды, расположенной на альфа-цепи MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на N-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на C-конце связывающей борозды, расположенной на альфа-цепи MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на С-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на N-конце связывающей борозды, расположенной на альфа-цепи МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на С-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде МНС, и остатком на С-конце связывающей борозды, расположенной на альфа-цепи МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на N-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на N-конце связывающей борозды, расположенной в бета-цепи MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на N-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на C-конце связывающей борозды, расположенной на бета-цепи MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на С-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде MHC, и остатком на N-конце связывающей борозды, расположенной на бета-цепи MHC класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления цистеиновая ловушка может быть образована между остатком цистеина на С-конце антигенного пептида, который связывается в связывающей борозде МНС, и остатком на С-конце связывающей борозды, расположенной на бета-цепи МНС класса II. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация может находиться в полипептиде связывающего ядра. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация включает замену аминокислотного остатка на цистеин. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация включает добавление остатка цистеина в рамке с другими остатками.

[099] Неограничивающие примеры полипептидов, которые содержат цистеиновую ловушку, включают в себя, без ограничения, полипептиды, указанные в SEQ ID NO: 60 и 61. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептиды для цистеинового улавливания содержат аминокислотную последовательность с идентичностью, составляющей по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% по отношению к полипептидам, указанным в любой из SEQ ID NO: 60 и 61. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация на цистеин может происходить в любом одном или нескольких остатках полипептидов, указанных в SEQ ID NO: 62 и 63. Согласно некоторым вариантам осуществления полипептиды для цистеинового улавливания содержит аминокислотную последовательность с идентичностью, составляющей по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% по отношению к полипептидами, указанными в любой из SEQ ID NO: 62 и 63. Согласно некоторым вариантам осуществления мутация на цистеин может быть в любом одном или нескольких остатках полипептидов, указанных в SEQ ID NO: 62 и 63.

Конъюгаты гетеродимер-наночастица

[0100] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и/или содержит твердое ядро. Согласно определенным вариантам осуществления твердое ядро может представлять собой металл или оксид металла. Согласно определенным вариантам осуществления твердое ядро может представлять собой железо, оксид железа или золото. Твердое ядро может представлять собой ядро высокой плотности, так что плотность превышает приблизительно 2,0 г/см³, приблизительно 3,0 г/см³, приблизительно 4,0 г/см³, приблизительно 5,0 г/см³, приблизительно 6,0 г/см³ или приблизительно 7,0 г/см³. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность твердого ядра составляет от приблизительно 4,0 г/см³ до приблизительно 8,0 г/см³. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность твердого ядра составляет от приблизительно 5,0 г/см³ до приблизительно 8,0 г/см³. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность твердого ядра составляет от приблизительно 5,0 г/см³ до приблизительно 7,0 г/см³. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность твердого ядра составляет от приблизительно 5,0 г/см³до приблизительно 6,0 г/см³.

[0101] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и содержит ядро из оксида железа.

[0102] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и содержит золотое ядро.

[0103] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и содержит ядро из оксида железа; и по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей через линкер.

[0104] Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрены конъюгаты гетеродимер-наночастица, содержащие по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и содержит ядро из оксида железа; и по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей через линкер, содержащий полиэтиленгликоль. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат гетеродимер-наночастица содержит по меньшей мере один описанный в настоящем документе гетеродимер и наночастицу, причем наночастица не является липосомальной и содержит ядро из оксида железа; и по меньшей мере один гетеродимер ковалентно связан с наночастицей через линкер, содержащий полиэтиленгликоль с молекулярной массой менее чем 500 дальтон. Согласно некоторым вариантам осуществления полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой менее чем 1 кДа, 2 кДа, 3 кДа, 4 кДа, 5 кДа, 6 кДа, 7 кДа, 8 кДа, 9 кДа или 10 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления полиэтиленгликоль функционализирован малеимидом. Согласно некоторым вариантам осуществления полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой от приблизительно 1 кДа до приблизительно 5 кДа, от приблизительно 2 кДа до приблизительно 5 кДа, от приблизительно 3 кДа до приблизительно 5 кДа. Согласно некоторым вариантам осуществления полиэтиленгликоль функционализирован малеимидом. Согласно некоторым вариантам осуществления конец линкера, который находится в контакте с твердым ядром, встроен в твердое ядро.

[0105] Согласно некоторым аспектам ядро наночастицы характеризуется диаметром, выбранным из группы от приблизительно 1 нм до приблизительно 100 нм; от приблизительно 1 нм до приблизительно 75 нм; от приблизительно 1 нм до приблизительно 50 нм; от приблизительно 1 нм до приблизительно 25 нм; от приблизительно 1 нм до приблизительно 25 нм; от приблизительно 5 нм до приблизительно 100 нм; от приблизительно 5 нм до приблизительно 50 нм; от приблизительно 5 нм до приблизительно 25 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 25 нм или от приблизительно 5 нм до приблизительно 20 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления ядро наночастиц характеризуется диаметром от приблизительно 25 нм до приблизительно 60 нм, от приблизительно 25 нм до приблизительно 50 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 40 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 50 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 40 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 35 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 30 нм или от приблизительно 15 нм до приблизительно 25 нм, альтернативно, приблизительно 15 нм, приблизительно 20 нм, приблизительно 25 нм, приблизительно 30 нм приблизительно 35 нм или приблизительно 40 нм.

[0106] Согласно некоторым аспектам количество pMHC на ядро наночастицы (называемое в настоящем документе «валентностью» комплекса наночастиц) может варьировать от приблизительно 1 комплекса pMHC на 1 ядро наночастицы до приблизительно 6000 комплексов pMHC на 1 ядро наночастицы, альтернативно, от приблизительно 10:1 до приблизительно 6000:1, альтернативно, от приблизительно 11:1 до приблизительно 6000:1, альтернативно, от приблизительно 12:1 до приблизительно 6000:1, альтернативно, по меньшей мере 2:1, альтернативно, по меньшей мере 8:1, альтернативно, по меньшей мере 9:1, альтернативно, по меньшей мере 10:1, альтернативно, по меньшей мере 11:1 или, альтернативно, по меньшей мере 12:1. Согласно некоторым вариантам осуществления количество pMHC на ядро наночастицы составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 6000:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 5500:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до приблизительно 5000:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до 4000:1, альтернативно, от 10:1 до 3500:1, альтернативно, от 10:1 до 3000:1, альтернативно, от 10:1 до 2500:1, альтернативно, от 10:1 до приблизительно 2000:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до приблизительно 1500:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до 1000:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до приблизительно 500:1, альтернативно, от приблизительно 10:1 до приблизительно 100:1, альтернативно, от приблизительно 20:1 до приблизительно 50:1, альтернативно, от приблизительно 25:1 до приблизительно 60:1; альтернативно, от приблизительно 30:1 до приблизительно 50:1, альтернативно, от приблизительно 35:1 до приблизительно 45:1 или, альтернативно, приблизительно 40:1. Согласно некоторым вариантам осуществления количество pMHC на ядро наночастицы составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 100:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 110:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 120:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 130:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 140:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 150:1 или от приблизительно 10:1 до приблизительно 160:1. Согласно некоторым вариантам осуществления количество pMHC на ядро наночастицы составляет от приблизительно 30:1 до приблизительно 100:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 110:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 120:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 130:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 140:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 150:1 или от приблизительно 30:1 до приблизительно 160:1. Согласно некоторым вариантам осуществления количество pMHC на ядро наночастицы составляет от приблизительно 32:1 до приблизительно 100:1, от приблизительно 32:1 до приблизительно 110:1, от приблизительно 32:1 до приблизительно 120:1, от приблизительно 30:1 до приблизительно 130:1, от приблизительно 32:1 до приблизительно 140:1, от приблизительно 32:1 до приблизительно 150:1 или от приблизительно 32:1 до приблизительно 160:1.

[0107] В некоторых аспектах ядро из наночастиц характеризуется определенной валентностью на площадь поверхности ядра, также называемую в настоящем документе «плотностью». Согласно этим аспектам плотность pMHC на наночастицу составляет от приблизительно 0,025 pMHC/100 нм² до приблизительно 100 pMHC/100 нм² площади поверхности ядра наночастицы, альтернативно, от приблизительно 0,406 рМНС/100 нм² до приблизительно 50 рМНС/100 нм² или, альтернативно, от приблизительно 0,05 рМНС/100 нм² до приблизительно 25 рМНС/100 нм². Согласно определенным аспектам плотность pMHC на наночастицу составляет от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 25 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 20 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 15 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 14 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 13 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 12 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 11,6 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 11,5 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 11 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до 10 мкМ/100 нм², от приблизительно 0,4 мкМ/100 нм² до приблизительно 9 мкМ/100 нм², от приблизительно 0,4 мкМ/100 нм² до приблизительно 8 мкМ/100 нм², от приблизительно 0,4 мкМ/100 нм² до приблизительно 7 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 6 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 5 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 pMHC/100 нм² до приблизительно 4 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 3 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 2,5 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 2 рМНС/100 нм² или от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,5 рМНС/100 нм².

[0108] Согласно другому аспекту наночастица может характеризоваться плотностью pMHC от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 10 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 9 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 8 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 7 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 6 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 5 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,22 pMHC/100 нм² до приблизительно 4 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,22 pMHC/100 нм² до приблизительно 3 pMHC/100 нм², от приблизительно 0,22 pMHC/100 нм² до приблизительно 2 pMHC/100 нм² или от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,5 рМНС/100 нм². Согласно некоторым аспектам наночастица характеризуется плотностью pMHC от приблизительно 0,22 рМНС/100 нм² до приблизительно 10 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,24 рМНС/100 нм² до приблизительно 9 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,26 рМНС/100 нм² до приблизительно 8 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,28 рМНС/100 нм² до приблизительно 7 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,24 рМНС/100 нм² до приблизительно 4 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,5 рМНС/100 нм² до приблизительно 3 рМНС/100 нм² или от приблизительно 0,6 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,5 рМНС/100 нм². Согласно дополнительному аспекту наночастица характеризуется плотностью pMHC от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,3 рМНС/100 нм², альтернативно, от приблизительно 0,5 рМНС/100 нм² до приблизительно 0,9 рМНС/100 нм² или, альтернативно, от приблизительно 0,6 рМНС/100 нм² до приблизительно 0,8 рМНС/100 нм².

