Агенты, связывающие CD8, и их применение Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61K51/10 G01N33/53 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент Соединенных Штатов Америки №62/895,865, поданной 4 сентября 2019 г., содержание которой полностью включено сюда посредством ссылки.

ПОДАЧА ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ФОРМЕ ТЕКСТОВОГО

ФАЙЛА ASCII

Содержание следующей подачи в форме текстового файла ASCII полностью включено сюда посредством ссылки: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла 146392049240SEQLIST.txt, дата записи 19 августа 2020 г., размер 14 Кбайт).

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящая заявка относится к агентам, связывающимся с CD8, на основе доменов VHH против CD8, и к способам применения таких агентов, связывающихся с CD8, для визуализации CD8⁺ Т-клеток in vivo.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Описание числа, типов и пространственного распределения иммунных клеток в опухолевых тканях может обеспечивать критически важную информацию применительно к диагностике рака, прогнозу, выбору терапии и ответу на терапию. В частности, неоднократно сообщалось, что CD8⁺ цитотоксические лимфоциты имеют диагностическое и прогностическое значение при различных видах рака. Современные методы выявления CD8⁺ клеток включают выделение клеток из периферической крови или интересующей ткани. Такие методы работы с образцами сопряжены с ошибками и не дают динамической информации, отражающей число, локализацию и перемещение CD8⁺ клеток in vivo. Одним примером неинвазивного метода выявления иммунных клеток in vivo является позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с использованием радиоактивно меченных индикаторов. Тем не менее, применение таких индикаторов ограничено периодом полувыведения/полураспада радиоактивного изотопа и делением клеток, что приводит к снижению концентрации зонда in vivo. Соответственно, в данной области сохраняется потребность в методах и реагентах для мониторинга изменений количества и временного распределения CD8⁺ клеток in vivo.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи тяжелоцепочечного антитела (домен VHH), где агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 250 пМ или менее или приблизительно 100 пМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 132 пМ или приблизительно 50 пМ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,002/с или менее или приблизительно 0,001/с или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,0018/с или приблизительно 0,00085/с. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 250 пМ или менее или приблизительно 150 пМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 344 пМ или приблизительно 137 пМ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,004/с или менее или приблизительно 0,002/с или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,0037/с или приблизительно 0,0019/с.В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, имеет время половинного снижения связывания с CD8 (например, в анализе связывания in vitro) по меньшей мере приблизительно 30 минут, такое как по меньшей мере приблизительно 1 час, 2 часа или более. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с CD8 макака-резуса с K_D приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не связывается с мышиным или крысиным CD8.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, агент, связывающийся с CD8, не стимулирует и не ингибирует активацию CD8⁺ Т-клеток. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не индуцирует пролиферацию CD8⁺ Т-клеток. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не связывается с CD4⁺ Т-клетками.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH представляет собой VHH представителя семейства Верблюдовых, такой как VHH ламы. В некоторых воплощениях домен VHH является химерным. В некоторых воплощениях VHH гуманизирован. В некоторых воплощениях VHH прошел созревание аффинности.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH специфично связывается с эпитопом человеческого CD8α, содержащим Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97, где нумерация аминокислот соответствует SEQ ID NO: 13. В некоторых воплощениях аминокислотные остатки эпитопа человеческого CD8α расположены в пределах приблизительно 4,5 (0,45 нм) от одного или более чем одного аминокислотного остатка домена VHH в кристаллической структуре агента, связывающегося с CD8, или домена VHH, связанного с человеческим CD8α.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит: участок 1, определяющий комплементарность (CDR1), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или 9; и CDR3, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 10-12.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит L49A, где нумерация соответствует нумерации Kabat. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, может быть очищен с применением аффинной хроматографии с белком А.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит одну или более чем одну аминокислотную модификацию, выбранную из группы, состоящей из замены V89T, замены T110Q, замены S112Q и добавления А в положении 114 (далее называемого «добавлением А114»), где нумерация соответствует нумерации Kabat. В некоторых воплощениях домен VHH содержит замену V89T, замену T110Q, замену S112Q и добавление А114, где нумерация соответствует нумерации Kabat. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не связывается с предсуществующими антителами против VHH у субъекта, получающего агент, связывающийся с CD8.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: l. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Здесь также предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая агент, связывающийся с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений. В некоторых воплощениях предложен вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений. В некоторых воплощениях предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, например, клетка СНО или клетка Expi293. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, такую как клетка Е. coli.

Кроме того, здесь предложен способ получения агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, включающий: (а) культивирование клетки-хозяина по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений в условиях, при которых она продуцирует агент; и (б) выделение агента, связывающегося с CD8, продуцированного клеткой-хозяином.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, агент, связывающийся с CD8, содержит метку. Агент, связывающийся с CD8, содержащий метку, называют здесь «меченым агентом, связывающимся с CD8».

В некоторых воплощениях предложен способ получения меченого агента, связывающегося с CD8, включающий конъюгацию хелатирующей группировки с доменом VHH агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, с получением конъюгата и приведение конъюгата в контакт с комплексом фторида алюминия, содержащим ¹⁸F, с получением меченого агента, связывающегося с CD8, где хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I):

В некоторых воплощениях конъюгат приводят в контакт с комплексом фторида алюминия в присутствии одного или более чем одного антиоксидантного соединения, такого как метионин и/или N-ацетилтриптофан.

Здесь предложен меченый агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH против CD8 по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, конъюгированный с меткой. В некоторых воплощениях метка представляет собой флуоресцентный краситель, радионуклид или фермент. В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, метка представляет собой радионуклид. В некоторых воплощениях радионуклид представляет собой ¹⁸F, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁴Cu, ⁵²Mn, ¹¹¹In или ¹²⁴I. В некоторых воплощениях домен VHH конъюгирован с меткой посредством хелатирующей группировки. В некоторых воплощениях хелатирующая группировка ковалентно связана с доменом VHH через лизиновый остаток. В некоторых воплощениях метка образует комплекс с металлом, где комплекс хелатирован хелатирующей группировкой. В некоторых воплощениях метка представляет собой ¹⁸F и металл представляет собой алюминий. В некоторых воплощениях хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I).

Здесь предложен меченый агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH против CD8, который содержит CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, где домен VHH конъюгирован с радионуклидом (например, ¹⁸F) посредством хелатирующей группировки. В некоторых воплощениях хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I) и радионуклид представляет собой ¹⁸F в комплексе с алюминием. В некоторых воплощениях домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Здесь предложен меченый агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH против CD8, который содержит CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, где домен VHH конъюгирован с радионуклидом (например, ¹⁸F) посредством хелатирующей группировки. В некоторых воплощениях хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I) и радионуклид представляет собой ¹⁸F в комплексе с алюминием. В некоторых воплощениях домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Также здесь предложена фармацевтическая композиция, содержащая агент, связывающийся с CD8 (включая меченый агент, связывающийся с CD8), по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений и фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, здесь предложены применение агента, связывающегося с CD8 (включая меченый агент, связывающийся с CD8), по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений для лечения или диагностики заболевания или состояния у субъекта и применение агента, связывающегося с CD8 (включая меченый агент, связывающийся с CD8), по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений в изготовлении лекарственного средства для лечения или диагностики заболевания или состояния у субъекта.

Кроме того, здесь предложена фармацевтическая композиция, содержащая агент, связывающийся с CD8 (включая меченый агент, связывающийся с CD8), по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений и одно или более чем одно антиоксидантное соединение. В некоторых воплощениях одно или более чем одно антиоксидантное соединение представляет собой метионин и/или N-ацетилтриптофан. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит метионин и N-ацетилтриптофан. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит гистидин и сахарозу.

Здесь предложен способ выявления CD8⁺ клеток у субъекта, включающий: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту; и (б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта, где выявление связывания указывает на присутствие CD8⁺ клеток. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях CD8⁺ клетки представляют собой CD8⁺ Т-клетки. В некоторых воплощениях CD8⁺ клетки представляют собой CD8⁺ опухолевые клетки. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через приблизительно 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях способ повторяют на протяжении более чем 1 года. В некоторых воплощениях способ имеет чувствительность от приблизительно 1 нМ до приблизительно 30 нМ. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека или примата, не являющегося человеком. В некоторых воплощениях субъект представляет собой яванского макака или макака-резуса. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека. В некоторых воплощениях у субъекта есть рак. В некоторых воплощениях у субъекта есть аутоиммунное заболевание или состояние, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина».

Здесь предложен способ прогнозирования чувствительности субъекта с раком к иммунотерапевтическому агенту, клеточной терапии или противораковой вакцине, включающий: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту; и (б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию: (в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого было выявлено связывание. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях способ повторяют на протяжении более чем 1 года.

Также здесь предложен способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, включающий: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту; и (б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию: (в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке выше уровня CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани в первой временной точке. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

Здесь предложен способ мониторинга хода лечения у субъекта с раком, получившего или получающего иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину, включающий: (1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту вместе с иммунотерапевтическим агентом, клеточной терапией или противораковой вакциной; и (2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше способов прогнозирования или способов мониторинга, субъекту вводят иммунотерапевтический агент. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1, антитело против PD-1, антитело против TIGIT, антагонист TIGIT, антитело против CSF-1R, антагонист против CSF-1R, антитело против СЕ А, антагонист против СЕА, антитело против CTLA4, антагонист CTLA4, антитело против ОХ40 или агонист ОХ40. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1. В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 вводят в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях один или более чем один терапевтический агент представляет собой TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), AVASTIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаб, INF-альфа, агент против CD40, антитело против ОХ40, агонист ОХ40, антитело против CSF-1R, антитело против СЕА, ингибитор IDO или антитело против TIGIT. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой цитокин. В некоторых воплощениях, цитокин представляет собой IL-2, искусственно сконструированный IL-2, IL-15 или искусственно сконструированный IL-15. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, специфично связывающуюся с CD3. В некоторых воплощениях биспецифичная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, специфично связывающуюся с CD 16. В некоторых воплощениях биспецифичная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.В некоторых воплощениях биспецифичная антигенсвязывающая молекула специфично связывается с CD16A. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой модулятор дендритных клеток, такой как активатор дендритных клеток или фактор роста дендритных клеток.

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше способов прогнозирования или способов мониторинга, субъекту вводят противораковую вакцину. В некоторых воплощениях противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину (PCV).

В некоторых воплощениях, согласно (или применительно к) любому из указанных выше способов прогнозирования или способов мониторинга, субъекту проводят клеточную терапию. В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой CAR-T. В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой неоантиген-специфичные Т-клетки.

Здесь предложен способ прогнозирования чувствительности субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина» к иммунотерапевтическому агенту, включающий: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту; и (б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию: (в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого было выявлено связывание. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях способ повторяют на протяжении более чем 1 года.

Также здесь предложен способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», включающий: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту; и (б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке, где повышение CD8⁺ Т-клеток от первой временной точки до второй временной точки указывает на прогрессирование аутоиммунного заболевания или состояния, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина». В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию: (в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого уровень CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во второй временной точке ниже уровня CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

Здесь предложен способ мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», получившего или получающего иммунотерапевтический агент, включающий: (1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений субъекту вместе с иммунотерапевтический агентом; и (2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта. В некоторых воплощениях визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта. В некоторых воплощениях меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки. В некоторых воплощениях выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее (например, в течение приблизительно 6 часов, 4 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее) после введения. В некоторых воплощениях способ повторяют один или более чем один раз, например, приблизительно 1-4 раза в год. В некоторых воплощениях способ повторяют через по меньшей мере 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

Здесь предложен способ идентификации кишечных микробных штаммов, ассоциированных с чувствительностью к лечению иммунотерапевтическим агентом, включающий: (а) получение образцов кишечного микробиома от популяции субъектов с раком, включающей субъектов, чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом, и субъектов, не чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом; (б) анализ образцов кишечного микробиома субъектов, чувствительных к лечению, и образцов кишечного микробиома субъектов, не чувствительных к лечению; и (в) идентификацию кишечных микробных штаммов, ассоциированных с субъектами, чувствительными к лечению, где чувствительность определяют выявлением связывания меченого агента, связывающегося с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъектов, и где выявление связывания указывает на чувствительность субъектов к иммунотерапевтическому агенту. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает изготовление микробиомного лекарственного средства, содержащего кишечные микробные штаммы, ассоциированные с чувствительностью к иммунотерапевтическому агенту. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-1. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1, такое как атезолизумаб.

Кроме того, здесь предложены наборы и изделия, содержащие агент, связывающийся с CD8, по (или применительно к) любому из указанных выше воплощений, такой как меченый агент, связывающийся с CD8. В некоторых воплощениях набор или изделие содержат инструкцию по применению агента, связывающегося с CD8, в соответствии с любым из способов, описанных выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей типичных доменов VHH против CD8, включая VHH ламы wt2C8 (SEQ ID NO: 1), гуманизированные VHH hu2C8v130 (SEQ ID NO: 2), hu2C8v142 (SEQ ID NO: 3) и hu2C8v144 (SEQ ID NO: 4) и несвязывающий контроль 2C8v145 (SEQ ID NO: 5).

На ФИГ. 2 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей человеческого CD8α (SEQ ID NO: 13), CD8α яванского макака (SEQ ID NO: 14) и CD8α резуса (SEQ ID NO: 15).

На ФИГ. 3 показаны результаты экспериментов, проведенных для оценки специфичного связывания CD8⁺ клеток вариантами VHH-Fc в сравнении с OKT8-Fc.

На ФИГ. 4 показаны типичные результаты окрашивания образцов клеток цельной крови здоровых добровольцев, связанных с VHH 2С8. OKT8 представляет собой IgG против CD8 и использован в качестве положительного контроля. VHH 3Е8 представляет собой несвязывающий отрицательный контроль.

На ФИГ. 5 показаны схематичные изображения кристаллических структур VHH 2С8. На структуре слева показан VHH 2С8 (светло-серый), связанный с гомодимером CD8α/8α (черный с эпитопом, выделенным белым, димер восстановлен с применением кристаллографических операторов симметрии). На структуре справа показано наложение комплекса VHH 2С8 и CD8α/8α (цвета те же, что на левом изображении) на опубликованную структуру комплекса МНС класса I с гетеродимером CD8α/β (PDB ID: 3DMM, МНС I показана светло-серым, и CD8β показан серым цветом средней интенсивности).

На ФИГ. 6 показаны результаты экспериментов, проведенных для оценки связывания VHH 2С8 дикого типа и 2C8.v144 с предсуществующими антителами против VHH в образцах крови от 96 здоровых доноров.

На ФИГ. 7А представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель).

На ФИГ. 7 В представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки высвобождения протеаз CD8⁺ Т-клетками в ответ на поликлональную стимуляцию Т-клеток антителами против CD3 и против CD28 в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель).

На ФИГ. 7С представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель) после стимуляции SEB.

На ФИГ. 7D представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель) после стимуляции пулом пептидов CEF.

На ФИГ. 7Е представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель) после стимуляции LPS.

На ФИГ. 8А представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель), где в качестве культуральной среды использовали 10%-ю FBS.

На ФИГ. 8 В представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель), где в качестве культуральной среды использовали 10%-ю аутологичную донорскую плазму.

На ФИГ. 8С представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель) после стимуляции SEB, где в качестве культуральной среды использовали 10%-ю FBS.

На ФИГ. 8D представлены результаты экспериментов, проведенных для оценки пролиферации CD8⁺ Т-клеток в присутствии VHH 2C8v130, Lys2 (несвязывающий контроль) или PBS (наполнитель) после стимуляции SEB, где в качестве культуральной среды использовали 10%-ю аутологичную донорскую плазму.

На ФИГ. 9 показаны результаты экспериментов, проведенных для оценки возможностей визуализации CD8 с использованием VHH против CD8 с ¹⁸F у химерных мышей с ксенотрансплантированными опухолями HPBALL/Daudi.

На ФИГ. 10 показаны MIP-ПЭТ мыши с ксенотрансплантированной опухолью TALL1 на 5 сутки после инъекции контрольного mAb ⁸⁹Zr-OA или Zr-huOKT8.v1-OA (слева) или через 90 минут после инъекции контрольного ¹⁸F-VHH или ¹⁸F-VHH против CD8 (справа).

На ФИГ. 11 показаны MIP-ПЭТ-изображения макак-резусов на 5 сутки после инъекции ¹⁸F-VHH против CD8 (сверху) или контрольного ¹⁸F-VHH (снизу).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь предложены агенты, связывающиеся с CD8 (включая антитела против CD8 или их антигенсвязывающие фрагменты), содержащие домен VHH, где агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с высокой аффинностью, но не стимулирует и не ингибирует CD8⁺ Т-клетки и не индуцирует пролиферацию CD8⁺ Т-клеток. Агенты, связывающиеся с CD8, способны связываться с CD8 у приматов, не являющихся людьми, таких как макаки-резусы и яванские макаки, с высокой аффинностью. По сравнению с агентами, связывающимися с CD8, основанными на традиционных 4-цепочечных антителах, агенты, связывающиеся с CD8, описанные здесь, обладают большей проницаемостью и меньшим периодом полувыведения из сыворотки. Таким образом, агенты, связывающиеся с CD8, описанные здесь, подходят для определения присутствия, локализации и/или количества CD8⁺ клеток (например, CD8⁺ Т-клеток) в течение короткого промежутка времени (например, в течение 1 суток, например, в течение 1 часа) после введения, позволяя получать результат в тот же день и проводить повторную визуализацию и мультиплексную визуализацию в комбинации с другими биомаркерами. Кроме того, агенты, связывающиеся с CD8, описанные здесь, демонстрируют высокую чувствительность к CD8, линейную корреляцию с уровнями CD8 в широком динамическом диапазоне, высокую точность благодаря сниженной чувствительности к посторонним факторам, таким как проницаемость, и высокое качество визуализации, отражением которого являются высокие отношения опухоль/кровь в ксенотрансплантационных моделях у мышей.

Здесь предложены способы применения агентов, связывающихся с CD8, в способах выявления CD8⁺ Т-клеток in vivo. Также предложены способы применения агентов, связывающихся с CD8, описанных здесь, в способах прогнозирования чувствительности субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина») к лечению иммунотерапевтическим агентом. Кроме того, предложены способы применения агентов, связывающихся с CD8, описанных здесь, для мониторинга прогрессирования заболевания и/или хода лечения у субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина»), получающего лечение иммунотерапевтическим агентом.

Определения

При использовании здесь термин «человеческий CD8» относится к белку, полипептиду или их частям, соответствующим молекуле кластера дифференцировки 8 у человека. Полноразмерный человеческий CD8 представляет собой трансмембранный гликопротеин, функционирующий как корецептор Т-клеточного рецептора. Человеческий белок CD8 представляет собой димер, состоящий из пары цепей CD8, включая цепи CD8α и CD8β. Термин «человеческий CD8» охватывает гомодимер CD8α/CD8α, гетеродимер CD8α/CD8β, цепь CD8α, цепь CD8β или их части, такие как внеклеточный домен (домены). «CD8α» и «CD8α» использованы здесь взаимозаменяемо, и «CD8b» и «CD8β» использованы здесь взаимозаменяемо. Типичная последовательность человеческой цепи CD8α показана на ФИГ. 2.

При использовании здесь «агент, связывающийся с CD8», относится к любой молекуле, связывающейся с CD8. Агент, связывающийся с CD8, может представлять собой полипептид, белок, антитело (включая 4-цепочечное антитело или тяжелоцепочечное антитело), фрагмент антитела (например, VHH) или иммуноконъюгат, связывающиеся с человеческим CD8, CD8 яванского макака и/или другими белками или пептидами CD8 от источников, не являющихся людьми. Агент, связывающийся с CD8, может также содержать метку, такую как низкомолекулярная метка, например, радионуклид. Агент, связывающийся с CD8, содержащий метку, также называют здесь «меченым агентом, связывающимся с CD8».

Термин «антитело» использован здесь в наиболее широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая, без ограничения, моноклональные антитела, моновалентные антитела (например, односторонние антитела (one-armed antibodies)), 4-цепочечные антитела (такие как антитела IgG), тяжелоцепочечные антитела и фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую антигенсвязывающую активность, то есть связывание с CD8 (таким как человеческий CD8, CD8 яванского макака и/или CD8 макака-резуса). Термины «4-цепочечное антитело» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения антитела или антигенсвязывающих фрагментов, имеющих две тяжелые цепи и две легкие цепи.

«Фрагменты антител» содержат часть антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область антитела. Примеры фрагментов антител включают VHH, однодоменные антитела, Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты, диатела, линейные антитела (см. патент США №5,641,870, Пример 2; Zapata et at, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]), молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифичные антитела, полученные из фрагментов антител. Термин «константный домен» относится к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельным доменом, содержащей антигенсвязывающий сайт. Константный домен содержит домены C_H1, C_H2 и C_H3 (вместе - C_H) тяжелой цепи и домен CHL (или C_L) легкой цепи.

Термин «Fc-область» или «область кристаллизуемого фрагмента» («fragment crystallizable») использован здесь для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и варианты Fc-областей. Несмотря на то, что границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, границы Fc-области тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяют от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Рго230 до ее С-конца. С-концевой лизин (остаток 447 по системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время продукции или очистки антитела или посредством рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител, где удалены все остатки K447, популяции антител без удаления остатков K447 и популяции антител, имеющие смесь антител с и без остатка K447. Подходящие Fc-области с нативной последовательностью для использования в антителах, описанных здесь, включают человеческие IgGl, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4.

При использовании здесь термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, то есть, отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных происходящих естественным образом мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного антигенного сайта. В отличие от препаратов поликлональных антител, обычно содержащих разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что они синтезированы гибридомной культурой и не содержат других иммуноглобулинов. Определение «моноклональное» указывает на свойства антитела, полученного из по существу однородной популяции антител, и его не следует толковать как требующее получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящей заявкой могут быть получены множеством методик, включая, например, гибридомный метод (например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 β): 253-260 (1995); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), методы рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4,816,567), технологии фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu etal, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee etal, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101β4): 12467-12472 (2004); и Lee etal, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)), и технологии получения человеческих антител или антител, подобных человеческим, у животных с некоторыми или всеми локусами или генами человеческих иммуноглобулинов, кодирующими последовательности человеческих

иммуноглобулинов (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits etal, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits etal, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann etal, Year in Immunol. 7:33 (1993); патенты США №5,545,807, №5,545,806, №5,569,825, №5,625,126, №5,633,425 и №5,661,016; Marks etal, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg etal, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild etal, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходную структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельных участка (HVR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания специфичности связывания с антигеном. Кроме того, антитела, связывающиеся с определенным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL антитела, связывающегося с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano etal, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352:624-628 (1991).

Термин «тяжелоцепочечное антитело», также известный как «антитела только из тяжелых цепей», или «HCAb» относится к функциональному антителу, содержащему две тяжелые цепи, но не содержащему двух легких цепей, обычно присутствующих в 4-цепочечных антителах. Известно, что HCAb образуются у животных семейства Верблюдовых (таких как верблюды, ламы или альпаки).

Термин «однодоменное антитело» или «sdAb» относится к отдельному антигенсвязывающему домену, имеющему три участка, определяющих комплементарность (CDR). sdAb способно связываться с антигеном само по себе, без образования пары с соответствующим CDR-содержащим полипептидом. В некоторых случаях однодоменные антитела конструируют из HCAb представителей семейства Верблюдовых и называют «VHH» (определение дано ниже). sdAb представителей семейства Верблюдовых является одним из наименьших известных антигенсвязывающих фрагментов антител (см., например, Hamers-Casterman etal, Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al, Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al, Nanomedicine (bond), 8:1013-26 (2013)).

Термин «VHH» или «вариабельный домен тяжелой цепи тяжелоцепочечного антитела» относится к отдельному вариабельному домену тяжелой цепи тяжелоцепочечного антитела. Молекулы VHH могут иметь происхождение от антител, полученных у вида семейства Camelidae, например, у верблюда, ламы, викуньи, одногорбого верблюда, альпаки и гуанако. Обычный VHH имеет следующую структуру, от N-конца к С-концу: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где FR1-FR4 относятся к каркасным областям 1-4, соответственно, и где CDR1-CDR3 относятся к участкам 1-3, определяющим комплементарность.

