Способ повышения физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах Российский патент 2025 года по МПК A61K48/00 C12N15/113 C12N15/63 C12N15/864 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и генетическим технологиям.

По известным литературным данным, мутации в гене DYSF в хромосоме 2p13 человека являются причиной дисферлинопатий. Дисферлинопатия включает в себя пресимптоматический этап бессимптомного повышения уровня креатинкиназы в крови и манифестный этап, характеризующийся прогрессирующим поражением проксимальных и/или дистальных мышц конечностей [Contreras-Cubas, C., Barajas-Olmos, F., Frayre-Martínez, M.I., Siordia-Reyes, G., Guízar-Sánchez, C.C., García-Ortiz, H., Orozco, L., & Baca, V. (2022). Dysferlinopathy misdiagnosed with juvenile polymyositis in the pre-symptomatic stage of hyperCKemia: a case report and literature review. BMC medical genomics, 15 (1), 139]. Мыши сублинии B6.A-Dysf^prmd/GeneJ (Bla/J) являются репрезентативной моделью дисферлинопатии и могут быть использованы для оценки новых терапевтических средств для лечения данного заболевания [М.В. Корокин, Е.В. Кузубова, А.И. Радченко и др. Мыши В6.А-DYSF^PRMD/GENEJ как генетическая модель дисферлинопатии. Фармация и фармакология. 2022; 10 (5): 483-496]. Как было показано ранее, генная терапия с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) хорошо переносится и безопасна [Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W.L., 3rd, & Strohl, W. R. (2017). Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy, 31(4), 317-334].

Известен способ терапии дисферлинопатий с применением кодон-оптимизированной кДНК, кодирующей дисферлин человека (патент на изобретение RU 2527073, опубл. 27.08.2014), включающий введение фармацевтической композиции для восстановления нарушенной экспрессии и/или функции белка дисферлина в скелетной мышце, содержащая аденовирус, человеку (или животным) таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы и медицинских показаний. Фармацевтическая композиция может вводиться внутримышечно - местно, системно - внутривенно, аэрозольно, в виде генно-клеточной трансплантации или трансфузии после in vitro обработки различных аутологичных клеток, например гемопоэтических и их более дифференцированных производных, мезенхимальных, сосудисто-стромальной фракции, мезангиобластов и др.

Основным недостатком способа является то, что аденовирус обладает более высокой иммуногенностью по сравнению с AAV. Преимущество использования рекомбинантного AAV в генной терапии можно объяснить отсутствием патогенности и дополнительной безопасностью из-за дефектности его репликации и способности опосредовать более долгосрочную экспрессию в различных тканях, чем у рекомбинантного аденовируса [Lai, C.M., Lai, Y.K., & Rakoczy, P.E. (2002). Adenovirus and adeno-associated virus vectors. DNA and cell biology, 21 (12), 895-913]. Помимо этого, в данном способе не приведены режимы введения и дозы препарата при конкретных показаниях.

Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения является способ терапии дисферлинопатий [Lostal, W. et al. Efficient recovery of dysferlin deficiency by dual adeno-associated vector-mediated gene transfer. Hum Mol Genet, 2010. 19 (10): p. 1897-907]. Авторы клонировали кДНК дисферлина в вектор на основе AAV. Так как кДНК дисферлина превышает размер трансгенной вставки, которую способен нести геном AAV, кДНК гена DYSF клонировали в виде 2 частей в два независимых AAV вектора: один рекомбинантный AAV несет 5′ конец кДНК вместе с донорным сайтом сплайсинга интрона, другой рекомбинантный AAV несет акцепторный сайт сплайсинга и следующий за ним 3′ концевую последовательность кДНК. В результате естественной способности AAV к конкатемеризации происходило объединение двух частей кДНК и экспрессия полноразмерного белка дисферлина. Системная инъекция в хвостовую вену самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd этих двух векторов приводила к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Инъекции приводили к улучшению гистологической картины мышечной ткани, сокращению числа некротических волокон, восстановлению репарации мембраны и глобальному улучшению двигательных функций.

Недостатком данного способа является слабая экспрессия белка дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV.

