Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма PB-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 C12N7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству антирабических вакцин, а именно к способу опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением разработанной показательной функции зависимости величины порогового цикла амплификации комплементарной ДНК и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}), репродуцированного в суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Бешенство (Rabies) занимает первоочередное место в ряду вирусных болезней человека и животных, является одним из высокоопасных зоонозов, вызывает поражение центральной нервной системы, энцефаломиелиты, параличи с неизбежным летальным исходом. Данное заболевание представляет собой мировую проблему, которой уделяют особое внимание международные организации (ВОЗ, МЭБ, ФАО, GARC) и ветеринарные службы многих стран мира [1].

Вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму длиной 100-300 нм, диаметром 45-100 нм. На наружной поверхности вирусной частицы имеются выступы в виде шипов длиной 10-12 нм, которые прикреплены к двуслойной липидной оболочке [2]. Геном вируса бешенства представлен несегментированной одноцепочечной негативной спиральной РНК длиной около 12000 н. о., который кодирует 5 основных белков: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок). Между G- и L-цистронами располагается псевдоген (ψ-фрагмент) [2].

Бешенство приводит к значительным экономическим потерям, которые связаны с гибелью животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением лабораторных исследований по постановке диагноза. Система мер для борьбы с бешенством и его профилактики предусматривает иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1].

При изготовлении аттенуированной антирабической вакцины вируссодержащую суспензию, полученную в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, исследуют на определение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК. В классическом варианте определения количества доз вируса бешенства используют монослойную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [2]. Существенными недостатками данного способа являются: 1) длительная процедура анализа (не менее 3 суток); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ.

Данный метод является объективным, высокочувствительным, специфичным и позволяет определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в вирусосодержащих суспензиях в течение 4 часов, не требует использования клеточных линий для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты, и предусматривает оценку степени чистоты выделенных элюатов РНК. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа быстрого определения количества инфекционных частиц вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового опосредованного способа определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины при использовании метода ОТ-ПЦР-РВ. Предложенный способ позволяет:

1) снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения количества инфекционных доз вируса бешенства до 4 ч;

2) исключить вероятность контаминации; 3) повысить степень чистоты элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97; 4) увеличить чувствительность и специфичность анализа; 5) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}) и пороговым циклом амплификации кДНК (C_t), представленной в виде показательной функции с основанием 10: КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040}) с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%. Предложенная модель позволяет опосредованного оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Спектры поглощения экстрактов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 стандартных образцов для оценки степени их чистоты при определении количества инфекционных доз вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса бешенства зарегистрированы при длине волны 260 нм) (n=3).

Фиг. 2 - Зависимость величины порогового цикла амплификации кДНК (C_t) и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}) с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ (n=4, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов амплификации кДНК).

Сущность изобретения заключается в новом подходе по опосредованному определению титра вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ. Заявляемый способ основан на: 1) элюировании РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применением хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианат в соотношении 1:1) и частиц цеолита (силикат алюминия) диаметром около 350 нм; 2) амплификации специфического фрагмента N-гена РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су5 (λ_max флуоресценции=670 нм) и тушителем свечения BHQ-3 (λ_max поглощения=670 нм); 3) детекции ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; 4) определении количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с применением показательной функции с основанием 10, выраженной в виде уравнения: КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)} с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%.

В настоящее время метод ОТ-ПЦР-РВ применяют для детекции нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе вируса бешенства. Для количественной оценки вирусной нагрузки суспензии, в частности, для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97, ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не применялся. Иными словами, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения количества инфекционных частиц вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап элюирования РНК вируса бешенства штамма РВ-97 с применением хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианат) и частиц цеолита диаметром 350 нм; амплификацию специфического фрагмента N-гена РНК вируса бешенства с применение специфических праймеров и молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем Су5 и тушителем свечения BHQ-3 (праймеры и зонд рассчитаны для консервативного участка N-гена производственного штамма РВ-97 вируса бешенства); детекцию ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; новый подход к методике расчета количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с применением модели зависимости порогового цикла амплификации ДНК для кривой флуоресценции и КИД вируса бешенства штамма РВ-97 в виде показательной функции с основанием 10. Применение предложенного способа позволит снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения КИД вируса бешенства штамма РВ-97 до 4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту элюата РНК вируса бешенства; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование; повысить достоверность проводимого анализа. Исходя их этого, актуально применять данный способ для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.

Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование пороговых циклов кривых реакции амплификации кДНК вируса бешенства штамма РВ-97 в режиме реального времени и определение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 с использованием разработанной математической модели зависимости порогового цикла амплификации кДНК-мишени и количества инфекционных доз вируса.

Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа ОТ-ПЦР-РВ, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок N-гена вируса бешенства штамма РВ-97, и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации кДНК и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 для опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины порогового цикла амплификации кДНК (C_t) и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}) (n=4) (фиг. 2).

Для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливают контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых используют суспензии вируса бешенства указанного штамма с КИД: 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ ККИД₅₀/см³ (культуральных клеточных инфекционных доз, вызывающих поражение 50% клеток, в 1,0 см³). В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97.

На первом этапе исследования из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют РНК вируса бешенства. Для этого применяют частицы цеолита с диаметром 350 нм. Учитывая, что размер вирионов составляет 100-300 × 45-100 нм, частицы цеолита диаметром 350 нм оптимально подходят для сорбирования вирионов вируса бешенства. Для лизиса белковых клеточных структур и вирусных частиц, а также ингибирования РНКаз и ДНКаз используют хаотропную смесь, а именно 3М мочевину и 3М гуанидинизотиоцианат в соотношении 1:1. Данный комплекс денатурирует белковые молекулы и нуклеиновые кислоты. Хаотропные компоненты в растворенном состоянии увеличивают энтропию системы путем нарушения межмолекулярных взаимодействий, а именно, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобных эффектов. Структура и функции макромолекул определяются влиянием данных сил, поэтому увеличение концентрации хаотропных растворенных веществ в биологической системе приводит к денатурации белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, используемые хаотропные агенты уменьшают гидрофобные взаимодействия между молекулами и, тем самым, влияют на липидный слой клеток и вириона вируса бешенства, что приводит к лизису [3, 4]. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляют 350 мкл указанной выше хаотропной смеси, перемешивают на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляют 20 мкл суспензии цеолита с диаметром частиц 350 мкл и инкубируют в процессе медленного перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют при 1500 об/мин, удаляют супернатант и проводят промывание частиц от ингибиторов реакции амплификации кДНК с помощью 4М раствора гуанидинизотиоцаната, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Проводят отмывание цеолитовых частиц с применением 80% раствора изопропанола-2 в объеме по 450 мкл. Осуществляют центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Данную процедуру повторяют. Полученный осадок частиц цеолита с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты высушивают от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляют 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3 минут для получения элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97. Содержимое пробирки центрифугируют при 14000 об/мин в течение 30 с и отбирают элюат РНК. Полученный экстракт РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.

На следующем этапе осуществляют спектральный анализ элюата суммарной РНК вируса бешенства, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [5]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка, если OD₂₆₀/OD₂₈₀ (коэффициент экстинкции R₁) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R₁ указывают на наличие ДНК, белковых составляющих в элюате. Более высокие значения коэффициента R₁ свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса бешенства штамма РВ-97 считают незагрязненным полисахаридами, если OD₂₆₀/OD₂₃₅ (коэффициент экстинкции R₂) приближен к значению 2,000 [4]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие R₂ снижается на 0,002. Значения коэффициента R₂ большие 2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD₃₂₀ приближено к нулевому значению [5]. При несоответствии требованиям чистоты повторно проводят этап выделения РНК вируса бешенства из суспензии.

На следующем этапе проводят ОТ-ПЦР-РВ для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей N-гена вируса бешенства производственного штамма РВ-97 и других изолятов, опубликованных в базах данных GeneBank [6] и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

