Пептид с антибактериальной активностью Российский патент 2024 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61K47/00 A61P31/04 

Область техники

Изобретение относится к химии органических соединений, фармакологии и медицине и касается нового пептида, характеризующегося антибактериальной активностью, который, в частности, может использоваться для профилактики и лечения инфекционных заболеваний у субъекта.

Уровень техники

В последние десятилетия человечество столкнулось с глобальной проблемой устойчивости к противомикробным препаратам, основной причиной которой является естественный эволюционный отбор вследствие чрезмерного использования противомикробных препаратов в медицине и сельском хозяйстве. По оценкам, к середине XXI века более 10 миллионов смертей ежегодно могут быть связаны с антибиотикорезистентностью. Недавняя работа показала, сейчас во всем мире более 1,2 миллиона смертей ежегодно непосредственно вызваны антибиотикоустойчивыми инфекциями [Murray, C.J.; Ikuta, K.S.; Sharara, F.; Swetschinski, L.; Robles Aguilar, G.; Gray, A.; Han, C.; Bisignano, C.; Rao, P.; Wool, E.; et al. Global Burden of Bacterial Antimicrobial Resistance in 2019: A Systematic Analysis. Lancet 2022, 399, 629-655]. Повсеместное распространение антибиотикорезистентности требует поиска новых эффективных антибактериальных соединений. Однако в последние десятилетия количество зарегистрированных антибиотиков было ограниченным [Browne, K.; Chakraborty, S.; Chen, R.; Willcox, M.D.; Black, D.S.; Walsh, W.R.; Kumar, N. A New Era of Antibiotics: The Clinical Potential of Antimicrobial Peptides. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7047].

В последние годы большой интерес вызывают так называемые антимикробные пептиды (далее - АМП), являющиеся важнейшим компонентом системы врожденного иммунитета. Известно, что АМП обладают выраженным антибактериальным, противовирусным, противогрибковым, противопаразитарным и противоопухолевым действием [Huan Y, Kong Q, Mou H, Yi H. Antimicrobial Peptides: Classification, Design, Application and Research Progress in Multiple Fields. Front Microbiol. 2020; 11:582779].

Важно отметить, что вероятность развития резистентности к АМП значительно ниже, чем к антибиотикам на основе малых молекул [Yu, G.; Baeder, D.Y.; Regoes, R.R.; Rolff, J. Predicting Drug Resistance Evolution: Insights from Antimicrobial Peptides and Antibiotics. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 2018, 285]. Это связано с механизмом действия АМП, который основан на прямом повреждении клеточной стенки бактерий посредством пермеабилизации мембраны [The Mechanism of Membrane Permeabilization by Peptides: Still an Enigma. Aust. J. Chem. 2019, 73, 96-103]. Это делает АМП одинаково эффективными против чувствительных и полирезистентных бактерий [Browne, K.; Chakraborty, S.; Chen, R.; Willcox, M.D.; Black, D.S.; Walsh, W.R.; Kumar, N. A New Era of Antibiotics: The Clinical Potential of Antimicrobial Peptides. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7047].

Из уровня техники известны de novo разработанные пептиды и модифицированные пептиды с противомикробной активностью (US9707282B2; RU2468033, RU2702661, WO2013124436). Целый ряд антимикробных пептидов в настоящее время находятся на стадии клинических исследований, а некоторые уже одобрены к применению в клинической практике [Dijksteel, Gabrielle S et al. “Review: Lessons Learned From Clinical Trials Using Antimicrobial Peptides (AMPs).” Frontiers in microbiology vol. 12 616979. 22 Feb. 2021].

Ранее исследовали стратегию использования АМП в сочетании с традиционными антибиотиками-малыми молекулами, в результате было показано, что фенотип антибиотикорезистентности бактерий не влияет на эффективность АМП [Bolatchiev, A. Antibacterial Activity of Human Defensins against Staphylococcus Aureus and Escherichia Coli. PeerJ 2020, 8, e10455].

Таким образом, попытки создания новых пептидных молекул с фармакологической активностью представляются целесообразными и актуальными.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка и создание новых эффективных антибактериальных средств, перспективных для применения в клинической практике для терапии и/или профилактики инфекционных заболеваний.

