СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ОБЕЗЬЯНЬЕЙ ОСПЫ ВИДА MONKEYPOX МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (MPX AMP PS) Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к мониторингу носительства вируса обезьяньей оспы вида monkeypox у здоровых лиц, диагностике лиц с подозрением на обезьянью оспу и больных обезьяньей оспой.

Обезьянья оспа относится к зоонозным инфекционным заболеваниям вирусной этиологии. Вирус обезьяньей оспы филогенетически близок вирусу натуральной оспы (оба входят в род Orthopoxvirus, семейство Poxviridae) и вызывает схожие симптомы, но обезьянья оспа у людей протекает значительно легче. Симптомы включают высокую температуру, головную боль, миалгию, боль в спине, озноб, истощение, увеличение лимфоузлов и характерные высыпания. В большинстве случаев обезьянья оспа - самокупируемое заболевание, и ее симптомы исчезают через 2-4 недели после начала заболевания, но в некоторых случаев возникают осложнения, которые включают вторичные инфекции, бронхопневмонию, заражение крови, энцефалит, а также инфекцию роговицы, которая может привести к потере зрения. Летальность варьируется от 0 до 11%. Наибольший уровень смертности наблюдается среди детей младшего возраста.

Зоонозная передача вируса может происходить при прямом контакте с кровью, биологическими жидкостями или пораженными участками кожи или слизистой зараженного животного. В Африке признаки инфицирования оспой обезьян были обнаружены у целого ряда животных, в том числе полосатых белок, древесных белок, гамбийских крыс, соней, а также различных видов обезьян. К настоящему моменту естественный резервуар вируса не выявлен, однако с наибольшей долей вероятности им выступают грызуны.

Передача инфекции от человека к человеку происходит воздушно-капельным путем и при тесном контакте с кожными поражениями инфицированного или предметами, недавно загрязненными вирусными частицами. Так как для передачи инфекции воздушно-капельным путем обычно требуется длительный контакт «лицом к лицу», в зоне повышенного риска находятся медицинские работники, домочадцы и другие люди, имевшие тесный физический контакт с инфицированными людьми. Вирус также может передаваться от матери к плоду через плаценту (что может привести к врожденной оспе обезьян) или при тесном контакте во время или после родов. Распространение обезьяньей оспы в человеческой популяции объясняться общим снижением иммунитета к вирусу из-за прекращения вакцинации от натуральной оспы.

В течение 1-3 дней (иногда позже) после появления лихорадки у больного появляется сыпь, часто начинающаяся на лице, затем распространяющаяся на другие части тела. Поражает лицо (в 95% случаев), ладони и подошвы стоп (в 75% случаев). Поражаются также слизистые оболочки полости рта (в 70% случаев), половых органов (30%) и конъюнктивы (20%), а также роговица. Сыпь развивается последовательно от пятен (поражения с плоским основанием) к папулам, везикулам, пустулам и, наконец, коркам, которые подсыхают и отпадают. Количество поражений колеблется от нескольких до нескольких тысяч. В тяжелых случаях поражения могут слоиться до тех пор, пока не отслоятся большие участки кожи.

Диагностируют оспу обезьян по наличию вирусной ДНК в биологических образцах методом ПНР. В качестве анализируемых образцов могут выступать смывы с участков кожных поражений, соскоб со дна пузырьков, корочки, мазки с задней стенки глотки или миндалин, образцы крови (с ЭДТА), аутопаты легких, печени, почек и селезенки (https://www.who.int/ru). Метод диагностики предусматривает экстракцию ДНК из биологических образцов с последующим проведением полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов ДНК генома вируса обезьяньей оспы с использованием набора праймеров и зонда, комплементарных участку гена анкирин-подобного белка вируса обезьяньей оспы.

Однако не существует готовых наборов для выявления ДНК вируса обезьяньей оспы вида monkeypox методом ПНР в реальном времени. В настоящее время пандемия обезьяньей оспой объявлена чрезвычайной ситуацией мирового масштаба. Для того чтобы сдержать распространения болезни, требуются инструменты для своевременной диагностики заболевших, а также для выявления носителей вируса оспы обезьян еще до появления первых симптомов. Создание такого инструмента и является целью нашего изобретения.

Технической задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа идентификации ДНК вируса обезьяньей оспы в биологических образцах и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость, и т.д.).

Поставленная задача решалась путем: конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на специфические для вируса оспы обезьян фрагменты ДНК; конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, несущей специфический участок ДНК-матрицы; оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР.