В качестве гомологичных участку N-гена вируса бешенства штамма РВ-97 олигонуклеотидов используют Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер (5'-GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AGA-A-3'), Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер (5'-GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG-AA-3') и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд (5'-Cy5-CAC-CTC-CCC-TTT-AAG-TTT-GCT-TTA-TT-BHQ3-3') в концентрации 5 пМ на реакцию с внесением в реакционную смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К⁺) (5⋅10^-2M) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). DMSO включают в реакционную смесь для сведения к минимуму неспецифического связывания олигонуклеотидов. В смесь также добавляют 2 мМ хлорида магния. Содержание деионизированной воды составляет 46%. В качестве катализаторов ОТ-ПЦР-РВ применяют следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.) и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (10 ед.). Элюаты суммарной РНК вируса бешенства каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Праймеры для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [7, 8]. Длины Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Су5/BHQ3-зонда составляют 22, 23 и 26 и.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.) [7, 8]. Молекулярный вес олигонуклеотидов Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда равен 6873; 7024 и 7829 (без учета флуорофора и гасителя свечения), соответственно. Процентное содержание G и С в Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймере, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймере и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонде составляет 45, 48 и 42%, соответственно, что нормально (допустимо 40-60%) [7, 8, 9, 10]. На 5'-конце праймеров и зонда отмечается преобладание G и С, а на 3'-конце - А и Т. На 3'-конце олигонуклеотидных праймеров располагается полиадениловый фрагмент (poly(A)). Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор Су5 присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ3 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ОТ-ПЦР-РВ [7, 8]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Су5 с длиной волны максимальной флуоресценцией 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения 620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ОТ-ПЦР-РВ вируса бешенства штамма РВ-97. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли несколько методов. Один из них -метод, учитывающий концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) с применением формулы [9, 11]:

где: [К⁺] - концентрация ионов калия (М),

[% DMSO] - количество диметилсульфооксида (%),

G - количество остатков гуанозинтрифосфата,

С - количество остатков цитидинтрифосфата.

Данный метод не является высокоточным, но он позволяет приблизительно оценить температуру плавления олигонуклеотидов.

Другой метод, который применяли в работе, высокоточный и основан на модели ближайших соседей (nearest neighbour) с применением расчетной формулы [12, 13]:

где: dH - дифференциал энтропии (ккал/моль),

dG - дифференциал энергии Гиббса (ккал/моль),

dS - дифференциал энтальпии (кал/°К⋅моль),

С - концентрация олигонуклеотида (М),

L - длина олигонуклеотида,

[К⁺] -концентрация ионов калия (М),

ln - натуральный логарифм.

В данной формуле учитывается длина олигонуклеотида (L), концентрация ионов калия ([К⁺]=5⋅10^-2M), газовая постоянная (R=1,987 кал/К⋅моль), концентрация олигонуклеотида в (с=2⋅10^-7M), значения энтропии (dH) (в ккал/моль) и энтальпии (dS) (в кал/°К⋅моль). Значения dH и dS вычисляли в соответствии с общеизвестными формулами и термодинамическими параметрами для ближайших соседей (NN) пар нуклеотидов при концентрации NaCl 1М [12, 13]. Расчеты термодинамических параметров проводили при условии, что концентрация NaCl 1 M, температура 25°С и значение водородного показателя рН 7,0.

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления [11] разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и зонда представлены в таблице 3. Из данных таблицы 3 видно, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера составили 173,0 ккал/моль, 27 ккал/моль, 454,4 кал/(°К⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера составили 185,6 ккал/моль, 30,4 ккал/моль, 484,4 кал/(°К⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 212,0 ккал/моль, 33,8 ккал/моль, 558,2 кал/(°К⋅моль), соответственно. Данные значения были необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 53, 58 и 58°С, соответственно. Исходя из полученных данных температура отжига (Т_а) примерно на 1-5°С ниже T_m.

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K⁺ и диметилсульфооксида (DMSO) T_m для Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймера, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймера и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонда составили 60, 63 и 65°С. Иными словами, температура отжига праймеров и зонда должна быть ниже полученных значений на 1-5°С.

Экспериментально было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 52, 57, 57°С. Для проведения ОТ-ПЦР-РВ было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком N-гена вируса бешенства штамма РВ-97 при температуре 55°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства [6]. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [10]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем амплификаторе любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР-РВ осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. ПЦР-РВ включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг праймеров и зонда, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 55°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 68°С в течение 30 с.

Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(C_t). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации кДНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде сигмоиды). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспонециальная кривая.

Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1,/k-1), где k -угловой коэффициент в зависимости C_t=10^^{(-k⋅КИДвб рв-97+b)}, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение КИД вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины.

Пример 1. Выражение функции зависимости количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины и порогового цикла реакции амплификации в виде показательного уравнения с основанием 10.

