Тест-система для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 C12N7/00 A61K39/135 C12Q1/68 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию тест-системы для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Ящур - особо опасное, карантинное, высококонтагиозное заболевание парнокопытных и мозоленогих животных, которое вызывает РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о. [1, 2]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (полные частицы, основной иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁-VP₂-VP₃-VP₄ [1].

Существует 7 серотипов ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и су 6 линии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2]. В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и даже многих других генетических линий.

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [3, 4, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [7].

Наличие семи серотипов и множества подтипов и вариантов усложняют лабораторную диагностику ящура и борьбу с ним. Появление новых вариантов неизбежно вызвано продолжающейся циркуляцией вируса в полевых условиях и квазивидовым характером РНК-генома [6]. Большая часть этих вариаций происходит в кодирующей капсид области генома (область полипептида P₁) и приводит к антигенной вариации.

Наиболее вариабельным является белок VP₁ вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [5, 7]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [8].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I-XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура и проведение ретроспективного анализа. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2.

Вспышки ящура серотипа SAT-2 регистрируются на территории Африканского континента. Преимущественно эпизоотическая ситуация связана с генотипом SAT-2/VII, который распространен в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечают в период с 2012 по 2022 гг.и Либии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г.), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно распространены изоляты вируса ящура данного генотипа. Соответственно, в указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром указанного генотипа. При этом появляются новые представители данного генотипа, которые имеют геномные и аминокислотные замены, что приводит к появлению новых свойств. Имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и сопредельных стран. Степень изменчивости внутри одного топотипа VII высокая, поэтому возникает острая необходимость в изучении свойств появляющихся штаммов вируса ящура и изготовления на его основе вакцинных препаратов и диагностических тест-систем [9, 10, 11, 12, 13].

В настоящее время известны производственные штаммы вируса ящура типа SAT-2, которые используются при производстве средств специфической профилактики ящура и при ретроспективной диагностике:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/l/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/l/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»l) (генотип SAT-2/XIV).

В 2012 году на территории Государства Ливия от крупного рогатого скота выделен изолят вируса ящура. По результатам ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим филогенетическим анализом, определили, что изолят принадлежит к генотипу SAT-2/VII.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм «SAT-2 Lib 39/2012» (генотип SAT-2/VII). Данный штамм был депонирован в 2021 году во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных, под регистрационным номером: №361-деп/21-22 -ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура представлена на фиг. 3.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (200 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 16 нуклеотидную последовательность. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 648 позиции. Эволюционный анализ проводился в MEGA 7.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Африки и Ближнего Востока, вероятность риска заноса ящура на территорию нашей страны является очень высокой. Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с распространения в мире генотипа SAT-2/VII вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного генотипа. В результате возникла необходимость создания диагностической тест-системы, которая позволила бы количественно определять антитела к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [12-19]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2], для определения иммунного статуса животных применяют реакцию микронейтрализации (РМН) и иммуноферментный анализ (ИФА). РМН считается чувствительной и специфичной, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции, 2) высокая себестоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием СО₂-инкубатора и другого оборудования, 3) использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности и предполагает проведение работ только в лабораториях уровня BSL-3.

В свою очередь, ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа, а также не предполагает проведение работ с микроорганизмами повышенного уровня опасности [20]. Исходя из этого, ИФА целесообразно применять для исследования уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.

Особым способом проведения ИФА является «сэндвич»-вариант, который обычно предполагает применение пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества: 1) высокая специфичность реакции; 2) подходит для скринингового анализа полевых образцов разной степени очистки; 3) высокая чувствительность реакции.

В зависимости от фазы, в которой находятся иммунные комплексы различают твердофазный и жидкофазные варианты ИФА. Особое внимание уделяют жидкофазному блокирующему непрямому «сэндвич»-варианту ИФА, который характеризуется рядом преимуществ: 1) данный анализ максимально приближен к классической реакции микронейтрализации, поскольку формирование иммунного комплекса происходит в жидкой фазе как наиболее естественных условиях; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, что позволяет повысить чувствительность и специфичность реакции.

На мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа SAT-2 - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).

Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА [21]. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2012 года (период, когда появился производственный штамм «SAT-2 Lib 39/2012») и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа SAT-2/VII ниже 39%, что подтверждают данные реакции микронейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать достоверных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа SAT-2/VII.

Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа SAT-2 [22].

Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:

Компонент 1 - Планшеты иммунологические.

Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.

Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).

Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.

Компонент 5 - Деминерализованная вода.

Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).

Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).

Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).

Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).

Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).

Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).

Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.

Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа SAT-2, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Прототипная тест-система разработана была еще в конце 90-гг XX в. В ней применяются антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов серотипа SAT-2, кроме вновь появившихся, в частности SAT-2/VII. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа SAT-2. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP₁ вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 48%. Исходя из этого требуется разработать чувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII.

Прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма удалена от РМН относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.

В прототипном варианте используются контрольные сыворотки крови животных в жидком виде, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и создает риски контаминации микроорганизмами.

Прототипная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и уровню гуморального иммунитета против антигена вируса ящура.

В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.

Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для проведения точного количественного анализа уровня гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, актуальной является разработка тест-системы для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.

В РФ на сегодняшний день существует тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А N2269/ВНИИЗЖ/2015» генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации [23].

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью количественно определять уровень гуморального иммунитета против структурных белков вируса ящура генотипа SAT-2/VII в сыворотках крови животных.

Целью изобретения является создание тест-системы для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты с высокой степенью активности:

1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII;

2) сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII;

3) детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII;

4) контроль 1 (сильноположительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с процентом ингибиции 80-100%;

5) контроль 2 (положительный контроль) - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с процентом ингибиции от 50,0% до 79,9%;

6) контроль 3 (отрицательный контроль) - сыворотка крови телят, не содержащая антитела к антигену вируса ящура;

7) блокирующая сыворотка крови;

8) антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 9,5-9,7), 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 1,0%-ный раствор лаурилсульфата натрия (SLS).

Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической РМН в культуре клеток IB-RS-2, поскольку все антигенные сайты полных частиц вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами. Реакция основана на взаимодействии иммуноглобулинов G исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII в жидкой фазе с образованием иммунных комплексов. Проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета антителами кролика против вируса ящура того же генотипа. Сенсибилизированные лунки обрабатывают с помощью блокирующей сыворотки крови, добавляют полученные иммунные комплексы из кругло донного планшета, инкубируют, вносят восстановленную из лиофильного высушенного состояния суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов G морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, специфической против структурных белков вируса ящура генотипа SAT-2/VII и чувствительной тест-системы, предназначенной для количественного определения уровня гуморального иммунитета против указанного антигена методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА на основе применения антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и при получении иммуноспецифических компонентов реакции.

В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный концентрированный в 1000-1200 раз инактивированный вирус ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, который представлен в виде лиофильно высушенной суспензии. Данный факт дает возможность количественно определять гуморальный иммунитет против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 52% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент с протектором (1,8% хлорида натрия) остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII составляет 1:3000.

В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела лабораторных животных, соответственно, высокоспецифичные по отношению к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура представлены в виде лиофильного компонента с протектором (1,8% хлорида натрия), что позволяет иммуноглобулинам G находится в стабильном состоянии не менее 4 лет и с активностью не менее 1:8000 и 1:4000, соответственно.

В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, сильноположительный и положительный контроли получены против высокоочищенного концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофильно высушенных суспензий, что позволяет хранить их не менее 4 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:4000. Данная активность удобна для получения большого объема контролей в рабочем нативном состоянии для проведения оператором ИФА.

В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде с протектором (1,8% хлорида натрия), что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 4 лет.

В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные данные по значениям оптической плотности и уровню антител против структурных белков вируса ящура генотипа SAT-2/VII.

В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяются антитела кроличьи к иммуноглобулину G морской свинки H&L (HRP), что позволяет повышать специфичность анализа и получать более достоверные результаты количественного определения титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:3000.

Разработанная тест-система основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносят в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Наличие антител к структурным белкам вируса ящура данного штамма в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против иммуноглобулинов G морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количественному значению выявленного уровня гуморального иммунитета животного. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Седиментационный профиль фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII.

Фиг. 2 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1-4: фракции с 40% сахарозы, 5-9: фракции с 30% сахарозы; целевой белок с молекулярным весом 25 kD.

Фиг. 3 - Филогенетическая принадлежность штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII вируса ящура.

На подготовительном этапе исследования лиофилизированные иммуноспецифические компоненты тест-системы (антиген вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, иммунопероксидазный конъюгат, положительные и отрицательный контроли, сенсибилизирующие и детекторные антитела) восстанавливают до необходимого объема деионизированной водой.

Проводят приготовление рабочих растворов.

Раствор №1 (солевой буферный раствор карбоната и гидрокарбоната натрия). Готовят по стандартной методике 50 мл раствора с водородным показателем 9,5-9,7.

Раствор №2 (Wash-раствор). Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,1% Tween-20 с водородным показателем 7,5-7,7. Рабочий Wash-раствор готовят разведением концентрата в 20 раз.

Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения антител и иммунопероксидазного конъюгата готовится непосредственно перед использованием из рабочего Wash-раствора с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.

Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма SAT-2 Lib 39/2012 генотипа SAT-2/VII представлены ниже.

1. Иммобилизация антител кролика против антигена вируса ящура. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител против антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII готовят в разведении 1:8000 в солевом буферном растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (раствор №1). Во все лунки иммунологического 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии данных антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18 ч при температуре (2-4)°С.

2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Wash-раствора 2 раза.

3. Образование иммунного комплекса в жидкой фазе. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:22-1:2048) в растворе №2. Для этого во все лунки планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1. Положительной сыворотка считается при уровне гуморального иммунитета ≥ 5,0 log₂ SN₅₀ (≥1:32).

В качестве контроля 1 используют сильноположительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII - процент ингибиции (PI) 80-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС/свиней против вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII-PI=50,0-79,9%, контроля 3 - нормальную сыворотку КРС/свиней - процент ингибиции < 50%.

Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3000. После перемешивания содержимого лунок планшета проводят в течение 1 часа при температуре (2-4)°С.

4. Улавливание антигена. В промытые сенсибилизированные лунки планшета вносят по 0,05 см³ смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 3 раза.

6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см³ раствора №3, вносят по 0,05 см³ рабочего разведения детекторных антител (1:4000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п.2). Процедуру повторяют 3 раза.

8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ рабочего разведения конъюгата (1:3000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±2 мин при температуре (37±1)°С.

9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.

10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ диаммониевой соли 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), закрывают крышкой и выдерживают 15 минут при температуре (20±2)°С.

11. Торможение реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ 1,0%-ного раствора лаурилсульфата натрия (SLS).

12. Определение значения экстинкции и уровня гуморального иммунитета по данным ИФА. Сразу после остановки реакции измеряют значение декадного коэффициента экстинкции (ε) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ε переводят в значение процента ингибиции (ПИ, %) по формуле:

ПИ (%)=(1-(ε_{сыворотки}-ε_KK)/(ε_КА-ε_КК))×100,

где, ε_{сыворотки} - среднее значение декадного коэффициента экстинкции смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII;

ε_KA - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля антигена;

ε_KK - среднее значение декадного коэффициента экстинкции контроля конъюгата.

Достоверность проводимого анализа с помощью предложенной тест-системы определяется при удовлетворении следующим критериям:

- разница между значениями ε_KA и ε_KK не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);

- контроль 1 имеет значение ПИ>75%;

- контроль 2 имеет значение ПИ в пределах 50,0-74,9%;

- контроль 3 имеет значение ПИ<50%.

Сыворотки крови, для которых значение ПИ≥50%, считают положительными, содержащими антитела к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Значение ПИ<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Данное разведение считают титром антител против структурных белков вируса ящура, вызванного вирусом штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и выражают в log₂ SN₅₀.

В результате проведенных исследований были оттитрованы оригинальные компоненты реакции. Активность детекторных антител в ИФА составила 1:4000, сенсибилизирующих антител - 1:8000, антивидового конъюгата - 1:3000; антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII - 1:3000, контроля 1 - 1:4000, контроля 2 - 1:4000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура генотипа SAT-2/VII и проведен сравнительный анализ с результатами РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5; 11,0 log₂ SN₅₀ (1:16-1:2048).

Контроль суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII на специфичность.

Специфичность суспензий антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP₁, в котором наиболее часто возникают мутации. По результатам исследования нуклеотидной последовательности указанного гена была выявлена принадлежность штамма «SAT-2 Lib 39/2012» к генотипу SAT-2/VII. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» составила 2,65 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,70 мкг/мл. Данное содержание полных вирусных частиц (146S компонент) достаточно для проведения дальнейших работ по концентрированию и получению готового лиофильно высушенного антигена для изготовления тест-системы.

Морфологические признаки.

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу SAT-2, генотипу SAT-2/VII и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров с кубическим типом симметрии.

Антигенные свойства.

По своим антигенным свойствам штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РМН и ИФА. При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении не менее 1:3000.

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие штаммы вируса ящура, представленные выше. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [2].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2 Lib 39/2012» составили r₁ от 0,01 до 0,20 а именно для штамма «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I) - 0,05, для «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II) - 0,07, для «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III) - 0,06, для «SAT-2/ETH/l/90» (генотип SAT-2/IV) - 0,01, для «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V) - 0,09, для «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI) - 0,08, для «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) - 0,28, для «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII) - 0,17, для «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX) - 0,11, для «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X) - 0,13, для «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI) - 0,11, для «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII) - 0,12, для «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII) - 0,19, для «SAT-2/ETH/2/9»1 (генотип SAT-2/XIV) - 0,18.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2 и отличии (r₁=0,28) от штамма «SAT-2/SAU/6/2000».

