Способ повышения физической работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного вектора в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 

Способ повышения физической работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного вектора в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и генетическим технологиям.

По известным литературным данным - рецессивные мутации в гене DYSF в хромосоме 2p13 человека являются причиной мышечных дистрофий, относящихся к дисферлинопатиям. Фенотип разнообразный - от бессимптомного повышения содержания креатинкиназы в сыворотке до селективного и прогрессирующего поражения проксимальных и/или дистальных мышц конечностей [Contreras-Cubas, C., Barajas-Olmos, F., Frayre-Martínez, M. I., Siordia-Reyes, G., Guízar-Sánchez, C. C., García-Ortiz, H., Orozco, L., & Baca, V. (2022). Dysferlinopathy misdiagnosed with juvenile polymyositis in the pre-symptomatic stage of hyperCKemia: a case report and literature review. BMC medical genomics, 15(1), 139]. Выявление молекулярных мишеней и идентификация геномных локусов, редактирование которых может привести к реверсии патологического процесса необходимы для разработки генотерапевтических препаратов для коррекции мышечных дистрофий [Gitler, A. D., Dhillon, P., & Shorter, J. (2017). Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope. Dis Model Mech, 10(5), 499-502]. Как было показано ранее, генная терапия с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) безопасна и хорошо переносится [Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., 3rd, & Strohl, W. R. (2017). Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy, 31(4), 317-334].

Известен способ терапии дисферлинопатий [Lostal, W., et al., Efficient recovery of dysferlin deficiency by dual adeno-associated vector-mediated gene transfer. Hum Mol Genet, 2010. 19(10): p.1897-907], в котором авторы клонировали кДНК дисферлина в вектор на основе AAV. Так как кДНК дисферлина превышает размер трансгенной вставки, которую способен нести геном AAV, кДНК гена DYSF клонировали в виде 2 частей в два независимых AAV вектора: один рекомбинантный AAV несет 5′ конец кДНК вместе с донорным сайтом сплайсинга интрона, другой рекомбинантный AAV несет акцепторный сайт сплайсинга и следующий за ним 3′ концевую последовательность кДНК. В результате естественной способности AAV к конкатемеризации происходило объединение двух частей кДНК и экспрессия полноразмерного белка дисферлина. Системная инъекция в хвостовую вену самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd этих двух векторов приводила к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Инъекции приводили к улучшению гистологической картины мышечной ткани, сокращению числа некротических волокон, восстановлению репарации мембраны и улучшению двигательных функций.

Недостатком данного способа является слабая экспрессия белка дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV.

Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения (прототипом) является способ повышения работоспособности и переносимости интенсивной физической нагрузки у лабораторных мышей [Стернин Ю.И., Мазуров В.И., Кнорринг Г.Ю., Трофимов Е.В. Оценка влияния системной энзимотерапии на цитокиновую регуляцию процессов адаптации животных к интенсивным физическим нагрузкам. Медицинская Иммунология, 2008, Т. 10, № 6, с. 577-582]. Для изучения влияния системной энзимотерапии на работоспособность и переносимость интенсивной физической нагрузки, а также влияния ее на продукцию основных цитокинов экспериментальным животным (45 беспородных белых мышей) вводили препараты системной энзимотерапии. Физическую работоспособность оценивали на 1, 2 и 3 неделях по длительности тест-плавания животных в аквариуме с грузом, составляющим 5% от массы тела. Применение системной энзимотерапии приводило к повышению работоспособности и переносимости интенсивной физической нагрузки у экспериментальных животных, значимый эффект реализовывался через 3 недели от начала назначения препарата.

Недостатком данного способа является то, что исследуемый лекарственный препарат Вобэнзим противопоказан при повышенной чувствительности к панкреатину, папаину, рутозиду тригидрату, бромелаину, трипсину, липазе, амилазе, химотрипсину, а также при заболеваниях, связанных с повышенной вероятностью кровотечений (в т.ч. гемофилия, тромбоцитопения); проведении гемодиализа; детском возрасте до 5 лет [https://grls.minzdrav.gov.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=fc7cbdff-2944-4cc3-8a9d-6e3c1e466df4].