[0109] Согласно некоторым вариантам осуществления наночастица может характеризоваться плотностью pMHC приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 или 12,0 рМНС/100 нм². Согласно конкретным вариантам осуществления наночастица может характеризоваться плотностью pMHC от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,5 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 2,5 рМНС/100 нм², от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 6 рМНС/100 нм² или от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 12 рМНС/100 нм².

[0110] Согласно еще одному аспекту наночастица характеризуется плотностью pMHC, как определено в настоящем документе, от приблизительно 0,4 рМНС/100 нм² до приблизительно 1,3 рМНС/100 нм², альтернативно, от приблизительно 0,5 рМНС/100 нм² до приблизительно 0,9 рМНС/100 нм² или, альтернативно, от приблизительно 0,6 рМНС/100 нм² до приблизительно 0,8 рМНС/100 нм² и, кроме того, при этом ядро наночастицы составляет в диаметре от приблизительно 25 нм до приблизительно 60 нм, от приблизительно 25 нм до приблизительно 50 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 40 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 50 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 40 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 35 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 30 нм, от приблизительно 15 нм до приблизительно 25 нм, альтернативно, приблизительно 15 нм, приблизительно 20 нм, приблизительно 25 нм, приблизительно 30 нм, приблизительно 35 нм или приблизительно 40 нм, или приблизительно 50 нм.

Компоненты костимулирующей молекулы

[0111] Согласно определенным аспектам NP дополнительно содержат или, альтернативно, состоят по существу или кроме того состоят по меньшей мере из одной костимулирующей молекулы. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы, которые производят вторичный сигнал in vivo, который служит для активации наивных Т-клеток в антигенспецифические Т-клетки, способные вызывать иммунный ответ на клетки, обладающие указанным специфическим антигеном. Настоящее раскрытие не ограничено какой-либо конкретной костимулирующей молекулой. Различные костимулирующие молекулы хорошо известны в настоящей области техники. Некоторыми неограничивающими примерами костимулирующих молекул являются 4-IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L и ICOSL. Только одна конкретная костимулирующая молекула может быть связана с одной наночастицей или множество костимулирующих молекул может быть связано с одной и той же наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления костимулирующая молекула представляет собой белок, такой как антитело, который способен выступать в роли агониста для костимулирующего рецептора на Т-клетке. В этом случае антитело способно индуцировать костимулирующий сигнал, который необходим для активации наивных Т-клеток и индукции иммунного ответа антигенспецифическим образом. Дополнительно или альтернативно, используемый в настоящем документе термин «костимулирующая молекула» может также относиться к средству, способному производить костимулирующий сигнал, оказывая агонистическое действие на нативную костимулирующую сигнальную молекулу, например, анти-CD28 или лиганд CD28, производящий костимулирующий ответ CD28.

[0112] Согласно конкретным вариантам осуществления костимулирующими молекулами по настоящему изобретению может быть любая одна или несколько из следующих молекул B7-1/CD80, BTLA, B7-2/CD86, CD28, B7-H1/PD-L1, CTLA-4, B7-H2, Gi24/VISTA/B7-H5, B7-H3, ICOS, B7-H4, PD-1, B7-H6, PD-L2/B7-DC, B7-H7, PDCD6, LILRA3/CD85e, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, лиганд GITR/TNFSF18, лиганд 4-1BB/TNFSF9, HVEM/TNFRSF14, BAFF/BLyS/TNFSF13B, LIGHT/TNFSF14, BAFF R/TNFRSF13C, лимфотоксин-альфа/TNF-бета, CD27/TNFRSF7, OX40/TNFRSF4, лиганд CD27/TNFSF7, лиганд OX40/TNFSF4, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, лиганд CD30/TNFSF8, TACI/TNFRSF13B, CD40/TNFRSF5, TL1A/TNFSF15, лиганд CD40/TNFSF5, TNF-альфа, DR3/TNFRSF25, TNF RII/TNFRSF1B, GITR/TNFRSF18, 2B4/CD244/SLAMF4, CD84/SLAMF5, BLAME/SLAMF8, CD229/SLAMF3, CD2, CRACC/SLAMF7, CD2F-10/SLAMF9, NTB-A/SLAMF6, CD48/SLAMF2, SLAM/CD150, CD58/LFA-3, CD7, DPPIV/CD26, CD96, EphB6, CD160, интегрин альфа 4 бета 1, CD200, интегрин альфа 4 бета 7/LPAM-1, CD300a/LMIR1, LAG-3, CRTAM, TIM-1/KIM-1/HAVCR, DAP12, TIM-4, дектин-1/CLEC7A, TSLP R, ICOSL и/или их биологические эквиваленты.

[0113] Костимулирующая молекула может быть связана с наночастицей таким же образом, как комплекс pMHC. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения костимулирующая молекула и комплекс антиген/МНС отдельно присоединены к наночастице. Согласно другому варианту осуществления настоящего раскрытия костимулирующая молекула и комплекс pMHC сначала образуют комплекс вместе, а затем впоследствии образуют комплекс с наночастицей. Несколько костимулирующих молекул могут быть связаны с наночастицей; они могут быть кратны одной и той же костимулирующей молекуле или множеству разных костимулирующих молекул. Как правило, полипептидные комплексы добавляют к наночастицам с получением наночастиц с адсорбированными или связанными полипептидными комплексами, характеризующихся соотношением количества костимулирующих молекул к количеству наночастиц от приблизительно 1 до 6000 молекул на наночастицу или, альтернативно, по меньшей мере приблизительно или максимум приблизительно 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 или более к 1, и колеблется, как правило, от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 50:1. Согласно другому аспекту отношение костимулирующей молекулы к комплексу pMHC может составлять приблизительно от 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50 или более к 1, предпочтительно получают соотношение 1:1, 1:2, 1:9, 1:10, 1:100, 2:1, 9:1, 10:1 или 100:1 комплекса костимулирующей молекулы к pMHC. Аналогично, плотность костимулирующих молекул по отношению к площади поверхности наночастиц может быть рассчитана по той же относительной формуле, что и комплексов pMHC. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность костимулирующей молекулы на единицу площади поверхности наночастицы составляет от приблизительно 0,0022 костимулирующих молекул/100 нм² до приблизительно 13,26 костимулирующих молекул/100 нм². Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон плотности костимулирующих молекул может быть таким же или отличаться от диапазона плотности для комплексов pMHC.

[0114] Согласно некоторым вариантам осуществления, при которых наночастица содержит одну или несколько костимулирующих молекул и не содержит комплекса pMHC, наночастица характеризуется костимулирующей плотностью от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 6,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 6 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5,8 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5,75 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,25 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1 костимулирующей молекулы/100 нм² или от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,75 костимулирующей молекулы/100 нм².

[0115] Согласно другому аспекту наночастица может характеризоваться плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1 рМНС/100 нм² или от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,75 костимулирующей молекулы/100 нм². Согласно некоторым аспектам ядро наночастиц характеризуется плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,11 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,12 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,13 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,14 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,12 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,25 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм² или от приблизительно 0,3 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,75 костимулирующей молекулы/100 нм². Согласно дополнительному аспекту ядро наночастиц характеризуется плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,2 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,65 костимулирующей молекулы/100 нм², альтернативно, от приблизительно 0,25 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,45 костимулирующей молекулы/100 нм² или, альтернативно, от приблизительно 0,3 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм².

[0116] Согласно некоторым вариантам осуществления, при которых наночастица содержит комплекс pMHC и одну или несколько костимулирующих молекул, наночастица характеризуется плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 13 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 12 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 11,6 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 11,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 11 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 10 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² приблизительно 9 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 8 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 7 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 6 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующей молекулы/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2,5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2 костимулирующих молекул/100 нм² или от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм².

[0117] Согласно другому аспекту наночастица может характеризоваться плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 10 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 9 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 8 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 7 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 6 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 5 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 2 костимулирующих молекул/100 нм² или от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм². Согласно некоторым аспектам ядро наночастиц характеризуется плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,22 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 10 костимулирующих молекул/100 нм², 0,24 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 9 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,26 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 8 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,28 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 7 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,24 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 4 костимулирующих молекул/100 нм², от приблизительно 0,5 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 3 костимулирующих молекул/100 нм² или от приблизительно 0,6 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,5 костимулирующих молекул/100 нм². Согласно дополнительному аспекту наночастица характеризуется плотностью костимулирующих молекул от приблизительно 0,4 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 1,3 костимулирующих молекул/100 нм², альтернативно, от приблизительно 0,5 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,9 костимулирующей молекулы/100 нм² или, альтернативно, от приблизительно 0,6 костимулирующей молекулы/100 нм² до приблизительно 0,8 костимулирующей молекулы/100 нм².

[0118] Согласно одному аспекту наночастица содержит костимулирующую молекулу и не содержит какого-либо компонента пептид-МНС. Согласно некоторым вариантам осуществления этот комплекс наночастиц костимулирующих молекул смешивают с комплексом наночастиц пептид-MHC с образованием композиции, которая содержит две разные популяции наночастиц, одна из которых содержит только костимулирующие молекулы, а другая содержит только пептид-MHC. Эти две популяции могут быть смешаны в любом подходящем соотношении, включая в себя 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 или 1:9 содержащих костимулирующие молекулы наночастиц к содержащим пептид-MHC наночастицам или 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 содержащих пептид-MHC наночастиц к содержащим костимулирующие молекулы наночастицам.