Биотехнологические характеристики.

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, и в течение 14-15 часов инкубирования вирус в указанных культурах клеток накапливается от 6,50 до 9,75 lg ТЦД₅₀/см³.

Генотаксономическая характеристика.

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура серотипа SAT-2 является РНК (+) - содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10⁶ Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один из них является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства.

Для данного вируса при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,41 см²/с молекулярная масса составляет 8,08×10⁶Д. Размер вириона 23-25 нм, масса составляет 8,4×10^-18 г.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм «SAT-2 Lib 39/2012» устойчив к эфиру, хлороформу, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги водородного показателя как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Вирусная частица чувствительна к формальдегиду, УФ-облучению, у-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства.

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - инактивированный вируса ящура указанного штамма не патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - инактивированный вируса ящура указанного штамма не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность неинактивированного вируса ящура - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигена вируса ящура генотипа SAT-2/VII.

Для получения антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» для изготовления тест-системы проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в течение 14-15 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли полигексаметиленгуанидином.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 2-4°С. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натри (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе, концентрируя в 1200 раз (1/1200 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012». Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

На следующем этапе проводили получение 146S частиц вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012», необходимого для иммунизации животных и получения антигена как одного из важнейших специфических компонентов ИФА.

Для выделения полных частиц с коэффициентом седиментации 146S готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 40 и 30%. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 40-30%-м слое сахарозы, которые отбирали и переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» в виде антигенного профиля представлены на фиг. 1. Анализ проводили для 9 фракций. Пики наблюдали для фракций №№2-5. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг. 2), который подтвердил, что для исследований подходят по степени чистоты фракции №№1-6.

Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012».

Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный антиген вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012», полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG (в соотношении адъювант/антиген = 70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 14 и 28 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации у кроликов отбирали кровь, содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре (2-4)°С.

Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012».

Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012», полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.

Пример 4. Определение активности в ИФА антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012», сенсибилизирующих и детекторных антител к нему.

Полученные образцы сывороток крови животных проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА. Проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 2, 3, 4.

Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:6000, 1:7000, 1:8000,1:9000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3000, для детекторных антител - 1:4000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 2 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:8000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении отмечали снижение детектируемых значений уровня гуморального иммунитета в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток получали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.

Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 3 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:2500, 1:3000, 1:3500. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител - 1:8000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 8,0 log₂ SN₅₀. Их таблицы 4 следует, что при разведении антигена 1:3000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8,0 log₂ SN₅₀). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.

При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанной тест-системы.

Таким образом, в ходе лабораторных испытаний определено, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012», сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:3000, 1:8000, 1:4000, соответственно.

Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII.

Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными моновалентными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Определены значения уровня гуморального иммунитета с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 5, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода РМН высокая (приближено к 100%).

Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич »-варианта ИФА (предлагаемое изобретение).

Для исследования представленной тест-системы для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 525 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным РМН в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Уровень антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 5,5-9,5 log₂ SN₅₀. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 525 образцов сывороток крови 523 определены в качестве положительных, а 2 - в качестве отрицательных (уровень гуморального иммунитета по данным ИФА составил 1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 254 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 254 отрицательных проб - 254 определены в качестве отрицательных. Определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,64-99,95%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,56-100,00%, k-критерий - 0,994; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 97,21-99,10%, общая точность (DAc) - 99,08-99,97% (табл. 6).

Таким образом предлагаемая «Тест-система для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против антигена вируса ящура штамма SAT-2 LIB 39/2012 генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением уровня гуморального иммунитета против антигена вируса ящура штамма SAT-2 LIB 39/2012 генотипа SAT-2/VII. Данный штамм и соответствующий ему генотип является актуальным и быстро распространяющимся на территории Африканского континента, а также в странах Ближнего Востока. Разработанная тест-система будет направлена на подтверждение высокой эффективности производимых в РФ противоящурных инактивированных вакцин, содержащих антиген данного штамма, и, тем самым, на защиту территории России и граничащих с ней на юге стран от распространения вируса ящура генотипа SAT-2/VII.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА»:

1. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R. [et al.] // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.

3. Гуленкин, B.M. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.

4. Brooksby, J.В. 1982. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18:1-23.

5. Rueckert, R.R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959,

6. Grubman, M. J. 1980. The 5' end of foot-and-mouth disease virion RNA contains a protein covalently linked to the nucleotide pUp. Arch. Virol. 63:311-315.

