Ссылка на список последовательностей

Данная заявка подана в электронном виде по сети EFS и включает представленный в электронном виде список последовательностей в формате txt. Файл txt содержит список последовательностей под именем "РС072530А_SeqListing_ST25.txt", созданный 1 июля 2021 года и имеющий размер 1,24 МБ. Список последовательностей, содержавшийся в этом файле txt, является частью описания и включен в настоящий документ посредством отсылки во всей свой полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам производства вакцин против респираторного синцитиального вируса (РСВ). В частности, изобретение относится к способам очистки рекомбинантно полученных белков РСВ, включающим стадию анионообменной хроматографии.

Уровень техники

Рекомбинантные белки, такие как белки, применяемые в терапевтических или профилактических целях, получают в генетически модифицированных клетках-хозяевах, собранных из биореакторов, а затем очищают в контролируемых многоступенчатых процессах, разработанных так, чтобы обеспечивать высокую степень чистоты конечного продукта.

Одной из главных сложностей является снижение содержания примесей, в частности, остаточных белков клеток-хозяев (БКХ), которые являются белками, экспрессируемыми клетками-хозяевами, используемыми при получении терапевтического белка.

Хотя с точки зрения регулирующих органов ни для каких биофармацевтических продуктов не может существовать какого-либо определенного приемлемого уровня БКХ, в каждом конкретном случае требуется максимально снижать уровень БКХ, чтобы свести к минимуму любой связанный с ними риск нарушения безопасности и отрицательное влияние на эффективность.

Одна из стандартных стадий, используемых в способах очистки белков для терапевтического или профилактического применения, состоит из стадии анионообменной хроматографии, в которой наносимый раствор, содержащий целевой белок, наносят на среду для анионообменной хроматографии, например, в форме смолы, помещенной в хроматографическую колонку.

Такая колонка для анионообменной хроматографии может работать в режиме связывания и элюирования, где:

- наносимый раствор, полученный из собранной культуральной жидкости клеток и включающий белок РСВ, подвергают контакту со средой для анионообменной хроматографии, в результате чего белок РСВ связывается со средой для анионообменной хроматографии;

- среду для анионообменной хроматографии промывают по меньшей мере промывочным раствором для удаления примесей; и

- белок РСВ элюируют со среды для анионообменной хроматографии.

Обычно ожидается, что представляющий интерес белок будет терять связывающую способность по мере снижения рабочего рН анионообменной смолы. Поэтому промывочные растворы, имеющие рН приблизительно 7,0 или выше, обычно используются в таких способах для сохранения связывания продукта. Условия с более низкими значениями рН обычно не используют для стадии анионного обмена, поскольку общепринятые принципы предполагают, что белки будут иметь меньше отрицательных поверхностных зарядов по мере снижения рН, что повлияет на способность белка связываться со средой.

Сущность изобретения

Авторы изобретения тем не менее обнаружили, что белки с сиалированием в гликановом профиле имеют дополнительные отрицательные заряды, которые позволяют белку оставаться связанным с анионообменной средой в условиях более низкого рН. Было обнаружено, что содержание сиаловой кислоты, как части гликановых модификаций белка, увеличивает общее количество поверхностных зарядов и обеспечивает сохранение связывания белка в диапазонах более низких значений рН.

Авторы изобретения также обнаружили, что уровень рН является значимым фактором снижения БКХ, и что применение промывочных растворов в условиях более низкого рН показало эффективное удаление белков клетки-хозяина.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения среду для анионообменной хроматографии промывают по меньшей мере одним промывочным раствором с более низким рН при рН от 3,0 до 6,5, в результате чего повышается удаление белков клетки-хозяина.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения:

- рН наносимого раствора составляет от 7,0 до 8,5, предпочтительно приблизительно 7,5;

- рН указанного промывочного раствора с более низким рН составляет от 4,0 до 6,0, предпочтительно от 4,5 до 5,5, предпочтительно приблизительно 5,0;

- указанный промывочный раствор с более низким рН включает ацетат;

- концентрация ацетата в указанном промывочном растворе с более низким рН составляет от 56 до 84 мМ, предпочтительно от 63 до 77 мМ, предпочтительно приблизительно 70 мМ;

- перед элюированием белка РСВ среду для анионообменной хроматографии дополнительно промывают, по меньшей мере, первым промывочным раствором с более высоким рН при рН от 7,0 до 8,0, предпочтительно приблизительно 7,5;

- указанный первый промывочный раствор с более высоким рН включает Трис в концентрации от 18 до 22 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ;

- указанный первый промывочный раствор с более высоким рН включает NaCl в концентрации от 45 до 55 мМ, предпочтительно приблизительно 50 мМ;

- стадию промывки с использованием указанного первого промывочного раствора с более высоким рН проводят перед стадией промывки с использованием указанного промывочного раствора с более низким рН;

- перед элюированием белка РСВ среду для анионообменной хроматографии дополнительно промывают, по меньшей мере, вторым промывочным раствором с более высоким рН при рН от 7,0 до 8,0, предпочтительно приблизительно 7,5;

- указанный второй промывочный раствор с более высоким рН включает Трис в концентрации от 45 до 55 мМ, предпочтительно приблизительно 50 мМ;

- указанный второй промывочный раствор с более высоким рН включает NaCl в концентрации от 18 до 22 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ;

- стадию промывки с использованием указанного второго промывочного раствора с более высоким рН проводят после стадии промывки с использованием указанного промывочного раствора с более низким рН. Такая дополнительная стадия промывки позволяет элюировать продукт при постоянном рН;

- белок РСВ элюируют элюирующим раствором, имеющим рН от 7,0 до 8,0, предпочтительно приблизительно 7,5;

