Тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма "SAT-2/Eritrea/1998" вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

Ящур является экономически значимой болезнью крупного рогатого скота, овец, коз и свиней, а также диких парнокопытных животных. Возбудитель данного заболевания вызывает огромные производственные потери, особенно в молочной промышленности и свиноводстве, и высокую смертность молодняка, а также является серьезным препятствием для международной торговли живыми животными и их продуктами. В дополнение к нарушению торговли животными, вспышки ящура имеют широкомасштабные экономические и социальные последствия как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе, включая сбои в производстве кормов для животных, ветеринарной фармацевтики и связанных с туризмом отраслях.

Страны, в которых встречается ящур, во многом отражают уровень их экономического развития: он отсутствует в Европе, Северной Америке и Австралии, спорадически наблюдается в Южной Америке и эндемично в большей части Азии и Африки. Присутствие возбудителя заболевания дает основания для ограничения торговли продуктами животноводства из пораженных стран в страны, где ящур отсутствует, и, таким образом, лишает развивающиеся государства доступа к богатым рынкам развитого мира, снижая стимулы к повышению производительности и эффективности [1-3].

Существует 7 серотипов ящура: O, A, C, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [2, 4, 5]. В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и даже многих других генетических линий [6].

При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (полные частицы, основной иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁-VP₂-VP₃-VP₄ [7, 8].

Наиболее вариабельным является протеин VP₁ вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [2]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [8, 9].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна генетическая изменчивость, а именно он включает в себя 14 топотипов (I - XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура и проведение ретроспективного анализа. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2.

Вспышки ящура серотипа SAT-2 топотипа VII регистрируются на территории Африканского континента. Вирус данного серотипа распространен в странах Северной Африки, в частности, в Египте, Эритрее, где вспышки отмечают в период с 2012 по 2022 гг. и Либии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г.), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно распространены изоляты вируса ящура топотипа VII. Учитывая тесные торговые отношения Российской Федерации и стран Африканского континента, имеют место крайне высокие риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и сопредельных стран. Степень изменчивости внутри одного топотипа VII высокая, поэтому возникает острая необходимость в изучении свойств появляющихся штаммов вируса ящура и изготовления на его основе вакцинных препаратов и диагностических тест-систем [10 - 20].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа SАT-2, которые используются при производстве средств специфической профилактики ящура и при ретроспективной диагностике:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»1) (генотип SAT-2/XIV).

Изолят «SAT-2/Eritrea» вируса ящура был выделен из патологического материала от крупного рогатого скота. По результатам ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим филогенетическим анализом, определили, что изолят принадлежит к генотипу SAT-2/VII.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм «SAT-2/Eritrea/1998». Данный штамм был депонирован в 2023 году во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных, под регистрационным номером: №459-деп/23-9 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура представлена на фиг. 3.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (500 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 16 нуклеотидную последовательность. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 648 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA X.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Африки, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны является очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом в борьбе с болезнью. В связи с распространения в мире изолятов, близкородственных штамму «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма. В результате возникла необходимость создания диагностической тест-системы, которая позволила бы детектировать антитела к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [12-19]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции, 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием CO₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня биобезопасности BSL-3.

ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [20]. Исходя из этого ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

Особым способом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы, различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание уделяют жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции микронейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа SAT-2 - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [21]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены на антиген вируса ящура, изоляты которого появились ранее 1998 года (период возникновения предлагаемого штамма вируса ящура) и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» ниже 34%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Таким образом, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов в отношении изолятов, близкородственных штамму «SAT-2/Eritrea/1998», антиген которого применяют в вакцинных препаратах.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа SAT-2 [22].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5x).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (TMB).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа SAT-2, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система была разработана в начале 90-х гг. XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных штаммов серотипа SAT-2, кроме «SAT-2/Eritrea/1998». Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа SAT-2.

Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен в указанном штамме. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более чем на 37%. Следовательно, требуется разработать высокочувствительную и специфичную тест-систему для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма удалена от реакции микронейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным вариантом ИФА.