Цитокины

[0119] Согласно определенным аспектам NP дополнительно содержат или, альтернативно, состоят по существу или еще дополнительно состоят по меньшей мере из одной молекулы цитокина. Используемый в настоящем документе термин «цитокин» охватывает низкомолекулярные белки, секретируемые различными клетками иммунной системы, которые действуют как сигнальные молекулы для регуляции широкого спектра биологических процессов в организме на молекулярном и клеточном уровнях. «Цитокины» включают в себя отдельные иммуномодулирующие белки, которые относятся к классу лимфокинов, интерлейкинов или хемокинов.

[0120] Неограничивающие примеры раскрыты в настоящем документе: например, IL-1A и IL-1B представляют собой два различных представителя семейства интерлейкинов-1 (IL-1) человека. Зрелый IL-1A представляет собой белок 18 кДа, также известный как фактор, активирующий фибробласты (FAF), фактор, активирующий лимфоциты (LAF), фактор, активирующий В-клетки (BAF), эндогенный медиатор лейкоцитов (LEM) и т.д. IL-4 представляет собой цитокин, который индуцирует дифференцировку клеток Т-хелперов-2 (Th2) и тесно связан с IL-13 и выполняет схожие функции. IL-5 производится Th2-клетками и тучными клетками. Он стимулирует рост В-клеток и увеличивает секрецию иммуноглобулина. Он также участвует в активации эозинофилов. IL-6 представляет собой интерлейкин, который может действовать как провоспалительный или противовоспалительный цитокин. Он секретируется Т-клетками и макрофагами для стимуляции иммунного ответа на травму или другое повреждение ткани, приводящее к воспалению. IL-6 также вырабатывается мышцами в ответ на их сокращение. IL-8 представляет собой хемокин, производимый макрофагами и другими типами клеток, такими как эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки, и действует как важный медиатор иммунной реакции в ответе врожденной иммунной системы. IL-12 участвует в дифференцировке наивных Т-клеток в Т-хелперные (Th1 или Th2) клетки. Как гетеродимерный цитокин, IL-12 образуется после того, как две субъединицы, кодируемые двумя отдельными генами, IL-12A (p35) и IL-12B (p40), димеризуются после синтеза белка. IL-12p70 указывает на этот гетеродимерный состав. IL-13, цитокин, секретируемый многими типами клеток, особенно клетками Th2, является важным медиатором аллергического воспаления и заболеваний. IL-17 представляет собой цитокин, производимый Т-хелперами, и индуцируется IL-23, что приводит к разрушительному повреждению тканей в реакциях замедленного типа. IL-17 функционирует как провоспалительный цитокин, который реагирует на вторжение внеклеточных патогенов в иммунную систему и вызывает разрушение клеточного матрикса патогена. IP-10 или индуцированный гамма-интерфероном белок 10 также известен как C-X-C мотив хемокина 10 (CXCL10) или цитокин B10 с малым индуцируемым действием. В качестве небольшого цитокина, принадлежащего к семейству хемокинов СХС, IP-10 секретируется несколькими типами клеток (включая в себя моноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) в ответ на IFN-γ. Воспалительные белки макрофагов (MIP) относятся к семейству хемокинов. Существуют две основные формы человеческого MIP, MIP-1α и MIP-1β, которые также известны как хемокиновый (C-C мотив) лиганд 3 (CCL3) и CCL4, соответственно. Оба производятся макрофагами после стимуляции бактериальными эндотоксинами. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF или GCSF), также известный как колониестимулирующий фактор 3 (CSF 3), представляет собой гормон колониестимулирующего фактора. G-CSF представляет собой гликопротеин, фактор роста и цитокин, производимый рядом различных тканей для стимуляции костного мозга с образованием гранулоцитов и стволовых клеток. G-CSF также стимулирует выживание, пролиферацию, дифференцировку и функцию предшественников нейтрофилов и зрелых нейтрофилов. Эпидермальный фактор роста или EGF представляет собой фактор роста, который играет важную роль в регуляции роста, пролиферации и дифференцировки клеток путем связывания с высокой аффинностью с его рецептором EGFR. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) представляет собой семейство факторов роста, которые являются важными сигнальными белками, участвующими как в васкулогенезе (образование de novo эмбриональной системы кровообращения), так и в ангиогенезе (рост кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой системы).

[0121] Цитокин или цитокины могут быть связаны с наночастицей таким же образом, как комплекс pMHC. Согласно одному варианту осуществления настоящего раскрытия цитокин или цитокины и комплекс pMHC отдельно прикреплены к наночастице. Согласно другому варианту осуществления настоящего раскрытия молекула цитокина или цитокинов и комплекс pMHC сначала образуют комплекс вместе, а затем впоследствии образуют комплекс с наночастицей. Множественные цитокины могут быть связаны с наночастицей; они могут представлять собой множество одних и тех же цитокинов или различных цитокинов.

[0122] Согласно некоторым вариантам осуществления цитокин образует комплекс с антителом к цитокину с образованием комплекса цитокин/антитело к цитокину, который впоследствии образует комплекс с наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления комплекс цитокин/антитело к цитокину включает в себя, без ограничения, комплексы IL-2/анти-IL-2. Комплексы IL-2/анти-IL-2 могут характеризоваться агонистическими свойствами или антагонистические свойствами.

[0123] Согласно некоторым вариантам осуществления цитокин образует комплекс с рецептором цитокинов с образованием комплекса цитокин/рецептор цитокина, который впоследствии образует комплекс с наночастицей. Согласно некоторым вариантам осуществления комплекс цитокин/рецептор цитокина включает в себя, без ограничения, IL15/IL-15Ra и/или IL-1/IL-2Ra. Согласно некоторым вариантам осуществления комплекс IL15/IL-15Ra может функционировать в качестве костимулятора.

[0124] Как правило, полипептидные комплексы добавляют к наночастицам для получения наночастиц с адсорбированными или связанными полипептидными комплексами, характеризующимися отношением количества цитокинов к количеству наночастиц от приблизительно 1 до 5999 молекул на наночастицу или, альтернативно, по меньшей мере приблизительно или максимум приблизительно 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 или более к 1 и варьировать в пределах, например, от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 50:1. Согласно другим аспектам отношение цитокина к комплексу антиген/МНС может составлять приблизительно от 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50 или более к 1, предпочтительно получают соотношение 1:1, 1:2, 1:9, 1:10, 1:100, 2:1, 9:1, 10:1 или 100:1 цитокина к комплексу антиген/МНС. Аналогично, плотность цитокинов относительно площади поверхности наночастиц может быть рассчитана по той же относительной формуле, что и комплексов антиген/МНС. Согласно некоторым вариантам осуществления плотность цитокинов на единицу площади поверхности наночастицы составляет от приблизительно 0,0022 цитокина/100 нм² до приблизительно 13,26 цитокинов/100 нм². Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон плотности цитокинов может быть таким же как диапазон плотности для комплексов антиген/МНС или отличаться от него.

[0125] Согласно одному аспекту наночастица содержит молекулу цитокина и не содержит какого-либо компонента пептид-МНС. Согласно некоторым вариантам осуществления этот комплекс наночастиц с молекулой цитокина смешивают с комплексом наночастиц с пептид-МНС с образованием композиции, которая включает в себя две разные популяции наночастиц, одна из которых содержит только молекулы цитокинов, а другая содержит только пептид-МНС. Эти две популяции могут быть смешаны в любом подходящем соотношении, включая в себя 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 содержащих молекулы цитокина наночастиц к содержащим пептид-MHC наночастицам или: 1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 содержащих пептид-MHC наночастиц к содержащим молекулы цитокина наночастицам.

Синтез NP

[0126] Наночастицы могут быть образованы путем контактирования водной фазы, содержащей костимулирующую молекулу(ы), комплекс pMHC и/или цитокин, а также полимер, и неводной фазы с последующим испарением неводной фазы, чтобы вызвать слияние частиц из водной фазы, как описано в патенте США № 4589330 или 4818542. Определенными полимерами для таких препаратов являются природные или синтетические сополимеры или полимеры, которые включают в себя желатин, агар, крахмал, арабиногалактан, альбумин, коллаген, полигликолевую кислоту, полимолочную кислоту, гликолид-L(-), лактид, поли(эпсилон-капролактон), поли(эпсилон-капролактон-CO-молочную кислоту), поли(эпсилон-капролактон-CO-гликолевую кислоту), поли(β-гидрокси-масляную кислоту), поли(этиленоксид), полиэтилен, поли(алкил-2-цианоакрилат), поли(гидроксиэтилметакрилат) , полиамиды, поли(аминокислоты), поли(2-гидроксиэтил DL-аспартам), поли(сложный эфир мочевины), поли(L-фенилаланин/этиленгликоль/1,6-диизоцианатогексан) и поли(метилметакрилат). В частности, определенными полимерами являются сложные полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-L(-), лактид, поли(эпсилон-капролактон), поли(эпсилон-капролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевая кислота). Растворители, применимые для растворения полимера, включают в себя: воду, гексафторизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или гексафторацетон сесквигидрат.