Для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливали контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых использовали суспензии вируса бешенства указанного штамма с КИД: 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ ККИД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97.

На первом этапе исследования из всех контролей выделяли РНК вируса бешенства. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляли 350 мкл хаотропной смеси (3М мочевина и 3М гуанидинизотиоцианата в соотношении 1:1), перемешивали на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляли 20 мкл суспензии цеолита с диаметром частиц 350 мкл и инкубировали в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугировали при 1500 об/мин, удаляли супернатант и проводили промывание частиц от ингибиторов реакции амплификации кДНК с помощью 4М раствора гуанидинизотиоцаната, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Смесь центрифугировали при 1500 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Проводили отмывание цеолитовых частиц с применением 80% раствора изопропанола-2 в объеме по 450 мкл. Осуществляли центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию проводили дважды. Полученный осадок частиц цеолита с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты высушивали от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg²⁺, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3 минут для получения элюата РНК вируса бешенства штамма РВ-97. Содержимое пробирки центрифугировали при 14000 об/мин в течение 30 с и отбирали элюат РНК.

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (l=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (фиг. 1, таблица 5).

По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD_205-259 и OD_261-325 не превышали OD₂₆₀, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (фиг. 1) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экстинкции (R₁) для стандартов приближены к норме 2,000 (R₁=1,994-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R₁ не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и гуанидинизотиоцианатом, поскольку значения коэффициента экстинкции (R₂) приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,998-2,000. Учитывая, что при замещении 1% РНК на углеводы значение R₂ уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей составило не более 1%, что допустимо. Разрушения РНК в экстрактах данным методом не обнаружено. Таким образом, экстракты РНК вируса бешенства, выделенные из стандартов, характеризовались высокой степенью чистоты [5].

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ для исследования стандартов. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с данными таблицы 1. Постановку реакции осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Результаты ОТ-ПЦР-РВ анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C_t, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f(C_t). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Полученные данные отражены на фиг.2 и выражены в виде показательной функции с основанием 10: КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)}. Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-1/k-1) (k брали из функции C_t=10^^{(-k⋅КИДвб рв-97+b})), а также достоверность аппроксимации (R²). Эффективность реакции амплификации составила 99,99%, достоверность аппроксимации - 0,9927, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [2].

Пример 2. Тестирование способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ.

Для анализа использовали 6 суспензий культурального вируса бешенства производственного штамма РВ-97 с количеством инфекционных доз вируса 10^6,50, 10^6,75, 10^7,00, 10^7,25, 10^7,50, 10^7,75 ККИД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с титром вируса 10^7,00 ККИД₅₀/см³. Отрицательными контролями служили суспензии клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не зараженные вирусом бешенства, и не зараженные вирусом бешенства штамма РВ-97. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1.

Из данных спектрального анализа (таблица 6) шести элюатов РНК проб вируса бешенства штамма РВ-97 следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD₂₆₀, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции (R₁) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 составляли 1,996-2,000, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие белка. Коэффициенты экстинкции (R₂) для проб вируса соответствовали значениям 1,996-2,000, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [5], и их можно использовать для дальнейших исследований.

С полученными экстрактами РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ получали данные, которые отражены в таблице 6. Из данных таблицы 6 следует, что средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 12,30±0,01, 11,40±0,03, 10,57±0,03, 9,87±0,01, 8,94±0,01, 8,15±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной показательной функцией КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)} (R²=0,9927, E=99,99%), рассчитали средние значения КИД вируса бешенства для проб №1-6, которые составили 10^6,50, 10^6,77, 10^7,02, 10^7,23, 10^7,51, 10^7,75 ККИД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 10,64±0,01, что соответствовало КИД вируса бешенства штамма РВ-97, равному 10^7,00 ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей сигмоиды не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.

Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21/2-17 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом и в ОТ-ПЦР-РВ. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток и ОТ-ПЦР-РВ на 99-100%) (n=8). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Таким образом, разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Пример 3. Определение степени достоверности оценки количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ.

Для анализа использовали 320 суспензий культурального вируса бешенства производственного штамма РВ-97 с количеством инфекционных доз вируса от 10^1,00 до 10^8,00 ККИД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с титром вируса 10^7,00 ККИД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, не зараженную вирусом бешенства, и не зараженную вирусом бешенства штамма РВ-97. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 7.