В прототипном варианте используются контрольные сыворотки крови животных в жидком состоянии, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.

Прототипная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», актуальной является разработка тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа с учетом выше приведенных недостатков.

В РФ на сегодняшний день существуют следующие тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА: 1) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации [23]; 2) тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008» генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации [24]; 3) способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму «О №2311/Забайкальский/2016» генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА [25]; 4) тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура «А №2205/G-IV» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [26]. При этом в настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура.

Целью изобретения является создание тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998»;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998»;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998»;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с процентом ингибиции 75-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с процентом ингибиции от 50,0% до 74,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вируса ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,6-9,7), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS²-E′, «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор лаурет-сульфата натрия (sodium laureth sulfate, сокращенно SLES).

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической РМН в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты полных частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» расположены в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Осуществляется сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против структурных белков вируса ящура того же штамма. Сенсибилизированные лунки обрабатывают с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» и чувствительной тест-системы, предназначенной для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

В отличие от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 350-360 раз инактивированный вирус ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность детектировать антитела против структурных белков вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 63% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент с протектором (2,4% хлорида натрия) остается стабильным не менее 4 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» составляет 1:5000.

В отличие от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела лабораторных животных, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента с протектором (2,4% хлорида натрия), что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 4 лет и с активностью не менее 1:9000 и 1:4000, соответственно.

В отличие от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 4 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:4000. Данная активность удобна для производства диагностических наборов.

В отличие от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде с протектором (2,4 хлорида натрия), что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 4 лет.

В отличие от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям оптической плотности и уровню антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

В отличие от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки (HRP, «Abcam», Китай), что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты детекции антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2500.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносят в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

Наличие антител к структурным белкам вируса ящура данного штамма в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Седиментационный профиль антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

Фиг. 2 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 - целевой белок с молекулярным весом 25 кD.

Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VР₁ штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объема деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,6-9,7.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% Tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 0,5% сухого молока.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» готовят в разведении 1:9000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 ч при температуре (2-4)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:22-1:2048) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета ≥ 5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» - процент ингибиции (PI) 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» - PI = 50,0-74,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции < 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-4)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые сенсибилизированные лунки планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:2500) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ ABTS^2- E°′, закрывают крышкой и выдерживают 15 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 0,5%-ного раствора SLES.

12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение декадного коэффициента экстинкции (ε) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ε переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:

PI (%) = (1- (ε_{сыворотки} - ε_КК)/( ε_КА - ε_КК)) × 100,

где ε_{сыворотки} - среднее значение декадного коэффициента экстинкции смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998»;

ε_КА - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля антигена;

ε_КК - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями ε _КА и ε _КК не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение PI>75%;

- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Сыворотки крови, для которых значение PI≥50%, считают положительными, содержащими антитела к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным. Исходя из полученных данных, берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против структурных белков вируса ящура, вызванного вирусом штамма «SAT-2/Eritrea/1998» и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных исследований были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:9000, антивидового конъюгата - 1:2500; антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» - 1:5000, контроля 1 - 1:4000, контроля 2 - 1:4000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных и сравнительный анализ с результатами РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Представленная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:2048).

Контроль суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» на специфичность.

Специфичность суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «SAT-2/Eritrea/1998» к генотипу SAT-2/VII. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» составила 2,78 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 2,00 мкг/мл (72%). Данное содержание полных вирусных частиц (146S компонент) достаточно для проведения дальнейших работ по концентрированию и получению готового лиофильно высушенного антигена для изготовления тест-системы.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена, кодирующего белок VP₁, штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/VII (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [2].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/Eritrea/1998» составили r₁ от 0,01 до 0,20, а именно для штамма «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I) - 0,05, для «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II) - 0,07, для «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III) - 0,06, для «SAT-2/ETH/1/90» (генотип SAT-2/IV) - 0,01, для «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V) - 0,09, для «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI) - 0,08, для «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) - 0,20, для «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII) - 0,17, для «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX) - 0,11, для «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X) - 0,13, для «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI) - 0,11, для «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII) - 0,12, для «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII) - 0,19, для «SAT-2/ETH/2/9»1 (генотип SAT-2/XIV) - 0,18.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

Для получения антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» для изготовления тест-системы проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин при 6000 об/мин и 2-4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе, концентрируя в 350 раз (1/350 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», необходимого для иммунизации животных и получения антигена как одного из важнейших специфических компонентов ИФА.

