НОВЫЙ ВАРИАНТ ГАММА-АМИНОБУТИРАТПЕРМЕАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛЕЙЦИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/10 C12N15/54 C12N15/77 C12P13/06 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новому варианту гамма(γ)-аминобутиратпермеазы, который уменьшает количество побочных продуктов, образуемых во время продуцирования L-изолейцина, полинуклеотиду, кодирующему этот вариант, и вектору, содержащему этот полинуклеотид, микроорганизму, содержащему этот вариант, полинуклеотид или вектор, и способу получения L-изолейцина с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

L-изолейцин представляет собой одну из аминокислот с разветвленной цепью среди имеющихся 20 аминокислот, его классифицируют как незаменимую аминокислоту и используют в таких областях как производство кормов для животных, пищевых добавок и медицина. Помимо метаболической функции L-изолейцин выполняет такие функции как генерирование энергии, продуцирование гемоглобина, контроль уровня сахара в крови и построение и восстановление мышц, и, следовательно, растет его применение в таких областях как производство кормов для животных, а также растворов для инфузии, пищевых добавок и спортивных пищевых добавок.

В соответствии с этой тенденцией различные микроорганизмы и их варианты используют для получения L-аминокислот (патент США No. 10113190), и в этом случае также образуется большое число побочных продуктов, отличных от L-изолейцина, и эти побочные продукты представляют собой вещества, которые сильно влияют на чистоту L-изолейцина на стадии очистки, и следовательно, необходим способ удаления побочных продуктов. В этом отношении способ очистки L-изолейцина, разработанный для увеличения чистоты L-изолейцина, обладает недостатком, связанным с необходимостью отдельного дополнительного процесса очистки (патент США No. 6072083), и следовательно существует необходимость в разработке способа увеличения чистоты L-изолейцина.

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая задача

В результате серьезных усилий по увеличению чистоты L-изолейцина во время продуцирования с использованием микроорганизмов был выявлен ген aroP, кодирующий γ-аминобутиратпермеазу которая может уменьшать количество побочных продуктов, таких как α-аминобутират и L-валин, и вносить вклад в продукцию L-изолейцина, и был получен вариант, способный дополнительно увеличивать чистоту L-изолейцина.

Техническое решение

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант γ-аминобутиратпермеазы.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий этот вариант.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вектор, содержащий этот полинуклеотид.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм, содержащий любой один или более чем один такой вариант, полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения L-изолейцина.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить композицию для получения L-изолейцина.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение этого варианта, полинуклеотида, кодирующего этот вариант, вектора, содержащего этот полинуклеотид, или микроорганизма для получения L-изолейцина.

Полезные эффекты

Микроорганизм, экспрессирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению, может существенно улучшить чистоту L-изолейцина по сравнению со штаммом, который не экспрессирует вариант γ-аминобутиратпермеазы, и, следовательно, можно эффективно получать L-изолейцин с использованием этого микроорганизма. Следовательно, можно ожидать, что этот микроорганизм может быть использован в широком диапазоне областей промышленности, таких как производство пищевых продуктов, кормов и медицина, где находит применение L-изолейцин.

Подробное описание изобретения

Здесь и далее содержание настоящего изобретения описано более подробно следующим образом. Между тем, описания и воплощения одного аспекта, раскрытого в настоящем изобретении, можно применять к описаниям и воплощениям других аспектов в отношении общего содержания. Более того, объем настоящего изобретения охватывает все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем изобретении. Кроме этого, не следует рассматривать подробное описание, изложенное ниже, как ограничивающее объем настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В этом варианте 212-ая аминокислота может быть заменена на треонин, 114-ая аминокислота может быть заменена на фенилаланин, или 28-ая аминокислота может быть заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и в частности, аминокислота, соответствующая положению 212, представляющая собой глицин, может быть заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, представляющая собой изолейцин, может быть заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, представляющая собой аланин, может быть заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но вариант не ограничен этим.

Вариант может состоять из любой одной или более чем одной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, но не ограничиваясь ими.

В частности, вариант, в котором 212-ая аминокислота (то есть, глицин) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена на треонин, может состоять из SEQ ID NO: 3; вариант, в котором 114-ая аминокислота (то есть, изолейцин) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена на фенилаланин, может состоять из SEQ ID NO: 20; и вариант, в котором 28-ая аминокислота (то есть, аланин) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена на валин, может состоять из SEQ ID NO: 21, соответственно, но варианты не ограничены этим.

Вариант по настоящему изобретению может представлять собой такой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, 114 или 28 в γ-аминобутиратпермеазе, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, что обеспечивает ему повышенную активность γ-аминобутиратпермеазы вследствие увеличения утилизации побочного продукта, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "L-изолейцин" относится к L-аминокислоте, имеющей химическую формулу HO₂CCH(NH₂)CH(CH₃)CH₂CH₃, представляющей собой одну из незаменимых аминокислот и структурно соответствующую аминокислоте с разветвленной цепью наряду с L-валином и L-лейцином.

Как его используют здесь, термин "γ-аминобутиратпермеаза" означает полипептид или белок, обладающий активностью γ-аминобутиратпермеазы, и относится к белку или полипептиду, обладающему активностью утилизации α-аминобутирата или L-валина. γ-Аминобутиратпермеаза может представлять собой белок или полипептид обладающий активностью утилизации L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана или L-гистидина, а также α-аминобутирата или L-валина, которые представляют собой побочные продукты, образуемые во время продуцирования L-изолейцина, но не ограничиваясь ими. γ-Аминобутиратпермеазу можно использовать взаимозаменяемо с пермеазой ароматических аминокислот, и ген, кодирующий γ-аминобутиратпермеазу можно использовать взаимозаменяемо с геном aroP, а γ-аминобутиратпермеазу можно использовать взаимозаменяемо с AroP.

γ-Аминобутиратпермеаза может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Термин "белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1" и "белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1".

В частности, SEQ ID NO: 1 может представлять собой аминокислотную последовательность γ-аминобутиратпермеазы, кодируемую геном aroP, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 можно взять из различных баз данных, таких как NCBI GenBank, которая представляет собой известную базу данных, но не ограничиваясь этим. Например, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 может иметь происхождение из Corynebacterium sp.или может иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь этим, и может включать последовательности, обладающие такой же активностью, как аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1, без ограничения. Дополнительно, хотя белок, обладающий активностью γ-аминобутиратпермеазы, в настоящем изобретении описан как полипептид или белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, добавление незначащих последовательностей перед и после аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 не исключено, или мутации, которые могут происходить в природе, или молчащие мутации в этой последовательности не исключены, и для специалиста в данной области техники очевидно, что белок, обладающий такой же активностью, как белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или соответствующей активностью, соответствует полипептиду или белку, обладающему активностью аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению. В качестве конкретного примера полипептид, обладающий активностью аминобутиратпермеазы, по настоящему изобретению может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности, гомологичной или идентичной указанной последовательности на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более. Может быть очевидно, что полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой некоторые последовательности делетированы, модифицированы, заменены или добавлены, также включены в ряд полипептидов по настоящему изобретению, при условии что эта аминокислотная последовательность обладает указанной степенью гомологии или идентичности и проявляет эффективность, соответствующую эффективности указанного полипептида.

Хотя полипептид или белок по настоящему изобретению описан как "полипептид или белок, включающий аминокислотную последовательность определенной SEQ ID NO:", "полипептид или белок, состоящий из аминокислотной последовательности определенной SEQ ID NO:" или "полипептид или белок, имеющий аминокислотную последовательность определенной SEQ ID NO:", очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, в которой некоторые последовательности делетированы, модифицированы, заменены, заменены путем консервативной замены или добавлены, также можно использовать в настоящем изобретении, при условии что он обладает такой же активностью, как полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности соответствующей SEQ ID NO, или соответствующей активностью. Примеры таких полипептидов или белков включают случай, где аминокислотная последовательность на N-конце и/или С-конце может иметь добавленную последовательность, не изменяющую функцию белка, природную мутацию, молчащую мутацию в ней или консервативную замену.

Согласно настоящему изобретению в качестве способа для обеспечения аминобутиратпермеазы применимы различные способы, хорошо известные в данной области техники. В качестве примера такого способа можно привести использование мутантного штамма методом скрининга полезных ферментативных источников с помощью технологии генетического синтеза, включающей оптимизацию кодонов и биоинформационные технологии, основанные на большом количестве геномной информации о микроорганизмах, с тем чтобы обеспечить ферменты из микроорганизмов, обычно и широко используемых для экспрессии фермента с высокой эффективностью, но способ не ограничен ими.

Как его используют здесь, термин "вариация" или "вариант" относится к культуре или индивидууму, которые генетически или не генетически проявляют одно стабильное фенотипическое изменение, и в частности, в настоящем изобретении это может быть вариант, в котором аминокислота в аминобутиратпермеазе, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, мутирована, и таким образом активность аминобутиратпермеазы эффективно повышена по сравнению с активностью фермента дикого типа, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "вариант" или "модифицированный полипептид" относится к белку, в котором одна или более чем одна аминокислота отличается от вышеупомянутой последовательности консервативными заменами и/или модификациями, но функции или свойства белка сохранены. Этот вариант отличается от идентифицированной последовательности несколькими аминокислотными заменами, делециями или вставками. Обычно такой вариант можно идентифицировать путем модификации одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности белка и оценке свойств модифицированного белка. Другими словами, активность варианта может быть повышена, не изменена или снижена по сравнению с таковой нативного белка. Дополнительно некоторые варианты могут включать модифицированные полипептиды, из которых удален один или более чем один участок, например N-концевая лидерная последовательность или транс мембранный домен. Другие варианты могут включать варианты, из которых удален участок из N- и/или С-конца зрелого белка. Термины "вариант" или "модифицированный полипептид" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами как "модификация", "модифицированный белок", "мутант", "мутеин", "дивергент" и "вариант", но не ограничиваясь этим, при условии что он представляет собой термин, используемый в смысле мутации.

Для задач настоящего изобретения вариант может означать модифицированный белок, обладающий повышенной активностью по сравнению с активностью природного белка дикого типа или немодифицированного белка, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "консервативная замена" относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую сходными структурными и/или химическими свойствами. Вариант может иметь, например, одну или более чем одну консервативную замену, в то же время сохраняя одну или более чем одну биологическую активность. Такие аминокислотные замены обычно могут происходить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы аминокислотных остатков.

Например, аминокислоты с боковыми цепями можно классифицировать на положительно заряженные (основные) аминокислоты среди аминокислот с электрически заряженными боковыми цепями, включая аргинин, лизин и гистидин, и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты, включая глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; и аминокислоты с незаряженными боковыми цепями, включая глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин.

Вариант может включать делеции или вставки аминокислот, которые оказывают минимальный эффект на вторичную структуру и свойства полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая вовлечена в ко-трансляционный или пост-трансляционный перенос белка. Полипептид может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами, так чтобы обеспечить возможность идентификации, очистки или синтеза полипептида.

Вариант по настоящему изобретению может обладать активностью γ-аминобутиратпермеазы и может обладать повышенной активностью γ-аминобутиратпермеазы, но не ограничиваясь этим.

Вариант, обладающий активностью γ-аминобутиратпермеазы, по настоящему изобретению описан как полипептид или белок, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но не исключая добавления незначащей последовательности до или после аминокислотной последовательности, в которой аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или мутаций, которые могут происходить в природе, или молчащих мутаций в ней, и специалисту в данной области техники может быть очевидно, что белок, обладающий такой же активностью, как белок, включающий аминокислотную последовательность, в которой аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или соответствующей активностью, соответствует полипептиду, белку или варианту, обладающему активностью γ-аминобутиратпермеазы, по настоящему изобретению. В качестве конкретного примера полипептид или вариант, обладающий активностью γ-аминобутиратпермеазы, по настоящему изобретению, может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, гомологичной или идентичной указанной последовательности на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более. Может быть очевидно, что полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой некоторые последовательности делетированы, модифицированы, заменены или добавлены, также включен в ряд полипептидов по настоящему изобретению, при условии что аминокислотная последовательность обладает такой гомологией или идентичностью и проявляет эффективность, соответствующую эффективности указанного полипептида.

Как его используют здесь, термин "соответствующий" или "соответствующее положение" относится к аминокислотному остатку в положении, перечисленном в составе белка или полипептида, или аминокислотному остатку подобному, идентичному или гомологичному остатку, перечисленному в составе белка или полипептида. Как его используют здесь, термин "соответствующий участок" обычно относится к подобному или соответствующему расположению в родственном белке или референсном белке.

В настоящем изобретении точную нумерацию можно использовать для указания положений аминокислотных остатков в белке, используемом в настоящем изобретении. Например, можно перенумеровать положение в соответствии с положением аминокислотного остатка в белке по настоящему изобретению путем выравнивания полипептидных последовательностей белка по настоящему изобретению и целевого белка, с которым сравнивают.