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа повышения физической выносливости с использованием генно-инженерной конструкции на основе AAV, экспрессирующей дисферлин человека.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ повышения физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, лишенный недостатка аналога, а именно высокой иммуногенности аденовируса, с приведением доз и режима введения ААВ9-ДИСФ-ДВ в эксперименте, и недостатка прототипа, а именно слабой экспрессии дисферлина при введении двух рекомбинантных AAV, за счет применения мышцеспецифичного промотора в комбинации с химерным интроном для усиления экспрессии дисферлина.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ повышения физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, включающий использование самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd и однократное введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса, причем вводят внутримышечно (в/м) ААВ9-ДИСФ-ДВ на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, содержащий вектор pAAV-Dysf5'-DV, несущий 5'-последовательность дисферлина, мышцеспецифичный промотор МНСК7 с SEQ ID NO: 2, химерный интрон с SEQ ID NO: 1, левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) с SEQ ID NO: 3 и правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) с SEQ ID NO: 4; и вектор pAAV- Dysf3'-DV, несущий 3'-последовательность дисферлина, L-ITR с SEQ ID NO: 3, PolyA SV40 с SEQ ID NO: 5 и R-ITR с SEQ ID NO: 4, в дозе 5×10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis (на животное суммарно 300 мкл) мышей B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 6 месяцев с оценкой физической выносливости через 3 месяца после введения ААВ9-ДИСФ-ДВ, подтверждаемый результатами теста «Удержание на проволоке».

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что однократное в/м введение ААВ9-ДИСФ-ДВ в дозе 5×10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis мышей B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 6 месяцев приводит к повышению физической выносливости у дисферлин-дефицитных мышей, что подтверждается достоверным увеличением времени удержания на проволоке мышей B6.A/J-Dysf^prmd с введением ААВ9-ДИСФ-ДВ, на 94,0% (р<0,01), по сравнению с нелеченными животными в тесте «Удержание на проволоке», так как двойные AAV векторы имеют перекрывающуюся область размером 1 т.п.н., которая служит субстратом для рекомбинации с целью создания полноразмерной кДНК дисферлина и более выраженной экспрессии полноразмерного белка дисферлина за счет наличия химерного интрона в 5'-кассете.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ААВ9-ДИСФ-ДВ

Пример 1

Этап 1. Был произведен дизайн и синтез олигонуклеотидов, кодирующих химерный интрон, представлено в таблице 1.

Этап 3. 3' последовательность дисферлина была клонирована в вектор для сборки AAV (pAAV-Dysf3'-DV), при этом вектор несет следующие регуляторные последовательности, представлено в таблице 3.

Этап 4. Была проведена проверка последовательностей плазмид pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-Dysf3'-DV секвенированием (только клонированные последовательности, не включая ITR).

Для сборки пробной партии вирусов были в препаративных количествах получены 4 плазмиды: AAV9-Dysf5'-DV, AAV9-Dysf3'-DV, pAAV-RC2/9 и pHelper.

Методом тройной транзиентной трансфекции в клетках НЕК293Т были получены пробные партии вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV. Вирусные препараты были очищены по отработанной ранее в лаборатории методике от клеточного дебриса, примесных белков и пустых вирусных капсидов. Вирусный препарат стерилизовали через спин-колонки с размером пор 0,22 мкм и замораживали в буфере для хранения вирусных препаратов: 1x PBS, 350 mM NaCl, 0,001% Pluronic F68 в пробирках типа эппендорф по 0,5 мл. Аликвоты вирусных препаратов отбирали перед замораживанием для контроля качества.

Качество полученных вирусов AAV9-Dysf5'-DV и AAV9-Dysf3'-DV определяли окрашиванием в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Концентрацию вирусов определяли количественной ПЦР в реальном времени с использованием зондов и праймеров к инвертированным повторам по отработанной ранее в лаборатории методике. Титр вирусных частиц в конечном препарате составляет 2,15Е+13 гк/мл для AAV9-Dysf5'-DV и 2,06Е+13 гк/мл для AAV9-Dysf3'-DV соответственно.

