Способ диагностики глиальных опухолей в дооперационном периоде Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/84 G01N33/574 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике путем исследования физических и химических свойств крови и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования степени злокачественности новообразований головного мозга.

На сегодняшний день распространенность опухолей головного мозга - от 5 до 14 случаев на 100 тысяч населения (Мацко Д.Е. Нейрохирургическая патология. Руководство. - СПб.: Б.И., 2012. - 405 с.). Глиома - самая распространенная и злокачественная опухоль головного мозга [Jemal A. Global Cancer Statistics. CA Cancer J Clin. 2011; 61: 69-90]. Высокая смертность при глиомах обусловлена в основном ее резистентностью к терапии и быстрым ростом опухоли и активной инвазией в головной мозг [Ohgaki H, Dessen P, Jourde B, Horstmann S, Nishikawa T, Di Patre PL, et al. Genetic pathways to glioblastoma: A population-based study. Cancer Res. 2004; 64: 6892-9; Ohgaki H, Kleihues P. Genetic alterations and signaling pathways in the evolution of gliomas. Cancer Sci. 2009; 100: 2235-41]. Быстрая и своевременная диагностика и определение типа глиальной опухоли позволит оптимизировать процесс лечения и существенно повысить его эффективность.

В настоящее время диагностика глиомы в основном основывается на методах нейровизуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) или компьютерная томография (КТ), которые дороги, трудоемки и требуют наличия дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала [Shankar GM, Balaj L, Stott SL, Nahed B, Carter BS. Liquid biopsy for brain tumors. Expert Rev Mol Diagn. 2017; 17: 943-7]. Кроме того, выделяют большое количество различных типов глиальных опухолей, которые требуют разных вариантов лечения. Невозможно точно определить тип опухоли только с помощью МРТ и/или КТ. Классификация глиом Всемирной организации здравоохранения [Louis, D.N; WHO Classification of Tumours Editorial Board. Central nervous system tumours [Internet]; International Agency for Research on Cancer: Lyon, France, 2021; 5th ed.; vol. 6; URL: https://tumourclassification.iarc.who.int/chapters/45] основана на степени злокачественности, определяемой по статусу опухолевых маркеров в ткани опухоли. К наиболее часто используемым в нейроонкологии маркерам, включенным в классификационные параметры первичных опухолей ЦНС определяемым с помощью иммуногистохимии, относится уровень пролиферативной активности Ki-67.

Ki-67 - ядерный белок, ассоциированный с пролиферацией клеток и принимающий участие в синтезе рибосомной РНК. Он обнаруживается во всех активных фазах клеточного цикла и не проявляет себя в фазе покоя, тем самым его экспрессия наглядно отражает выраженность пролиферативной активности ткани. В глиальных новообразованиях этот фактор чаще всего используется как вспомогательный для дифференциальной диагностики Low Grade (I, II) и High Grade (III, IV) глиом [Theresia, E.; Malueka, R.G.; Pranacipta, S.; Kameswari, B.; Dananjoyo, K.; Asmedi, A.; Wicaksono, A.S.; Hartanto, R.A.; Dwianingsih E.K. Association between Ki-67 Labeling index and Histopathological Grading of Glioma in Indonesian Population. Asian Pac J Cancer prev. 2020, 21, 1063 - 1068. doi: 10.31557/APJCP.2020.21.4.1063].

Стратегия лечения для каждого типа глиомы также определяется на основе этих оценок. Статус глиомы может иметь отношение к степени хирургического вмешательства, которое может потребоваться.

Однако, определение опухолевых маркеров проводится только непосредственно в опухоли, то получение информации о иммуногистохимичеком статусе глиомы возможно только после операции или после проведения биопсии. Биопсия ткани головного мозга имеет высокую инвазивность и высокий риск для субъекта, имеются случаи, когда забор ткани головного мозга не может быть проведен. Кроме того, гистопатологическое исследование требует сложных операций иммуногистохимического окрашивания, для получения результата требуется время и дорогостоящее оборудование и импортные реактивы.