Как его используют здесь, термин "гомология" или "идентичность" относится к степени сходства между двумя определенными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и она может быть выражена в процентах. Термины "гомология" и "идентичность" часто можно использовать взаимозаменяемо.

Гомологию или идентичность консервативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности определяют путем стандартного алгоритма выравнивания, и вместе с ним можно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный с помощью программы. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно обладают способностью гибридизоваться в умеренных или строгих условиях гибридизации на протяжении всей последовательности или по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% полноразмерной последовательности. Очевидно, что гибридизация также включает полинуклеотиды, содержащие общие кодоны в полинуклеотид ах или кодоны с учетом вырожденности кодонов.

Наличие гомологии, сходства или идентичности между двумя произвольными полинуклеотидными или полипептидными последовательностями можно определить, например, с использованием параметров по умолчанию, как изложено в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 и известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FASTA". Альтернативно, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как он выполнен в программе "Needleman" пакета "EMBOSS" (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), В LAS TP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. E, et al, J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, Ed., Academic Press, San Diego, 1994 и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать "BLAST" от Национального Центра Биотехнологической Информации или "ClustalW".

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определить путем сравнения информации о последовательностях, например, с использованием компьютерной программы "GAP", например как в Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, например, как известно из Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Таким образом, гомологию, сходство или идентичность можно определять как величину, полученную путем деления числа одинаково выровненных символов (а именно, нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей в программе "GAP". Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значения 1 для идентичных и 0 для неидентичных символов) и взвешенную матрицу сравнения по Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен "EDNAFULL" (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353 358 (1979); (2) штраф 3,0 за каждый пропуск и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска 10, штраф за удлинение пропуска 0,5) и (3) отсутствие штрафа за окончание пропуска.

Обладают ли две произвольные полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью можно подтвердить путем сравнения последовательностей путем экспериментов с гибридизацией по Саузерну в заданных строгих условиях, и подходящие условия гибридизации, которые следует определить, известны в данной области техники, и могут быть определены способами, хорошо известными специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению. В частности, предложен полинуклеотид, кодирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1, γ-аминобутиратпермеаза и вариант являются такими, как описано выше.

В настоящем изобретении аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 может, например, кодировать полинуклеотид, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, и вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, может кодировать полинуклеотид, включающий любую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 24, но не ограничиваясь ими.

Полинуклеотид, кодирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы, может включать любую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 24, но не ограничиваясь ими.

Как его используют здесь, термин "полинуклеотид" относится к цепи ДНК или РНК, имеющей определенную длину или больше, где полимер нуклеотидов, в котором мономеры нуклеотидов соединены в длинную цепь, образованную с помощью ковалентных связей. В настоящем изобретении полинуклеотид может кодировать полипептид, проявляющий активность γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но не ограничиваясь этим.

Полинуклеотид может включать, без ограничения, любой полинуклеотид, кодирующий полипептид, проявляющий активность γ-аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению. В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность γ-аминобутиратпермеазы, представляет собой ген aroP, и ген может иметь происхождение из микроорганизма, принадлежащего Corynebacterium sp., и в частности, он может иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь этим.

В частности, полинуклеотид, кодирующий полипептид, проявляющий активность γ-аминобутиратпермеазы, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, в которой аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В полинуклеотиде кодирующая область может быть по-разному модифицирована вследствие вырожденности кодонов или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, предназначенного для экспрессии полипептида, в диапазоне, в котором аминокислотная последовательность полипептида не изменена. Полинуклеотид может содержать, например, последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, и может состоять из последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей 80%, в частности 90% или более, более конкретно 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или еще более конкретно 99% или более гомологии или идентичности с указанной последовательностью, но не ограничиваясь этим.

Дополнительно полинуклеотид по настоящему изобретению может содержать без ограничения любую последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, в которой аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 путем гибридизации с зондом, который может быть получен из известной последовательности гена, например, последовательности, комплементарной всей последовательности нуклеиновой кислоты или части такой последовательности в строгих условиях.

В частности, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 последовательность, кодирующая вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, может включать SEQ ID NO: 22; последовательность, кодирующая вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, может включать SEQ ID NO: 23, и последовательность, кодирующая вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин, может включать SEQ ID NO: 24, но последовательности не ограничены этими.

"Строгие условия" относятся к условиям, обеспечивающим возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия специально описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., выше). Примеры таких условий включают условия, в которых полинуклеотиды, имеющие высокую степень гомологии или идентичности друг с другом, например, полинуклеотиды, гомологичные или идентичные друг другу на 40% или более, в частности 90% или более, более конкретно 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или еще более конкретно 99% или более, гибридизуются друг с другом, и полинуклеотиды, имеющие меньшую степень гомологии или идентичности друг с другом, чем указанная выше, не гибридизуются друг с другом; или условия, в которых промывку выполняют 1 раз, в частности от 2 до 3 раз, при температуре и концентрации соли, соответствующей 60°С 1×SSC, 0,1% SDS, в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, стандартным условиям промывки для гибридизации по Саузерну.

Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя несовпадения между нуклеиновыми кислотами возможны в зависимости от строгости условий гибридизации. Термин "комплементарные" используют для описания отношения между нуклеотидными основаниями, способными гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, полинуклеотид по настоящему изобретению также может содержать по существу похожие последовательности нуклеиновой кислоты, а также выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, комплементарные полной последовательности.

В частности, полинуклеотиды, имеющие гомологию друг с другом или идентичные друг другу, можно выявить путем гибридизации в условиях, включающих этап гибридизации при значении Tm 55°С и условиях гибридизации, описанных выше.

Значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничиваясь этим, и может быть подходящим образом уточнено специалистом в данной области техники в зависимости от задачи.

Подходящая строгость условий для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и параметры хорошо известны в данной области техники (смотрите, Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению. В частности, предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1, γ-аминобутиратпермеаза, вариант и полинуклеотид являются такими, как описано выше.

Как его используют здесь, термин "вектор" относится к ДНК-продукту, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, функционально связанный с подходящей областью регуляции экспрессии (или последовательностью регуляции экспрессии), так что целевой полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Область регуляции экспрессии может включать промотор, способный инициировать транскрипцию; произвольную последовательность оператора для регулирования такой транскрипции; последовательность, кодирующую подходящую мРНК сайта связывания с рибосомой, и последовательность контроля терминации транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящую клетку-хозяин вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина и сам может встраиваться в геном.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, специально не ограничен, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемых векторов включают плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги в природном или рекомбинантном состоянии. Например, pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A можно использовать в качестве фагового вектора или космидного вектора, и систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему pET и им подобные можно использовать в качестве плазмидного вектора. В частности, можно использовать векторы pDCM2 (заявка на патент Кореи в открытом доступе No. 10-2020-0136813), pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC и им подобные.

В качестве примера, полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, может быть вставлен в хромосому с помощью вектора для внутриклеточной вставки в хромосому. Вставку полинуклеотид а в хромосому можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь этим. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для определения того, произошла ли вставка в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть, для определения того, произошла ли вставка целевой молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксичным агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде обработки агентом селекции только клетки, экспрессирующие селективный маркер, выживают или проявляют другие признаки экспрессии, и таким образом можно отбирать трансформированные клетки.

В настоящем изобретении термин "экспрессионная кассета" относится к единой кассете, которая включает промотор и целевой ген и, таким образом, экспрессирует целевой ген, функционально связанный с промотором. Различные факторы, которые могут способствовать эффективной экспрессии целевого гена, могут быть включены внутри или снаружи генной экспрессионной кассеты. Генная экспрессионная кассета обычно может включать сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции дополнительно к промотору, функционально связанному с целевым геном, но не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении термин "трансформация" относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяин или микроорганизм, так чтобы белок, кодируемый этим полинуклеотидом, мог экспрессироваться в клетке-хозяине. Полинуклеотид для трансформации может включать любой из таких векторов независимо от того, вставлен он в хромосому клетки-хозяина или расположен вне хромосомы, при условии что он может экспрессироваться в клетке-хозяине. Полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующую целевой белок. Полинуклеотид можно вводить в любой форме, при условии что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид можно вводить в клетку-хозяин в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяин в своей собственной форме и функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "функционально связанный" означает, что промоторная последовательность, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотид а, кодирующего целевой полипептид, по настоящему изобретению и последовательность гена функционально связаны друг с другом.

Метод трансформации вектором по настоящему изобретению включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку, и его можно выполнять путем выбора подходящей стандартной технологии, известной в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, известны методы электропорации, осаждения фосфатом кальция (СаРО₄), осаждения хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекции, метод с использованием полиэтиленгликоля (PEG), метод с DEAE-декстраном, катионно-липосомный метод и метод с ацетатом лития - DMSO, но метод не ограничен этими.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, содержащий один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант; и вектор, содержащий этот полинуклеотид.

В одном воплощении микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, который продуцирует L-изолейцин, но не ограничиваясь этим. В частности, микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, который продуцирует L-изолейцин в качестве целевого продукта, и может представлять собой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-изолейцин благодаря включению любого одного или более чем одного варианта, полинуклеотида или вектора по настоящему изобретению, но не ограничиваясь этим.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1, γ-аминобутиратпермеаза, вариант, полинуклеотид, вектор и L-изолейцин являются такими, как описано выше.

В настоящем изобретении термин "микроорганизм" включает как микроорганизмы дикого типа, так и микроорганизмы, в которых произошла природная или искусственная генетическая модификация, и представляет собой понятие, включающее все микроорганизмы, у которых определенный механизм ослаблен или усилен вследствие таких причин как вставка чужеродного гена или повышенная или пониженная активность эндогенного гена. В настоящем изобретении микроорганизм может включать без ограничения любой микроорганизм, в который введен или включен один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид.

В настоящем изобретении микроорганизм может включать один или более чем один полипептид, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, обладающий способностью продуцировать целевой белок или целевой продукт, вовлеченный в продукцию целевого белка, вследствие включения любого одного или более чем одного полипептида, полинуклеотида, кодирующего этот полипептид, и вектора, содержащего этот полинуклеотид, но не ограничиваясь этим. Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, обладающий способностью естественным образом продуцировать целевой белок или целевой продукт, или микроорганизм, в котором способность продуцировать целевой белок или целевой продукт придана родительскому штамму, не обладающему способностью продуцировать целевой белок или целевой продукт, но не ограничиваясь этим.

Микроорганизм представляет собой клетку или микроорганизм, трансформированные вектором, содержащим ген, кодирующий полинуклеотид по настоящему изобретению и целевой белок, и экспрессирующие, например, целевой белок, и для задач настоящего изобретения клетка-хозяин или микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, способный продуцировать целевой продукт, включая целевой белок.

Микроорганизм может представлять собой рекомбинантный микроорганизм, и рекомбинация может быть выполнена путем генетической модификации, такой как трансформация.

Как его используют здесь, термин "микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт" включает как микроорганизмы дикого типа, так и микроорганизмы, в которых генетическая модификация произошла естественным или искусственным путем, относится к микроорганизму, у которого определенный механизм ослаблен или усилен вследствие таких причин как вставка внешнего гена или повышенная или пониженная активность эндогенного гена, и может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования целевого белка или продукта.

Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, генетически модифицированный с использованием любого одного или более чем одного полипептида, полинуклеотида, кодирующего этот полипептид, и вектора, содержащего этот полинуклеотид; микроорганизм, модифицированный для экспрессии полипептида или полинуклеотида, кодирующего этот полипептид; рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий полипептид или полинуклеотид, кодирующий этот полипептид; или рекомбинантный микроорганизм, обладающий активностью полипептида, но не ограничиваясь этим.

Для задач настоящего изобретения микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, может представлять собой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать целевой белок или целевой продукт, вследствие включения полинуклеотида по настоящему изобретению. В частности, в настоящем изобретении микроорганизм, продуцирующий целевой белок или целевой продукт, или микроорганизм, обладающий способностью продуцировать целевой белок или целевой продукт, может представлять собой микроорганизм, у которого часть гена в пути биосинтеза целевого белка или целевого продукта усилена или ослаблена, или часть гена в пути расщепления целевого белка или целевого продукта усилена или ослаблена.

Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой а микроорганизм, содержащий один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, но не ограничиваясь этим. Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, продуцирующий L-изолейцин в качестве целевого продукта, и может обладать повышенной продуктивностью по L-изолейцину или уменьшать количество побочных продуктов, образуемых во время продуцирования L-изолейцина, по сравнению с немодифицированными микроорганизмами или микроорганизмами дикого типа, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "для экспрессии/экспрессируется" относится к состоянию, в котором целевой белок вводят в микроорганизм или модифицируют для экспрессии в микроорганизме. Когда целевой белок представляет собой белок, присутствующий в микроорганизме, термин "для экспрессии/экспрессируется" относится к состоянию, в котором активность повышена по сравнению с собственной активностью или активностью до модификации.