В ходе работ были получены 2 плазмидные конструкции, кодирующие кДНК дисферлина pAAV-Dysf5'-DV и pAAV-DysD'-DV. Последовательности полученных плазмид были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Полученные плазмиды были трансформированы в штамм Тор 10 E.coli для выделения.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ААВ9-ДИСФ-ДВ

Эксперименты проведены на 34 мышах-самцах сублинии B6.A/J-Dysf^prmd массой 27-33 г в возрасте 6 месяцев, полученных из испытательного центра «Виварно-экспериментальный комплекс ООО «НИИ Митоинженерии МГУ». Ранее на мышах сублинии B6.A/J-Dysf^prmd было показано, что к 6 месяцам жизни у данных мышей симптоматика дисферлинопатии прогрессирует и более выражена, чем в 3 месяца, в связи с чем в эксперимент были взяты мыши в возрасте 6 месяцев [Кузубова Е.В., Радченко А.И., Краюшкина A.M. и др. (2023). Анализ модели миодистрофии Миоши в поведенческом тесте «Вынужденное плавание с грузом». Экспериментальная и клиническая фармакология, 86 (lis), 90]. Когорты животных получены в результате скрещивания мышей линии A/J (#:000646), у которых была случайно обнаружена спонтанная инсерция в интроне 4, с мышами дикого типа C57BL/6J. Поддержание и размножение колонии проводили путем скрещивания мутантных животных между собой из одного помета. Мыши были рандомизированы в соответствии с массой тела и использованы для исследования специфической фармакологической активности препарата на основе аденоассоциированного вирусного вектора ААВ9-ДИСФ-ДВ.

Первая группа (n=10) - отрицательный контроль - дисферлин-дефицитные мыши (шифр К-) с генотипом B6.A/J-Dysf^prmd; вторая группа (n=10) - положительный контроль - мыши дикого типа (шифр К+); третья группа (n=14) - дисферлин-дефицитные мыши, получающие препарат ААВ9-ДИСФ-ДВ внутримышечно (в/м) в дозе 5×10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis (шифр AAV 2 i/m).

Физическую выносливость оценивали через 3 месяца после введения препарата путем оценки времени удержания мыши на проволоке до момента падения. Тест «Удержание на проволоке» основан на инстинкте мышей избегать падения. Мышь помещается на горизонтально натянутую проволоку с захватом всеми четырьмя конечностями (диаметр 3 мм, высота над поверхностью 60 см). Способность удерживаться на проволоке измеряется путем оценки времени удержания мыши до момента падения при помощи секундомера. В качестве итогового значения был взят наилучший результат двух попыток, пауза между которыми была 20 мин [М.В. Корокин, Е.В. Кузубова, А.И. Радченко и др. Мыши В6.А-DYSFPRMD/ GENEJ как генетическая модель дисферлинопатии. Фармация и фармакология. 2022; 10(5):483-496].

Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий - с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при р≤0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Время удержания животного на проволоке было значительно меньше у мышей с дисферлинопатией по сравнению с мышами дикого типа, на 62,8% (р<0,01), что свидетельствует о снижении физической выносливости у мышей с генотипом B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 9 месяцев. Выраженная эффективность ААВ9-ДИСФ-ДВ наблюдалась в опытной группе, т.к. время удержания мышей на проволоке было больше на 94,0% (р<0,01), чем в группе К-, но при этом отличаясь от значений группы К+ на 27,9% (р<0,05) (таблица 4).

Примечания: представлены медианы и стандартная ошибка среднего. Выборки проверены на нормальность, а статистическая достоверность оценивалась с помощью Н-критерия Крускала-Уоллиса. * - р<0,05 в сравнении с группой К+; ** -р<0,05 в сравнении с группой К-.