Известен способ диагностики степени анаплазии опухолей головного мозга с использованием протонной магнитно-резонансной спектроскопия (ПМРС) [Труфанов Г.Е., Тютин Л.А. Магнито-резонансная спектроскопия. - СПб.: ЭЛ-БИ-СПб, 2008. - 239 с.]. Способ основан на определении содержания некоторых метаболитов в опухолевых тканях и в перитуморальной зоне. Наиболее часто исследуют холин, лактат, креатин, фосфокреатинин, мио-инозин, глутамат, глутамин, липиды, N-ацетиласпартат и их соотношения.

Известный способ включает получение спектра из кубического участка (вокселя) вещества мозга или опухоли размером 2×2×2 см (8 см³) и анализ частот в регистрируемом от этого вокселе спектра, в результате чего получают распределение определенных метаболитов в ткани по шкале химического сдвига (ррт). Соотношение между пиками метаболитов в спектре, уменьшение или увеличение высоты отдельных пиков спектра позволяют неинвазивно оценивать биохимические процессы, происходящие в тканях. Злокачественные опухоли характеризуются низким соотношением N-ацетиласпартат / креатин, увеличением соотношения холин / креатин и, в некоторых случаях, появлением пика лактата.

Технический результат известного способа заключается в обеспечении возможности оценки различных объёмных образований головного мозга и дифференциальной диагностике астроцитом, эпендимом и примитивных нейроэпителиальных опухолей, предположительно определяя тип опухолевой ткани. Известный способ позволяет диагностировать с высокой долей вероятности степень злокачественности процесса

Однако, к недостаткам известного способа можно отнести недостаточную точность диагностики, так как исследуется только один участок ткани небольшого объема (воксель). При многовоксельной спектроскопии исследование осуществляют только в одной плоскости на относительно небольшом участке новообразования. Вместе с тем, известно, что опухоль неоднородна по своему строению и активности опухолевых клеток. Поэтому получить информацию об активности всей опухоли с применением данного способа не представляется возможным. Кроме того, расположение рядом с зоной исследования костных структур, ликворных пространств, крупных сосудов и очагов геморрагии приводит к появлению артефактов, искажающих результаты исследований [Подопригора А.Е. Протонная магнито-резонансная спектроскопия в диагностике объемных заболеваний головного мозга: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - М., 2002. - 30 с.]. Помимо этого, похожие изменения метаболитов выявляются при абсцессах, при пилоцитарных астроцитомах, что не позволяет с помощью ПМРС четко дифференцировать степень анаплазии, злокачественные и доброкачественные опухоли головного мозга [Корниенко, В.Н., Пронин И.Н. Диагностическая. - М.: ИП «Андреева Т.М.», 2006. - 1327 с.]. Кроме того, исследование противопоказано проводить при встроенном кардиостимуляторе, зажимах сосудов, металлических имплантах, кохлертарном протезе внутреннего уха, беременности, клаустрофобии и тяжелом общем состоянии пациента. Иногда для проведения ПМРС необходим наркоз (для детей младшего возраста, взрослых пациентов с психическими отклонениями или с болевым синдромом), так как во время проведения процедуры обследуемый должен быть абсолютно неподвижен на протяжении длительного времени.

Известен способ диагностики злокачественных новообразований головного мозга, включающий исследование биологического материала с помощью инструментальных методов исследования и постановку диагноза [Wang H., Jiang D., Li W., Xiang X., Zhao J., Yu B., Wang C., He Z., Zhu L., Yang Y. Evaluation of serum extracellular vesicles as noninvasive diagnostic markers of glioma // Theranostics. 2019 Jul 9; 9(18): 5347-5358. DOI: 10.7150/thno.33114].

Известный способ осуществляют следующим образом.

