Способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 A61D99/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к генотипированию вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

На протяжении столетий ящур является опасным и самым контагиозным заболеванием животных. В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus [1].

На сегодняшний день известно 7 следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. Представители серотипа SAT-2 широко распространены на Африканском континенте, Ближнем Востоке и периодически фиксируются в странах Азии [2]. Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I - XIV) [1-3].

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа SAT-2 имеют одинаковую длину около 8400-8500 и.о., но при этом для них характерных индивидуальные уникальные мутации в ID-гене [2].

С целью профилактики и борьбы с ящуром в Российской Федерации применяется система мероприятий, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Такие вакцинные препараты включают в свой состав штаммы вируса ящура серотипа SAT-2 [4. 5].

Учитывая, что вакцинные штаммы серотипа SAT-2 вируса ящура применяются для производства инактивированных культуральных препаратов, но при этом отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля вируссодержащего материала использовать способы, которые могут быстро проводить генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 [6]. Данный этап крайне необходим при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования требуемого штамма для изготовления противоящурных вакцин в рамках крупномасштабного процесса.

Для производства культуральных инактивированных вакцин против ящура в настоящее время в ФГБУ «ВНИИЗЖ» используют следующие вакцинные штаммы вируса ящура серотипа SAT-2: «SAT-2/Кения/19/2017» (депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №452 - деп/23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»), «SAT-2 Lib 39/2012» (депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №361 - деп/21-22 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»), «SAT-2/Eritrea/1998» (депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №459 - деп/23-9 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»), «SAT-2 Kenya 183/74» (депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №363 - деп/21-24 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»), «SAT-2 SAU 7/2000» (депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №362 - деп/21-23 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

В связи с этим целесообразно провести поиск способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса ящура, что даст возможность разработать метод для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной реакции амплификации исследование пиков температур плавления ампликонов стало перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов, в частности вируса ящура серотипа SAT-2 [7-9].

Флуоресцентный анализ плавления ампликонов после реакции амплификации стал популярным с появлением в 1997 году прибора для ПЦР в реальном времени LightCycler®. Данная технология и соответствующий амплификатор позволяет достовернее контролировать температуру и обеспечить высокую скорость плавления 0,1-1,0°С/сек, сократив время плавления до нескольких минут [7-14].

Анализ пиковых значений температур плавления для каждого представителя вирусов и других микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ампликонов после реакции амплификации в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ПЦР-продуктов и современных флуоресцирующих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных ДНК и кДНК [11, 12].

Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения реакции амплификации с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры ампликоны начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. ПЦР-продукты с разной последовательностью за счет наличия мутаций «плавятся» при разной температуре. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного метода можно достичь высокой общей точности разработанного способа [9].

Прототипным вариантом проведения генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 является обратная транскрипция и реакция амплификации со специфическими праймерами, гель-электрофорез и секвенирование по Сенгеру [15]. При этом указанный метод является крайне дорогостоящим, трудоемким и продолжительным во времени проводимого исследования. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ контроля сырья для изготовления противоящурных вакцин, а именно культуральных суспензий вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 с помощью современных молекулярно-биологических методов исследования с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Сущность разработанного способа заключается в следующем: 1) создание дизайна оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров с тем расчетом, чтобы амплифицировать фрагмент кДНК содержащий мутации, уникальные для вакцинных штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура серотипа SAT-2; 2) проведение выделения РНК вируса ящура, постановка обратной транскрипции и реакции амплификации с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488. Полученные ПЦР-продукты постепенно нагревают в широком диапазоне температур и при достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ампликонов, осуществляется дифференциация и генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять современный флуоресцирующий димерный акридин Eva488, который не ингибирует реакцию и характеризующийся ярким разгоранием после встраивания в ампликоны, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК 1 D-гена вируса ящура серотипа SAT-2 (таргетный участок ID-гена в диапазоне 387…549 и.о., учитывая, что данный ген нумеровали изолированно от других генов). Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве культуральных инактивированных вакцин против ящура серотипа SAT-2.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1 D-гена вируса ящура серотипа SAT-2; 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению флуоресцирующего димерного акридина Eva488; 3) с помощью анализа пиков температур плавления ампликонов по найденным константам проводить генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Дизайн оригинальных высоко специфических олигонуклеотидных праймеров для генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 с помощью разработанного способа. Примечание: А - прямой праймер, Б - обратный праймер (дана прямая форма и revers-complement - перевернутая комплементарная форма).