При использовании здесь термин «гипервариабельный участок» или «HVR» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, последовательность которых гипервариабельна («участки, определяющие комплементарность», или «CDR») и/или которые образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли») и/или содержат остатки, контактирующие с антигеном («области, контактирующие с антигеном»). Обычно 4-цепочечные антитела и антигенсвязывающие фрагменты таких антител содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Обычно тяжелоцепочечные антитела содержат три HVR (HVR1, HVR2, HVR3).

Применяется несколько определений HVR, и настоящее изобретение охватывает все эти определения. Типичные HVR 4-цепочечных антител и антигенсвязывающих фрагментов таких антител содержат: (а) гипервариабельные петли, соответствующие аминокислотным остаткам 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (6) CDR, соответствующие аминокислотным остаткам 24-34 (LI), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat etal, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (в) области, контактирующие с антигеном, соответствующие аминокислотным остаткам 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum etal. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и (г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки вариабельного домена (например, остатки FR) пронумерованы здесь в соответствии с Kabat et al, как указано выше.

Аминокислотные остатки однодоменного антитела (такого как VHH) могут быть пронумерованы в соответствии с общей нумерацией для доменов V_H согласно Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91), примененной к доменам VHH представителей семейства Верблюдовых в статье Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-195. Согласно этой нумерации, FR1 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 VHH содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102 и FR4 VHH содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. В этой связи следует отметить, что, как хорошо известно в данной области применительно к доменам V_H и доменам VHH, общее число аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьировать и может не соответствовать общему числу аминокислотных остатков, указанному в нумерации Kabat (то есть, одно или более чем одно положение по нумерации Kabat может быть не занято в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, предусмотренное нумерацией Kabat).

Остатки «каркасных областей» или «FR» представляют собой остатки вариабельных доменов, не являющиеся остатками HVR, как определено здесь.

Термин «химерное» антитело относится к антителу, где часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или имеет происхождение от определенного источника или вида, в то время как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или имеет происхождение от другого источника или вида.

«Гуманизированные» антитела представляют собой антитела, содержащие минимальную последовательность, имеющую происхождение от антитела, не являющегося человеческим. Обычно гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельного участка реципиента заменены остатками гипервариабельного участка вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как представитель семейства Верблюдовых, мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющего желаемую специфичность, аффинность и активность. В определенных аспектах «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки CDR, не являющихся человеческими (например, CDR представителей семейства Верблюдовых), и аминокислотные остатки человеческих FR. В некоторых случаях, остатки каркасных областей (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, которые не являются человеческими. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации проводят для дополнительного улучшения свойств антитела. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипер вариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности человеческого иммуноглобулина. Дополнительные подробности приведены в Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et at, Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Антитело, «прошедшее созревание аффинности», представляет собой антитело с одним или более чем одним изменением в одном или более чем одном CDR, приводящее к улучшению аффинности антитела в отношении антигена по сравнению с исходным антителом без этого изменения (изменений). В некоторых воплощениях антитело, прошедшее созревание аффинности, имеет наномолярную или даже пикомолярную аффинность в отношении антигена-мишени. Антитела, прошедшие созревание аффинности, получают методиками, известными в данной области. Например, случайный мутагенез остатков CDR и/или каркасных областей описан, например, в: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson etal, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» или «гомология» применительно к последовательностям полипептидов и антител, указанным здесь, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в полипептиде, с которым проводят сравнение, после выравнивания последовательностей с учетом любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть осуществлено различными способами, входящими в компетенцию специалиста в данной области, например, с применением общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или MegAlign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания с целью измерения, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако в настоящей заявке для этих целей значения % идентичности аминокислотных последовательностей получены с применением компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Автором компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2 является Genentech, Inc., и ее исходный код был подан с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования на операционной системе UNIX, предпочтительно Digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не меняются.

При использовании здесь термин «специфичное связывание», или «специфично связывается с», или «специфичен в отношении» определенного полипептида или эпитопа определенного полипептида-мишени может быть представлен, например, молекулой, имеющей K_D в отношении мишени по меньшей мере приблизительно 10^-4М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-5 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-6 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-7М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-8 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-9 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-10 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-11 М, альтернативно по меньшей мере приблизительно 10^-12М или более. В некоторых воплощениях термин «специфичное связывание» относится к связыванию, где молекула связывается с определенным полипептидом или эпитопом определенного полипептида без существенного связывания с каким-либо другим полипептидом или эпитопом другого полипептида. K_D может быть определена методами, известными в данной области, такими как ELISA, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), анализ сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитация (RIA). Специфичное связывание может быть оценено, например, определением связывания молекулы в сравнении со связыванием контрольной молекулы, обычно представляющей собой молекулу сходной структуры, не обладающую связывающей активностью. Например, специфичное связывание может быть определено конкуренцией с контрольной молекулой, сходной с мишенью, например, с избытком немеченой мишени. В данном случае признаком специфичного связывания является конкурентное ингибирование связывания меченой мишени с зондом под действием избытка немеченой мишени.

При использовании здесь «лечение» представляет собой способ получения полезных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Для задач данной заявки полезные или желаемые клинические результаты включают, без ограничения, одно или более из следующего: облегчение одного или более чем одного симптома, являющегося результатом заболевания, уменьшение степени выраженности заболевания, стабилизацию заболевания (например, предотвращение или задержку ухудшения заболевания), предотвращение или задержку распространения (например, метастазирования) заболевания, предотвращение или задержку рецидивирования заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение болезненного состояния, обеспечение ремиссии (частичной или полной) заболевания, снижение дозы одного или более чем одного другого лекарственного средства, необходимого для лечения заболевания, задержку прогрессирования заболевания, повышение или улучшение качества жизни, увеличение прибавки массы тела и/или повышение выживаемости. «Лечение» также охватывает уменьшение патологических последствий рака (таких как, например, объем опухоли). Способы, предложенные здесь, предполагают любой один или более чем один из этих аспектов лечения.

«Эффективное количество» агента, связывающегося с CD8, или композиции, как раскрыто здесь, представляет собой количество, достаточное для решения конкретно заявленной задачи, например, для визуализации CD8⁺ Т-клеток in vivo. «Эффективное количество» может быть определено эмпирически и известными методами, относящимися к заявленной задаче (такой как визуализация CD8⁺ Т-клеток in vivo).

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, например, иммунотерапевтического агента (такого как иммунотерапевтический агент, описанный в других разделах настоящей заявки), клеточной терапии или противораковой вакцины, эффективному для «лечения» заболевания или расстройства у субъекта (например, млекопитающего, такого как человек). В случае рака терапевтически эффективное количество иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины позволяет: уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер или массу опухоли; ингибировать (например, в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) инфильтрацию периферических органов раковыми клетками; ингибировать (например, в некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; в некоторой степени ингибировать рост опухоли; и/или в некоторой степени облегчать один или более чем один симптом, ассоциированный с раком. В той степени, в которой иммунотерапевтический агент, клеточная терапия или противораковая вакцина позволяют предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, они могут быть цитостатическими и/или цитотоксическими. В некоторых воплощениях терапевтически эффективное количество представляет собой количество, ингибирующее рост. В другом воплощении терапевтически эффективное количество представляет собой количество, повышающее выживаемость у пациента. В другом воплощении терапевтически эффективное количество представляет собой количество, повышающее выживаемость без прогрессирования у пациента.

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, без ограничения, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся людьми, таких как макаки-резусы и яванские макаки), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых воплощениях индивид или субъект представляет собой человека.

При использовании здесь «чувствительность» относится к развитию благоприятного ответа, когда субъект проходит или прошел лечение терапевтическим агентом (например, иммунотерапевтическим агентом). Примером благоприятного ответа является ингибирование роста опухоли у субъекта во время или после лечения терапевтическим агентом (например, иммунотерапевтическим агентом), в то время как примером неблагоприятного является продолжение роста или ускорение роста опухоли у субъекта во время или после лечения терапевтическим агентом (например, иммунотерапевтическим агентом).

При использовании здесь «мониторинг прогрессирования заболевания» относится к оценке субъекта (например, субъекта, у которого диагностирован рак, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина») в следующих друг за другом временных интервалах для определения ухудшения, стабилизации или улучшения (то есть уменьшения степени выраженности) симптомов заболевания. Например, мониторинг прогрессирования рака у субъекта может, в определенных случаях, включать мониторинг изменений массы или размера опухоли (таких как регрессирование опухоли или рост опухоли), времени до прогрессирования, выживаемости, выживаемости без прогрессирования, общей частоты ответа, продолжительности ответа, качества жизни, экспрессии и/или активности маркеров заболевания (например, экспрессии определенных генов и/или белков) или других критериев, известных в данной области. Возможно применение дополнительных способов мониторинга прогрессирования заболевания у пациента с раком, включая, например, оценку ответа на лечение с применением методик визуализации, описанных более подробно в других разделах настоящей заявки.

При использовании здесь «мониторинг хода лечения» относится к оценке субъекта (например, субъекта, у которого диагностирован рак, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина») в следующих друг за другом временных интервалах во время или после лечения (например, иммунотерапевтическим агентом) для определения ухудшения, стабилизации или улучшения (то есть уменьшения степени выраженности) симптомов заболевания в результате лечения. Например, мониторинг хода лечения у субъекта (например, субъекта, получившего или получающего лечение иммунотерапевтическим агентом) можно проводить с применением тех же критериев, что применяют для мониторинга прогрессирования заболевания.

При использовании здесь «фармацевтически приемлемый» или «фармацевтически совместимый» обозначают вещество, не являющееся биологически или иным образом нежелательным, например, вещество может быть включено в фармацевтическую композицию, вводимую пациенту, не вызывая каких-либо существенных нежелательных биологических эффектов или вредного взаимодействия с какими-либо из других компонентов композиции, в состав которой оно входит.Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты предпочтительно соответствуют необходимым стандартам токсикологического и производственного тестирования и/или включены в Руководство по неактивным ингредиентам (Inactive Ingredient Guide), подготовленное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США.

При использовании здесь «вместе с» относится к времени введения, например, агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, относительно введения второго агента, например, иммунотерапевтического агента. Например, введение агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, вместе с иммунотерапевтическим агентом означает, что агент, связывающийся с CD8, может быть введен до введения иммунотерапевтического агента, после введения иммунотерапевтического агента, параллельно с введением иммунотерапевтического агента или одновременно с введением иммунотерапевтического агента. Дополнительные агенты могут быть введены до или после введения агента, связывающегося с CD8, и иммунотерапевтического агента. Дополнительно или альтернативно, другие агенты могут быть введены между последовательным введением агента, связывающегося с CD8, и иммунотерапевтического агента.

Подразумевается, что термин «выявление» включает определение присутствия или отсутствия вещества или определение количества вещества (такого как CD8). Таким образом, данный термин относится к применению веществ, композиций и способов по настоящему изобретению для качественного и количественного определения. Обычно конкретная методика, применяемая для выявления, не имеет критического значения для практического применения способов по настоящему изобретению. Например, «выявление» согласно способам, описанным здесь, может включать: наблюдение присутствия или отсутствия полипептида CD8 или изменения уровней полипептида CD8. В некоторых воплощениях «выявление» может включать выявление уровней CD8 дикого типа (например, уровней мРНК или полипептида). Выявление может включать количественное определение изменения (увеличение или уменьшение) на любое значение от 10% до 90% или на любое значение от 30% до 60% или более 100% по сравнению с контролем. Выявление может включать количественное определение изменения любой кратности от 2-кратного до 10-кратного включительно или более, например, 100-кратного.

При использовании здесь слово «метка» относится к соединению или композиции, поддающимся выявлению и конъюгированным прямым или непрямым образом с антителом (например, VHH). Сама метка может поддаваться выявлению сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать поддающееся выявлению химическое изменение соединения-субстрата или композиции-субстрата.

Ссылка на «приблизительное» значение или параметр относится здесь к обычному диапазону погрешности соответствующего значения, который хорошо известен специалисту в данной области. Ссылка на «приблизительное» значение или параметр включает (и описывает) здесь аспекты, направленные непосредственно на это значение или параметр. Например, описание с указанием «приблизительно X» включает описание «X».

Следует понимать, что аспекты и воплощения настоящего изобретения включают аспекты и воплощения, «включающие»/«содержащие», «состоящие» и «состоящие по существу из».

Если контекстом ясно не продиктовано иное, при использовании здесь и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число.

Подразумевается, что термин «и/или», использованный здесь в такой фразе, как «А и/или В», включает «А и В», «А или В», «А» (само по себе) и «В» (само по себе). Сходным образом, подразумевается, что термин «и/или», использованный здесь в такой фразе, как «А, В и/или С», охватывает каждое из следующих воплощений: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (само по себе); В (само по себе); и С (само по себе).

Следует понимать, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных воплощений, могут также быть представлены в комбинации в одном воплощении. Наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного воплощения, могут также быть представлены по отдельности или в любой подходящей субкомбинации. Все комбинации воплощений, относящихся к агентам, связывающимся с CD8, и к способам их применения прямо охвачены настоящим изобретением и раскрыты здесь точно так же, как если бы каждая комбинация была прямо раскрыта здесь по отдельности.

Агенты, связывающиеся с CD8

а. Функциональные характеристики

Агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH (например, VHH представителя семейства Верблюдовых или гуманизированный VHH) и имеет одну или более чем одну из следующих характеристик: (а) агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 1 нМ или менее; (б) агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,002/с или менее (например, приблизительно 0,0018/с или приблизительно 0,00085/с); (в) агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 1 нМ или менее; (г) агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,004/с или менее (например, приблизительно 0,0037/с или приблизительно 0,0019/с); (д) агент, связывающийся с CD8, не ингибирует и не стимулирует активацию CD8⁺ Т-клеток; (е) агент, связывающийся с CD8, не индуцирует пролиферацию CD8⁺ Т-клеток; и (ж) агент, связывающийся с CD8, не связывается с CD4⁺клетками. В некоторых воплощениях домен VHH имеет одну или более чем одну характеристику агента, связывающегося с CD8, описанного здесь. В некоторых воплощениях меченый домен VHH (например, домен VHH, конъюгированный с выявляемой меткой) имеет одну или более чем одну характеристику агента, связывающегося с CD8, описанную здесь.

Агент, связывающийся с CD8, описанный здесь, связывается с CD8 с высокой аффинностью и специфичностью. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^-9 М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^{- 12} М), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 макака-резуса с K_D приблизительно 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^-9 М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^-12 М), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^{- 9} М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^-12 М), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с: (а) человеческим CD8 с K_D приблизительно 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^-9 М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^-12 М), включая любое значение или диапазон между этими значениями; (б) CD8 макака-резуса с K_D приблизительно 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^-9 М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^-12 М), включая любое значение или диапазон между этими значениями; и (в) CD8 яванского макака с K_D приблизительно 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,25 нМ, 0,2 нМ, 0,15 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,02 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или менее (например, 10^-9 М или менее, например, от 10^-9 М до 10^-13 М или от 10^-10 М до 10^-12 М), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 150 пМ или менее и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 350 пМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 132 пМ и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 344 пМ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 50 пМ или менее и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 150 пМ или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 50 пМ и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 137 пМ. В некоторых воплощениях CD8 представляет собой CD8α. В некоторых воплощениях CD8 представляет собой гомодимер CD8α/CD8α. В некоторых воплощениях CD8 представляет собой гетеродимер CD8α/CD8β\

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,0002/с, 0,0001/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 макака-резуса с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,002/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,002/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с: (а) человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,0002/с, 0,0001/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями; (б) CD8 макака-резуса с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,002/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями; CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,01/с, 0,005/с, 0,002/с, 0,001/с, 0,0005/с, 0,004/с, 0,003/с, 0,002/с, 0,0015/с, 0,001/с, 0,0005/с или менее (например, 10^-2/с или менее, например, от 10^-5/с до 10^-2/с или от 10^-4/с до 10^-3/с), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD 8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,002/с или менее и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,004/с или менее. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,0018/с и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,0037/с.В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,001/с и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,002/с.В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,00085/с и агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,0019/с.В некоторых воплощениях CD8 представляет собой CD8α. В некоторых воплощениях CD8 представляет собой гомодимер CD8α/CD8α. В некоторых воплощениях CD8 представляет собой гетеродимер CD8α/CD8β.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с человеческим CD8 с временем половинного снижения связывания с CD8 (например, в анализе связывания in vitro) приблизительно 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа или более (например, по меньшей мере 15 минут, например, от 15 минут до 6 часов или от 30 минут до 2 часов), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 макака-резуса с временем половинного снижения связывания с CD8 приблизительно 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа или более (например, по меньшей мере 15 минут, например, от 15 минут до 6 часов или от 30 минут до 2 часов), включая любое значение или диапазон между этими значениями. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, связывается с CD8 яванского макака с временем половинного снижения связывания с CD8 приблизительно 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа или более (например, по меньшей мере 15 минут, например, от 15 минут до 6 часов или от 30 минут до 2 часов), включая любое значение или диапазон между этими значениями.

K_D и k_off агентов, связывающихся с CD8, предложенных здесь, применительно к человеческому CD8, CD8 макака-резуса и/или CD8 яванского макака могут быть определены любым методом, известным в данной области, включая, без ограничения, ELISA, анализ сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), радиоиммунопреципитацию (RIA) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых воплощениях K_D и/или k_off агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь, применительно к человеческому CD8, CD8 макака-резуса и/или CD8 яванского макака определены посредством SPR. В некоторых воплощениях K_D агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь, применительно к человеческому CD8, CD8 макака-резуса и/или CD8 яванского макака определена посредством FACS. Типичные аминокислотные последовательности человеческого CD8α, CD8α макака-резуса и CD8α яванского макака показаны на ФИГ. 2.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) с мышиным CD8. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) с крысиным CD8. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) ни с мышиным CD8, ни с крысиным CD8, например, как определено посредством SPR и/или FACS.

Характеристики агентов, связывающихся с CD8, описанных здесь, могут быть оценены с применением хорошо известных методов, например, методов, применяемых в приведенных ниже Примерах. В некоторых воплощениях проводят оценку пролиферации CD8⁺ Т-клеток in vitro в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь. В некоторых воплощениях проводят оценку пролиферации CD8⁺ Т-клеток in vitro в присутствии РВМС, антитела против CD3, антитела против CD28 и агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь. В некоторых воплощениях проводят оценку пролиферации CD8⁺ Т-клеток in vitro в присутствии РВМС, стимулированных энтеротоксином В Staphylococcus (SEB), и агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь. В некоторых воплощениях проводят оценку пролиферации CD8⁺ Т-клеток in vitro в присутствии РВМС, стимулированных пулом пептидов CEF, и агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь. В некоторых воплощениях проводят оценку пролиферации CD8⁺ Т-клеток in vitro в присутствии РВМС, стимулированных липополисахаридом (LPS), и агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь. В некоторых воплощениях in vitro-шализ проводят с использованием 10%-й FBS в качестве среды. В некоторых воплощениях in wrro-анализ проводят с использованием 10%-й аутологичной донорской плазмы в качестве среды, где донорская плазма и РВМС получены от одного и того же донора.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) с человеческими CD4⁺ Т-клетками. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) с человеческими CD3" клетками. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, не связывается (например, не демонстрирует специфичного связывания) ни с человеческими CD4⁺ Т-клетками, ни с человеческими CD3" клетками. В некоторых воплощениях отсутствие специфичного связывания агента, связывающегося с CD8, предложенного здесь, с человеческими CD4⁺ Т-клетками или человеческими CD3" клетками выявляют сортировкой клеток с активацией флуоресценции (FACS), как обсуждено в Примерах.

Здесь предложены типичные агенты, связывающиеся с CD8 (включая антитела против CD8 и их фрагменты), имеющие одну или более чем одну из функциональных характеристик, описанных выше. В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, специфично связывающийся с эпитопом человеческого CD8α, содержащим Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97, где нумерация аминокислот соответствует SEQ ID NO: 13. Также предложен эпитоп человеческого CD8α, содержащий Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97, где нумерация аминокислот соответствует SEQ ID NO: 13. В некоторых воплощениях аминокислотные остатки эпитопа человеческого CD8α расположены в пределах приблизительно 4,5 А (0,45 нм) от одного или более чем одного аминокислотного остатка домена VHH в кристаллической структуре агента, связывающегося с CD8, или домена VHH, связанного с человеческим CD8α. Кроме того, предложено антитело против CD8, конкурентно связывающееся с тем же эпитопом CD8α, что любой из агентов, связывающихся с CD8 (например, VHH против CD8), описанных здесь.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH представителя семейства Верблюдовых, специфично связывающийся с человеческим CD8. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит гуманизированный домен VHH, специфично связывающийся с человеческим CD8.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий по меньшей мере один, два или три CDR в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий по меньшей мере один, два или три CDR, выбранные из: (a) CDR1, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7; (6) CDR2, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9; и (в) CDR3, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: l 1 или SEQ ID NO: 12.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, который содержит CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: l.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, который содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, который содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, который содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В некоторых воплощениях предложен агент, связывающийся с CD8, содержащий домен VHH, который содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Типичные последовательности CDR показаны на ФИГ. 1 и в Таблице 1 ниже.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, содержащий L49A, где нумерация соответствует нумерации Kabat. Примеры мутаций L49A показаны в SEQ ID NO: 2-4 на ФИГ. 1. В некоторых воплощениях мутация L49A позволяет проводить очистку агента, связывающегося с CD8, с использованием колонки с белком А. В некоторых воплощениях мутация L49A повышает выход агента, связывающегося с CD8, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз или более.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, содержащий одну или более чем одну мутацию каркасной области, снижающую иммуногенность домена VHH, например, снижающую связывание агента, связывающегося с CD8, с предсуществующими антителами против VHH у субъекта, получающего агент, связывающийся с CD8. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, содержащий одну или более чем одну аминокислотную модификацию, выбранную из группы, состоящей из замены V89T, замены T110Q, замены S112Q и добавления А114, где нумерация соответствует нумерации Kabat. В некоторых воплощениях домен VHH содержит замену V89T, замену T110Q, замену S112Q и добавление А114, где нумерация соответствует нумерации Kabat. Примеры этих мутаций показаны в SEQ ID NO: 2-4 на ФИГ. 1. В некоторых воплощениях мутации каркасных областей снижают иммуногенность агента, связывающегося с CD8, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 10 раз, в 100 раз, в 1000 раз или более.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: l. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит домен VHH, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Типичные последовательности VHH показаны на ФИГ. 1.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, подвержен почечному клиренсу. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, подвержен почечному клиренсу (например, преимущественно почечному клиренсу).

В некоторых воплощениях предложены антитела против CD8. В некоторых воплощениях предложены тяжелоцепочечные антитела против CD8, содержащие любой из доменов VHH, описанных здесь. В некоторых воплощениях тяжелоцепочечное антитело против CD8 содержит Fc-область, такую как Fc-область представителя семейства Верблюдовых или человеческая Fc-область. В некоторых воплощениях тяжелоцепочечное антитело против CD8 содержит Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее вариант. В некоторых воплощениях антитело против CD8, предложенное здесь, содержит вариант Fc, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для применений, где важен период полувыведения антитела in vivo, но определенные эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) не являются необходимыми или вредны.

В некоторых воплощениях предложены фрагменты антител против CD8, такие как однодоменное антитело против CD8 или VHH против CD8.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не содержит Fc-область.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит одну или более чем одну небелковую группировку. Группировки, подходящие для дериватизации антитела, включают, без ограничения, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, без ограничения, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо неупорядоченные сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может быть предпочтителен при производстве благодаря его стабильности в воде. Молекулярная масса полимера может быть любой, и он может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и в случае присоединения более чем одного полимера они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. Обычно число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть определены, исходя из соображений, включающих, без ограничения, конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, или возможное применение производного антитела в терапии при определенных условиях, и так далее.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не содержит небелковую группировку, увеличивающую период полувыведения агента из сыворотки. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, не содержит растворимый полимер, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

б. Варианты и модификации В некоторых воплощениях предусмотрены варианты аминокислотных последовательностей агентов, связывающихся с CD8 (например, антител против CD8), описанных здесь. Например, может быть желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства агента, связывающегося с CD8. Варианты аминокислотной последовательности агента, связывающегося с CD8, могут быть получены введением подходящих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях (например, в одной или более чем одной последовательности CDR и/или каркасных областей или в домене VHH) агента, связывающегося с CD8. Для получения конечной конструкции может быть проведена любая комбинация делеции, вставки и замены, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками (например, как описано в других разделах настоящей заявки).