Образец сыворотки крови приготовляют путем центрифугирования (в течение 10 минут при 2500 g) венозной крови. 250 мкл сыворотки разводили в 15 мл фосфатно-солевого буфера, центрифугировали при 2000 g в течение 15 минут, фильтровали (размеры пор 0,2 мкм). Затем сыворотку ультрацентрифугировали при 150 000 g в течение не менее 8 ч при 4°С. Осадок промывали 26 мл фосфатно-солевым буфером при 4°С в течение 2 часов. Полученные внеклеточные везикулы ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, смешивали с латексными шариками и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре при 220 об/минут на термошейкере. Затем добавляют 100 мкл фосфатно-солевого буфера и инкубируют при 4°С в течение более 7 часов. Затем добавляют 100 мМ глицина и 10% бицинхониновой кислоты для остановки реакции. Потом 100 мкл 2% бицинхониновой кислоты используют для промывки шариков и центрифугируют в течение 1 мин. в 14 800 g. Далее с помощью проточной цитометрии с использованием первичных и вторичных антител определяют экспрессию белков EGFR. При экспрессии EGFR в сывороточных внеклеточных везикулах более 46% диагностируют глиомы высокой степени злокачественности, поскольку уровень EGFR во внеклеточных везикулах положительно коррелирует с Ki-67 в опухолевой ткани.

К недостаткам способа можно отнести его сложность и трудоемкость выполнения. Известный способ ограничен в применении из-за отсутствия в больницах практического здравоохранения технического оснащения для его выполнения и высокой себестоимости реактивов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа диагностики глиальных опухолей и определение степени ее анаплазии в дооперационном периоде.

Технический результат способа заключается в прогнозировании уровня Ki-67 на основании которого устанавливается диагноз, то есть обеспечивает раннюю диагностику на дооперационном этапе.

Технический результат изобретения достигается тем, что исследуют удельную активность гексокиназы крови, удельный уровень натрия и цинка, при удельной активности гексокиназы в крови более 0,1 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 49,45 мкг×10^-3/ 1г белка, удельном уровне цинка более 0,01 мкг×10^-3/ 1г белка диагностируют наличие опухоли, при этом при удельной активности гексокиназы в крови 0,21 сЕд/г белка и менее, удельном уровне натрия 71 мкг×10^-3/ 1г белка и менее, удельного уровня цинка 0,09 ×10^-3/ 1г белка и менее определяют степень анаплазии 1-2, прогнозируя низкий, менее 10%, уровень Ki-67, а при удельной активности гексокиназы в крови более 0,21 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 71 мкг×10^-3/ 1г белка, удельном уровне цинка более 0,09 ×10^-3/ 1г белка определяют степень анаплазии 3-4, прогнозируя высокий, более 10%, уровень Ki-67.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У больного из кубитальной вены берут кровь объёмом 10 мл в пробирку с цитратом в качестве антикоагулянта. Из плазмы, полученной в результате центрифугирования (в течение 10 минут при 2500 g) отбирают для определения активности гексокиназы 0,2 мл, для определения белка 0,4 мл, для определения концентрации натрия и цинка - 1 мл.

Определяют активность гексокиназы путем измерений в многолуночном спектрофотометрическом планшетном ридере при 450 нм с использованием набора реактивов «Sigma-Aldrich» (США). Строят стандартную кривую NADH по стандартным пробам с заданными концентрациями никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (NADH): в каждую лунку 96-луночного планшета 0, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл стандартного раствора NADH с концентрацией 1,25 мМ (1,25 нмоль / мл) и доводят объем до 50 мкл буфером для анализа гексокиназы, получая 0; 2,5; 5; 7,5; 10 и 12,5 нмоль/мл концентрацию стандартов NADH. Из полученных данных вычитают фоновые значения (значение оптической плотности нулевого «0» фонового образца).

Для измерения в опытных пробах в каждую лунку планшета добавляют 50 мкл реакционной смеси, которая содержит: буфер (34 мкл), ферментная смесь (2 мкл), проявитель гексокиназы (2 мкл), кофермент гексокиназы (2 мкл), плазма крови пациента (10 мкл). В лунку с фоновым образцом вносят: буфер (44 мкл), ферментную смесь (2 мкл), проявитель гексокиназы (2 мкл) и кофермент гексокиназы (2 мкл). Выполняют не менее трех повторностей.