Техническим результатом изобретения является разработка и получение нового пептидного соединения, обладающего высокой антибактериальной активностью широкого спектром действия и перспективного для применения в терапии инфекционных заболеваний у субъекта, вызванных бактериальной инфекцией, в том числе заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными (в т.ч. полирезистентными) бактериальными штаммами. Неожиданно установлено, что пептид по изобретению характеризуется способностью ингибировать штаммы патогенов, в том числе штаммы патогенов, которые не чувствительны в отношении широко используемых препаратов, в частности карбапенем-устойчивые бактериальные изоляты, ванкомицин-устойчивые бактериальные изоляты.

Помимо этого, пептид по изобретению расширяет арсенал доступных антибактериальных средств для терапии инфекционных заболеваний, вызванных, в частности, полирезистентными бактериальными штаммами.

Указанный технический результат достигается посредством разработки и создания пептида с антибактериальной активностью, или его фармацевтически приемлемой соли, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также включает применение пептида по изобретению в качестве антибактериального средства.

Предметом настоящего изобретения также является применение пептида по изобретению для получения фармацевтической композиции с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано грамотрицательной или грамположительной бактерией.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано антибиотикорезистентным бактериальным штаммом.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано бактерией из рода ацинетобактеров, псевдомонад, стафилококков, протей или клебсиелл.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus.

Предметом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией, содержащая эффективное количество пептида по изобретению и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано грамотрицательной или грамположительной бактерией.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано антибиотикорезистентным бактериальным штаммом.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано бактерией из рода ацинетобактеров, псевдомонад или клебсиелл.

В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

Настоящее изобретение также включает получение соединений по изобретению.

Настоящее изобретение также включает способ лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией, посредстом введения субъекта пептида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.

Настоящее изобретения также включает способ блокирования и/или ингибирования и/или подавления роста бактерий, в том числе патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (в частности, карбапенем-устойчивых бактерий, ванкомицин-устойчивых бактерий), с помощью пептида по изобретению или фармацевтических композиций по изобретению.

Настоящее изобретение относится к пептиду или его фармацевтически приемлемым солям, которые проявляют антибактериальную активность. Эти молекулы показывают широкий спектр активности против различных патогенов (в том числе антибиотикорезистентных (в т.ч. полирезистентных) бактериальных штаммов и т.д.). Заявленный пептид, в частности, проявляет выраженную противомикробную активность в отношении широкого спектра грамотрицательных или грамположительных антибиотикоустойчивых бактериальных штаммов.

Подробное раскрытие изобретения

Краткое описание чертежей

Фигур 1. Кривая Каплана-Мейера, построенная по результатам исследования пептида по изобретению в мышиной модели летальной генерализованной инфекции in vivo.

Фигура 2. Масс-спектр (MS) пептида по изобретению.

Фигура 3. Хроматограмма ВЭЖХ пептида по изобретению.

Определения и термины

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Термин "аминокислота" относится и к природным аминокислотам (включая как L- аминокислоты, так и D- аминокислоты). Аминокислоты обозначают стандартными сокращениями: аргинин (Arg; R), лейцин (Leu; L), лизин (Lys; K), фенилаланин (Phe; F), триптофан (Trp; W).

Соединения, составляющие суть данного изобретения, могут существовать в меченой радиоизотопом форме, т.е. указанные соединения могут содержать один или несколько атомов, чья атомная масса или массовое число отличается от атомной массы или массового числа наиболее распространенных природных изотопов. Радиоизотопы водорода, углерода, фосфора, хлора включают ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, и ³⁶Cl, соответственно. Соединения данного изобретения, которые содержат такие радиоизотопы и/или другие радиоизотопы других атомов, находятся в сфере настоящего изобретения. Тритиевые, т.е. ³H и углеродные, т.е. ¹⁴С радиоизотопы являются особенно предпочтительными благодаря простоте приготовления и обнаружения.

Соединения настоящего изобретения, меченые радиоактивными изотопами, могут быть получены с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Меченые соединения могут быть получены с помощью процедур, описанными здесь, простой заменой немеченых реагентов соответствующими мечеными реагентами.