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа повышения физической работоспособности с использованием генно-инженерной конструкции на основе AAV, экспрессирующей дисферлин человека.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ повышения физической работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного вектора в эксперименте, лишенный недостатка аналога, а именно, слабой экспрессии дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV, за счет применения мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина, и недостатков прототипа, касающихся противопоказаний к применению.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ повышения физической работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного вектора в эксперименте, включающий использование лабораторных мышей и введение им препарата с целью коррекции и оценки физической работоспособности после введения препарата по длительности тест-плавания животных в аквариуме с грузом, составляющим 5% от массы тела мыши, причем в эксперименте используют дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd и однократное введение двувекторного препарата ААВ9-ДИСФ-ДВ на основе аденоассоциированного вируса в дозе 1*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis на животное суммарно 300 мкл с оценкой физической работоспособности через 3 месяца после введения препарата.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что однократное введение ААВ9-ДИСФ-ДВ в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis приводит к выраженной коррекции физической работоспособности у дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd, что подтверждается достоверным увеличением продолжительности плавания у мышей B6.A/J-^Dysfprmd с введением ААВ9-ДИСФ-ДВ по сравнению с нелеченными животными (p<0,05) в тесте «Вынужденное плавание с грузом», при этом достигая целевых значений. Эффективность ААВ9-ДИСФ-ДВ в данном тесте обусловлена тем, что двойные AAV векторы имеют перекрывающуюся область размером 1 т. п. н., которая служит субстратом для рекомбинации с целью создания полноразмерной кДНК дисферлина и более выраженной экспрессии полноразмерного белка дисферлина за счет наличия химерного интрона в 5'-кассете.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ААВ9-ДИСФ-ДВ

Пример 1

Этап 1. Был произведен дизайн и синтез олигонуклеотидов, кодирующих химерный интрон, представлено в таблице 1.

Таблица 1

Химерный интрон (CI) gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag (SEQ ID NO: 1)

Этап 2. 5' последовательность дисферлина была клонирована в вектор для сборки AAV (pAAV-Dysf5'-DV), при этом вектор несет следующие регуляторные последовательности, представлено в таблице 2.

Таблица 2

Наименование характеристики Целевое значение Регуляторная последовательность
(промотор MHCK7) ctagaagctgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgaggtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttggggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttcatgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaacacctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctgtgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagtattactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaaccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggtccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggacagcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcattctaccaccacctccacagcacgagct (SEQ ID NO: 2) Химерный интрон (CI) gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag (SEQ ID NO: 3) Левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct (SEQ ID NO: 4) Правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg (SEQ ID NO: 5)

Этап 3. 3' последовательность дисферлина была клонирована в вектор для сборки AAV (pAAV-Dysf3'-DV), при этом вектор несет следующие регуляторные последовательности, представлено в таблице 3.

Таблица 3

Наименование характеристики Целевое значение Левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct (SEQ ID NO: 6) Сигнал полиаденилирования SV40 (PolyA SV40) taagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctctatttgtgaaatttgtgatgctattgtcctatttgtaaccattataagctgcaataaacaagtt (SEQ ID NO: 7) Правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg (SEQ ID NO: 8)

Этап 4. Была проведена проверка последовательностей плазмид pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-Dysf3'-DV секвенированием (только клонированные последовательности, не включая ITR).

Для сборки пробной партии вирусов были в препаративных количествах получены 4 плазмиды: AAV9-Dysf5'-DV, AAV9-Dysf3'-DV, pAAV-RC2/9 и pHelper.