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 40 и 30%. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 40-30%-м слое сахарозы, которые отбирали и переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» в виде антигенного профиля представлены на фиг. 1. Анализ проводили для 9 фракций. Пики наблюдали для фракций №№ 2-5. Проведен электрофорез антигена в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 2), который подтвердил, что полученная суспензия антигена вируса ящура является очищенной.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-28 R VG (в соотношении адъювант/антиген = 50/50 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 сутки в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (2-4)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998».

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Полученные образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:7000, 1:8000, 1:9000, 1:10000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:5000, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:9000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:5000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:9000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:5000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При бóльшем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы. Таким образом, в ходе лабораторных испытаний определено, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:5000, 1:9000, 1:4000, соответственно.

Пример 5. Применение разработанной тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученные после иммунизации инактивированными сорбированными моновалентными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы (предлагаемое изобретение).

Для исследования представленной тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 456 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находился в диапазоне 5,5-10,0 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 456 образцов сывороток крови 453 определены в качестве положительных, а 3 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 225 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 225 отрицательных проб - все определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,10-99,87%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,37-100,00%, k-критерий - 0,9901; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 96,04-99,57%, общая точность (DAc) - 98,72-99,91% (табл. 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа» является специфичной и чувствительной, позволяющей проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента и за его пределами. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа»:

1. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R. [et al.] // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J. B. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,

6. Grubman, M. J. 1980. The 5′ end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, C. M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong H.K., Ho K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson T., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

12. King, A. M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W. R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C., D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson T., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP₀ cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

20. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_ upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis__Brocchi_.pdf (Дата обращения: 05.04.2023).

22. Наборы для определения антител к антигену вируса ящура (FMDV) PrioCHECK. URL: vetprofilab.ru/f/rus_priochek_fmdv.pdf (Дата обращения: 24.03.2023).

23. Патент РФ № 2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

24. Патент РФ № 2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка № 2022119118 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Оковытая Т.В., Борисов А.В., Воеводина М.Э.

25. Патент РФ № 2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022113420 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

26. Патент РФ № 2798510, 23.06.2023. Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура А №2205/G-IV с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка № 2022122687 / Доронин М.И., Луговская Н.Н., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Борисов А.В., Воеводина М.Э.

Таблица 5
Корреляция результатов количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА (предлагаемое изобретение) и в реакции микронейтрализации № п/п Характеристика пробы Титр антител против структурных белков вируса ящура Степень корреляции, % в ИФА (предлагаемое изобретение) в РМН, log₂ SN₅₀ 1 Сыворотка 1 свиная против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 21 ДПВ 1:128 7,0 100% 2 Сыворотка 2 свиная против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 21 ДПВ 1:128 7,0 100% 3 Сыворотка 3 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 14 ДПВ 1:64 6,0 100% 4 Сыворотка 4 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 28 ДПВ 1:362 8,5 100% 5 Сыворотка 5 КРС против ВЯ штамма
«SAT-2/Eritrea/1998», 21 ДПВ 1:362 8,5 100% 6 Сыворотка 6 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 35 ДПВ 1:512 9,0 100% 7 Сыворотка 7 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 14 ДПВ 1:45 5,5 100% 8 Сыворотка 8 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 28 ДПВ 1:512 9,0 100% 9 Сыворотка 9 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 21 ДПВ 1:128 7,0 100% 10 Сыворотка 10 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 21 ДПВ 1:181 7,5 100% 11 Сыворотка 11 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 28 ДПВ 1:512 9,0 100% 12 Сыворотка 12 КРС против ВЯ штамма «SAT-2/Eritrea/1998», 28 ДПВ 1:1024 10,0 100% 13 КА ОП=1,118 - соответствует 14 КК ОП=0,036 - соответствует 15 К1 (PI > 80%) PI = 91,99% - соответствует 16 К2 (50%<PI < 80%) PI = 65,32% - соответствует 17 К3 (PI<50%) PI = 3,22% - соответствует