Микроорганизм, экспрессирующий вариант белка по настоящему изобретению, может представлять собой микроорганизм, модифицированный для экспрессии варианта белка. Соответственно, еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения микроорганизма, экспрессирующего вариант белка по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении термин "введение белка" означает, что микроорганизм проявляет активность определенного белка, которого исходно не было у микроорганизма, или что микроорганизм проявляет улучшенную активность по сравнению с собственной активностью соответствующего белка или его активностью до модификации. Например, термин "введение белка" может относиться к состоянию, когда введен определенный белок; полинуклеотид, кодирующий этот определенный белок, введен в хромосому микроорганизма, или в микроорганизм введен вектор, содержащий этот полинуклеотид, кодирующий определенный белок, и проявляется активность этого определенного белка.

Как его используют здесь, термин "усиление" активности полипептида или белка означает, что активность полипептида или белка повышена по сравнению с его собственной активностью. Термин "усиление" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами как "повышающая регуляция", "сверхэкспрессия" и "повышение". Здесь, повышение может включать как проявление активности, которой полипептид или белок исходно не обладал, или проявление улучшенной активностью по сравнению с его собственной активностью или активностью до модификации. Термин "собственная активность" относится к активности определенного полипептида или белка, которой исходно обладает родительский штамм до трансформации или немодифицированный микроорганизм, до того как характерная особенность была изменена вследствие генетической мутации под воздействием природных или искусственных факторов. Этот термин можно использовать взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". Тот факт, что активность полипептида или белка "усилена" или "повышена" по сравнению с собственной активностью означает, что активность полипептида или белка улучшена по сравнению с активностью определенного полипептида или белка, которой исходно обладает родительский штамм до трансформации или немодифицированный микроорганизм. В качестве примера, активность полипептида или белка может быть улучшена по меньшей мере на 1%, 3%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400% или 500% и максимально на 1000% или 2000% по сравнению с активностью белка родительского штамма до трансформации или немодифицированного микроорганизма, но усиление или повышение активности полипептида или белка не ограничено этим. Термин "примерно" означает диапазон, включающий все из ±0,5; ±0,4; ±0,3; ±0,2; ±0,1 и им подобные, и включает все числовые значения в диапазоне, эквивалентном или близком к числовому значению, следующему за термином "примерно", но не ограничиваясь этим.

"Повышение активности" может быть достигнуто путем введения экзогенного полипептида или белка или усиления активности эндогенного полипептида или белка, но в частности может быть достигнуто путем усиления активности эндогенного полипептида или белка. Усилена ли активность полипептида или белка или нет, можно проверить по повышению степени активности или уровня экспрессии соответствующего полипептида или белка или количества продукта, экскретируемого из соответствующего белка.

Усиление активности полипептида или белка может быть не ограничено, при условии что применимы различные способы, хорошо известные в данной области техники, и активность целевого полипептида или белка может быть усилена по сравнению с таковой у микроорганизма до модификации. Можно использовать технологию генетической инженерии и/или белковой инженерии, хорошо известные специалисту в данной области техники, представляющие собой традиционные методы молекулярной биологии (Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.), но способ не ограничен этим.

Способ усиления активности полипептида или белка с использованием генетической инженерии может быть выполнен, например, путем:

1) увеличения числа внутриклеточных копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок,

2) способа, в котором область регуляции экспрессии гена, кодирующего полипептид или белок, в хромосоме заменена на последовательность, проявляющую сильную активность,

3) способа, в котором последовательность нуклеиновой кислоты стартового кодона или области 5'-UTR для этого полипептида или белка модифицирована,

4) способа, в котором полинуклеотидная последовательность в хромосоме модифицирована для повышения активности полипептида или белка,

5) введения экзогенного полинуклеотида, обеспечивающего активность полипептида или белка, или кодон-оптимизированного модифицированного варианта этого полинуклеотида, или

6) комбинации этих способов, но не ограничиваясь ими.

Способ усиления активности полипептида или белка с использованием белковой инженерии может быть выполнен путем, например, способа, в котором анализируют третичную структуру полипептида или белка для выбора экспонированного сайта и этот экспонированный сайт модифицируют или химически модифицируют, но не ограничиваясь этим.

1) Увеличение числа внутриклеточных копий гена или полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения в клетку-хозяин вектора, способного реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, с которым функционально связан ген или полинуклеотид, кодирующий соответствующий полипептид или белок. Альтернативно, 1) увеличение может быть достигнуто путем введения в клетку-хозяин вектора, способного вставлять ген или полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, с которым ген функционально связан, но не ограничиваясь этим. Вектор является таким, как описано выше.

2) Способ, в котором область регуляции экспрессии (или последовательность регуляции экспрессии) гена, кодирующего полипептид или белок, в хромосоме заменена на последовательность, проявляющую сильную активность, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения мутации в последовательность путем введения делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в последовательность нуклеиновой кислоты или их комбинации для дополнительного усиления активности области регуляции экспрессии или путем замены области регуляции экспрессии на последовательность нуклеиновой кислоты, проявляющую более сильную активность. Область регуляции экспрессии может включать промотор; последовательность оператора; последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой; последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобное, но специально не ограничиваясь этим. Этот способ может, в частности, обеспечивать связывание сильного гетерологичного промотора вместо нативного промотора, но не ограничиваясь этим.

Примеры известных сильных промоторов включают промоторы cj1 - cj7 (патент США. No. 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор фага лямбда PR, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13(sm3) (патент США No. 10584338 В2), промотор O2 (патент США No. 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваясь ими.

3) Способ, в котором последовательность нуклеиновой кислоты стартового кодона или 5'-UTR(нетранслируемой области) для полипептида или белка модифицирована, может представлять собой любой способ, известный в данной области техники, например, может представлять собой замену эндогенного стартового кодона полипептида или белка на другой старт-кодон, обеспечивающий более высокий уровень экспрессии полипептида или белка, чем эндогенный старт-кодон, но не ограничиваясь этим.

4) Способ, в котором полинуклеотидная последовательность в хромосоме модифицирована для повышения активности полипептида или белка, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем индуцирования мутации в последовательности регуляции экспрессии путем введения делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в последовательность нуклеиновой кислоты, или их комбинации для дополнительного усиления активности полинуклеотидной последовательность, или путем замены полинуклеотидной последовательности на полинуклеотидную последовательность, улучшенную для проявления значительно более сильной активности. В частности, замена может быть предназначена для вставки гена в хромосому путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим.

Вектор, используемый в этом случае, может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения того, произошла ли вставка в хромосому или нет. Селективный маркер является таким, как описано выше.

5) Введение экзогенного полинуклеотида, проявляющего активность полипептида или белка, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения в клетку-хозяин экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид или белок, проявляющий такую же/похожую активность как полипептид или белок, или его кодон-оптимизированного модифицированного полинуклеотида. В качестве экзогенного полинуклеотида можно использовать любой экзогенный полинуклеотид без ограничения по происхождению или последовательности, при условии что он проявляет такую же/подобную активность, как этот полипептид или белок. Кодон-оптимизированный экзогенный полинуклеотид можно ввести в клетку-хозяин для того, чтобы выполнить оптимизированную транскрипцию и трансляцию введенного экзогенного полинуклеотида в клетке-хозяине. Введение может быть выполнено путем выбранного подходящим образом способа трансформации, известного специалисту в данной области техники, и получен полипептид или белок, и его активность может быть повышена, поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине.

Наконец, 6) комбинация способов может быть выполнена путем применения одного или более чем одного способа из 1) - 5) вместе.

Такое усиление активности полипептида или белка может представлять собой повышение активности или концентрации соответствующего полипептида или белка относительно активности или концентрации полипептида или белка, экспрессируемого в штамме микроорганизма дикого типа или штамме микроорганизма до модификации, или увеличение количества продукта, продуцируемого соответствующим полипептидом или белком, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" не исключает штаммы, содержащие мутации, которые могут происходить в микроорганизмах естественным путем, и может относиться к штамму дикого типа или самому природному штамму, или штамму до изменения признака путем генетической мутации вследствие природных или искусственных факторов. Термины "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" можно использовать взаимозаменяемо с термином "немутированный штамм", "немодифицированный штамм", "немутированный микроорганизм", "немодифицированный микроорганизм" или "референсный микроорганизм".

В одном воплощении микроорганизм по настоящему изобретению может принадлежать к Corynebacterium sp., но не ограничиваясь этим.

Термин "микроорганизм, принадлежащий к Corynebacterium sp." по настоящему изобретению может включать все микроорганизмы, принадлежащие Corynebacterium sp. Микроорганизм, принадлежащий Corynebacterium sp., в частности, может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiem, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens, более конкретно, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium crenatum или Corynebacterium deserti.

В настоящем изобретении родительский штамм микроорганизма может представлять собой микроорганизм, у которого путь биосинтеза L-изолейцина дополнительно усилен для увеличения продукции L-изолейцина, но не ограничиваясь этим.

В частности, для усиления пути биосинтеза L-изолейцина микроорганизм может представлять собой, например, микроорганизм, у которого промотор aroP заменен на промотор gapA для усиления функции промотора; генетическая мутация (R407H) дополнительно введена в ген horn, кодирующий гомосериндегидрогеназу для устранения ингибирования по типу обратной связи треонином, предшественником изолейцина (зарегистрированный патент Кореи No. 10-1996769); дополнительно введены генетические мутации (T381A,F383A) гена ilvA, кодирующего L-треониндегидратазу (заявка на патент Кореи No. 10-2020-0078669), или генетическая мутация (L377K) дополнительно введена в ген lysC, кодирующий аспартокиназу (зарегистрированная публикация США No. 10662450 В2). Однако микроорганизм не ограничен вышеперечисленными, и продукцию L-изолейцина можно увеличить способом контроля экспрессии генов, известным в данной области техники.

В другом примере для увеличения продукции L-изолейцина в настоящем изобретении родительский штамм микроорганизма может представлять собой микроорганизм, в котором ген, который ослабляет путь биосинтеза L-изолейцина, дополнительно инактивирован для увеличения продукции L-изолейцина, но не ограничиваясь этим.

Как их используют здесь, термины "инактивация" или "ослабление" в отношении полипептида или белка представляют собой понятие, включающее как пониженную активность по сравнению с собственной активностью, так и отсутствие активности. Термины "инактивация" или "ослабление" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами как "понижающая регуляция", "понижение" и "уменьшение". Инактивация или ослабление также может включать случай, когда активность самого белка понижена или устранена по сравнению с активностью белка, которой обладает нативный микроорганизм, вследствие мутации в гене, кодирующем этот белок, и подобным образом, случай, где общая степень активности белка в клетке ниже, чем таковая в природном штамме, вследствие ингибирования экспрессии или ингибирования трансляции гена, кодирующего этот белок; случай, где экспрессия гена полностью отсутствует, и случай, где ген не проявляет активность, хотя ген экспрессируется. Термин "собственная активность" относится к активности определенного полипептида или белка, которой изначально обладает родительский штамм до трансформации или у немодифицированного микроорганизма, когда характерная особенность изменена путем генетической мутации вследствие природных или искусственных факторов. Этот термин можно использовать взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". Тот факт, что активность полипептида или белка "понижена" по сравнению с собственной активностью означает, что активность понижена по сравнению с активностью определенного полипептида или белка, которой изначально обладает родительский штамм до трансформации или немодифицированный микроорганизм.

Такая инактивация белка или ослабление его активности могут быть достигнуты путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники, но не ограничиваясь ими (Nakashima N. et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).

Примеры таких способов включают:

1) способ, в котором ген, кодирующий белок, делетирован полностью или частично;

2) модификацию области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего белок;

3) модификацию последовательности гена, кодирующего белок, так что активность белка устранена или ослаблена;

4) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего белок;

5) способ, в котором при добавлении последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, к переднему концу последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего белок, образуется вторичная структура, что делает присоединение рибосомы невозможным; и

6) способ, в котором добавляют промотор, транскрибируемый в направлении противоположном 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок (инженерия обратной транскрипцией, RTE), и инактивация белка или ослабление его активности могут быть достигнуты путем комбинации этих способов, но специально не ограничиваясь этим.

В частности способ, в котором ген, кодирующий белок, делетирован полностью или частично, может быть выполнен путем замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок на хромосоме, на полинуклеотид или маркерный ген, в котором некоторые нуклеотидные последовательности делетированы, с помощью вектора для вставки в хромосому в микроорганизме. В качестве примера такого способа в котором полинуклеотид делетирован полностью или частично, можно использовать способ, в котором полинуклеотид делетирован путем гомологичной рекомбинации, где способ не ограничен этим.