«Вариант агента, связывающегося с CD8», означает полипептид, например, агент, связывающийся с CD8, обладающий желаемыми характеристиками, описанными здесь, содержит VHH, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере приблизительно на 80% идентична VHH агента, связывающегося с CD8, описанного здесь. Такие варианты агента, связывающегося с CD8, включают, например, агенты, где добавлен или удален один или более чем один аминокислотный остаток домена VHH. Обычно аминокислотная последовательность варианта агента, связывающегося с CD8, будет по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, альтернативно по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична агенту, связывающемуся с CD8, описанному здесь. Возможно, варианты агентов, связывающихся с CD8, будут иметь не более чем одну консервативную аминокислотную замену по сравнению с последовательностью агента, связывающегося с CD8, предложенной здесь, альтернативно, не более чем приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с последовательностью агента, связывающегося с CD8, предложенной здесь В некоторых воплощениях предложены варианты агентов, связывающихся с CD8, имеющие одну или более чем одну аминокислотную замену, вставку и/или делецию. Сайты, представляющие интерес с точки зрения мутагенеза с применением замен, включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Таблице 2 под заголовком «Консервативные замены». Более существенные изменения представлены в Таблице 2 под заголовком «Типичные замены», и как описано более подробно ниже с указанием классов аминокислот по боковой цепи. В интересующее антитело могут быть введены аминокислотные замены, и может быть проведен скрининг продуктов на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания с антигеном, снижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.

Существенные изменения биологических свойств варианта агента, связывающегося с CD8, могут быть достигнуты выбором замен, значительно различающихся по их эффекту на поддержание: (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации; (б) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте; или (в) объема боковой цепи. Аминокислоты могут быть сгруппированы по сходным свойствам их боковых цепей (в A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro P), Phe (F), Trp (W), Met (M);

2) незаряженные полярные: Gly(G), Ser (S), Thr(T), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q);

3) кислые: Asp (D), Glu (E);

4) основные: Lys (K), Arg (R), His (H).

Альтернативно, встречающиеся в природе аминокислотные остатки разделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:

1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) кислые: Asp, Glu;

4) основные: His, Lys, Arg;

5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены будут включать замену представителя одного из этих классов другим классом.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, предложенный здесь, содержит домен VHH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная последовательность VHH содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, но агент, связывающийся с CD8, содержащий эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с CD8 (например, человеческим CD8, CD8 макака-резуса и/или CD8 яванского макака). В некоторых воплощениях в SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 проведены замены, вставки и/или делеции в общей сложности от 1 до 10 аминокислот.В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции проведены в областях вне CDR (то есть в FR). В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, содержит последовательность VHH, представленную в SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, включая посттрансляционные модификации этой последовательности.

Один тип варианта с заменами включает замену одного или более чем одного остатка гипервариабельного участка исходного антитела (например, VHH ламы или гуманизированного VHH). Обычно полученный вариант (варианты), выбранный для дальнейшего изучения, будет иметь изменения (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) по сравнению с исходным антителом и/или будет по существу сохранять определенные биологические свойства исходного антитела. Типичный вариант с заменами представляет собой антитело, прошедшее созревание аффинности, которое может легко быть получено, например, с применением методик созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как описанные здесь. Кратко, проводят мутации одного или более чем одного остатка HVR и представление вариантов антител на фаге с последующим скринингом на предмет определенной биологической активности (например, аффинности связывания).

Возможны изменения (например, замены) в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть внесены в «горячие точки» HVR, то есть остатки, кодируемые кодонами, подверженными частым мутациям в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или SDR (a-CDR), с анализом полученных вариантов VHH на предмет аффинности связывания. Созревание аффинности посредством конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom etal. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien etal., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых воплощениях созревания аффинности вариабельные гены, выбранные для созревания, диверсифицируют любым из множества методов (например, ПЦР пониженной точности, перестановкой цепей или олигонуклеотид-направленным мутагенезом). Затем получают вторичную библиотеку. После этого проводят скрининг библиотеки для идентификации любых вариантов антитела с желаемой аффинностью. Другой метод диверсификации включает HVR-направленные методики, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки HVR, вовлеченные в связывание с антигеном, могут быть конкретно определены, например, с применением мутагенеза методом аланинового сканирования или при моделировании. В частности, частой мишенью таких методов является CDR3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут быть проведены в пределах одного или более чем одного CDR, при условии, что такие изменения не приводят к существенному снижению способности агента, связывающегося с CD8, к связыванию с CD8. Например, в CDR могут быть проведены консервативные изменения (например, консервативные замены, предложенные здесь), не приводящие к существенному снижению аффинности связывания. Такие изменения могут быть проведены вне «горячих точек» CDR или SDR. В некоторых воплощениях последовательностей вариантов VHH, предложенных выше, каждый HVR либо не изменен, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Полезный метод определения остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями мутагенеза, назван «мутагенезом методом аланинового сканирования», как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В данном методе определяют остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и заменяют их нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), определяя возможный эффект на взаимодействие антитела с антигеном. В аминокислотных положениях, демонстрирующих функциональную чувствительность к начальным заменам, могут быть проведены дополнительные замены. Альтернативно или дополнительно, анализируют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для определения точек контакта антитела с антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть стать мишенями или быть устранены как кандидаты на замену. Может быть проведен скрининг вариантов на предмет желаемых свойств.

Вставки аминокислотных последовательностей включают N- и/или С-концевые слияния, длина которых варьирует от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метиониновым остатком. Другие варианты антител с вставками включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, увеличивающим период полувыведения антитела из сыворотки.

Иммуноконъюгаты, содержащие детектируемые метки

В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представляет собой иммуноконъюгат, содержащий любое из антител к CD8 (например, анти-CD8 VHH), описанных в настоящем документе, конъюгированное с обнаруживаемой меткой. Термин «метка» или «детектируемая метка» относится к атому, молекуле или соединению, которое полезно для диагностики, обнаружения или визуализации/визуализации местоположения и/или количества молекулы-мишени (такой как CD8) на клетке, ткани, органе и тому подобное. Детектируемые метки, которые можно использовать в соответствии с воплощениями в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные вещества (например, радиоизотопы, радионуклиды, радиометки или радиоактивные индикаторы), красители (например, IndoCyanine Green (ICG)), контрастные вещества, флуоресцентные соединения или молекулы, биолюминесцентные соединения или молекулы, ферменты и усиливающие агенты (например, парамагнитные ионы). Кроме того, некоторые наночастицы, например, квантовые точки и наночастицы металлов, могут быть пригодны для использования в качестве агента обнаружения.

Радиоактивные вещества, которые можно использовать в качестве детектируемых меток в соответствии с воплощениями настоящего документа, включают, но не ограничиваются ими, ¹⁸F, ³²Р, ³³Р, ⁴⁵Ti, ⁴⁷Sc, ⁵²Fe, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁵Sc, ⁷⁷As, ⁸⁶Y, ⁸⁹Sr, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁰Nb, ⁹⁴Tc, ⁹⁹Tc, ⁹⁹mTc, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Pd, ¹⁰⁵Rh, ⁿⁱAg, ^mIn, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ^154-158Gd, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹¹Pb, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra, и ²²⁵Ac. Примерами парамагнитных ионных веществ, которые можно применять в качестве детектируемых меток, включают, но не ограничиваются ими, ионы переходных и лантаноидных металлов (например, металлов с атомными номерами от 6 до 9, от 21 до 29, от 42 до 44 или от 57 до 71). К таким металлам относятся ионы Cr, V, Mn, Fe, Со, Ni, Cu, La, Се, Pr, Nd, Pm, Sm, Ей, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb и Lu.

Когда детектрируемая метка представляет собой радиоактивный ион металла или парамагнитный ион, в некоторых воплощениях метка может реагировать с реагентом, имеющим длинный «хвост» с одной или несколькими хелатирующими группами, присоединенными к длинному «хвосту» для связывания этих ионов. Длинный «хвост» может представлять собой полимер, такой как полилизин, полисахарид или другие дериватизированные или дериватизируемые цепи, имеющие боковые группы, с которыми может быть связана хелатирующая группа (т.е. для связывания ионов). Примеры хелатирующих групп, которые можно использовать в соответствии с воплощениями настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), DOTA, NOIA, NOGADA, NETA, NODA, NOTA, дефероксамин (DfO), DFO* (т.е. DFO «со звездочкой»), DFO-скварамид, порфирины, полиамины, макроциклические эфиры, бис-тиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы. Хелат может быть связан с анти-CD8-антителом (например, анти-CD8 VHH), представленным в настоящем документе, группой, которая позволяет образовывать связь с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренним перекрестным связыванием. Те же хелаты в комплексе с нерадиоактивными металлами (например, марганцем, железом и гадолинием) можно использовать для магнитно-резонансной томографии (МРТ) при использовании вместе с агентами, связывающими CD8, описанными в настоящем документе. Макроциклические хелаты, такие как NOIA, NOGADA, DOTA, NODA, NOTA и TETA, можно использовать с различными металлами и радио металлами, включая, но не ограничиваясь ими, например, радионуклиды галлия, иттрия и меди. Могут быть использованы другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические простые полиэфиры, которые представляют интерес для стабильного связывания радионуклидов, такие как радий-223 для лечения радиоактивным йодом (RAIT). В некоторых воплощениях хелатирующие фрагменты можно использовать для присоединения визуализирующего агента для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), такого как комплекс алюминия-¹⁸F, к агенту, связывающему CD8, представленному в настоящем документе для использования в анализе ПЭТ. Комплекс алюминий-¹⁸F может быть конъюгирован с доменом VHH с помощью удерживающего комплексообразователя (RESCA), такого как соединение формулы (I):

См., например, US 20180273441 А1 и Cleeren F. et al. Nature Protocols 13, 2330-2347 (2018).

В некоторых воплощениях предложен связывающий CD8 агент, содержащий любой из VHH-доменов анти-CD8, описанных в настоящем документе, конъюгированный с радионуклидной меткой, такой как ¹⁸F. В некоторых воплощениях домен VHH конъюгирован с меткой через хелатирующий фрагмент. В некоторых воплощениях хелатирующий фрагмент ковалентно связан с доменом VHH через остаток лизина. В некоторых воплощениях радионуклидная метка содержится в комплексе металла. В некоторых воплощениях радионуклидная метка образует комплекс с металлом, при этом комплекс хелатируется хелатирующей частью. В некоторых воплощениях связывающий CD8 агент содержит домен VHH анти-CD8, конъюгированный с хелатирующий фрагментом, который хелатирует комплекс, содержащий метку ¹⁸F и алюминий. В некоторых воплощениях хелатирующий фрагмент представляет собой соединение формулы (I).

В некоторых воплощениях предложен связывающий CD8 агент, содержащий любой из VHH-доменов анти-CD8, описанных в настоящем документе, конъюгированный с комплексом ¹⁸F-алюминий через соединение формулы (I).

В некоторых воплощениях предложен связывающий CD8 агент, содержащий домен VHH, конъюгированный с комплексом ¹⁸F-алюминий через соединение формулы (I), где домен VHH содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В некоторых воплощениях предложен связывающий CD8 агент, содержащий домен VHH, конъюгированный с комплексом ¹⁸Е-алюминий через соединение формулы (I), где домен VHH содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Примеры контрастных веществ, которые можно использовать в качестве детектируемых меток в соответствии с вариантами осуществления способов и композиций в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, барий, диатризоат, этиодированное масло, цитрат галлия, йокарминовую кислоту, йоцетаминовую кислоту, йодамид, йодипамид., йодоксамовая кислота, йогуламид, йогексил, йопамидол, йопановая кислота, йопроцемовая кислота, йозефамовая кислота, йозериновая кислота, иозуламид меглюмин, йосеметиновая кислота, йотасул, йотетривая кислота, йоталамовая кислота, йотроксова кислота, йоксагликовая кислота, йоксотризоевая кислота, йоподат, меглумин, метризамид, метризоат, пропилиодон, хлористый таллий или их комбинации.

Биолюминесцентные и флуоресцентные соединения или молекулы и красители, которые можно использовать в качестве детектируемых меток в соответствии с описанными здесь способами и композициями, включают, но не ограничиваются ими, например, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), OREGON GREEN™, родамин, техасский красный, IRDye800CW, ALEXA FLUOR^® 647, тетрародимина изотиоцинат (TRITC), Су3, Су5 и т.п.), флуоресцентные маркеры (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), фикоэритрин и т.п.), автогасящиеся флуоресцентные соединения, которые активируются опухолеассоциированными протеазами, ферментами (например, люциферазой, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и т.п.), наночастицами, биотином, дигоксигенином или их комбинацией.

Ферменты, которые можно использовать в качестве обнаруживаемых меток в соответствии с описанными здесь способами и композициями, включают, но не ограничиваются ими, например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, кислую фосфатазу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, бета-глюкоронидазу или бета-лактамазу. Такие ферменты могут быть использованы в сочетании с хромогеном, флуорогенным соединением или люминогенным соединением для получения детектируемого сигнала.

В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представленный в настоящем документе, конъюгирован с наночастицей, то есть микроскопической частицей, размер которой измеряется в нанометрах. Например, наночастица представляет собой частицу, по крайней мере, с одним измерением менее примерно 100 нм. Наночастицы можно использовать в качестве детектируемых веществ, поскольку они достаточно малы, чтобы рассеивать видимый свет, а не поглощать его. Например, наночастицы золота обладают значительными свойствами поглощения видимого света и в растворе кажутся от темно-красного до черного. В результате агенты, связывающие CD8, представленные в настоящем документе, которые были конъюгированы с наночастицами, могут быть использованы для визуализации Т-клеток in vivo у субъекта. Вследствие малого диапазона размеров наночастицы часто называют кластерами. Были сформированы металлические, диэлектрические и полупроводниковые наночастицы, а также гибридные структуры (например, наночастицы ядро-оболочка). Наносферы, наностержни и наночашки - это лишь некоторые из форм, которые были созданы. Полупроводниковые квантовые точки и нанокристаллы являются примерами дополнительных типов наночастиц. Такие наночастицы при конъюгации с анти-СВ8-антителом (например, анти-CD8 VHH), представленным в настоящем документе, можно использовать в качестве визуализирующих агентов для выявления Т-клеток in vivo, как описано в настоящем документе.

Конъюгаты антитела и метки могут быть получены с использованием различных бифункциональных связывающих белков агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и биоактивные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получить, как описано у Vitetta et at, Science 238:1098 (1987). Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является типичным хелатирующий агентом для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, могут быть использованы кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметиллинкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент US 5208020) Иммуноконъюгаты в данном документе включают, но не ограничиваются ими, такие конъюгаты, полученные с использованием сшивающих реагентов, включая, но не ограничиваясь ими, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB., SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые имеются в продаже (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США). В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представленный в настоящем документе, содержит линкер, который представляет собой соединение десферриоксамина (см., например, Vugts et al. (2017) Eur J Nucl Med Mol Imaging. 44:286-295 и Rudd et al. (2016) Chem Commun., 52: 11859-12000). В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представленный в настоящем документе, содержит линкер N-сукцинил-десферриоксамин (DFO). В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представленный в настоящем документе, содержит анти-CD8 VHH, конъюгированный с радионуклидом (например, включая, помимо прочего, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I или F) посредством соединения десферриоксамина (например, N-сукцинил-десферриоксамина). В некоторых воплощениях метка конъюгирована с доменом VHH анти-CD8 сайт-специфическим образом, например, с использованием фермента.

В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представленный в настоящем документе, содержит VHH-домен против CD8, непосредственно связанный с детектируемой меткой (т.е. без линкера).

Способы получения агентов, связывающих CD8

Также в настоящем документе представлены способы получения агентов, связывающих CD8, описанные в настоящем документе, включая способы получения антител к CD8 (например, анти-CD8 VHH) и способы получения меченых агентов, связывающих CD8.

Антитела к CD8 (например, VHH к CD8), описанные в настоящем документе, могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте US №6015695. В некоторых воплощениях предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD8-антитело (например, анти-CD8 VHH), описанное в настоящем документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VHH-домен анти-CD8. В некоторых воплощениях предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая VHH-домен против CD8, где нуклеиновая кислота содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4

В некоторых воплощениях предложен вектор (например, вектор экспрессии), содержащий нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе. В некоторых воплощениях предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту или вектор. В некоторых воплощениях клетка-хозяин является эукариотической, например клетка яичника китайского хомячка (СНО), клетка Expi293 или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NSO, Sp20). В некоторых воплощениях клетка-хозяин является прокариотической, например клетка кишечной палочки. В некоторых воплощениях предложен способ получения анти-CD8-антитела (например, анти-CD8 VHH), включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела и, возможно выделения антитела из клетки-хозяина (или среды для культивирования клеток-хозяев).

Кроме того, предложены способы получения меченого CD8-связывающего агента, включающие конъюгирование хелатирующего фрагмента с любым из анти-CD8-антител (например, анти-CD8 VHH), описанных в настоящем документе, с получением конъюгата, содержащего анти-CD8-антитело и хелатирующий фрагмент и приведение конъюгата в контакт с комплексом фторида алюминия, содержащим ¹⁸F, с получением меченого CD8-связывающего агента, где хелатирующий фрагмент представляет собой соединение формулы (I). В некоторых воплощениях хелатирующий фрагмент конъюгирован с остатком лизина антитела против CD8. В некоторых воплощениях конъюгат контактирует с комплексом фторида алюминия в присутствии одного или нескольких антиоксидантных соединений. В некоторых воплощениях одно или несколько антиоксидантных соединений включают метионин и/или N-ацетилтриптофан. В некоторых воплощениях конъюгат контактирует с комплексом фторида алюминия в присутствии метионина и N-ацетилтриптофана. В некоторых воплощениях способ включает очистку меченого CD8-связывающего агента из реакционной смеси, содержащей конъюгат и фторид алюминия, на колонке для обессоливания. В некоторых воплощениях обессоливающую колонку уравновешивают буфером, содержащим гистидин, метионин, N-ацетилтриптофан и/или сахарозу. В некоторых воплощениях обессоливающую колонку уравновешивают буфером, содержащим гистидин, метионин, N-ацетилтриптофан и сахарозу.

Для рекомбинантного получения анти-CD8-антитела (например, анти-CD8 VHH) нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, выделяют и встраивают в вектор для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделить и секвенировать с использованием стандартных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, включают описанные здесь прокариотические или эукариотические клетки. Например, антитела могут продуцироваться бактериями, в частности, когда не требуются гликозилирование и эффекторная функция Fc. Об экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты US 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, описывающую экспрессию фрагментов антител в Е. coli.). После экспрессии антитело может быть выделено из массы бактериальных клеток в виде растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.

Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, являются эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к продукции антитела с частично или полностью человеческим паттерном гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Подходящие клетки-хозяев а для экспрессии гликозилированного антитела также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры клеток растений также могут быть использованы в качестве хозяев. См., например, патенты US 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

Клетки позвоночных также могут быть использованы в качестве хозяев. Например, могут быть использованы клеточные линии млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия С VI почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7); линия эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детенышей хомячка (ВНК); мышиные клетки Сертоли (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени крысы-буйвола (BRL ЗА); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, как описано, например, в Mather et al.., Annals NY Acad.Sci., 383:44-68 (1982), клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для получения антител, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

Способы обнаружения, локализации и/или визуализации клеток CD8⁺ с использованием агентов, связывающих CD8

В настоящем документе предложены способы обнаружения, локализации и/или визуализации клеток CD8⁺ с использованием любого из агентов, связывающих CD8, описанных в настоящем документе (например, антитело к CD8 или иммуноконъюгат, содержащий антитело к CD8 и обнаруживаемую метку). В некоторых воплощениях способ включает определение присутствия CD8 в образце in vitro или ex vivo. В некоторых воплощениях способ включает добавление агента, связывающего CD8, к образцу in vitro или ex vivo. Такой способ, который включает, помимо прочего, вестерн-блоттинг, иммуногистохимические анализы, анализы ELISA и т.п., возможно включает проведение промывки после добавления агента, связывающего CD8, к образцу in vitro или ex vivo. В некоторых воплощениях обнаружение связывания CD8-связывающего агента с CD8 включает обнаружение метки, прикрепленной к анти-CD8 VHH-домену. В некоторых воплощениях способ включает применение второго агента, содержащего детектируемую метку, которая связывает комплекс анти-CD8:CD8, и обнаружение связывания CD8-связывающего агента с CD8 включает обнаружение детектируемой метки второго агента. Специалистам в данной области легко понять, что второй агент не конкурирует с CD8-связывающим агентом за связывание с CD8 или не конкурирует с CD8 за связывание с CD8-связывающим агентом.

В некоторых воплощениях способ включает обнаружение, локализацию или визуализацию присутствия CD8 in vivo. В некоторых воплощениях способ включает введение субъекту агента, связывающего CD8, описанного в настоящем документе. В некоторых воплощениях субъектом является человек. В некоторых воплощениях субъект представляет собой млекопитающее, отличное от человека, например, крысу, мышь, морскую свинку, хомяка, кролика, собаку, кошку, корову, лошадь, козу, овцу, осла, свинью, обезьяну, человекообразную обезьяну или другого примата, не являющегося человеком. В некоторых воплощениях примат, отличный от человека, представляет собой макаку-резус или яванского макака. В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, вводят субъекту перорально, местно или локально. В некоторых воплощениях CD8-связывающий агент вводят субъекту последством инфузии (например, внутривенной инфузии). В некоторых воплощениях инфузия является внутрибрюшинной. В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, вводят субъекту путем инъекции, такой как внутривенная инъекция или подкожная инъекция. В некоторых воплощениях способ включает введение агента, связывающего CD8, субъекту и взятие образца у субъекта для анализа (т.е. определение связывания агента, связывающего CD8, с CD8).

В некоторых воплощениях обнаружение, локализацию и/или визуализацию клеток CD8⁺ осуществляют in vivo, например, с использованием способов, более подробно описанных в других разделах настоящего документа.

В некоторых воплощениях обнаружение присутствия CD8 in vivo включает локализацию CD8 (например, клеток CD8⁺ ) в органе или ткани. В некоторых воплощениях способ включает определение количества клеток CD8⁺ в органе или ткани субъекта, например в пораженной ткани. В некоторых воплощениях у субъекта имеется рак, и обнаружение присутствия CD8 in vivo включает локализацию клеток CD8⁺ в опухоли. В некоторых воплощениях клетки CD8⁺ представляют собой CD8⁺ Т-клетки, например, CD8⁺ Т-клетки, инфильтрирующие опухоль. В некоторых воплощениях способ включает определение количества CD8⁺ Т-клеток в опухоли у субъекта, страдающего раком. В некоторых воплощениях способ включает определение количества CD8⁺ Т-клеток в опухоли у субъекта, страдающего раком, в несколько последовательных моментов времени.

В некоторых воплощениях клетки CD8⁺ могут быть обнаружены, локализованы или визуализированы in vivo в течение примерно 1 дня или менее, например, в течение примерно 6 часов, 4 часов, 3 часов, 2 часов, 90 минут, 1 часа, 30 минут или менее (например, от около 30 минут до около 6 часов, от около 30 минут до около 4 часов или от около 2 часов до 4 часов), включая любое значение или диапазон между этими значениями, после введения агента, связывающего CD8.

В некоторых воплощениях клетки CD8⁺ могут быть обнаружены, локализованы или визуализированы in vivo с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе, один или несколько раз, например, 1, 2, 3, 4, 5 раз или более в год без превышения инструкции по дозиметрии. В некоторых воплощениях способ можно повторить примерно через 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня, 1 день или менее после первого введения агента, связывающего CD8.