Фиг. 2 - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя ящура: «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2/ Кения/19/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком к ДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2/ Кения/19/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 Lib 39/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура;

SEQ ID NO: 6 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура;

SEQ ID NO: 7 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 Kenya 183/74» вируса ящура;

SEQ ID NO: 8 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 Kenya 183/74» вируса ящура;

SEQ ID NO: 9 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура;

SEQ ID NO: 10 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК 1 D-гена вакцинного штамма «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура.

Для отражения полноценных последовательностей NO: 1-14 был проведен анализ полного 1D-гена вируса ящура (645 н.о.) и VP₁-белка (215 а.о.).

Сущность изобретения заключается в разработке способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагирование РНК вируса ящура из сырья для изготовления вакцин; 2) проведение обратной транскрипции и амплификации специфического фрагмента кДНК 1 D-гена вируса ящура размером 162 пл. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров FMDV/SAT-2/F387 с дизайном 5'-gtacaaYggYgaRtgYaaatacac-3' и FMDV/SAT-2/R526 с дизайном 5'-cttcatcctgtagtaMacMtcgac-3' (фиг.1А, 1Б, таблицы 1, 2, большими буквами обозначены альтернативные замены в дизайне для повышения универсальности праймеров) и флуоресцирующего димерного акридина Eva488; 3) детекция результатов анализа с определением пиков температуры плавления и проведение инструментального дифференциального анализа геномов вакцинных штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура серотипа SAT-2.

По результатам анализа опубликованных в научной литературе данных, в настоящее время используется только прототипный способ генотипирования штаммов вируса ящура с помощью секвенирования по Сенгеру [15], однако, как указано выше, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить контроль сырья при изготовлении вакцинных препаратов против ящура серотипа SAT-2. Кроме того, следует отметить, что флуоресцирующий димерный акридин Eva488 более чувствителен своих аналогов, в частности, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот. Оранжевый краситель Eva488 имеет явное преимущество для проведения исследований по генотипированию, поскольку он не ингибирует реакцию амплификации и характеризуется ярким «разгоранием» при связывании с двуцепочечными фрагментами кДНК, в частности, ампликонами вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 [16].

В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК 1 D-гена вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента 1 D-гена кДНК вируса ящура в диапазоне 387…549 п. н. (нумерацию проводили изолированно для данного гена вируса ящура) с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров FMDV/SAT-2/F3 87 и FMDV/SAT-2/R526 для амплификации фрагмента размером 162 п. н. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 в разработанном режиме с учетов пиков температур плавления двуцепочечных кДНК и применение флуоресцирующего димерного акридина Eva488, а также детекцию результатов анализа с определением пиков значения температуры плавления для проведения генотипирования указанных вакцинных штаммов вируса ящура. Таким образом, для контроля производственного процесса крупномасштабного изготовления вакцин против ящура актуально применять предложенный способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров FMDV/SAT-2/F3 87 и FMDV/SAT-2/R526 и метода исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 для генотипирования вакцинных штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура серотипа SAT-2.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров FMD V/S AT-2/F3 87 и FMD V/S AT-2/R526, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1 D-гена вируса ящура размером 162 п.н. и метода исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 для генотипирования вакцинных штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000» вируса ящура серотипа SAT-2.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя ящура: «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000» (фиг.2).

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из культуральных суспензий, содержащих вирус ящура, (сырье для изготовления культуральных инактивированных противоящурных вакцин) с использованием отечественного набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе проводят обратную транскрипцию и реакцию амплификации с применением высокоспецифичных оригинальных разработанных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцирующего димерного акридина Eva488 для исследования стандартных образцов и проб. Стандартными образцами являются положительные контроли, представляющие собой индивидуальные культуральные суспензии вируса ящура вакцинных штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000», которые изначально исследованы с помощью секвенирования по Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте. В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ.

