Способ сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и генетическим технологиям.

По известным литературным источникам – дисферлинопатия – это фенотипически гетерогенная прогрессирующая миодистрофия, вызванная мутациями в гене DYSF (2p13), который кодирует трансмембранный белок дисферлин (230 кДа), участвующий в восстановлении сарколеммы [Reash N.F., James M.K., Alfano L.N. etal. Comparison of strength testing modalities in dysferlinopathy // Muscle Nerve. – 2022. – Vol. 66, No. 2. – P. 159–166]. К данной группе заболеваний относится дистальная миопатия Миоши [Bardakov S.N., TsargushV.A., CarlierP.G. etal. Magnetic resonance imaging pattern variability in dysferlinopathy // Acta Myol. – 2021. – Vol. 40, No. 4. – P. 158–171]. Манифестация заболевания приходится на поздний подростковый возраст – ранний взрослый возраст с последующим неуклонным прогрессированием мышечной слабости и утратой амбулаторного статуса в 35–45 лет [Fanin M., Angelini C. Progress and challenges in diagnosis of dysferlinopathy // Muscle Nerve. – 2016. – Vol. 54, No. 5. – P. 821–835].

Возможность восстановления дефектного белка мышц путем введения в клетку функционального гена дикого типа является перспективным методом генной терапии миодистрофий [Старостина И.Г. Создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оптимизированный ген дисферлина, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro / И.Г. Старостина, В.В. Соловьева, К.Г. Шевченко, Р.В. Деев, А.А. Исаев, А.А. Ризванов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. - Т.7, №3. - С.25-28]. Ранее было показано, что генная терапия с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) безопасна и хорошо переносится [Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., 3rd, &Strohl, W. R. (2017). Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy, 31(4), 317–334].

Ранее с использованием тестов «Перевернутая сетка», «Сила хватки», «Удержание на проволоке», «Вынужденное плавание с грузом», «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» было показано, что отсутствие экспрессии гена Dysf-/- у мышей сублинии B6.A/J-Dysfprmd может приводить к мышечной дистрофии. Данная патология проявляла себя с начала развития фенотипических проявлений болезни с 12 недели жизни и пиком фенотипических проявлений к 24 неделе жизни животных. Мыши сублинии B6.A-Dysfprmd/GeneJ (Bla/J) являются репрезентативной моделью дисферлинопатии и могут быть использованы для оценки новых терапевтических средств для лечения данного заболевания [М.В. Корокин, Е.В. Кузубова, А.И. Радченко и др. Мыши В6.А-DYSFPRMD/GENEJ как генетическая модель дисферлинопатии. Фармация и фармакология. 2022;10(5):483-496].

Известен способ терапии дисферлинопатий с применением кодон-оптимизированной кДНК, кодирующей дисферлин человека (патент на изобретение RU 2527073, публ.27.08.2014), включающий введение фармацевтической композиции для восстановления нарушенной экспрессии и/или функции белка дисферлина в скелетной мышце, содержащая аденовирус, человеку (или животным) таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы и медицинских показаний. Фармацевтическая композиция может вводиться внутримышечно - местно, системно - внутривенно, аэрозольно, в виде генно-клеточной трансплантации или трансфузии после in vitro обработки различных аутологичных клеток, например гемопоэтических и их более дифференцированных производных, мезенхимальных, сосудисто-стромальной фракции, мезангиобластов и др.

Основным недостатком способа является то, что аденовирус обладает более высокой иммуногенностью по сравнению с AAV. Преимущество использования рекомбинантного AAV в генной терапии можно объяснить отсутствием патогенности и дополнительной безопасностью из-за дефектности его репликации и способности опосредовать более долгосрочную экспрессию в различных тканях, чем у рекомбинантного аденовируса [Lai, C. M., Lai, Y. K., & Rakoczy, P. E. (2002). Adenovirus and adeno-associated virus vectors. DNA and cell biology, 21(12), 895–913]. Помимо этого, в данном способе не приведены режимы введения и дозы препарата при конкретных показаниях.

Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения является способ терапии дисферлинопатий [Lostal, W., etal., Efficientrecoveryofdysferlindeficiencybydualadeno-associatedvector-mediatedgenetransfer. HumMolGenet, 2010. 19(10): p.1897-907]. Авторы клонировали кДНК дисферлина в вектор на основе AAV. Так как кДНК дисферлина превышает размер трансгенной вставки, которую способен нести геном AAV, кДНК гена DYSF клонировали в виде 2 частей в два независимых AAV вектора: один рекомбинантный AAV несет 5′ конец кДНК вместе с донорным сайтом сплайсинга интрона, другой рекомбинантный AAV несет акцепторный сайт сплайсинга и следующий за ним 3′ концевую последовательность кДНК. В результате естественной способности AAV к конкатемеризации происходило объединение двух частей кДНК и экспрессия полноразмерного белка дисферлина. Системная инъекция в хвостовую вену самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysfprmd этих двух векторов приводила к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Инъекции приводили к улучшению гистологической картины мышечной ткани, сокращению числа некротических волокон, восстановлению репарации мембраны и глобальному улучшению двигательных функций.