Авторами предложен способ выявления вируса обезьяньей оспы, согласно которому выделенную из биологических образцов ДНК анализируют в одной пробирке при помощи полимеразной цепной реакции, при помощи олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно меченого зонда.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров и зонд для гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) был выбран наиболее консервативный участок генома вируса обезьяньей оспы. Были проанализированы все имеющиеся в базе данных последовательности. Также были подобраны праймеры и флуоресцентный зонд для ВКО в качестве внутреннего контроля ПНР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фиг. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе контрольных образцов. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце ДНК вируса обезьяньей оспы, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие ДНК вируса.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда проводился с использованием программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator и MFold.

Для контроля качества прохождения ПНР в состав методики были введены рекомбинантные положительные контрольные образцы K+ и ПКО и внутренний контрольный образец (ВКО). Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в два шага. Конечный ПНР-продукт лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», USA) и трансформировали им Escherichia coli (штамм XLl-Blue). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500x1 («Applied Biosystems», США).

Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительных контрольных образцов этапа ПЦР (К+) и выделения (ПКО). Для этого определяли концентрацию ДНК в растворе рекомбинантной плазмиды и разводили стерильной водой до рабочей концентрации 1*10⁷ копий/мл для K+, и 1*10⁵ копий/мл для ПКО.

Оценку аналитической чувствительности метода производили на разведениях раствора рекомбинантной плазмиды, которую проводили через все стадии выделения с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), а затем с помощью специфических праймеров и флуоресцентных зондов определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев.

Определенная таким образом аналитическая чувствительность метода составила 1*10² копий/мл.

Свойство изобретения специфически определять ДНК вируса обезьяньей оспы достигнуто путем подбора праймеров и зондов к высококонсервативным фрагментам ДНК вируса, что минимизирует возможность перекрестных реакций с геномом человека, близкородственных микроорганизмов, других инфекционных возбудителей.

Аналитическую специфичность оценивали при помощи тестирования образцов генома человека и следующих микроорганизмов: вирус коровьей оспы, вирус ветряной оспы, вакцинный штамм. Неспецифические реакции отсутствуют.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован способ выявления ДНК вируса обезьяньей оспы в различных видах биологического материала. Технический результат достигается путем определения ДНК вируса, включающим выделение ДНК исследуемой пробы и проведение ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.

Диагностика проводится следующим образом: Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Материалом для исследования могут служить: клинические и биологические образцы.

Экстракция производится из 100 мкл полученной суспензии образца с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения нуклеиновых кислот, и последующим инкубированием 5 минут при температуре (65±1)°С. Выделение ДНК осуществляют с помощью наборов «Рибо-преп» и «Рибо-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам. Во все пробирки, включая контроль выделения, до этапа прогревания в лизирующем буфере добавляют 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО). После выделения ДНК приступают к постановке ПЦР.

Для упрощения подготовки и стандартизации выполнения анализа в тест-систему входят 7 реактивов:

1) Amp 1 МРХ, представляющий собой буферный раствор 100 mМ Трис-HCl, рН 8,5, 100 mМ KСl, 0,4 мМ каждого нуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgCl₂, 0.1 ед. акт./мкл HS-Taq ДНК-полимеразы, 0,025% Tween 20, стабилизаторы Taq ДНК-полимеразы;

2) Amp 2 МРХ - содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды к ДНК вируса обезьяньей оспы и к ВКО;

3) K+- представляет собой смесь двух плазмидных ДНК:

a) Плазмида, содержащая фрагмент вируса обезьяньей оспы;

b) Плазмида, содержащая фрагмент ВКО;

с которых, при помощи реактива Amp 2 МРХ, амплифицируются специфические фрагменты;

4) K- - представляет собой дистиллированную стерильную воду;

5) ПКО - плазмида, содержащая фрагмент вируса обезьяньей оспы, который амплифицируются при помощи реактива Amp 2 МРХ;

6) ОКО - дистиллированная стерильная вода;

7) ВКО - представляет собой плазмиду, содержащую фрагмент ВКО, которая амплифицируются при помощи реактива Amp 2 МРХ.

Все реактивы хранятся при температуре -20°С.