Проводят обратную транскрипцию с применением следующих реагентов: деионизированная вода - 45 мкл, буфер 5-кратный - 20 мкл, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - 10 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 10 мкл, AMV-ревертаза - 3 мкл, элюат РНК - 15 мкл.

Для постановки реакции амплификации готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х -3 мкл, хлорид магния 25 мМ - 2 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 5 мкл, краситель Eva488 - 3 мкл, Taq ДНК-полимераза - 1 е.а. (0,1 мкл), кДНК - 5 мкл, деионизированная вода - 6,9 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 30 мкл.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США), или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию осуществляют при температуре 50°С в течение 20 минут. Предварительную денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 2 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 65°С в течение 30 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Для детекции сигнала устанавливают канал HRM, для которого длина волны источника составляет 460 нм, детектора - 610 нм. В качестве красителя применяется Eva488. Данный флуорофор можно анализировать также в системе детекции с длиной волны 488 нм [16].

Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов кДНК представленных выше вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие пики температур плавления характерны для вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, указанных выше, что позволяет судить о принадлежности исследуемого образца к одному из пяти указанных выше вакцинных штаммов возбудителей ящура серотипа SAT-2.

Пример 1. Разработка способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Для определения показателей, позволяющих проводить генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из неинактивированного сырья для изготовления противоящурных вакцин, содержащих РНК вируса ящура, с применением набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали контроли, представленные выше.

На следующем этапе проводили обратную транскрипцию и реакцию амплификации для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Проведение анализа осуществляли, как отражено в таблице 3.

Исследование кривой плавления для анализа данных пиков температуры плавления ампликонов участка 1 D-гена кДНК вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96, или аналога. Проводили построение кривых плавления в виде параболы и детектировали пики температур плавления для полученных графиков. Тестировали к ДНК вируса ящура указанных вакцинных штаммов в 32 повторностях для каждого вакцинного штамма для получения результатов с высокой степенью достоверности (табл.4).

Выявили, что для каждого из указанных выше вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 с помощью разработанного способа характерен свой узкий диапазон температуры плавления. Для вакцинного штамма «SAT-2/ Кения/19/2017» данная температура составила 73,62±0,04°С (n=32, р<0,001), «SAT-2 Lib 39/2012» - 80,72±0,03°С (n=32, р<0,001), «SAT-2/Eritrea/1998» - 78,96±0,04°С (n=32, р<0,001), «SAT-2 Kenya 183/74» - 75,98±0,05°С (n=32, р<0,001), «SAT-2 SAU 7/2000» - 79,54±0,05°С (n=32, р<0,001) (фиг.2, табл.4). Следовательно, для каждого из пяти применяемых в производстве вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 характерен индивидуальный пик температуры плавления.

Таким образом, разработан способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Специфичность анализа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 оценивали при исследовании 7 экстрактов РНК вируса ящура серотипов А, О, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97». В качестве положительных контролей использовали следующие вакцинные штаммы вируса ящура: «8АТ-2/Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000». Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификации с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов графики не были сформированы, что подтверждало высокую специфичность компонентов реакционной смеси данного способа для вируса ящура именно серотипа SAT-2 (табл.5).

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса ящура именно серотипа SAT-2, и отрицательного контроля не формировали графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительных контролей получены следующие значения температур плавления: для вакцинного штамма «SAT-2/ Кения/19/2017» -73,63°С, «SAT-2 Lib 39/2012» - 80,71°С, «SAT-2/Eritrea/1998» - 78,96°С, «SAT-2 Kenya 183/74» - 75,99°С, «SAT-2 SAU 7/2000» - 79,54°C. Полученные результаты контролей подтверждают стандартные данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488.

При исследовании стандартных диагностических показателей провели работу для определения диагностической чувствительности и специфичности метода. При определении диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 560 заведомо положительных проб культуральных суспензий вируса ящура вакцинного штаммов «SAT-2/ Кения/19/2017» (n=112), «SAT-2 Lib 39/2012» (n=112), «SAT-2/Eritrea/1998» (n=112), «SAT-2 Kenya 183/74» (n=112), «SAT-2 SAU 7/2000» (n=112) с титрами инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Постановку обратной транскрипции и реакцию амплификации с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 560 исследуемых культуральных суспензий вируса ящура указанных выше штаммов все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 189 суспензии вируса ящура других серотипов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 189 проб содержали геном вируса ящура всех серотипов, но не серотипа SAT-2. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,34-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,07-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,51-100,00% (табл.6).