Соединения настоящего изобретения могут существовать в свободной форме или, если требуется, в виде фармацевтически приемлемой соли или другого производного. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к таким солям, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Фармацевтически приемлемые соли аминов, карбоновых кислот, фосфонатов и другие типы соединений хорошо известны в медицине. Соли могут быть получены in situ в процессе выделения или очистки соединений изобретения, а также могут быть получены отдельно, путем взаимодействия свободной кислоты или свободного основания соединения изобретения с подходящим основанием или кислотой, соответственно. Примером фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей кислот могут служить соли аминогруппы, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная или малоновая кислоты, или полученные другими методами, используемыми в данной области, например, с помощью ионного обмена. К другим фармацевтически приемлемым солям относятся адипинат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептанат, гексанат, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканат, валериат и подобные. Типичные соли щелочных и щелочноземельных металлов содержат натрий, литий, калий, кальций, магний и другие. Кроме того, фармацевтически приемлемые соли могут содержать, если требуется, нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, полученные с использованием таких противоионов, как галогениды, гидроксиды, карбоксилаты, сульфаты, фосфаты, нитраты, низшие алкил сульфонаты и арил сульфонаты.

Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Под «профилактически эффективным количеством» подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на профилактику инфекционных заболеваний, вызванных бактериальной инфекцией. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.Для профилактического лечения терапевтически или профилактически эффективное количество представляет собой то количество, которое будет эффективно в предотвращении микробной (например, бактериальной) инфекции.

Термин «пациент» («субъект») охватывает все виды млекопитающих, предпочтительно человека, которые используют соединения в рамках данного изобретения как путем самостоятельного введения, так и/или введения пациенту другим лицом для лечения и/или профилактики заболевания или медицинского состояния.

Термины «лечение», «терапия» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) блокирование (приостановку) течения заболевания, б) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Термин "антибактериальное средство", как используется в настоящем документе, относится к соединению или комбинации соединений, способным к: (i) ингибированию, уменьшению или предотвращению роста бактерий; (ii) ингибированию или уменьшению способности бактерий вызывать инфекцию у субъекта; или (iii) ингибированию или уменьшению способности бактерий размножаться или оставаться инфекционными в окружающей среде. Термин "антибактериальное средство" также относится к соединениям, способным к уменьшению инфекционности или вирулентности бактерий.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что пептид, описанный в настоящем документе, может существовать и часто используется в виде своих фармацевтически приемлемых производных, таких как соли, пролекарства, метаболиты, сложные эфиры, простые эфиры, гидраты, полиморфы, сольваты, комплексы, энантиомеры или другие фармацевтически приемлемые производные. Поэтому предполагается, что ссылка на пептид, рассмотренный в настоящем документе, включает такие фармацевтически приемлемые соли, пролекарства, метаболиты, сложные эфиры, простые эфиры, гидраты, полиморфы, сольваты, комплексы, энантиомеры или любые другие их фармацевтически приемлемые производные.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат пептид по изобретению (или про-лекарственную форму, фармацевтически приемлемую соль или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента вместе с соединением, составляющим сущность этого изобретения, и которые не разрушают фармакологическую активность этого соединения, и нетоксичны при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Фармацевтические композиции, указанные в этом изобретении, содержат пептиды настоящего изобретения вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать любые растворители (в частности, вода), разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазки и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтическими приемлемыми носителями, включают, но не ограничены, моно - и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; вспомогательные вещества, такие как масло какао и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло и другие; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; депирогенизированная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; спиртовые и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленочные агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Предметом настоящего изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, структура которых оптимизирована для определенного способа введения в организм в терапевтической эффективной дозе, например, для введения в организм внутривенно, перорально, внутримышечно, подкожно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и сублингвально, в рекомендуемых дозировках.

Лекарственные формы этого изобретения могут содержать структуры, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, способами получения наноформ лекарственного средства или другими способами, известными в фармацевтике.

Для введения парентеральным способом используются водные суспензии, изотонические физиологические растворы или стерильные растворы для инъекций, совместимые агенты которых содержат фармакологические, например, пропиленгликоль или бутиленгликоль.