Методом тройной транзиентной трансфекции в клетках HEK293T были получены пробные партии вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV. Вирусные препараты были очищены по отработанной ранее в лаборатории методике от клеточного дебриса, примесных белков и пустых вирусных капсидов. Вирусный препарат стерилизовали через спин-колонки с размером пор 0,22мкм и замораживали в буфере для хранения вирусных препаратов: 1х PBS, 350mM NaCl, 0,001% Pluronic F68 в пробирках типа эппендорф по 0,5мл. Аликвоты вирусных препаратов отбирали перед замораживанием для контроля качества.

Качество полученных вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV определяли окрашиванием в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Концентрацию вирусов определяли количественной ПЦР в реальном времени с использованием зондов и праймеров к инвертированным повторам по отработанной ранее в лаборатории методике. Титр вирусных частиц в конечном препарате составляет 2,15Е+13гк/мл для AAV9-Dysf5'-DV и 2,06Е+13гк/мл для AAV9-Dysf3'-DV соответственно.

В ходе работ были получены 2 плазмидные конструкции, кодирующие кДНК дисферлина pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-Dysf3'-DV. Последовательности полученных плазмид были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Полученные плазмиды были трансформированы в штамм Top10 E.coli для выделения.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ААВ9-ДИСФ-ДВ

Эксперименты проведены на 34 мышах сублинии B6.A/J-Dysf^prmd массой 27-33 г в возрасте 6 месяцев, полученных из испытательного центра «Виварно-экспериментальный комплекс ООО «НИИ Митоинженерии МГУ». Ранее на мышах сублинии B6.A/J-Dysf^prmd было показано, что к 6 месяцам жизни у данных мышей симптоматика дисферлинопатии прогрессирует и более выражена, чем в 3 месяца, в связи с чем в эксперимент были взяты мыши в возрасте 6 месяцев [Кузубова Е.В., Радченко А.И., Краюшкина А.М. и др. (2023). Анализ модели миодистрофии Миоши в поведенческом тесте «Вынужденное плавание с грузом». Экспериментальная и клиническая фармакология, 86 (11s), 90]. Когорты животных получены в результате скрещивания мышей линии A/J (#:000646), у которых была случайно обнаружена спонтанная инсерция в интроне 4, с мышами дикого типа C57BL/6J. Поддержание и размножение колонии проводили путем скрещивания мутантных животных между собой из одного помета. Мыши были рандомизированы в соответствии с массой тела и использованы для исследования специфической фармакологической активности препарата на основе аденоассоциированного вирусного вектора ААВ9-ДИСФ-ДВ.

Первая группа (n=10) - отрицательный контроль - дисферлин-дефицитные мыши (шифр К-) с генотипом B6.A/J-Dysf^prmd; вторая группа (n=10) - положительный контроль - мыши дикого типа (шифр К+); третья группа (n=14) - дисферлин-дефицитные мыши, получающие препарат ААВ9-ДИСФ-ДВ внутримышечно (в/м) в дозе 1*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis (шифр AAV 1 i/m).

Физическую работоспособность оценивали через 3 месяца после введения препарата по длительности плавания животных в тесте «Вынужденное плавание с грузом».

Тест «Вынужденное плавание с грузом». Физическую работоспособность животных в данном тесте оценивали по длительности плавания с грузом, который составляет 5% от массы тела, прикрепленным к корню хвоста животного при помощи резиновой повязки [Кузубова Е.В., Радченко А.И., Краюшкина А.М. и др. (2023). Анализ модели миодистрофии Миоши в поведенческом тесте «Вынужденное плавание с грузом». Экспериментальная и клиническая фармакология, 86 (11s), 90]. Массу животных определяли с точностью до 0,1 г, груз подбирали с точностью 0,01 г. Длительность тестирования (плавания) регистрировали при помощи секундомера с точностью до 1 с. Окончанием эксперимента считался момент утомления животного, признаком которого являлась неспособность животного всплыть в течение 5 сек на поверхность воды или отказ от плавания (погружение на дно более, чем на 5 сек). Признаком утомления животного являлось нарушение моторно-координационной функции (вращением вокруг своей оси и заваливание на бок в толще воды). Плавание проводили в сосудах из органического стекла с внутренним диаметром 30 см и высоты 60 см. Высота столба воды составляла 30 см, температура воды 23±1°C.

Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий - с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p≤0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Продолжительность плавания мышей в группе К- была значительно снижена по сравнению с группой K+, на 45,8% (p<0,05), что свидетельствует о снижении физической работоспособности у мышей сублинии B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 9 месяцев. При проведении теста «Вынужденное плавание с грузом» было выявлено статистически значимое различие между контрольной группой мышей К- и экспериментальной группой AAV 1 i/m. Оценка физической работоспособности в тесте «Вынужденное плавание с грузом» представлена на Фиг.1. Выраженная эффективность препарата ААВ9-ДИСФ-ДВ выявлена в группе AAV 1 i/m, на 92,3% (p<0,05) превышая показатель в группе К-, при этом достигая целевых значений. На Фиг. 1 представлены медианы и стандартная ошибка среднего, количество животных указано в нижней части соответствующего столбца. Выборки проверены на нормальность, статистическая достоверность оценивалась с помощью Н-критерия Крускала-Уоллиса (*p<0,05).

Таким образом, в предлагаемом способе однократное введение двувекторного препарата ААВ9-ДИСФ-ДВ на основе аденоассоциированного вируса в дозе 1*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis (на животное суммарно 300 мкл) приводит к выраженному повышению физической работоспособности у мышей с генотипом B6.A/J-Dysf^prmd, что подтверждается результатами теста «Вынужденное плавание с грузом» через 3 месяца после введения ААВ9-ДИСФ-ДВ.

--->

<rupat:RUPatentApplication

xmlns:pat="http://www.wipo.int/standards/XMLSchema/ST96/Patent"

xmlns:com="http://www.wipo.int/standards/XMLSchema/ST96/Common"

xmlns:rucom="http://www1.fips.ru/XMLSchema/EApp/Common"

xmlns:rupat="http://www1.fips.ru/XMLSchema/EApp/Patent"><rupat:RUInven

tionInfo><rupat:RUInventionTitle>Способ повышения физической

работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного

вектора в эксперименте на дисферлин-дефицитных

мышах</rupat:RUInventionTitle><pat:PatentClassificationBag><pat:IPCCla

ssification><pat:PatentClassificationText>C12N

15/00</pat:PatentClassificationText></pat:IPCClassification></pat:Pate

ntClassificationBag></rupat:RUInventionInfo><rupat:RUPartyInfo><rupat:

RUApplicant><rucom:RUContact><com:Name><com:OrganizationName

com:languageCode="ru"><com:OrganizationStandardName>федеральное

государственное автономное образовательное учреждение высшего

образования "Белгородский государственный национальный

исследовательский университет" (НИУ

"БелГУ")</com:OrganizationStandardName></com:OrganizationName><com:Org

anizationName

com:languageCode="la"><com:OrganizationStandardName>federalnoe

gosudarstvennoe avtonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego

obrazovaniia "Belgorodskii gosudarstvennyi natsionalnyi

issledovatelskii universitet" (NIU

"BelGU")</com:OrganizationStandardName></com:OrganizationName></com:Na

me><com:PostalAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddre

ss

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы,

85</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308015, Rossiya, g. Belgorod, ul. Pobedy,

85</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

com:EmailAddressBag><com:EmailAddressText>toktar@bsu.edu.ru</com:Email

AddressText></com:EmailAddressBag></rucom:RUContact><rucom:RUIndividua

lTaxNumber

/><rucom:RULegalEntityCode><rucom:RUOGRN>1023101664519</rucom:RUOGRN><

/rucom:RULegalEntityCode><rucom:RURegistrationReasonCode

/></rupat:RUApplicant><rucom:RUCorrespondenceAddress><rucom:RUContact>

<com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Токтарева Татьяна

Михайловна</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308015, г.Белгород, ул. Победы, 85, НИУ

"БелГУ"</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddress

Bag><com:PhoneNumberBag><com:PhoneNumber>+79511538299</com:PhoneNumber

></com:PhoneNumberBag></rucom:RUContact></rucom:RUCorrespondenceAddres

s><rucom:RUInventorBag><rucom:RUInventor><rucom:RUContact><com:Name><c

om:PersonName com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Корокин

Михаил

Викторович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Korokin Mikhail

Viktorovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Posta

lAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">305047, Россия, г. Курск, ул. 2-я Рабочая, д.