Способ, в котором ген делетирован полностью или частично, может быть выполнен путем индуцирования мутаций с использованием света, такого как ультрафиолетовое излучение, или химических веществ и отбора штаммов, лишенных целевого гена, среди полученных мутантов. Способ делетирования гена включает способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В технологии рекомбинантной ДНК делеция гена может быть получена, например, путем введения последовательности нуклеиновой кислоты, гомологичной целевому гену, или вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичную целевому гену, в микроорганизм для достижения гомологичной рекомбинации. Введенная последовательность нуклеиновой кислоты или вектора может включать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь этим.

Способ, в котором последовательность регуляции экспрессии модифицирована, может быть выполнен путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники. В качестве примера способ может быть выполнен путем индуцирования мутаций в области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены полинуклеотидной последовательности или их комбинации, так что активность области регуляции экспрессии (или последовательности регуляции экспрессии) дополнительно ослаблена, или путем замены полинуклеотидной последовательности на полинуклеотидную последовательность, проявляющую значительно более слабую активность. Область регуляции экспрессии включает промотор; последовательность оператора; последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничиваясь этим.

Способ, при котором последовательность гена модифицирована, может быть выполнен путем индуцирования мутаций в последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены последовательности гена, или комбинации вышеперечисленного, так что активность полипептида дополнительно ослаблена, или путем замены последовательности гена на последовательность гена, улучшенную для проявления значительно более слабой активности, или последовательность гена, улучшенную для устранения активности, но не ограничиваясь этим.

Например, экспрессия гена может быть ингибирована или ослаблена путем введения мутации в последовательность гена для получения стоп-кодона.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-изолейцина. В частности, такой способ обеспечивает способ, включающий культивирование микроорганизма, содержащего один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, в среде.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ уменьшения количества побочных продуктов, образованных во время продуцирования L-изолейцина. В частности, этот способ обеспечивает способ, включающий культивирование микроорганизма, содержащего один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, в среде.

L-изолейцин, аминокислота SEQ ID NO: 1, γ-аминобутиратпермеаза, вариант, полинуклеотид, вектор и микроорганизм являются такими, как описано выше.

Микроорганизм может принадлежать к Corynebacterium sp., в частности Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь этим. Микроорганизм также является таким, как описано выше.

В настоящем изобретении термин "культура" означает выращивание микроорганизма в условиях окружающей среды, контролируемых подходящим образом. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть выполнен в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области техники. Специалист в данной области техники может легко отрегулировать и использовать такой процесс культивирования в зависимости от выбранного штамма. В частности, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и периодическое культивирование с подпиткой, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "среда" относится к материалу, в котором питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма, перемешаны в качестве основных компонентов, и которое обеспечивает питательные вещества и факторы роста, включая воду, необходимые для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, можно использовать любую среду без какого-либо специального ограничения, при условии что она представляет собой среду, традиционно используемую для культивирования микроорганизмов. Микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в традиционной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины и тому подобное, в аэробных условиях при одновременном контроле температуры, рН и тому подобного.

В настоящем изобретении источники углерода могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахарные спирты, такие как манит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; и аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизаты крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниоку, отходы сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованная предварительно обработанная меласса (а именно, меласса, конвертированная в восстанавливающий сахар). Подходящие количества других источников углерода можно использовать по-разному без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более чем двух типов таких источников, но источники углерода не ограничены этими.

В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония, и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизаты казеина, рыба или продукты ее переработки и обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более чем двух типов таких источников, но источники азота не ограничены этим.

Источники фосфора могут включать одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия или соответствующую им натрийсодержащую соль. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное, и неорганические соединения могут включать аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники дополнительно к ним. Эти компоненты или предшественники можно добавлять в среду либо периодически, либо непрерывно. Однако среда не ограничена этим.

Во время культивирования микроорганизма такие соединения как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорную кислоту и серную кислоту можно добавлять в среду подходящим образом для подведения рН среды. Во время культивирования можно использовать пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для подавления образования пузырей. Кислород или кислородсодержащий газ можно вводить в среду для поддержания аэробного состояния среды, или азот, водород или углекислый газ можно вводить или газ можно не вводить для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния, но условия не ограничены этим.

Температура среды может составлять от 20°С до 50°С, в частности от 30°С до 37°С, но не ограничиваясь этим. Культивирование можно выполнять непрерывно до получения желаемого количества продуцированного полезного вещества, и период культивирования, в частности, может составлять от 10 часов до 100 часов, но не ограничиваясь этим.

В частности, состав культуральной среды для штамма Corynebacterium sp.можно взять из литературных источников ("Manual of Methods for General Bacteriology" Американского общества бактериологии (Washington D.C., USA, 1981)), но не ограничиваясь этим.

В одном воплощении способ ппродуцирования L-изолейцина, способ получения L-изолейцина или способ уменьшения количества побочных продуктов, образованных во время продуцирования L-изолейцина, может дополнительно включать выделение L-изолейцина из среды или микроорганизма, но не ограничиваясь этим.

Способ выделения L-изолейцина может состоять в извлечении целевого L-изолейцина с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например, способа периодического, непрерывного культивирования или периодического культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованных белков (метод высаливания), экстракцию, разрушение ультразвуком, ультрафильтрацию, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография), и комбинацию этих методов, и целевой L-изолейцин может быть выделен из среды или микроорганизма любым подходящим способом, известным в данной области техники.

Способ получения может включать дополнительный процесс очистки. В процессе очистки выделенный L-изолейцин можно очищать с использованием любого подходящего способа, известного в данной области техники. Выделенный L-изолейцин может находиться в очищенной форме или в ферментационной среде микроорганизма, содержащей целевой продукт (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair, 2008).

В одном воплощении способ ппродуцирования L-изолейцина или способ получения L-изолейцина может состоять в уменьшении количества побочных продуктов, образованных во время продуцирования L-изолейцина, но не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении термин "побочный продукт" включает все вещества, которые могут быть образованы во время продуцирования L-изолейцина. Побочные продукты могут представлять собой один или более чем один продукт, выбранный из α-аминобутирата (ААВА) или аргинина (Arg, R), гистидина (His, Н), глутаминовой кислоты (Glu, Е), аспарагиновой кислоты (Asp, D), глицина (Gly, G), аланина (Ala, А), валина (Val, V), лейцина (Leu, L), метионина (Met, М), фенилаланина (Phe, F), триптофана (Trp, W), пролина (Pro, Р), серина (Ser, S), цистеина (Cys, С), тирозина (Туг, Y), аспарагина (Asn, N) и глутамина (Gin, Q), представляющих собой аминокислоты, отличные от L-изолейцина, но не ограничиваясь ими. Для задач настоящего изобретения побочный продукт может представлять собой один или более чем один продукт, выбранный из группы, состоящей из α-аминобутирата (ААВА), валина, фенилаланина и лейцина, в частности может представлять собой α-аминобутират или валин, но не ограничиваясь ими.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция для получения L-изолейцина. В частности, композиция обеспечивает микроорганизм, содержащий один или более чем один вариант γ-аминобутиратпермеазы, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, или культуру этого микроорганизма.

Аминокислота SEQ ID NO: 1, γ-аминобутиратпермеаза, вариант, полинуклеотид, вектор, микроорганизм и культура являются такими, как описано выше.

Термин "композиция для получения L-изолейцина" может относиться к композиции, из которой с высокой эффективностью можно получать L-изолейцин с помощью варианта γ-аминобутиратпермеазы по настоящему изобретению. Эта композиция может включать, без ограничения, вариант γ-аминобутиратпермеазы или структуру, способную обеспечить функционирование варианта γ-аминобутиратпермеазы. Вариант γ-аминобутиратпермеазы может находится в форме гена, включенного в вектор, так чтобы функционально связанный ген мог экспрессироваться в клетке-хозяине, в которую он введен.

Композиция может дополнительно включать криопротектор или эксципиент. Криопротектор или эксципиент может представлять собой вещество, которое не встречается в природе, или вещество, встречающееся в природе, но не ограничиваясь этим. В другом воплощении криопротектор или эксципиент может представлять собой вещество, с которым штамм в природе не контактирует, или вещество, которое изначально не включено одновременно вместе со штаммом, но не ограничиваясь этим.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение варианта γ-аминобутиратпермеазы, где аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или микроорганизма, содержащего этот вариант, полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, для получения L-изолейцина.

Вариант, полинуклеотид, вектор, микроорганизм и изолейцин являются такими как описано выше.

Примеры осуществления изобретения

Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры и Экспериментальные Примеры предназначены исключительно для целей проиллюстрировать настоящее изобретение, и объем настоящего изобретения не ограничен этими Примерами и Экспериментальными Примерами.

Референсный Пример 1: Конструирование вектора для сверхэкспрессии гена aroP

В соответствии с задачей настоящего изобретения, для более точного подтверждения трансформации с участием гена aroP, кодирующего γ-аминобутиратпермеазу и ее вариант, выполняли сверхэкспрессию гена aroP в штамме Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

Для сверхэкспрессии гена aroP, кодирующего γ-аминобутиратпермеазу, был сконструирован плазмидный вектор, в котором промотор aroP был усилен путем замены промотора гена aroP на промотор gapA.

Для конструирования штамма, в котором промотор aroP заменен на промотор gapA, проводили ПЦР с использованием хромосомы АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9. Праймеры, используемые для проведения каждой ПЦР, представлены в Таблице 1 ниже.

Высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для проведения реакции ПЦР в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты, и денатурацию, отжиг и полимеризацию в этих условиях повторяли 28 раз. В результате получали фрагмент ДНК 1000 п. н. из 5'-области по ходу транскрипции и фрагмент ДНК 1392 п. н. из 3'-области против хода транскрипции относительно части промотора gapA и стартового кодона гена aroP, соответственно. Снова проводили ПЦР с использованием трех амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 95°С в течение 5 минут; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 6 раз; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 20 раз; и затем проводили полимеризацию при 72°С в течение 5 минут. В результате амплифицировали фрагмент ДНК 2,4 т.п.н., кодирующий ген aroP, включающий промотор gapA. Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки ПЦР от QUIAGEN и использовали в качестве фрагмента ДНК для вставки в векторную конструкцию.

Между тем, фрагмент ДНК вставки, амплифицированный путем вышеизложенной ПЦР, перемешивали с вектором pDCM2, расщепленным ферментом рестрикции Smal и затем прогретым при 65°С в течение 20 минут, в молярном соотношении 1:2 (М), и фрагмент ДНК вставки клонировали в вектор pDCM2 с использованием набора "Infusion cloning kit" от TaKaRa в соответствии с рекомендациями производителя, и таким образом был сконструирован вектор pDCM2-PgapA-aroP, в котором промотор aroP заменен на промотор gapA, для введения в хромосому.

Референсный Пример 2: Получение штамма, продуцирующего L-изолейцин

Corynebacterium glutamicum дикого типа обладает способностью продуцировать L-изолейцин, но не обеспечивает сверхпродукцию L-изолейцина. Однако для подтверждения генетической особенности, которая увеличивает способность к продуцированию L-изолейцина в соответствии с задачей настоящего изобретения, использовали штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-изолейцин.

Сначала на основании Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа был разработан штамм, продуцирующий L-изолейцин. В частности, для устранения ингибирования треонином по типу обратной связи, предшественник изолейцина в пути биосинтеза L-изолейцина, аргинин, представляющий собой 407-ую аминокислоту гомосериндегидрогеназы, был заменен на гистидин путем мутации гена horn, кодирующего гомосериндегидрогеназу (зарегистрированный патент Кореи No. 10-1996769). В частности, полинуклеотидная последовательность, кодирующая hom(R407H), представлена в SEQ ID NO: 10.

В частности, для получения штаммов, в которые введена мутация hom(R407H), проводили ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно. Последовательности праймеров, используемые для проведения каждой ПЦР, представлены в Таблице 2 ниже.

Высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для проведения реакции ПЦР в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты, и денатурацию, отжиг и полимеризацию в этих условиях повторяли 28 раз. В результате был получен фрагмент ДНК 1000 п. н. из 5'-области по ходу транскрипции и фрагмент ДНК 1000 п. н. из 3'-области против хода транскрипции относительно мутации гена horn, соответственно.

ПЦР проводили с использованием двух амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 14. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 95°С в течение 5 минут; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд; отжиг 55°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 28 раз, и затем проводили полимеризацию при 72°С в течение 5 минут.

В результате был амплифицирован фрагмент ДНК 2 т.н., содержащий мутацию гена horn, кодирующего вариант гена гомосериндегидрогеназы, в котором 407-ый аргинин заменен на гистидин. Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки ПЦР (QUIAGEN) и использовали в качестве фрагмента ДНК вставки для конструирования вектора. Как вектор pDCM2 (публикация заявки на патент Кореи No. 10-2020-0136813), прогретый при 65°С в течение 20 минут, так и очищенный продукт амплификации расщепляли ферментом рестрикции Smal и брали в молярном соотношении 1:2 (М), и очищенный продукт амплификации клонировали в вектор pDCM2 с использованием набора "Infusion cloning kit" от TaKaRa в соответствии с рекомендациями производителя, и таким образом сконструировали вектор pDCM2-R407H для введения мутации hom(R407H) в хромосому.