[0127] Наночастицы с золотом (GNP) синтезируют с использованием химического восстановления хлорида золота цитратом натрия, как описано (Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett 9: 1909-1915). Вкратце, 2 мл 1% HAuCl₄ (Sigma Aldrich) добавляют к 100 мл H₂O при интенсивном перемешивании и раствор нагревают на масляной бане. Шесть (для 14 нм GNP) или два мл (для 40 нм GNP) 1% цитрата Na добавляют к кипящему раствору HAuCl₄, который перемешивают в течение дополнительных 10 минут, а затем охлаждают до комнатной температуры. GNP стабилизируют добавлением 1 мкМ тиол-ПЭГ-линкеров (Nanocs, MA), функционализированных группами -COOH или -NH₂ в качестве акцепторов МНС. Пегилированные GNP промывают водой для удаления свободного тиол-ПЭГ, концентрируют и хранят в воде для дальнейшего анализа. Плотность NP определяют с помощью спектрофотометрии и рассчитывают по закону Бера.

[0128] Серии SFP NP с оксидом железа (SFP IONP) также могут быть получены тепловым разложением ацетата железа в органических растворителях в присутствии поверхностно-активных веществ, а затем превращением растворителя в водные буферы путем пегилирования (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826). Вкратце, 2 мМ Fe(acac)₃ (Sigma Aldrich, Oakville, ON) растворяют в смеси 10 мл бензилового эфира и олеиламина и нагревают до 100°С в течение 1 часа, затем при 300°С в течение 2 часов с обратным холодильником под защитой слоя азота. Синтезированные NP осаждают добавлением этанола и ресуспендируют в гексане. Для пегилирования IONP 100 мг различных линкеров DPA-PEG 3,5 кДа (JenKem Tech USA) растворяют в смеси CHCl₃ и HCON(CH₃)₂ (диметилформамид (DMF)). Затем раствор NP (20 мг Fe) добавляют к раствору DPA-PEG и перемешивают в течение 4 часов при комнатной температуре. Пегилированные SFP NP осаждают в течение ночи путем добавления гексана и затем ресуспендируют в воде. Следовые количества агрегатов удаляют с помощью высокоскоростного центрифугирования (20000 мкг, 30 мин), и монодисперсные SFP NP хранят в воде для дальнейшей характеристики и конъюгации pMHC. Концентрацию железа в продуктах IONP определяют спектрофотометрией при A410 в 2 н. HCL. На основании молекулярной структуры и диаметра SFP NP (Fe₃O₄; диаметр 8 ± 1 нм) (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014), по оценкам заявителя, растворы SFP, содержащие 1 мг железа, содержат 5 × 10¹⁴ NP.

[0129] Наночастицы также могут быть получены тепловым разложением или нагреванием предшественника наночастиц. Согласно одному варианту осуществления наночастица представляет собой наночастицу металла или оксида металла. Согласно одному варианту осуществления наночастица представляет собой наночастицу оксида железа. Согласно одному варианту осуществления наночастица представляет собой наночастицу золота. Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе представлены наночастицы, полученные в соответствии с настоящей технологией. Согласно одному варианту осуществления в настоящем документе предложен способ получения наночастиц оксида железа, включающий реакцию теплового разложения ацетилацетоната железа. Согласно одному варианту осуществления полученная наночастица оксида железа является водорастворимой. Согласно одному аспекту наночастица оксида железа является подходящей для конъюгации белка. Согласно одному варианту осуществления способ включает одностадийную реакцию теплового разложения.

[0130] Согласно одному аспекту тепловое разложение происходит в присутствии функционализированных молекул ПЭГ.

[0131] Согласно одному аспекту тепловое разложение включает нагревание ацетилацетоната железа. Согласно одному варианту осуществления тепловое разложение включает нагревание ацетилацетоната железа в присутствии функционализированных молекул ПЭГ. Согласно одному варианту осуществления тепловое разложение включает нагревание ацетилацетоната железа в присутствии бензилового эфира и функционализированных молекул ПЭГ.

[0132] Без ограничения теорией согласно одному варианту осуществления функционализированные молекулы ПЭГ используются в качестве восстанавливающих реагентов и в качестве поверхностно-активных веществ. Предлагаемый в настоящем документе способ изготовления наночастиц упрощает и улучшает обычные способы, в которых используются поверхностно-активные вещества, которые трудно смещать или которые не смещаются до завершения молекулами ПЭГ, чтобы сделать частицы водорастворимыми. Как правило, поверхностно-активные вещества могут быть дорогими (например, фосфолипиды) или токсичными (например, олеиновая кислота или олеиламин). Согласно другому аспекту без ограничения теорией способ получения наночастиц устраняет необходимость применения обычных поверхностно-активных веществ, тем самым достигая высокой степени молекулярной чистоты и растворимости в воде.

[0133] Согласно одному варианту осуществления тепловое разложение включает ацетилацетонат железа и бензиловый эфир и в отсутствие обычных поверхностно-активных веществ, отличных от применяемых в настоящем документе.

[0134] Согласно одному варианту осуществления температура для теплового разложения составляет от приблизительно 80°С до приблизительно 300°С или от приблизительно 80°С до приблизительно 200°С, или от приблизительно 80°С до приблизительно 150°С, или от приблизительно 100°С до приблизительно 250°С, или от приблизительно 100°С до приблизительно 200°С, или от приблизительно 150°C до приблизительно 250°C, или от приблизительно 150°C до приблизительно 250°C. Согласно одному варианту осуществления тепловое разложение происходит в течение приблизительно от 1 до 2 часов.

[0135] Согласно одному варианту осуществления способ изготовления наночастиц оксида железа включает стадию очистки, например, с использованием магнитной колонки Miltenyi Biotec LS.

[0136] Согласно одному варианту осуществления наночастицы стабильны при температуре приблизительно 4°С в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) без какой-либо заметной деградации или агрегации. Согласно одному варианту осуществления наночастицы стабильны в течение по меньшей мере 6 месяцев.

[0137] Согласно одному аспекту в настоящем документе предложен способ получения комплексов наночастиц, включающий контактирование pMHC с наночастицами оксида железа, представленными в настоящем документе. Без ограничения теорией pMHC кодирует цистеин на своем карбокситерминальном конце, который может реагировать с малеимидной группой в функционализированном ПЭГ при температуре от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,5 в течение от приблизительно 12 до приблизительно 14 часов.

[0138] Согласно одному аспекту способ получения комплексов наночастиц включает стадию очистки, например, с использованием магнитной колонки Miltenyi Biotec LS.

Относящиеся к заболеванию антигены

[0139] Комплекс pMHC в pMHC-NP выбирают для применения на основании подлежащего лечению заболевания. Например, относящийся к сахарному диабету антиген представляет собой антиген или его фрагмент, который экспрессируется в клетке, ткани или органе, на который нацеливаются при этом аутоиммунном заболевании и который подвергается воздействию иммунной системы при повреждении клетки, ткани или органа, вызванном аутоиммунным ответом, даже если антиген не является пусковым механизмом процесса заболевания или ключевым игроком в его патогенезе и, когда он присутствует, вызывает иммунный ответ, который служит для лечения сахарного диабета; таким образом, относящийся к сахарному диабету антиген, отвечающий этому определению, выбирают для лечения сахарного диабета. Относящийся к MS антиген выбирают для лечения MS. Относящийся к сахарному диабету антиген не будет выбран для лечения MS. Относящийся к раку или опухоли антиген будет лечить рак и/или опухоли. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к заболеванию антигены раскрыты в настоящем документе, и, кроме того, такие антигены могут быть определены для конкретного заболевания на основе техник, механизмов и способов, хорошо документированных в литературе.

[0140] Согласно определенным аспектам относящийся к заболеванию антиген, содержащийся в комплексе антиген-МНС, выбирают из относящегося к аутоиммунному заболеванию антигена, относящегося к воспалению антигена или относящегося к аллергическому заболеванию антигена. Согласно дополнительным аспектам относящийся к иммунному воспалению антиген выбирают из следующей группы: относящийся к бронхиальной астме антиген, относящийся к сахарному диабету антиген, относящийся к преддиабету антиген, относящийся к рассеянному склерозу антиген, относящийся к аллергической астме антиген, относящийся к первичному билиарному циррозу антиген, относящийся к циррозу антиген, относящийся к нейромиелиту зрительного нерва со спектральным расстройством (болезнь Девика, NMO) антиген, относящийся к аутоиммунному энцефалиту антиген, относящийся к аутоантитело-опосредованным неврологическим синдромам антиген, относящийся к синдрому мышечной скованности антиген, относящийся к паранеопластическим заболеваниям антиген, относящийся к другим заболеваниям центральной и периферической нервной системы антиген, относящийся к обыкновенной пузырчатке антиген, относящийся к воспалительному заболеванию кишечника (IBD) антиген, относящийся к болезни Крона антиген, относящийся к язвенному колиту антиген, относящийся к артриту антиген, относящийся к ревматоидному артриту антиген, относящийся к системной красной волчанке (SLE) антиген, относящийся к глютеиновой болезни антиген, относящийся к псориазу антиген, относящийся к очаговой алопеции антиген, относящийся к приобретенной тромбоцитопенической пурпуре антиген, относящийся к аутоиммунной кардиомиопатии антиген, относящийся к идиопатической дилятационной кардиомиопатии (IDCM) антиген, относящийся к миастении гравис антиген, относящийся к увеиту антиген, относящийся к анкилозирующему спондилиту антиген, относящийся к болезни Грейвса антиген, относящийся к тиреоидиту Хашимото антиген, относящийся к опосредованным иммуннитетом миопатиям антиген, относящийся к антифосфолипидному синдрому (ANCA+) антиген, относящийся к атеросклерозу антиген, относящийся к склеродермии антиген, относящийся к аутоиммунному гепатиту антиген, относящийся к дерматомиозиту антиген, относящийся к хронической обструктивной болезни легких антиген, относящийся к травме спинного мозга антиген, относящийся к травматическому повреждению антиген, относящийся к индуцированному табаком разрушению легких антиген, относящийся к хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) антиген, относящийся к эмфиземе легкого антиген, относящийся к склерозирующему холангиту антиген, относящийся к периферической невропатии антиген, относящийся к нарколепсии антиген, относящийся к синдромом Гудпасчера антиген, относящийся к болезни Кавасаки антиген, относящийся к аутоиммунному увеиту антиген, относящийся к колиту антиген, относящийся к эмфиземе антиген, относящийся к пузырчатке антиген, относящийся к пузырчатке листовидной антиген, относящийся к артриту антиген, относящийся к синдрому Шегрена антиген, относящийся к ANCA-ассоциированному васкулиту антиген, относящийся к первичному склерозирующему холангиту антиген, относящийся к воспалению жировая ткани/сахарному диабету типа II антиген или относящийся к связанному с ожирением воспалению жировой ткани/инсулинрезистентности антиген.