После перемешивания на горизонтальном шейкере реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре. Первое измерение оптической плотности (A450) проводят через пять минут (T_initial) от начала инкубации. Далее фиксируют значения каждые пять минут до тех пор, пока значение самого активного образца в повторностях не станет больше значения самого высокого стандарта, фиксируя оптическую плотность при T_final.

Из опытного показателя самого активного образца в повторностях вычитают значение оптической плотности нулевого «0» фонового образца. Рассчитывают активность гексокиназы по формуле:

В - количество нмоль NADH, генерируемого между T_initial и T_final; Т_{реакции} = T_final - T_initial (минуты); V- объем образца (мл), добавленный в лунку; фактор разведения образца =1.

Определяют концентрацию натрия и цинка методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на спектрометре iСАР6300Duo [Thermo Scientific, США; Чудинов Э.Г. Атомно-эмиссионный анализ с индукционной плазмой. Итоги науки и техники. Сер. Аналитическая химия. М.: ВИНИТИ. 1990. Т. 2. 253 с.; Бёккер Ю. Спектроскопия. Пер. с нем. Москва: Техносфера. 2009. 528 с.].

1 мл плазмы осторожно переносят на дно кварцевой пробирки. Заливают содержимое 2 мл азотной кислоты (особо чистой) и оставляют на ночь. На следующий день наливают в каждую пробирку по 250 мкл пероксида водорода 36%.

Далее выполняют автоклавную минерализацию тканей: пробирку с пробой и пробирку с «контролем», содержащую эквивалентную смесь реактивов, помещают в реакционную ёмкость; реакционную ёмкость с пробирками закрывают крышкой и герметизируют в металлическом корпусе автоклава; автоклав помещают в холодный термостат, устанавливают температуру первой стадии нагрева и нагревают автоклав в соответствии с температурной программой, выдерживая на каждой стадии ступенчатого нагрева: 160ºС - 1 ч, 180ºС - 1 ч, 200ºС - 2 ч. Затем (по окончании минерализации) извлекают автоклав из термостата, помещают в устройство для охлаждения и охлаждают до комнатной температуры. Разгерметизацию автоклава и последующие операции по подготовке минерализата к анализу проводят в вытяжном шкафу. Образовавшийся минерализат переносят в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 2-3 мл бидистилированной воды. Доводят объём раствора минерализата бидистилированной водой до отметки 15 мл. Определяют концентрацию натрия и цинка с помощью атомно-эмиссионного спектрометра с индуктивно связанной плазмой АЭС и ИСП Модель i САР6300 INTERTECH (США).

Определяют концентрацию белка методом Лоури с использованием набора реактивов ООО «Фирма Синтакон», Россия, на спектрофотометре UVmini 1240, Shimadzu. В пробирку с опытной пробой добавляют плазму крови пациента (0,4 мл) и рабочий раствор (2,0 мл). В пробирку с холостой пробой помещают дистиллированную воду (0,4 мл) и рабочий раствор (2 мл). Тщательно перемешивают содержимое двух пробирок и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем в каждую добавляют реагент (0,2 мл), перемешивают и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем измеряют на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм оптическую плотность опытной пробы относительно холостой. Содержание белка в образце определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания белка в пробе, для построения которого используют калибровочные пробу.

Удельную активность гексокиназы и удельную концентрацию натрия и цинка определяют путем деления полученных значений на количество белка.