- указанный элюирующий раствор включает NaCl в концентрации от 146 до 180 мМ, предпочтительно приблизительно 163 мМ;

- указанный элюирующий раствор включает Трис в концентрации от 18 до 22 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ;

- наносимая нагрузка составляет от 7,5 до 15,0 мг на мл среды для анионообменной хроматографии;

- способ дополнительно включает стадию сНА-хроматографии;

- способ дополнительно включает стадию ХГВ-хроматографии;

- указанные стадии анионообменной хроматографии, сНА-хроматографии и ХГВ-хроматографии проводят последовательно в указанном порядке;

- белок РСВ является белком РСВ подгруппы А или РСВ подгруппы В;

- белок РСВ является F-белком РСВ;

- F-белок РСВ находится в префузионной конформации;

- F-белок РСВ представляет собой мутант F-белка дикого типа для любой подгруппы РСВ, который содержит одну или больше введенных мутаций;

- F мутант РСВ стабилизирован в префузионной конформации;

- F мутант РСВ специфично связывается с антителом D25 или AM-14;

- белок РСВ включают в состав для применения в качестве фармацевтического продукта для инъекций.

В еще одном аспекте изобретения предложен фармацевтический продукт, включающий белок РСВ, очищенный способом согласно первому аспекту изобретения.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F-белок РСВ.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F-белок РСВ из РСВ подгруппы А.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F-белок РСВ из РСВ подгруппы В.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F-белок РСВ в префузионной конформации.

В одном варианте осуществления полученный рекомбинантным способом белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ, стабилизированный в префузионной конформации.

В одном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ в тримерной форме.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ в тримерной форме и стабилизированный в префузионной конформации.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ в тримерной форме, включающий домен тримеризации, связанный с С-концом полипептида F1 указанного мутантного F-белка и стабилизированный в префузионной конформации.

В конкретном варианте осуществления указанный домен тримеризации представляет собой фолдон домен фибритина Т4.

В конкретном варианте осуществления указанный фолдон домен фибритина Т4 имеет аминокислотную последовательность

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 40).

В предпочтительном варианте рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, который специфично связывается с антителом D25 и/или АМ-14. Предпочтительно рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, который специфично связывается с антителами D25 и АМ-14.

Аминокислотная последовательность большого числа нативных F-белков РСВ из различных подтипов РСВ, а также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, известны в уровне техники. Например, последовательности нескольких белков-предшественников РСВ подтипов А, В и РСВ крупного рогатого скота представлены в заявке W0 2017/109629, SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6 и 81-270, которые представлены в прилагаемом к ней Списке последовательностей. Любая ссылка на номера SEQ ID NO в описании относится к номерам в WO 2017/109629, которые включены в Список последовательностей, содержащийся в файле txt, представленном как часть данного описания, и который полностью включен в настоящее описание посредством отсылки.

Нативный F-белок РСВ демонстрирует заметную консервативность последовательности среди подтипов РСВ. Например, подтипы А и В РСВ обладают 90% идентичностью последовательности, причем каждый из подтипов А и В РСВ обладает 81% идентичностью последовательности с F-белком РСВ крупного рогатого скота в молекуле белка-предшественника F0. Внутри подтипов РСВ идентичность последовательности F0 еще выше; например, в РСВ каждого из подтипов А, В и РСВ крупного рогатого скота белок-предшественник F0 РСВ обладает примерно 98% идентичностью последовательности. Почти все идентифицированные последовательности предшественников F0 РСВ состоят из 574 аминокислот с небольшими различиями по длине, как правило, из-за длины С-концевого цитоплазматического хвоста. Идентичность последовательностей различных нативных F-белков РСВ известна в уровне техники (см., например, WO 2014/160463). Чтобы дополнительно проиллюстрировать уровень консервативности последовательности F-белков, в Таблицах 17 и 18 WO 2014/160463 представлены неконсенсусные аминокислотные остатки из последовательностей полипептидов-предшественников F0 репрезентативных штаммов РСВ А и штаммов РСВ В (где неконсенсусные аминокислоты были идентифицированы после выравнивания выбранных последовательностей F-белка из штаммов РСВ А при использовании ClustalX (v. 2)).

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, содержащий пару цистиновых мутаций, названных в WO 2017/109629 "генно-инженерно введенными мутациями дисульфидной связи", где мутант включает те же введенные мутации, которые присутствуют в любом из иллюстративных мутантов, представленных в Таблицах 1 и 4-6 в WO 2017/109629. Примеры F мутантов РСВ, представленные в Таблицах 1 и 4-6 WO 2017/109629, основаны на одной и той же нативной последовательности F0 штамма РСВ А2 с тремя встречающимися в природе заменами в положениях 102, 379 и 447 (SEQ ID NO:3). Одни и те же введенные мутации в каждом из мутантов могут быть включены в последовательность нативного полипептида F0 любого другого подтипа или штамма РСВ с получением разных F мутантов РСВ, таких как последовательность нативного полипептида F0, указанная в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6 и 81-270. F мутанты РСВ, которые основаны на нативной полипептидной последовательности F0 любого другого подтипа или штамма РСВ и включают любые генно-инженерно введенные дисульфидные мутации, также включены в объем изобретения. В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий по меньшей мере одну генно-инженерно введенную дисульфидную мутацию, выбранную из группы, состоящей из: 55С и 188С; 155С и 290С; 103С и 148С; и 142С и 371С, такие как S55C и L188C, S155C и S290C, Т103С и I148C или L142C и N371C.