Таким образом, в предлагаемом способе однократное в/м введение ААВ9-ДИСФ-ДВ в дозе 5×10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis мышей B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 6 месяцев приводит к повышению физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, что подтверждается результатами теста «Удержание на проволоке» через 3 месяца после введения ААВ9-ДИСФ-ДВ.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ повышения

физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных

мышах.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-11-07">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135268</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-26</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1059</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023135268</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-26</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

автономное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Белгородский государственный национальный исследовательский

университет&quot; (НИУ &quot;БелГУ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>federal&apos;noe gosudarstvennoe avtonomnoe

obrazovatel&apos;noe uchrezhdenie vysshego obrazovaniya

&quot;Belgorodskij gosudarstvennyj nacional&apos;nyj

issledovatel&apos;skij universitet&quot; (NIU

&quot;BelGU&quot;)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Корокин Михаил

Викторович</InventorName>

<InventorNameLatin>Korokin Mikhail Viktorovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ повышения физической

выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных

мышах</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>133</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..133</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgg

gcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgc

ctttctctccacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>775</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..775</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctagaagctgcatgtctaagctagacccttcagattaaaaataactgag

gtaagggcctgggtaggggaggtggtgtgagacgctcctgtctctcctctatctgcccatcggccctttg

gggaggaggaatgtgcccaaggactaaaaaaaggccatggagccagaggggcgagggcaacagacctttc

atgggcaaaccttggggccctgctgtctagcatgccccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggc

aaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaacccagacatgtggctgcccccccccccccaac

acctgctgcctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccctgcatgcgaagatcttcgaacaaggctg

tgggggactgagggcaggctgtaacaggcttgggggccagggcttatacgtgcctgggactcccaaagta

ttactgttccatgttcccggcgaagggccagctgtcccccgccagctagactcagcacttagtttaggaa

ccagtgagcaagtcagcccttggggcagcccatacaaggccatggggctgggcaagctgcacgcctgggt

ccggggtgggcacggtgcccgggcaacgagctgaaagctcatctgctctcaggggcccctccctggggac

agcccctcctggctagtcacaccctgtaggctcctctatataacccaggggcacaggggctgccctcatt

ctaccaccacctccacagcacgagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>130</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..130</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtc

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcac

taggggttcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>141</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..141</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctc

gctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgag

cgagcgcgcagctgcctgcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>122</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..122</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaa

aaaatgctctatttgtgaaatttgtgatgctattgtcctatttgtaaccattataagctgcaataaacaa

gtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и генетическим технологиям. Предложен способ повышения физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах. Самцам дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd однократно вводят двувекторный препарат на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, содержащий вектор pAAV-Dysf5'-DV, несущий 5'-последовательность кДНК дисферлина, мышцеспецифичный промотор МНСК7, химерный интрон, левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) и правый инвертированный концевой повтор (R-ITR); и вектор pAAV-Dysf3'-DV, несущий 3'-последовательность кДНК дисферлина, L-ITR, PolyA SV40 и R-ITR. Способ приводит к повышению физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, что подтверждается результатами теста «Удержание на проволоке» через 3 месяца после введения препарата. 4 табл., 1 пр.

Способ повышения физической выносливости в эксперименте на дисферлин-дефицитных мышах, включающий использование самцов дисферлин-дефицитных мышей B6.A/J-Dysf^prmd и однократное введение двувекторного препарата на основе аденоассоциированного вируса, отличающийся тем, что вводят внутримышечно двувекторный препарат на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, содержащий вектор pAAV-Dysf5'-DV, несущий 5'-последовательность кДНК дисферлина, мышцеспецифичный промотор МНСК7 с SEQ ID NO: 2, химерный интрон с SEQ ID NO: 1, левый инвертированный концевой повтор (L-ITR) с SEQ ID NO: 3 и правый инвертированный концевой повтор (R-ITR) с SEQ ID NO: 4; и вектор pAAV- Dysf3'-DV, несущий 3'-последовательность кДНК дисферлина, L-ITR с SEQ ID NO: 3, PolyA SV40 с SEQ ID NO: 5 и R-ITR с SEQ ID NO: 4, в дозе 5×10¹² ед. вируса с геном DYSF в объеме 50 мкл в следующие мышцы обеих задних конечностей: m. vastus lateralis, m. tibialis anterior, m. gastrocnemius lateralis мышей B6.A/J-Dysf^prmd в возрасте 6 месяцев, на животное суммарно 300 мкл, с оценкой физической выносливости через 3 месяца после введения двувекторного препарата, подтверждаемый результатами теста «Удержание на проволоке».