В частных вариантах воплощения изобретения, композиции по изобретению могут включать пептид настоящего изобретения, конъюгированный с полиэтиленгликолем, а именно конъюгация N-конца пептида с полиэтиленгликолем (далее - ПЭГ) [ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 41, 46991-47001; https://doi.org/10.1021/acsami.0c13492]. Существуют различные вариации ПЭГ - в зависимости от его молекулярной массы.

Данный подход позволяет снизить иммуногенность, увеличить растворимость и период полувыведения белковых препаратов [Pasut G. Pegylation of biological molecules and potential benefits: pharmacological properties of certolizumab pegol. BioDrugs. 2014;28 Suppl 1:S15-S23. doi:10.1007/s40259-013-0064-z]. ПЭГ обладает высокой растворимостью в воде и многих органических растворителях, нетоксичен и неиммуногенен. ПЭГилирование биологически активных соединений позволяет повысить метаболическую стабильность за счет создания стерических затруднений, которые защищают молекулу от протеаз, и, таким образом, увеличить время циркуляции в условиях in vivo.

Методы терапевтического применения

Соединение настоящего изобретения является антибактериальным агентом, и поэтому оно являются полезным агентом для лечения и/или профилактики бактериальной инфекции субъекта, в том числе инфекции, вызванной антибиотикорезистентными (в т.ч. полирезистентными) бактериальными штаммами.

В еще одном аспекте изобретение также относится к способам лечения или профилактики бактериальной инфекции субъекта, включающим введение субъекту эффективного количества пептида по изобретению. Субъекты, подлежащие лечению, включают собак, кошек, лошадей, крупный рогатый скот, овец, свиней, домашнюю птицу, приматов (например, макак-резус и яванских макак, обезьян, мартышек, тамаринов, шимпанзе, макак), кроликов и грызунов (крыс, мышей, морских свинок и тому подобных). В одном варианте воплощения изобретения субъект представляет собой человека, и антимикробный пептид, согласно изобретению, может быть доставлен местно, интраназально, внутриглазным способом. Антимикробный пептид может быть доставлен в форме капель, спрея, крема, геля, мази и тому подобных форм.

Инфекции, которые могут подвергаться лечению описанными соединениями, включают инфекции наружного уха, инфекции среднего уха, такие как острый средний отит, инфекции черепных пазух, инфекции глаз, инфекции полости рта, такие как инфекции зубов, десны и слизистых оболочек, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, инфекции мочеполовой системы, желудочно-кишечные инфекции, гинекологические инфекции, сепсис, инфекции костей и суставов, инфекции кожи и ее структуры, ожоги, антибактериальная профилактика в хирургии и антибактериальная профилактика пациентов с иммунодефицитом, например, находящихся под действием химиотерапии рака, или после трансплантации органов. Эти инфекции можно лечить в больничных условиях или в сообществах с помощью различных способов введения, описанных в данном изобретении.

Соединение или композиции, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы в целях профилактики. Соответственно, соединение или композиция могут быть введены субъекту, потенциально подверженному риску развития микробной инфекции. Субъекты, подверженные риску развития микробной инфекции, включают индивидуумов, подвергнутых воздействию определенного микроорганизма, принадлежащего к патогенным видам бактерий; индивидуумов с нарушениями иммунной системы, или субъектов, особенно уязвимых для инфекций из-за нарушения естественной защиты (например, кожа, подверженная риску из-за ожогов или порезов).