В других вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, который включает одну или больше мутаций с заполнением полости. Термин "мутация с заполнением полости" относится к замене аминокислотного остатка в F-белке РСВ дикого типа аминокислотой, которая, как ожидается, будет заполнять внутреннюю полость зрелого F-белка РСВ. В одном применении такие мутации с заполнением полости способствуют стабилизации префузионной конформации мутантного F-белка РСВ. Полости в префузионной конформации F-белка РСВ можно идентифицировать способами, известными в уровне техники, такими как визуальный осмотр кристаллической структуры F РСВ в префузионной конформации или с использованием компьютерной программы для белкового дизайна (такой как BioLuminateTM [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2015], Discovery StudioTM [Discovery Studio Modeling Environment, Accelrys, San Diego, 2015], MOETM [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2015] и RosettaTM [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2015]). Аминокислоты, подвергаемые замене при мутациях с заполнением полости, обычно включают небольшие алифатические (например, Gly, Ala и Val) или небольшие полярные аминокислоты (например, Ser и Thr). Они также могут включать аминокислоты, которые являются внутренними в префузионной конформации, но доступны растворителю в постконформации. Заменяющие аминокислоты могут быть крупными алифатическими аминокислотами (Не, Leu и Met) или крупными ароматическими аминокислотами (His, Phe, Tyr и Trp). Например, в нескольких вариантах осуществления мутант F-белка РСВ включает мутацию Т54Н.

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий одну или больше мутаций с заполнением полости, выбранных из группы, состоящей из:

1) замены S в положениях 55, 62, 155, 190 или 290 на I, Y, L, Н или М;

2) замены Т в положении 54, 58, 189, 219 или 397 на I, Y, L, Н или М;

3) замены G в положении 151 на А или Н;

4) замены А в положении 147 или 2 98 на I, L, Н или М;

5) замены V в положении 164, 187, 192, 207, 220, 296, 300 или 495 на I, Y, Н; и

6) замены R в положении 106 на W.

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, включающий одну или больше мутаций с заполнением полости, где мутант включает мутации с заполнением полости в любом из мутантов, представленных в Таблицах 2, 4 и 6 в WO 2017/109629. F-мутанты РСВ, представленные в этих Таблицах 2, 4 и 6, основаны на одной и той же нативной последовательности F0 РСВ штамма А2 с тремя встречающимися в природе заменами в положениях 102, 379 и 447 (SEQ ID NO:3). Одни и те же введенные мутации в каждом из мутантов могут быть сделаны в последовательности нативного полипептида F0 любого другого подтипа или штамма РСВ с получением различных F мутантов РСВ, такой как нативная последовательность полипептида F0, представленная в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6 и 81-270. F мутанты РСВ, которые основаны на нативной полипептидной последовательности F0 любого другого подтипа или штамма РСВ и включают любую из одной или больше мутаций с заполнением полости, также включены в объем изобретения. В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий по меньшей мере одну мутацию с заполнением полости, выбранную из группы, состоящей из: Т54Н, S190I и V296I.

В других вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий одну или больше электростатических мутаций. Термин "электростатическая мутация" относится к аминокислотной мутации, введенной в F-белок РСВ дикого типа, которая уменьшает ионное отталкивание или увеличивает ионное притяжение между остатками в белке, которые расположены близко друг к другу в свернутой структуре. Поскольку водородная связь является частным случаем ионного притяжения, электростатические мутации могут усиливать образование водородных связей между такими ближними остатками. В одном примере электростатическую мутацию могут вводить для повышения стабильности тримера. В некоторых вариантах осуществления электростатическую мутацию вводят для уменьшения отталкивающих ионных взаимодействий или увеличения притягивающих ионных взаимодействий (потенциально включающих водородные связи) между остатками, которые находятся в непосредственной близости в F-гликопротеине РСВ в его префузионной конформации, но не в его постфузионной конформации. Например, в префузионной конформации кислотная боковая цепь Asp486 из одного протомера тримера F-гликопротеина РСВ расположена на поверхности тримера и структурно уложена между двумя другими кислотными боковыми цепями Glu487 и Asp489 из другого протомера. С другой стороны, в постфузионной конформации кислотная боковая цепь Asp486 расположена на поверхности тримера и доступна растворителю. В некоторых вариантах осуществления мутантный F-белок РСВ включает электростатическую замену D486S, которая уменьшает отталкивающие ионные взаимодействия или увеличивает притягивающие ионные взаимодействия с кислотными остатками Glu487 и Asp489 из другого протомера F-тримера РСВ. Таким образом, в варианте осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, включает электростатическую замену D486S. Как правило, введение электростатической мутации повышает температуру плавления (Тп) префузионной конформации или префузионной тримерной конформации F-белка РСВ.

Нежелательные электростатические взаимодействия в префузионной или префузионной тримерной конформации могут быть идентифицированы с помощью способа, известного в уровне техники, например, путем визуального исследования кристаллической структуры F РСВ в префузионной или префузионной тримерной конформации или с использованием программы для компьютерного белкового дизайна (такой как BioLuminateTM [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2015], Discovery StudioTM [Discovery Studio Modeling Environment, Accelrys, San Diego, 2015], MOETM [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2015] и RosettaTM [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2015]).

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий по меньшей мере одну электростатическую мутацию, выбранную из группы, состоящей из:

1) замены Е в положении 82, 92 или 487 на D, F, Q, Т, S, L или Н;

2) замены K в положении 315, 394 или 399 на F, М, R, S, L, I, Q или Т;

3) замены D в положении 392, 486 или 489 на Н, S, N, Т или Р; и

4) замены R в положении 106 или 339 на F, Q, N или W.