Для постановки реакции ПЦР в реальном времени нужно взять необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб; плюс четыре пробирки для положительных и отрицательных контролей. Подготовить ПЦР-смесь из расчета на одну реакцию: 12,5 мкл реактив Ampl МРХ, 2,5 мкл реактив Аmр2 МРХ. По 15 мкл полученной смеси вносят в пробирки, затем добавляют в каждую по 10 мкл ДНК-пробы, экстрагированной из исследуемого материала. Готовят 4 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля ПЦР вносят 10 мкл K+, в пробирку для положительного контроля экстракции вносят 10 мкл образца, экстрагированного из ПКО. В пробирку для отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл K-, в пробирку для отрицательного контроля экстракции вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Микропробирки переносят в программируемый амплификатор с функцией детекции флуоресценции в режиме «реального времени» по каналам (FAM/SybrGreen/Green и JOE/HEX/Yellow). Режим амплификации представлен в таблице 3.

Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 60°С по каналам Green (FAM) и Yellow (JOE/HEX). Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. Накопление флуоресцентного сигнала по каналу HEX свидетельствует о наличии в исследуемом материале ДНК вируса обезьяньей оспы. При этом результат считается валидным, если параллельно в пробе по каналу FAM регистрируется накопление флуоресцентного сигнала ВКО, а в образцах K+ и ПКО - по каналу HEX. Сигнал по каналу HEX в образцах K- и ОКО должен отсутствовать.

Таким образом, заявляемый способ выявления позволяет достоверно выявлять ДНК вируса обезьяньей оспы в биологических образцах.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="21032023MPX.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>00000</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>00000</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022128990</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-08</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки &quot;Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека&quot;(ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени

Пастера),ул.Мира,14,Санкт-Петербург,197101,Российская Федерация

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Saint-Petersburg Pasteur Institute

</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Долгова Анна Сергеевна

</InventorName>

<InventorNameLatin>Dolgova Anna Sergeevna </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления вируса обезьяньей

оспы вида Monkeypox методом ПЦР в реальном времени (MPX AMP

PS)</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">A method for detecting monkeypox

virus by Real-Time PCR (MPX AMP PS).</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>искусственная

последовательность</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atagatagatagaatatgcattagttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>искусственная последовательность

</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tacttatcgtgaacgtaccatac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>искусственная

последовательность</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&lt;1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodamine 6G

(9-[2-(ethoxycarbonyl)phenyl)-N-ethyl-6-(ethylamino)-2,7-dimethyl-3H-x

anthen-3-iminium chloride) fluorophore at

5&apos;end.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Флуорофор Родамин 6Ж

(9-[2-(этоксикарбонил)фенил]-N-этил-6-(этиламино)-2,7-диметил-3H-ксант

ен-3-иминия хлорид) на 5&apos;-конце.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>&gt;31</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Non fluorescent Black Hole Quencher 1

(2-[N-(2-hydroxyethyl)-4-[[2-methoxy-5-methyl-4-[(4-methyl-2-nitrophen

yl)diazenyl]phenyl]diazenyl]anilino)ethanol at 3&apos; end

.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Не флуоресцентный тушитель Black

Hole Quencher 1

(2-[N-(2-гидроксиэтил)-4-[[2-метокси-5-метил-4-[(4-метил-2-нитрофенил)

диазенил]фенил]диазенил]анилино]этанол] на 3&apos;-конце

.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taccgctatagttactatcgaataacacggt</INSDSeq_sequence

>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Описан способ выявления вируса обезьяньей оспы у здоровых лиц, диагностики лиц с подозрением на оспу, и у людей, больных оспой обезьян. Диагностику проводят с использованием ДНК, праймеров и зонда: ATAGATAGATAGAATATGCATTAGTTC, TACTTATCGTGAACGTACCATAC, R6G-TACCGCTATAGTTACTATCGAATAACACGGT-BHQ1. Изобретение позволяет осуществлять эпидемиологический мониторинг, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению свойств вируса обезьяньей оспы. 1 ил., 3 табл.

Способ выявления вируса обезьяньей оспы вида monkeypox методом ПЦР в реальном времени, предусматривающий экстракцию ДНК из биологических образцов, с последующим проведением полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов ДНК генома вируса обезьяньей оспы с использованием набора праймеров и зонда, комплементарных участку гена анкирин-подобного белка вируса обезьяньей оспы, отличающийся тем, что в качестве праймеров используются последовательности

MPX-f (SEQ ID NO. 1) ata gat aga tag aat atg cat tag ttc

MPX-r (SEQ ID NO. 2) tac tta teg tga acg tac cat ac

а в качестве зонда

MPX-pr (SEQ ID NO. 3) R6G - tac cgc tat agt tac tat cga ata аса egg t - BHQ1.