Примечание: условие: ОП_КА - ОП _КК>0,400,

КА - контроль антигена,

КК - контроль конъюгата,

К1 - положительный контроль-1,

К2 - положительный контроль-2,

К3 - отрицательный контроль-3,

ДПВ - день после вакцинации, ВЯ - вирус ящура.

Таблица 6
Пределы диагностических возможностей тест-системы для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа (предлагаемое изобретение) Диагностические показатели Результаты обработки данных в 95%-ном
доверительном интервале DSe 98,10-99,87% DSp 98,37-100,00% k-критерий 0,9901 NPV 96,04-99,57% DAc 98,72-99,91%

Примечание: DSe - диагностическая чувствительность,

DSp - диагностическая специфичность,

NPV - прогностичность отрицательного результата,

DAc - общая точность.

--->

- <rupat:RUPatentApplication

xmlns:pat="http://www.wipo.int/standards/XMLSchema/ST96/Patent"

xmlns:com="http://www.wipo.int/standards/XMLSchema/ST96/Common"

xmlns:rucom="http://www1.fips.ru/XMLSchema/EApp/Common"

xmlns:rupat="http://www1.fips.ru/XMLSchema/EApp/Patent">

- <rupat:RUInventionInfo>

<rupat:RUInventionTitle>Тест-система для детекции антител к

структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в

жидкофазном варианте иммуноферментного

анализа</rupat:RUInventionTitle>

- <pat:PatentClassificationBag>

- <pat:IPCClassification>

<pat:PatentClassificationText>G01N 33/53, C12N

7/00</pat:PatentClassificationText>

</pat:IPCClassification>

</pat:PatentClassificationBag>

</rupat:RUInventionInfo>

- <rupat:RUPartyInfo>

- <rupat:RUApplicant>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:OrganizationName com:languageCode="ru">

<com:OrganizationStandardName>Федеральное государственное бюджетное

учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" - ФГБУ

"ВНИИЗЖ"</com:OrganizationStandardName>

</com:OrganizationName>

- <com:OrganizationName com:languageCode="la">

<com:OrganizationStandardName>Federalnoe gosudarstvennoe

biudzhetnoe uchrezhdenie "Federalnyi tsentr okhrany zdorovia

zhivotnykh" - FGBU "VNIIZZh"</com:OrganizationStandardName>

</com:OrganizationName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, мкр.

Юрьевец, г. Владимир</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, mkr.

Yuryevets, g. Vladimir</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

- <com:EmailAddressBag>

<com:EmailAddressText>ruchnova@arriah.ru</com:EmailAddressText>

</com:EmailAddressBag>

</rucom:RUContact>

<rucom:RUIndividualTaxNumber>3327100048</rucom:RUIndividualTaxNumber

>

- <rucom:RULegalEntityCode>

<rucom:RUOGRN>1023301283720</rucom:RUOGRN>

</rucom:RULegalEntityCode>

<rucom:RURegistrationReasonCode>332701001</rucom:RURegistrationReaso

nCode>

</rupat:RUApplicant>

- <rucom:RUCorrespondenceAddress>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Ручнова Ольга Ивановна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

- <com:EmailAddressBag>

<com:EmailAddressText>ruchnova@arriah.ru</com:EmailAddressText>

</com:EmailAddressBag>

- <com:PhoneNumberBag>

<com:PhoneNumber>+74922260753</com:PhoneNumber>

</com:PhoneNumberBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUCorrespondenceAddress>

- <rucom:RUInventorBag>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Михалишин Дмитрий

Валерьевич</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Mikhalishin Dmitrii

Valerevich</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Михалькова, д. 15, кв.