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, включающий одну или больше электростатических мутаций, где мутант включает электростатические мутации в любом из мутантов, представленных в Таблицах 3, 5 и 6 в WO 2017/109629. F мутанты РСВ, представленные в этих Таблицах 3, 5 и 6, основаны на одной и той же нативной последовательности F0 РСВ штамма А2 с тремя встречающимися в природе заменами в положениях 102, 379 и 447 (SEQ ID NO:3). Одни и те же введенные мутации в каждом из мутантов могут быть сделаны в нативной последовательности полипептида F0 любого другого подтипа или штамма РСВ с получением различных F мутантов РСВ, такой как нативная последовательность полипептида F0, представленная в любой из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6 и 81-270. F мутанты РСВ, которые основаны на нативной полипептидной последовательности F0 любого другого подтипа или штамма РСВ и включают любую из одной или больше электростатических мутаций, также включены в объем изобретения. В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий мутацию D486S.

В-2 (d) Комбинация генно-инженерно введенных мутаций дисульфидной связи, мутаций с заполнением полости и электростатических мутаций.

В другом аспекте рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутантный F-белок РСВ, включающий комбинацию двух или больше различных типов мутаций, выбранных из генно-инженерно введенных мутаций дисульфидной связи, мутаций с заполнением полости и электростатических мутаций, каждая из которых соответствует мутациям, описанным выше. В некоторых вариантах осуществления мутанты включат по меньшей мере одну генно-инженерно введенную мутацию дисульфидной связи и по меньшей мере одну мутацию с заполнением полости. В некоторых конкретных вариантах осуществления F мутанты РСВ включают комбинацию мутаций, указанных в Таблице 4 в W0 2017/109629.

В некоторых других вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий по меньшей мере одну генно-инженерно введенную дисульфидную мутацию и по меньшей мере одну электростатическую мутацию. В некоторых конкретных вариантах осуществления F мутанты РСВ включают комбинацию мутаций, указанных в Таблице 5 в WO 2017/109629.

В других вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой мутант F-белка РСВ, включающий по меньшей мере одну генно-инженерно введенную дисульфидную мутацию, по меньшей мере одну мутацию с заполнением полости и по меньшей мере одну электростатическую мутацию. В некоторых конкретных вариантах осуществления F мутанты РСВ включают комбинацию мутаций, представленных в Таблице 6 в WO 2017/109629.

В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, который включает комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из:

(1) комбинации Т103С, I148C, S190I и D486S;

(2) комбинации Т54Н S55C L188C D486S;

(3) комбинации Т54Н, Т103С, I148C, S190I, V296I и D486S;

(4) комбинации Т54Н, S55C, L142C, L188C, V296I и N371C;

(5) комбинации S55C, L188C и D486S;

(6) комбинации Т54Н, S55C, L188C и S190I;

(7) комбинации S55C, L188C, S190I и D486S;

(8) комбинации Т54Н, S55C, L188C, S190I и D486S;

(9) комбинации S155C, S190I, S290C и D486S;

(10) комбинации Т54Н, S55C, L142C, L188C, V296I, N371C, D486S, E487Q и D489S; и

(11) комбинации Т54Н, S155C, S190I, S290C и V296I.

В некоторых конкретных вариантах осуществления F мутант РСВ включает комбинацию введенных мутаций, где мутант включает комбинацию мутаций в любом из мутантов, представленных в Таблицах 4, 5 и 6 в WO 2017/109629. F мутанты РСВ, представленные в этих Таблицах 4, 5 и 6, основаны на одной и той же нативной последовательности F0 РСВ штамма А2 с тремя встречающимися в природе заменами в положениях 102, 379 и 447 (SEQ ID NO:3). Одни и те же введенные мутации в каждом из мутантов могут быть сделаны в нативной последовательности полипептида F0 любого другого подтипа или штамма РСВ с получением различных F мутантов РСВ, такой как нативная последовательность полипептида F0, указанная в любой из SEQ ID NO:1, 2, 4, 6 и 81-270. F мутанты РСВ, основанные на нативной последовательности полипептида F0 любого другого подтипа или штамма РСВ и включающие любую комбинацию мутаций, также включены в объем изобретения.

В некоторых других конкретных вариантах осуществления рекомбинантно полученный белок РСВ, очищенный в соответствии со способом согласно изобретению, представляет собой F мутант РСВ, включающий цистеин (С) в положении 103 (103С) и в положении 148 (148С), изолейцин (I) в положении 190 (1901) и серии (S) в положении 486 (486S), и где мутант включает полипептид F1 и полипептид F2, выбранные из группы, состоящей из:

(1) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42;

(2) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:41, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:42;

(3) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44;

(4) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:43, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44;

(5) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46;

(6) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:45, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:46;

(7) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48;

(8) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48;

(9) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50;

(10) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50.

(11) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27 9, и полипептид F1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:280;

(12) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27 9, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:280;

(13) полипептид F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:281, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:282;

(14) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:281, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:282;

(15) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:283, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:284;

(16) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:283, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:284;

(17) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:285, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:286;

(18) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:285, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:286;

(19) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:287, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:288;

(20) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:287, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:288;

(21) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:289, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:290; и

(22) полипептида F2, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:289, и полипептида F1, включающего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:290.

В некоторых конкретных вариантах осуществления домен тримеризации связан с С-концом полипептида F1 мутантного F-белка. В конкретном варианте осуществления домен тримеризации представляет собой фолдон-домен фибритина фага Т4, такой как аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 40).