Сконструированным вектором трансформировали Corynebacterium glutamicum АТСС13032 методом электропорации, и затем следовал процесс вторичного кроссинговера для получения штамма, содержащего мутацию hom(R407H) в хромосоме, получившего название Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 hom(R407U).

Для устранения обратной связи и повышения активности полученного штамма АТСС13032 hom(R407H) в отношении L-изолейцина треонин, представляющий собой 381-ую аминокислоту L-треониндегидратазы (SEQ ID NO: 25), был заменен на аланин; и фенилаланин, представляющий собой 383-ю аминокислоту L-треониндегидратазы, был заменен на аланин путем мутирования ilvA, гена, кодирующего L-треониндегидратазу. В частности, был получен штамм, в который введен; ilvA(T381A, F383A), и полинуклеотид, кодирующий ilvA (Т381А, F383A), представлен SEQ ID NO: 15.

В частности, для получения штаммов, в которые введена мутация; ilvA (T381A, F383A), проводили ПЦР с использованием хромосомы Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19. Последовательности праймеров, используемые для проведения каждой ПЦР, представлены в Таблице 3 ниже.

Высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для проведения реакции ПЦР в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты, и денатурацию, отжиг и полимеризацию в этих условиях повторяли 28 раз. В результате был получен фрагмент ДНК 1126 п. н. из 5'-области по ходу транскрипции и фрагмент ДНК 286 п. н. из 3'-области против хода транскрипции относительно мутации гена ilvA, соответственно.

ПЦР проводили с использованием двух амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 19. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 95°С в течение 5 минут; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 28 раз, и затем полимеризацию проводили при 72°С в течение 5 минут.

В результате амплифицировали фрагмент ДНК 1,4 т.н., содержащий мутацию в гене ilvA, кодирующем вариант L-треониндегидратазы, в котором 381-ый треонин заменен на аланин, и 383-ий фенилаланин заменен на аланин. Продукт амплификации очищали с использованием набора для очистки ПЦР (QUIAGEN) и использовали в качестве фрагмента ДНК вставки для конструирования вектора. Вектор pDCM2 (публикация заявки на патент Кореи No. 10-2020-0136813), прогретый при 65°С в течение 20 минут, и очищенный продукт амплификации расщепляли ферментом рестрикции Smal и брали в молярном соотношении 1:2 (М), и очищенный продукт амплификации клонировали в вектор pDCM2 с использованием набора "Infusion cloning kit" от TaKaRa в соответствии с рекомендациями производителя, и таким образом сконструировали вектор pDCM2-ilvA(T381A, F383A) для введения мутации; ilvA(Т381А, F383A) в хромосому.

Сконструированным вектором трансформировали Corynebacterium glutamicum АТСС13032 hom(R407H) путем электропорации, и затем следовал процесс вторичного кроссинговера для получения штамма, содержащего мутацию ilvA(T381A, F383A) в хромосоме, получившего название Corynebacterium glutamicum СА10-3101.

Штамм СА10-3101 был депонирован на международном уровне в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), международном депозитарии, в соответствии с Будапештским Договором 27 мая 2020 года, и получил депозитарный номер КССМ12739Р.

Для информации, для подтверждения того, что введение; ilvA(Т381А, F383A) в штамм, продуцирующий L-изолейцин, устраняет регуляцию по типу обратной связи и повышает активность в отношении L-изолейцина и, таким образом, увеличивает эффективность продуктивности по L-изолейцину, проводили следующий эксперимент. В частности, концентрации L-изолейцина и L-треонина в культуре штамма KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A), в котором мутация ilvA(Т381А, F383A) введена в штамм KCJI-38 (КССМ11248Р, зарегистрированный патент Кореи No. 10-1335789), представляющий собой обработанный NTG (N-метил-N''-нитро-N-нитрозогуанидин) штамм, продуцирующий L-изолейцин, измеряли методом электрического импульса, и результаты представлены в Таблице 4 ниже.

Как представлено в Таблице 4, было подтверждено, что продукция L-изолейцина значительно повышена, и скорость расщепления L-треонина выше в штамме KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A), в который введена мутация ilvA(T381A,F383A), по сравнению со штаммом КССМ11248Р или штаммом KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A). Другими словами, было подтверждено, что введение мутации ilvA(Т381А, F383A) устраняет регуляцию по типу обратной связи и повышает активность в отношении L-изолейцина для целей настоящего изобретения.

Пример 1: Получение L-изолейцин-продуцирующего штамма, сверхэкспрессирующего ген aroP, и подтверждение эффекта aroP в отношении ферментационной чистоты L-изолейцина

Для подтверждения того, что сверхэкспрессия или мутация aroP во время продуцирвоания L-изолейцина уменьшает количество побочных продуктов и увеличивает чистоту L-изолейцина, ген aroP усиливали. Для этой цели выбрали СА10-3101, представляющий собой штамм, продуцирующий L-изолейцин, полученный в Референсном Примере 2. В частности, вектором, сконструированным в Референсном Примере 1, трансформировали Corynebacterium glutamicum СА10-3101 путем электропорации, и затем следовал процесс вторичного кроссинговера для получения штамма, в котором промотор aroP усилен на хромосоме, и этот штамм получил название Corynebacterium glutamicum СА10-3117. Родительский штамм (СА10-3101) и штамм с усиленным aroP (СА10-3117) инокулировали в колбы с угловыми перегородками на 250 мл, содержащие 25 мл среды для продукции изолейцина, соответственно, и затем культивировали при 32°С в течение 60 часов с встряхиванием при 200 об/мин для получения L-изолейцина. Состав продукционной среды, используемой в настоящем Примере, был следующим.

<Продукционная среда>

Глюкоза: 10%, дрожжевой экстракт: 0,2%, сульфат аммония: 1,6%, одноосновный фосфат калия: 0,1%, сульфат магния гептагидрат: 0,1%, сульфат железа гептагидрат: 10 мг/л, сульфат марганца моногидрат: 10 мг/л, биотин: 200 мкг/л, и рН: 7,2

После завершения культивирования продукцию L-изолейцина и побочных продуктов измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и концентрации L-изолейцина и побочных продуктов в культуре для каждого штамма, взятого в эксперимент, представлены в Таблице 5 ниже.

В результате, как представлено в Таблице 5, Corynebacterium glutamicum СА10-3101, родительский штамм, продуцировал L-изолейцин в концентрации 2,5 г/л, и α-кетобутират (ААВА) и L-валин, основные побочные продукты, были обнаружены в концентрации 0,9 г/л и 1,4 г/л, соответственно, но Corynebacterium glutamicum СА10-3117, штамм Corynebacterium glutamicum с усиленным aroP, полученный в настоящем Примере, продуцировал L-изолейцин в концентрации 2,7 г/л и, таким образом, было подтверждено, что он проявляет продуктивность по L-изолейцину, повышенную на 108% по сравнению с таковой у родительского штамма. Дополнительно побочные продукты, α-кетобутират и валин, были обнаружены в концентрации 0,4 г/л и 1,1 г/л, соответственно, и, таким образом, было подтверждено, что количества побочных продуктов, α-кетобутирата и валина, продуцированного штаммом, полученным в настоящем Примере, были уменьшены на 55% и 21%, соответственно, по сравнению с количествами побочных продуктов, α-кетобутирата и валина, продуцированных родительским штаммом.

На основании вышеизложенных результатов было подтверждено, что ген aroP может представлять собой мишень для увеличения ферментационной чистоты L-изолейцина вследствие уменьшения количества побочных продуктов L-изолейцина и увеличения продуктивности по L-изолейцину. Соответственно, метод случайного мутагенеза использовали для дополнительного улучшения aroP и разработки превосходящих вариантов aroP.

Пример 2: Конструирование вектора библиотеки модифицированного aroP

На основе вектора, сконструированного в Референсном Примере 1, была получена библиотека модифицированного aroP. Для этой цели была получена библиотека с использованием набора для склонной к ошибкам ПЦР (Clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit), и реакцию ПЦР проводили с использованием SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 в качестве праймеров в условиях, допускающих возникновение мутаций.

В частности, в условиях, в которых может происходить от 0 до 3 мутаций на 1000 п. н., реакцию ПЦР проводили таким образом, что после предварительного прогревания при 94°С в течение 30 секунд процесс при 94°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 1 минуты и 30 секунд повторяли 25 раз. В это время полученный продукт повторно подвергали процессу: 95°С в течение 50 секунд, 60°С в течение 50 секунд и 68°С в течение 12 минут с использованием мегапраймера (от 500 нг до 125 нг) 25 раз, затем обрабатывали DpnI, трансформировали полученной конструкцией Escherichia coli DH5a и высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Затем отбирали 20 трансформированных колоний, выделяли плазмиду и анализировали полинуклеотидную последовательность, и в результате было подтверждено, что мутации были введены в различные положения с частотой 2 мутации/т.н. Брали примерно 20000 колоний трансформированной Escherichia coli и выделяли плазмиды, которые получили название рТОРО-aroP-библиотека.

Пример 3: Получение L-изолейцин-продуцирующего штамма с введенной aroP-библиотекой

Corynebacterium glutamicum СА10-3101 трансформировали pTOPO-aroP-библиотекой, полученной в Примере 2, путем электропорации и затем высевали на питательную среду, содержащую канамицин в концентрации 25 мг/л, с получением 5000 колоний штаммов со вставкой мутантного гена, и каждая из колоний получила название от CA10-3101/pTOPO-aroPml до CA10-3101/pTOPO-aroPm 5000.

Для выявления колоний с повышенной продуктивностью по L-изолейцину и уменьшенным количеством побочных продуктов среди 5000 полученных колоний ферментационную эффективность каждой колонии оценивали следующим образом. Родительский штамм и мутантные штаммы инокулировали в колбы на 250 мл с угловыми перегородками, содержащие 25 мл среды для продукции изолейцина, соответственно, и затем культивировали при 32°С в течение 60 часов с встряхиванием при 200 об/мин для получения L-изолейцина. Состав продукционной среды, используемой в настоящем Примере, был следующим.

<Продукционная среда>

Глюкоза: 10%, дрожжевой экстракт: 0,2%, сульфат аммония: 1,6%, одноосновный фосфат калия: 0,1%, сульфат магния гептагидрат: 0,1%, сульфат железа гептагидрат: 10 мг/л, сульфат марганца моногидрат: 10 мг/л, биотин: 200 мкг/л, и рН: 7,2

После завершения культивирования продукцию L-изолейцина и L-треонина измеряли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и концентрации L-изолейцина, L-валина и ААВА в культуре каждого штамма, взятого в эксперимент, представлены в Таблице 6 ниже.

- Соотношение побочных продуктов: концентрация побочных продуктов (ААВА, L-валин)/концентрация (изолейцин + побочные продукты)

В результате, как представлено в Таблице 6, были идентифицированы три штамма, проявляющие повышенную продуктивность по L-изолейцину по сравнению с таковой у Corynebacterium glutamicum СА10-3101, родительского штамма, и продуцирующие побочные продукты, ААВА и L-валин, в меньшем количестве по сравнению с родительским штаммом. Было выполнено секвенирование для этих трех мутантных штаммов, и ген aroP сравнивали с таковым у АТСС13032 дикого типа, и в результате было подтверждено, что эти три мутантных штамма содержат мутацию в гене aroP.

В частности, было подтверждено, что глицин, 212-ая аминокислота в аминокислотной последовательности aroP, заменена на треонин (G212T) в штамме CA10-3101/pTOPO-aroPm138; изолейцин, 114-ая аминокислота в аминокислотной последовательности aroP, заменена на фенилаланин (I114F) в штамме СА10-3101/рТОРО-aroPm2542; и аланин, 28-ая аминокислота в аминокислотной последовательности aroP, заменена на валин (A28V) в штамме СА10-3101/рТОРО-aroPm3798. На основании вышеизложенных результатов было подтверждено, что три мутантных штамма могут продуцировать L-изолейцин с более высокой эффективностью и более высоким выходом по сравнению с родительским штаммом. Более конкретно, при сравнении каждого штамма, в который введен aroP (G212T), aroP (1114) или aroP (A28V), с родительским штаммом было показано, что L-изолейцин продуцировался в сходных концентрациях, концентрация ААВА снижалась примерно на 33%, 78% и 56%, соответственно, концентрация L-валина снижалась примерно на 0%, 42% и 8%, соответственно, и соотношение побочных продуктов (ААВА, валин) уменьшалось на 16%, 44% и 22%, соответственно, и было подтверждено, что эффект уменьшения количества побочных продуктов был превосходным в штаммах, в которые введены aroP (G212T), aroP (1114) или aroP (A28V).