Описанный в данном изобретении антимикробный пептид может быть использован для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, вызванных различными бактериальными организмами, включая инфицирование видами патогенных бактерий. Примеры бактериальной инфекции, без ограничений, включают грамположительные и грамотрицательные аэробные и анаэробные бактерии, такие как стафилококки, например, S. aureus; энтерококки, например, E. faecalis; стрептококки, например, S. pyogenes и S. pneumoniae; виды эшерихий, например, E.coli, включая энтеротокси генные, энтеропатогенные, энтероинвазивные, энтерогеморрагические и энтероагрегационные штаммы E.coli; штаммы пропионовых бактерий, например, P. acnes; гемофиллезы, например, Н. influenza; моракселлы, например, М. catarrhalis. Другие примеры включают микобактерии, например, М. tuberculosis, М. avian-intracellulare, М. kansasii, М. bovis, М. africanum, М. genavense, М. leprae, М. xenopi, М. simiae, М. scrofulaceum, М. malmoense, М. celatum, М. abscessus, М. chelonae, М. szulgai, М. gordonae, М. haemophilum, М. fortuni и М. marinum; коринебактерии, например, С.diphtheriae; виды псевдомонад, например, P. aeruginosa; виды боррелий, например, В. burgdorferi; виды листерий, например, L. Monocytogenes, виды бацилл, например, В. cereus; виды бордетелл, например, В. bronchiseptica; виды клебсиелл, виды клостридий, например, С.perfringens, С.tetani; виды хламидий, например, С.psittaci; виды риккетсий, например, R. rickettsii и R. prowazekii; виды сальмонелл, например, S. typhimurium; виды ерсиний, например, Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis; виды клебсиелл, например, K. pneumoniae или K.aerogenes; и микоплазм, например, М. pneumonia, виды актинобактерий, H. parasuis; и Trueperella pyogenes.

В определенных аспектах изобретения, были выбраны стафиллококковые бактерии, например, S. pseudintermedius, S. aureus, S. schleiferi, S. chromogenes, S. simulans, S. xylosus. Также, могут быть выбраны стрептококковые бактерии, например, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. suis. Кроме того, бактерии семейства Pasteurellaceae также подходят для лечения композициями, описанными в данном изобретении. Подходящие бактерии семейства Pasteur ellaceae включают М. haemolytica, P. multocida, H. somni, виды рода Escherichia, например, E.coli и виды рода Klebsiella.

В определенных вариантах воплощения изобретения бактериями являются S. pseudintermedius и/или P. aeruginosa.

В определенных вариантах воплощения изобретения бактериями являются бактерии из рода ацинетобактеров, в частности Acinetobacter baumannii.

В определенных вариантах воплощения изобретения бактериями являются Proteus vulgaris.

Для терапевтического применения соединения изобретения могут вводиться с помощью фармацевтической композиции в любой фармацевтической лекарственной форме любым способом введения. Лекарственные формы обычно включают фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для выбранной конкретной лекарственной формы. В частности, соединение по изобретению может вводиться ежедневно в течение периода времени, необходимого для лечения и/или профилактики заболеваний, имеющих отношение к пациенту, включая курс терапии, длящийся дни, месяцы, годы или всю жизнь пациента. Способы введения включают, но не ограничиваются внутривенно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриглазным способом, ингаляционно, интраназально и сублингвально. Предпочтительным способом введения является внутривенный.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей ежедневную дозу указанного соединения в форме фиксированной единицы дозировки, и к комбинации, содержащей указанную фармацевтическую композицию или указанное соединение. В предпочтительном варианте осуществления указанную композицию для применения в соответствии с изобретением вводят один раз в день в дозировке 1 мг или более выбранного соединения по изобретению. Предпочтительная дозировка составляет 1-500 мг.Наиболее предпочтительная дозировка составляет 10-200 мг.

Один или несколько дополнительных фармакологически активных агентов могут вводиться в комбинации с пептидом по изобретению. Как правило, любые дополнительные одиночные или множественные активные агенты, отличные от соединений по изобретению, включая, но не ограничиваясь, другими антибактериальными лекарственными средствами, могут использоваться в любой комбинации с соединением по изобретению в одной или отдельной лекарственной форме, позволяющей одновременное или последовательное терапевтическое действие активных агентов.

Осуществление изобретения

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Получение пептида по изобретению

Общие методики получения пептида по изобретению

Специалист в данной области техники может легко синтезировать пептид согласно изобретению. Стандартные способы получения синтетических пептидов хорошо известны в данной области техники. Пептид изобретения может быть синтезированы с помощью таких обычно используемых способов как t-BOC или FMOC защита альфа-аминогрупп.Оба способа включают ступенчатый синтез, при этом одна аминокислота добавляется на каждой стадии, начиная от карбоксильного конца пептида. Пептид изобретения также может быть синтезированы методами твердофазного синтеза пептидов, хорошо известными в данной области техники.