В некоторых воплощениях способ можно использовать для обнаружения, локализации или визуализации клеток CD8⁺ in vivo в течение длительного периода времени, например, по меньшей мере, около 3 месяцев, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет и более, включая любое значение или диапазон между этими значениями. Низкая иммуногенность СВ8-связывающих агентов, описанных в настоящем документе, позволяет повторное и продолжительное использование CD8-связывающих агентов для визуализации и обнаружения CD8 in vivo.

В некоторых воплощениях способ имеет чувствительность около 1 нМ, 2 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 15 нМ, 20 нМ, 25 нМ, 30 нМ, 40 нМ или 50 нМ (например, по меньшей мере около 50 нМ, например, от около 1 нМ до около 50 нМ или от около 1 нМ до около 30 нМ), включая любое значение или диапазон между этими значениями, CD8 для обнаружения CD8 in vivo. В некоторых воплощениях способ имеет линейную корреляцию между сигналом от метки и уровнем CD8 in vivo. В некоторых воплощениях способ имеет отношение опухоль:кровь по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 или выше в модели ксенотрансплантата опухоли CD8⁺ (например, TALL-1) у мыши.

Методики in vivo детекции CD8

В некоторых воплощениях связывание агента, связывающего CD8, с CD8 (такой как клетка CD8⁺ , например, CD8⁺ T-клетка) in vivo выявляется с помощью по меньшей мере одного из: иммуно-ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография), ОФЭКТ (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), МРТ (магнитно-резонансная томография), которая также известна как ЯМР (ядерный магнитный резонанс), ближняя инфракрасная область (NIR) или черенковская люминесцентная визуализация (CLI). В некоторых воплощениях связывание агента, связывающего CD8, с CD8 выявляют с помощью двух или более форм детекции. В некоторых воплощениях связывание агента, связывающего CD8, с CD8 выявляют с помощью ближнего инфракрасного обзора (БИК) и/или CLI. В некоторых воплощениях связывание СВ8-связывающего агента с CD8 выявляется с помощью иммуно-ОФЭКТ и/или флуоресценции в ближней ИК-области. В некоторых воплощениях связывание агента, связывающего CD8, с CD8 выявляют с помощью иммуноОФЭКТ и компьютерной томографии.

Иммуно-ПЭТ основана на случайном обнаружении антитела (такого как представленное здесь антитело против CD8) или его фрагмента, меченного позитрон-излучающим радионуклидом. Такие радионуклиды включают, но не ограничиваются ими, например, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁷⁶Br, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ^mIn, ¹⁷⁷ Lu, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, и ¹³¹L. Испущенный позитрон пройдет расстояние в несколько миллиметров, в зависимости от начальной энергии позитрона и плотности окружающей среды (см., например, Таблицу 2 в Guus et al. (2007) The Oncologist, 12:1379-1389). Потеряв свою кинетическую энергию, позитрон соединяется с электроном, что приводит к так называемому процессу аннигиляции, в результате которого образуются два фотона с энергией 511 кэВ каждый. Два фотона испускаются одновременно в противоположных направлениях. Распределение позитронно-излучающих меченных радионуклидами анти-CD8-антител в организме пациента можно отслеживать путем обнаружения пар аннигиляционных фотонов с помощью ПЭТ-камеры. ПЭТ-камера состоит из кольца детекторов, размещенных вокруг тела пациента. Если два фотона регистрируются детекторами на противоположных сторонах тела в течение очень короткого промежутка времени (обычно 5-15 наносекунд), предполагается, что где-то на линии между двумя детекторами произошло событие аннигиляции. Вычисляя пересечение всех линий, можно определить местонахождение источника излучения (меченого антитела). Для количественной оценки ПЭТ может предоставить достоверную информацию при выполнении соответствующих поправок (см. Verel et al. (2005) J Nucl Med, 46, приложение 1:164S-171S). Дополнительные подробности относительно иммуноПЭТ приведены, например, van Dongen et al. (2007) The Oncologist, 12(12): 1379-1389; Reddy et al. (2010) Semin Nucl Med. 40(3): 182-189; Boerman et al. (2011) J. Nucl Med. 52(8): 1171-1172; Santangelo et al. (2015)Nature Methods, 12: 427-432.

Визуализация ImmunoSPECT влечет за собой введение антитела (такого как анти-CD8-антитело, представленное в настоящем документе) или его фрагмента, меченного гамма-излучающим радионуклидом, субъекту, как правило, посредством инъекции в кровоток. Примеры гамма-излучающих радионуклидов включают, но не ограничиваются ими, например, ^99mTc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹³¹I, ¹⁵³Sm, или ¹⁸⁶Re. Затем применяют гамма-камеру для получения нескольких двумерных изображений под разными углами. Затем применяют компьютер для применения алгоритма томографической реконструкции к нескольким проекциям, что дает набор трехмерных данных. Затем этим набором данных можно манипулировать, чтобы показать тонкие срезы вдоль любой выбранной оси тела, аналогичные полученным с помощью других томографических методов. Для получения изображений SPECT гамма-камера вращается вокруг пациента. Проекции получаются в определенных точках во время вращения, обычно каждые 3 6 градусов. В большинстве случаев для получения оптимальной реконструкции используется полный поворот на 360 градусов. Время, необходимое для получения каждой проекции, также варьируется, но обычно составляет 15-20 секунд. Таким образом, общее время сканирования составляет 15-20 минут.В некоторых случаях гамма-сканер ОФЭКТ может работать с обычным компьютерным томографом с совместной регистрацией изображений. Это позволяет локализовать опухоли или ткани, которые можно увидеть при сцинтиграфии ОФЭКТ, но которые трудно определить точно по отношению к другим анатомическим структурам. Дополнительные сведения об иммуноОФЭКТ можно найти, например, в Laverman et al. (2015) J Nucl Med, 56(5): 778-783; Lutje et al. (2014) Cancer Res, 74(21): 6216-6223; Muselaers et al. (2013) Eur Urology 64(4): 1101-1106; и другие.

Принцип MPT in vivo (магнитно-резонансная томография), также известная как ЯМР (ядерный магнитный резонанс), основан на манипулировании магнитными свойствами протонов и нейтронов, содержащихся в атомных ядрах, присутствующих в теле субъекта (чаще всего, тех, содержится в атомах водорода). Движение этих ядер создает небольшой магнитный момент. Когда тело субъекта помещается в магнитное поле МРТ-сканера, магнитный момент этих ядер совпадает с направлением магнитного поля. Затем к телу субъекта в сканере прикладывается радиочастотный (РЧ) импульс, который возбуждает ядра таким образом, что происходят переходы между спиновыми состояниями с более низкой и более высокой энергией. Как только подается РЧ-импульс, ядра возвращаются в свое равновесное состояние (процесс, называемый релаксацией), высвобождая поглощенную дополнительную энергию и испуская РЧ-сигнал. Этот сигнал обнаруживается радиочастотными катушками сканера и затем используется для создания подробного изображения тканей тела. Используя контрастные вещества для МРТ, контраст этого изображения и, следовательно, видимость определенных структур тела можно улучшить. Примеры меток, обнаруживаемых с помощью МРТ, включают, помимо прочего, суперпарамагнитные оксиды железа (включая наночастицы оксида железа, такие как Molday ION Rhodamine-В Carboxyl), зонды на основе ¹⁹F, парамагнитные металлы (например, гадолиний, марганец, оксид марганца, диспрозий), (U)SPIO, PARA(CEST), DIA(CEST) и PFC. Дополнительная информация о применении меченых антител для МРТ in vivo и/или меток, которые обнаруживаются с помощью МРТ, обсуждается, например, в Srivastava (2015) Dis Model Mech. 8(4): 323-336; Zhou etal. (2013) Wiley Inter discip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 5(1): 1-18; Sohn et al. (2015) Nanomedicine. 11(1): 127-135; Bates et al. (2014) PloS ONE 9(5): e97220; Zhu et al. (2015) Int. J. Mol. Sci. 16: 9573-9587; и Zhang et al. (2014) Int J. Medicine. 9: 33-41.

NIR-изображение использует преимущества глубокого проникновения фотонов ближнего инфракрасного света в живую ткань, чтобы обеспечить визуализацию эндогенного и/или экзогенного контраста на глубине менее 1 см. В рамках этой области NIR-флуоресцентная визуализация фокусируется на обнаружении антител, меченных экзогенным контрастным веществом, которые излучают флуоресценцию в диапазоне 700-900 нм. Типичная система флуоресцентной визуализации подробно описана в другом месте (De Grand et al. (2003) Technol Cancer Res Treat, 2:553-62; Nakayama et al. (2002) Mol Imaging,l:365-77; Ntziachristos etal. (2003) Eur Radiol, 13:195-208; Tanaka et al. (2006) Ann Surg Oncol, 13:1671-81; Themelis et al. (2009) JBiomed Opt, 4:064012; and Troyan et al. (2009) Ann Surg Oncol, 16:2943-52. Вкратце, он состоит из источника света со спектральным разрешением (широкополосный фильтрованный источник, светоизлучающий диод [LED] или лазерный диод), возбуждающего флуорофор в мутной среде. Свет, испускаемый этим флуорофором, затем отображается на камеру устройства с зарядовой связью (ПЗС), при этом особое внимание уделяется фильтрации мощного возбуждающего света. Примеры инфракрасных красителей включают, но не ограничиваются ими, Tracy 652, Tracy 645, родаминовые красители, цианиновые красители, Су7, Су7.5, ALEXA FLUOR^®, CYDYE^®, IRDYE^®, DyLight и АТТО. Длина волны 950 нм удобна для визуализации in vivo из-за низкого поглощения биологических молекул в этой области. Дополнительные сведения об использовании меченых антител для NIR-визуализации in vivo и обнаруживаемых меток для NIR-визуализации in vivo представлены в Cillers et al. (2017) Mol Pharmaceuticals 14(5): 1623-1633; Hilderbrand et al. (2010) Curr Opin ChemBiol. 14(1): 71-79; Hong et al. (2017) Nat Biomed Eng. 1, 0010 DOI: 10.1038/s41551-016-0010; Pansare et al. (2012) Chem Mater. 24(5): 812-827; Hickson (2009) Urol Oncol Semin Orig Invest. 27: 295-297; Zhang et al. (2012) Curr Protoc Cytom. Chapter 12: Unit 12.7; Quek et al. (2012) Nanomaterials. 2: 92-112; Luker et al. (2008) J Nucl Med 49:1-4; и Liu et al. (2016) NPG Asia Materials. 8, e295.

Люминесцентная визуализация Черенкова (CLI) представляет собой способ молекулярно-оптической визуализации, который основан на обнаружении оптических фотонов Черенкова, испускаемых визуализирующими агентами позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) (например, описанными в других разделах настоящего документа). Другие агенты визуализации CLI включают, но не ограничиваются ими, например, ¹³¹I, ¹⁸F и ⁹⁰Y. Черенковское излучение возникает, когда заряженная частица проходит через диэлектрическую среду (т.е. среду, которая может быть поляризована электрическим полем) со скоростью, превышающей скорость света в этой среде. Распространяясь, заряженная частица (положительно заряженный позитрон или отрицательно заряженный электрон) индуцирует локальную поляризацию, смещая положительные и отрицательные заряды атомов в среде. См., например, рисунок 1 в Grootendorst et al. (2016) Clin Transl Imaging. 4(5): 353-366). Когда скорость частицы превышает скорость света, поляризация становится асимметричной вдоль пути частицы, что приводит к дипольному электрическому полю на больших расстояниях от частицы. Когда частица проходит, электроны атомов возвращаются в свое основное состояние, тем самым излучая переданную энергию в виде оптических фотонов. Изображения CLI могут быть получены путем обнаружения черенковского света от ПЭТ-трассеров с использованием сверхвысокочувствительных оптических камер, таких как камеры с электронным умножением и зарядовой связью (EMCCD). Изображение CLI можно анализировать полуколичественно в фотонном излучении. CLI и ПЭТ напрямую коррелируют из-за того, что оба метода измеряют фотоны, производимые радиофармацевтическими препаратами, излучающими позитроны; ПЭТ измеряет аннигиляционные фотоны, a CLI измеряет черенковские фотоны. Несколько исследований показали сильную корреляцию между CLI и ПЭТ для различных радиофармпрепаратов in vitro, ex vivo и in vivo, тем самым продемонстрировав применимость CLI для молекулярной визуализации живых субъектов. Публикации, касающиеся CLI или подробно описывающие корреляцию между CLI и ПЭТ, включают, например, Xu et al. (2012) J Nucl Med, 53(2):312-317; Liu et al. (2010) PLoS ONE. 5β):e9470; Zhang etal. (2013) PLoS ONE. 8(4):e62007; Ни etal. (2015) Eur Radiol. 25(6):1814-1822; Robertson et al. (2011) J Nucl Med. 52(11): 1764-1769; Timmermand et al. (2015) J Nucl Med. 56β):444-449; Cao etal. (2014) Biomed Opt Express. 5(10):3660-3670 и Thorek et al. (2014) J Nucl Med. 55(1):95 98.

Способы прогнозирования чувствительности субъекта, больного раком, к иммунотерапии

Также предложены способы прогнозирования ответа субъекта, страдающего раком, на лечение иммунотерапевтическим агентом. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающего CD8, и обнаружение связывания меченого агента, связывающего CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани у субъекта, при этом обнаружение связывания указывает на то, что субъект, вероятно, ответит на иммунотерапевтическое средство. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого CD8-связывающего агента, описанного в настоящем документе, и обнаружение связывания меченого CD8-связывающего агента с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани у субъекта, где обнаружение связывания указывает на то, что субъект нуждается в лечении иммунотерапевтическим средством. В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, помечен детектируемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F и т.д.), и связывание меченого агента, связывающего CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют с помощью ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представляет собой анти-CD8 VHH, конъюгированный с меткой ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающий CD8, представляет собой анти-CD8 VHH, конъюгированный с комплексом ¹⁸Е-алюминий через соединение формулы (I). В некоторых воплощениях анти-CD8 VHH содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях анти-CD8 VHH содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях анти-CD8 VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях анти-CD8 VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях способ включает введение терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического средства, клеточной терапии или противораковой вакцины (например, персонализированной противораковой вакцины или «PCV») субъекту, у которого было обнаружено связывание меченого агента, связывающего CD8 с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани.

В некоторых воплощениях CD8-связывающий агент вводят более одного раза для повторного прогнозирования чувствительности субъекта к иммунотерапевтическому агенту. В некоторых воплощениях способ повторяют в течение длительного периода времени, такого как по меньшей мере около 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любое значение или диапазон между этими значениями.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой ингибитор контрольной точки иммунного ответа. В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой терапевтическое антитело против CTLA-4, такое как ипилимумаб (YERVOY^®). В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой терапевтическое антитело против PD-1. В некоторых воплощениях терапевтическое антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб (OPDIVO^®). В некоторых воплощениях терапевтическое антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб (KEYTRUDA^®). В некоторых воплощениях терапевтическое антитело к PD-1 представляет собой пидлизумаб.

В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой терапевтическое антитело против PD-L1. В некоторых воплощениях терапевтическое антитело против PD-L1 представляет собой BMS-936559. В некоторых воплощениях терапевтическое антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб (BANVENCIO^®). В некоторых воплощениях терапевтическое антитело против PD-L1 представляет собой дурвалумаб (IMFINZI^®). В некоторых воплощениях терапевтическое антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб (TECENTRIQ^®).

Более подробная информация о терапевтических ингибиторах контрольных точек иммунитета представлена в Byun et al. (2017) Nat Rev Endocrinol. 13: 195-207; La-Beck et al. (2015) Pharmacotherapy. 35(10): 963-976; Buchbinder et al. (2016) Am J Clin Oncol. 39(1): 98-106; Michot et al. (2016) Eur J Cancer. 54:139-148, и Topalian et al. (2016) Nat Rev Cancer. 16: 275-287.

В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки иммунного ответа вводят субъекту в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими (такими как химиотерапевтические) агентами. В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки иммунного ответа, который вводят субъекту в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими (такими как химиотерапевтические) агентами, представляет собой антитело против PD-L1 (такое как атезолизумаб). Примеры химиотерапевтических средств включают эрлотиниб (TARCEVA^®, Genentech/OSI Pharm.), бортезомиб (VELCADE^®, Millennium Pharm.), дисульфирам, галлат эпигаллокатехина, салиноспорамид А, карфилзомиб, 17-AAG (гелданамицин), радицикол, лактатдегидрогеназу А (LDH-A), фулвестрант (FASLODEX^®, AstraZeneca), сунитиб (SUTENT^®, Pfrzer/Sugen), летрозол (FEMARA^®, Novartis), мезилат иматиниба (GLEEVEC^®, Novartis), финасунат (VATALANIB^®, Novartis), оксалиплатин (ELOXATIN^®, Sanofi), 5-FU (5-фторурацил), лейковорин, рапамицин (Sirolimus, RAPAMUNE^®, Wyeth), лапатиниб (TYKERB^®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафамиб (SCH 66336), сорафениб (NEXAVAR^®, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA^®, AstraZeneca), AG1478, алкилирующие агенты, такие кактиотепа и циклофосфамид CYTOXAN^®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбокон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метил аме л амины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая топотекан и иринотекан); бриостатин; каллистатин; СС 1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); адренокортикостероиды (включая преднизолон и преднизолон); ципротерона ацетат; 5а-редуктазы, включая финастерид и дутастерид); вориностат, ромидепсин, панобиностат, вальпроевая кислота, моцетиностат, доластатин; альдеслейкин, тальк, дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хломафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтамина оксида, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин yll и калихеамицин coll (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 33:183-186); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые эндииновые антибиотические хромофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабин, каминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-норлейко-L, ADRIAMYCIN^® (доксорубицин), морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцеломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пуромицин, фипломицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства против надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бесстрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефамин; демеколцин; диазиквон; эльфомитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамнол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лосоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK^® (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ара-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, TAXOL (паклитаксел; Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси), ABRAXANE^® (без кремофора), составы наночастиц паклитаксела, сконструированные с использованием альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL), и TAXOTERE^® (доцетаксел), доксетаксел, Санофи-Авентис); хлорамбуцил; ГЕМЗАР^® (гемцитабин); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (ВП-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; НАВЕЛБИН^® (винорелбин); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабин (XELODA^®); ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифтор метил орнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеперечисленных.

Химиотерапевтический агент также включает (1) антигормональные агенты, которые регулируют или подавляют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая NOLVADEX^®; тамоксифен цитрат), ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON^® (торемифин цитрат); (2) ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующий выработку эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, MEGASE^® (мегестрола ацетат), AROMASIN^® (экземестан; Pfizer), форместание, фадрозол, РИВИЗОР^® (ворозол), ФЕМАРА^® (летрозол; Новартис) и АРИМИДЕКС^® (анастрозол; АстраЗенека); β) антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; бусерелин, триптерелин, медроксипрогестерона ацетат, диэтилстильбэстрол, премарин, флуоксиместерон, полностью трансретионовую кислоту, фенретинид, а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); (4) ингибиторы протеинкиназы; (5) ингибиторы липидкиназы; (6) антисмысловые олигонуклеотиды, особенно те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в аберрантной клеточной пролиферации, такие как, например, РКС-альфа, Ralf и H-Ras; (vii) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии VEGF (например, ANGIOZYME^®) и ингибиторы экспрессии HER2; (7) вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например, АЛЛОВЕКТИН^®, ЛЕУВЕКТИН^® и ВАКС ИД^®; ПРОЛЕЙКИН^®, rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1, такой как LURTOTECAN^®; АБАРЕЛИКС^® рмОВ; и (8) фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных.

Химиотерапевтический агент также включает антитела, такие как алемтузумаб (Campath), бевацизумаб (AVASTIN^®, Genentech); цетуксимаб (ERBITUX^®, Imclone); панитумумаб (VECTIBIX^®, Amgen), ритуксимаб (RITUXAN^®, Genentech/Biogen Idee), пертузумаб (OMNITARG^®, 2С4, Genentech), трастузумаб (HERCEPTIN^®, Genentech), тозитумомаб (Bexxar, Corixia) и конъюгат антитело-лекарственное средство, гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG^®, Wyeth). Дополнительные гуманизированные моноклональные антитела с терапевтическим потенциалом в качестве агентов в сочетании с соединениями по настоящему изобретению включают: аполизумаб, аселизумаб, атлизумаб, бапинезумаб, биватузумаб мертанзин, кантузумаб мертанзин, цеделизумаб, цертолизумаб пегол, цидфузитузумаб, цидтузумаб, даклизумаб, экулизумаб, эфализумаб, эрлизумаб, фелвизумаб, фонтолизумаб, гемтузумаб озогамицин, инотузумаб озогамицина, ипилимумаб, лабетузумаб, линтузумаб, матузумаб, меполизумаб, мотавизумаб, мотовизумаб, натализумаб, нимотузумаб, нумавитузумаб, окрелизумаб, амализумаб, палвизумаб, пасколизумаб, пекфузитузумаб, пектузумаб, пекселизумаб, раливизумаб, ранибизумаб, ресливизумаб, реслизумаб, резувизумаб, ровелизумаб, руплизумаб, сибротузумаб, сиплизумаб, сонтузумаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тефибазумаб, тоцилизумаб, торализумаб, тукотузумаб целмолейкин, тукузитузумаб, умавизумаб, уртоксазумаб, устекиназумаб, визилизумаб, и анти-интерлейкин-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories), который представляет собой рекомбинантное полноразмерное антитело IgG1 λ исключительно человеческой последовательности, генетически модифицированное для распознавания белка р40 интерлейкина-12.

Химиотерапевтический агент также включает «ингибиторы EGFR», которые относятся к соединениям, которые связываются или иным образом взаимодействуют непосредственно с EGFR и предотвращают или снижают его сигнальную активность, и альтернативно называются «антагонистами EGFR». Примеры таких агентов включают антитела и небольшие молекулы, связывающие EGFR. Примеры антител, которые связывают EGFR, включают MAb 579 (АТСС CRL НВ 8506), MAb 455 (АТСС CRL НВ8507), MAb 225 (АТСС CRL 8508), MAb 528 (АТСС CRL 8509) (см. патент US 4943533, Mendelsohn et al.) и их варианты, такие как химеризированный 225 (С225 или цетуксимаб; ERBUTIX^®) и модифицированный человеческий 225 (Н225) (см. WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, полностью человеческое антитело, нацеленное на EGFR (Imclone); антитела, которые связывают мутантный EGFR II типа (патент US 5212290); гуманизированные и химерные антитела, связывающие EGFR, как описано в патенте US 5891996; и антитела человека, которые связывают EGFR, такие как ABX-EGF или панитумумаб (см. WO 98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (матузумаб) гуманизированное антитело к EGFR, направленное против EGFR, которое конкурирует как с EGF, так и с TGF-альфа за связывание с EGFR (EMD/Merck); антитело к EGFR человека, HuMax-EGFR (GenMab); полностью человеческие антитела, известные как E1.1, Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, E2.11, Е6.3 и Е7.6. 3 и описанные в US 6235883; MDX-447 (Medarex Inc); и mAb 806 или гуманизированное mAb 806 (Johns et at, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). Антитело против EGFR может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом с образованием таким образом иммуноконъюгата (см., например, ЕР659439А2, Merck Patent GmbH). Антагонисты EGFR включают малые молекулы, такие как соединения, описанные в патентах US 5616582; 5457105; 5475001; 5654307; 5679683; 6084095; 6265410; 6455534; 6521620; 6596726; 6713484; 5770599; 6140332; 5866572; 6399602; 6344459; 6602863; 6391874; 6344455; 5760041; 6002008; и 5747498; а также следующие публикации РСТ: WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016 и WO 99/24037. Конкретные низкомолекулярные антагонисты EGFR включают OSI-774 (СР-358774, эрлотиниб, TARCEVA^® Genentech/OSI Pharmaceuticals), PD 183805 (CI 1033, 2-пропенамид, N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолинил)пропокси]-6-хиназолинил]-дигидрохлорид, Pfizer Inc.); ZD1839, гефитиниб (IRESSA^®) 4-3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-амино-4-3-метилфениламино)хиназолин, Zeneca); BIBX-1382 (М8-β-хлор-4-фторфенил)-К2-(1-метилпиперидин-4-ил)-пиримидо[5,4-d]пиримидин-2,8-диамин, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(l-фенилэтил)амино]-1H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]-фенол); (R)-6-(4-гидроксифенил)-4-[(1-фенилэтил)амино]-7Н-пирроло[2,3-d] пиримидин); CL-387785 (N-[4-[(3-бромфенил)амино]-6-хиназолинил]-2-бутинамид); EKB-569 (N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолинил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); двойные ингибиторы тирозинкиназы EGFR7HER2, такие как лапатиниб (TYKERB^®, GSK572016 или N-[3-хлор-4-[(3-фторфенил)метокси]фенил]-6[5[[[2 метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин).