[0141] Согласно определенным аспектам относящийся к заболеванию антиген, получают из одного или нескольких из следующей группы: PPI, IGRP, GAD, периферин, aGlia, PDC-E2, инсулин, DG1EC2, DG3, AQP4, PLP, MOG, MBP, CII, DERP1, DERP2, OVA, BacInt, CBir, Fla-X, Fla-2, YIDX, AChR, тиреоидная пероксидаза, тиреоидный рецептор, фосфолипидный антиген, H4, H2B, H1, ДНК, ApoB, ApoE, NMDAR, потенциал-управляемый калиевый канал, эластин, аррестин, миоропероксидаза PERM_HUMAN, миелобластин PRTN3_HUMAN, цитохром CP4D6_HUMAN P450 2D6, SPCS_HUMAN O-фосфосерил-тРНК(Sec) селен-трансфераза, антимикробный пептид кателицидин CAMP_HUMAN, ДНК топоизомераза I, CENP-C, бета-2-гликопротеин 1 APOH_HUMAN, RO60_HUMAN 60 кДа SS-A/Ro рибонуклеопротеин, белок Lupus La LA_HUMAN, IRBP, миозин, CD1d-связывающие липидные антигены, Cap18, CP2D6, SPCS, RO60, RO52, LA, APOH, MPO, PRTN3 или HSP.

[0142] Согласно некоторым вариантам осуществления относящийся к заболеванию антиген представляет собой:

а) относящийся к сахарному диабету антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: препроинсулин (PPI), островок-специфическая глюкозо-6-фосфатаза (IGRP), глутамат декарбоксилаза (GAD), аутоантиген-2 островковых клеток (ICA2), инсулин, проинсулин или фрагмент или эквивалент каждого из них;

b) относящийся к рассеянному склерозу антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы миелиновый основной белок, миелин-ассоциированный гликопротеин, миелиновый олигодендроцитарный белок, протеолипидный белок, олигодендроцитный миелиновый олигопротеин, миелин-ассоциированный олигодендроцитарный основной белок, специфический к олигодендроциту белок, белки теплового шока, специфические к олигодендроцитам белки, NOGO A, гликопротеин Po, периферический миелиновый белок 22, 2'3'-циклический нуклеотид-3'-фосфодиэстераза или фрагмент или эквивалент каждого из них;

c) относящийся к глютеиновой болезни антиген и происходящий из глиадина или его фрагмента или его эквивалента;

d) относящийся к первичному билиарному циррозу антиген и происходящий из PDC-E2 или его фрагмента или его эквивалента;

e) относящийся к пузырчатке листовидной антиген и/или относящийся к пузырчатке обыкновенной антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: DG1, DG3 или фрагмента или эквивалента каждого из них;

f) относящийся к нейромиелиту зрительного нерва со спектральным расстройством антиген и происходящий из AQP4 или его фрагмента или его эквивалента;

g) относящийся к артриту антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: белки теплового шока, связывающий иммуноглобулин белок, гетерогенные ядерные RNP, аннексин V, кальпастатин, коллаген типа II, глюкозо-6-фосфат-изомераза, фактор элонгации хряща человека gp39, маннозосвязывающий лектин, цитруллинированный виментин, коллаген типа II, фибриноген, альфа-енолаза, анти-карбамилированный белок (анти-CarP), пептидиларгининдеминаза типа 4 (PAD4), BRAF, гамма-цепь фибриногена, тяжелая цепь H1 ингибитора интер-альфа-трипсина, альфа-1-антитрипсин, ингибитор C1 плазменной протеазы, гельсолин, альфа-1-B гликопротеин, церулоплазмин, тяжелая цепь H4 ингибитора интер-альфа-трипсина, фактор комплемента H, альфа-2-макроглобулин, сывороточный амилоид, C-реактивный белок, сывороточный альбумин, бета-цепь фиброгена, серотрансферин, альфа 2 HS гликопротеин, виментин, комплемент C3 или фрагмент или эквивалент каждого из них;

h) относящийся к аллергической астме антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: DERP1, DERP2 или фрагмента или эквивалента каждого из них;

i) относящийся к воспалительному заболеванию кишечника антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: флагелин, Fla-2, Fla-X, YIDX, интеграза бактероидов или фрагмент или эквивалент каждого из них;

j) относящийся к системной красной волчанке антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: двухцепочечная (дц)ДНК, рибонуклеопротеин (RNP), Smith (Sm), связанный с синдромом Шегрена антиген A (SS-A)/Ro, связанный с синдромом Шегрена антиген B (SS-B)/La, RO60, RO52, гистоны или фрагмент или эквивалент каждого из них;

k) относящийся к атеросклерозу антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: ApoB, ApoE или фрагмент или эквивалент каждого из них;

l) относящийся к ХОБЛ антиген и/или относящийся к эмфиземе антиген и происходящий из эластина или его фрагмента или его эквивалента;

m) относящийся к псориазу антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: Cap18, ADMTSL5, ATL5 или их фрагмент или эквивалент;

n) относящийся к аутоиммунному гепатиту антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: CYP2D6, SLA или фрагмент или эквивалент каждого из них;

o) относящийся к увеиту антиген и происходящий из аррестина или его фрагмента или его эквивалента;

p) относящийся к синдрому Шегрена антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: (SS-A)/Ro, (SS-B)/La, MR3, RO60, RO52 или фрагмент или эквивалент каждого из них;

q) относящийся к склеродермии антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: CENP-C, TOP 1, РНК-полимераза III или фрагмент или эквивалент каждого из них;

r) относящийся к антифосфолипидному синдрому антиген и происходящий из APOH или его фрагмента или его эквивалента;

s) относящийся к ANCA-ассоциированному васкулиту антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: MPO, PRTN3 или фрагмент или эквивалент каждого из них; или же

t) относящийся к синдрому мышечной скованности антиген и происходящий из GAD или его фрагмента или его эквивалента.

Относящиеся к сахарному диабету антигены

[0143] Относящиеся к сахарному диабету антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из PPI, IGRP, GAD, аутоантигена-2 островковых клеток (ICA2) и/или инсулина. Аутореактивные, относящиеся к диабету антигенные пептиды включают в себя, без ограничения, те, которые перечислены в следующей таблице 1, в дополнение к пептидам и белкам, раскрытым в публикации США 2005/0202032, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 1. Пептид Пептид hInsB_10-18 HLVEALYLV Проинсулин_L2-10 ALWMRLLPL hIGRP_228-236 LNIDLLWSV Проинсулин_L3-11 LWMRLLPLL hIGRP_265-273 VLFGLGFAI Проинсулин_L6-14 RLLPLLALL IGRP_206-214 VYLKTNVFL Проинсулин_B5-14 HLCGSHLVEA hIGRP_206-214 VYLKTNLFL Проинсулин_B10-18 HLVEALYLV NRP-A7 KYNKANAFL Проинсулин_B14-22 ALYLVCGER NRP-I4 KYNIANVFL Проинсулин_B15-24 LYLVCGERGF NRP-V7 KYNKANVFL Проинсулин_B17-25 LVCGERGFF YAI/D^b FQDENYLYL Проинсулин_B18-27 VCGERGFFYT INS B_15–23 LYLVCGERG Проинсулин_B20-27 GERGFFYT PPI_{76-90 (K88S)} SLQPLALEGSLQSRG Проинсулин_B21-29 ERGFFYTPK IGRP_13-25 QHLQKDYRAYYTF Проинсулин_B25-C1 FYTPKTRRE GAD_555-567 NFFRMVISNPAAT Проинсулин_B27-C5 TPKTRREAEDL GAD_{555-567(557I)} NFIRMVISNPAAT Проинсулин_C20-28 SLQPLALEG IGRP_23-35 YTFLNFMSNVGDP Проинсулин_C25-33 ALEGSLQKR B₂₄-C₃₆ FFYTPKTRREAED Проинсулин_C29-A5 SLQKRGIVEQ PPI_76-90 SLQPLALEGSLQKRG Проинсулин_A1-10 GIVEQCCTSI INS-I9 LYLVCGERI Проинсулин_A2-10 IVEQCCTSI TUM KYQAVTTTL Проинсулин_A12-20 SLYQLENYC G6Pase KYCLITIFL

Относящиеся к MS антигены

[0144] Антигены настоящего раскрытия включают в себя антигены, связанные с рассеянным склерозом. Такие антигены включают в себя, например, антигены, раскрытые в публикации заявки на патент США № 2012/0077686, и антигены, происходящие из миелинового основного белка, миелин-ассоциированного гликопротеина, миелинового олигодендроцитарного белка, протеолипидного белка, олигодендроцитарного миелинового олигопротеина, миелин-ассоциированного олигодендроцитарного основного белка, специфического к олигодендроцитам белка, белков теплового шока, олигодендроцит-специфических белков NOGO A, гликопротеина Po, периферического миелинового белка 22 или 2'3'-циклической нуклеотид-3'-фосфодиэстеразы. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген происходит из миелинового олигодендроцитарного гликопротеина (MOG).