При удельной активности гексокиназы в крови более 0,1 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 49,45 мкг×10^-3/ 1г белка, удельном уровне цинка более 0,01 мкг×10^-3/ 1г белка диагностируют наличие опухоли, при этом при удельной активности гексокиназы в крови 0,21 сЕд/г белка и менее, удельном уровне натрия 71 мкг×10^-3/ 1г белка и менее, удельного уровня цинка 0,09 ×10^-3/ 1г белка и менее определяют степень анаплазии 1-2, прогнозируя низкий уровень Ki-67 (менее 10%); при удельной активности гексокиназы в крови более 0,21 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 71 мкг×10^-3/ 1г белка, удельном уровне цинка более 0,09 ×10^-3/ 1г белка определяют степень анаплазии 3-4, прогнозируя высокий, более 10%, уровень Ki-67.

Для характеристики информативности способа диагностики глиальных опухолей в дооперационном периоде были рассчитаны объективные параметры, именуемые операционными характеристиками теста. Рассчитанная диагностическая чувствительность способа выявления наличия глиомы в дооперационном периоде составляет 72,2%, а диагностическая специфичность - 100%.

Рассчитанная диагностическая чувствительность способа дооперационного прогнозирования степени анаплазии глиальных опухолей составляет 67,7%, а диагностическая специфичность - 83,3%.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из карт пациентов.

Пример 1.

Пациентка Б., 36 лет. Поступила с жалобами на головную боль, ощущение движения предметов, тошноту, нарушение речи при нервных нагрузках. По данным МРТ - в интра- и субкортикальных отделах левой височной доли, распространяясь на лобную долю и островок, определяется объемное образование с нечеткими неровными контурами, сливающимися с зоной перифокального отека, совокупными размерами около 8,2×4,8×5,9 см.

Для установки предварительного диагноза использован предложенный способ. При поступлении в стационар до начала терапевтических мероприятий осуществлен анализ биохимических параметров крови:

- удельная активность гексокиназы = 0,21 сЕд/г белка, (более 0,1 сЕд/г белка и равно 0,21);

- удельный уровень натрия = 70,31 мкг×10^-3/ 1г белка (более 49,45 мкг×10^-3/ 1г белка и менее 71 мкг×10^-3/ 1г белка);

- удельный уровень цинка = 0,086 мкг×10^-3/ 1г белка (более 0,01 мкг×10^-3/ 1г белка менее 0,09 ×10^-3/ 1г белка), что позволяет сделать вывод о наличии глиальной опухоли и низкой степени ее анаплазии (степень анаплазии 1-2), прогнозировать низкий уровень Ki-67 в опухоли (менее 10%).

Больная была прооперирована - удаление опухоли. При гистологическом исследовании послеоперационного материала гистохимически выявлен уровень Ki-67 = 8% (<10 %), гистологическая картина и иммунофенотип опухоли соответствуют Олигодендроглиоме, ICD-O code 9450/3, grade II. Таким образом, вывод, сделанный по предложенному способу, подтвержден.

Пример 2. Пациент Г., 53 года. Поступил с жалобами на нарушение зрения, головную боль. Болеет с 02.12.2020, первичные жалобы: заболела голова, ухудшилось зрение на фоне высокого артериального давления. По данным МРТ в базальных отделах правой височно-теменно-затылочной области определяется объемное кистозно-солидное образование, кортикально-субкортикальной локализации с вовлечением зрительной лучистости, размерами 5,6×4,25×5,18 см.

При поступлении в стационар до начала терапевтических мероприятий осуществлен анализ биохимических параметров крови:

удельная активность гексокиназы = 0,22 сЕд/г белка (более 0,1 сЕд/г белка и более 0,21),

удельный уровень натрия = 72,66 мкг×10^-3/ 1г белка, (более 49,45 мкг×10^-3/ 1г белка и более 71 мкг×10^-3/ 1г белка)

удельный уровень цинка = 0,096 мкг×10^-3/ 1г белка (более 0,01 мкг×10^-3/ 1г белка более 0,09 ×10^-3/ 1г белка),

В соответствии с предложенным способом сделан вывод о наличии глиальной опухоли и высокой степени ее анаплазии (степень анаплазии 3-4), прогнозируя высокий уровень Ki-67 (более 10%) в опухоли.