Химиотерапевтические агенты также включают «ингибиторы тирозинкиназы», в том числе препараты, нацеленные на EGFR, указанные в предыдущем абзаце; низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы HER2, такой как TAK165, доступный от Takeda; СР-724,714, пероральный селективный ингибитор тирозинкиназы рецептора ErbB2 (Pfizer и OSI); двойные ингибиторы HER, такие как EKB-569 (доступный от Wyeth), который предпочтительно связывает EGFR, но ингибирует клетки, сверхэкспрессирующие как HER2, так и EGFR; лапатиниб (GSK572016; доступен от GlaxoSmithKline), пероральный ингибитор тирозинкиназы HER2 и EGFR; PKI-166 (доступен от Novartis); ингибиторы пан-HER, такие как канертиниб (CI-1033; Pharmacia); ингибиторы Raf-1, такие как антисмысловой агент ISIS-5132, доступный от ISIS Pharmaceuticals, который ингибирует передачу сигналов Raf-1; ингибиторы ТК, не нацеленные на HER, такие как мезилат иматиниба (GLEEVEC^®, доступный от Glaxo SmithKline); многоцелевые ингибиторы тирозинкиназы, такие как сунитиниб (SUTENT^®, доступный от Pfizer); ингибиторы тирозинкиназы рецептора VEGF, такие как ваталаниб (PTK787/ZK222584, доступный от Novartis/Schering AG); ингибитор внеклеточной регулируемой киназы I МАРК CI-1040 (доступный от Pharmacia); хиназолины, такие как PD 153035,4-β-хлоранилино)хиназолин; пиридопиримидины; пиримидопиримидины; пирролопиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706; пиразолопиримидины, 4-(фениламино)-7Н-пирроло[2,3-с1]пиримидины; куркумин (диферулоилметан, 4,5-бис(4-фторанилино)фталимид); тирфостины, содержащие фрагменты нитротиофена; PD-0183805 (Warner-Lambert); антисмысловые молекулы (например, те, которые связывают HER-кодирующую нуклеиновую кислоту); хиноксалины (патент US 5804396); трифостины (патент US 5804396); ZD6474 (AstraZeneca); ПТК-787 (Novartis/Schering AG); ингибиторы pan-HER, такие как CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); мезилат иматиниба (GLEEVEC^®); ИПК 166 (Novartis); GW2016 (GlaxoSmithKline); CI-1033 (Pfizer); ЭКБ-569 (Wyeth); семаксиниб (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); ПТК-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE^®); или как описано в любой из следующих патентных публикаций: патент US 5804396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner-Lambert); WO 1999/06378 (Warner-Lambert); WO 1999/06396 (Warner-Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc.); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) и WO 1996/33980 (Zeneca).

Химиотерапевтические агенты также включают дексаметазон, интерфероны, колхицин, метоприн, циклоспорин, амфотерицин, метронидазол, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, амифостин, триоксид мышьяка, аспарагиназу, живую БЦЖ, бевакузимаб, бексаротен, кладрибин, клофарабин, дарбэпоэтин альфа, денилейкин, дексразоксан, эпоэтин альфа, элотиниб, филграстим, гистрелина ацетат, ибритумомаб, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, леналидомид, левамизол, месна, метоксален, нандролон, неларабин, нофетумомаб, опрелвекин, палифермин, памидронат, пегадемаза, пегаспаргастим, пегфилспаргазе пеметрексед динатрий, пликамицин, порфимер натрия, хинакрин, расбуриказа, сарграмостим, темозоломид, VM-26, 6-TG, торемифен, третиноин, ATRA, валрубицин, золедронат и золедроновая кислота и их фармацевтически приемлемые соли.

Химиотерапевтические агенты также включают гидрокортизон, ацетат гидрокортизона, ацетат кортизона, тиксокортол пивалат, триамцинолона ацетонид, триамцинолоновый спирт, мометазон, амцинонид, будесонид, дезонид, флуоцинонид, флуоцинолона ацетонид, бетаметазон, бетаметазона фосфат натрия, дексаметазон, дексаметазона фосфат натрия, флуокортолон, гидрокортизона-17-бутират, гидрокортизона-17-валерат, аклометазона дипропионат, бетаметазона валерат, бетаметазона дипропионат, предникарбат, клобетазон-17-бутират, клобетазол-17-пропионат, флуокортолона капроат, флуокортолона пивалат и флупредниденацетат; иммуноселективные противовоспалительные пептиды (ImSAID), такие как фенилаланин-глутамин-глицин (FEG) и его D-изомерная форма (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); противоревматические препараты, такие как азатиоприн, циклоспорин (циклоспорин А), D-пеницилламин, соли золота, гидроксихлорохин, лефлуномидаминоциклин, сульфасалазин, блокаторы фактора некроза опухоли альфа (ФНОа), такие как этанерцепт (Энбрел), инфликсимаб (Ремикейд), адалимумаб (Хумира), цертолизумаб пегол (Симзия), голимумаб (Симпони), блокаторы интерлейкина 1 (IL-1), такие как анакинра (Кинерет), блокаторы костимуляции Т-клеток, такие как абатацепт (Оренсия), блокаторы интерлейкина 6 (IL-6), такие как тоцилизумаб (АКТЕМЕРА^®); блокаторы интерлейкина 13 (IL-13), такие как лебрикизумаб; блокаторы альф а-интерферона (IFN), такие как ронтализумаб; блокаторы интегрина бета-7, такие как rhuMAb Beta7; блокаторы пути IgE, такие как Anti-Mi prime; блокаторы секретируемого гомотримера LTa3 и связанного с мембраной гетеротримера LTal/p2, такие как антилимфотоксин альфа (LTa); радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu), различные экспериментальные препараты, такие как тиоплатин, PS-341, фенилбутират, ЕТ-18-ОСНЗ или ингибиторы фарнезилтрансферазы (L-739749, L-744832); полифенолы, такие как кверцетин, ресвератрол, пикетаннол, галлат эпигаллокатехина, теафлавины, флаванолы, процианидины, бетулиновая кислота и ее производные; ингибиторы аутофагии, такие как хлорохин; дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL^®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); подофиллотоксин; тегафур (У ФТОР АЛ^®); бексаротен (ТАРГРЕТИН^®); бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS^® или OSTAC^®), этидронат (DIDROCAL^®), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA^®), алендронат (FOSAMAX^®), памидронат (AREDIA^®), тилудронат (SKELID^®) или ризедронат (ACTONEL^®); и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE^®; перифозин, ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); ТПП-779; типифарниб (R11577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE^®); пиксантрон; ингибиторы фарнезилтрансферазы, такие как лонафарниб (SCH 6636, SARASARTM); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных; а также комбинации двух или более из вышеперечисленных, такие как CHOP, аббревиатура для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном; и FOLFOX, аббревиатура схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-ФУ и лейковорином.

К химиотерапевтическим средствам относятся также нестероидные противовоспалительные препараты с обезболивающим, жаропонижающим и противовоспалительным действием. НПВП включают неселективные ингибиторы фермента циклооксигеназы. Конкретные примеры НПВП включают аспирин, производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, фенопрофен, кетопрофен, флурбипрофен, оксапрозин и напроксен, производные уксусной кислоты, такие как индометацин, сулиндак, этодолак, диклофенак, производные эноловой кислоты, такие как пироксикам, мелоксикам, теноксикам, дроксикам, лорноксикам и изоксикам, производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота, меклофенамовая кислота, флуфенамовая кислота, толфенамовая кислота, и ингибиторы ЦОГ-2, такие как целекоксиб, эторикоксиб, лумиракоксиб, парекоксиб, рофекоксиб, рофекоксиб и валдекоксиб.

В некоторых воплощениях антитело к PD-L1 (такое как атезолизумаб) вводят в комбинации с одним или несколькими из следующих химиотерапевтических агентов: антитело к HER2 (например, трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН^®, Genentech) или пертузумаб (PERJETA^®, Genentech), антагонист связывания PD1 (например, MDX-1106 (ниволумаб), МК-3475 (пембролизумаб, ламбролизумаб), СТ-011 (пидилизумаб) или АМР-224) и связывающий PD-L2 антагонист.

В некоторых воплощениях антитело к PD-L1 (такое как атезолизумаб) вводят в комбинации с агентом, ингибирующим рост.«Ингибирующий рост агент» при использовании здесь относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки либо in vitro, либо in vivo. Примеры ингибирующих рост агентов включают, например, барвинок (винкристин и винбластин), таксаны (доцетаксел (TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer) и паклитаксел (TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb)) и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те агенты, которые блокируют G1, также переходят в S-фазу, например, агенты, алкилирующие ДНК, такие как тамоксифен, преднизолон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ара-С.Дополнительную информацию можно найти в Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), например, на стр. 13.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой активатор дендритных клеток или фактор роста дендритных клеток. В некоторых воплщениях иммунотерапевтический агент представляет собой вакцинный адъювант.В воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой стимулятор Т-клеток или фактор роста. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой агент, который нейтрализует или ингибирует супрессивные иммунные клетки, цитокины и/или ферменты.

В некоторых воплощениях способ включает введение иммунотерапевтического средства, выбранного из группы, состоящей из антитела против TIGIT, антагониста TIGIT, антитела против CSF-1R, антагониста против CSF-1R, антитела против СЕА, антагониста анти-СЕА, антитела к CTLA4, антагониста CTLA4, антитела к ОХ40, агониста ОХ40, любого антитела к PD-L1 в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами, любого антитела к PD1 в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами и атезолизумаб в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами. В некоторых воплощениях антитело к PD1 или к PD-L1 комбинируют с одним или несколькими из TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), А V AS TIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтансин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаб, INF-альфа, анти-CD40 агент, антитело к ОХ40 (например, агонист ОХ40), антитело к CSF-1R, антитело к CEA, ингибитор IDO или антитело к TIGIT. В некоторых воплощениях антитело к PD-L1 представляет собой атезолизумаб, и атезолизумаб сочетается с одним или несколькими из TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), А V AS TIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаб, INF-альфа, антиген агент -CD40, антитело к ОХ40 (например, агонист ОХ40), антитело к CSF-1R, антитело к СЕ А, ингибитор IDO, антитело к CTLA4 или антитело к TIGIT.

В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой терапию Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR-T). В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой терапию с использованием Т-клеточного рецептора Т-клеток (TCR-T). В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой терапию неоантиген-специфическими Т-клетками.

Способы мониторинга прогрессирования у субъекта с раком

Здесь предложены способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком. Такие способы включают введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают введение терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента (например, иммунотерапевтического агента, описанного в других разделах настоящей заявки) субъекту, у которого есть прогрессирование заболевания. В некоторых воплощениях способы включают: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани до введения иммунотерапевтического агента; (б) введение иммунотерапевтического агента; (в) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани во временной точке после введения иммунотерапевтического агента; и (г) измерение разности мечения CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани до и после введения иммунотерапевтического агента.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой ингибитор иммунных контрольных точек. В некоторых воплощениях ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой антитело против PD-1 (такое как, без ограничения, антитело против PD-1, описанное здесь). В некоторых воплощениях ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой антитело против PD-L1 (такое как, без ограничения, антитело против PD-L1, описанное здесь). В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб. В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 (такое как атезолизумаб) вводят субъекту в комбинации со вторым терапевтическим агентом (таким как, без ограничения, иммунотерапевтический и/или химиотерапевтический агент, описанные в других разделах настоящей заявки). В некоторых воплощениях второй терапевтический агент представляет собой иммунотерапевтический агент.В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1 или антитело против PD-1 в дополнительной комбинации с одним или более из антитела против TIGIT, антагониста TIGIT, антитела против CSF-1R, антагониста против CSF-1R, антитела против CEA, антагониста против CEA, антитела против ОХ40, агониста ОХ40, антитела против CTLA4, антагониста CTLA4, TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), AVASTIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаба, INF-альфа, агента против CD40 или ингибитора IDO.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой цитокин. В некоторых воплощениях цитокин представляет собой IL-2, конструированный IL-2, IL-15 или конструированный IL-15.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой модулятор дендритных клеток. В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой активатор дендритных клеток или фактор роста дендритных клеток.

В некоторых воплощениях эффект иммунотерапевтического агента определяют, определяя уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке и сравнивая его с уровнем CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани в первой временной точке. В некоторых воплощениях прогрессирование заболевания выявляют, когда уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке выше уровня CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани в первой временной точке. В некоторых воплощениях уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани определяют в третьей, четвертой или пятой последующих временных точках. В некоторых воплощениях временные точки отстоят друг от друга по меньшей мере на 1 сутки, 3 суток, 1 неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года или более чем на три года. В некоторых воплощениях уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани определяют после введения пациенту иммунотерапевтического агента.

В некоторых воплощениях эффект одной или более чем одной схемы введения иммунотерапевтического агента на опухолевую ткань определяют, сравнивая уровни CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани пациента, измеренные агентом, связывающимся с CD8, в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях уровни (или локализацию) CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани после введения субъекту иммунотерапевтического агента определяют, сравнивая уровни CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани, измеренные агентом, связывающимся с CD8, в первой временной точке до введения иммунотерапевтического агента и во второй временной точке после введения.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, мечен выявляемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F, ⁶⁸Ga и так далее) и связывание меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют посредством ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, вводят более чем один раз для повторного мониторинга прогрессирования рака у субъекта. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении длительного периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любое значение или диапазон между этими значениями.

Способы мониторинга хода лечения у субъекта с раком

Здесь предложены способы мониторинга хода лечения у субъекта с раком, ранее получавшего или в настоящее время получающего лечение иммунотерапевтическим агентом (например, иммунотерапевтическим агентом, описанным в других разделах настоящей заявки). Такие способы включают введение субъекту меченого агента, связывающегося с CD8, вместе с иммунотерапевтическим агентом и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, и первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента, и вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента. В некоторых воплощениях снижение уровней CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на положительный ход лечения (например, полезные или желаемые клинические результаты). В некоторых воплощениях повышение уровней CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и вторая временная точка следует после первой временной точки. В некоторых воплощениях снижение уровней CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на положительный ход лечения (например, полезные или желаемые клинические результаты). В некоторых воплощениях повышение уровней CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях данный способ применяют для объяснения механизма неэффективности лечения, например, уменьшением числа CD8⁺ клеток, истощением и/или снижением терапевтической активности. В некоторых воплощениях уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани определяют в третьей, четвертой или пятой последующих временных точках. В некоторых воплощениях временные точки отстоят друг от друга по меньшей мере приблизительно на 1 сутки, 3 суток, 1 неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года или более чем на три года.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой ингибитор иммунных контрольных точек. В некоторых воплощениях ингибитор иммунных контрольных точек представляет собой антитело против PD-L1 (например, как описано в других разделах настоящей заявки). В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб. В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 (такое как атезолизумаб) вводят субъекту в комбинации со вторым терапевтическим агентом (например, как описано в других разделах настоящей заявки).

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, мечен выявляемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F, ⁶⁸Ga и так далее) и связывание меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют посредством ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, вводят более чем один раз для повторного мониторинга хода лечения у субъекта. В некоторых воплощениях у субъекта проводят мониторинг на протяжении длительного периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любое значение или диапазон между этими значениями.

Способы прогнозирования чувствительности субъекта с раком к лечению противораковой вакциной и способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, которому была ведена противораковая вакцина

Здесь предложены способы прогнозирования чувствительности субъекта с раком к лечению противораковой вакциной. В некоторых воплощениях противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину («PCV»). Типичные PCV описаны, например, в Ott etal. (2017)Nature 547, 217-221, и Sahin etal. (2017) Nature 547, 222-226. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на противораковую вакцину. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект нуждается в лечении противораковой вакциной. В некоторых воплощениях противораковую вакцину вводят в комбинации с одним или более чем одним иммунотерапевтическим и/или химиотерапевтическим агентом, описанным здесь.

Также здесь предложены способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком. Такие способы включают введение агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают введение терапевтически эффективного количества противораковой вакцины. В некоторых воплощениях противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину («PCV»).

Здесь предложены способы мониторинга хода лечения у субъекта с раком, ранее получавшего или в настоящее время получающего лечение противораковой вакциной. В некоторых воплощениях противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину («PCV»). В некоторых воплощениях способы включают: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани до введения противораковой вакцины (например, PCV); (б) введение противораковой вакцины (например, PCV); (в) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани во временной точке после введения противораковой вакцины (например, PCV); и (г) измерение разности мечения CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани до и после введения противораковой вакцины (например, PCV). В некоторых воплощениях данный способ применяют для объяснения механизма неэффективности лечения, например, уменьшением числа CD8⁺ клеток, истощением и/или снижением терапевтической активности.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, мечен выявляемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F, ⁶⁸Ga и так далее) и связывание меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют посредством ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, вводят более чем один раз для повторного прогнозирования или мониторинга у субъекта. В некоторых воплощениях способ повторяют или мониторинг у субъекта проводят на протяжении длительного периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любое значение или диапазон между этими значениями.

Способы прогнозирования чувствительности субъекта с раком к лечению клеточной терапией и способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, у которого была проведена клеточная терапия

Здесь предложены способы прогнозирования чувствительности субъекта с раком к лечению клеточной терапией. В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой CAR-T-клеточную или неоантиген-специфичную Т-клеточную терапию. Типичные варианты клеточной терапии описаны, например, в June et al. (2018) Science 359, 1361-1365, и Guedan etal. (2019) Annu. Rev. Immunol. 37:145-171. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на клеточную терапию. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект нуждается в лечении клеточной терапией. В некоторых воплощениях клеточную терапию проводят в комбинации с одним или более чем одним иммунотерапевтическим и/или химиотерапевтический агентом, описанным здесь.

Также здесь предложены способы мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком. Такие способы включают введение агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают проведение терапевтически эффективного количества клеточной терапии.

Здесь предложены способы мониторинга хода лечения у субъекта с раком, ранее получавшего или в настоящее время получающего лечение клеточной терапией. В некоторых воплощениях клеточная терапия представляет собой CAR-T-клеточную или неоантиген-специфичную Т-клеточную терапию. В некоторых воплощениях способы включают: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани до проведения клеточной терапии; (б) проведение клеточной терапии; (в) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани во временной точке после проведения клеточной терапии; и (г) измерение разности мечения CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани до и после проведения клеточной терапии. В некоторых воплощениях данный способ применяют для объяснения механизма неэффективности лечения, например, уменьшением числа CD8⁺ клеток, истощением и/или снижением терапевтической активности.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, мечен выявляемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F, ⁶⁸Ga и так далее) и связывание меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют посредством ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, вводят более чем один раз для повторного прогнозирования или мониторинга у субъекта. В некоторых воплощениях способ повторяют или мониторинг у субъекта проводят на протяжении длительного периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любой диапазон между этими значениями.

Способы для аутоиммунных заболеваний или состояний, отторжения трансплантата и болезни «трансплантат против хозяина»

Вследствие их высокой чувствительности и низкой иммуногенности агенты, связывающиеся с CD8, описанные здесь, подходят для мониторинга прогрессирования заболевания, прогнозирования чувствительности к иммунотерапии и/или мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина». В некоторых воплощениях иммунотерапия представляет собой иммуносупрессивный агент.

Здесь предложены способы мониторинга хода лечения и прогрессирования заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием или расстройством (например, аутоиммунным артритом, колитом), отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина». Все такие заболевания включают CD8⁺ Т-клетки как часть вредоносного воспалительного процесса. См. Petrelli & Femke, CD8⁺ Т cells in human autoimmune arthritis: the usual suspects; Nature Reviews Thumatology 12:421-428 (2016). Такие способы включают введение субъекту меченого агента, связывающегося с CD8, с или без интервенционного лечения, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани в первой временной точке и во второй временной точке. В некоторых воплощениях повышение CD8⁺ Т-клеток от первой временной точки до второй временной точки указывает на прогрессирование аутоиммунного заболевания или состояния, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина». В некоторых воплощениях интервенционную терапию для лечения аутоиммунного заболевания или состояния, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина» проводят до введения меченого агента, связывающегося с CD8, первая временная точка следует после проведения интервенционной терапии для лечения аутоиммунного заболевания или состояния, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина» и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и вторая временная точка следует после первой временной точки. В некоторых воплощениях снижение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на положительный ход лечения (например, полезные или желаемые клинические результаты). В некоторых воплощениях повышение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во второй временной точке по сравнению с первой временной точкой указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях уровень CD8⁺ Т-клеток в ткани определяют в третьей, четвертой или пятой последующих временных точках. В некоторых воплощениях снижение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани в последующей временной точке (точках) по сравнению с первой временной точкой указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях повышение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, в последующей временной точке (точках) по сравнению с первой временной точкой указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях данный способ применяют для объяснения механизма неэффективности лечения. В некоторых воплощениях временные точки отстоят друг от друга по меньшей мере приблизительно на 1 сутки, 3 суток, 1 неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года или более чем на три года.

Также здесь предложены способы прогнозирования чувствительности субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина» к иммунотерапевтическому агенту (например, к иммуносупрессивному агенту). В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент. В некоторых воплощениях способ включает введение меченого агента, связывающегося с CD8, описанного здесь, и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, где выявление связывания указывает на то, что субъект нуждается в лечении иммунотерапевтическим агентом. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает введение терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого было выявлено связывание.

Кроме того, предложены способы мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», получившего или получающего иммунотерапевтический агент (например, иммуносупрессивный агент). В некоторых воплощениях способы включают: (а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани, пораженной заболеванием, до введения иммунотерапевтического агента; (б) введение иммунотерапевтического агента; (в) введение меченого агента, связывающегося с CD8, субъекту и выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани, пораженной заболеванием, во временной точке после введения иммунотерапевтического агента; и (г) измерение разности мечения CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани до и после введения иммунотерапевтического агента. В некоторых воплощениях снижение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во временной точке после введения иммунотерапевтического агента по сравнению с временной точкой до введения иммунотерапевтического агента указывает на положительный ход лечения (например, полезные или желаемые клинические результаты). В некоторых воплощениях повышение уровней CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во временной точке после введения иммунотерапевтического агента по сравнению с временной точкой до введения иммунотерапевтического агента указывает на отсутствие положительного хода лечения (например, отсутствие полезных или желаемых клинических результатов). В некоторых воплощениях уровень CD8⁺ Т-клеток в ткани определяют в одной, двух, трех, четырех или более последующих временных точках. В некоторых воплощениях данный способ применяют для объяснения механизма неэффективности лечения. В некоторых воплощениях временные точки отстоят друг от друга по меньшей мере приблизительно на 1 сутки, 3 суток, 1 неделю, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года или более чем на три года.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, мечен выявляемой меткой (например, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ¹⁸F, ⁶⁸Ga и так далее) и связывание меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани выявляют посредством ПЭТ или ПЭТ/КТ. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях данный способ применяют при отторжении трансплантата, таком как отторжение трансплантата почки, печени, сердца или сердца/легкого. В некоторых воплощениях данный способ применяют при аутоиммунном заболевании или состоянии, таком как гепатит, волчанка (например, СКВ), васкулит и неврит с демиелинизацией, включая рассеянный склероз.

В некоторых воплощениях иммунотерапевтический агент представляет собой иммуносупрессивный агент. Подходящие иммуносупрессивные агенты включают, без ограничения, преднизон, циклофосфамид, циклоспорин, микофенолата мофетил, ибрутиниб, руксолитиниб и биологические агенты, такие как антитела к TNF-альфа, например, адалимумаб, этанерцепт, голимумаб и инфликсимаб.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, вводят более чем один раз для повторного прогнозирования или мониторинга у субъекта. В некоторых воплощениях способ повторяют или мониторинг у субъекта проводят на протяжении длительного периода времени, такого как по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 10 лет или более, включая любое значение или диапазон между этими значениями.