Из данных спектрального анализа 320 элюатов РНК проб вируса бешенства штамма РВ-97 следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 261-325 нм не превышали OD₂₆₀, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах отсутствовали выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициенты экстинкции (R₁) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 составляли 1,990-2,001, что приближено к значению нормы 2,000 и означало высокую степень чистоты элюатов вирусной РНК, практически полное отсутствие белка. Коэффициенты экстинкции (R₂) для проб вируса бешенства штамма РВ-97 соответствовали значениям 1,998-2,002, что близко к норме 2,000 и обуславливало высокую чистоту элюатов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [5], и их можно использовать для дальнейших исследований.

С полученными экстрактами РНК вируса бешенства штамма РВ-97 проводили ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ получили данные, результат обработки которых отражен в таблице 7. Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной показательной функцией

КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)} (R²=0,9927, E=99,99%) с получением значений КИД_{ВБ РВ-97} для каждой из 320 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 10,64±0,01, что соответствовало КИД вируса бешенства штамма РВ-97, равному 10^7,00 ККИД₅₀/см³. Для отрицательных контролей сигмоиды не были сформированы, что означало отсутствие вируса бешенства в данных образцах.

Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии ВНК-21/2-17 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом и в ОТ-ПЦР-РВ. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99,5-100% для 10^8,0-7,0 ККИД₅₀/см³ (n=64), на 98-99,5% для 10^7,0-4,0 ККИД₅₀/см³ (n=64), на 97-98,5% для 10^4,0-3,0 ККИД₅₀/см³ (n=64), на 94-98% для 10^3,0-2,0 ККИД₅₀/см³ (n=64), на 93-98% для 10^2,0-1,0 ККИД₅₀/см³ (n=64). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Таким образом, разработанный способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет с высокой степенью достоверности оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 позволяет с высокой степенью достоверности оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Для определения аналитической чувствительности разработанной тест-системы для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливали калибровочную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97 с КИД: 10⁰, 10^0,5, 10^1,0, 10^1,5, 10^2,0, 10^2,5, 10^3,0, 10^4,0, 10^5,0, 10^6,0, 10^7,0, 10^8,0 ККИД₅₀/см³. Испытуемые контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 7, в которой отражен сравнительный анализ определения КИД вируса бешенства штамма РВ-97 разработанным способом в сравнении с данными прототипного метода. Выявлено, что с достоверностью ≥98,5% разработанным способом определены КИД вируса бешенства штамма РВ-97 со значениями от 10^3,0 до 10^8,0 ККИД₅₀/см³, с достоверностью 93-98% - с КИД от 10^1,0 до 10^3,0 ККИД₅₀/см³. Наиболее часто для производства аттенуированных антирабических вакцин применяют суспензии вируса бешенства штамма РВ-97 с КИД более 10^6,50 ККИД₅₀/см³, следовательно, для данных образцов достоверность определения количества инфекционных доз вируса составляла 99,5-100%.

Таким образом, аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ составляет не менее 10^1,00 ККИД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования 93-100%.

Пример 5. Оценка специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ.

Для оценки специфичности тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ, исследовали суспензии вируса бешенства штаммов РВ-97, ВНИИЗЖ, CVS-11, вируса ящура штамма А/Забайкальский/13, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карповых, инфекционного некроза поджелудочной железы. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял 10^6,0 ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в трех повторностях.

Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 1. Выделенные экстракты РНК характеризовались высокими показателями степени чистоты, поскольку коэффициенты экстинкции R₁ и R₂ находились в диапазоне 1,996-2,000, что соответствовало требованиям [5].

В ходе ОТ-ПЦР-РВ с тест-системой, специфичной только для участка N-гена гена вируса бешенства штамма РВ-97, наблюдали построение сигмоид накопления флуоресцентного сигнала только для штамма вируса бешенства штамма РВ-97. Для проб, содержащих другие штаммы вируса бешенства и другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0125 у.е.) (таблица 8). Иными словами, разработанная тест-система и предложенный способ являются специфичными по отношению к вирусу бешенства штамма РВ-97.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность снизить время проведения анализа сырья аттенуированной антирабической вакцины для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 до 4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту РНК вируса бешенства штамма РВ-97; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование. В предлагаемом изобретении между количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 и пороговым циклом амплификации установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R=0,9927) и эффективностью амплификации 99,99%. Разработанная математическая модель КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)} дает возможность оценивать количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для производства аттенуированной антирабической вакцины.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов и с последующим применением разработанной математической модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»:

1. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 3.1.17.-P. 578-612.