12</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Mikhalkova, d. 15, kv.

12</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Силантьева Екатерина

Андреевна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Silanteva Ekaterina

Andreevna</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Всесвятская, д. 8, кв.

11</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Vsesvyatskaya, d. 8, kv.

11</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Луговская Наталия

Николаевна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Lugovskaia Nataliia

Nikolaevna</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Институтский городок, д. 32, кв.

37</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Institutskiy gorodok, d. 32, kv.

37</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Михалишин Валерий

Васильевич</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Mikhalishin Valerii

Vasilevich</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Михалькова, д. 15, кв.

99</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Mikhalkova, d. 15, kv.

99</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Оковытая Татьяна

Владимировна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Okovytaia Tatiana

Vladimirovna</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Институтский городок, д. 24, кв.

28</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Institutskiy gorodok, d. 24, kv.

28</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Борисов Алексей Валерьевич</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Borisov Aleksei Valerevich</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600028, RU, Россия, г.

Владимир, ул. Сурикова, д. 10 А, кв. 35</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600028, RU, Rossiya,

g. Vladimir, ul. Surikova, d. 10 A, kv. 35</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Харитонова Анастасия

Александровна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Kharitonova Anastasiia

Aleksandrovna</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600000, RU, Россия, г.

Владимир, ул. Княгининская, д. 6 а, кв. 31</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600000, RU, Rossiya,

g. Vladimir, ul. Knyagininskaya, d. 6 a, kv.

31</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

- <rucom:RUInventor>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Гочмурадов Ыхлас Мурадович</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

- <com:PersonName com:languageCode="la">

<com:PersonFullName>Gochmuradov Ykhlas

Muradovich</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode>RU</com:CountryCode>

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">600901, RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец, ул. Славная, д. 27 а</com:PostalAddressText>

<com:PostalAddressText com:languageCode="la">600901, RU, Rossiya,

g. Vladimir, mkr. Yuryevets, ul. Slavnaya, d. 27

a</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact>

</rucom:RUInventor>

</rucom:RUInventorBag>

- <rucom:RURepresentative>

- <rucom:RUContact>

- <com:Name>

- <com:PersonName com:languageCode="ru">

<com:PersonFullName>Ручнова Ольга Ивановна</com:PersonFullName>

</com:PersonName>

</com:Name>

- <com:PostalAddressBag>

- <com:PostalAddress>

- <com:PostalStructuredAddress com:languageCode="ru">

<com:CountryCode />

</com:PostalStructuredAddress>

<com:PostalAddressText com:languageCode="ru">RU, Россия, г.