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, может позволять проводить серийную оценку лимфоидных тканей и органов, вовлеченных в рак, аутоиммунное заболевание или состояние, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина». В некоторых воплощениях уровень (уровни) или сигнал (сигналы), определенные с использованием агента, связывающегося с CD8, у субъекта, могут быть сопоставлены с другими методиками визуализации (например, МРТ). В некоторых воплощениях уровень (уровни) или сигнал (сигналы), определенные с использованием агента, связывающегося с CD8, у субъекта, могут быть сопоставлены с кровяными и/или тканевыми биомаркерами (например, биомаркерами, определяемыми при биопсии тканей).

В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, позволяет проводить мультиплексную визуализацию, например, с применением других методов визуализации, таких как ПЭТ, ОФЭКТ или сцинтиграфия.

В некоторых воплощениях данные визуализации, полученные с использованием агента, связывающегося с CD8, сопоставляют с данными, полученными другими рентгенологическими методами, такими как МРТ, КТ, ультразвуковое исследование или рентгенография.

Фармацевтические композиции

Также предложены композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие агент, связывающийся с CD8, такой как антитело против CD8 (например, VHH против CD8), или полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие агент, связывающийся с CD8, такой как антитело против CD8 (например, VHH против CD8). В некоторых воплощениях композиции содержат один или более чем один агент, связывающийся с CD8, которые связываются с CD8, или один или более чем один полинуклеотид, содержащий последовательности, кодирующие один или более чем один агент, связывающийся с CD8, которые связываются с CD8. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие носители, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, хорошо известные в данной области.

В некоторых воплощениях предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой один или более чем один из агентов, связывающихся с CD8 (например, меченых агентов, связывающихся с CD8), описанных здесь, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из меченых агентов, связывающихся с CD8, описанных здесь, и одно или более чем одно антиоксидантное соединение, такое как метионин и/или N-ацетилтриптофан. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит гистидин, метионин, N-ацетилтриптофан и/или сахарозу. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит гистидин, метионин, N-ацетилтриптофан и сахарозу.

Фармацевтические композиции агента, связывающегося с CD8, как описано здесь, изготавливают смешиванием такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или более чем одним необязательным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают, без ограничения: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилметилбензиламмония, хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропиларабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и лг-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (из менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, белковые комплексы цинка); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители включают здесь также агенты для диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтрально активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например, человеческие растворимые гиалуронидазные гликопротеины РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.). Определенные типичные sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинируют с одной или более чем одной дополнительной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.

Типичные лиофилизированные композиции антител описанный в патенте США №6,267,958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в патенте США №6,171,586 и WO 2006/044908, при этом последние композиции содержат гистидин-ацетатный буфер.

Здесь композиция может, по необходимости, также содержать более чем один активный ингредиент (например, иммунотерапевтический агент) для определенного показания, по которому проводят лечение (например, рак, аутоиммунное заболевание или состояние, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина»), предпочтительно с взаимодополняющей активностью, не оказывающие отрицательного влияния друг на друга. Например, может быть желательным предоставить дополнительный статин. Подходящим образом, такие активные ингредиенты присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для предполагаемых задач.

Активные ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, коацервационными методиками или полимеризацией на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть изготовлены препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул.

Композиции, предназначенные для применения введением in vivo, обычно стерильны. Стерильность может легко быть обеспечена, например, фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.

Изделия и наборы

В некоторых воплощениях предложены изделие или набор, содержащие вещества, полезные для прогнозирования чувствительности субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина») к иммунотерапевтическому агенту, для мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина») и/или мониторинга хода лечения у субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина»).

В некоторых воплощениях изделие или набор содержат контейнер, содержащий один или более чем один из агентов, связывающихся с CD8, или композиции, описанные здесь. В некоторых воплощениях изделие или набор содержат контейнер, содержащий нуклеиновую кислоту (кислоты), кодирующую один (или более чем один) из агентов, связывающихся с CD8, или композиции, описанные здесь. В некоторых воплощениях набор содержит клетку или клеточную линию, продуцирующую агент, связывающийся с CD8 (например, антитело против CD8), как описано здесь.

В некоторых воплощениях набор или изделие содержат VHH против CD8. В некоторых воплощениях набор или изделие содержат меченый агент, связывающийся с CD8, например, иммуноконъюгат, содержащий выявляемую метку. В некоторых воплощениях набор содержит как антитело против CD8 (например, VHH против CD8), так и меченый агент, связывающийся с CD8. В некоторых воплощениях набор или изделие дополнительно содержат реагенты для получения меченого агента, связывающегося с CD8, такие как хелатирующий агент формулы (I) и комплекс [¹⁸F] и алюминия.

В некоторых воплощениях меченый агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с меткой, содержащей ¹⁸F. В некоторых воплощениях агент, связывающийся с CD8, представляет собой VHH против CD8, конъюгированный с комплексом [¹⁸F] и алюминия посредством соединения формулы (I). В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых воплощениях VHH против CD8 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых воплощениях набор содержит один или более чем один положительный контроль, например, CD8 (или его фрагменты) или CD8⁺ клетки. В некоторых воплощениях набор содержит отрицательные контроли, например, поверхность или раствор, по существу свободные от CD8.

В некоторых воплощениях изделие или набор содержат контейнер и этикетку или вкладыш на контейнере или в связи с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты с растворами для внутривенного введения и так далее. Контейнеры могут быть изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая, сама по себе или в комбинации с другой композицией, эффективна для лечения, предотвращения и/или диагностики рака, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один агент в композиции представляет собой агент, связывающийся с CD8, описанный здесь. На этикетке или вкладыше указано, что композиция применяется для прогнозирования чувствительности субъекта с раком к иммунотерапевтическому агенту, для мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком и/или мониторинга хода лечения у субъекта с раком.

Более того, изделие или набор могут содержать: (а) первый контейнер с композицией, содержащей агент, связывающийся с CD8, описанный здесь; и (б) второй контейнер с композицией, содержащей дополнительный цитотоксический или другой терапевтический агент.В некоторых воплощениях терапевтический агент представляет собой иммунотерапевтический агент, как описано здесь.

Изделие или набор, предложенные здесь, могут дополнительно содержать вкладыш, в котором указано, что композиция (композиции) может быть использована для прогнозирования чувствительности субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина») к иммунотерапевтическому агенту, для мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина») и/или мониторинга хода лечения у субъекта с заболеванием (например, раком, аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина»). Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Иллюстративные воплощения

Настоящее изобретение предлагает следующие воплощения:

1. Агент, связывающийся с CD8, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи тяжелоцепочечного антитела (домен VHH), где агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 1 нМ или менее.

2. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 1, связывающийся с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,002/с или менее.

3. Агент, связывающийся с CD8, по воплощениям 1 или 2, где K_D и/или k_off определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса с применением слитого белка одностороннего антитела человека CD8α/CD8β-Fc человека (т.е. одноцепочечного полипептида, содержащего CD8α человека и CD8β человека, который слит с одной полипептидной цепью Fc) в качестве реагента.

4. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-3, связывающийся с CD8 яванского макака с K_D приблизительно 1 нМ или менее.

5. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-4, связывающийся с CD8 яванского макака с k₀fr приблизительно 0,004/с или менее.

6. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 4 или 5, где K_D и/или k_off определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса с применением слитого белка одностороннего антитела яванского макака CD8α/CD8β-Fc яванского макака (т.е. одноцепочечного полипептида, содержащего CD8α яванского макака и CD8β яванского макака, который слит с одной полипептидной цепью Fc) в качестве реагента.

7. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-6, не стимулирующий или ингибирующий активацию CD8⁺ Т-клеток.

8. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-7, не индуцирующий пролиферацию CD8⁺ Т-клеток.

9. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-8, не связывающийся с CD4⁺ Т-клетками.

10. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-9, где домен VHH представляет собой VHH ламы.

11. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-10, где домен VHH гуманизирован.

12. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-11, где домен VHH специфично связывается с эпитопом человеческого CD8α, содержащим Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97, где нумерация аминокислот соответствует SEQ ID NO: 13.

13. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 12, где домен VHH содержит: участок 1, определяющий комплементарность (CDR1), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или 7; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или 9; и CDR3, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 10-12.

14. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 13, где домен VHH содержит:

(1) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

(2) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;

β) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; или

(4) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

15. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 13, где домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

16. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-15, где домен VHH содержит L49A, где нумерация соответствует нумерации Kabat.

17. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-16, где домен VHH содержит одну или более чем одну аминокислотную модификацию, выбранную из группы, состоящей из замены V89T, замены T110Q, замены S112Q и добавления А114, где нумерация соответствует нумерации Kabat.

18. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-17, где домен VHH содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-4.

19. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-18, не содержащий Fc-область.

20. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-19.

21. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по воплощению 20.

22. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по воплощению 20 или вектор экспрессии по воплощению 21.

23. Клетка-хозяин по воплощению 22, представляющая собой эукариотическую клетку.

24. Клетка-хозяин по воплощению 23, представляющая собой клетку млекопитающего.

25. Клетка-хозяин по воплощению 24, представляющая собой клетку Expi293.

26. Клетка-хозяин по воплощению 22, представляющая собой прокариотическую клетку.

27. Способ получения агента, связывающегося с CD8, включающий:

а) культивирование клетки-хозяина по любому из воплощений 22-26 в условиях, при которых она продуцирует агент; и

б) выделение агента, связывающегося с CD8, продуцированного клеткой-хозяином.

28. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-19, где домен VHH конъюгирован с меткой.

29. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 28, где метка представляет собой флуоресцентный краситель, радионуклид или фермент.

30. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 29, где метка представляет собой радионуклид.

31. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 30, где радионуклид представляет собой ¹⁸F, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁴Cu, ⁵²Mn, ¹¹¹In или ¹²⁴I.

32. Агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 28-31, где домен VHH конъюгирован с меткой посредством хелатирующей группировки.

33. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 32, где хелатирующая группировка ковалентно связана с доменом VHH через лизиновый остаток.

34. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 32 или 33, где метка образует комплекс с металлом, где комплекс хелатирован хелатирующей группировкой.

35. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 34, где метка представляет собой ¹⁸F и металл представляет собой алюминий.

36. Агент, связывающийся с CD8, по воплощению 35, где хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I):

37. Способ выявления CD8⁺ клеток у субъекта, включающий:

а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта, где выявление связывания указывает на присутствие CD8⁺ клеток.

38. Способ по воплощению 37, где выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта.

39. Способ по воплощению 38, где визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта.

40. Способ по любому из воплощений 37-39, где CD8⁺ клетки представляют собой CD8⁺ Т-клетки.

41. Способ по любому из воплощений 37-40, где CD8⁺ клетки представляют собой CD8⁺ опухолевые клетки.

42. Способ по любому из воплощений 37-41, где выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее после введения.

43. Способ по любому из воплощений 37-42, повторяемый один или более чем один раз.

44. Способ по воплощению 43, повторяемый через приблизительно 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8.

45. Способ по воплощению 43 или 44, повторяемый от 1 до 4 раз в год.

46. Способ по любому из воплощений 43-45, повторяемый на протяжении более чем 1 года.

47. Способ по любому из воплощений 37-46, имеющий чувствительность от приблизительно 1 нМ до приблизительно 30 нМ.

48. Способ по любому из воплощений 37-47, где субъект представляет собой человека или примата, не являющегося человеком.

49. Способ по воплощению 48, где примат, не являющийся человеком, представляет собой яванского макака или макака-резуса.

50. Способ по воплощению 48, где субъект представляет собой человека.

51. Способ по любому из воплощений 37-50, где у субъекта есть рак.

52. Способ по любому из воплощений 37-50, где у субъекта есть аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина».

53. Способ прогнозирования чувствительности субъекта с раком к иммунотерапевтическому агенту, клеточной терапии или противораковой вакцине, включающий:

а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину.

54. Способ по воплощению 53, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого было выявлено связывание.

55. Способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, включающий:

а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке.

56. Способ по п. 55, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого уровень CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке выше уровня CD8⁺ Т-клеток в опухолевой ткани в первой временной точке.

57. Способ мониторинга хода лечения у субъекта с раком, получившего или получающего иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину, включающий:

1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту вместе с иммунотерапевтическим агентом, клеточной терапией или противораковой вакциной; и

2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани в первой временной точке и во второй временной точке.

58. Способ по воплощению 57, где меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины.

59. Способ по воплощению 57, где иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки.

60. Способ по любому из воплощений 53-54 и 56-59, где субъекту вводят иммунотерапевтический агент.

61. Способ по воплощению 60, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1, антитело против PD-1, антитело против TIGIT, антагонист TIGIT, антитело против CSF-1R, антагонист против CSF-1R, антитело против СЕА, антагонист против СЕА, антитело против CTLA4, антагонист CTLA4, антитело против ОХ40 или агонист ОХ40.

62. Способ по воплощению 61, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1.

63. Способ по воплощению 62, где антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

64. Способ по воплощению 62 или 63, где антитело против PD-L1 вводят в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим агентом.

65. Способ по воплощению 64, где один или более чем один терапевтический агент представляет собой TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), А V AS TIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаб, INF-альфа, агент против CD40, антитело против ОХ40, агонист ОХ40, антитело против CSF-1R, антитело против СЕА, ингибитор IDO или антитело против TIGIT.

66. Способо по воплощению 60, где иммунотерапевтический агент представляет собой цитокин.

67. Способ по ворлощению 66, где цитокин представляет собой IL-2, искусственно сконструированный IL-2, IL-15 или искусственно сконструированный IL-15.

68. Способ по воплощению 60, где иммунотерапевтический агент представляет собой биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, специфично связывающуюся с CD3.

69. Способ по воплощению 60, где иммунотерапевтический агент представляет собой биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, специфично связывающуюся с CD16.

70. Способ по воплощению 68 или 69, где биспецифичная антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

71. Способ по воплощению 69 или 70, где биспецифичная антигенсвязывающая молекула специфично связывается с CD16A.

72. Способ по воплощению 60, где иммунотерапевтический агент предствляет собой модулятор дендритных клеток.

73. Способ по воплощению 72, где иммунотерапевтический агент представляет собой активатор дендритных клеток или фактор роста дендритных клеток.

74. Способ по любому из воплощений 53-54 и 56-59, где субъекту вводят противораковую вакцину.

75. Способ по воплощению 74, где противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину.

76. Способ по любому из воплощений 53-54 и 56-59, где у субъекта проводят клеточную терапию.

77. Способ по воплощению 76, где клеточная терапия представляет собой CAR-T-клетки или неоантиген-специфичные Т-клетки.

78. Способ прогнозирования чувствительности субъекта с аутоиммунным заболеванием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина» к иммунотерапевтическому агенту, включающий:

а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощенй 28-36 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент.

79. Способ по воплощению 78, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого было выявлено связывание.

80. Способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», включающий:

а) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке, где повышение CD8⁺ Т-клеток от первой временной точки до второй временной точки указывает на прогрессирование аутоиммунного заболевания, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина».

81. Способ по воплощению 80, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого уровень CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во второй временной точке ниже уровня CD8⁺ Т-клеток в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке.

82. Способ мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», получившего или получающего иммунотерапевтический агент, включающий:

1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 субъекту вместе с иммунотерапевтическим агентом; и

2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке.

83. Способ по воплощению 82, где меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента.

84. Способ по воплощению 82, где иммунотерапевтический агент вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки.

85. Способ по любому из воплощений 53-84, где выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ Т-клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ Т-клеток у субъекта.

86. Способ по воплощению 85, где визуализация CD8⁺ Т-клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта.

87. Способ по любому из воплощений 53-86, дополнительно включающий другое визуализирующее сканирование (например, ПЭТ, SPECT или сцинтиграфию) в течение 48 часов от визуализации с применением меченого агента, связывающегося с CD8.

88. Способ по любому из воплощений 55-77 и 80-87, где у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

89. Способ идентификации кишечных микробных штаммов, ассоциированных с чувствительностью к лечению иммунотерапевтическим агентом, включающий:

а) получение образцов кишечного микробиома от популяции субъектов с раком, включающей субъектов, чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом, и субъектов, не чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом;

б) анализ образцов кишечного микробиома субъектов, чувствительных к лечению, и образцов кишечного микробиома субъектов, не чувствительных к лечению; и

в) идентификацию кишечных микробных штаммов, ассоциированных с субъектами, чувствительными к лечению, где чувствительность определяют выявлением связывания меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из воплощений 28-36 с CD8⁺ Т-клетками в опухолевой ткани субъектов и где выявление связывания указывает на чувствительность субъектов к иммунотерапевтическому агенту.

90. Способ по воплощению 89, дополнительно включающий изготовление микробиомного лекарственного средства, содержащего кишечные микробные штаммы, ассоциированные с чувствительностью к иммунотерапевтическому агенту.

91. Способ по воплощению 89 или 90, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-1.

92. Способ по воплощению 89 или 90, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1.

93. Способ по воплощению 92, где антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

94. Набор, содержащий меченый агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 28-36.

95. Способ получения меченого агента, связывающегося с CD8, включающий конъюгацию хелатирующей группировки с доменом VHH агента, связывающегося с CD8, по любому из п.п. 1-17, с получением конъюгата и приведение конъюгата в контакт с комплексом фторида алюминия, содержащим ¹⁸F, с получением меченого агента, связывающегося с CD8, где хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I):

96. Способ по воплощению 95, где конъюгат приводят в контакт с комплексом фторида алюминия в присутствии одного или более чем одного антиоксидантного соединения.

97. Способ по воплощению 96, где одно или более чем одно антиоксидантное соединение включает метионин и/или N-ацетилтриптофан.

98. Фармацевтическая композиция, содержащая агент, связывающийся с CD8, по любому из воплощений 1-19 и 28-36 и одно или более чем одно антиоксидантное соединение.

99. Фармацевтическая композиция по воплощению 98, где одно или более чем одно антиоксидантное соединение представляет собой метионин и/или N-ацетилтриптофан.

100. Фармацевтическая композиция по воплощений 98 или 99, дополнительно содержащая гистидин и сахарозу.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Разработка и характеристика VHH против CD8 человека Открытие и начальный скрининг VHH против CD8

Лам иммунизировали одним из двух антигенов, С-концевым hFC-меченным CD8a-рецептором (CD8α-Fc) или одноцепочечным белком с С-концевой гистидиновой меткой, в котором CD8α слит с CD8β посредством линкера (CD8αp-His). Стандартные протоколы иммунизации были такими, как описано в Ghahroudi et al. FEBS 1997 (см. также патент US 6015695). Амплифицировали репертуар тяжелой цепи VHH посредством стандартных способов ОТ-ПЦР, и клонировали в фагмидный вектор для создания библиотеки иммунных фагов. Затем проводили несколько раундов отбора in vitro с использованием фаговых библиотек, с применением CD8αp-His либо CD8α-Fc при различных концентрациях, времени промывки и условий элюирования. После трех и четырех раундов отбора, отдельные фаговые клоны охарактеризовывали посредством ИФА и подвергали секвенированию по Сэнгеру.

Кроме того, с помощью SPR (поверхностный плазмонный резонанс) определяли аффинность связывания выбранных антител VHH с CD8 человека (huCD8α-Fc) и яванского макака (cynoCD8α-Fc). В частности, 2С8.1-Н (также обозначаемый здесь как «wt2C8») проявлял хорошую аффинность и связывание с клетками huCD8⁺ HPBALL (ФИГ. 3).

Экспрессия и очистка УИН

Уникальные последовательности, идентифицированные при пэннинге фагов, экспрессировали в векторе экспрессии млекопитающих, содержащем С-концевую His-метку. Экспрессированные VHH подвергали двухэтапной очистке: на колонке Ni Sepharose excel со смолой для очистки меченого гистидином белка (GE Healthcare) с последующей эксклюзионной хроматографией (SEC). VHH без метки также экспрессировались в клетках млекопитающих. VHH без метки подвергали ионообменной очистке (колонка SP) или очистке на смоле с рекомбинантным белком А (GORE) с последующей SEC.

Описание посредством SPR

Аффинность связывания для каждого варианта VHH как с человеком (одностороннее одноцепочечное huCD8α/huCD8β-Fc), так и с яванским макаком (одностороннее одноцепочечное cynoCD8α/cynoCD8β-Fc) определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Эксперименты SPR проводились на Biacore Т200 (GE Healthcare) при 37°С с использованием рабочего буфера HBS-P+(GE Healthcare). 1,5 мкг/мл CD8αp-Fc улавливали с использованием набора для захвата Fc против HulgGI (GE Healthcare) и добавляли мономерные VHH в качестве аналита в растворе при скорости потока 100 мкл/мин. VHH титровали, используя серию разведений от 100 до 0 нМ. Сенсограммы были согласованы с моделью Ленгмюра 1:1 для определения кинетических параметров, включая KD, k_on и k_off.

Идентификация вариантов УИН, специфичных в отношении СР8⁺ клеток Рекомбинантные VHH, слитые с С-концевым Fc hulgGI, экспрессировали, очищали и подвергали скринингу посредством FACS против клеток huCD8⁺ HPBALL, линии клеток Т-клеточного лейкоза человека, экспрессирующих CD8 (DSMZ, Германия). Эмбриональные клетки почки человека (НЕК), полученные из АТСС, были включены в качестве контрольной клеточной линии, не экспрессирующей CD8. Приблизительно 300000 клеток высевали в круглодонные 96-луночные планшеты в присутствии 100 мкл среды RPMI с добавлением 10% об./об. эмбриональной бычьей сыворотки и 1% об./об. пенициллина-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific). Варианты VHH, слитые с Fc IgG человека, инкубировали с клетками в концентрации 10 мкг/мл в течение 60 минут при 37°С.Затем несвязанный VHH отмывали и к клеткам добавляли козье антитело ALEXA FLUOR^® 647 против IgG Fc человека (Jackson Immuno Research, Inc.) в концентрации 7,5 мкг/мл на 60 минут при 37°С.Затем клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и анализировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences). Образцы анализировали в двух повторностях. OKT8-Fc, полученный из четырехцепочечного антитела, связывающего CD8α человека, служил в качестве положительного контроля Результаты представлены на ФИГ. 3, которая показывает, что 2С8 VHH-Fc имеет сравнимую аффинность и связывание с клетками HPBALL, что и OKT8-Fc. Связывание с цельными клетками крови и РВМС

2С8 VHH был выбран для дальнейшего FACS-анализа цельной крови человека и соответствующих образцов РВМС.VHH экспрессировали в виде His-меченых мономеров и непосредственно метили ALEXA FLUOR^® 647.

Вкратце, образцы цельной крови от 4 здоровых доноров (Health center, Genentech) собирали при комнатной температуре и обрабатывали менее чем через 30 минут после забора крови. Для каждого донора образец объемом 1 мл сохраняли для прямого окрашивания, а образец объемом 4 мл использовали для выделения моноцитов периферической крови (РВМС) (разделение Ficoll-Paque) перед окрашиванием. Чтобы избежать неспецифического связывания, цельную кровь или РВМС инкубировали перед окрашиванием с 20 мкл FcR-блокирующего человеческого реагента (Miltenyi Biotech) на 1000 мкл или 10⁷ клеток соответственно. 100 мкл цельной крови или 5×10⁴ РВМС распределяли в 96-луночные планшеты с глубокими лунками для окрашивания посредством проточной цитометрии. Флуоресцентно меченные антитела готовили посредством опосредованной EDC-NHS конъюгации с красителем ALEXA FLUOR^® 647 (AF647) в соответствии с протоколом производителя (Thermo Fisher Scientific).

Варианты OKT8-AF647 или VHH-AF647 (20 нг/мл), анти-CD14 VioBlue (Miltenyi Biotech; 1/25), анти-CD16 PerCP Су5.5 (Becton-Dickinson; 1/200), анти-CD4 VioBright-FITC (Miltenyi Biotech; 1/50), анти-CD3 APC-Vio770 (Miltenyi Biotech; 1/50) добавляли в виде смеси предварительно смешанных антител на 10 минут при комнатной температуре. Затем образцы ресуспендировали с 2 мл раствора, лизирующего эритроциты (Becton Dickinson), тщательно перемешивали и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре перед центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об/мин. После удаления супернатанта осадки промывали PBS IX, BSA 0,5% перед сбором на анализаторе MacsQuant 10 (Miltenyi Biotech).