Подробное описание изобретения

Определения

Следующие определения будут использоваться в настоящем описании и формуле изобретения:

- термин "собранная клеточная культуральная жидкость" (или "собранная CCF") относится к раствору, содержащему по меньшей мере одно целевое вещество, которое требуется очистить от других веществ, которые также присутствуют. Собранные CCF часто представляют собой сложные смеси, содержащие множество биологических молекул (таких как белки, антитела, гормоны и вирусы), малых молекул (такие как соли, сахара, липиды и т.д.) и даже частиц. Тогда как типичная собранная CCF биологического происхождения может быть водным раствором или суспензией, она также может содержать органические растворители, используемые на более ранних этапах разделения, таких как остаточные растворители после осаждения, экстракции и т.п. Примеры собранных CCF, которые могут содержать ценные биологические вещества, подходящие для очистки в различных вариантах осуществления настоящего изобретения, включают, без ограничения, культуральный супернатант из биореактора, гомогенизированную суспензию клеток, плазму, фракции плазмы и молоко;

- термин "наносимая проба" относится к любому материалу, содержащему целевое вещество, полученному из клеточной культуры (собранной CCF) или в результате хроматографической стадии (и, таким образом, частично очищенному) и нанесенному на хроматографическую среду;

- термин "наносимая нагрузка" относится к общей массе вещества, наносимого на хроматографическую среду в цикле нанесения хроматографической стадии, измеряемой в единицах массы вещества на удельный объем среды;

- термин "примеси" относится к материалам в собранной CCF, которые отличаются от представляющего интерес белка (или целевого белка) и предпочтительно исключаются из готового состава терапевтического белка. Типичные примеси включают нуклеиновые кислоты, белки (включая БКХ и низкомолекулярные компоненты, пептиды, эндотоксины, вирусы и малые молекулы;

- термин "лекарственная субстанция" относится к терапевтическому белку в качестве активного фармацевтического ингредиента, получаемого с применением способов настоящего изобретения;

- термин "фармацевтический продукт" относится к готовой лекарственной форме, которая содержит терапевтический белок в сочетании со вспомогательными веществами;

- термин "вспомогательные вещества" означает компоненты, включенные в готовый состав терапевтического белка, которые не являются терапевтическим белком. Вспомогательные вещества, как правило, включают белковые стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, аминокислоты, например, способствующие стабилизации белка, и т.д.;

- если не указано иное, термин "приблизительно", связанный с числовым значением, означает в пределах +5% от указанного значения.

Под "снижением БКХ" или "улучшением удаления БКХ" подразумевается, что концентрация присутствующих БКХ снижена в пуле элюируемых фракций по сравнению с терапевтическим белком. Общее снижение БКХ может быть измерено с помощью методов, известных в данной области, таких как ИФА БКХ (обычно используемый в качестве основного инструмента) и ЖХ-МС/МС.

ПРИМЕР

Далее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующим примером, соответствующим процессу очистки,

применяемому в отношении рекомбинантно полученного белка РСВ и оцениваемому с различными стратегиями промывки в анионообменной хроматографии (АОХ). Данный Пример представлен исключительно в иллюстративных целях и не должен рассматриваться как ограничивающий объем изобретения.

В иллюстративном Примере белок РСВ представляет собой либо белок РСВ А, либо белок РСВ В.

В этом Примере белок РСВ, присутствующий в наносимом растворе, собранном из биореактора, очищают с применением многостадийного способа очистки, который последовательно включает:

- начальную стадию центрифугирования и глубинной фильтрации;

- первую стадию ультрафильтрации/диафильтрации;

- стадию анионообменной хроматографии (АОХ), которую проводят на хроматографической колонке, содержащей следующую среду: Fractogel™ EMD ТМАЕ HiCap (М), которую можно приобрести у Millipore Sigma. Можно использовать альтернативные среды, такие как смолы Q Sepharose™, Capto™ Q или Capto Q ImpRes™, доступные для приобретения в GE Healthcare, смолу TOYOPEARL GigaCap™ Q-650М производства Tosoh Bioscience или смолу Eshmuno™ Q производства Millipore Sigma. Сначала смолу уравновешивают уравновешивающим буфером. Затем образец наносят на колонку таким образом, чтобы целевой белок связался со смолой. Затем смолу промывают одним или больше промывочными растворами, и наносят элюирующий буфер, после чего целевой белок элюируется со смолы в пуле элюируемых фракций. Основная цель этапа АОХ хроматографии состоит в отделении белков РСВ от примесей, появляющихся в результате процесса;

- стадию хроматографии на карбонатсодержащем гидроксиапатите (сНА), таком как гидроксиапатит СНТ™ Ceramic Hydroxyapatite Type I, 40 мкм, который можно приобрести у Bio-Rad;

- стадию хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ), которую проводят на хроматографической колонке, включающей среду, такую как смолу Butyl Sepharose 4 Fast Flow™, доступную для приобретения в GE Healthcare;

- стадию фильтрации вирусов с использованием фильтра ViresolvePro™, поставляемого Millipore Sigma. В альтернативе для этой стадии фильтрации вируса можно использовать фильтр Planova™, который можно приобрести у Asahi Kasei;

- вторую стадию ультрафильтрации/диафильтрации; и

- окончательную стадию изготовления состава и фильтрации. Анионообменная хроматография - оценка промывочного буфера Наносимый раствор, включающий целевой белок (РСВ А или РСВ В) и имеющий рН 7,5±0,2, наносят на колонку Fractogel™ EMD ТМАЕ HiCap (М). Колонку уравновешивают следующим уравновешивающим буфером: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 7,5. Эксперимент проводят с различными условиями нанесения и промывают колонку разными промывочными растворами, как показано в Таблице 1 ниже, с последующим элюированием белка при использовании элюирующего буфера 20 мМ Трис, 163 мМ NaCl, рН 7,5.

Представляющий интерес белок находится в тримерной форме ("тример" в Таблице 1). "Контрольная промывка при рН 7,5", указанная в Таблице 1, представляет собой промывочный раствор на основе Трис и NaCl с рН 7,5.