Владимир, мкр. Юрьевец</com:PostalAddressText>

</com:PostalAddress>

</com:PostalAddressBag>

- <com:EmailAddressBag>

<com:EmailAddressText>ruchnova@arriah.ru</com:EmailAddressText>

</com:EmailAddressBag>

- <com:PhoneNumberBag>

<com:PhoneNumber>8(4922)26-07-53</com:PhoneNumber>

</com:PhoneNumberBag>

</rucom:RUContact>

<com:RepresentativeCategory>Other</com:RepresentativeCategory>

<rucom:RUPatentAttorneyNumber />

- <rucom:RURepresentationPeriod>

<com:PeriodLimitationEndDate>2026-12-31</com:PeriodLimitationEndDate

>

</rucom:RURepresentationPeriod>

</rucom:RURepresentative>

</rupat:RUPartyInfo>

- <rupat:RUAttachmentInfo>

- <rupat:RUDescriptionFile>

<com:DocumentFileName>s.docx</com:DocumentFileName>

</rupat:RUDescriptionFile>

- <rupat:RUAbstractFile>

<com:DocumentFileName>a.docx</com:DocumentFileName>

</rupat:RUAbstractFile>

- <rupat:RUDrawingsFile>

<com:DocumentFileName>00001p.docx</com:DocumentFileName>

</rupat:RUDrawingsFile>

- <rupat:RUDrawingsFile>

<com:DocumentFileName>00002p.pdf</com:DocumentFileName>

</rupat:RUDrawingsFile>

- <rupat:RUSequenceListingFile>

<com:DocumentFileName>pp.xml</com:DocumentFileName>

</rupat:RUSequenceListingFile>

- <rupat:RUPowerOfAttorneyFile>

<com:DocumentFileName>00004d.pdf</com:DocumentFileName>

</rupat:RUPowerOfAttorneyFile>

- <rupat:RUClaimFile>

<com:DocumentFileName>f.rtf</com:DocumentFileName>

</rupat:RUClaimFile>

- <rupat:RUOtherFileBag>

- <rupat:RUOtherFile>

<com:DocumentFileName>00002d.pdf</com:DocumentFileName>

</rupat:RUOtherFile>

- <rupat:RUOtherFile>

<com:DocumentFileName>00003d.doc</com:DocumentFileName>

</rupat:RUOtherFile>

</rupat:RUOtherFileBag>

- <rupat:RUPaymentFileBag>

- <rupat:RUPaymentFile>

<com:DocumentFileName>00001d.pdf</com:DocumentFileName>

</rupat:RUPaymentFile>

</rupat:RUPaymentFileBag>

</rupat:RUAttachmentInfo>

- <rupat:RUPayer>

- <com:Name>

- <com:OrganizationName com:languageCode="ru">

<com:OrganizationStandardName>ФГБУ

"ВНИИЗЖ"</com:OrganizationStandardName>

</com:OrganizationName>

</com:Name>

- <rucom:RUPayerIdentity>

- <rucom:RULegalEntityPayerIdentity>

<rucom:RUIndividualTaxNumber>3327100048</rucom:RUIndividualTaxNumber

>

<rucom:RURegistrationReasonCode>332701001</rucom:RURegistrationReaso

nCode>

</rucom:RULegalEntityPayerIdentity>

</rucom:RUPayerIdentity>

</rupat:RUPayer>

</rupat:RUPatentApplication>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа. Преимуществом разработанной тест-системы является продолжительный срок хранения (не менее 4 лет) за счет получения лиофильно высушенных иммуноспецифических составляющих. Предложенная тест-система является первой в Российской Федерации, современной, специфической и чувствительной, предназначенной для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа в широком диапазоне 1:22 - 1:2048 или 4,5-11,0 log₂ SN₅₀. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента и соседних регионов. Созданная тест-система направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного генотипа вируса ящура, и тем самым на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения изолятов вируса ящура, близкородственных штамму «SAT-2/Eritrea/1998». 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для детекции антител к структурным белкам штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в жидкофазном варианте иммуноферментного анализа, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный антиген лиофилизированный вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с активностью в ИФА 1:5000; сенсибилизирующие антитела – иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с активностью в ИФА 1:9000; детекторные антитела – иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 – сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» генотипа SAT-2/VII с процентом ингибиции 75-100%; контроль 2 – положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» с процентом ингибиции от 50% до 74,9%; контроль 3 – отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вирусу ящура; блокирующий раствор – 0,5%-ный раствор сухого молока; антивидовой конъюгат – иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:2500;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,6-9,7; 20-кратный концентрат буферного раствора; хромогенный субстрат, «стоп»-раствор SLES – 0,5%-ный раствор лаурет-сульфата натрия;

2. Тест-система по п. 1, которая является специфичной и чувствительной и позволяет проводить анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» в диапазоне 1:22 – 1:2048 или 4,5-11,0 log₂ SN₅₀.

3. Тест-система по п. 1, где сенсибилизирующие и детекторные антитела против структурных белков вируса ящура животных получены путем иммунизации эмульсией, содержащей 350-кратный концентрированный антиген вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» и масляный адъювант Montanide ISA-28 R VG в соотношении 50÷50.