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура пяти указанных выше вакцинных штаммов серотипа SAT-2 в позициях данного гена 387…549 п.н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «SAT-2/ Кения/19/2017», «SAT-2 Lib 39/2012», «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2 Kenya 183/74», «SAT-2 SAU 7/2000», что позволило разработать высокоспецифичные оригинальные олигонуклеотидные праймеры FMDV/SAT-2/F387 и FMDV/SAT-2/R526 для детекции целевого участка кДНК 1 D-гена вируса ящура серотипа SAT-2 с помощью анализа пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488. Впервые представлено генотипирование указанных вакцинных штаммов вируса ящура с помощью разработанного способа.

Разработанный способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488 характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,34-100,00%, диагностическая специфичность - 98,07-100,0%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477. PMID: 32974392; PMCID: PMC7473413.

2. Hussein HA, El Nashar RM, El-Sherbiny IM, Hassan RYA. High selectivity detection of FMDV- SAT-2 using a newly-developed electrochemical nanosensors. Biosens Bioelectron. 2021 Nov 1;191:113435. doi: 10.1016/j.bios.2021.113435. Epub 2021 Jun 24. PMID: 34175651.

3. Woldemariyam F, Paeshuyse J. Viral Protein 1 (VP1) Sequence-Based Genetic Diversity of SAT 2 FMDV Circulating in Ethiopia from 1990 to 2015. Vet Med (Auckl). 2023 May 25;14:91-101. doi: 10.2147/VMRR.S408352. PMID: 37256222; PMCID: PMC10226516.

4. Вакцины против ящура. URL:

https://shop.arriah.ru/catalog/vaktsiny/vaktsiny-protiv-yashchura/vaktsina-protiv-yashchura-kulturalnaya-inaktivirovannaya-emulsionnaya-arriakh-vak. (дата обращения: 14.06.2023).

5. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed.-Paris, 2022-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

6. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV. (Дата обращения: 10.06.2023).

7. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(l):50-8. doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

8. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

9. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7. doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

10. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.08.005. Epub 2016 Aug 6. PMID: 27506582; PMCID: PMC7119729.

11. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Vims. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5): 1610-1623. doi: 10.1111/tbed.l2554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

12. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

13. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC6364153.

14. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec;284(24):4174. doi: 10.1 lll/febs.14319. Epub 2017 Nov 24. PMID: 29171728.

15. Kirsanov KI, Lesovaya EA, Yakubovskaya MG, Belitsky GA. SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in the Ames test. Mutat Res. 2010 Jun 17;699(l-2):l-4. doi: 10.1016/j.mrgentox.2010.04.014. Epub 2010 Apr 18. PMID: 20403457.

16. Eva488 краситель для ПЦР, 20x. URL: https://ru.lumiprobe.com/p/eva488-eva-green. (Дата обращения: 14.06.2023).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV SAT-2 Diff

xml.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-03-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-12</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>523</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-12</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования вакцинных

штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков

температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего

димерного акридина Eva488</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccagcgccggtgagggagcagacgttgtcacaactgacccctcgt

cacacggcggtagtgtagcagacaaaaggcggatgcacacagacgttgcattcgtgcttgacaggttcac

ccatgtacacaccaacaaaaccacatttaacgtggacctgatggacaccagacagcacactctggtgggg

gctctcctcagagcatcaacctactatttctgtgacctggaaattgcctgtgttggcacacacaagcgcg

tctactggcaacctaacggcgcaccacgtacgacgcaactgggtgacaaccccatggtgtttgcccacaa

cagtgtcactaggttcgccataccttacactgcaccacaccggttgcttgcaactgcgtacaacggtgag

tgcaaatacacagaccgagtttccgcaatccgcggtgaccgtactgtgttggcagccaagtatgctgact

ccaggcacacgcttccgtccacgttcaactttggacacgtgaccgccgaccaaccagtcgacgtttacta

caggatgaagcgggctgagctgtactgtccaagaccacttctcccggcttaccacaacgaccgggataga

ttcgacgcaccyatcggcgtcgagaaacaactgtgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSSHGGSVADKRRMHTDVAFVLDRFTHVHTNKTTF