[0145] Согласно дополнительным аспектам пептидные антигены для лечения MS и связанных с MS нарушений включают в себя, без ограничения, перечисленные в таблице 2, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них:

Таблица 2. Пептид Пептид MOG_35-55 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK MOG_97-109 TCFFRDHSYQEEA MOG_36-55 EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK MOG_{97-109(E107S)} TCFFRDHSYQEEA MAG_287-295 SLLLELEEV MOG_{97-109(E107S)} TCFFRDHSYQSEA MAG_509-517 LMWAKIGPV MBP_89-101 VHFFKNIVTPRTP MAG_556-564 VLFSSDFRI PLP_175-192 YIYFNTWTTCQSIAFPSK MBP_110-118 SLSRFSWGA PLP_94-108 GAVRQIFGDYKTTIC MOG_114-122 KVEDPFYWV MBP_86-98 PVVHFFKNIVTPR MOG_166-175 RTFDPHFLRV PLP_54-68 NYQDYEYLINVIHAF MOG_172-180 FLRVPCWKI PLP_249-263 ATLVSLLTFMIAATY MOG_179-188 KITLFVIVPV MOG_156-170 LVLLAVLPVLLLQIT MOG_188-196 VLGPLVALI MOG_201-215 FLRVPCWKITLFVIV MOG_181-189 TLFVIVPVL MOG_38-52 RHPIRALVGDEVELP MOG_205-214 RLAGQFLEEL MOG_203-217 RVPCWKITLFVIVPV PLP_80-88 FLYGALLLA PLP_250-264 TLVSLLTFMIAATYN MAG_287-295 SLLLELEEV MPB_13-32 KYLATASTMDHARHGFLPRH MAG_509-517 LMWAKIGPV MPB_83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTP MAG_556-564 VLFSSDFRI MPB_111-129 LSRFSWGAEGQRPGFGYGG

Относящиеся к глютеиновой болезни (CD) антигены

[0146] Относящиеся к глютеиновой болезни антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из глиадина. Согласно некоторым вариантам осуществления неограничивающие типы глиадина включают в себя альфа/бета-глиадин, γ-глиадин или ω-глиадин. Другие неограничивающие иллюстративные относящиеся к глютеиновой болезни антигены включают в себя антигены, перечисленные в таблице 3, а также их эквиваленты и/или комбинации.

Таблица 3. Пептид aGlia_57-68 QLQPFPQPELPY aGlia_62-72 PQPELPYPQPE aGlia_217-229 SGEGSFQPSQQNP

Относящиеся к первичному билиарному циррозу (PBC) антигены

[0147] Относящиеся к первичному билиарному циррозу антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из PDC-E2. Неограничивающие примеры иллюстративных антигенов включают в себя те, которые перечислены в таблице 4, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 4. Пептид Пептид PDC-E2_122-135 GDLIAEVETDKATV PDC-E2_422-436 DIPISNIRRVIAQRL PDC-E2_249-262 GDLLAEIETDKATI PDC-E2_629-643 AQWLAEFRKYLEKPI PDC-E2_249-263 GDLLAEIETDKATIG PDC-E2_80-94 SPGRRYYSLPPHQKV PDC-E2_629-643 AQWLAEFRKYLEKPI PDC-E2_353-367 GRVFVSPLAKKLAVE PDC-E2_72-86 RLLLQLLGSPGRRYY PDC-E2_535-549 ETIANDVVSLATKAR PDC-E2_353-367 GRVFVSPLAKKLAVE

Относящиеся к пузырчатке листовидной (PF) и пузырчатке обыкновенной (PV) антигены

[0148] Относящиеся к PF и PV антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из десмоглеина 3 (DG3) и/или десмоглеина 1 (DG1). Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 5, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 5. Пептид Пептид DG1_216-229 GEIRTMNNFLDREI DG3_438-452 DSKTAEIKFVKNMNR DG3_97-111 FGIFVVDKNTGDINI DG1_48-62 KREWIKFAAACREGE DG3_251-265 CECNIKVKDVNDNFP DG1_206-222 MFIINRNTGEIRTMN DG3_351-365 NKAEFHQSVISRYRV DG1_363-377 SQYKLKASAISVTVL DG3_453-467 DSTFIVNKTITAEVL DG1_3-17 WSFFRVVAMLFIFLV DG3_540-554 SITTLNATSALLRAQ DG1_192-206 SKIAFKIIRQEPSDS DG3_280-294 ILSSELLRFQVTDLD DG1_326-340 TNVGILKVVKPLDYE DG3_326-340 EGILKVVKALDYEQL DG1_1-15 MDWSFFRVVAMLFIF DG3_367-381 STPVTIQVINVREGI DG1_35-49 KNGTIKWHSIRRQKR DG3_13-27 AIFVVVILVHGELRI DG1_325-339 RTNVGILKVVKPLDY DG3_323-337 RTNEGILKVVKALDY

Относящиеся к нейромиелиту зрительного нерва со спектральным расстройством (NMO) антигены

[0149] Относящиеся к NMO антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из AQP4 или аквапорина 4. Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 6, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 6. Пептид Пептид AQP4_129-143 GAGILYLVTPPSVVG AQP4_129-143 GAGILYLVTPPSVVG AQP4_284-298 RSQVETDDLILKPGV AQP4_39-53 TAEFLAMLIFVLLSL AQP4_63-76 EKPLPVDMVLISLC

Относящиеся к артриту антигены

[0150] Относящиеся к артриту антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из белков теплового шока, иммуноглобулин-связывающего белка, гетерогенных ядерных RNP, аннексина V, кальпастатина, коллагена типа II, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фактора элонгации человеческого хряща gp39, связывающего маннозу лектина, цитруллинированного виментина, коллагена типа II, фибриногена, альфа-енолазы, анти-карбамилированного белка (анти-CarP), пептидиларгининдеиминазы типа 4 (PAD4), BRAF, гамма-цепи фибриногена, тяжелой цепи интер-альфа-трипсина H1, альфа-1-антитрипсина, ингибитора C1 плазменной протеазы, гельзолина, альфа-1-B гликопротеина, церулоплазмина, тяжелой цепи H4 ингибитора альфа-трипсина, фактора комплемента H, альфа-2-макроглобулина, сывороточного амилоида, C-реактивного белка, сывороточного альбумина, бета-цепи фиброгена, серотрансферина, альфа 2 HS гликопротеина, виментина, комплемента C3 или фрагмента или эквивалента каждого из них.

Относящиеся к аллергической астме антигены

[0151] Относящиеся к аллергической астме антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из DERP1 и DERP2. Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 7, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 7. Пептид Пептид DERP-1_16-30 LRQMRTVTPIRMQGG DERP-2_26-40 PCIIHRGKPFQLEAV DERP-1_171-185 AVNIVGYSNAQGVDY DERP-2_107-121 TVKVMGDDGVLACAI DERP-1_110-124 RFGISNYCQIYPPNV

Относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника антигены

[0152] Относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника антигены включают в себя, без ограничения, относящиеся к болезни Крона антигены и относящиеся к язвенному колиту антигены. Согласно некоторым вариантам осуществления относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из интегразы бактероидов, флагелина, флагеллина 2 (Fla-2/Fla-X) или неохарактеризованного белка E.coli (YIDX). Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 8, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 8. Пептид Пептид антиген инегразы бактероидов_183-197 EAINQGYMHADAYPF Fla-2/Fla-X_1-15 MVVQHNLRAMNSNRM антиген инегразы бактероидов_146-160 KDLTYTFLRDFEQYL Fla-2/Fla-X_51-65 KMRKQIRGLSQASLN антиген инегразы бактероидов_175-189 RQLRTLVNEAINQGY Fla-2/Fla-X_269-283 GAYKLIQKELGLASS антиген инегразы бактероидов_1-15 MDKIRYRLVYNRQNT Fla-2/Fla-X_4-18 QHNLRAMNSNRMLGI антиген инегразы бактероидов_183-197 EAINQGYMHADAYPF Fla-2/Fla-X_271-285 YKLIQKELGLASSIG антиген инегразы бактероидов_30-44 LNQRKIYLKTNVYLK YIDX_78-92 ADDIVKMLNDPALNR антиген инегразы бактероидов_70-84 EYILYLQGIELGYWK YIDX_93-107 HNIQVADDARFVLNA антиген инегразы бактероидов_337-351 TCATLLIHQGVAITT YIDX_98-112 ADDARFVLNAGKKKF антиген инегразы бактероидов_171-185 AKHMRQLRTLVNEAI YIDX_23-37 GCISYALVSHTAKGS антиген инегразы бактероидов_4-18 IRYRLVYNRQNTLNR YIDX_78-92 ADDIVKMLNDPALNR антиген инегразы бактероидов_256-270 ENFIRINGKRWLYFK YIDX_195-209 LPVTVTLDIITAPLQ Fla-2/Fla-X_366-380 TGAAATYAIDSIADA YIDX_22-36 SGCISYALVSHTAKG Fla-2/Fla-X_164-178 NATFSMDQLKFGDTI YIDX_80-94 DIVKMLNDPALNRHN Fla-2/Fla-X_261-275 DRTVVSSIGAYKLIQ YIDX_101-115 ARFVLNAGKKKFTGT

Относящиеся к системной красной волчанке (SLE) антигены

[0153] Относящиеся к SLE антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из H4, H2B, H1’, дцДНК, RNP, Smith (Sm), связанного с синдромом Шегрена антигена A (SS-A)/Ro, связанного с синдромом Шегрена антигена B (SS-B)/La и/или гистонов. Согласно некоторым вариантам осуществления SS-A включает в себя, без ограничения, RO60 и RO52. Согласно некоторым вариантам осуществления гистоны включают в себя, без ограничения, H4, H2B, H1’. Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 9, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 9. Пептид Пептид H4_71-94 TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG H4_80-94 TVTAMDVVYALKRQ H4_74-88 EHAKRKTVTAMDVVY H2B_10-24 PKKGSKKAVTKAQKK H4_76-90 AKRKTVTAMDVVYAL H2B_16-30 KAVTKAQKKDGKKRK H4_75-89 HAKRKTVTAMDVVYA H1´_22-42 STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR H4_78-92 RKTVTAMDVVYALKR H1´_27-41 KYSDMIVAAIQAEKN

Относящиеся к атеросклерозу антигены

[0154] Относящиеся к атеросклерозу антигены включают в себя, без ограничения, антигены, происходящие из аполипопротеина B (ApoB) или аполипопротеина E (ApoE). Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 10, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 10. Пептид Пептид ApoB_3501-3516 SQEYSGSVANEANVY ApoB_210A KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH ApoB_1952-1966 SHSLPYESSISTALE ApoB_210B KTTKQSFDLSVKAQY ApoB_978-993 TGAYSNASSTESASY ApoB_210C TTKQSFDLSVKAQYK ApoB_3498-3513 SFLSQEYSGSVANEA

Относящиеся к хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и/или эмфиземе антигены

[0155] Относящиеся к ХОБЛ и/или эмфиземе антигены включают в себя, без ограничения, происходящие из эластина. Неограничивающие примеры включают в себя те, которые перечислены в таблице 11, а также эквиваленты и/или комбинации каждого из них.