Тот же протокол применяли для окрашивания РВМС, за исключением того, что не выполняли этап лизиса эритроцитов.

На ФИГ. 4 представлены результаты с использованием образцов клеток цельной крови. OKT8 и 2С8 VHH демонстрируют схожие паттерны окрашивания, включая сильное окрашивание CD8⁺ Т-клеток и низкий уровень окрашивания CD3^- клеток (например, NK-клеток). Эксперименты с образцами РВМС дали аналогичные результаты. 2С8 VHH прочно связывается только с популяцией CD3⁺CD8⁺ Т-клеток как в цельной крови (которая содержит многоядерные и мононуклеарные клетки), так и в РВМС (которая содержит только мононуклеарные клетки), подтверждая специфичность к CD8 человека.

Структурная характеристика

Для определения эпитопа 2С8 на CD8α определяли кристаллическую структуру 2С8, связанного с гомодимерным CD8αα (ФИГ. 5А-5 В). 2С8 связывается с вершиной CD8α и контактирует с Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97. Каждый из этих аминокислотных остатков CD8α находится в пределах примерно 4,5 А (0,45 нм) от одного или нескольких аминокислотных остатков 2С8 в кристаллической структуре. Этот эпитоп не перекрывается со связывающим эпитопом мышиного CD8αp в комплексе с MHCI (Wang et al. J Immunol 2009).

Созревание аффинности посредством мутагенеза NNK-кодонов VHH CDRs

Начальная аффинность 2С8 считалась субоптимальной для чувствительного обнаружения клеток CD8⁺ без какого-либо механизма продления периода полужизни, такого как пегилирование, как описано в Rashidian et al. JEM 2017. Чтобы идентифицировать мутации в 2С8, улучшающие аффинность, авторы изобретения выполнили мутагенез NNK-кодонов CDR 2С8, как описано Koenig, et al. JBC 2015.

Вкратце, была создана библиотека сканирования CDR NNK, в которой каждый мутант содержит одну мутацию, и вся библиотека включает все 20 аминокислот в каждом положении CDR в VHH. Библиотеку клонировали в фагмидный вектор и подвергали нескольким раундам фагового пэннинга против CD8α-hFc с уменьшением концентрации и увеличением времени промывки. Домен VHH был амплифицирован из исходной библиотеки и библиотеки, отобранной в раунде 3, и подвергнут секвенированию следующего поколения (NGS). NGS выполняли на ампликонах амплифицированной ДНК с использованием прибора MiSeq (Illumina). Коэффициенты обогащения определяли путем деления частоты каждой мутации после 3 раундов селекции на частоту каждой мутации в исходной библиотеке.

При анализе результатов NGS авторы изобретения обнаружили, что A99G и AlOOfD были сильно обогащены. Генерация 2С8 с мутациями A99G и AlOOffl улучшила аффинность примерно в 10 раз по сравнению с родительским клоном.

Гуманизация 2С8

Авторы изобретения гуманизировали 2С8 путем пересадки CDR (30-35 (H1), 50-65 (Н2) и 94-102 (Н3)) на IGHV3-23*04. Все остатки Вернье от ламы также были пересажены на соответствующие им места. Авторы изобретения оставили несколько остатков ламы (F37, R45, G47 и L49) в каркасе, поскольку они необходимы для поддержания связывания, стабильности и экспрессии растворимых форм VHH. После характеристики SPR авторы изобретения определили, что только остатки Вернье S71 и V78 необходимы для поддержания связывания с высокой аффинностью. При гуманизации авторы изобретения заметили очень плохое связывание со смолами белка А, несмотря на наличие предпочтительного остатка во всех местах контакта белка А (как описано в Henry et al. PLoS One 2016). Авторы изобретения исследовали потенциальные остатки за пределами тех остатков, которые непосредственно контактируют с белком А, что могло бы косвенно изменить конформацию остатков VHH, важных для связывания с белком А. Авторы изобретения идентифицировали L49 как один из таких остатков. После его мутации на Ala (L49A) авторы изобретения наблюдали значительное увеличение восстановления VHH после очистки по остатку белка А (Таблица 3).

Уменьшение связывания с уже существующими АРА

Предыдущие клинические данные по VHH показали, что у пациентов ранее существовали антитела против VHH [Cordy et al. Clin Exp Immunol 2015; Holland et al. J Clin Immunol 2013; Papadopoulos et al. Cancer Chemother Pharmacol 2015]. Авторы изобретения оценили связывание вариантов VHH с ранее существовавшими антителами против VHH, ввели четыре каркасные мутации (V89T, T110Q, S112Q и добавление А114) для снижения риска, связанного со связыванием с этими ранее существовавшими антителами.

Для проведения анализа VHH на антитела к лекарственным препаратам, вариантами VHH покрывали планшеты Maxisorp в концентрации 2 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали PBS+0,5% BSA+0,1% Tween20 (PBSBT) и блокировали в течение 2 часов при 25°С с 2% BSA. Индивидуальные образцы сыворотки от 96 различных здоровых доноров разводили в соотношении 1:50 и инкубировали с лунками, покрытыми VHH, и пустыми лунками, в течение 1-2 часов при 25°С при встряхивании. После промывки добавляли анти-человеческое Fc-специфическое антитело HRP 2° (1:10000) на 30 минут при 25°С при встряхивании. После промывания PBSBT планшеты проявляли субстратом ТМВ в течение 10 минут и проводили детекцию при 650 нм.

Как показано на ФИГ. 6, каркасные мутации устраняют связывание анти-CD8 VHH с уже существующими анти-VHH антителами, полученными от 96 здоровых доноров.

В целом, авторы изобретения разработали несколько гуманизированных и оптимизированных клонов (v130, v142 и v144), которые прочно связываются как с CD8α человека, так и с CD8α яванского макака. На ФИГ. 1 и в Таблице 4 показаны аминокислотные последовательности иллюстративных клонов VHH.

В Таблицах 5 и 6 показана аффинность 2C8v142 и 2C8v144 к ар, определенная с помощью SPR, соответственно. 2C8v144 имеет высокую аффинность к CD8α человека и яванского макака и относительно низкую скорость диссоциации. Клон 2C8v142 содержит мутацию W98F в CDR3 по сравнению с 2C8v144, что делает 2C8v142 менее склонным к окислению при воздействии высоких уровней радиации по сравнению с 2C8v144.

Влияние на функционирование Т-клеток

Чтобы оценить потенциальное влияние связывания 2С8 VHH на функцию CD8⁺ Т-клеток, авторы изобретения провели анализ пролиферации Т-клеток in vitro в присутствии 2C8.v130.

Вкратце, свежевыделенные РВМС от трех здоровых доноров промывали в PBS IX и осадки ресуспендировали в концентрации 10×10⁶ клеток на мл в PBS1X. Перед инкубацией в течение 5 минут при комнатной температуре добавляли равный объем свежеприготовленного рабочего раствора 2,5 мкМ

карбоксифлуоресцеинсукцинимидилового эфира (CFSE) (Molecular Probe). Мечение останавливали добавлением 9 объемов RPMI, 10% FBS, перед центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об/мин. Перед подсчетом и распределением клеток проводили две дополнительные промывки средой RPMI, 10% FBS.

100000 меченых CFSE клеток высевали в круглодонный 96-луночный планшет для поликлональной стимуляции с использованием анти-СОЗ в концентрации 0,2 мкг/мл (Becton Dickinson; предварительно покрытый планшет) плюс свежедобавленное анти-CD28 в концентрации 1 мкг/мл или суперантиген стафилококкового энтеротоксина В (SEB) в концентрации 0,4 мкг/мл (пробирка TruCulture; Myriad RBM). Для антиген-специфической стимуляции 500000 меченых CFSE клеток высевали в круглодонный 96-луночный планшет, и в каждую лунку добавляли 2 мкг/мл пула пептидов CEF (Mabtech). 10 нг/мл липополисахарида («LPS», Sigma) использовали в качестве врожденного контроля активатора клеток, и только среду (RPMI, 10% FBS) использовали в качестве отрицательного контроля. Наконец, для всех условий в трех повторностях добавляли PBS IX, 2C8v130 VHH (конечная концентрация 1 мкг/мл и 10 мкг/мл) или Lys2 VHH (10 мкг/мл), контроль, до конечного объема 200 мкл на лунку. Контрольный Lys2 VHH связывает лизоцим и был описан De Genst, et al. JBC 2005.

Кроме того, для оценки потенциального влияния циркулирующих молекул крови человека на эффект связывания VHH FBS, в культуральной среде заменяли 10% аутологичной плазмы без стимуляции или SEB 0,4 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С перед анализом.

После центрифугирования планшета супернатант удаляли и осадки один раз промывали PBS IX. Добавляли 100 мкл разбавленного раствора фиксируемого красителя, позволяющего оценить жизнеспособность клеток (Live Dead Aqua, ThermoFischer), и клетки инкубировали 15 минут при 4°С перед промывкой PBS, 0,5% BSA. Смесь предварительно смешанных антител, содержащую анти-CD4 APC-Vio770 (Miltenyi Biotech; 1/50), анти-СОЗ Pacific Blue (Becton Dickinson; 1/100), анти-CD8α APC (Becton Dickinson; 1/100) добавляли к осадкам. Клетки инкубировали в течение 20 минут на льду перед промывкой PBS и анализом проточной цитометрией с использованием MacsQuant 10 (Miltenyi Biotech).

На ФИГ. 7А-7Е показаны результаты анализов пролиферации с использованием меченых CFSE РВМС человека (n=3) в присутствии высоких (10 мкг/мл) или более низких (1 мкг/мл) насыщающих концентраций 2C8.v130, высокой концентрации (10 мкг/мл) не связывающего CD8 VHH (Lys2) или PBS (носитель). Без стимуляции (культуральная среда, ФИГ. 7А) ни 2C8.v130, ни Lys2-VHH не индуцировали фоновую пролиферацию среди трех протестированных доноров, что указывает на то, что добавление VHH со связыванием или без связывания с CD8⁺ клетками не запускает неспецифическую Т-клеточную активацию. При поликлональной стимуляции анти-CD3/CD28 (ФИГ. 7В) для всех доноров была получена оптимальная пролиферация CD8⁺ Т-клеток (более 90% разведения CFSE), а добавление 2C8.v130 или Lys2 VHH не влияло на Т-клеточную активацию. Суперантиген SEB индуцирует перекрестную связь между МНС-П и TCR, но добавление SEB к образцам не обеспечивало оптимальной скорости пролиферации (менее 15% от CFSE low) из-за высокой гибели клеток. Тем не менее, не наблюдалось существенной разницы в различных условиях для одного донора (ФИГ. 7С). Чтобы имитировать более физиологическое взаимодействие комплекса MHC-LTCR/CD8, пул пептидов CEF использовали для активации TCR-специфических CD8⁺ Т-клеток. Однако ни у одного из протестированных доноров не было обнаруживаемых реагирующих CD8⁺ Т-клеток, поскольку скорости пролиферации были аналогичны условиям культуральной среды (фиг. 7D), что подтверждает отсутствие VHH-индуцированной фоновой пролиферации. Таким же образом при стимуляции TLR4 на моноцитах (состояние LPS) непрямая пролиферация Т-клеток не наблюдалась при добавлении VHH (фиг. 7Е).

На ФИГ. 8A-8D представлены сравнения результатов анализов пролиферации с 10% FBS или аутологичной донорской плазмой в качестве культуральной среды. Образцы аутологичной донорской плазмы получали до выделения РВМС и использовали в анализах пролиферации для имитации физиологических условий. Без стимуляции не наблюдалось различий между экспериментами с использованием 10% среды FBS или аутологичной донорской плазмы для всех доноров (ФИГ. 8А и 8 В). Таким образом, в присутствии растворимых факторов плазмы человека VHH также не индуцируют фоновую пролиферацию Т-клеток.

Пример 2. Оценка 2C8v144 VHH для молекулярной визуализации

Меченые 2С8 VHH

Процедуры получения VHH, модифицированного RESCA (ограниченный комплексообразующий агент), и VHH, модифицированного 18F-A1F-RESCA, включая контрольный 18F VHH и 18F анти-CD8 VHH, были адаптированы из ранее описанного протокола (Cleeren F et al. Nature Protocols 13, 2330-2347 (2018)). Типовой RESCA имеет химическую структуру формулы (I). Вкратце, RESCA-конъюгированный VHH добавляли к смеси 18Г-фторида в реакционной среде, состоящей либо из ацетата натрия, либо из ацетата натрия с метионином и N-ацетилтриптофаном. Реакционную смесь очищали с использованием обессоливающей колонки, уравновешенной рецептурным буфером, дополненным гистидином, метионином, N-ацетилтриптофаном и сахарозой, что снижает скорость окисления VHH. В качестве контроля рецептурный буфер дополняли фосфатно-солевым буфером. Рецептурный буфер с гистидином тщательно контролировали по рН и температуре, чтобы ограничить скорость диссоциации ¹⁸F-A1F из RESCA. Конечный продукт анализировали на концентрацию белка, чистоту белка, радиохимическую чистоту и связывание с мишенью (иммунореактивная фракция, где уместно) посредством эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC).

¹⁸F контрольный VHH с использованием 2C8v145 VHH и ¹⁸F анти-CD8 VHH с использованием 2C8v144 были получены с радиохимическим выходом 40-60% (без поправки на распад). Конечный продукт демонстрировал диапазон удельной активности 3,0-6,0 Ки/мкмоль, радиохимическую чистоту более 95%, а для ¹⁸F анти-CD8 VHH - иммунореактивную фракцию, превышающую 94%.

Не ограничиваясь какой-либо теорией или гипотезой, конъюгация анти-CD8 VHH с радионуклидной меткой может привести к окислению одного или нескольких остатков VHH, таких как остатки триптофана, что приводит к снижению способности связывания CD8. Использование антиоксидантных соединений, таких как метионин и/или N-ацетилтриптофан, в реакционном буфере для конъюгации, в буфере для очистки и/или в рецептурном буфере может снизить окисление остатков VHH, тем самым повышая выход функционально меченых анти-CD8 VHH.

Визуализация посредством ПЭТ ксенотрансплантатов химерных СР8⁺ опухолей у мышей

Чувствительность и динамический диапазон ¹⁸F-анти-CD8 VHH оценивали посредством проведения ПЭТ-визуализации ксенотрансплантатов химерных CD8⁺ опухолей у мышей.

Вкратце, HPBALL, экспрессирующую CD8 клеточную линию Т-клеточного лейкоза человека (DSMZ, Германия), смешивали в различных соотношениях с Daudi, клеточной линией лимфомы человека (DSMZ, Германия), лишенной CD8, для получения химерных опухолей с различными концентрациями CD8 для ПЭТ-визуализации с использованием ¹⁸F-анти-CD8 VHH. Вкратце, самкам мышей CB17.SCID.bg инокулировали по 10 миллионов клеток, в смеси НВ88:матригель в соотношении 50:50 подкожно в грудную область спины. Когда размер опухоли достигал приблизительно 400 мм³, животным вводили через хвостовую вену ¹⁸F-анти-CD8 VHH и подвергали динамическому 60-минутному ПЭТ-сканированию на ПЭТ/компьютерном томографе (КТ) Inveon (Siemens Preclinical Solutions, Inc.).

Для оценки экспрессии CD8 после завершения ПЭТ-визуализации химерные опухоли вырезали у мышей и гомогенизировали с использованием гомогенизатора gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) в соответствии с протоколом производителя. Затем полученную клеточную суспензию пропускали через 70-микрометровый клеточный фильтр (Corning) для удаления агрегатов. Затем подсчитывали опухолевые клетки и 300000 клеток высевали в круглодонные 96-луночные планшеты в присутствии 100 мкл среды RPMI. Клетки окрашивали 20 нМ меченого ALEXA FLUOR^® 647 анти-СВ8-антитела OKT8 (60 минут, 4°С), а также окрашивали Sytox Orange для мертвых клеток (15 минут, 4°С) (Thermo Fisher Scientific). Клетки промывали и затем анализировали с помощью проточного питометра FACS Calibur для определения процентного содержания клеток CD8⁺ в опухоли.

Как показано на ФИГ. 9, ¹⁸F-анти-CD8 VHH позволял четко визуализировать CD8⁺ опухолевые клетки посредством ПЭТ-визуализации всего с 10% CD8⁺ клеток HPBALL. Результаты также демонстрируют четкую корреляцию между поглощением ПЭТ (%Ш/г) и концентрацией клеток CD8⁺ HPBALL. Основываясь на предыдущих данных FAC, было подсчитано, что каждая клетка HPBALL имеет примерно 55000-85000 копий молекул CD8, а каждая CD8⁺ Т-клетка имеет 200000-300000 копий молекул CD8. 18F-анти-CD8 VHH является чувствительным визуализирующим агентом, который может обнаруживать низкие уровни (чувствительность примерно 1-30 нМ) экспрессии CD8 на опухолевых клетках.

ПЭТ-визуализация опухолевых ксенотрансплантатов TALL1 у мышей

¹⁸F-анти-CD8 VHH и антитело ⁸⁹Zr-One Armed («OA»)-анти-CD8 (см. публикацию международной патентной заявки №WO2019/033043А2) использовали для визуализации ксенотрансплантатов опухоли TALL1 у мышей. TALL1 представляет собой лейкозную клеточную линию с низким уровнем экспрессии CD8. На основании предыдущих данных FACS было подсчитано, что каждая клетка TALL1 содержит около 12000-15000 копий молекул CD8.

Вкратце, самкам мышей CB17.SCID.bg подкожно инокулировали в правый бок 10 миллионов клеток TALL1 в смеси 50:50 НВ88:матригель. Животных группировали для ПЭТ-визуализации, как только опухоли достигали размера примерно 400 мм³. Для визуализации с использованием антитела ⁸⁹Zr-OA-анти-CD8 животным проводили инъекции через хвостовую вену и подвергали статической ПЭТ на 0, 1, 2 и 5 день. Для визуализации с помощью ¹⁸F-анти-CD8 VHH животным проводили инъекции через хвостовую вену и подвергали динамическому 60-минутному сканированию ПЭТ, как и раньше.

Измерения области интереса (region of interest, ROI) были выполнены на множественных осевых срезах тканей с использованием программного обеспечения IRW (Siemens Preclinical Solutions, Inc.). Интенсивность сигнала от органов с поправкой на распад измеряли в процентах от введенной дозы на грамм (%ГО/г), предполагая эквивалентность 1 сс в 1 грамме мягких тканей.

¹⁸F-анти-CD8 VHH позволяет быстро визуализировать опухоли ксенотрансплантата TALL1 с низким уровнем экспрессии CD8 в течение 1 часа. Как показано на ФИГ. 10, ксенотрансплантатную опухоль TALL1, экспрессирующую CD8, можно было четко визуализировать через 90 минут после инъекции, и было достигнуто высокое соотношение опухоль/кровь, равное 14. Визуализация с использованием ¹⁸F-анти-CD8 VHH может быть завершена в течение 0,5-4 часов. Для сравнения, антитело ⁸⁹Zr-OA-анти-CD8 подходит для значимой визуализации в более длительные моменты времени, то есть от 1 до 5 дней после инъекции. Из-за своего небольшого размера ¹⁸F-анти-CD8 VHH очень быстро проникает в ткани и демонстрирует быстрый почечный клиренс, что облегчает проведение дополнительных ПЭТ-сканирований (таких как ФДГ-ПЭТ) у того же пациента позже в тот же день или повторных сканирований CD8, непосредственно на следующий день. Совместимость с меткой ¹⁸F (или другими метками, такими как ⁶⁸Ga) позволяет проводить процедуры визуализации с анти-CD8 VHH, которые приводят к относительно низкой лучевой нагрузке на пациента, так что дополнительные сканирования можно выполнять на протяжении всего курса лечения в соответствии с общими рекомендациями по дозиметрии для пациента-человека. Например, с ¹⁸F-анти-CD8 VHH можно было бы повторно визуализировать одного и того же пациента примерно до 5 раз в течение типичного курса лечения и наблюдения продолжительностью в несколько месяцев или лет.

ПЭТ-визуализация у макак-резусов

Эксперименты по визуализации проводили с ¹⁸F-анти-CD8 VHH у макак-резусов, чтобы определить, можно ли обнаружить поглощение в тканях, которые обычно богаты CD8. Макаке-резус (2,5 кг) вводили 64 мкг ¹⁸F-анти-CD8 VHH, содержащую дозу облучения 1,2 мКи. Ткани, богатые CD8, такие как лимфатические узлы, тимус и селезенка, можно было четко визуализировать в течение 1 часа после инъекции. Например, верхняя фигура на ФИГ. 11 демонстрирует изображение ПЭТ MIP на первые сутки после инъекции. Напротив, ткани, богатые CD8, не были видны на ПЭТ МГР-изображении в день 1 после инъекции ¹⁸F-контрольного VHH (ФИГ. 11 внизу). Заметен только клиренс в почках.

Пример 3: Способы применения визуализации CD8 для определения эффективности иммунотерапии рака, аутоиммунного заболевания, отторжения трансплантата или реакции «трансплантат против хозяина»

Агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, используют для оценки инфильтрации опухолей и лимфатических узлов клетками CD8⁺ . Такую визуализацию используют для идентификации иммунных фенотипов, которые предсказывают прогноз для пациента и/или ответ на иммунотерапию. Такую визуализацию используют для определения распространенности CD8⁺ Т-клеток в пораженных тканях (например, опухолях) и, например, в других лимфатических узлах. Такую визуализацию используют для выбора иммунотерапевтических агентов или комбинированных терапевтических агентов, которые включают один или несколько иммунотерапевтических агентов, для пациентов, страдающих раком, аутоиммунным заболеванием, таким как колит, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина».

Во всех воплощениях, раскрытых в настоящем документе, иммунотерапия для онкологического больного представляет собой, например, любой агент против PD1 или агент против PD-L1, раскрытые в настоящем документе, такие как моноклональные антитела для лечения рака, биспецифические антитела, которые связывают Т-клетки и ассоциированный с опухолью белок, биспецифические антитела, которые связывают NK-клетки, и ассоциированный с опухолью белок, терапию CAR-T-клетками, неспецифическую иммунотерапию рака и адъюванты, а также ингибиторы иммунных контрольных точек. Биспецифические антитела, которые связывают Т-клетки и ассоциированный с опухолью белок, включают, например, биспецифические антитела против CD3. Биспецифические антитела, которые связывают NK-клетки и белок, ассоциированный с опухолью, включают, например, биспецифические антитела к CD16 (FcgammaRIII), биспецифические антитела к CD 16А, биспецифические антитела к CD56, биспецифические антитела к NKp46 и любые другие биспецифические антитела, связывающие NK-клетки.

В некоторых воплощениях CD8-связывающий агент (например, ¹⁸F-анти-CD8 VHH) можно использовать для лечения, диагностики, прогнозирования, сопутствующей диагностики и мониторинга прогрессирования/ремиссии заболевания, такого как рак, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина», как описано в настоящем документе.

В некоторых воплозщениях СВ8-связывающий агент (например, ¹⁸F-анти-CD8 VHH) можно использовать для визуализации субъекта, у которого наблюдалась неэффективность лечения иммунотерапевтическим агентом при заболевании (таком как рак, аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина»), при этом результаты визуализации объясняют механизм(ы) неэффективности лечения. Например, субъект может получать комбинации атезолизумаба и не отвечать на лечение. Результаты визуализации могут показать, что субъект утратил опухолевые клетки CD8⁺ или все еще имеет опухолевые клетки CD8⁺ , но терапевтические агенты исчерпаны или больше не эффективны против опухолевых клеток CD8⁺ .

Пример 4: Способы применения визуализации CD8 для исследования микробиома и идентификации иммунного фенотипа

Агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, можно использовать для оценки инфильтрации опухолей и лимфатических узлов клетками CD8⁺ . Такая визуализация используется для идентификации иммунных фенотипов, которые лежат в основе паттернов микробиома, предсказывающих прогноз для пациента и/или ответ на иммунотерапию рака.