Недостатком данного способа является слабая экспрессия белка дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV.

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей с использованием генно-инженерной конструкции на основе AAV, экспрессирующей дисферлин человека.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей, лишенный недостатков аналога, а именно, высокой иммуногенности аденовируса, с приведением доз и режима введения ААВ9-ДИСФ-ДВ в эксперименте, и недостатка прототипа, а именно, слабой экспрессии дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV, за счет применения мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей в эксперименте, включающий использование самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysfprmd и введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса, причем вводят внутримышечно (в/м) ААВ9-ДИСФ-ДВ на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, несущего кодон-оптимизированную кДНК гена дисферлина под управлением мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина в дозе 5*1012 ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemiuslateralis (на животное суммарно 300 мкл) мышей B6.A/J-Dysfprmd в возрасте 6 месяцев с повторным введением препарата через 1 месяц после первого введения с оценкой физической работоспособности через 3 месяца после первого введения ААВ9-ДИСФ-ДВ, подтверждаемый результатами теста «Удержание животного на скользком вертикальном стержне».

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что в/м введение ААВ9-ДИСФ-ДВ в дозе 5*1012 ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemiuslateralis мышей B6.A/J-Dysfprmd в возрасте 6 месяцев с повторным введением препарата через 1 месяц после первого введения приводит к сохранению статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей, что подтверждается достоверным увеличениемвремени удержания на скользком вертикальном стержне мышей B6.A/J-Dysfprmd с введением ААВ9-ДИСФ-ДВ, на 23,0% (p<0,05) по сравнению с нелеченными животными в тесте «Удержание животного на скользком вертикальном стержне», так как двойные AAV векторы имеют перекрывающуюся область размером 1 т. п. н., которая служит субстратом для рекомбинации с целью создания полноразмерной кДНК дисферлина и более выраженной экспрессии полноразмерного белка дисферлина за счет наличия химерного интрона в 5'-кассете.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ААВ9-ДИСФ-ДВ

Пример 1

Этап 1. Был произведен дизайн и синтез олигонуклеотидов, кодирующих химерный интрон, представлено в таблице 1.

Таблица 1

Химерный интрон (CI) gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(SEQ ID NO: 1)

Этап 2. 5' последовательность дисферлина была клонирована в вектор для сборки AAV (pAAV-Dysf5'-DV), при этом вектор несет следующие регуляторные последовательности, представлено в таблице 2.

Таблица 2

Наименование характеристики Целевое значение Регуляторная последовательность
(промотор МHCK7) ctagaagctgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacgagct(SEQ ID NO: 2) Химерный интрон (CI) gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag(SEQ ID NO: 3) Левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(SEQ ID NO: 4) Правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg(SEQ ID NO: 5)

Этап 3. 3' последовательность дисферлина была клонирована в вектор для сборки AAV (pAAV-Dysf3'-DV), при этом вектор несет следующие регуляторные последовательности, представлено в таблице 3.

Таблица 3

Наименование характеристики Целевое значение Левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(SEQ ID NO: 6) Сигнал полиаденилирования SV40 (PolyA SV40) taagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctctatttgtgaaatttgtgatgctattgtcctatttgtaaccattataagctgcaataaacaagtt(SEQ ID NO: 7) Правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg(SEQ ID NO: 8)

Этап 4. Была проведена проверка последовательностей плазмид pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-Dysf3'-DV секвенированием (только клонированные последовательности, не включая ITR).

Для сборки пробной партии вирусов были в препаративных количествах получены 4 плазмиды: AAV9-Dysf5'-DV, AAV9-Dysf3'-DV, pAAV-RC2/9 и pHelper.

Методом тройной транзиентной трансфекции в клетках HEK293T были получены пробные партии вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV. Вирусные препараты были очищены по отработанной ранее в лаборатории методике от клеточного дебриса, примесных белков и пустых вирусных капсидов. Вирусный препарат стерилизовали через спин-колонки с размером пор 0,22мкм и замораживали в буфере для хранения вирусных препаратов: 1х PBS, 350mM NaCl, 0,001% Pluronic F68 в пробирках типа эппендорф по 0,5мл. Аликвоты вирусных препаратов отбирали перед замораживанием для контроля качества.

Качество полученных вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV определяли окрашиванием в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Концентрацию вирусов определяли количественной ПЦР в реальном времени с использованием зондов и праймеров к инвертированным повторам по отработанной ранее в лаборатории методике. Титр вирусных частиц в конечном препарате составляет 2,15Е+13гк/мл для AAV9-Dysf5'-DV и 2,06Е+13гк/мл для AAV9-Dysf3'-DV соответственно.