7а, кв.5</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">305047, Rossiya, g. Kursk, ul. 2-ya Rabochaya,

d. 7a,

kv.5</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag

></rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUConta

ct><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Покровский Михаил

Владимирович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Pokrovskii Mikhail

Vladimirovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Pos

talAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308027, Россия, г. Белгород, ул. 5 августа, д.

31, кв. 171</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308027, Rossiya, g. Belgorod, ul. 5 avgusta, d.

31, kv.

171</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContac

t><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Дейкин Алексей

Васильевич</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Deikin Aleksei

Vasilevich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">117041, Россия, г. Москва, ул. Адмирала

Лазарева, д. 50/1, кв.

6</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">117041, Rossiya, g. Moskva, ul. Admirala

Lazareva, d. 50/1, kv.

6</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag></

rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact>

<com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Корокина Лилия

Викторовна</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Korokina Liliia

Viktorovna</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308514, Россия, Белгородская обл., п.

Комсомольский, ул. Славянская,

д.12</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308514, Rossiya, Belgorodskaya obl., p.

Komsomolskiy, ul. Slavyanskaya,

d.12</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag

></rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUConta

ct><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Пересыпкина Анна

Александровна</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Peresypkina Anna

Aleksandrovna</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Pos

talAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308036, Россия, г. Белгород, ул. Конева,7,

кв.37</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308036, Rossiya, g. Belgorod, ul. Koneva,7,

kv.37</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBa

g></rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUCont

act><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Гудырев Олег Сергеевич

</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Gudyrev Oleg Sergeevich

</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:PostalAddressBag

><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">305023, Россия, г. Курск, ул. Энгельса, д. 90,

кв. 239</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">305023, Rossiya, g. Kursk, ul. Engelsa, d. 90,

kv. 239

</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag></r

ucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact><

com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Деев Роман

Вадимович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Deev Roman

Vadimovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">192131, Россия, Санкт-Петербург, пр. Обуховской

обороны д. 197, кв. 131</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">192131, Rossiya, Sankt-Peterburg, pr.

Obukhovskoy oborony d. 197, kv.

131</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag>

</rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContac

t><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Кузубова Елена

Валерьевна</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Kuzubova Elena

Valerevna</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:PostalA

ddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">309023, Россия, Белгородская область,

Прохоровский район, хутор Клиновое, ул. Стригунова, д.

22</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">309023, Rossiya, Belgorodskaya oblast,

Prokhorovskiy rayon, khutor Klinovoye, ul. Strigunova, d.

22</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

/rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact

><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Яковлев Иван

Антонович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Iakovlev Ivan

Antonovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">198320, Россия, г. Санкт-Петербург, гор.

Красное Село, ул. Цветочная

16</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">198320, Rossiya, g. Sankt-Peterburg, gor.

Krasnoye Selo, ul. Tsvetochnaya

16</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

/rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact

><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Исаев Артур

Александрович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Isaev Artur

Aleksandrovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Po

stalAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">127015, Россия, г. Москва, ул. Новодмитровская,

д. 2 корп. 7,</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">127015, Rossiya, g. Moskva, ul.

Novodmitrovskaya, d. 2 korp.

7,</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

/rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact

><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Покровский Владимир

Михайлович</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Pokrovskii Vladimir

Mikhailovich</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Post

alAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308027, Россия, г. Белгород, ул. 5 Августа,

д.31, кв.171</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308027, Rossiya, g. Belgorod, ul. 5 Avgusta,

d.31,

kv.171</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressB

ag></rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUCon

tact><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Жунусов Никита Сергеевич

</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Zhunusov Nikita Sergeevich

</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:PostalAddressBag

><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308015, Россия, 308015, г. Белгород, ул.