NVDLMDTRQHTLVGALLRASTYYFCDLEIACVGTHKRVYWQPNGAPRTTQLGDNPMVFAHNSVTRFAIPY

TAPHRLLATAYNGECKYTDRVSAIRGDRTVLAAKYADSRHTLPSTFNFGHVTADQPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYHNDRDRFDAPIGVEKQLC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctctgccggtgagggtgcagatgttgttacaactgacccctcaa

cacacggcggacaggtagtggagaagaggcggatgcacacagacgttgcattcgtcatggacaggttcac

gcacgtccacaccagcaagacgacgttcaacgtggacctcatggataccaaggacaaggccctagtgggt

gcgctgttgcgagcgtccacctactatttctgtgacctggaaattgcttgtgttggtgaacacaaacgcg

tgtactggcaaccaaacggagcgccacgcaccacccagctgggagacaaccctatggtcttctcccgtaa

tggtgtctccaggtttgctctgccatacactgcgccccaccgtctgctgtctacagtgtacaacggtgag

tgtaaatacactgaccgcgtcaccgccatccgcggagaccgtgcggtcctggcagggaagtatgccaaca

cacggcacgcgcttccttccaccttcaacttcggccacattaccgccgacgcaccagtcgatgtgtacta

caggatgaagcgcgctgagctatactgccccaggccacttctcccggcctacgaccacggggcccgggac

aggttcgacgcaccaattggcgttgaaaaacagttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSTHGGQVVEKRRMHTDVAFVMDRFTHVHTSKTTF

NVDLMDTKDKALVGALLRASTYYFCDLEIACVGEHKRVYWQPNGAPRTTQLGDNPMVFSRNGVSRFALPY

TAPHRLLSTVYNGECKYTDRVTAIRGDRAVLAGKYANTRHALPSTFNFGHITADAPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYDHGARDRFDAPIGVEKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcggcgggagaaggcgcggatgtcgtcaccacggacccgtcta

cacacggcgggaacgtgcaagagggccgacgcaagcacactgaagtcgccttccttcttgaccgcagtac

acatgtccacacaaacaaaacatcattcgttgtggacctcatggacacaaagggaaaagcactcgtaggt

gcgatcctgcgggcttccacttactacttttgtgaccttgagattgcatgtgtgggtgaccacactaggg

tcttttggcagcctaacggggcgccgcggactacccaacttggtgacaaccccatggtttacgccaaggg

cggtgtgacccgctttgctatcccgttcacggccccacacaggctgctgtccactgtctacaatggcgag

tgcaaatacacaaaaaccgccaccgccattcgtggagaccgcgcagcactcgcggcgaagtacgctgcca

gcgtgcacactctaccgcaaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgatgtttacta

caggatgaagagggctgagttgtactgtccacgcccactgctgccagcctacgaccacgcaagcagagac

agattcgacgcgcccattggcgtcgaaaggcagacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTNKTSF

VVDLMDTKGKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDHTRVFWQPNGAPRTTQLGDNPMVYAKGGVTRFAIPF

TAPHRLLSTVYNGECKYTKTATAIRGDRAALAAKYAASVHTLPQTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYDHASRDRFDAPIGVERQT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacatcgtcaggtgagggagcagacgtagtcacgactgatccctcca

cccacggtgggtctgtgacggagaagaggcgcatgcacaccgatgtcgccttcgtcatggacaggttcac

ccacgtccacaccaaccagactagcacagtgattgacttgatggacaccaatgagaagacccttgtgggt

gcgttgctccgtgcttccacctactacttctgtgacatggaaattgcttgcgttggcaaacacgcacgcg

tgtggtggcaacccaacggtgcgccgcggacaacccagctccgcgacaacccaatggtgttctcacacaa

caacgtcacacgctttgccctgccgttcactgcaccacaccgcctcctgtccaccaggtacaacggtgaa

tgcaaatacacacagacatcaaccgccatccgtggcgaccgtgctgtgttggcagccaaatacgcaaatg

caaagcatgagcttccctccaccttcaacttcgggtacttgaccgccgacgaaccagtcgacgtttacta

caggatgaagaggactgagctctactgtccaagagcccttctccctgcttatgaccaccaaagcagggac

aggttcgacgcccccattggcgtcgagaaacaactg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSSGEGADVVTTDPSTHGGSVTEKRRMHTDVAFVMDRFTHVHTNQTST