Из этого эксперимента видно, что условия промывки с более низким рН по сравнению с более стандартными промывочными растворами при рН 7,5 могут улучшать снижение содержания БКХ (на ~1 log) с минимальными потерями продукта. Такие условия промывки с более низким рН также повышают чистоту тримера (86 и 89% в сравнении с 72%).

Эксперимент позволяет предположить, что в условиях промывки при более низком рН (в данном примере рН 4,8) потери продукта во время промывки при низком рН увеличиваются по мере увеличения наносимой нагрузки ("нагрузка на смолу" в Таблице 1).

Последующие эксперименты, проведенные с промывочными растворами на основе ацетата при различных рН, концентрациях ацетата и наносимых нагрузках, показали, что: более низкий рН при промывке коррелирует с лучшим удалением БКХ. Более низкая массовая нагрузка коррелирует с лучшим удалением БКХ и более высокими выходами. Более высокая концентрация ацетата коррелирует с более низкими выходами.

Результаты показывают, что из протестированных факторов наиболее значимым фактором при снижении БКХ является уровень рН, и что концентрация буфера является наиболее значимым фактором для выхода продукта.

Помимо ацетата, который использовали в вышеописанных экспериментах, для этого способа можно использовать альтернативные растворы анионов: цитрат, фосфат, сульфат, хлорид.

Были проведены дополнительные эксперименты для оценки влияния различных видов буферных растворов с разной концентрацией анионов и определения оптимальных условий для удаления БХП.

В Таблице 2 ниже показаны условия промывки (соли, концентрация, рН), которые оценивали.

На ФИГУРЕ 1 и ФИГУРЕ 2 представлены значения выхода (процент выхода продукта), полученные для каждого промывочного раствора, в зависимости от значения рН, соответственно, для наносимого раствора РСВ А и РСВ В.

На ФИГУРЕ 1, в отношении РСВ А, можно видеть, что

(i) повышенная концентрация буфера приводит к снижению выхода из-за потерь продукта во время промывки при низком рН;

(ii) ацетат и цитрат демонстрируют зависимость выхода от рН промывки;

(iii) фосфаты и сульфаты демонстрируют более высокие выходы при рН 3,5 и менее чувствительны к рН.

Данные, представленные на ФИГУРЕ 2 для РСВ В, указывают, что:

(i) аналогичная тенденция, как и для РСВ А, наблюдается в случае ацетата, т.е. более низкий рН и повышенная концентрация приводят к более низким выходам;

(ii) выход не так чувствителен к высокой концентрации буфера, как в случае РСВ А;

(iii) в случае РСВ В наблюдаются более низкие показатели выхода по сравнению с РСВ А.

В дополнительном эксперименте эффективность нескольких условий промывки (тип буфера, концентрация, рН) для РСВ А и для РСВ В оценивали с точки зрения снижения содержания БКХ и выхода и сравнивали с предпочтительным промывочным раствором: 70 мМ ацетата, рН 5,0.

Полученные данные были сопоставлены в Таблице 3 ниже.

В Таблице 3 данные, полученные для предпочтительного промывочного раствора (70 мМ ацетата, рН 5,0) методом высокопроизводительного скрининга (HTS), как показано в предпоследнем столбце, были нормализованы по архивным данным и показали следующее:

- для РСВ А: выход 7 0% и логарифмическое значение снижения (LRV) БКХ от 0,9 до 1,1; и

- для РСВ В: выход 65% и LRV от 0,9 до 1,4.

Проведенные скрининги промывок позволяют предположить, что повышенные концентрации буфера приводят к потерям со снижением выхода в ходе промывки, а снижение рН промывки приводит к лучшему удалению БХП. РСВ А и РСВ В продемонстрировали аналогичные тенденции в отношении выхода и БКХ, при этом РСВ В показал более низкие выходы. Различные буферы продемонстрировали некий диапазон эффективности между удалением БКХ и выходом, в частности, фосфат и сульфат, которые являются эффективными вариантами в качестве альтернативы ацетату на основе нормализованных данных в Таблице 3.

Наконец, в случае наносимого раствора, имеющего рН 7,0-8,5, а более конкретно, приблизительно 7,5, и наносимой нагрузки, включающей от 7,5 до 15,0 мг на мл анионообменной хроматографической среды, предпочтительными условиями промывки с низким рН для АОХ хроматографической колонки, применимыми как для РСВ А, так и для РСВ В, являются: 70 мМ ацетата и рН 5,0.

На основании вышеуказанных экспериментов приемлемый диапазон рН для промывочного раствора с низким рН может составлять от 3,0 до 6,5, более предпочтительно от 4,0 до 6,0 и наиболее предпочтительно от 4,5 до 5,5.

В таких условиях процесса фосфаты и сульфаты являются надежной альтернативой ацетату.

В фактическом способе, перед нанесением наносимого раствора, включающего целевой белок (РСВ А или РСВ В), на АОХ колонку, колонку уравновешивают следующим уравновешивающим раствором: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 7,5.

После нанесения колонку последовательно промывают тремя промывочными растворами, причем второй из них представляет собой промывочный раствор с более низким рН, а первый и третий - промывочные растворы с более высоким рН:

- Промывка 1: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 7,5;

- Промывка 2: 7 0 мМ ацетат, рН 5,0;

- Промывка 3: 50 мМ Трис, 20 мМ NaCl, рН 7,5.

Вышеуказанные значения рН и составы промывочных растворов являются предпочтительными, однако приемлемые характеристики с точки зрения снижения БКХ и выхода также могут быть получены при следующих условиях:

- первый промывочный раствор с более высоким рН (промывка 1) может иметь рН 7,0-8,0. Концентрация Триса может составлять 18-22 мМ, а концентрация NaCl может составлять 45-55 мМ;

- концентрация ацетата в промывочном растворе с более низким рН (промывка 2) может составлять 56-84 мМ, более предпочтительно 63-77 мМ. Приемлемые диапазоны рН, как обсуждалось выше, составляют 3,0-6,5, предпочтительно 4,0-6,0 и более предпочтительно 4,5-5,5;

- второй промывочный раствор с более высоким рН (промывка 3) может иметь рН 7,0-8,0. Концентрация Триса может составлять 45-55 мМ, а концентрация NaCl может составлять 18-22 мМ.