Таблица 11. Пептид Пептид эластин_89-103 GALVPGGVADAAAAY эластин_563-577 VAAKAQLRAAAGLGA эластин_698-712 AAQFGLVGAAGLGGL эластин_558-572 KSAAKVAAKAQLRAA эластин_8-22 APRPGVLLLLLSILH эластин_698-712 AAQFGLVGAAGLGGL эластин_94-108 GGVADAAAAYKAAKA эластин_566-580 KAQLRAAAGLGAGIP эластин_13-27 VLLLLLSILHPSRPG эластин_645-659 VPGALAAAKAAKYGA эластин_695-709 AAKAAQFGLVGAAGL

Относящиеся к псориазу антигены

[0156] Относящиеся к псориазу антигены включают в себя, без ограничения, перечисленные в следующей таблице 12, а также их эквиваленты и/или комбинации. Другие неограничивающие иллюстративные относящиеся к псориазу антигены могут происходить из человеческого адамис-подобного белка 5 (ATL5), кателицидинового антимикробного пептида (CAP18) и/или ADAMTS-подобного белка 5 (ADMTSL5).

Таблица 12. Пептид Пептид Cap18_64-78 RPTMDGDPDTPKPVS ADMTSL5_372-386 RLLHYCGSDFVFQAR Cap18_34-48 SYKEAVLRAIDGINQ ADMTSL5_289-303 HDLLLQVLLQEPNPG Cap18_47-61 NQRSSDANLYRLLDL ADMTSL5_396-410 ETRYEVRIQLVYKNR Cap18_151-165 KRIVQRIKDFLRNLV ADMTSL5_433-447 HRDYLMAVQRLVSPD Cap18_149-163 EFKRIVQRIKDFLRN ADMTSL5_142-156 EGHAFYHSFGRVLDG Cap18_152-166 RIVQRIKDFLRNLVP ADMTSL5_236-250 RNHLALMGGDGRYVL Cap18_131-145 RFALLGDFFRKSKEK ADMTSL5_301-315 NPGIEFEFWLPRERY Cap18_24-38 QRIKDFLRNLVPRTE ADMTSL5_203-217 VQRVFRDAGAFAGYW ADMTSL5_245-259 DGRYVLNGHWVVSPP ADMTSL5_404-418 QLVYKNRSPLRAREY ADMTSL5_267-281 THVVYTRDTGPQETL

Относящиеся к аутоиммунному гепатиту антигены

[0157] Относящиеся к аутоиммунному гепатиту антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в приведенной ниже таблице 13, а также их эквиваленты и/или комбинации. Другие неограничивающие иллюстративные относящиеся к аутоиммунному гепатиту антигены могут происходить из микросомального цитохрома P450IID6 (CYP2D6) и/или растворимого печеночного антигена (SLA).

Таблица 13. Пептид Пептид CYP2D6_193-207 RRFEYDDPRFLRLLD SLA_334-348 YKKLLKERKEMFSYL CYP2D6_76-90 TPVVVLNGLAAVREA SLA_196-210 DELRTDLKAVEAKVQ CYP2D6_293-307 ENLRIVVADLFSAGM SLA_115-129 NKITNSLVLDIIKLA CYP2D6_313-332 TLAWGLLLMILHPDVQRRVQ SLA_373-386 NRLDRCLKAVRKER CYP2D6_393-412 TTLITNLSSVLKDEAVWEKP SLA_186-197 LIQQGARVGRID CYP2D6_199-213 DPRFLRLLDLAQEGL SLA_317-331 SPSLDVLITLLSLGS CYP2D6_450-464 RMELFLFFTSLLQHF SLA_171-185 DQKSCFKSMITAGFE CYP2D6_301-315 DLFSAGMVTTSTTLA SLA_417-431 YTFRGFMSHTNNYPC CYP2D6_452-466 ELFLFFTSLLQHFSF SLA_359-373 YNERLLHTPHNPISL CYP2D6_59-73 DQLRRRFGDVFSLQL SLA_215-229 DCILCIHSTTSCFAP CYP2D6_130-144 EQRRFSVSTLRNLGL SLA_111-125 SSLLNKITNSLVLDI CYP2D6_193-212 RRFEYDDPRFLRLLDLAQEG SLA_110-124 GSSLLNKITNSLVLD CYP2D6_305-324 AGMVTTSTTLAWGLLLMILH SLA_299-313 NDSFIQEISKMYPGR CYP2D6_131-145 QRRFSVSTLRNLGLG SLA_342-356 KEMFSYLSNQIKKLS CYP2D6_216-230 ESGFLREVLNAVPVL SLA_49-63 STLELFLHELAIMDS CYP2D6_238-252 GKVLRFQKAFLTQLD SLA_119-133 NSLVLDIIKLAGVHT CYP2D6_199-213 DPRFLRLLDLAQEGL SLA_260-274 SKCMHLIQQGARVGR CYP2D6_235-252 GKVLRFQKAFLTQLD SLA_26-40 RSHEHLIRLLLEKGK CYP2D6_293-307 ENLRIVVADLFSAGM SLA_86-100 RRHYRFIHGIGRSGD CYP2D6_381-395 DIEVQGFRIPKGTTL SLA_331-345 SNGYKKLLKERKEMF CYP2D6_429-443 KPEAFLPFSAGRRAC

Относящиеся к увеиту антигены

[0158] Относящиеся к увеиту антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в приведенной ниже таблице 14, а также их эквиваленты и/или их комбинации. Другие неограничивающие иллюстративные относящиеся к увеиту антигены могут происходить из аррестина, S-антигена сетчатки человека и/или связывающего ретиноидный интерфорецептор белка, (IRBP).

Таблица 14. Пептид Пептид аррестин_199-213 QFFMSDKPLHLAVSLN аррестин_102-116 STPTKLQESLLKKLG аррестин_77-91 DVIGLTFRRDLYFSR аррестин_59-73 KKVYVTLTCAFRYGQ аррестин_250-264 NVVLYSSDYYVKPVA аррестин_280-294 KTLTLLPLLANNRER аррестин_172-186 SSVRLLIRKVQHAPL аррестин_291-306 NRERRGIALDGKIKHE аррестин_354-368 EVPFRLMHPQPEDPA аррестин_195-209 EAAWQFFMSDKPLHL аррестин_239-253 KKIKAFVEQVANVVL аррестин_200-214 QFFMSDKPLHLAVSL

Относящиеся к синдрому Шегрена антигены

[0159] Относящиеся к синдрому Шегрена антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в следующей таблице 15, а также их эквиваленты и/или комбинации. Другие неограничивающие иллюстративные относящиеся к синдрому Шегрена антигены могут происходить из (SS-A)/Ro, (SS-B)/La, RO60, RO52 и/или мускаринового рецептора 3 (MR3).

Таблицы 15. Пептид Пептид RO60_127-141 TFIQFKKDLKESMKC LA_101-115 TDEYKNDVKNRSVYI RO60_523-537 DTGALDVIRNFTLDM LA_153-167 SIFVVFDSIESAKKF RO60_243-257 EVIHLIEEHRLVREH LA_178-192 TDLLILFKDDYFAKK RO60_484-498 REYRKKMDIPAKLIV LA_19-33 HQIEYYFGDFNLPRD RO60_347-361 EEILKALDAAFYKTF LA_37-51 KEQIKLDEGWVPLEI RO60_369-383 KRFLLAVDVSASMNQ LA_133-147 DKGQVLNIQMRRTLH RO60_426-440 TDMTLQQVLMAMSQI LA_50-64 EIMIKFNRLNRLTTD RO60_267-281 EVWKALLQEMPLTAL LA_32-46 RDKFLKEQIKLDEGW RO60_178-192 SHKDLLRLSHLKPSS LA_153-167 SIFVVFDSIESAKKF RO60_358-372 YKTFKTVEPTGKRFL LA_83-97 SEDKTKIRRSPSKPL RO60_221-235 ETEKLLKYLEAVEKV LA_136-150 QVLNIQMRRTLHKAF RO60_318-332 RIHPFHILIALETYK LA_297-311 RNKEVTWEVLEGEVE RO60_407-421 EKDSYVVAFSDEMVP LA_59-73 NRLTTDFNVIVEALS RO60_459-473 TPADVFIVFTDNETF LA_151-165 KGSIFVVFDSIESAK RO60_51-65 QKLGLENAEALIRLI LA_86-100 KTKIRRSPSKPLPEV RO60_312-326 KLLKKARIHPFHILI LA_154-168 IFVVFDSIESAKKFV LA_241-255 DDQTCREDLHILFSN

Относящиеся к склеродермии антигены

[0160] Относящиеся к склеродермии антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в приведенной ниже таблице 16, а также их эквиваленты и/или комбинации. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к склеродермии антигены могут происходить из центромерного белка С центромерного аутоантигена (CENP-C), ДНК-топоизомеразы I (TOP1) и/или РНК-полимеразы III.