Левобережная, д. 22, кв.

95</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">Rossiya, 308015, g. Belgorod, ul.

Levoberezhnaya, d. 22, kv.

95</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

/rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact

><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Краюшкина Анастасия

Михайловна </com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Kraiushkina Anastasiia

Mikhailovna

</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:PostalAddressBag

><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308000, Россия, г.Белгород, пр. Богдана

Хмельницкого 80а, кв.5</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308000, Rossiya, g.Belgorod, pr. Bogdana

Khmelnitskogo 80a,

kv.5</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag

></rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUConta

ct><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Радченко Александра

Игоревна</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Radchenko Aleksandra

Igorevna</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:PostalAd

dressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308023, Россия, г. Белгород, ул. Садовая, д.

118б, кв. 82</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308023, Rossiya, g. Belgorod, ul. Sadovaya, d.

118b, kv.

82</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

/rucom:RUContact></rucom:RUInventor><rucom:RUInventor><rucom:RUContact

><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Екимова Наталья

Викторовна</com:PersonFullName></com:PersonName><com:PersonName

com:languageCode="la"><com:PersonFullName>Ekimova Natalia

Viktorovna</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308031, Россия, г.Белгород, ул. Бульвар-Юности,

29, кв.238</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308031, Rossiya, g.Belgorod, ul.

Bulvar-Yunosti, 29,

kv.238</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressB

ag></rucom:RUContact></rucom:RUInventor></rucom:RUInventorBag><rucom:R

URepresentative><rucom:RUContact><com:Name><com:PersonName

com:languageCode="ru"><com:PersonFullName>Токтарева Татьяна

Михайловна</com:PersonFullName></com:PersonName></com:Name><com:Postal

AddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddress

com:languageCode="ru"><com:CountryCode

/></com:PostalStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">ул. Победы, д. 85, г. Белгород, беогородская

обл., 308015,

ОИС</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag>

<com:EmailAddressBag><com:EmailAddressText>toktar@bsu.edu.ru;

toktar14@mail.ru</com:EmailAddressText></com:EmailAddressBag><com:Phon

eNumberBag><com:PhoneNumber>(4722)301037</com:PhoneNumber></com:PhoneN

umberBag></rucom:RUContact><com:RepresentativeCategory>Professional

representative</com:RepresentativeCategory><rucom:RUPatentAttorneyNumb

er>1213</rucom:RUPatentAttorneyNumber></rucom:RURepresentative><rucom:

RUContractInfo><rucom:RUContractKind>State</rucom:RUContractKind><ruco

m:RUContractNumber>075-15-2021-1346

</rucom:RUContractNumber><rucom:RUContractDate>2021-10-04</rucom:RUCon

tractDate><rucom:RUImplementor><com:Name><com:OrganizationName

com:languageCode="ru"><com:OrganizationStandardName>федеральное

государственное автономное образовательное учреждение высшего

образования "Белгородский государственный национальный

исследовательский университет" (НИУ

"БелГУ")</com:OrganizationStandardName></com:OrganizationName><com:Org

anizationName

com:languageCode="la"><com:OrganizationStandardName>federalnoe

gosudarstvennoe avtonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego

obrazovaniia "Belgorodskii gosudarstvennyi natsionalnyi

issledovatelskii universitet" (NIU

"BelGU")</com:OrganizationStandardName></com:OrganizationName></com:Na

me><com:PostalAddressBag><com:PostalAddress><com:PostalStructuredAddre

ss

com:languageCode="ru"><com:CountryCode>RU</com:CountryCode></com:Posta

lStructuredAddress><com:PostalAddressText

com:languageCode="ru">308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы,

85</com:PostalAddressText><com:PostalAddressText

com:languageCode="la">308015, Rossiya, g. Belgorod, ul. Pobedy,

85</com:PostalAddressText></com:PostalAddress></com:PostalAddressBag><

com:EmailAddressBag><com:EmailAddressText>toktar@bsu.edu.ru</com:Email

AddressText></com:EmailAddressBag></rucom:RUImplementor></rucom:RUCont

ractInfo></rupat:RUPartyInfo><rupat:RUAttachmentInfo><rupat:RUDescript

ionFile><com:DocumentFileName>s.docx</com:DocumentFileName></rupat:RUD

escriptionFile><rupat:RUAbstractFile><com:DocumentFileName>a.docx</com

:DocumentFileName></rupat:RUAbstractFile><rupat:RUDrawingsFile><com:Do

cumentFileName>00001p.docx</com:DocumentFileName></rupat:RUDrawingsFil

e><rupat:RUSequenceListingFile><com:DocumentFileName>pp.xml</com:Docum

entFileName></rupat:RUSequenceListingFile><rupat:RUFeeReductionFile><c

om:DocumentFileName>00002d.docx</com:DocumentFileName></rupat:RUFeeRed

uctionFile><rupat:RUPowerOfAttorneyFile><com:DocumentFileName>00007d.p

df</com:DocumentFileName></rupat:RUPowerOfAttorneyFile><rupat:RUClaimF

ile><com:DocumentFileName>f.rtf</com:DocumentFileName></rupat:RUClaimF

ile><rupat:RUOtherFileBag><rupat:RUOtherFile><com:DocumentFileName>000

01d.docx</com:DocumentFileName></rupat:RUOtherFile><rupat:RUOtherFile>

<com:DocumentFileName>00004d.doc</com:DocumentFileName></rupat:RUOther

File><rupat:RUOtherFile><com:DocumentFileName>00005d.docx</com:Documen

tFileName></rupat:RUOtherFile><rupat:RUOtherFile><com:DocumentFileName

>00006d.doc</com:DocumentFileName></rupat:RUOtherFile></rupat:RUOtherF

ileBag><rupat:RUPaymentFileBag><rupat:RUPaymentFile><com:DocumentFileN

ame>00003d.docx</com:DocumentFileName></rupat:RUPaymentFile></rupat:RU

PaymentFileBag></rupat:RUAttachmentInfo><rupat:RUPayer><com:Name><com:

OrganizationName

com:languageCode="ru"><com:OrganizationStandardName>федеральное

государственное автономное образовательное учреждение высшего

образования "Белгородский государственный национальный

исследовательский университет" (НИУ

"БелГУ")</com:OrganizationStandardName></com:OrganizationName></com:Na

me><rucom:RUPayerIdentity><rucom:RULegalEntityPayerIdentity><rucom:RUI

ndividualTaxNumber>3123035312</rucom:RUIndividualTaxNumber><rucom:RURe

gistrationReasonCode>312301001</rucom:RURegistrationReasonCode></rucom

:RULegalEntityPayerIdentity></rucom:RUPayerIdentity></rupat:RUPayer><r

upat:RUApplicationPetitions><rupat:RUApplicationExpertise>true</rupat:

RUApplicationExpertise></rupat:RUApplicationPetitions></rupat:RUPatent

Application>

<---

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и генетическим технологиям. Описан способ заключается в следующем. У дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd выявлено выраженное увеличение продолжительности плавания с грузом при однократном введении препарата на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа в дозе 1*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis (на животное суммарно 300 мкл) в тесте «Вынужденное плавание с грузом» через 3 месяца после введения ААВ9-ДИСФ-ДВ. Изобретение может быть использовано для повышения физической работоспособности. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ повышения физической работоспособности с использованием аденоассоциированного вирусного вектора в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, включающий использование лабораторных мышей и введение им препарата с целью коррекции и оценки физической работоспособности после введения препарата по длительности тест-плавания животных в аквариуме с грузом, составляющим 5% от массы тела мыши, отличающийся тем, что в эксперименте используют дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd и однократное введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа в дозе 1*10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis на животное суммарно 300 мкл с оценкой физической работоспособности через 3 месяца после введения препарата.