В ходе работ были получены 2 плазмидные конструкции, кодирующие кДНК дисферлина pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-Dysf3'-DV. Последовательности полученных плазмид были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Полученные плазмиды были трансформированы в штамм Top10 E.coli для выделения.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ААВ9-ДИСФ-ДВ

Эксперименты проведены на 34 мышах сублинии B6.A/J-Dysfprmd массой 27-33 г в возрасте 6 месяцев, полученных из испытательного центра «Виварно-экспериментальный комплекс ООО «НИИ Митоинженерии МГУ». Когорты животных получены в результате скрещивания мышей линии A/J (#:000646), у которых была случайно обнаружена спонтанная инсерция в интроне 4, с мышами дикого типа C57BL/6J. Поддержание и размножение колонии проводили путем скрещивания мутантных животных между собой из одного помета. Мыши были рандомизированы в соответствии с массой тела и использованы для исследования специфической фармакологической активности препарата на основе аденоассоциированного вирусного вектора ААВ9-ДИСФ-ДВ.

Первая группа (n=10) – отрицательный контроль – дисферлин-дефицитные мыши (шифр К-) с генотипом B6.A/J-Dysfprmd; вторая группа (n=10) – положительный контроль – мыши дикого типа (шифр К+); третья группа (n=14) – дисферлин-дефицитные мыши, получающие препарат ААВ9-ДИСФ-ДВ в/м в дозе 5*1012 ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemiuslateralis с повторным введением препарата (шифр AAV 3 i/m).

Для оценки сохранности статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей использовался тест «Удержание животного на скользком вертикальном стержне». Установка представляет из себя штатив с диаметром стержня 7 мм, высотой 60 см с установленным на верхушке пластиковым ограждением. Для проведения эксперимента животное помещали на одинаковом расстоянии от верхушки стержня строго вверх головой, не менее 1 м над полом. Фиксировали время падения животного со стержня при помощи секундомера. О сохранности статической выносливости судили путем сравнения с контрольной группой [М.В. Корокин, Е.В. Кузубова, А.И. Радченко и др. Мыши В6.А-DYSFPRMD/ GENEJ как генетическая модель дисферлинопатии. Фармация и фармакология. 2022;10(5):483-496].

Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий – с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p≤0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Время удержания животного на стержне было значительно меньше у мышей с дисферлинопатией по сравнению с мышами дикого типа, на 16,5% (p<0,05), что свидетельствует о снижении статической выносливости у мышей с генотипом B6.A/J-Dysfprmd при развивающейся миодистрофии. Выраженная эффективность ААВ9-ДИСФ-ДВ наблюдалась в опытной группе, т.к. время удержания мышей на скользком стержне было больше на 23,0% (p<0,05), чем в группе К-, при этом достигая целевых значений (таблица 4).

Таблица 4

Результаты исследования фармакологической активности ААВ9-ДИСФ-ДВ в тесте «Удержание животного на скользком вертикальном стержне»

(Мe±SD), с

№ п/п Экспериментальные группы Время падения 1 К- (n=10) 24,3±1,7* 2 К+ (n=10) 29,1±2,1** 3 AAV 3 i/m (n=14) 29,9±2,4**

Примечания: представлены медианы и стандартная ошибка среднего. Выборки про-верены на нормальность, а статистическая достоверность оценивалась с помощью Н-критерия Крускала-Уоллиса. * – p<0,05 в сравнении с группой К+; ** – p<0,05 в сравнении с группой К-.

Таким образом, в предлагаемом способе в/м введение ААВ9-ДИСФ-ДВ в дозе 5*1012 ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemiuslateralis мышей B6.A/J-Dysfprmd в возрасте 6 месяцев с повторным введением препарата через 1 месяц после первого введения приводит к сохранению статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей, что подтверждается результатами теста «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» через 3 месяца после первого введения ААВ9-ДИСФ-ДВ.

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, биомедицины и к области клеточных технологий. Описан способ сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей в эксперименте, включающий использование самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysfprmd и введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса. При этом вводят внутримышечно (в/м) препарат на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, несущего кодон-оптимизированную кДНК гена дисферлина под управлением мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина в дозе 5*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialisanterior, m. gastrocnemiuslateralis на животное суммарно 300 мкл мышей B6.A/J-Dysfprmd в возрасте 6 месяцев с повторным введением препарата через 1 месяц после первого введения с оценкой физической работоспособности через 3 месяца после первого введения препарата, подтверждаемой результатами теста «Удержание животного на скользком вертикальном стержне». Изобретение может быть использовано для сохранения статической выносливости. 4 табл., 1 пр.

Способ сохранения статической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей в эксперименте, включающий использование самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysfprmd и введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса, отличающийся тем, что вводят внутримышечно (в/м) препарат на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, несущего кодон-оптимизированную кДНК гена дисферлина под управлением мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина в дозе 5*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastuslateralis, m. tibialisanterior, m. gastrocnemiuslateralis на животное суммарно 300 мкл мышей B6.A/J-Dysfprmd в возрасте 6 месяцев с повторным введением препарата через 1 месяц после первого введения с оценкой физической работоспособности через 3 месяца после первого введения препарата, подтверждаемый результатами теста «Удержание животного на скользком вертикальном стержне».