7. Domingo, E., C. Escarmis, E. Baranowski, С.M. Ruiz-Jarabo, E. Carrillo, J. I. Nunez, and F. Sobrino. 2003. Evolution of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91:47-63.

8. Sobrino, F., M. Davila, J. Ortin, and E. Domingo. 1983. Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology 128:310-318.

9. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.

10. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.К., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V. 7. - P. 477.

11. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.

12. King, A. M., D. McCahon, K. Saunders, J. W. Newman, and W. R. Slade. 1985. Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3:373-384.

13. Tosh, C, D. Hemadri, and A. Sanyal. 2002. Evidence of recombination in the capsid-coding region of type A foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol. 83:2455-2460.

14. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101/

15. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.

16. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VPo cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.

17. Anon N. Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.

18. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.

19. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

20. Tamura К., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

21. IZSLER ELISA. URL: https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/docs/Open_Session2012/Appendices/75_New_Elisa_for_diagnosis_Brocchi_.pdf (Дата обращения: 05.04.2023).

22. Наборы для определения антител к антигену вируса ящура (FMDV) PrioCHECK. URL: vetprofilab.m/f/rus_priochek_fmdv.pdf (Дата обращения: 24.03.2023).

23. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324 / Луговская Н.Н., Доронин М.И., Михалишин Д.В., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ELISA FMDV SAT-2

VII antibody_1682426392533.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-04-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-25</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>502</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-04-25</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система для количественного

определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа

SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого

«сэндвич»-варианта ИФА</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>648</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..648</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcagcgggagaaagcgcagatgtcgtcaccacggacccatcta

cacacggtggaaacgtgcaagagggccgacgcaaacacaccgaagttgcgttccttcttgaccgcagtac

acacgtccacacaaacaaaacatcctttgttgtggacctcatggacacaaaggagaaggcactcgtgggc

gcaatcctgcgggcttccacctactacttttgtgaccttgagattgcatgtgtgggcgacnacacaaggg

ccttttggcagcctaacggggcgccgcggaccacccaacttggcgacaaccccatggttttcgccaaggg

cggtgtgacccgctttgccatcccgttcacggccccacacaggttgctgtctactgtctacaatggtgag

tgtgtttacaagaaaactcccaccgccatccgtggagaccgtgcggcgctagcggcaaagtacgctgaca

gcacgcacactttgccgtcaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgatgtttacta

ccggatgaagagggctgaactgtactgtccacgcccgctgctgccagcctatgaacacacaggcggagac

agattcgacgcgcccattggcgtcgagaggcagaccctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>216</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..216</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTNKTSF

VVDLMDTKEKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDXTRAFWQPNGAPRTTQLGDNPMVFAKGGVTRFAIPF

TAPHRLLSTVYNGECVYKKTPTAIRGDRAALAAKYADSTHTLPSTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYEHTGGDRFDAPIGVERQTL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА. Тест-система включает иммуноспецифические лиофилизированные составляющие и неспецифические компоненты. Иммуноспецифические лиофилизированные составляющие включают культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII, детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. Изобретение расширяет арсенал средств для количественного определения уровня гуморального иммунитета против указанного антигена методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА на основе применения антигена вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Тест-система для количественного определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT-2/VII с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, содержащая:

- иммуноспецифические лиофилизированные составляющие: культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с активностью в ИФА 1:3000; сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с активностью в ИФА 1:8000; детекторные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с активностью в ИФА 1:4000; контроль 1 - сильноположительная сыворотка крови телят против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с процентом ингибиции 80-100%; контроль 2 - положительная сыворотка крови телят к структурным белкам вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII с процентом ингибиции от 50 до 79,9%; контроль 3 - отрицательная сыворотка крови телят, не содержащая антител к антигену вируса ящура; блокирующая сыворотка крови крупного рогатого скота; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против Ig G морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена, с активностью в ИФА 1:3000;

- неспецифические компоненты: буферный раствор на основе карбоната и гидрокарбоната натрия с рН 9,5-9,7, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), «стоп»-раствор - 1,0%-ный раствор лаурилсульфата натрия (SLS);

отличающаяся тем, что в качестве антигена вируса ящура содержит культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII; и для определения процента ингибиции используются значения декадного коэффициента экстинкции и математическая формула: ПИ, %=(1-(ε_{сыворотки}-ε_KK)/(ε_KA-ε_KK))×100, при этом титр антител к структурным белкам вируса ящура определяется как максимальное разведение сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 3-4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением титра антител против структурных белков вируса ящура штамма «SAT-2 Lib 39/2012» генотипа SAT-2/VII и количественно определять уровень гуморального иммунитета в диапазоне 1:22-1:2048 или 4,5-11,0 log₂ SN₅₀.