Больной был прооперирован - удаление опухоли. При гистологическом исследовании послеоперационного материала гистохимически выявлен уровень Ki-67 = 25% (>10 %), гистологическая картина и иммунофенотип опухоли соответствуют Глиобластоме, ICD-0 code 9445/3, WHO grade IV. Таким образом, вывод, сделанный по предложенному способу, подтвержден.

Пример 3. Пациентка М., 30 лет. Обратилась с жалобами на эпиприступы. При МРТ от 20.03.2023 выявлено образование правой теменно-височной области.

При поступлении в стационар до начала терапевтических мероприятий осуществлен анализ биохимических параметров крови:

удельная активность гексокиназы = 0,1 сЕд/г белка, (=0,1 сЕд/г белка);

удельный уровень натрия = 48,73 мкг×10^-3/ 1г белка (менее 49,45 мкг×10^-3/ 1г белка);

удельный уровень цинка = 0,007 мкг×10^-3/ 1г белка (менее 0,01 мкг×10^-3/ 1г белка).

В соответствии с предложенным способом сделан вывод об отсутствии глиальной опухоли.

При ПЭТ КТ с метионином диагноз опухоли головного мозга исключен, диагностирована фокальная корковая дисплазия. Больная была прооперирована. В результате исследования гистологического послеоперационного материала была подтверждена Фокальная корковая дисплазия, которая не является опухолевым заболеванием, а возникшим в период внутриутробного развития локальное нарушение в строении мозговой коры за счет разрастания корковых клеток мозга в белом мозговом веществе. Таким образом, вывод, сделанный по предложенному способу, подтвержден.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, онкологии, и может быть использовано для диагностики глиальных опухолей в дооперационном периоде. Проводят исследование крови, в котором определяют удельную активность гексокиназы крови, удельный уровень натрия и цинка в крови. При удельной активности гексокиназы в крови более 0,1 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 49,45 мкг×10^-3/1 г белка, удельном уровне цинка более 0,01 мкг×10^-3/1 г белка диагностируют наличие опухоли. При удельной активности гексокиназы в крови 0,21 сЕд/г белка и менее, удельном уровне натрия 71 мкг×10^-3/1 г белка и менее, удельном уровне цинка 0,09×10^-3/1 г белка и менее определяют степень анаплазии 1-2, прогнозируя низкий, менее 10%, уровень Ki-67. При удельной активности гексокиназы в крови более 0,21 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 71 мкг×10^-3/1 г белка, удельном уровне цинка более 0,09×10^-3/1 г белка определяют степень анаплазии 3-4, прогнозируя высокий, более 10%, уровень Ki-67. Способ обеспечивает возможность прогнозирования уровня Ki-67, на основании которого устанавливается диагноз, то есть обеспечивает раннюю диагностику на дооперационном этапе и прогнозирование степени злокачественности новообразований головного мозга, за счет исследования свойств крови: удельной активности гексокиназы крови и удельного уровня натрия и цинка в крови. 3 пр.

Способ диагностики глиальных опухолей в дооперационном периоде, включающий исследование крови и постановку диагноза, отличающийся тем, что определяют удельную активность гексокиназы крови, удельный уровень натрия и цинка в крови и при удельной активности гексокиназы в крови более 0,1 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 49,45 мкг×10^-3/1 г белка, удельном уровне цинка более 0,01 мкг×10^-3/1 г белка диагностируют наличие опухоли, при этом при удельной активности гексокиназы в крови 0,21 сЕд/г белка и менее, удельном уровне натрия 71 мкг×10^-3/1 г белка и менее, удельном уровне цинка 0,09×10^-3/1 г белка и менее определяют степень анаплазии 1-2, прогнозируя низкий, менее 10%, уровень Ki-67, а при удельной активности гексокиназы в крови более 0,21 сЕд/г белка, удельном уровне натрия более 71 мкг×10^-3/1 г белка, удельном уровне цинка более 0,09×10^-3/1 г белка определяют степень анаплазии 3-4, прогнозируя высокий, более 10%, уровень Ki-67.