Помимо этого, пептид по изобретению может быть получены не только путем химического синтеза, но также с помощью применения биотехнологических методов: могут быть синтезированы нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность аминокислот заявленного пептида - данные нуклеотидные последовательности могут быть внедрены в клетки (с помощью векторов или нативных нуклеиновых кислот), и трансформированные таким образом клетки могут быть использованы для экспрессии заявленных пептидов. Указанные векторы и нуклеотидные последовательности могут быть введены в организм человека (и других живых организмов) для экспрессии заявленных пептидов непосредственно in vivo. Указанные методы также хорошо известны специалистам в данной области техники.

Синтез пептида по изобретению

Пептид по изобретению синтезирован методом твердофазного Fmoc-синтеза с помощью автоматического синтезатора JBMS-96-A (Jianbang Pharmacy Technology Co.,Ltd.). Пептид был очищен (чистота>93%) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (табл.2).

Некоторые частные варианты воплощения изобретения раскрыты в таблице 1 ниже.

Таблица 1. Примеры пептидов по изобретению.

Структура SEQ ID No: Условное обозначение RLKLKFRLW 1 ABP5

ВЭЖХ пептида по изобретению проводили на колонке YMC-Triart C18 (4.6*250mm*5um), элюируя 0,1% трифторуксусной кислоты в 100% воде (растворитель A) и 0,1% трифторуксусной кислоты в 100% ацетонитриле (растворитель B), при скорости потока 1 мл/мин (фиг.3).

Таблица 2. Данные ВЭЖХ и масс-спектроскопии для пептида по изобретению.

SEQ ID No: Условное
обозначение Данные масс-спектрометрии (MS), фигура 2 Чистота
(по ВЭЖХ) 1 ABP5 m/z 1259.70 [M+H]+ >99,6%

Заявленный пептид может быть включен в состав других крупных молекул (белков, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов) без изменения их фармакологической активности или с целью придания им новых свойств. Кроме того, производные заявленного пептида могут быть получены путем химической модификации концевых участков аминокислот.

Характеристика биологической активности

Спектр антибактериальной активности пептида по изобретению in vitro

Исследование эффективности заявленного пептида in vitro проводилось методом серийных разведений. Чистые бактериальные культуры культивировались на твердой питательной среде (маннитол-солевой агар, BioMedia, Санк-Петербург, Россия). Из свежей утренней культуры готовили суспензию на стерильном физиологическом растворе, которая соответствовала стандарту мутности по 0,5 МакФарланду (что эквивалентно 1-2×10⁸ CFU/mL). Суспензию растворяли в бульоне Мюллера-Хинтона (BBL(Mueller Hinton Broth, Becton, Dickinson and Company, США) для получения инокулюма с примерной концентрацией 5×10⁵ CFU/mL. После чего инокулюм (100 мкл) добавляли в лунки стерильных микропланшетов (Медполимер, Санкт-Петербург, Россия), в которые затем вносили по 100 мкл пептида по изобретению в различных концентрациях (от 0 до 32 мкг/мл). Контроли: контроль стерильности (только бульон Мюллера-Хинтона, без инокулюма) и контроль роста (бактериальный инокулюм без заявленного пептида). Затем микропланшеты инкубировались в термостате при 37°C. Через 18-20 ч оценивались величины минимальной подавляющей концентрации (МПК). За МПК считалось минимальное значение концентрации пептидного соединения, при котором визуально полностью отсутствовал рост в соответствующей лунке [Wiegand, Irith et al. “Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.” Nature protocols vol. 3,2 (2008): 163-75].

Исследование антибактериальной активности заявленного соединения проводилось в отношении клинических полирезистентных грамотрицательных карбапенем-устойчивых бактерий и грамположительных ванкомицин-устойчивых бактерий, результаты представлены в таблице 3 ниже.

Таблица 3. Минимальные подавляющие концентрации (МПК; мкг/мл) пептида ABP5 по изобретению в отношении клинических изолятов бактерий (значения МПК представлены в виде медианы; n - число исследованных бактериальных изолятов).