2. Груздев K.H., Метлин A.E. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019.-394 с.

3. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.

4. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Hansen C.L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

5. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).

6. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 15.12.2019).

7. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.

8. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.

9. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.

10. The RNA Institute college of arts and scienceuniversity at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/forml.cgi (Дата обращения: 11.01.2020).

11. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 19.12.2019).

12. Nicolas von Ahsen, Carl Т. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg²⁺, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.

13. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4.-P. 1460-1465.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением оригинальных специфических олигонуклеотидов и разработанной показательной функции зависимости величины порогового цикла амплификации и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97. Количество инфекционных доз вируса бешенства определяют при проведении ОТ-ПЦР-РВ по величине порогового цикла амплификации. На основании установленной величины порогового цикла амплификации (C_t) рассчитывают значение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}) с применением разработанной математической модели: КИД_{ВБ РВ-97}=10^^{(-0,3012⋅Ct+10,2040)} (R²=0,9927, Е=99,99%). Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины на основе ОТ-ПЦР-РВ с последующим применением разработанной математической модели. 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 5 пр.

1. Способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что в качестве гомологичных N-гену вируса бешенства штамма РВ-97 оригинальных олигонуклеотидов используют Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер с нуклеотидной последовательностью GGT-GAA-GCT-AGA-CTG-TGA-AGA-A, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер с нуклеотидной последовательностью GCG-AAT-CTA-CTC-TGT-CGC-ATG-AA и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд с нуклеотидной последовательностью Cy5-CGC-CNC-CCC-TTT-AAG-TTT-GCT-TTA-TT-BHQ3, и включающий следующие стадии:

- подготавливают калибровочную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве положительного контроля используют суспензии с количеством инфекционных доз: 10⁰, 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ ККИД₅₀/см³, а в качестве отрицательного контроля используют суспензии клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не зараженные вирусом бешенства любого штамма и вирусом бешенства штамма РВ-97;

- выделяют РНК вируса бешенства штамма РВ-97 из сырья для аттенуированной антирабической вакцины, образцов отрицательных и положительных контролей;

- элюаты РНК добавляют к смеси компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ в соотношении 1:5;

- проводят ОТ-ПЦР-РВ с последующей детекцией ДНК-ампликонов с помощью флуоресцентного детектора, анализируют полученные данные;

- определяют величину порогового цикла амплификации;

- устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для аттенуированной антирабической вакцины в виде показательной функции с основанием 10;

- оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) и достоверность аппроксимации (R²);

- рассчитывают значение количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИД_{ВБ РВ-97}) в образцах сырья для аттенуированной антирабической вакцины на основе разработанной математической модели: КИД_{ВБ РВ-97}=10^{^(-0,3012⋅Ct+10,2040)}, (R²=0,9927, E=99,99%), где R² обозначает достоверность аппроксимации, а Е обозначает эффективность амплификации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие компоненты: Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер, Downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд, каждый - по 5 пМ, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) - по 0,20 мМ, MgCl₂ - 2 мМ, Taq-буферный раствор Colorless Flexi (× 5) - 20% от объема реакционной смеси, AMV-ревертаза - 10 ед., Taq-ДНК-зависимая ДНК-полимераза - 10 ед.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОТ-ПЦР-РВ проводят с соблюдением следующих режимов:

- обратная транскрипция: температура 42°С в течение 15 мин;

- предварительная денатурация: температура 95°С в течение 5 мин;

- ПЦР-РВ: денатурация - температура 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - температура 55°С в течение 30 с, элонгация - температура 68°С в течение 30 с.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 снижается до 4 ч.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается степень чистоты РНК вируса бешенства штамма РВ-97 за счет применения частиц цеолита диаметром 350 нм в присутствии хаотропной смеси, содержащей 3М мочевины и 3М гуанидинизотиоцианат, в соотношении 1:1.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что увеличивается специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ по определению количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 имеет аналитическую чувствительность не менее 10 ККИД₅₀/см³.