Кроме того, агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, можно использовать для идентификации паттернов микробиома, которые связаны с конкретными паттернами биораспределения CD8⁺ Т-клеток во всем организме. Такую визуализацию используют, например, для определения распространенности CD8⁺ Т-клеток в опухолях и других лимфатических узлах. Такую визуализацию используют для выбора наиболее надежных биомаркеров микробиома, даже когда прямые ассоциации с результатом зашумлены или слабы.

Резидентные кишечные бактерии могут влиять на ответ пациента на иммунотерапию рака. См., например, Gopalakrishnan et al. (2018) Science. 359(6371):97-103. Соответственно, идентификация ключевых микробных штаммов, связанных с ответом пациентов на иммунотерапию рака, может быть полезна для определения подходящих схем лечения больных раком. Агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, можно использовать для идентификации профиля (профилей) микробиома (например, состава (составов) кишечной флоры), которые коррелируют с ответом пациента на иммунотерапию (например, иммунотерапию, обсуждаемую здесь).

Вкратце, образцы кишечного микробиома (например, образцы фекалий) получают от онкологических больных, которым предстоит пройти иммунотерапию (например, иммунотерапию, описанную в другом месте настоящего документа). Агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, вводят каждому из пациентов перед проведением им иммунотерапии рака, и у каждого пациента оценивают инфильтрацию опухолей и лимфатических узлов клетками CD8⁺ . Затем каждый пациент получает иммунотерапию рака (например, иммунотерапию, описанную в настоящем документе). Агент, связывающий CD8, описанный в настоящем документе, такой как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, снова вводят пациентам после иммунотерапии рака, и инфильтрацию опухоли и лимфатических узлов клетками CD8⁺ оценивают второй раз у каждого пациента. Оценивают уровень инфильтрации CD8 в опухоли (опухолях) пациента и лимфатических узлах после иммунотерапии, а также определяют профиль микробиома каждого пациента (например, типы микробов, а также обилие каждого типа микробов, присутствующих в образце микробиома кишечника). Идентифицируют ключевые микробные штаммы, присутствующие в образцах кишечного микробиома пациентов, у которых наблюдается инфильтрация CD8⁺ Т-клеток в опухоль (опухоли) и лимфатические узлы.

После идентификации ключевых микробных штаммов у пациентов с инфильтрацией CD8⁺ Т-клеток в лимфатические узлы и/или опухоль, из донорского стула, полученного от таких пациентов, изготавливают микробиомный препарат, содержащий ключевые микробные штаммы. Препарат микробиома вводят пациентам, у которых не наблюдается инфильтрации CD8⁺ Т-клеток в лимфатические узлы или опухоль. В качестве альтернативы процедура FMT (трансплантация фекальной микробиоты) проводится пациентам, у которых не наблюдается инфильтрации CD8⁺ Т-клеток в лимфатические узлы и/или опухоль, с использованием донорского стула, взятого у пациентов, у которых наблюдается инфильтрация CD8⁺ Т-клеток в лимфатические узлы и/или опухоли. В некоторых воплощениях FMT или препарат микробиома превращает пациента, у которого не наблюдается инфильтрации CD8⁺ в лимфатические узлы и/или опухоль после иммунотерапии рака, в пациента, который отвечает на иммунотерапию рака.

В некоторых воплощениях визуализацию CD8 проводят у пациента, у которого не наблюдается инфильтрации CD8⁺ в лимфатические узлы и/или опухоль до FMT или до введения препарата микробиома. После FMT или введения препарата микробиома пациент получает иммунотерапию. После иммунотерапии пациенту проводят визуализацию, чтобы определить, приводит ли FMT или препарат микробиома к увеличению инфильтрации CD8⁺ в лимфатические узлы и/или опухоль. В некоторых воплощениях, если повышенная инфильтрация CD8⁺ наблюдается в ответ на лечение иммунотерапией рака после FMT или другого препарата микробиома, то FMT или другой препарат микробиома считается успешным.

Визуализирующий агент CD8, используемый в связи с исследованием и открытием микробиома, может быть любым агентом, связывающим CD8, описанным в настоящем документе, таким как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, с использованием wt2C8 VHH, 2C8v130 VHH, 2C8v142 VHH или 2C8v144 VHH.

В некоторых воплощениях иммунотерапия рака представляет собой ингибитор контрольной точки. В некоторых воплощениях иммунотерапия рака представляет собой терапию, нацеленную на Т-клетки. В некоторых воплощениях терапия, нацеленная на Т-клетки, представляет собой биспецифическое, триспецифическое или мультиспецифическое Т-клеточное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.В некоторых воплощениях иммунотерапия рака представляет собой терапию, нацеленную на NK-клетки. В некоторых воплощениях терапия, нацеленная на NK-клетки, представляет собой биспецифическое, триспецифическое или мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых воплощениях визуализацию CD8 с использованием CD8-связывающего агента, описанного в настоящем документе, такого как ¹⁸F-анти-CD8 VHH, можно применять для оценки CD8⁺ -инфильтрации опухоли и лимфатического узла до, во время и после введения ингибитора контрольной точки или иммуномодулирующей молекулы, такой как фрагмент, нацеленный на CD 16 или CD3. Такую визуализацию используют для определения биомаркеров микробиома, которые связаны с эффективностью ингибитора контрольной точки или иммуномодулирующей молекулы, такой как фрагмент, нацеленный на CD16 или CD3.

Ингибитор контрольной точки, используемый в этом примере, может представлять собой любой ингибитор контрольной точки. В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки представляет собой антитело против PD1 или против PD-L1. В некоторых воплощениях ингибитор контрольной точки представляет собой атезолизумаб (TECENTRIQ^®).

Иммуномодулирующие молекулы могут представлять собой любые молекулы, которые влияют на пролиферацию и инфильтрацию клеток CD8. Примеры включают биспецифические молекулы Т-клеток, такие как антитела, которые связывают CD3 и антиген, ассоциированный с опухолью, и молекулы, которые связывают CD 16 и антиген, ассоциированный с опухолью.

Примеры предложены лишь в иллюстративных целях и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящей заявки. Действительно, различные модификации в дополнение к показанным и описанным здесь станут очевидными для специалистов в данной области техники из вышеприведенного описания и подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Genentech, Inc.

<120> АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С CD8, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 14639-20492.40

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> US 62/895,865

<151> 2019-09-04

<160> 15

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> Lama glama

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Leu Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Ser Phe Trp Ala Cys Thr Arg Pro Glu Gly Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Ser Phe Phe Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp

100 105 110

Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gln Ser Ala

115 120 125

<210> 3

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Ser Phe Phe Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp

100 105 110

Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gln Ser Ala

115 120 125

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Ser Phe Trp Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp

100 105 110

Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gln Ser Ala

115 120 125

<210> 5

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Phe Phe Ser Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp

100 105 110

Tyr Phe Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gln Ser Ala

115 120 125

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Asp Tyr Ala Ile Gly

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Asp Tyr Val Ile Gly

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Cys Ile Arg Ile Phe Asp Arg His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gly Ser Phe Trp Ala Cys Thr Arg Pro Glu Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Gly Ser Phe Phe Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Gly Ser Phe Trp Gly Cys Thr Arg Pro Glu Gly Asp Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 234

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr

20 25 30

Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe

115 120 125

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

195 200 205

Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser

210 215 220

Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr

225 230

<210> 14

<211> 276

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 14

Met Arg Asn Gln Ala Pro Gly Arg Pro Lys Gly Ala Thr Ser Pro Pro

1 5 10 15

Pro Leu Pro Thr Gly Ser Arg Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Leu Arg

20 25 30

Ala Glu Pro Arg Pro Gly Glu Arg Val Met Ala Pro Pro Val Thr Ala

35 40 45

Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Gln

50 55 60

Phe Arg Val Ser Pro Leu Gly Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val

65 70 75 80

Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser

85 90 95

Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Thr Ala Ala Arg Pro Thr Phe Leu Leu

100 105 110

Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln

115 120 125

Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Arg

130 135 140

Asp Phe Arg Gln Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser

145 150 155 160

Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala

165 170 175

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

180 185 190

Thr Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

195 200 205

Ala Gly Gly Ser Val Asn Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

210 215 220

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ala Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

225 230 235 240

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys

245 250 255

Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Gly Lys Pro Ser Leu Ser

260 265 270

Asp Arg Tyr Val

275

<210> 15

<211> 276

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 15

Met Arg Asn Gln Ala Pro Gly Arg Pro Lys Gly Ala Thr Ser Pro Pro

1 5 10 15

Pro Leu Pro Thr Gly Ser Arg Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Leu Arg

20 25 30

Ala Glu Pro Arg Pro Gly Glu Arg Val Met Ala Pro Pro Val Thr Ala

35 40 45

Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Gln

50 55 60

Phe Arg Val Ser Pro Leu Gly Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val

65 70 75 80

Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser

85 90 95

Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Thr Ala Ala Arg Pro Thr Phe Leu Leu

100 105 110

Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln

115 120 125

Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Arg

130 135 140

Asp Phe Arg Gln Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser

145 150 155 160

Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala

165 170 175

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Ser Pro Thr Pro Ala Pro Thr

180 185 190

Thr Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

195 200 205

Ala Gly Gly Ser Val Asn Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

210 215 220

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ala Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

225 230 235 240

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys

245 250 255

Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Gly Lys Pro Ser Leu Ser

260 265 270

Asp Arg Tyr Val

275

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к агенту, связывающемуся с CD8, способу его получения, а также к меченому агенту, композиции и набору, его содержащим. Также раскрыты выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный агент, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение эффективно для выявления CD8+ клеток у субъекта, для прогнозирования чувствительности субъекта с раком к иммунотерапевтическому агенту, клеточной терапии или противораковой вакцине, для мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, для мониторинга хода лечения у субъекта с раком, получившего или получающего иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину, для прогнозирования чувствительности субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина» к иммунотерапевтическому агенту, для мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», для мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», получившего или получающего иммунотерапевтический агент, а также для идентификации кишечных микробных штаммов, ассоциированных c субъектами, чувствительными к лечению иммунотерапевтическим агентом. 17 н. и 65 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Агент, связывающийся с CD8, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи тяжелоцепочечного антитела (домен VHH), где VHH содержит:

(1) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10;

(2) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11;

(3) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11; или

(4) CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12,

и где агент, связывающийся с CD8, специфично связывается с человеческим CD8 с K_D приблизительно 0,15 нМ или менее.

2. Агент, связывающийся с CD8, по п. 1, который связывается с человеческим CD8 с k_off приблизительно 0,002/с или менее.

3. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1, 2, который связывается с CD8 яванского макака с k_off приблизительно 0,004/с или менее.

4. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-3, который не стимулирует или ингибирует активацию CD8⁺ T-клеток.

5. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-4, который не индуцирует пролиферацию CD8⁺ T-клеток.

6. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-5, который не связывается с CD4⁺ T-клетками.

7. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-6, где домен VHH представляет собой VHH ламы.

8. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-7, где домен VHH гуманизирован.

9. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-8, где домен VHH специфично связывается с эпитопом человеческого CD8α, содержащим Arg25, Lys42, Gln44, Val45, Leu46, Leu47, Ser48, Pro50, Thr51, Ser52, Gln75, Arg93, Leu94, Gly95, Asp96 и Thr97, где нумерация аминокислот соответствует SEQ ID NO:13.

10. Агент, связывающийся с CD8, по п. 1, где домен VHH содержит CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.

11. Агент, связывающийся с CD8, по п. 1, где домен VHH содержит: CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12.

12. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-11, где домен VHH содержит L49A, где нумерация соответствует нумерации Kabat.

13. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-12, где домен VHH содержит одну или более чем одну аминокислотную модификацию, выбранную из группы, состоящей из замены V89T, замены T110Q, замены S112Q и добавления A114, где нумерация соответствует нумерации Kabat.

14. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-13, где домен VHH содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 85% идентичность аминокислотной последовательности с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-4.

15. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-13, где домен VHH содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-4.

16. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-13, где домен VHH содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-4.

17. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-16, не содержащий Fc-область.

18. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-17.

19. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 18.

20. Клетка-хозяин для получения агента, связывающегося с CD8, по п. 1, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 18 или вектор экспрессии по п. 19.

21. Клетка-хозяин по п. 20, представляющая собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, в частности клетка Expi293, или прокариотическую клетку.

22. Способ получения агента, связывающегося с CD8, включающий:

а) культивирование клетки-хозяина по п. 20 или 21 в условиях, при которых она продуцирует агент; и

б) выделение агента, связывающегося с CD8, продуцированного клеткой-хозяином.

23. Меченый агент, связывающийся с CD8, который представляет собой агент, связывающийся с CD8, содержащий VHH домен, как определено в любом из пп. 1-17, где домен VHH конъюгирован с меткой.

24. Меченый агент, связывающийся с CD8, по п. 23, где метка представляет собой флуоресцентный краситель, радионуклид или фермент.

25. Меченый агент, связывающийся с CD8, по п. 24, где метка представляет собой радионуклид, возможно где радионуклид представляет собой ¹⁸F, ³²P, ³³P, ⁴⁵Ti , ⁴⁷Sc, ⁵²Fe, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu , ⁶⁴Cu , ⁶⁷Cu , ⁶⁷Ga , ⁶⁸Ga, ⁷⁵Sc, ⁷⁷As, ⁸⁶Y, ⁸⁹Sr, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁰Nb, ⁹⁴Tc, ⁹⁹Tc, ⁹⁹mTc, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Pd, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ^154-158Gd, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹¹Pb, ²¹²Bi , ²¹²Pb , ²¹³Bi, ²²³Ra, и ²²⁵Ac..

26. Меченый агент, связывающийся с CD8, по п. 25, где радионуклид представляет собой ¹⁸F, ⁸⁹Zr, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁴Cu, ⁵²Mn, ¹¹¹In или ¹²⁴I, предпочтительно где радионуклид представляет собой ¹⁸F.

27. Меченый агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 23-26, где домен VHH конъюгирован с меткой посредством хелатирующей группировки.

28. Меченый агент, связывающийся с CD8, по п. 27, где (а) хелатирующая группировка ковалентно связана с доменом VHH через лизиновый остаток; и/или (б) метка образует комплекс с металлом, где комплекс хелатирован хелатирующей группировкой; предпочтительно где метка представляет собой ¹⁸F и металл представляет собой алюминий.

29. Меченый агент, связывающийся с CD8, по п. 28, где хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I):

30. Агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 1-17, или меченый агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 23-29, содержащий домен VHH, конъюгированный с комплексом [¹⁸F]-алюминий через соединение формулы (I), где домен VHH содержит CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6; CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9; и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, где домен VHH содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, предпочтительно где домен VHH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и где указанный агент не содержит Fc-область.

31. Фармацевтическая композиция, обладающая CD-8-связывающей активностью, содержащая:

1) CD8-связывающий агент по любому из пп. 1-17 или меченый CD8-связывающий агент по любому из пп. 23-29; и

2) фармацевтически приемлемый эксципиент.

32. Фармацевтическая композиция по п. 31, дополнительно содержащая одно или более антиоксидантных соединений.

33. Способ выявления CD8⁺ клеток у субъекта, включающий:

a) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 или фармацевтической композиции, содержащей меченый CD8-связывающий агент по любому из пп. 23-29, субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта, где выявление связывания указывает на присутствие CD8⁺ клеток.

34. Способ по п. 33, где выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ клеток у субъекта.

35. Способ по п. 34, где визуализация CD8⁺ клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта;

возможно где субъект представляет собой человека или млекопитающее, отличное от человека, например крысу, мышь, морскую свинку, хомяка, кролика, собаку, кошку, корову, лошадь, козу, овцу, осла, свинью, обезьяну, человекообразную обезьяну или другого примата, отличного от человека; предпочтительно субъект представляет собой человека.

36. Способ по любому из пп. 33-35, где CD8⁺ клетки представляют собой CD8⁺ T-клетки или CD8⁺ опухолевые клетки.

37. Способ по любому из пп. 33-35, где выявление проводят в течение приблизительно 1 суток или менее после введения.

38. Способ по любому из пп. 33-37, повторяемый один или более чем один раз.

39. Способ по п. 38, повторяемый через приблизительно 1 сутки после предшествующего введения агента, связывающегося с CD8.

40. Способ по п. 38 или 39, повторяемый от 1 до 4 раз в год.

41. Способ по любому из пп. 38-40, повторяемый на протяжении более чем 1 года.

42. Способ по любому из пп. 33-41, имеющий чувствительность от приблизительно 1 нМ до приблизительно 30 нМ.

43. Способ по любому из пп. 33-42, где субъект представляет собой человека или примата, не являющегося человеком.

44. Способ по п. 43, где примат, не являющийся человеком, представляет собой яванского макака или макака-резуса.

45. Способ по любому из пп. 33-44, где у субъекта есть рак.

46. Способ по любому из пп. 33-44, где у субъекта есть аутоиммунное заболевание или состояние, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина».

47. Способ прогнозирования чувствительности субъекта с раком к иммунотерапевтическому агенту, клеточной терапии или противораковой вакцине, включающий:

a) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в опухолевой ткани субъекта, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину.

48. Способ по п. 47, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого было выявлено связывание.

49. Способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с раком, включающий:

a) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в опухолевой ткани субъекта в первой временной точке и во второй временной точке.

50. Способ по п. 49, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины субъекту, у которого уровень CD8⁺ T-клеток в опухолевой ткани во второй временной точке выше уровня CD8⁺ T-клеток в опухолевой ткани в первой временной точке.

51. Способ мониторинга хода лечения у субъекта с раком, получившего или получающего иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину, включающий:

1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту вместе с иммунотерапевтическим агентом, клеточной терапией или противораковой вакциной; и

2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в опухолевой ткани в первой временной точке и во второй временной точке.

52. Способ по п. 51, где меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины, и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины.

53. Способ по п. 51, где иммунотерапевтический агент, клеточную терапию или противораковую вакцину вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента, клеточной терапии или противораковой вакцины и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки.

54. Способ по любому из пп. 47, 48 и 50-53, где субъекту вводят иммунотерапевтический агент.

55. Способ по п. 54, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1, антитело против PD-1, антитело против TIGIT, антагонист TIGIT, антитело против CSF-1R, антагонист против CSF-1R, антитело против CEA, антагонист против CEA, антитело против CTLA4, антагонист CTLA4, антитело против OX40 или агонист OX40.

56. Способ по п. 55, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1.

57. Способ по п. 56, где антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

58. Способ по п. 56 или 57, где антитело против PD-L1 вводят в комбинации с одним или более чем одним терапевтическим агентом.

59. Способ по п. 58, где один или более чем один терапевтический агент представляет собой TARCEVA^® (эрлотиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб), GAZYVA^® (обинутузумаб), AVASTIN^® (бевацизумаб), COTELLIC^® (кобиметиниб), ZELBORAF^® (вемурафениб) и COTELLIC^® (кобиметиниб), ALECENSA^® (алектиниб), KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин), HERCEPTIN^® (трастузумаб), PERJETA^® (пертузумаб), полатузумаб, INF-альфа, агент против CD40, антитело против OX40, агонист OX40, антитело против CSF-1R, антитело против CEA, ингибитор IDO или антитело против TIGIT.

60. Способ по п. 54, где иммунотерапевтический агент представляет собой цитокин, такой как IL-2, искусственно сконструированный IL-2, IL-15 или искусственно сконструированный IL-15.

61. Способ по п. 54, где иммунотерапевтический агент представляет собой модулятор дендритных клеток, такой как активатор дендритных клеток или фактор роста дендритных клеток.

62. Способ по п. 54, где иммунотерапевтический агент представляет собой биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, специфично связывающуюся с CD3 или CD16, такой как CD16A.

63. Способ по любому из пп. 47, 48 и 50-53, где субъекту вводят противораковую вакцину.

64. Способ по п. 63, где противораковая вакцина представляет собой персонализированную противораковую вакцину (PCV).

65. Способ по любому из пп. 47, 48 и 50-53, где у субъекта проводят клеточную терапию.

66. Способ по п. 65, где клеточная терапия представляет собой CAR-T-клетки или неоантиген-специфичные T-клетки.

67. Способ прогнозирования чувствительности субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина» к иммунотерапевтическому агенту, включающий:

a) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, где выявление связывания указывает на то, что субъект, вероятно, будет отвечать на иммунотерапевтический агент.

68. Способ по п. 67, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого было выявлено связывание.

69. Способ мониторинга прогрессирования заболевания у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», включающий:

a) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту; и

б) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в ткани субъекта, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке, где повышение CD8⁺ T-клеток от первой временной точки до второй временной точки указывает на прогрессирование аутоиммунного заболевания, отторжения трансплантата или болезни «трансплантат против хозяина».

70. Способ по п. 69, дополнительно включающий стадию:

в) введения терапевтически эффективного количества иммунотерапевтического агента субъекту, у которого уровень CD8⁺ T-клеток в ткани, пораженной заболеванием, во второй временной точке ниже уровня CD8⁺ T-клеток в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке.

71. Способ мониторинга хода лечения у субъекта с аутоиммунным заболеванием или состоянием, отторжением трансплантата или болезнью «трансплантат против хозяина», получившего или получающего иммунотерапевтический агент, включающий:

1) введение меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 субъекту вместе с иммунотерапевтическим агентом; и

2) выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками в ткани, пораженной заболеванием, в первой временной точке и во второй временной точке.

72. Способ по п. 71, где меченый агент, связывающийся с CD8, вводят до иммунотерапевтического агента, где первая временная точка следует после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и предшествует введению иммунотерапевтического агента и где вторая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента.

73. Способ по п. 71, где иммунотерапевтический агент вводят до меченого агента, связывающегося с CD8, где первая временная точка следует после введения иммунотерапевтического агента и после введения меченого агента, связывающегося с CD8, и где вторая временная точка следует после первой временной точки.

74. Способ по любому из пп. 47-73, где выявление связывания меченого агента, связывающегося с CD8, с CD8⁺ T-клетками у субъекта включает визуализацию CD8⁺ T-клеток у субъекта.

75. Способ по п. 74, где визуализация CD8⁺ T-клеток у субъекта включает проведение позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) у субъекта.

76. Способ по любому из пп. 49-66 и 69-75, где у субъекта проводят мониторинг на протяжении более чем 1 года.

77. Способ идентификации кишечных микробных штаммов, ассоциированных c субъектами, чувствительными к лечению иммунотерапевтическим агентом, включающий:

а) получение образцов кишечного микробиома от популяции субъектов с раком, включающей субъектов, чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом, и субъектов, не чувствительных к лечению иммунотерапевтическим агентом;

б) анализ образцов кишечного микробиома субъектов, чувствительных к лечению, и образцов кишечного микробиома субъектов, не чувствительных к лечению; и

в) идентификацию кишечных микробных штаммов, ассоциированных с субъектами, чувствительными к лечению, где чувствительность определяют выявлением связывания меченого агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 23-30 с CD8⁺ T-клетками в опухолевой ткани субъектов, и где выявление связывания указывает на чувствительность субъектов к иммунотерапевтическому агенту.

78. Способ по п. 77, дополнительно включающий изготовление микробиомного лекарственного средства, содержащего кишечные микробные штаммы, ассоциированные с чувствительностью к иммунотерапевтическому агенту.

79. Способ по п. 77 или 78, где иммунотерапевтический агент представляет собой антитело против PD-1 или антитело против PD-L1, такое как атезолизумаб.

80. Набор для применения в способе по любому из пп. 33, 47, 49, 51, 67, 69, 71 и 77, содержащий меченый агент, связывающийся с CD8, по любому из пп. 23-30, и инструкцию по применению агента, связывающегося с CD8.

81. Набор по п. 80, дополнительно содержащий реагенты для получения меченого агента, связывающегося с CD8, такие как хелатирующий агент формулы (I) и комплекс [¹⁸F]- алюминия фторид.

82. Способ получения меченого агента, связывающегося с CD8, включающий конъюгацию хелатирующей группировки с доменом VHH агента, связывающегося с CD8, по любому из пп. 1-4, с получением конъюгата и приведение конъюгата в контакт с комплексом фторида алюминия, содержащим ¹⁸F, с получением меченого агента, связывающегося с CD8, где хелатирующая группировка представляет собой соединение формулы (I):