Таблица 16. Пептид Пептид TOP1_346-360 KERIANFKIEPPGLF CENP-C_857-871 KVYKTLDTPFFSTGK TOP1_420-434 QGSIKYIMLNPSSRI CENP-C_887-901 QDILVFYVNFGDLLC TOP1_750-764 QREKFAWAIDMADED CENP-C_212-226 KVMLKKIEIDNKVSD TOP1_419-433 IQGSIKYIMLNPSSR CENP-C_643-657 EDNIMTAQNVPLKPQ TOP1_591-605 YNASITLQQQLKELT CENP-C_832-846 TREIILMDLVRPQDT TOP1_695-709 EQLMKLEVQATDREE CENP-C_167-181 TSVSQNVIPSSAQKR TOP1_305-319 SQYFKAQTEARKQMS CENP-C_246-260 RIRDSEYEIQRQAKK TOP1_346-360 KERIANFKIEPPGLF CENP-C_846-860 TYQFFVKHGELKVYK TOP1_419-433 IQGSIKYIMLNPSSR CENP-C_149-163 DEEFYLSVGSPSVLL TOP1_425-439 YIMLNPSSRIKGEKD CENP-C_833-847 REIILMDLVRPQDTY TOP1_614-628 KILSYNRANRAVAIL CENP-C_847-861 YQFFVKHGELKVYKT CENP-C_297-311 KLIEDEFIIDESDQS

Относящиеся к антифосфолипидному синдрому антигены

[0161] Относящиеся к антифосфолипидному синдрому антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в приведенной ниже таблице 17, а также их эквиваленты и/или комбинации. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к антифосфолипидному синдрому антигены могут происходить из бета-2-гликопротеина 1 (BG2P1 или APOH).

Таблица 17. Пептид Пептид APOH_235-249 HDGYSLDGPEEIECT APOH_295-309 KVSFFCKNKEKKCSY APOH_306-320 KCSYTEDAQCIDGTI APOH_49-63 YSCKPGYVSRGGMRK APOH_237-251 GYSLDGPEEIECTKL APOH_269-283 KKATVVYQGERVKIQ APOH_295-309 KVSFFCKNKEKKCSY APOH_295-309 KVSFFCKNKEKKCSY APOH_28-42 DLPFSTVVPLKTFYE APOH_321-355 EVPKCFKEHSSLAFW APOH_173-187 ECLPQHAMFGNDTIT APOH_322-336 VPKCFKEHSSLAFWK APOH_264-278 CKVPVKKATVVYQGE APOH_324-338 KCFKEHSSLAFWKTD

Относящиеся к ANCA-ассоциированному васкулиту антигены

[0162] Относящиеся к ANCA-ассоциированному васкулиту антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в приведенной ниже таблице 18, а также их эквиваленты и/или комбинации. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к ANCA-ассоциированному васкулиту антигены могут происходить из миелопероксидазы (MPO), протеиназы (PRTN3) или фактора повышения проницаемости бактерий (BPI).

Таблица 18. Пептид Пептид MPO_506-520 QPFMFRLDNRYQPME PRTN3_44-58 SLQMRGNPGSHFCGG MPO_302-316 RIKNQADCIPFFRSC PRTN3_234-248 TRVALYVDWIRSTLR MPO_7-21 SSLRCMVDLGPCWAG PRTN3_59-73 TLIHPSFVLTAAHCL MPO_689-703 QQRQALAQISLPRII PRTN3_117-131 NDVLLIQLSSPANLS MPO_248-262 RSLMFMQWGQLLDHD PRTN3_164-178 DPPAQVLQELNVTVV MPO_444-458 QEARKIVGAMVQIIT PRTN3_71-85 HCLRDIPQRLVNVVL MPO_513-527 DNRYQPMEPNPRVPL PRTN3_241-255 DWIRSTLRRVEAKGR MPO_97-111 ELLSYFKQPVAATRT PRTN3_59-73 TLIHPSFVLTAAHCL MPO_616-630 QLGTVLRNLKLARKL PRTN3_183-197 RPHNICTFVPRRKAG MPO_462-476 YLPLVLGPTAMRKYL PRTN3_62-76 HPSFVLTAAHCLRDI MPO_617-631 LGTVLRNLKLARKLM PRTN3_118-132 DVLLIQLSSPANLSA MPO_714-728 KNNIFMSNSYPRDFV PRTN3_239-253 YVDWIRSTLRRVEAK

Относящиеся к синдрому мышечной скованности антигены

[0163] Относящиеся к синдрому мышечной скованности антигены включают в себя, без ограничения, антигены, раскрытые в следующей таблице 14, а также их эквиваленты и/или комбинации. Неограничивающие иллюстративные относящиеся к синдрому мышечной скованности антигены могут происходить из глутаматдекарбоксилазы (GAD). Согласно некоторым вариантам осуществления GAD включает в себя, без ограничения, GAD65.

Таблица 19. Пептид GAD_212-226 EYVTLKKMREIIGWP GAD_555-569 NFFRMVISNPAATHQ GAD_297-311 DSVILIKCDERGKMI

[0164] Предполагается, что в композициях по настоящему раскрытию содержится от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 10 мг общего белка на мл в композиции. Таким образом, концентрация белка в композиции может составлять приблизительно, по меньшей мере приблизительно или максимум приблизительно 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 мкг/мл или мг/мл или более (или любой диапазон, полученный из него). Из этого приблизительно, по меньшей мере приблизительно или максимум приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99 или 100% могут представлять собой комплекс пептид/МНС/наночастицы.

[0165] Настоящее раскрытие включает введение комплекса пептид/MHC/наночастица для осуществления диагностики, лечения или профилактической терапии против развития заболевания или состояния, связанного с аутоиммунными реакциями или раком.

[0166] Кроме того, в патенте США № 4554101 (Hopp), который включен в настоящий документ посредством ссылки, описывается идентификация и получение эпитопов из первичных аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. Посредством способов, раскрытых в Hopp, специалист в настоящей области техники сможет идентифицировать потенциальные эпитопы из аминокислотной последовательности и подтвердить их иммуногенность. Многочисленные научные публикации были также посвящены предсказанию вторичной структуры и идентификации эпитопов из анализа аминокислотных последовательностей (Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979). Любой из них может быть использован, если это желательно, в дополнение к идеям Hopp в патенте США № 4554101.

Другие антигенные компоненты

[0167] Молекулы, отличные от пептидов, могут быть использованы в качестве антигенов или антигенных фрагментов в комплексе с молекулами МНС. Такие молекулы включают в себя, без ограничения, углеводы, липиды, небольшие молекулы и т.п. Углеводы представляют собой основные компоненты внешней поверхности различных клеток. Определенные углеводы характерны для разных стадий дифференцировки, и очень часто эти углеводы распознаются специфическими антителами. Экспрессия отдельных углеводов может быть ограничена определенными типами клеток. Было показано, что ответы аутоантител на эндометриальные и сывороточные антигены являются общей чертой эндометриоза. Был описан ответ аутоантитела сыворотки при эндометриозе на ряд ранее идентифицированных антигенов, включая в себя гликопротеин 2-Гереманс-Шмида и карбоангидразу, которая специфична для углеводного эпитопа.

Неограничивающие иллюстративные комплексы антиген-MHC

[0168] Согласно определенным вариантам осуществления конкретные комбинации антигена и МНС могут быть оптимизированы для лечения конкретного заболевания. Неограничивающие примеры включают в себя, без ограничения, следующие примеры.

[0169] Для лечения сахарного диабета типа I антиген комплекса pMHC может быть получен из антигена группы: PPI_76-90(K88S), IGRP_13-25, GAD_555-567, GAD_{555-567(557I)}, IGRP_23-35, B₂₄-C₃₆, PPI_76-90 или фрагмента или эквивалента каждого из них, а MHC комплекса pMHC содержит весь полипептид или часть полипептида группы: HLA-DRB1*0401/DRA, HLA-DRB1*0301/DRA или фрагмента или эквивалента каждого из них.

[0170] Согласно некоторым вариантам осуществления антиген комплекса pMHC содержит:

а) относящийся к сахарному диабету антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: препроинсулин (PPI), островок-специфическая глюкозо-6-фосфатаза (IGRP), глутамат декарбоксилаза (GAD), аутоантиген-2 островковых клеток (ICA2), инсулин, проинсулин или фрагмент или эквивалент каждого из них;

b) относящийся к рассеянному склерозу антиген и происходящий из антигена, выбранного из одного или нескольких из следующей группы: миелиновый основной белок, миелин-ассоциированный гликопротеин, миелиновый олигодендроцитарный белок, протеолипидный белок, олигодендроцитный миелиновый олигопротеин, миелин-ассоциированный олигодендроцитарный основной белок, специфический к олигодендроциту белок, белки теплового шока, специфические к олигодендроцитам белки, NOGO A, гликопротеин Po, периферический миелиновый белок 22, 2'3'-циклический нуклеотид-3'-фосфодиэстераза или фрагмент или эквивалент каждого из них;

c) относящийся к глютеиновой болезни антиген и происходящий из глиадина или его фрагмента или его эквивалента;

d) первичный относящийся к билиарному циррозу антиген и происходящий из PDC-E2 или его фрагмента или его эквивалента;