VIDLMDTNEKTLVGALLRASTYYFCDMEIACVGKHARVWWQPNGAPRTTQLRDNPMVFSHNNVTRFALPF

TAPHRLLSTRYNGECKYTQTSTAIRGDRAVLAAKYANAKHELPSTFNFGYLTADEPVDVYYRMKRTELYC

PRALLPAYDHQSRDRFDAPIGVEKQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcagcgggagaaagcgcagatgtcgtcaccacggacccatcta

cacacggtggaaacgtgcaagagggccgacgcaaacacaccgaagttgcgttccttcttgaccgcagtac

acacgtccacacaaacaaaacatcctttgttgtggacctcatggacacaaaggagaaggcactcgtgggc

gcaatcctgcgggcttccacctactacttttgtgaccttgagattgcatgtgtgggcgacnacacaaggg

ccttttggcagcctaacggggcgccgcggaccacccaacttggcgacaaccccatggttttcgccaaggg

cggtgtgacccgctttgccatcccgttcacggccccacacaggttgctgtctactgtctacaatggtgag

tgtaaatacacgaaaactcccaccgccatccgtggagaccgtgcggcgctagcggcaaagtacgctgaca

gcacgcacactttgccgtcaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgatgtttacta

caggatgaagagggctgaactgtactgtccacgcccgctgctgccagcctatgaacacacaggcggagac

agattcgacgcgcccattggcgtcgagaggcagacc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTNKTSF

VVDLMDTKEKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDXTRAFWQPNGAPRTTQLGDNPMVFAKGGVTRFAIPF

TAPHRLLSTVYNGECKYTKTPTAIRGDRAALAAKYADSTHTLPSTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYEHTGGDRFDAPIGVERQT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtacaayggygartgyaaatacac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttcatcctgtagtamacmtcgac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Описан способ молекулярной диагностики, а именно генотипирование вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени, не более 2,5 ч, генотипирование вируса ящура вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 разработанным способом. Впервые представлена дифференциация генома вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 с помощью разработанного способа. Разработанный способ характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,34-100,00%, диагностическая специфичность - 98,07-100,0%. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 3 пр.

1. Способ генотипирования вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 методом исследования пиков температур плавления ампликонов с применением флуоресцирующего димерного акридина Eva488, с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров FMDV/SAT-2/F387 с дизайном 5'-gtacaaYggYgaRtgYaaatacac-3' и FMDV/SAT-2/R526 с дизайном 5'-cttcatcctgtagtaMacMtcgac-3' и флуоресцирующего димерного акридина Eva488, включающий следующие этапы исследования:

- экстрагирование РНК вируса ящура из сырья для изготовления вакцин;

- проведение обратной транскрипции и амплификации специфического фрагмента кДНК ID-гена вируса ящура размером 162 п.н. с применением олигонуклеотидных праймеров и флуоресцирующего димерного акридина Eva488;

- осуществление анализа пиков температур плавления ампликонов, при проведении которого используются следующие пики температур плавления для следующих вакцинных штаммов вируса ящура: «SAT-2/Кения/19/2017» - 73,62±0,04°С, «SAT-2 Lib 39/2012» - 80,72±0,03°С, «SAT-2/Eritrea/1998» - 78,96±0,04°С, «SAT-2 Kenya 183/74» - 75,98±0,05°С, «SAT-2 SAU 7/2000» - 79,54±0,05°C, и по различию данных температур проводится дифференциация указанных вакцинных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2.

2. Способ по п. 1, где аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале - 99,34-100,00%, диагностическая специфичность - 98,07-100,0%.