Пример 4: Получение L-изолейцин-продуцирующего штамма, в который введен модифицированный aroP

Вариантом aroP (1114), обеспечивающим самую высокую продуктивность по L-изолейцину и сниженный уровень побочных продуктов среди трех типов модифицированных aroP, полученных в Примере 3, трансформировали Corynebacterium glutamicum СА10-3101.

В частности, как в Референсном Примере 1, проводили ПЦР с использованием хромосомы АТСС 13032 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, или с использованием хромосом рТОРО-aroPm2542 в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно. Высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для проведения ПЦР в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты, и денатурацию, отжиг и полимеризацию повторяли 28 раз. В результате был получен фрагмент ДНК 1000 п. н. из 5'-области по ходу транскрипции и фрагмент ДНК 1392 п. н. из 3'-области против хода транскрипции относительно части промотора gapA и стартового кодона гена aroP, соответственно. ПЦР проводили с использованием трех амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 9. Условия ПЦР были следующими: денатурация при 95°С в течение 5 минут; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 6 раз; затем денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 2 минут повторяли 20 раз, и затем проводили полимеризацию при 72°С в течение 5 минут. В результате был амплифицирован фрагмент ДНК 2,4 т.н., кодирующий ген aroP, включающий промотор gapA. Продукты амплификации очищали с использованием набора для очистки ПЦР от QUIAGEN и использовали в качестве фрагмента ДНК вставки для конструирования вектора. Между тем, фрагмент ДНК вставки, амплифицированный вышеизложенной ПЦР, перемешивали с вектором pDCM2, расщепленным ферментом рестрикции Smal и прогретым при 65°С в течение 20 минут, в молярном соотношении 1:2 (М), и фрагмент ДНК вставки клонировали в вектор pDCM2 с помощью набора "Infusion cloning kit" от TaKaRa в соответствии с рекомендациями производителя, и таким образом был сконструирован вектор pDCM2-PgapA-aroP(I114F), в котором промотор aroP заменен на промотор gapA для введения в хромосому.

Векторами, сконструированными как описано выше, трансформировали Corynebacterium glutamicum СА10-3101 путем электропорации, и затем следовал процесс вторичного кроссинговера для получения штаммов, в которых модифицированный промотор aroP был усилен, и CA10-3101::PgapA-aroP(I114F) получил название СА10-3118. В отношении L-изолейцин-продуцирующего родительского штамма (СА10-3101); штамма с усиленным aroP (СА10-3117), полученного в Примере 1, и штамма (СА10-3101) с введенным вариантом aroP(I114F), полученного в настоящем Примере, ферментационную эффективность каждого штамма оценивали следующим образом для подтверждения эффекта по увеличению продуктивности по L-изолейцину и уменьшения количества побочных продуктов. Родительский штамм и другие штаммы соответственно инокулировали в колбы на 250 мл с угловыми перегородками, содержащие 25 мл среды для продукции изолейцина, и затем культивировали при 32°С в течение 60 часов с встряхиванием при 200 об/мин для получения L-изолейцина. Состав продукционной среды, используемой в настоящем Примере, был следующим.

<Продукционная среда>

Глюкоза: 10%, дрожжевой экстракт: 0,2%, сульфат аммония: 1,6%, одноосновный фосфат калия: 0,1%, сульфат магния гептагидрат: 0,1%, сульфат железа гептагидрат: 10 мг/л, сульфат марганца моногидрат: 10 мг/л, биотин: 200 мкг/л, и рН: 7,2

После завершения культивирования концентрации L-изолейцина, ААВА и L-валина измеряли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и результаты представлены в Таблице 7 ниже.

- Соотношение побочных продуктов: концентрация побочных продуктов (ААВА, L-валин)/концентрация (изолейцин + побочные продукты)

Как представлено в Таблице 7, было подтверждено, что количество L-изолейцина, продуцированного штаммом с усиленным aroP (СА10-3117), штаммом с введенным вариантом aroP(G212T), штаммом с введенным вариантом aroP(I114F) (СА10-3118) и штаммом с введенным вариантом aroP(A28V), было увеличено по сравнению с таковым у родительского штамма (СА10-3101), и что концентрации побочных продуктов (то есть, ААВА и L-валина) были снижены по сравнению с таковыми у родительского штамма.

В частности, количество L-изолейцина, продуцируемого штаммом с введенным aroP(G212T), было увеличено на 15% и 7% по сравнению с таковым у родительского штамма и штамма с усиленным aroP, соответственно; количество ААВА, продуцированного штаммом с введенным aroP(G212T), было уменьшено на 44% по сравнению с таковым у родительского штамма; и количество L-валина, продуцированного штаммом с введенным aroP(G212T), было уменьшено на 20% по сравнению с таковым у родительского штамма.

Было подтверждено, что количество ААВА, продуцированного штаммом с введенным вариантом aroP(I114F), было уменьшено на 88% и 50% по сравнению с таковым у родительского штамма и штамма с усиленным aroP, соответственно; и количество L-валина, продуцированного штаммом с введенным вариантом aroP(I114F), было уменьшено на 42% и 30% по сравнению с родительским штаммом и штаммом с усиленным aroP, соответственно.

Было подтверждено, что количество L-изолейцина, продуцированного штаммом с введенным aroP(A28V), было увеличено на 19% и 11% по сравнению с таковым у родительского штамма и штамма с усиленным aroP, соответственно; количество ААВА, продуцированного штаммом с введенным aroP(A28V), было уменьшено на 56% по сравнению с таковым у родительского штамма; и количество L-валина, продуцированного штаммом с введенным aroP(A28V), было уменьшено на 25% и 10% по сравнению с родительским штаммом и штаммом с усиленным aroP, соответственно.

Дополнительно, отношение количества продуцированных побочных продуктов (ААВА, L-валин) к количеству продуцированного L-изолейцина и побочных продуктов для штамма с введенным вариантом aroP(G212T), штамма с введенным вариантом aroP(I114F) и штамма с введенным вариантом aroP(A28V) было уменьшено примерно на 29%, 47% и 33% по сравнению с таковым у родительского штамма и на 3%, 27% и 9% по сравнению с таковым у штамма с усиленным aroP, подтверждая тем самым что количество образованных побочных продуктов было уменьшено в штаммах с введенными вариантами aroP(G212T), aroP(I114F) и aroP(A28V), в то время как продуктивность по L-изолейцину и чистота L-изолейцина была существенно повышена в этих штаммах.

Штамм СА10-3118 был депонирован на международном уровне в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), международном депозитарии, в соответствии с Будапештским Договором 1 декабря 2020 года, и получил депозитарный номер КССМ12857Р.

Пример 5: Конструирование штамма с усиленным aroP и штамма с введенным вариантом aroP на основе L-изолейцин-продуцирующего штамма

Усиленный (путем введения промотора gapA) aroP и варианты aroP, демонстрирующие увеличение продукции L-изолейцина и уменьшение количества образуемых побочных продуктов, соответственно, вводили в штамм KCJI-38 (КССМ11248Р, зарегистрированный патент Кореи No. 10-1335789), представляющий собой обработанный NTG (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин) L-изолейцин-продуцирующий штамм, методом электрического импульса, затем высевали на селективную среду, содержащую канамицин в концентрации 25 мг/л, и проводили трансформацию с последующим процессом вторичного кроссинговера для получения штаммов с усиленным aroP и модифицированным усиленным aroP на хромосоме.

После этого концентрации L-изолейцина и побочных продуктов в культуре измеряли таким же способом как в Примере 1, и результаты представлены в Таблице 8 ниже.

- Соотношение побочных продуктов: концентрация побочных продуктов (ААВА, L-валинУконцентрация (изолейцин + побочные продукты)

Как показано в Таблице 8, было подтверждено, что штамм КССМ11248РАРп-aroP::PgapA-aroP с введенным aroP демонстрировал увеличение количества продуцированного L-изолейцина и уменьшение количества образованных побочных продуктов по сравнению с этими показателями для родительского штамма КССМ11248Р, в то время как штаммы KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(G212T), KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(I114F) и KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(A28V) с введенным вариантом aroP демонстрировали увеличение количества продуцированного L-изолейцина по сравнению со штаммами КССМ11248Р и KCCM11248PAPn-aroP::PgapA-aroP

Штамм KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(I114F) демонстрировал уменьшение количества ААВА (то есть, побочного продукта) примерно на 57% и 25% и уменьшение количества L-валина примерно на 33% и 20% по сравнению со штаммами КССМ11248Р и KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP, соответственно; и штаммы КССМ11248РΔPn-aroP::PgapA-aroP(G212T) и KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(A28V) демонстрировали уменьшение количества ААВА (побочного продукта) примерно на 43% и 43% и уменьшение количества L-валина примерно на 8% и 17% по сравнению с КССМ11248Р, таким образом показывая значительное увеличение уровня снижения количества побочных продуктов.

Дополнительно, отношение количества образованных побочных продуктов (ААВА, L-валин) к количеству (L-изолейцин + побочные продукты (ААВА, L-валин)) для каждого варианта штамма, штаммов KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(G212T), KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(I114F) и KCCM11248PΔPn-aroP::PgapA-aroP(A28V), показало уменьшение на 23%, 34% и 2%, соответственно, по сравнению с родительским штаммом и уменьшение на 23%, 16% и 2% по сравнению со штаммом с усиленным aroP. Следовательно было подтверждено, что количество продуцированных побочных продуктов было существенно уменьшено в штаммах с введенными aroP(G212T), aroP(I114F) или aroP(A28V), в то время как продуктивность по L-изолейцину и его чистота были значительно увеличены.

Вышеизоженные результаты служат подтверждением того, что штамм с усиленным aroP и его варианты могут повышать уровень продукции L-изолейцина. В дополнение, поскольку было подтверждено, что штамм с усиленным aroP и его варианты могут вносить вклад в увеличение чистоты при получении и в процессе очистки L-изолейцина, было подтверждено, что эти вариации играют роль в увеличении продукции L-изолейцина.

На основании вышеизложенного описания специалист в данной области техники понимает, что настоящее изобретение может быть выполнено в различных конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных характеристик. Таким образом, следует понимать, что вышеизложенное воплощение не является ограничивающим, но является исключительно иллюстративным во всех аспектах. Объем изобретения определяет прилагаемая формула изобретения, а не предшествующее ей описание, и следовательно считают, что все изменения и модификации, попадающие в границы и пределы, определяемые прилагаемой формулой изобретения, или эквиваленты таких границ и пределов, таким образом, охватываются формулой изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ ГАММА-АМИНОБУТИРАТПЕРМЕАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ИЗОЛЕЙЦИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> OPA21253

<150> KR 10-2020-0173743

<151> 2020-12-11

<160> 25

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 1

Met Ala Lys Ser Asn Glu Gly Leu Gly Thr Gly Leu Arg Thr Arg His

1 5 10 15

Leu Thr Met Met Gly Leu Gly Ser Ala Ile Gly Ala Gly Leu Phe Leu

20 25 30

Gly Thr Gly Val Gly Ile Arg Ala Ala Gly Pro Ala Val Leu Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Ile Ala Gly Ala Ile Val Val Leu Val Met Gln Met Leu Gly

50 55 60

Glu Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gly Ser Phe Ser Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Asp Ala Phe Gly His Trp Ala Gly Phe Ser Leu Gly Trp Leu Tyr

85 90 95

Trp Phe Met Leu Ile Met Val Met Gly Ala Glu Met Thr Gly Ala Ala

100 105 110

Ala Ile Met Gly Ala Trp Phe Gly Val Glu Pro Trp Ile Pro Ser Leu

115 120 125

Val Cys Val Val Phe Phe Ala Val Val Asn Leu Val Ala Val Arg Gly

130 135 140

Phe Gly Glu Phe Glu Tyr Trp Phe Ala Phe Ile Lys Val Ala Val Ile

145 150 155 160

Ile Ala Phe Leu Ile Ile Gly Ile Ala Leu Ile Phe Gly Trp Leu Pro

165 170 175

Gly Ser Thr Phe Val Gly Thr Ser Asn Phe Ile Gly Asp His Gly Phe

180 185 190

Met Pro Asn Gly Ile Ser Gly Val Ala Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala

195 200 205

Phe Ala Phe Gly Gly Ile Glu Ile Val Thr Ile Ala Ala Ala Glu Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Arg Glu Ala Ile Ser Leu Ala Val Arg Ala Val Ile Trp

225 230 235 240

Arg Ile Ser Val Phe Tyr Leu Gly Ser Val Leu Val Ile Thr Phe Leu

245 250 255

Met Pro Tyr Glu Ser Ile Asn Gly Ala Asp Thr Ala Ala Glu Ser Pro

260 265 270

Phe Thr Gln Ile Leu Ala Met Ala Asn Ile Pro Gly Thr Val Gly Phe

275 280 285

Met Glu Ala Ile Ile Val Leu Ala Leu Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gln

290 295 300

Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Val Phe Ser Met Ala Asn Arg Gln Asp