После стадии промывки, которую проводят путем последовательной промывки колонки тремя промывочными растворами, белок РСВ элюируют элюирующим раствором. Элюирующий раствор включает NaCl в концентрации 146-180 мМ, предпочтительно приблизительно 163 мМ, и Трис в концентрации 18-22 мМ, предпочтительно приблизительно 20 мМ. Показатель рН элюирующего раствора составляет 7,0-8,0, предпочтительно приблизительно 7,5.

Последующие стадии хроматографии данного Примера предпочтительно проводят в следующих условиях.

сНА хроматография

Перед нанесением продукта на хроматографическую колонку с сНА колонку уравновешивают первым уравновешивающим буфером, содержащим 0,5 М фосфата натрия, рН 7,2, а затем вторым уравновешивающим буфером, содержащим 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 13 мМ фосфата натрия, рН 7,0.

Пул продукта, собранный с хроматографической колонки АОХ и модифицированный путем добавления фосфата, после фильтрации наносят на хроматографическую колонку с сНА. Показатель рН наносимого раствора устанавливается на уровне 7,1±0,3, и наносимая нагрузка составляет от 8,0 до 12,0 мг на мл среды.

Колонку промывают промывочным раствором, включающим: 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 13 мМ фосфата натрия, рН 7,0.

Колонка работает в проточном режиме, что означает, что по мере нанесения наносимой жидкости на колонку, целевой белок проходит через колонку, а примеси связываются со средой. Промывка предназначена для смыва с колонки случайно связавшихся целевых белков.

ХГВ

Перед нанесением продукта на колонку ХГВ колонку уравновешивают первым уравновешивающим буфером, включающим 20 мМ фосфата калия при рН 7,0, а затем вторым уравновешивающим буфером, включающим 1,1 М фосфата калия при рН 7,0.

Пул продукта, собранный с хроматографической колонки сНА и модифицированный путем добавления фосфата калия, после фильтрации наносят на колонку ХГВ. Показатель рН и проводимость наносимого раствора доводят до 7,0±0,3 и 104±10 мСм/см соответственно. Наносимая нагрузка составляет 8,0-12,0 мг на мл среды.

Колонка работает в режиме связывания и элюирования, при котором целевые белки, нанесенные на колонку, связываются со средой, а затем элюируются с применением элюирующего буфера. Перед применением элюирующего буфера колонку промывают промывочным раствором, чтобы смыть примеси, связавшиеся со средой.

Промывочный раствор, используемый в этой стадии ХГВ, представляет собой 1,1 М фосфата калия, рН 7,0, а элюирующий буфер представляет собой 448 мМ фосфата калия, рН 7,0.

Вышеописанный способ подходит для очистки рекомбинантно полученных белков РСВ с достаточной степенью чистоты, чтобы указанные белки можно было использовать для получения фармацевтических продуктов. В частности, такие очищенные белки РСВ могут быть включены в составы путем добавления подходящих вспомогательных веществ для применения в качестве фармацевтического продукта для инъекций.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

Kublbeck, Jill Ann

Pettaway, Alexandra

Salm, Jeffrey Richard

<120> УЛУЧШЕНИЯ ПРОМЫВОЧНЫХ РАСТВОРОВ ДЛЯ АНИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

В СПОСОБЕ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНО ПОЛУЧЕННЫХ БЕЛКОВ РСВ

<130> PC072530A

<150> US 63/056,949

<151> 2020-07-27

<160> 326

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> БЕЛОК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 1

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 2

<211> 574

<212> БЕЛОК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Val Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro

100 105 110

Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser

115 120 125

Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Met Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly

450 455 460

Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys

565 570

<210> 3

<211> 568

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический полипептид

<400> 3

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln

515 520 525

Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

530 535 540

Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser

545 550 555 560

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

565

<210> 4

<211> 574

<212> БЕЛОК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 4

Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ala Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 5

<211> 568

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический полипептид

<400> 5

Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Ser Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Ile

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln

515 520 525

Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

530 535 540

Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser

545 550 555 560

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

565

<210> 6

<211> 574

<212> БЕЛОК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус человека

<400> 6

Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro

100 105 110

Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser

115 120 125

Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly

450 455 460

Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Ala Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys

565 570

<210> 7

<211> 568

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический пептид

<400> 7

Met Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala

1 5 10 15

Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro

100 105 110

Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser

115 120 125

Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly

450 455 460

Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln

515 520 525

Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

530 535 540

Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser

545 550 555 560

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

565

<210> 8

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

atggaacttc tgatcctgaa agccaacgcg attaccacta tcctgactgc cgtcaccttc 60

tgcttcgcat cgggacagaa cattaccgag gagttctacc agtccacctg ttcggcggtg 120

tccaagggtt acctctcggc cctgagaact ggctggtacc actgtgtgat tactatcgag 180

ctgagcaaca tcaaggagaa caagtgcaat ggaacggacg cgaaggtcaa gctgattaag 240

caggaactcg ataagtacaa gaacgccgtg accgagctcc agctgctgat gcaatcgacc 300

cctgccacta acaacagagc tcgccgggaa ctgccgcgct tcatgaatta caccctcaac 360

aacgcgaaga aaaccaacgt gaccctgtcc aagaagcgca agcggaggtt cctgggattc 420

ctgtgtggcg tgggctccgc aatcgcatcc ggagtggccg tgtccaaagt gctgcatctg 480

gagggggaag tgaacaagat caagtccgcc ctcctgtcaa ctaataaggc ggtggtgtcc 540

ctgagcaacg gagtcagcgt gtgtacatcc aaggtcctgg acctcaagaa ctacatcgac 600

aagcagctgt tgcccatcgt caacaagcag tcatgctcga ttagcaatat cgaaaccgtg 660

attgagttcc agcagaagaa caacagactg ctcgaaatta cccgggagtt ttccgtgaac 720

gccggagtga ccactcctgt gtccacctac atgcttacga actccgaact gctcagcctc 780

atcaacgata tgccgatcac taacgaccag aagaagttga tgagcaacaa tgtgcagatc 840

gtgcgccaac agtcctactc aatcatgtca attatcaagg aggaaatcct cgcctatgtg 900

gtgcaattgc ctctgtacgg agtcatcgac acaccctgct ggaagctgca cactagccca 960

ctctgtacga ccaacaccaa ggaaggttcc aacatctgcc tgactaggac cgatcggggc 1020

tggtattgcg ataatgctgg gtccgtgagc ttcttcccgc aagccgagac ttgcaaagtg 1080

cagtcaaacc gcgtgttctg tgacaccatg tgtagcctga ccctgccatc cgaagtcaac 1140

ctctgcaacg tggacatctt taacccgaaa tacgactgca agattatgac ctccaagacc 1200

gacgtcagca gctctgtcat cactagcctg ggagctattg tgtcctgcta cggaaagacc 1260

aaatgcactg cctcgaacaa gaacagaggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgtgac 1320

tacgtgtcca acaagggagt ggacaccgtg tccgtcggga acaccctgta ctacgtgaac 1380

aagcaggagg ggaagtcgct ctacgtcaag ggggaaccga ttatcaattt ctacgacccc 1440

ctggtgttcc cttccgacga gttcgatgcc tccatatccc aagtcaacga gaagatcaac 1500

cagtctcttg ccttcatccg gaagtcggac gaactgctgt ccgccatcgg tggctatatt 1560

ccggaagccc ccagggatgg acaggcctac gtgcggaagg atggagaatg ggtgcttttg 1620

tccaccttcc tgggcggtct ggtgccccgc ggctcacacc atcatcacca ccacggttcg 1680

tggtcccacc ctcaatttga gaagtga 1707

<210> 9

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 9

atggaacttc tgatcctgaa agccaacgcg attaccacta tcctgactgc cgtcaccttc 60

tgcttcgcat cgggacagaa cattaccgag gagttctacc agtccacctg ttcggcggtg 120

tccaagggtt acctctcggc cctgagaact ggctggtaca cctgtgtgat tactatcgag 180

ctgagcaaca tcaaggagaa caagtgcaat ggaacggacg cgaaggtcaa gctgattaag 240

caggaactcg ataagtacaa gaacgccgtg accgagctcc agctgctgat gcaatcgacc 300

cctgccacta acaacagagc tcgccgggaa ctgccgcgct tcatgaatta caccctcaac 360

aacgcgaaga aaaccaacgt gaccctgtcc aagaagcgca agcggaggtt cctgggattc 420

ctgttgggcg tgggctccgc aatcgcatcc ggagtggccg tgtccaaagt gctgcatctg 480

gagggggaag tgaacaagat caagtccgcc ctcctgtcaa ctaataaggc ggtggtgtcc 540

ctgagcaacg gagtcagcgt gtgtacatcc aaggtcctgg acctcaagaa ctacatcgac 600

aagcagctgt tgcccatcgt caacaagcag tcatgctcga ttagcaatat cgaaaccgtg 660

attgagttcc agcagaagaa caacagactg ctcgaaatta cccgggagtt ttccgtgaac 720

gccggagtga ccactcctgt gtccacctac atgcttacga actccgaact gctcagcctc 780

atcaacgata tgccgatcac taacgaccag aagaagttga tgagcaacaa tgtgcagatc 840

gtgcgccaac agtcctactc aatcatgtca attatcaagg aggaagtgct cgcctatgtg 900

gtgcaattgc ctctgtacgg agtcatcgac acaccctgct ggaagctgca cactagccca 960

ctctgtacga ccaacaccaa ggaaggttcc aacatctgcc tgactaggac cgatcggggc 1020

tggtattgcg ataatgctgg gtccgtgagc ttcttcccgc aagccgagac ttgcaaagtg 1080

cagtcaaacc gcgtgttctg tgacaccatg aacagcctga ccctgccatc cgaagtcaac 1140

ctctgcaacg tggacatctt taacccgaaa tacgactgca agattatgac ctccaagacc 1200

gacgtcagca gctctgtcat cactagcctg ggagctattg tgtcctgcta cggaaagacc 1260

aaatgcactg cctcgaacaa gaacagaggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgtgac 1320

tacgtgtcca acaagggagt ggacaccgtg tccgtcggga acaccctgta ctacgtgaac 1380

aagcaggagg ggaagtcgct ctacgtcaag ggggaaccga ttatcaattt ctacgacccc 1440

ctggtgttcc cttcctccga gttcgatgcc tccatatccc aagtcaacga gaagatcaac 1500

cagtctcttg ccttcatccg gaagtcggac gaactgctgt ccgccatcgg tggctatatt 1560

ccggaagccc ccagggatgg acaggcctac gtgcggaagg atggagaatg ggtgcttttg 1620

tccaccttcc tgggcggtct ggtgccccgc ggctcacacc atcatcacca ccacggttcg 1680

tggtcccacc ctcaatttga gaagtga 1707

<210> 10

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 10