Исследованные бактериальные изоляты МПК (мкг/мл) Staphylococcus aureus (n=6) 4 Enterococcus faecalis (n=4) 0,5 Proteus vulgaris (n=4) 4 Escherichia coli (n=8) 0,5 Pseudomonas aeruginosa (n=4) 2 Acinetobacter baumannii (n=4) 2 Klebsiella pneumoniae (n=8) 4

Таким образом, полученные результаты исследований показывают, что пептид по изобретению обладают высокой антибактериальной активностью, в том числе в отношении антибиотикорезистентных (в т.ч. полирезистентным) бактериальных штаммов.

Исследование активности пептида по изобретению в условиях in vivo

Для скрининговой оценки эффективности пептида ABP5 in vivo была использована мышиная модель летальной генерализованной инфекции. Для моделирования сепсиса мышам линии ICR (CD-1) (самцы, средняя масса=30 г) внутрибрюшинно вводили бактериальную суспензию карбапенем-устойчивого изолята K. pneumoniae (~6,75×10⁸ КОЕ/мышь). В эксперименте было 2 группы мышей (по 12 особей в каждой группе): 1 группа - контрольная (получали физиологический раствор), 2 группа - получали ABP5, в эмпирической дозе 100 мкг/мышь; ABP5 вводился через 30 мин после инфицирования, однократно внутрибрюшинно. Выживаемость оценивали каждые 24 часа в течение 5 дней. Для статистического анализа проводилась оценка функции выживания в методе Каплана-Мейера (https://www.statskingdom.com/kaplan-meier.html).

В результате проведенного исследования было показано, что введение пептида ABP5 значимо увеличивает вероятность выживания по сравнению с контрольной группой (p=0,0004074). К концу эксперимента, через 120 часов после инфицирования, процент выживших животных в группе ABP5 составил 58%, против 0% в контрольной группе. При этом, интересно, что уже через 48 часов после инфицирования в контрольной группе выжило лишь 16% животных, в а группе ABP5 - 91% (фиг.1).

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к химии и фармакологии, а именно: к пептиду с антибактериальной активностью или его фармацевтически приемлемой соли, имеющему последовательность SEQ ID NO: 1; к его применению в качестве антибактериального средства; к его применению для получения фармацевтической композиции с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией; к фармацевтической композиции с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией, содержащей эффективное количество предложенного пептида и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала антибактериальных средств для терапии инфекционных заболеваний, в том числе тех, которые вызваны полирезистентными бактериальными штаммами. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

1. Пептид с антибактериальной активностью или его фармацевтически приемлемая соль, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1.

2. Применение пептида по п.1 в качестве антибактериального средства.

3. Применение пептида по п.1 для получения фармацевтической композиции с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией.

4. Применение по п.3, характеризующееся тем, что заболевание вызвано грамотрицательной или грамположительной бактерией.

5. Применение по п.3, характеризующееся тем, что заболевание вызвано антибиотикорезистентным бактериальным штаммом.

6. Применение по п.4, характеризующееся тем, что заболевание вызвано бактерией из рода ацинетобактеров, псевдомонад, стафилококков, протей или клебсиелл.

7. Применение по п.4, характеризующееся тем, что заболевание вызвано Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus.

8. Фармацевтическая композиция с антибактериальной активностью для лечения и/или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, вызванного бактериальной инфекцией, содержащая эффективное количество пептида по п.1 и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, характеризующаяся тем, что фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой носитель, наполнитель и/или растворитель.

10. Фармацевтическая композиция по п.8, характеризующаяся тем, что заболевание вызвано грамотрицательной или грамположительной бактерией.

11. Фармацевтическая композиция по п.8, характеризующаяся тем, что заболевание вызвано антибиотикорезистентным бактериальным штаммом.

12. Фармацевтическая композиция по п.8, характеризующаяся тем, что заболевание вызвано бактерией из рода ацинетобактеров, псевдомонад или клебсиелл.

13. Фармацевтическая композиция по п.8, характеризующаяся тем, что заболевание вызвано Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus.

14. Фармацевтическая композиция по п.8, где субъект представляет собой человека.