305 310 315 320

Ala Pro Arg Val Phe Ser Lys Leu Ser Thr Ser His Val Pro Thr Asn

325 330 335

Ala Val Leu Leu Ser Met Phe Phe Ala Phe Val Ser Val Gly Leu Gln

340 345 350

Tyr Trp Asn Pro Ala Gly Leu Leu Asp Phe Leu Leu Asn Ala Val Gly

355 360 365

Gly Cys Leu Ile Val Val Trp Ala Met Ile Thr Leu Ser Gln Leu Lys

370 375 380

Leu Arg Lys Glu Leu Gln Ala Asn Asp Glu Ile Ser Thr Val Arg Met

385 390 395 400

Trp Ala His Pro Trp Leu Gly Ile Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Gly

405 410 415

Leu Val Ala Leu Met Leu Gly Asp Ala Ala Ser Arg Ser Gln Val Tyr

420 425 430

Ser Val Ala Ile Val Tyr Gly Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Val Thr

435 440 445

Val Asn Ser Pro Leu Arg Gly Gly Arg Thr Pro Ser Asp Leu Asn

450 455 460

<210> 2

<211> 1392

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 2

atggctaaat ctaatgaagg gctgggaacc ggacttcgga cccgccacct cacaatgatg 60

ggactcggct ccgcaattgg tgccggactg ttcctcggca ccggcgttgg tatccgcgca 120

gccggccccg cagtgctcct ggcgtacatc atcgccggag ccatcgttgt gcttgttatg 180

caaatgctcg gcgagatggc tgctgcccgt cccgcctccg gatcgttttc acgttacggc 240

gaggatgctt tcggccactg ggctggtttc tccctcggtt ggttgtactg gttcatgctg 300

attatggtga tgggcgccga aatgactggc gctgctgcca tcatgggtgc atggttcggc 360

gtcgaaccgt ggattccttc gcttgtctgc gtggtcttct tcgctgtggt gaacctcgtc 420

gcggttcgcg gtttcggtga attcgagtac tggttcgcat tcattaaggt cgcggtgatc 480

atcgctttcc tcatcattgg tattgctctt attttcggat ggcttcccgg atccaccttt 540

gttggaacct caaacttcat cggtgatcac ggattcatgc ccaatggtat ttctggtgtt 600

gctgctggtt tgctcgcggt ggcttttgcc tttggtggca ttgaaattgt caccattgca 660

gctgcagagt ccgataagcc acgtgaagct atttccctgg cggtgcgtgc cgtgatttgg 720

cgtatttcag tcttttactt gggctctgtt ttggtcatca ctttcctcat gccttatgag 780

tcgatcaatg gtgccgacac cgctgcggaa tcccccttca cccaaatcct ggcgatggca 840

aacatccctg gcacggttgg tttcatggaa gcgatcatcg ttctagcact gctttccgct 900

ttcaacgccc aaatctatgc cacttctcgt ttggtatttt ccatggcgaa tcgacaagac 960

gctccgcgag ttttcagtaa gctcagcacc agccacgtcc ccaccaatgc ggtgctgttg 1020

tccatgttct tcgccttcgt ttcagttggt ttgcagtact ggaatccagc cggtctgctt 1080

gatttcctcc tcaacgctgt tggcggttgt ttgattgtgg tgtgggcaat gatcactttg 1140

tcacagttga aactccgcaa agaactgcaa gcaaacgatg aaatctccac ggttcgcatg 1200

tgggcgcacc catggttagg catcctcacc ttggttttgt tggcaggact cgttgctctc 1260

atgctcggcg acgcagcctc ccgcagccag gtttactcag tggcaattgt gtacggattc 1320

ttggttcttt tgtccttcgt cacagttaac agcccattgc gcggaggtcg caccccttcc 1380

gacttgaact ga 1392

<210> 3

<211> 463

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 3

Met Ala Lys Ser Asn Glu Gly Leu Gly Thr Gly Leu Arg Thr Arg His

1 5 10 15

Leu Thr Met Met Gly Leu Gly Ser Ala Ile Gly Ala Gly Leu Phe Leu

20 25 30

Gly Thr Gly Val Gly Ile Arg Ala Ala Gly Pro Ala Val Leu Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Ile Ala Gly Ala Ile Val Val Leu Val Met Gln Met Leu Gly

50 55 60

Glu Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gly Ser Phe Ser Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Asp Ala Phe Gly His Trp Ala Gly Phe Ser Leu Gly Trp Leu Tyr

85 90 95

Trp Phe Met Leu Ile Met Val Met Gly Ala Glu Met Thr Gly Ala Ala

100 105 110

Ala Ile Met Gly Ala Trp Phe Gly Val Glu Pro Trp Ile Pro Ser Leu

115 120 125

Val Cys Val Val Phe Phe Ala Val Val Asn Leu Val Ala Val Arg Gly

130 135 140

Phe Gly Glu Phe Glu Tyr Trp Phe Ala Phe Ile Lys Val Ala Val Ile

145 150 155 160

Ile Ala Phe Leu Ile Ile Gly Ile Ala Leu Ile Phe Gly Trp Leu Pro

165 170 175

Gly Ser Thr Phe Val Gly Thr Ser Asn Phe Ile Gly Asp His Gly Phe

180 185 190

Met Pro Asn Gly Ile Ser Gly Val Ala Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala

195 200 205

Phe Ala Phe Thr Gly Ile Glu Ile Val Thr Ile Ala Ala Ala Glu Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Arg Glu Ala Ile Ser Leu Ala Val Arg Ala Val Ile Trp

225 230 235 240

Arg Ile Ser Val Phe Tyr Leu Gly Ser Val Leu Val Ile Thr Phe Leu

245 250 255

Met Pro Tyr Glu Ser Ile Asn Gly Ala Asp Thr Ala Ala Glu Ser Pro

260 265 270

Phe Thr Gln Ile Leu Ala Met Ala Asn Ile Pro Gly Thr Val Gly Phe

275 280 285

Met Glu Ala Ile Ile Val Leu Ala Leu Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gln

290 295 300

Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Val Phe Ser Met Ala Asn Arg Gln Asp

305 310 315 320

Ala Pro Arg Val Phe Ser Lys Leu Ser Thr Ser His Val Pro Thr Asn

325 330 335

Ala Val Leu Leu Ser Met Phe Phe Ala Phe Val Ser Val Gly Leu Gln

340 345 350

Tyr Trp Asn Pro Ala Gly Leu Leu Asp Phe Leu Leu Asn Ala Val Gly

355 360 365

Gly Cys Leu Ile Val Val Trp Ala Met Ile Thr Leu Ser Gln Leu Lys

370 375 380

Leu Arg Lys Glu Leu Gln Ala Asn Asp Glu Ile Ser Thr Val Arg Met

385 390 395 400

Trp Ala His Pro Trp Leu Gly Ile Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Gly

405 410 415

Leu Val Ala Leu Met Leu Gly Asp Ala Ala Ser Arg Ser Gln Val Tyr

420 425 430

Ser Val Ala Ile Val Tyr Gly Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Val Thr

435 440 445

Val Asn Ser Pro Leu Arg Gly Gly Arg Thr Pro Ser Asp Leu Asn

450 455 460

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 4

aattcgagct cggtaccctt ccccctggag tccgca 36

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 5

ataggctcgg tcgtttttag gcttgtatca accgtaaacc ca 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 6

tgggtttacg gttgatacaa gcctaaaaac gaccgagcct at 42

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 7

ccttcattag atttagccat gtgtctcctc taaagattgt 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 8

acaatcttta gaggagacac atggctaaat ctaatgaagg 40

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 9

gtcgactcta gaggatcccc tcagttcaag tcggaagggg tgcga 45

<210> 10

<211> 1338

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> hom

<400> 10

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcaca tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 11

tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 35

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 12

cacgatcaga tgtgcatcat cat 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 13

atgatgatgc acatctgatc gtg 23

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 14

ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35

<210> 15

<211> 1311

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> ilvA

<400> 15

atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60

attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120

ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180

gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240

ctcactcagg agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300

ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360

actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420

gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480

ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggtacagtg 540

gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600

ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660

cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720

aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780

cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840

agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900

atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960

ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020

atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080

caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140

gcgctggcag agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200

cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260

gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 16

tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 17

gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 18

ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер

<400> 19

ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34

<210> 20

<211> 463

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 20

Met Ala Lys Ser Asn Glu Gly Leu Gly Thr Gly Leu Arg Thr Arg His

1 5 10 15

Leu Thr Met Met Gly Leu Gly Ser Ala Ile Gly Ala Gly Leu Phe Leu

20 25 30

Gly Thr Gly Val Gly Ile Arg Ala Ala Gly Pro Ala Val Leu Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Ile Ala Gly Ala Ile Val Val Leu Val Met Gln Met Leu Gly

50 55 60

Glu Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gly Ser Phe Ser Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Asp Ala Phe Gly His Trp Ala Gly Phe Ser Leu Gly Trp Leu Tyr

85 90 95

Trp Phe Met Leu Ile Met Val Met Gly Ala Glu Met Thr Gly Ala Ala

100 105 110

Ala Phe Met Gly Ala Trp Phe Gly Val Glu Pro Trp Ile Pro Ser Leu

115 120 125

Val Cys Val Val Phe Phe Ala Val Val Asn Leu Val Ala Val Arg Gly

130 135 140

Phe Gly Glu Phe Glu Tyr Trp Phe Ala Phe Ile Lys Val Ala Val Ile

145 150 155 160

Ile Ala Phe Leu Ile Ile Gly Ile Ala Leu Ile Phe Gly Trp Leu Pro

165 170 175

Gly Ser Thr Phe Val Gly Thr Ser Asn Phe Ile Gly Asp His Gly Phe

180 185 190

Met Pro Asn Gly Ile Ser Gly Val Ala Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala

195 200 205

Phe Ala Phe Gly Gly Ile Glu Ile Val Thr Ile Ala Ala Ala Glu Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Arg Glu Ala Ile Ser Leu Ala Val Arg Ala Val Ile Trp

225 230 235 240

Arg Ile Ser Val Phe Tyr Leu Gly Ser Val Leu Val Ile Thr Phe Leu

245 250 255

Met Pro Tyr Glu Ser Ile Asn Gly Ala Asp Thr Ala Ala Glu Ser Pro

260 265 270

Phe Thr Gln Ile Leu Ala Met Ala Asn Ile Pro Gly Thr Val Gly Phe

275 280 285

Met Glu Ala Ile Ile Val Leu Ala Leu Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gln

290 295 300

Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Val Phe Ser Met Ala Asn Arg Gln Asp

305 310 315 320

Ala Pro Arg Val Phe Ser Lys Leu Ser Thr Ser His Val Pro Thr Asn

325 330 335

Ala Val Leu Leu Ser Met Phe Phe Ala Phe Val Ser Val Gly Leu Gln

340 345 350

Tyr Trp Asn Pro Ala Gly Leu Leu Asp Phe Leu Leu Asn Ala Val Gly

355 360 365

Gly Cys Leu Ile Val Val Trp Ala Met Ile Thr Leu Ser Gln Leu Lys

370 375 380

Leu Arg Lys Glu Leu Gln Ala Asn Asp Glu Ile Ser Thr Val Arg Met

385 390 395 400

Trp Ala His Pro Trp Leu Gly Ile Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Gly

405 410 415

Leu Val Ala Leu Met Leu Gly Asp Ala Ala Ser Arg Ser Gln Val Tyr

420 425 430

Ser Val Ala Ile Val Tyr Gly Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Val Thr

435 440 445

Val Asn Ser Pro Leu Arg Gly Gly Arg Thr Pro Ser Asp Leu Asn

450 455 460

<210> 21

<211> 463

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 21

Met Ala Lys Ser Asn Glu Gly Leu Gly Thr Gly Leu Arg Thr Arg His

1 5 10 15

Leu Thr Met Met Gly Leu Gly Ser Ala Ile Gly Val Gly Leu Phe Leu

20 25 30

Gly Thr Gly Val Gly Ile Arg Ala Ala Gly Pro Ala Val Leu Leu Ala

35 40 45

Tyr Ile Ile Ala Gly Ala Ile Val Val Leu Val Met Gln Met Leu Gly

50 55 60

Glu Met Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gly Ser Phe Ser Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Asp Ala Phe Gly His Trp Ala Gly Phe Ser Leu Gly Trp Leu Tyr

85 90 95

Trp Phe Met Leu Ile Met Val Met Gly Ala Glu Met Thr Gly Ala Ala

100 105 110

Ala Ile Met Gly Ala Trp Phe Gly Val Glu Pro Trp Ile Pro Ser Leu

115 120 125

Val Cys Val Val Phe Phe Ala Val Val Asn Leu Val Ala Val Arg Gly

130 135 140

Phe Gly Glu Phe Glu Tyr Trp Phe Ala Phe Ile Lys Val Ala Val Ile

145 150 155 160

Ile Ala Phe Leu Ile Ile Gly Ile Ala Leu Ile Phe Gly Trp Leu Pro

165 170 175

Gly Ser Thr Phe Val Gly Thr Ser Asn Phe Ile Gly Asp His Gly Phe

180 185 190

Met Pro Asn Gly Ile Ser Gly Val Ala Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala

195 200 205

Phe Ala Phe Gly Gly Ile Glu Ile Val Thr Ile Ala Ala Ala Glu Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Arg Glu Ala Ile Ser Leu Ala Val Arg Ala Val Ile Trp

225 230 235 240

Arg Ile Ser Val Phe Tyr Leu Gly Ser Val Leu Val Ile Thr Phe Leu

245 250 255

Met Pro Tyr Glu Ser Ile Asn Gly Ala Asp Thr Ala Ala Glu Ser Pro

260 265 270

Phe Thr Gln Ile Leu Ala Met Ala Asn Ile Pro Gly Thr Val Gly Phe

275 280 285

Met Glu Ala Ile Ile Val Leu Ala Leu Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gln

290 295 300

Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Val Phe Ser Met Ala Asn Arg Gln Asp

305 310 315 320

Ala Pro Arg Val Phe Ser Lys Leu Ser Thr Ser His Val Pro Thr Asn

325 330 335

Ala Val Leu Leu Ser Met Phe Phe Ala Phe Val Ser Val Gly Leu Gln

340 345 350

Tyr Trp Asn Pro Ala Gly Leu Leu Asp Phe Leu Leu Asn Ala Val Gly

355 360 365

Gly Cys Leu Ile Val Val Trp Ala Met Ile Thr Leu Ser Gln Leu Lys

370 375 380

Leu Arg Lys Glu Leu Gln Ala Asn Asp Glu Ile Ser Thr Val Arg Met

385 390 395 400

Trp Ala His Pro Trp Leu Gly Ile Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Gly

405 410 415

Leu Val Ala Leu Met Leu Gly Asp Ala Ala Ser Arg Ser Gln Val Tyr

420 425 430

Ser Val Ala Ile Val Tyr Gly Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Val Thr

435 440 445

Val Asn Ser Pro Leu Arg Gly Gly Arg Thr Pro Ser Asp Leu Asn

450 455 460

<210> 22

<211> 1392

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 22

atggctaaat ctaatgaagg gctgggaacc ggacttcgga cccgccacct cacaatgatg 60

ggactcggct ccgcaattgg tgccggactg ttcctcggca ccggcgttgg tatccgcgca 120

gccggccccg cagtgctcct ggcgtacatc atcgccggag ccatcgttgt gcttgttatg 180

caaatgctcg gcgagatggc tgctgcccgt cccgcctccg gatcgttttc acgttacggc 240

gaggatgctt tcggccactg ggctggtttc tccctcggtt ggttgtactg gttcatgctg 300

attatggtga tgggcgccga aatgactggc gctgctgcca tcatgggtgc atggttcggc 360

gtcgaaccgt ggattccttc gcttgtctgc gtggtcttct tcgctgtggt gaacctcgtc 420

gcggttcgcg gtttcggtga attcgagtac tggttcgcat tcattaaggt cgcggtgatc 480

atcgctttcc tcatcattgg tattgctctt attttcggat ggcttcccgg atccaccttt 540

gttggaacct caaacttcat cggtgatcac ggattcatgc ccaatggtat ttctggtgtt 600

gctgctggtt tgctcgcggt ggcttttgcc tttaccggca ttgaaattgt caccattgca 660

gctgcagagt ccgataagcc acgtgaagct atttccctgg cggtgcgtgc cgtgatttgg 720

cgtatttcag tcttttactt gggctctgtt ttggtcatca ctttcctcat gccttatgag 780

tcgatcaatg gtgccgacac cgctgcggaa tcccccttca cccaaatcct ggcgatggca 840

aacatccctg gcacggttgg tttcatggaa gcgatcatcg ttctagcact gctttccgct 900

ttcaacgccc aaatctatgc cacttctcgt ttggtatttt ccatggcgaa tcgacaagac 960

gctccgcgag ttttcagtaa gctcagcacc agccacgtcc ccaccaatgc ggtgctgttg 1020

tccatgttct tcgccttcgt ttcagttggt ttgcagtact ggaatccagc cggtctgctt 1080

gatttcctcc tcaacgctgt tggcggttgt ttgattgtgg tgtgggcaat gatcactttg 1140

tcacagttga aactccgcaa agaactgcaa gcaaacgatg aaatctccac ggttcgcatg 1200

tgggcgcacc catggttagg catcctcacc ttggttttgt tggcaggact cgttgctctc 1260

atgctcggcg acgcagcctc ccgcagccag gtttactcag tggcaattgt gtacggattc 1320

ttggttcttt tgtccttcgt cacagttaac agcccattgc gcggaggtcg caccccttcc 1380

gacttgaact ga 1392

<210> 23

<211> 1392

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 23

atggctaaat ctaatgaagg gctgggaacc ggacttcgga cccgccacct cacaatgatg 60

ggactcggct ccgcaattgg tgccggactg ttcctcggca ccggcgttgg tatccgcgca 120

gccggccccg cagtgctcct ggcgtacatc atcgccggag ccatcgttgt gcttgttatg 180

caaatgctcg gcgagatggc tgctgcccgt cccgcctccg gatcgttttc acgttacggc 240

gaggatgctt tcggccactg ggctggtttc tccctcggtt ggttgtactg gttcatgctg 300

attatggtga tgggcgccga aatgactggc gctgctgcct tcatgggtgc atggttcggc 360

gtcgaaccgt ggattccttc gcttgtctgc gtggtcttct tcgctgtggt gaacctcgtc 420

gcggttcgcg gtttcggtga attcgagtac tggttcgcat tcattaaggt cgcggtgatc 480

atcgctttcc tcatcattgg tattgctctt attttcggat ggcttcccgg atccaccttt 540

gttggaacct caaacttcat cggtgatcac ggattcatgc ccaatggtat ttctggtgtt 600

gctgctggtt tgctcgcggt ggcttttgcc tttggtggca ttgaaattgt caccattgca 660

gctgcagagt ccgataagcc acgtgaagct atttccctgg cggtgcgtgc cgtgatttgg 720

cgtatttcag tcttttactt gggctctgtt ttggtcatca ctttcctcat gccttatgag 780

tcgatcaatg gtgccgacac cgctgcggaa tcccccttca cccaaatcct ggcgatggca 840

aacatccctg gcacggttgg tttcatggaa gcgatcatcg ttctagcact gctttccgct 900

ttcaacgccc aaatctatgc cacttctcgt ttggtatttt ccatggcgaa tcgacaagac 960

gctccgcgag ttttcagtaa gctcagcacc agccacgtcc ccaccaatgc ggtgctgttg 1020

tccatgttct tcgccttcgt ttcagttggt ttgcagtact ggaatccagc cggtctgctt 1080

gatttcctcc tcaacgctgt tggcggttgt ttgattgtgg tgtgggcaat gatcactttg 1140

tcacagttga aactccgcaa agaactgcaa gcaaacgatg aaatctccac ggttcgcatg 1200

tgggcgcacc catggttagg catcctcacc ttggttttgt tggcaggact cgttgctctc 1260

atgctcggcg acgcagcctc ccgcagccag gtttactcag tggcaattgt gtacggattc 1320

ttggttcttt tgtccttcgt cacagttaac agcccattgc gcggaggtcg caccccttcc 1380

gacttgaact ga 1392

<210> 24

<211> 1392

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> aroP

<400> 24

atggctaaat ctaatgaagg gctgggaacc ggacttcgga cccgccacct cacaatgatg 60

ggactcggct ccgcaattgg tgttggactg ttcctcggca ccggcgttgg tatccgcgca 120

gccggccccg cagtgctcct ggcgtacatc atcgccggag ccatcgttgt gcttgttatg 180

caaatgctcg gcgagatggc tgctgcccgt cccgcctccg gatcgttttc acgttacggc 240

gaggatgctt tcggccactg ggctggtttc tccctcggtt ggttgtactg gttcatgctg 300

attatggtga tgggcgccga aatgactggc gctgctgcca tcatgggtgc atggttcggc 360

gtcgaaccgt ggattccttc gcttgtctgc gtggtcttct tcgctgtggt gaacctcgtc 420

gcggttcgcg gtttcggtga attcgagtac tggttcgcat tcattaaggt cgcggtgatc 480

atcgctttcc tcatcattgg tattgctctt attttcggat ggcttcccgg atccaccttt 540

gttggaacct caaacttcat cggtgatcac ggattcatgc ccaatggtat ttctggtgtt 600

gctgctggtt tgctcgcggt ggcttttgcc tttggtggca ttgaaattgt caccattgca 660

gctgcagagt ccgataagcc acgtgaagct atttccctgg cggtgcgtgc cgtgatttgg 720

cgtatttcag tcttttactt gggctctgtt ttggtcatca ctttcctcat gccttatgag 780

tcgatcaatg gtgccgacac cgctgcggaa tcccccttca cccaaatcct ggcgatggca 840

aacatccctg gcacggttgg tttcatggaa gcgatcatcg ttctagcact gctttccgct 900

ttcaacgccc aaatctatgc cacttctcgt ttggtatttt ccatggcgaa tcgacaagac 960

gctccgcgag ttttcagtaa gctcagcacc agccacgtcc ccaccaatgc ggtgctgttg 1020

tccatgttct tcgccttcgt ttcagttggt ttgcagtact ggaatccagc cggtctgctt 1080

gatttcctcc tcaacgctgt tggcggttgt ttgattgtgg tgtgggcaat gatcactttg 1140

tcacagttga aactccgcaa agaactgcaa gcaaacgatg aaatctccac ggttcgcatg 1200

tgggcgcacc catggttagg catcctcacc ttggttttgt tggcaggact cgttgctctc 1260

atgctcggcg acgcagcctc ccgcagccag gtttactcag tggcaattgt gtacggattc 1320

ttggttcttt tgtccttcgt cacagttaac agcccattgc gcggaggtcg caccccttcc 1380

gacttgaact ga 1392

<210> 25

<211> 436

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ilvA

<400> 25

Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser

1 5 10 15

Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg

20 25 30

Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu

35 40 45

Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln

50 55 60

Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln

65 70 75 80

Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly

85 90 95

Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln

100 105 110

Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg

115 120 125

Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn

130 135 140

Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr

145 150 155 160

Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly

165 170 175

Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly

180 185 190

Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu

195 200 205

Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile

210 215 220

Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His

225 230 235 240

Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly

245 250 255

Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys

260 265 270

Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys

275 280 285

Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro

290 295 300

Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro

305 310 315 320

Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu

325 330 335

Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys

340 345 350

His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His

355 360 365

Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu

370 375 380

Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile

385 390 395 400

His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu

405 410 415

Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr

420 425 430

Glu Tyr Leu Thr

435

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен полипептид, вовлеченный в продуцирование L-изолейцина, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Также предложены полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, вектор экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид, микроорганизм для продуцирования L-изолейцина, содержащий любой один или более чем один указанные полипептид, полинуклеотид и вектор. Также предложено применение указанного микроорганизма в способе получения L-изолейцина, в способе уменьшения количества побочного продукта, образуемого во время продуцирования L-изолейцина, а также в составе композиции для получения L-изолейцина. Изобретение позволяет увеличить выход L-изолейцина. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 пр.

1. Полипептид, вовлеченный в продуцирование L-изолейцина, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.

3. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 2.

4. Микроорганизм для продуцирования L-изолейцина, содержащий любой один или более чем один полипептид по п. 1, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид.

5. Микроорганизм по п. 4, где микроорганизм представляет собой микроорганизм рода Corynebacterium.

6. Микроорганизм по п. 4, где микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum.

7. Способ получения L-изолейцина, включающий культивирование микроорганизма, содержащего один или более чем один полипептид, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,

полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, в среде.

8. Способ получения L-изолейцина по п. 7, дополнительно включающий выделение L-изолейцина из среды или микроорганизма.

9. Способ получения L-изолейцина по п. 7, где микроорганизм представляет собой микроорганизм рода Corynebacterium.

10. Способ уменьшения количества побочного продукта, образуемого во время продуцирования L-изолейцина по сравнению с количеством побочного продукта от микроорганизма, имеющего эндогенную гамма(γ)-аминобутиратпермеазную активность, включающий культивирование микроорганизма, содержащего один или более чем один полипептид, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, в среде, где побочный продукт представляет собой один или более чем один продукт, выбранный из группы, состоящей из α-аминобутирата (ААВА) и валина.

11. Композиция для получения L-изолейцина, содержащая микроорганизм, содержащий один или более чем один полипептид, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, или культуру указанного микроорганизма, где композиция дополнительно содержит эксципиент.

12. Применение полипептида, в котором аминокислота, соответствующая положению 212, заменена на треонин, аминокислота, соответствующая положению 114, заменена на фенилаланин, или аминокислота, соответствующая положению 28, заменена на валин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или микроорганизма, содержащего один или более чем один указанный полипептид, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и вектор, содержащий этот полинуклеотид, для получения L-изолейцина.